JPH05501656A - ハンノキの花粉のアレルゲンおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

ハンノキの花粉のアレルゲンおよびその用途１、本発明の分野 本発明は、ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子ならびにブナ目の樹木、 特にハンノキ（ハンノキ属の種）、ハシバミ（ハシバミ属の種）およびカバ（カ バ属の種）のυ」」Ｌ」−花粉アレルゲンあるいはＣｏｒ　ａ　Ｉ花粉アレルゲ ンあるいはＢｅｔｖｌ花粉アレルゲン、すなわち全但工」Ｌ」−アレルゲンタン パク質、全ＣｏｒａＩアレルゲンタンパク質あるいは全ＢｅｔｖＩアレルゲンタ ンパク質の少なくとも一種のエピトープを有し、そして酊工」Ｌ」−１Ｃｏｒａ ｌまたはＢｅｔｖＩアレルゲンと同一あるいは類似した抗原性を呈するポリペプ チド自体を提供する。 本発明は、この種のアレルゲンポリペプチドを生産する過程で使用する複製可能 な微生物発現ベクター（ベヒクル）および微生物も提供する。本発明の合成ポリ ペプチドを使用したアレルギー性疾患の診断法ならびに治療法も提供される。 ２、発明の背景 花粉タンパク質に対するタイプＩのアレルギーが、かゆくて充血した目、はな水 、眼瞼の腫れ、咳および喘息症状のような症状を伴うことが、長い間知られてき た。この点では、ブナ目（例えば、カバツキ、ハシバミ、ハンノキおよびクマシ デ類）の早期開花樹木の花粉が重要な位置を占めている。これらの花粉のアレル ゲンを正確に同定し、特徴づけるために、数多くの研究が行なわれてきた（１− ４）。花粉アレルゲンの正確な特徴づけは、現在用いられている花粉抽出物が不 均一であることによってその進展が妨げられている。ハンノキの花粉のある８つ のアレルゲンは、アトピー症でＩｇＥ応答を誘導し、さらにその内の１種の１７ ｋＤのタンパク質である虹ＬＬユは、主要アレルゲンとして、アレルギー患者の 血清の大半と反応する（５．６）。 人口の少なくとも１０％が、程度の差こそあれさまざまな時期に花粉アレルギー にかかる。これらのアレルギーは、花粉タンパク質と反応するＩｇＥ抗体によっ て媒介される。減感作、すなわち、アレルギーの生起するタンパク質を定期的に ゆっ（り増量しつつ投与することによる花粉アレルギーの治療の可能性がある。 アレルギー性疾患の診断方法、例えばプジオーアレルゴソルベントテスト（ＲＡ ＳＴ）　、ペーパーラジオイムノソルベントテスト（ＰＲＩＳＴ）、酵素結合イ ムノソルベントアッセイ（ＥＬＩ　ＳＡ）　、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ） 、免疫放射化アッセイ（Ｉ　ＲＭＡ）、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）、ヒスタ ミン放出アッセイ、および工ｇＥイムノプロットのような診断方法は、純粋なア レルゲンの入手の可能性に太き（依拠している。天然源から単離された花粉由来 のタンパク質抽出物は、調製物がバッチによって異なるので、標準化が困難であ る。例えば、望ましくない成分が含まれていたり、そして／または特定のタンパ ク質が抽出過程で失われて最終調製物に含まれなくなる可能性がある（７）。再 現可能性をもって製造し得る十分に成分の限定されたアレルゲンを使用する診断 用検査の方が、アレルゲンと他の成分が充分に確立されていない混合物を用いた 粗花粉抽出物を使用する検査より優れているのは明らかである。アレルゲンポリ ペプチドまたはそのアレルゲン断片の組換えＤＮＡを用いた生産を行うことによ り、標準化された診断および治療方法のための成分が確立されたアレルゲンを再 現可能性をもって製造することが可能となる。 公知のタンパク質／化学的方法、例えばアフィニティークロマトグラフィーを用 いることによって花粉からアレルゲンを均質になるまで精製することができる（ ８）。これらの方法は、比較的高価であり、さらにアレルゲンのソースとして高 価な花粉を必要とする。したがって、アレルゲンタンパク質またはそのタンパク 質断片を生成するにあたっては、組換えＤＮＡ法を使用する方が安価かつ効率的 である。 減感作（ハイポセンシティゼイション）は、アレルギー疾患での効果的な治療法 であることが立証されている。この治療法では、十分に長い期間かけて投与量を 増加させながら、アレルゲンを非経口または経口投与する。 ３、発明の要旨 本発明は、ブナ目の樹木、例えばハンノキ（ハンノキ属の種（Ａｉｎｕｓ　ｓｐ 、）　）　、ハシバミ（ハシバミ属の種（Ｃｏｒｙｌｕｓ　ｓｐ、）　）または カバ（カバ属の種（Ｂｅｔｕｌａ　ｓｐ、））の主要アレルゲンである但」二Ｌ 」−１ＣｏｒａＩまたはＢｅｔｖｉと同一または類似した抗原特性を呈するポリ ペプチドまたはこの種アレルゲンの少な（とも１種のエピトープを含むポリペプ チドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ分子を提供する。本発明 は、酊Ｊ−Ｌ」−１ＣｏｒａＩまたはＢｅｔｖＩの完全なｃＤＮＡ配列ならびに 完全な推定アミノ酸配列を提供する。さらに、本発明は（ａ）この種のｃＤＮＡ 配列と高緊縮条件下でハイブリダイズし、況」−Ｌ」−１ＣｏｒａｌまたはＢｅ ｔｖｒアレルゲンの少なくとも１種のニブトープを持つポリペプチドをコードす るヌクレオチド配列、ならびに（ｂ）遺伝暗号の縮重によってこれらのアレルゲ ンポリペプチドから導（ことのできるヌクレオチド配列を包含する。このヌクレ オチド配列は、酊」二Ｌ」−１ＣｏｒａＩまたはＢｅｔｖＩアレルゲンとして、 またはそれらの少な（とも１種のエピトープを含むポリペプチドとして表わされ 得る。好適実施態様では、このｃＤＮＡ配列は、配列リスト中で酊」−Ｌ」工認 識番号２２として配列リスト中に記載した配列の全配列または配列の１部を含む ものである。 これまでに知られている限りでは、カバ、ハンノキ、ハシバミおよびクマシデ類 の花粉は、ＩｇＥとの結合については、アミノ酸レベルにおいて高度の相同性を 呈する類似した主要アレルゲンを有する。したがって、本発明は、ハンノキのＭ 二１」−アレルゲンまたはハシバミのＣｏｒａＩまたはカバノキゲンＤＮＡによ ってコードされるかまたは遺伝暗号の縮重によりこれらのポリペプチドアレルゲ ンから導びかれうる上記以外の他の種のｖＬ−Ｌ」−１ＣｏｒａＩまたはＢｅｔ ｖＩ花粉アレルゲンにも関する。 緊縮条件下で、ポリヌクレオチドと別のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼイ ションは、核酸レベルでポリヌクレオチド間の少な（とも６０％の相同性を必要 とする。 前記緊縮条件は、以下のようなハイブリット化されたニトロセルロースフィルタ ーの洗浄を必然的に意味する。 （ａ）ＤＡＮ／ＤＮＡおよびＤＡＮ／ＲＮＡハイブリダイゼイションとして 温度５５℃、１５０ｍＭのＮａＣ１および１５ｍＭのクエン酸ナトリウムの塩濃 度（ｐＨ７，０）、およびＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウム）界面活性剤を０ ．１％（Ｗ／Ｖ）の濃度で。 （ｂ）オリゴデオキシヌクレオチド／ＤＮＡハイブリダイゼイションとして、 温度５５℃、ＩＭのＮａＣ１および１０ｍＭのクエン酸ナトリウム・２Ｈ２０の 塩濃度（ｐＨ７，０）、およびＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウム）界面活性剤 を０．５％（Ｗ／Ｖ）の濃度で。これに関連して、「オリゴデオキシヌクレオチ ド」は、鎖長１００ヌクレオチドまでの単鎖Ｄ　Ｎ　Ａのオリゴマーを意味する 。 さらに、本発明は、上で記述したようなヌクレオチド配列を内包する発現プラス ミドおよびこれらの発現プラスミド類を宿す宿主を提供する。 本発明は、高度（少なくとも５０％）のアミノ酸相同性（９）のために、ハンノ キの但」−Ｌ」−アレルゲンの一部または全部と抗原交差反応性を呈し、ハンノ キの酊」−Ｌ」−アレルゲンまたは他の植物のアレルゲンの一部または全部に抗 原性を呈する合成ポリペプチド、すなわち、ハンノキのＡｌｎ二Ｌ」−アレルゲ ンから実際に導かれ、これらの分子に同様に結合し得る抗体または細胞抗原結合 部位を含有する組成物をも提供する。 これらの合成ポリペプチド類は、酊ニーＬ」−１ＣｏｒａＩまたはＢｅｔｖＩア レルゲンの一部または全部の抗原性を有するポリペプチド部分を内包するハンノ キのポリペプチドの一部または全部の抗原性を有するポリペプチド部分を内包す る融合および非融合ポリペプチドを包含する。前記合成ポリペプチドを製造する 方法は、上で記載した発現プラスミドを内包する真核または原核の宿主細胞の培 養の各工程およびその培地からの合成ポリペプチド（類）の精製を含む。 ここで「合成」の語は、ここで記述したヌクレオチド配列のクローニングおよび 発現によって、またはこれらのヌクレオチド配列によってコードされたポリペプ チドの化学的合成によって製造されたポリペプチドをどちらをも含む。 本発明によって生産される合成ポリペプチドは、生得のアレルゲンと同じかまた は同様の抗原性を示す。以下に示すように、ハンノキの旦ＬＬユ、ハシバミのＣ ｏｒａＩまたはカバのＢｅｔｖＩをコードするｃＤＮＡクローンは、アレルギー の人達の血清中でＩｇＥと反応する非融合ポリペプチドを生産するために使用さ れ得る。したがって、診断用検査（当業界で知られているＲＡＳＴ、ＰＲＩＳＴ 、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＩＲＭＡ、ＬＩＡ、ヒスタミン放出アッセイおよびＩｇ Ｅイムノプロット法のような検査であり、前述されている。）での抗原として、 減感作治療における予防または治療剤の成分として、および生体内の診断、例え ば気管支、結膜、皮膚、鼻腔および経口誘発および皮膚検査のような種類の診断 での成分として、このポリペプチドを使用することが可能である。 特に、合成アレルゲンの抗原性は、生得の酊」二Ｌ」−花粉アレルゲンの抗原性 と一致し、したがって、それらはｖｊ−Ｌ」−花粉アレルギーにかかつている人 達の血清のＩｇＥを結合し得るので、合成アレルゲンを、生体内および生体外で の診断剤として使用し得る。同じ考え方で、その抗原性は、生得のＣｏｒａＩま たはＢｅｔｖｌ花粉アレルゲン類のものと一致し、さらにそれらはまた、過敏ま たはアレルギーの患者の血清のＩｇＥと結合し得る。 したがって、本発明の目的の１つは、花粉アレルゲンを製造するための方法を提 供することにあり、特に対応するアレルギーの検出のための診断用検査および、 あるいは減感作治療のための一群のアレルゲンを有するように、酊」二ＩＬ、Ｃ ｏｒａＩまたはＢｅｔｖＩアレルゲンを製造するための方法を提供することにあ る。 修飾Ｔ細胞（モデイファイイング　Ｔ−セル）応答が可能な主要エピトープとし て、以下のアミノ酸配列が見い出された。 Ｇ１ｙＶａｌＰｈｅＡｓｎＴｙｒＧ１ｕＰｈｅｎｅＬａＩＡｓｐＧ１ｙＡｓｐＬ ｙｓＬｅｕＡ１ａｎａＳｅｒＳｅｒＶａｌＧ１ｕＡｓｎｎｅＧ１ｙＡｓｎＧ１ｙ Ｇ１ｙＰｒｏＧ１ｙＴｈｒｌｌｅＬｙｓＬｙｓ１１ｅＳｅｒＰｈｅ全てのこれら の配列は、全ての前記アレルゲン類、すなわち、酊」−Ｌ」−１ＣｏｒａＩおよ びＢｅｔｖＩ中に存在する。 ４、

【図面の簡単な説明】

以下の図面および説明は、本発明の分野および目的を理解する上で助けとなる。 図１は、ハンノキの且ＬＬユアレルゲンをコードするヌクレオチド配列を包含す るｃＤＮＡ　（６６５ヌクレオチド、配列認識番号１）を示す。このｃＤＮＡは 、４８３ヌクレオチド（開始および終止コドンを含む）のコード領域、１６２ヌ クレオチドの３′−非コード領域および２０ヌクレオチドのポリーＡ末端を含む 。ハンノキのポリペプチドの理論的アミノ酸配列を、それぞれのコドンにより図 １に表示する。完全タンパク質は、１６０（配列認識番号３）のアミノ酸（開始 コドンのメチオニンを含む）を有する。 図２は、第１のｃＤＮＡ鎖の合成のために使用されたＢＰ−Ａプライマー（配列 認識番号４）のヌクレオチド配列を示す。 制限酵素Ｂｇｌｌ？（ヌクレオチド１９−２４）およびＨｉｎｄＩＩ［（ヌクレ オチド３１〜３６）の認識配列に下線を付す。ｕＬＬユのＰＣＲ増幅のためのプ ライマーとして使用され、さらにＢＰＡの成分でもあるＴ７プライマー（ヌクレ オチド４−１７）の配列も同じように表示する。 図３〜１０は、特に組換え非融合タンパク質としてハシバミの主要な花粉アレル ゲンＣｏｒａＩの種々のイソ型のイムノプロット分析を示す。 図３〜６、 同一の患者群の血清を使用して、ＣｏｒａＩイソ型を特徴づけた（第１〜９列） 。 Ｂ列：患者群の血清添加をしない対照緩衝液（バッファーコントロール）、 Ｎ列：非アレルギーの健常人の血清のプールそのイソ型に結合する、アレルギー の患者の血清由来のＩｇＥ抗体類を、　′２ＩＩ標識化うさぎ一抗ヒトＩｇＥに よって検出した。各々のイソ型は、アレルギーの患者の血清由来のＩｇＥと反応 性を示す、それらの個々の結合パターンは患者によって異なっていてもよいが、 全てのイソ型は、ＩｇＥを結合同一の一群の実験が、いかなるｃＤＮＡ挿入をも 伴わないプラスミドｐＫＫ２２３．３で形質転換された大腸菌エッシェリヒア・ コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｊ　Ｍ　Ｉ　Ｏ５を用いて行なわれた。 図８ また同様に、その配列が配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤＮ０１）１で示されるｃＤ ＮＡ断片を、発現プラスミドｐＫＫ２２３、３中に結合した。コード領域（配列 認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ，）２および配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ，） ３を参照）に対応するタンパク質をエツシエリヒア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｊ 　Ｍ　１０５中で発現させ、上記と同様に同一の患者の血清を用いて試験した。 口ｌユ」」−は、各々の場合にこれらの患者の血清由来のＩｇＥを結合し得た（ 第１〜９列）。Ｂ列（対照緩衝液、患者の血清を含まず）およびＮ列（非アレル ギーの個体群由来の血清のプール）で、結合しないものは観察されなこの図は、 上記実験中で使用された患者の血清の品質制御な示す。はぼ同一の血清の組を、 カバの花粉の水性抽出物から、分離してプロットされたタンパク質上で試験した 。各単一血清からのＩｇＥは、カバの花粉、Ｂｅｔｖｌの主要アレルゲンに強力 に結合した（１〜９列）。対照緩衝液（Ｂ列）および非アレルギー個体群由来の 血清のプールでは結合は観察されなかった。 図１０、 さらに、同一の血清群をｒＢｅｔ　ｖ　Ｉ上で試験したところ、組換え非融合タ ンパク質と厳密に同じ強さの反応性を示した。 図１１、 樹木の花粉アレルギー患者の血清由来のＩｇＥの能力を示す、すなわち、対応す るハシバミの花粉アレルゲンＣ：ｏｒａＩにＩｇＥがさらに結合するのを阻害す る能力を示す阻害実験。 １：１０希釈のハシバミ花粉にアレルギーのある個体群の血清（１〜５）、非ア レルギー個体群の血清プール（６）、および血清を添加しない緩衝液（７）の各 １ｍｌに、５μｇのｒＢｅｔ　ｖ　Ｉ　（パネル１）、５μｇのＢＳＡ　（パネ ル２）、または緩衝液のみ（パネル３）を添加して、−夜、４℃でインキュベー トした。これらの標本を５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離したハシバミの花粉タンパク質 のウェスタン・プロットを調査（プローブ）するのに使用した。ｒＢｅｔ　ｖ　 Ｉを添加した場合、１７ｋＤのＣｏｒａ　Ｉに結合するＩｇＥは全く観察されな かった。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはタンパク質の添加を伴わない緩衝 液の添加は、ハシバミのＣｏｒａＩに対する患者のＩｇＨの結合を阻害し得なか った。 ５、実施例 ５．１　花粉からのポリＡ＋ＲＮＡの単離および第１のｃＤＮＡ！ｉの合成 ポリアデニル化された（ポリＡ＋）ｍＲＮＡを、成熟ハンノキ花粉（アレルゴン 社（Ａｌ　１ｅｒｇｏｎＡＢ）、エンゲゼルホルム、スウェーデン（Ｅｎｇｅｌ ｓｈｏｌｍ　、　Ｓｗｅｄｅｎ）　）から単離した（１）。 これを使用して、ｃＤＮＡの第１の鎖を以下のように合成した。 ２μｍの１０×緩衝液（４８０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ Ｔｒ　ｉ　ｓ）、６０ｍＭのＭ　ｇ　Ｃｌ　２．４００ｍＭのＫＣＩ、ｐＨ４， ８） ２μｍの１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）１μｍのプライマーＢＰ−Ａ　 （１００％ｇ／μｍ、図２のヌクレオチド配列）（配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ，）２μｍの２５ｍＭデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ ｓ）、すなわち各々２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＤ　（フ ァルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、アップサラ、スウェーデン（Ｕｐｐｓａ ｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）　）１１μｍの８．０ １μｍポリＡ＋ＲＮＡ　（３μｇ） １μｍのＡＭＶ逆転写酵素（ユナイテッド・ステーブ・バイオケミカル・コーポ レーション（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐｏ ｒａｔｉｏｎ　（Ｕ　Ｓ　Ｂ　）　）　、クリーブランド、オハイオ、米国）＝ ３２単位 総容量２０μｍでこの反応物を、２時間４２℃で、インキュベートし、その後Ｉ 　ＸＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス、１ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴ Ａ）（ｐＨ８，０））を用いて１：１に希釈し、４℃で保存した。 ５．２　複製連鎖反応（ＰＣＲ） セクション５．１で製造したハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ分子にＰＣＲを行なっ た。以下に示す２つのオリゴデオキシヌクレオチドの混合物を分子の５′−末端 のプライマーとして使用した。 Ｎｏ、　２４８２　’（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、５）５’−ＧＴｒＴｒＣＡＡＴＴ ＡＣＧＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣ−３゜Ｎｏ、２４９０　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、６ ）５’−ＧＴｒＴｒＣＡＡＴＴＡＣＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣ−３’これらのオリ ゴデオキシヌクレオチドのヌクレオチド配列を、エドマン分解およびカバ（ビー ・ベルコサ（Ｂ、　Ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）　）の以下のコドンの使用によって部 分的に決定されたハンノキの酊」二Ｌ」−のＮ−末端アミノ酸配列から得た。・ 同様にＢＰ−Ａプライマーの成分であるＴ７プライマー（配列認識番号７）（フ ァルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　）を分子の３′−末端のプライマーとし て使用した。以下の混合物を反応に使用した。 ２．５μｍのセクション５．１に記載の反応混合物５．０μｌの１０ＸＰＣＲ緩 衝液（４００ｍＭ（７）ＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２．１０％のゼラチン、１ ００ｍＭトリス（ｐＨ８，３）） ２．０μｍのＴ７プライマー（配列認識番号７）（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ）　）　＝　２０　ｐ　ｍ　ｏ　１４．０μｍの２４８２番 （配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ，）５）および２４９０番（配列認識番号 （ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ，）　６）の等側部分中のプライマー混合物＝１００ｐｍ ｏＬ ２．５μｌの２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ （ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　）１．５ｕｌのｌｏｏｍＭ　ＭｇＣ Ｌｚ ３２．５μｌ（’）Ｈｚ　Ｏ（５０μｌまで）１単位のＴａｑ　ＤＮＡポリメラ ーゼ（ＵＳＢ）の添加。反応混合物を９３℃で３０秒間、５５℃で３０秒問およ び７２℃で１分間インキュベートした。この系を全部で３０回行った。 最後に、反応混合物を７２℃でさらに１０分間保持した。 ５．３ＰＣＲ断片のクローニングおよび配列決定セクション５．２で合成したＤ ＮＡ断片をＤＥＡＥベーパーの手段で１．５％アガロースゲルから単離した（１ ０）。その後この断片を５′−末端でキナーゼ処理した。 ａ）キナーゼ処理 １０μｍのＤ　Ｎ　Ａ　（＝　５００　ｎ　ｇ　ＡＸＬＬｉＤ　Ｎ　Ａ　）２． ５μｌの１０ＸＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液（ボーエリンゲン社（Ｂｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒ）、マンハイム、ドイツ）７．０μｍのｙ−”Ｐ−ＡＴＰ、ｌ ｏｍｃｉ／ｍｌ（アマジャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、リトル・チャルフォント （Ｌｉｔｔｌｅ　Ｃｈａｌｆｏｎｔ）　、英国）４．５μｍのＨ，０ １，０ｔＬｌポリヌクレオチドキナーゼ（ポーニリンゲル社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ ｅｒ）　）反応混合物を３７℃で２０分間インキュベートした。１μｍポリヌク レオチドキナーゼをさらに添加した後、混合物を３７℃で６０分間インキュベー トした。 ｂ）フレノウフィルイン反応 上記反応混合物に、１μｌの２ｍＭ　ｄＮＴＰＳ（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ）　）　１　μｌｌフレノウ片（２＝単位）を加えた。 キナーゼ処理し、うめ込んだＤＮＡ断片を、ニックカラム（Ｎｉｃｋ（登録商標 ）Ｃｏｌｕｍｎ）（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　）の方法により精 製し、その後エタノールおよび酢酸ナトリウムを用いて沈殿させた（９）。 Ｃ）断片のＢｇｌｌＩ消化 ＰＣＲにおいてＢＰ−Ａオリゴデオキシヌクレオチド（図２、配列認識番号（Ｓ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ，）　４）の使用によってｍユ配列に数種の制限酵素部位を、 ３′−末端で加えた。この配列でのＢｇｌＩ［部位を制限酵素Ｂｇｌ　ＩＩを用 いた開裂のために選択し、ｐ−ブルースクリプト（登録商標）（ｐＢｌｕｅｓｃ ｒｉｐｔ”）プラスミド（ストラタジエン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラホラ 、カリフォルニア（ＬａＪｏＬｌａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）、米国）の対応 するＢｇｌＩｌｒ部位中にその断片を結合した。フレノウ反応のため平滑末端が すでに配列の５′−末端で生成されていた。 セクション５．３ｂの全てのＤＮＡ沈殿物を２μｌのＩＯＸＢｇｌＩＩ緩衝液（ ポーニリンゲル社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）　）中に溶かした。１７μｍのＨ２ ０および１μｌのＢｇｌｌＩ（１１単位）を加えた。反応混合物を３７℃で１． ５時間インキュベートした。このように切断された断片をＤＥＡＥペーパーの手 段で１．５％アガロースゲルから抽出した（１０）。 ｄ）ｐ−ブルースクリプト（登録商標）　（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ”）　Ｋ　 Ｓ十プラスミド中のＤＮＡ断片の結合 ｐ−ブルースクリプト（登録商標）　（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ”）　Ｋ　Ｓ＋ プラスミド（ストラタジエン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　）を、クローニング ベクターとして選択し、制限酵素ＥｃｏＲＶ　（平滑末端の供給、酊」−Ｌ」− 断片の５′末端をこれらに結合した）およびＢａｍＨＩ（Ｂｇｌ　Ｕに付着し得 る付着末端の供給、旦Ｕユ断片の３′末端をこれらに結合した）を用いて切断し た。プラスミドの５′末端のリン酸基をアルカリホスファターゼによって取り除 き（１２）、ベクターの非特異的再結合を防いだ。 ｐ−ブルースクリプト（登録商標）　（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ”）　Ｋ　Ｓ＋ プラスミドでの酊」二Ｌ」−断片の結合 １０μｌのＨ，Ｏ中に溶かしたセクション５．３０から得た２０ｎｇのＤＮＡ ２．０μｌの１０×連結緩衝液（２００ｍＭトリス、５０ｍＭのＭ　ｇ　Ｃｌ　 ＊　、５０　ｍ　ＭのＤＴＴ、５００ｕｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、ｐＨ７ ，６） １．０μｌの１０ｍＭ　ＡＴＰ ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩを用いて切断したｐ−ブルースクリプト（登録商標 ）　（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ”）ＫＳ＋３．０μｌ　（＝５０ｎｇ） ４．０μｍのＨ２Ｏ １，０μｍの７４ＤＮＡリガーゼ（ポーニリンゲル社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ） 　）　（＝　３単位）この反応は、室温で４時間インキュベートした。 ｅ）受容能のあるエッシエリヒア・コリ（Ｅ−ｃｏｌｉ）宿主細胞の形質転換（ トランスフォーメーション）エッシェリヒア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｘ　Ｌ　１ −ブルー（Ｂｌｕｅ）細胞（ストラタゲン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））中で形 質転換を行った（１３）、アンピシリン含有（１００１，Ｌｇ／ｍｌ）培養平板 上でブルーーホワイトインディケーションシステム（ｂｌｕｅ−ｗｈｉｔｅｉｎ ｄｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ）の方法によって陽性クローンの選別を行った （１４）。 ｆ）酊ニーＬ」−Ｄ　Ｎ　Ａの配列決定Ｔ７配列決定キット（ファルマシア社（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　）の手段によって、製造業者の説明に従い、Ｍ」−Ｌ」 −Ｄ　Ｎ　Ａの配列決定を行った。 ５゜４　Ａｌｎ二Ｌ」−Ｄ　Ｎ　Ａの発現および得られたタンパク質のＩｇＥ結 合の検出 ａ）酊」−Ｌ」−のためのコード配列を包含するｐ−ブルースクリプト（登録商 標）　（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ）　Ｋ　Ｓ十ベクターから得られたＤＮＡ 挿入物に、クンケルらによる（１５）変異の誘発を行った。（１５）。５′末端 で酊ニーし」−配列を完成し配列を提供するために、さらにＡＴＧコドンおよび 付加的ＥｃｏＲＩ部位を用いて以下のオリゴデオキシヌクレオチドを合成しく配 列認識番号８）、 ５°−ＣｒＴ　ＣＧＴ　ＡＡＴ　ＴＧＡ　ＡＡＡ　ＣＡＣＣＣＡ　ＴＧＡ　Ａｎ ”　ＣＣＧ　ＡＴＡ　ＣＣＧ　ＴＣＧ　Ａ　−３′変異の誘発に使用した。これ は、発現プラスミドｐＫＫ２３３．３（ファルマシア社）中の遺伝子の５′末端 でのＥｃｏＲＩ部位および３′末端でのＨｉｎｄＩＩＩによって正しい方向で結 合されるべき酊」−Ｌ」−配列を可能にした。エッシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃ ｏｌｉ）　Ｋ１２ＪＭ１０５細胞（ｔｈｉ、　ｒｐｓＬ、　ｅｎｄＡ、　５ｂｃ Ｂ１５．　ｈｓｄＲ４，ｄｅｌｔａ（ｌａｃｐｒｏ　ＡＢ）　／　Ｆ　’　、　 ｔｈｒａＤ３６　、　ｐｒｏＡ８　、１ａｃＩｑＺ、　ｄｅｌｔａ　Ｍ２Ｓ）を このプラスミドを用いて形質転換した。タンパク質合成が行なわれた後、細菌細 胞を採取し、液体窒素を用いて破砕した。 溶解物をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離した。イムノプロットによって 組換え幻ニーＬ」−非融合タンパク質の検出を行った。アレルギー患者の血清中 のＩｇＥを組換え酊」−Ｌ」−で結合した。　＋２！ＩＩ標識化抗ヒトＩｇＥ（ ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　）によって結合ＩｇＥの検出を行なっ た。 ｂ）旦ＬＬユをコードする配列を含むｐ−ブルースクリプト（登録商標）　（ｐ ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＲ）　Ｋ　Ｓ＋プラスミド中のＤＮＡ挿入物を、挿入物の 読取り枠を各回１ヌクレオチド分シフトする発現プラスミドｐＥＸＡ、ｐＥＸＢ およびｐＥＸＣ中のＥｃｏＲＩリンカ−（ポーニリンゲル社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ ｅｒ）　）によって結合した（１６）。１例としてこの方法で、酎」工Ｌ」−の ための正確な読取り枠を得、さらに組換えＭ」−Ｌ」−融合タンパク質の生産を 誘導した。イムノプロットによって、ハンノキの花粉にアレルギーのある患者の 血清中のＩｇＥを結合するこの組換えＬ辷と」−］−融合タンパク質の能力を示 した。１′　工標識化抗ヒトＩｇＥ（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　 ）によって、結合ＩｇＥの検出を行った。 類似の方法をＣｏｒａ　Ｉのクローニングおよび発現のために行った。 ５．５　ＣｏｒａＩＤＮＡの発現および得られたタンパク質のＩｇＥ結合の検出 その配列が配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ，）９．１２．１５および１８で 示されるｃＤＮＡ断片を発現プラスミドｐ　Ｋ　Ｋ　２２３゜３　（ファルマシ ア・エルケイビー・バイオテクノロジー社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　、アップサラ、スウェーデン（Ｕｐｐｓａｌａ、　 Ｓｗｅｄｅｎ）　）中に結合した。それぞれの組換えプラスミドを用いて形質転 換したエッシュリヒア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｊ　Ｍ　１０５中で、これらの 断片のコード領域（配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ０１）１０．１３．１６お よび１９を参照）に対応するタンパク質を発現した。ＯＤ、。。が０．４に達す るまで培養基を生育させた。その後、イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ ドを最終濃度０．５ｍＭまで加え、さらに組換え非融合タンパク質の発現のため に培養基を３７℃で３．５時間かけて生育させた。細菌細胞を遠心分離によって 採取し、２２０ｍＭのＮａＣ１を含有する５　０　ｍ　Ｍ　トリス−ＨＣｌ緩衝 液（ｐＨ７，５）に取り、凍結融解サイクルによって細胞を破砕した。組換λ非 融合タンパク質を含有する上清を１５％Ｓ　Ｄ　Ｓ　−、Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅに充填 した。分離したタンパク質をニトロセルロースフィルターに移した。アレルギー 患者の血清の使用により、ＩｇＥ結合タンパク質を検出した。 結果を図３〜６に示した。 ５．６　Ｔ細胞エピトープの反応検査 ウェスタンプロットによって示されたように、厳密にＢｅｔｖＩに対するＩｇＥ 反応性を示すカバの花粉のアレルギー患者から末梢血液を集めた。密度勾配遠心 分離によって末梢単核細胞（ＰＢＭＣ、リンパ球を含有する白血球細胞）を単離 した。Ｂｅｔｖｒ存在下でＰＢＭＣを培養することによってアレルギー特異的子 細胞を豊富にした。クローニング過程の後、３Ｈ−チミジン取込みによって測定 した場合、特異的アレルゲンの存在下で、ＴＣＣの自動増殖活性より少な（とも １０倍高い増殖を起こすことを示す増殖アッセイによって、Ｔ細胞クローン（Ｔ ＣＣ）が完全ＢｅｔｖＩ分子と反応することが立証された。全Ｂｅｔ　ｖ　Ｉ分 子を用いるのと同じ方法で、アトピーの供与者から単離した２つのＢｅｔｖｌ特 異的ＴＣＣを上述のベブチドと反応させ、同時にこれらのペプチドが関連Ｔ細胞 ニブトープを代表するかまたは含有することを立証した。 ＴＣＣＴＣＣ＋ＦＣＴＣＣ＋ＦＣ＋シ辷」　”ｒｃｃ＋’ｐｃ＋　ぺ’ｆ％Ｆ４ ４３　９６０　３０５１６　３１５８０”　ｃｐｍ１６０　５０８　２１２１８ 　２３３０９”−ｃｐｍＦＣ：フィダーセルズＣｆｅｅｄｅｒ　ｃｅｌｌｓ）ｃ ｐｍ：１０当たりの数 璽　べ１チＦ　：　ＬＬＲ，へＶＸミＳＹにＬ＾、Ｈ５ＩＩ−べ１＋Ｆ　：　Ｋ ＹＶＫＤＲＶＤＥ”ν］〕６、投与方法 本発明は、標準の薬学上の実務に従って、上記ポリペプチドのみを、またはいか なる薬学上許容し得る担体または希釈剤との組み合せで前記ポリペプチドを使用 して晴乳類を処置するための本発明の組換えまたは合成ポリペプチドの用途を網 羅する。 処置の方法は、気管、結膜、皮膚、腸管内、鼻腔内、経口または膣内投与のいか なる経路による前記ペプチドアレルゲンまたはその一部の投与を包含する。■使 用当たり１ピコグラムがら１０ミリグラムまでの範囲を使用し得る。一般に受け 入れられたガレノスの方法に従って、当業者に熟知された方法によって希釈剤お よび担体を選択し得る。診断法と同様、この方法は純粋で十分に確定したアレル ゲンを必要とする。精製組換えアレルゲンまたは合成ペプチドの用途は、歓迎さ れない成分に対して過敏になっている患者のリスクを大いに減じる。 ７、引用文献 上記明細書中で引用された文献 １、　ブライテネダ−（Ｂｒｅｉｔｅｎｅｄｅｒ）　、　Ｈ，、ペテンブルガー （Ｐｅｔｔｅｎｂｕｒｇｅｒ）、Ｋ６、ピトー（Ｂｉｔｏ）、Ａ６、バレンタ（ Ｖａｌｅｎｔａ）　、Ｒ−、クラフト（Ｋｒａｆｔ）　、　Ｄ、　、ルンボルド （Ｒｕｍｐｏｌｄ）　、Ｈ６ｓ　シャイナー（Ｓｈｅｉｎｅｒ）　、Ｏ，、ブラ イテンバッハ（Ｂｒｅｉｔｅｎｂａｃｈ）　、　Ｍ、（１９８９）。 カバ花粉の主要アレルゲンＢｅｔｖ　Ｉをコードする遺伝子は、エントウマメ病 抵抗応答遺伝子（ａ　ｐｅｒ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｇｅｎ ｅ）と高い相同性を有する。ＥＭＢＯＪ、　、８．１９３５−１９３８゜ ２、　イブセン（Ｉｐｓｅｎ）　、Ｈ，およびハンセン（Ｈ’ａｎｓｅｎ）、０ ゜Ｃ，（１９９０）、アレルゲンの物理化学的および免疫学的特性。Ｉｎニアド ビー性アレルゲンのエピトープ。七ホン（Ｓｅｈｏｎ）　、　Ａ、　Ｈ，、クラ フト（Ｋｒａｆｔ）　、　Ｄ、　、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）、Ｇ　、　（ｅｄ ｓ）　Ｕ　ＣＢ、グラッセル、ベルギー、ｐｐ。 ３−８゜ ３、　ルンボルド（Ｒｕｍｐｏｌｄ）　、　Ｈ，、ロアク（Ｒｏｈａｃ）　、Ｍ 、、ボーμ（Ｂｏｈｌｅ）　、Ｂ、　、ブライテンバッハ（Ｂｒｅｉｔｅｎｂａ ｃｈ）、Ｍｌ、シャイナー（Ｓｃｈｅｉｎｅｒ）、ｏｏ、クラフト（Ｋｒａｆｔ ）　、Ｄ。 （１９９０）、患者のＩｇＥによって認識されるＢｅｔｖｉエピトープとモノク ローナル抗−Ｂｅｔｖ　Ｉ抗体との関係、工ｎニアドビー性アレルゲンのエピト ープ、セオン（Ｓｅｈｏｎ）　、Ａ、　Ｈ，、クラフト（Ｋｒａｆｔ）　、　Ｄ 、　、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）、Ｇ、　、　（ｅｄｓ）ＵＣＢ、グラッセル、 ベルギー、ｐｐ２６−２８゜４、　バレンタ（Ｖａｌｅｎｔａ）、Ｒ１、ブライ テンダー（Ｂｒｅｉｔｅｎｅｄｅｒ）、Ｒ９、ペテンブルガー（Ｐｅｔｔｅｎｂ ｕｒｇｅｒ）、Ｋ１、ブライテンバッハ（Ｂｒｅｉｔｅｎｂａｃｈ）　、Ｍ、　 、シャイナー（Ｓｃｈｅｉｎｅｒ）、０８、クラフト（Ｋｒａｆｔ）　、Ｄ　、 （１９９０）。 カバ、ハンノキ、ハシバミおよびクマシデ類の花類の主要アレルゲンのＲＮＡ− およびＤＮＡ配列の相同性。工ｎニアドビー性アレルゲンのエピトープ。七ホン （Ｓｅｈｏｎ）　、Ａ、　Ｈ，、クラフト（Ｋｒａｆｔ）　、Ｄ、　、クンケル （１（ｕｎｋｅｌ）、Ｇ、　（ｅｄｓ）ＵＣＢ、ブラッセル、ベルギー、ｐｐ、 ７３−７６゜５、フロールパック（Ｆｌｏｒｖａａｇ）、Ｅｌ、およびエルサイ ド（Ｅｌｓａｙｅｄ）　、Ｓ　、（１９８４）　、樹木花粉アレルゲンの比較研 究。■。ハンノキ（Ａｉｎｕｓ　１ｎｃａｎａ）花粉抽出物の免疫学的特性、 Ｉｎｔ　％Ａｒｃｈ％Ａｌｌｅｒｇｙ　Ａｐｐｌ　Ｉｍａ＋ｕｎｏｌ、工５：　 ３００−３０８゜ ６、　フロールパック（Ｆｌｏｒｖａａｇ）、Ｅｏ、エルサイド（Ｅｌｓａｙｅ ｄ）、Ｓ９、アボルド（Ａｐｏｌｄ）　、Ｊ、（１９８２）　、樹木花粉アレル ゲンの比較研究、■。 ハンノキ（Ａｉｎｕｓ　１ｎｃａｎａ）花粉アレルゲンの単離。主たるアレルゲ ンｐＩ４．７８の精製と特性。 Ｉｎｔ　、　Ａｒｃｈ、　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ａｐｐｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、立ユニ ４９−５６゜７、トーツス（Ｔｈｏｍａｓ）、Ｗ、Ｒ，、チュ（Ｃｈｕａ）、Ｋ 。 Ｙｌ、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）、Ｗ、に、、およびスチュワード（Ｓｔｅｗａ ｒｔ）　、　Ｇ、　Ａ、（Ｌ　９９０）。 組換え小アレルゲン。Ｉｎニアドビー性アレルゲンのエピトープ。セホン（Ｓｅ ｈｏｎ）　、　Ａ、　Ｈ，、クラフト（Ｋｒａｆｔ）　、Ｄｌ、およびクンケル （Ｋｕｎｋｅｌ）、Ｇ　、　（ｅｄｓ）　Ｕ　ＣＢアレルギー研究所、グラッセ ル。 ８、　ジャロリム（Ｊａｒｏｌｉｍ）　、　Ｅ、　、テジクル（Ｔｅｊｋｌ）　 、Ｍｌ、ロアク（Ｒｏｈａｃ）　、　Ｍ、、シュレルカ（Ｓｃｈｌｅｒｋａ）、 Ｇ９、ブライテンバッハ（Ｂｒｅｉｔｅｎｂａｃｈ）、　Ｍ、、シャイナー（Ｓ ｃｈｅｉｎｅｒ）、○３、クラフト（Ｋｒａｆｔ）　、　Ｄ、、およびルンボル ド（Ｒｕｍｐｏｌｄ）、Ｈ，（１９８９）。 カバ花粉アレルゲンに対するモノクローナル抗体；イムノプロット法による特性 付けおよび主要アレルゲンＢｅｔｖ　Ｉの単工程アフィニティ精製への利用。 Ｉｎｔ　％Ａｒｃｈ％Ａｌｌｅｒｇｙ　Ａｐｐｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１旦：　５ ４−６０゜９、　ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）　、　Ｓ、　、　Ｂ、　 、ブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）、Ｃ，Ｄ、（１９７０）、二つのタンパク質のアミ ノ酸配列の相同性の調査に有効な一般的方法。Ｊ、Ｍｏｌ。 Ｂｉｏｌ、４８：４４３−４５３゜ １０、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）、Ｆ、　Ｍ、　（ｅｄ）　（１９８７）　 、分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ 　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）　Ｇｒｅｅｎ　Ｐｗｂｌｉｓｈｉｎｇ　 Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　：　Ｊ ｏｈｎ　ＷｉＬｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ　、ニューヨーク、Ｕｎｉｔ２、６． １１、　Ｉｂ１ｄ、、Ｕｎｉｔ　２．　１．１２、　Ｉｂ１ｄ、、Ｕｎｉｔ　３ ．　１０．１３、　Ｉｂ１ｄ、、Ｕｎｉｔ　１．　８．１４、　Ｉｂ１ｄ、、Ｕ ｎｉｔ　１゜ １５、クンケル０（ｕｎｋｅｌ）、Ｔ、Ａ、、ロバート（Ｒｏｂｅｒｔｓ）、Ｊ 、Ｄ、ザコール（Ｚａｋｏｕｒ）、Ｒ，Ａ、（１９８７）　、迅速かつ効果的な 表現型の選択なしのサイト−特異的突然変異の誘発。 Ｉｎ：酵素学における方法。 Ｖｏｌ、　１５４、ウー（Ｗｕ）、Ｒ１およびグロスマン（Ｇｒｏｓｓｍａｎ） 、Ｌ、（ｅｄｓ）　、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、　ｐ　ｐ　３６ ７−３８２゜１６、ナガイ（Ｎａｇａｉ）　、　Ｋ、　、ソーゼルセン　（Ｔｈ Φｇｅｒｓｅｎ）、Ｈ，Ｃ，（１９８４）。 Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、で作られた複合タンパクの配列特異的タンパ ク質加水分解によるγ−グロブリンの生成。Ｎａｔｕｒｅ配列リスト （１）一般情報 （ｉ）申請者　ハイモ・ブライテンダー（Ｄｒ、　Ｈｅｉｍｏ　Ｂｒｅｉｔｅｎ ｄｅｒ）アーノルド・ライケルストルフエル （Ｍａｇ、　Ａｒｎｏｌｄ　Ｒｅ１ｋｅｒｓｔｏｒｆｅｒ）ルドルフ・バレンタ 　（Ｄｒ、　Ｒｕｄｏｌｆ　Ｖａｌｅｎｔａ）カリシ・ホフマン−シンマーブル −バー（Ｍｒｓ、　Ｄｒ、　Ｋａｒｉｎ　Ｈｏｆｆｍａｎ−３ｏｍｍｅｒｇｒｕ ｂｅｒ）ミカエル・ブライテンバッハ （Ｄｒ、　Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｂｒｅｉｔｅｎｂａｃｈ）ディートリッヒ・クラフ ト （Ｄｒ、　Ｄｉｅｔｒｉｃｈ　Ｋｒａｆｔ）ヘルムート・ルンボルド （叶、　Ｈｅｌｍｕｔ　Ｒｕｍｐｏｌｄ）オツド・シャイナー　（Ｄｒ、０ｔｔ ｏ　５ｃｈｅｉｎｅｒ）（ｉｉ）発明の名称　ハンノキの花粉のアレルゲンおよ びその用途 （ｉｉｉ）配列の数　２３ （ｉｖ）連絡先住所 （Ａ）住　所　ベニ−・アンド・エドモンズ（ＰｅｎｎｉｅＥｄｍｏｎｄｓ） （Ｂ）通　リ　ザ・アメリカス・オブ・アベニュー（Ｅ）国　米国 （Ｆ）ＺＩＰ：Ｉ−ド　１００３６ （ｖ）コンピュータ読み取り可能フオーム（Ａ）媒体のタイプ　フロッピーディ スク（Ｂ）コンピュータ　ＩＢＭ　ＰＣコンバーティブル（Ｃ）オペレイティン グシステム　ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア　ヮードパーフェクト　５．１（ ｖｉ）出願データ （Ａ）出願番号　０７／６８３，８３１ｆＢ）出願日　１９９１年４月１１日 （Ｃ）分類 （νｉｉ）弁理士／代理人　情報 ＆（Ａ）氏　名　八り−・シー・ジョーンズ、■（Ｈａｒｒｙ　Ｃ，Ｊｏｎｅｓ 、　ＩＩＩ）（Ｂ）登録番号　２０，２８０ （Ｃ）照会／事件番号　６５３０−００９（ｖｉｉｉ）電信情報 （Ａ）電話　（２１２）７９０−９０９０（Ｂ）テレファックス（２１２）８６ ９−９７４１／８８６４（２）配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　）　１（ ｉ）配列特性 （Ａ）鎖　長　６６５ヌクレオチド （Ｂ）タイプ　核　酸 （Ｃ）鎖性　単鎖 （Ｄ）形態　線状 （ｉｉ）分子タイプ　ｍ　ＲＮ　ＡのｃＤＮＡ（ｉｉｉ）仮定部分　な　し くｉｖ）アンチセンス　な　し くｖ）起源 （Ａ）生　物　ハンノキ（ハンノキ属の種（Ａｉｎｕｓ　ｓｐ、））（ｖｉ）配 列内容　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１（３）配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　 ）　２（ｉ）配列特性 （Ａ）鎖　長　４８０ヌクレオチド （Ｂ）タイプ　核　酸 （Ｃ）鎖性　単鎖 ＣＤ）形°・態　線状 （ｉｉ）分子タイプ　ｍ　ＲＮ　ＡのｃＤＮＡ（ｉｉｉ）仮定部分　な　し くｉｖ）アンチセンス　な　し くＶ）起源 （Ａ）生　物　ハンノキ（ハンノキ属の種（Ａｉｎｕｓ　ｓｐ、））（ｖｉ）配 列内容　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　２（４）配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、 　）　３（ｉ）配列特性 （Ａ）鎖　長　１６０アミノ酸 （Ｂ）タイプ　アミノ酸 （Ｄ）形態　線状 （ｉｉ）分子タイプ　ポリペプチド （ｉｉｉ）仮定部分　な　し くｖｉ）起源 （Ａ）生　物　ハンノキ（ハンノキ属の種（Ａｉｎｕｓ　ｓｐ、））（ｘｉ）配 列内容　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　３１−１ｅｔ　Ｇｌｙ　Ｖｉｌ　Ｐｈｅ入ａｎ 　Ｔｙｒ　Ｃ１ｕ入１ａ　Ｇｌｕτｈｒ　ｌ’ｒ口Ｓａｔ　Ｖａｌ　工１ａ　Ｐ ｒｏ＾１＆ｌ　Ｓ　１０　１５ 人工＆λｘｇ　Ｌｅｕ　Ｐｈ＠’Ｌｙｅ　入１ａ　Ｐｈａ　工１ａ　Ｌｅｕ　＾ ｓｐ　ＧＬｙ　入ｓｐ　Ｌｙｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。 ２０　２５　３Ｑ Ｌｙｅ　Ｖａｌ　入１ａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　入１ａ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　５ｅｒ　 Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　ｒｌｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　入５ｎｃｌｙ　Ｇｌｙ　ｐ ｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ工１＠Ｌｙｅ　Ｌｙｇ　ｒｌｅ　Ｔｈｒ　ｐｈ偕Ｐｒｏ　 Ｃ１ｕ　Ｃ１ｙ　５ｅ＝　Ｐｒ。 Ｐｈａ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　ＶＪＬＩ　Ｌｙｓ　（Ｌｕ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　入ｓｐ 　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　入ｓｐ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｐｈ■ ＬＹＩＩ　Ｔｙｒ　Ｓａｔ　Ｐｈ曾　Ｓｅｘ：　ＶａＬ　工Ｌｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌ ｙ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　入ｓｐ　人工ｈ　Ｌ■■ Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　ＶｉＬ　Ｃｙｉ　入ｇｎ　Ｇｌｕ　工１ｅ　Ｌｙｅ　工１ａ　 ＶａＬ　入１ａ入１ａ　Ｐｒｏ　入＊ｐ　Ｃ１ｙ　Ｇｌｙｌｏｏ　１０５　１１ ０ ５ｅｒ　エエ命Ｌ＊ｕ　Ｌｙｅ　工ｌａ　Ｓｅｒ　入ｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　１ （１ｓ　丁ｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　入ｇｐ　ＨＬｓ　Ｃ１ｕ工１ａ　入ｓｎ　入 １ａ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　工ｌｅ　ＬＹ！ｌ　工１ｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　ＧＬｕ　 Ｌｙｍ　入１ａ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌａ■ Ｌａｕ　Ｌｙｅ　入１ａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　 入ｌｘ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　入ｓｐ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　入５ｎ（５）配列認識番号 （ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、）４（ｉ）配列特性 （Ａ）鎖　長　５０ヌクレオチド ＣＢ）タイプ　核　酸 （Ｃ）錆性　単鎖 （Ｄ）形態　線状 （ｉｉ）分子タイプ　他の核酸−合成 （ｉｉｉ）仮定部分　あ　リ （ｉｘ）特徴 （Ａ）その他の情報　逆転写のプライマー（ｘｉ）配列内容　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ ｏ、　４丁τＴ入入τへＣＣ入　ＣＴＣＡＣＴ入τ入Ｇ　入τｃｒｃｃｃｃｃａ 　入入ＧＣτＴ丁ττ丁　Ｔτττττ丁丁ττ　５０（６）配列認識番号（Ｓ ＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　）　５（ｉ）配列特性 （Ａ）鎖　長　２３ヌクレオチド （Ｂ）タイプ　核　酸 （Ｃ）錆性　単鎖 （Ｄ）形態　線状 （ｉｉ）分子タイプ　その他の核酸−合成（ｉｉｉ）仮定部分　あり （ｖｉ）起源 （Ａ）個体／単離物　２４８２ （ｉｘ）特　徴 （Ｄ）その他の情報　ＡｌｎｇＩ　ｍＲＮＡの５′末端で利用されるポリメラー ゼ連鎖反応（ＰＣＲ） のプライマー （ｘｉ）配列内容　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、５Ｇτｒｒｒ口入入ττ　入ＣＣλＡ にＣＧｃ入λ入Ｃ２３（７）配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　）　６（ｉ ）配列特性 （Ａ）鎖　長　２３ヌクレオチド （Ｂ）タイプ　核　酸 （Ｃ）錆性　単鎖 （Ｄ）形態　線状 （ｉｉ）分子タイーブ　その他の核酸−合成（ｉｉｉ）仮定部分　あ　リ （ｖｉ）起源 （Ａ）個体の単離物　２４９０ （ｉｘ）特　徴 （Ａ）その他の情報　Ａｌｎｇ　Ｉ　ｍ　ＲＮ　Ａの５′末端で活性化されたポ リメラーゼ連鎖反応のプライ マー （ｉｘ）配列内容　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　６ＧＴＴＴ’ＴｃＡＡＴＴ　入ＣＧ ＡＡＣＣＧＧＡ　にＡＣ２コ（８）配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　）　 ７（ｉ）配列特性 （Ａ）鎖　長　１４ヌクレオチド （Ｂ）タイプ　核　酸 （Ｃ）錆性　単鎖 （Ｄ）形態　線状 （ｉｉ）分子タイプ　その他の核酸−合成（ｉｉｉ）仮定部分　あ　リ （ｉｘ）特徴 （Ｄ）その他の情報　Ａｌｎｇ　Ｉ　ｍ　ＲＮ　Ａの３′末端で利用されるポリ メラーゼ連鎖反応のプライ マー （ｘｉ）配列内容　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　７鮎τ＾工＾ＣＴＣＡＣ？＾　１４ （９）配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、）８（ｉ）配列特性 （Ａ）鎖　長　４０ヌクレオチド （ＢＪタイプ　核　酸 （Ｃ）錆性　単鎖 （Ｄ）形態　線状 （ｉｉ）分子タイプ　その他の核酸−合成（ｉｉｉ）仮定部分　あ　リ （ｘｉ）配列内容　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　８ＣＴＴＣＩＩ：Ｔ入入τ’ｒ　Ｇ λ入ＡＡ（ＪＣＣＣ＾τＧ入入丁’ｒｃｃｃ　＾τ入ＣＣＧＴＣＣ入　４゜配列 認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、）９（ｉ）配列特性 （Ａ）鎖　長　６１９ヌクレオチド （Ｂ）タイプ　核　酸 （Ｃ）錆性　単鎖 （Ｄ）形態　線状 （ｉｉ）分子タイプ　ｍＲＮＡのｃ　ＤＮＡ（、ｉ　ｉ　ｉ　）仮定部分　な　 し くｉｖ）アンチセンス　な　し くＶ）断片タイプ　不明 （ｖｉ）起源 （Ａ）生　物　ハシバミ（ハシバミ属の種（Ｃｏｒｙｌｕｓ　ｓｐ、））（ｖｉ ｉ）直接のソース （Ａ）アレルゴン社（Ａｌｌｅｒｇｏｎ　ＡＢ）　（エンゲルボルム、スウェー デン（ＥＮＧＥＬＨｏＬＭ、　５ＷＥＤＥＮ）　）　カラ得た花粉（ｖｉｉｉ） ゲノム中の位置　不明 （ｉｘ）特　徴　不明 （ｘ）出版物の情報　不明 （ｘｉ）配列内容　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　９配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ ｏ、　）　１０（ｉ）配列特性 （Ａ）鎖　長　４８０ヌクレオチド （Ｂ）タイプ　核　酸 （Ｃ）錆性　単鎖 ＣＤ）形態　線状 （ｉｉ）分子タイプ　ｍＲＮＡのｃＤＮＡ（ｉｉｉ）仮定部分　な　し くｉｖ）アンチセンス　な　し くＶ）断片タイプ　不明 （ｖｉ）起源 コｐ、）） （ｖｉｉｌ直接のソース （Ａ）アレルゴン社（Ａｌｌｅｒｇｏｎ　ＡＢ）　（−ｒ−ンゲルホルム、スウ ェーデン（ＥＮＧＥＬ）（ＯＬＭ、　５ＷＥＤＥＮ）　）がら得た花粉（ｖｉｉ ｉｌゲノム中の位置　不明 （ｉｘ）特　徴　不明 （ｘ）出版物の情報　不明 （ｘｉ）配列内容　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１０配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ ｏ、）１１（ｉ）配列特性：ＣｏｒａＩ　５（ｃ）（Ａ）鎖　長　１６０アミノ 酸 （Ｂ）タイプ　アミノ酸 （Ｃ）形態　線状 （ｉｉ）分子タイプ　ボリベブチド （ｉｉｉ）仮定部分　な　し くｉｖ）アンチセンス　不明 （ｖ）断片タイプ　不明 （ｖｉ）起源 （Ａ）生　物　ハシバミ（ハシバミ属の種（Ｃｏｒｙｌｕｓ　ｓｐ、））（ｖｉ ｉ）直接のソース （Ａ）アレルゴン社（Ａｌｌｅｒｇｏｎ　ＡＢ）　（エンゲルホルム、スウェー デン（ＥＮＧＥＬＨＯＬＭ、　５ＷＥＤＥＮ）　）から得た花粉（ｖｉｉｉ）ゲ ノム中の位置　不明 （Ｌｘ）特　徴　不明 （ｘ）出版物の情報　不明 （ｘｉ）配列内容　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１１１　２　３　４　５　６　７　Ｂ 　９１０１１１２ｉ３１４１ＳＩｎｔ　ＧＡＹ　ＶＪＬＩ　Ｐｈｅ　入ａｎ　Ｔ ｙｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｃ１ｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｔ　Ｖａｌ　Ｉｌａ　Ｐ ｒ。 λｂ 工１ｍ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　λｌａ　ｆ’ｒｏ　Ｇｉｎ　入Ｌａ　工１・ 　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　入ａｎ　ＶＪＬＩ４６　４７　４８　４９ 　５０　５１　５２　５３　５４　５５　５６　Ｓフ　５Ｅ１　５９　６０Ｇｌ ｕ　Ｇｌｙ　入ｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　工１ｍ　Ｌｙ ｓ　Ａ露ｒｌ　ＩＩ−Ｔｈｒ　Ｐｈ偕　Ｇｌｙ６１　６２　６３　６４　６５　 ６６　６７　６８　６９　フＯ７１７２７３７４７５Ｃ１ｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　 入ｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　（：ｌｕ　入ｒｇ　Ｖａｎ 　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｖ＆１Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｇｎ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　 Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　ＶａＬ　工１ｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　入５ｐＶ ａｌ　Ｌ＠ｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｚ、ｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　ＶａＬ　 Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　Ｃ１ｕ　Ｌａｕ　Ｌｙｇ　工１ｅ１０６　１０７　１０ｇ　１ ０９　ｉｌｏ　ｉｌｌ　１１２　１ユ３　ユ１４　１１５　１１６　１１７　１ １１１　ユ１９　１２０Ｖａｌ　入１＆入１ａ　Ｐｒｏ　Ｃ１ｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌ ｙ　Ｓｅｒ　１１ｍ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　工ｌ＊　Ｓａｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ１２１ 　１２２　１２３　１２４　１２５　１２６　１２７　１２Ｂ　１２９　１３０ 　１３１　１３２　１３３　１３４　Ｄ５Ｐｈａ　Ｈｉｓ　λＬａ　ＬｙｍＧｌ ｙ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　工１ｅ入ａｎ　入Ｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ 　Ｌｙｓユ３６　ユ３７　１３８１３９　１４０　１４１　１４２　１４３　１ ４４　１４５　１４６　１４７　１４８　１４９　１５０ＧＩＹ　人工龜Ｌｙｓ 　ＧＬｕ　Ｍｔ　λｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｙｍ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　入；９八１ＪＬ　 ＶａＬ　ＧＬｕ　ＴｈｒＱｒ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　λＩＪＬ　ＨＬｍ　Ｓａｒ　入 Ｌａ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　＾ｓｎ配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　）　１２ （ｉ）配列特性 （Ａ）鎖　長　７４２ヌクレオチド （Ｂ）タイプ　核　酸 （Ｃ）錆性　単鎖 （Ｄ）形態　線状 （ｉｉ）分子タイプ　ｍＲＮＡのｃＤＮＡ（ｉｉｉ）仮定部分　な　し くｉｖ）アンチセンス　な　し くｖ）断片タイプ　不明 （ｖｉ）起源 （Ａ）生　物　ハシバミ（ハシバミ属の種（Ｃｏｒｙｌｕｓ　ｓｐ、））（ｖｉ ｉ）直接のソース （Ａ）アレルゴン社（Ａ１１℃ｒｇｏｎ　ＡＢ）　（エンゲルホルム、スウェー デン（ＥＮＧＥＬＨＯＬＭ、　５ＷＥＤＥＮ）　）から得た花粉（ｖｉｉｉ）ゲ ノム中の位置　不明 （ｉｘ）特　徴　不明 （ｘ）出版物の情報　不明 （ｘｉ）配列内容　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１２配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ ｏ、　）　１３（ｉ）配列特性 （Ａ）　Ｉｌ　長　４８０ヌクレオチド（Ｂ）タイプ　核　酸 （Ｃ）錆性　単鎖 （Ｄ）形態　線状 （ｉｉ）分子タイプ　ｍＲＮＡのｃＤＮＡ（ｉｉｉ）仮定部分　な　し くｉｖ）アンチセンス　な　し くＶ）断片タイプ　不明 （ｖｉ）起源 （Ａ）生　物　ハシバミ（ハシバミ属の種（Ｃｏｒｙｌｕｓ　ｓｐ、））（ｖｉ ｉ）直接のソース （Ａ）アレルゴン社（Ａｌｌｅｒｇｏｎ　ＡＢ）　（エンゲルホルム、スウェー デン（ＥＮＧＥＬＨＯＬＭ、　５ＷＥＤＥＮ）　）から得た花粉（ｖｉｉｉ）ゲ ノム中の位置　不明 （ｉｘ）特　徴　不明 （ｘ）出版物の情報　不明 （ｘｉ）配列内容　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１３配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ ｏ、　）　１４（ｉ）配列特性 （Ａ）鎖　長　１６０アミノ酸 （Ｂ）タイプ　アミノ酸 （Ｃ）形態　線状 （ｉｉ）分子タイプ　ポリペプチド （ｉｉｉ）仮定部分　な　し くｉｖ）アンチセンス　不明 （Ｖ）断片タイプ　不明 （ｖｉ）起源 （Ａ）生　物　ハシバミ（ハシバミ属の種（Ｃｏｒｙｌｕｓ　ｓｐ、））（ｖｉ ｉ）直接のソース （Ａ）アレルゴン社（Ａｌｌｅｒｇｏｎ　ＡＢ）　（エンゲルホルム、スウェー デン（ＥＮＧＥＬＨＯＬＭ、　５ＷＥＤＥＮ）　）から得た花粉（ｖｉｉｉ）ゲ ノム中の位置　不明 （ｉｘ）特　徴　不明 （ｘ）出版物の情報　不明 （ｘｉ）配列内容　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１４Ｍｅｔ　ＧＬｙ　ＶａＬ　Ｐｈａ 　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　ＶＪＬ Ｌ工Ｌａ　Ｐｒ。 １６　１７　１８　１９　２０　２１　２２　２３　２４　２５　２６　２７　 ２Ｂ　２９　３０人ＩＪＬ　入１ａ入ｒｇ　Ｌａｕ　Ｐｈａ　Ｌｙｓ　５ｅｒ　 Ｔｙｒ　ＶＪＬＬ　Ｌａｕ　入ｓｐ　Ｇｌｙ　入ｉｐ　Ｌｙｓ　Ｌ＠ＩｕＺｌ＠ 　Ｐｒｏ　Ｌｙｅ　ＶａＬ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　ＧＬｎ　入１＆　工１＊　Ｔｈｒ 　Ｓｉｒ　Ｖａｌ　（：ｌｕ　λＩｎ　Ｖ＆１４６　４７　４８　４９　Ｓｏ　 ５１　５２．５３　５４　５５　５６　５７　５８　５９　６０Ｇｌｕ　ＣＬｙ 　八ａｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒ：ｏ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　工Ａｌｌ　Ｌｙｅ　入 ｓｎ　Ｈｌｍ　Ｔｈｒ　Ｐｈａ　Ｇｌｙ６１、６２　６３　６４　６５　６６　 ６７　６８　６９　７０　７１　７２　７３　７４　７５Ｃ１ｕ　ＣＬｙ　５ｔ ａｒ　入ｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｙｅ　Ｔｙｒ　ＶＪＬＩ　Ｌｙｅ　Ｇｌｕ　入ｒｇ　 ＶａＬ　入ｇｐ　Ｇｌｕ　Ｖａ１７６　７７　１８　７９　８０　８ｄ　８２　 ８３　８４　ＢＳ　８６　８７　８１１　８９　９０人ｆｉｐ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ 　入ｓｎ　Ｐｈａ　Ｌｙｅ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　丁ｈｒ　Ｖａｌ　Ｉｌａ 　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　入５ｐ９１　９２　９３　９４　９５　９６　９７　９１１ 　９９　１００１ｏｌ　１０２１０３１０４１０５Ｖ＆Ｌ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ入ｓ ｐ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｅ　ＶａＬ　Ｃｙｓ　Ｓａｒ　（：ｌｕ　Ｌ ａｕ　Ｌｙｅ　工１ｅ１０６　１０７　１ｏｌｌ　１０９　ｉｌｏ　１１１　１ １２　１１３　１１４　１１５　１１６　１１〕　１１８　１１９　１２０Ｖａ Ｌ　入１ａ入り龜Ｐｒｏ　ＧＬＹ　ＧＩＹ　ＧＬＹ　Ｓｅｔ　Ｈｌｍ　Ｌｅｕ　 Ｌｙｅ　工ｌ＊　５ａｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ１２１１２２１２３１２４１２５　１ ２６１２７１２８１２９１３０１３１１３２１３３　Ｄ４１３５Ｐｈａ　Ｈｉｓ 　入Ｌａ　Ｌｙｅ　Ｇｌｙ　Ａｍｐ　Ｈｌｓ　Ｃ１ｕ　工１・入１ｎ入１ａ　Ｇ ｌｕ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｌｙｅ１３６　１３フ　１３８　Ｄ９　１４０　１４１ 　１４２　１４３　１４４　ユ４５　１４６　１４フ　１４１ｉ１　１４９　１ ５０ＧＬｙ　Ａｌａ　Ｌｙｇ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　入Ｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｙｅ　Ｌ＠ ｕ　Ｌｅｕ　λｒｑλｌａ　ｖａＬ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ１５１　１５２　：ｔＳ３ 　１５４　１５５　１５６　１５７　１５１１　：１５９　１６０Ｔｙｒ　Ｉ、 ＠ｕ　Ｌａｕ　入１ａ　Ｈｌｍ　Ｓｅｒ　λＩＪＬ　Ｃ１ｕ　Ｔｙｒ　λａｎ配 列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　）　１５（ｉ）配列特性 （Ａ）鎖　長　６５５ヌクレオチド （Ｂ）タイプ　核　酸 （Ｃ）錆性　単鎖 （Ｄ）形態　線状 （ｉｉ）分子タイプ　ｍＲＮＡのｃＤＮＡ（ｉｉｉ）仮定部分　な　し くｉｖ）アンチセンス　な　し くｖ）断片タイプ　不明 （ｖｉ）起源 （Ａ）生　物　ハシバミ（ハシバミ属の種（Ｃｏｒｙｌｕｓ　ｓｐ、））（ｖｉ ｉ）直接のソース （Ａ）アレルゴン社（Ａｌｌｅｒｇｏｎ　ＡＢ）　（エンゲルホルム、スウェー デン（ＥＮＧＥＬＨＯＬＭ、　５ＷＥＤＥＮ）　）から得た花粉（ｖｉｉｉ）ゲ ノム中の位置　不明 （ｉｘ）特　徴　不明 （ｘ）出版物の情報　不明 （ｘｉ）配列内容　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１５入ＴＧＧＧＴＧＴＴＴ　τＣ入入 ｒｒ入ＣＧ八へＣＣＣτＧ八ｑ八Ｃへ　へへＣＣＴＣＣＧＴτへ　ＴＣＣＣＴＧ ＣＧＧＣＳ。 配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　）　１６（ｉ）配列特性 （Ａ）鎖　長　４８０ヌクレオチド （Ｂ）タイプ　核　酸 （Ｃ）錆性　単鎖 （Ｄ）形態　線状 （ｉｉ）分子タイプ　ｍＲＮＡのｃＤＮＡ（ｉｉｉ）仮定部分　な　し くｉｖｌアンチセンス　な　し くＶ）断片タイプ　不明 （ｖｉ）起源 （Ａ）生　物　ハシバミ（ハシバミ属の種（Ｃｏｒｙｌｕｓ　ｓｐ、））（ｖｉ ｉ）直接のソース （Ａ）アレルゴン社（Ａｌｌｅｒｇｏｎ　ＡＢ）　（エンゲルホルム、スウェー デン（ＥＮＧＥＬＨＯＬＭ、　５ＷＥＤＥＮ）　）から得た花粉（ｖｉｉｉ）ゲ ノム中の位置　不明 （ｉｘ）特　徴　不明 （ｘ）出版物の情報　不明 （ｘｉｌ配列内容　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１６τＡ（：Ｃ’ｒλＴＴＧＧ　ＣＡ ＣＡＣＴＣ？ＧＣＴにＡＡ丁入ＣＡλＣ４１１０配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　 Ｎｏ、　）　１７（ｉ）配列特性 （Ａ）鎖　長　１６０アミノ酸 （ＢＪタイプ　アミノ酸 （Ｃ）錆性　単鎖 （Ｄ）形態　線状 （ｉｉ）分子タイプ　ポリペプチド （ｉｉｉ）仮定部分　な　し くｉｖ）アンチセンス　不明 （ｖ）断片タイプ　不明 （ｖｉ）起源 （Ａ）生　物　ハシバミ（ハシバミ属の種（Ｃｏｒｙｌｕｓ　ｓｐ、））（ｖｉ ｉ）直接のソース　。 （Ａ）アレルゴン社（Ａｌｌｅｒｇｏｎ　ＡＢ）　（エンゲルホルム、スウェー デ”、／　（ＥＮＧＥＬＨＯＬＭ、　５ＷＥＤＥＮ）　）　カラ得た花粉（ｖｉ ｉｉ）ゲノム中の位置　不明 （ｉｘ）特　徴　不明 （ｘ）出版物の情報　不明 （ｘｉ）配列内容　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１７ｚ　２　３　４　５　６　７　８ 　９１０１１１２１３１４ｘＳＭｇｔ　ＧＡＹ　ＶＪＬＩ　Ｐｈａ　入ｍｎ　Ｔ ｙｒ　Ｇｌｕ　入ＩＪＬ　Ｃ１ｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｘ　Ｖａｌ　！ｌ＊　 Ｐｒ。 Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｐｈｓ　Ｌｙｓ　５ａｒ　Ｔｙｒ　ＶａＬ　 Ｌｅｕ　λ！ｐ　ＧＬｙ　λｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ３工　３２　３３　３４　３ ５　３６　３７　３１１　３９　４０　４ユ　４２　４３　４４　４５！１ｍ　 Ｐｒｏ　Ｌｙｍ　Ｍａｌ　入Ｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　入１ｍ　ＸＬ＊　Ｔｈｒ　 Ｓｓｒ　Ｖａｌ　にｌｕ　入ａｎ　Ｖａ１４６　４７　４８　４９　Ｓｏ　５１ 　５２　５３　５４　５５　５６　５７　５１ｉ１　５９　６０Ｃ１ｕ　ＧＬｙ 　入ａｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｉ’ｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　ＩＩｓ　Ｌｙｓ　＾１ ｎ　工１ａ　Ｔｈｒ　Ｐｈａ　Ｃ１ｙ６１　６２　６３　６４　６５　６６　６ ７　Ｃ８６９７０７１７２７３７４７５Ｃ１ｕ　Ｇｌｙ　Ｓａｔ　入ｒｇ　Ｔｙ ｒ　Ｌｙｅ　Ｔｙｒ　Ｖｉｌ　Ｌｙｅ　Ｃ１ｕ　入ｒｇ　Ｖｉｌ　入ｇｐ　Ｇｌ ｕ　ＶｔＬ７６　７フ　７８　７９　８０　８Ｌ　８２　１１３　８４　Ｂ５　 ８６　８７　８８　８９　９０人ｇｐ　Ａ＋ｎ　Ｔｈｒ　八ｓｎ　Ｐｈｅ　Ｔｈ ｒ　Ｔｙｒ　Ｓｅ！″Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｖｈｌ　１１ｅ　Ｃ１ｕ　Ｇｌｙ　入５ ｐ９１　９２　９Ｚ　９４　９５　９６　９７　９８　９９　１００１０１１０ ２１０１　１０４１０５ＶｉＬ　Ｉ、ａｕ　Ｃ１ｙ　Ａｓｐ　Ｌｙｅ　Ｌａｕ　 Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｃ−ｙｍ　Ｈｌ　にｌｕ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　工１ｅ１ ０６　ユ０フ　１０８　１０９　ユ１０　１１１　ｉｉ２　１１３　１１４　： １１Ｓ　１１６　１１７　ユ１８　工１９　１２０ｖａｌ　入１ａ入１ａ　Ｐｒ ｏ　Ｇｌｙ　Ｃ１ｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｘ　Ｉｌ＠Ｉ、ｅｕ　Ｌｙｓ　工ｌ＠　５ｅ ｒ　ｓａｒ　Ｌｙｓユ２１　ユ２２　ユ２３　１２４　１２５　！２６　ユ２７ 　１２４　１２９　ユコ０　１３１　１３２　１３３　１３４　１３５Ｐｈｅ　 Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　ＧＬｙ　入＊ｐ　ｋｌｉｇ　にｍｕ　エエｅ　入ｓｎ 　Ａｌａ　にｌｕ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ１３６　ｉ３７　Ｌ３１３　１３９ 　１４０　１４１　１４２　１４３　１４４　１４５　１４６　１４７　１４８ １４９　１５０Ｃ１ｙ　入１ａ　Ｌｙｔｔ　Ｇｌｕ　Ｍａｔ　入１ａ　Ｇｌｕ　 Ｌｙｇ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　ｌｒｇ　入１ａ　Ｖｉｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ配列・認識 番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　）　１８（ｉ）配列特性 （Ａ）鎖　長　８６０ヌクレオチド （Ｂ）タイプ　核　酸 （Ｃ）調性　単鎖 （Ｄ）形態　線状 （ｉｉ）分子タイプ　ｍＲＮＡのｃＤＮＡ（ｉｉｉ）仮定部分　な　し くｉｖ）アンチセンス　な　し くｖ）断片タイプ　不明 （ｖｉ）起源 （Ａ）生　物　ハシバミ（ハシバミ属の種（Ｃｏｒｙｌｕｓ　ｓｐ、））（ｖｉ ｉ）直接のソース （Ａ）アレルゴン社（Ａｌｌｅｒｇｏｎ　ＡＢ）　（ｒ−ンゲルホルム、スウェ ーデン（ＥＮＧＥＬＨＯＬＭ、　５ＷＥＤＥＮ）　）から得た花粉（ｖｉｉｉ） ゲノム中の位置　不明 （ｉｘ）特　徴　不明 （ｘ）出版物の情報　不明 （ｘｉ）配列内容　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１８入ＴＧＧＧＴＧＴＴＴ　ＴＣ入入 Ｔτ入ＣＧ＾　ＧＯ’ｒＴＧ八Ｇ＾ＣＣへ　ＣＣＣτＣＣＣτ丁Ａ　丁ＣτＣλ ＧＣＧＣ；ＣＳ。 配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　）　１９（ｉ）配列特性 （Ａ）鎖　長　４８０ヌクレオチド （Ｂ）タイプ　核　酸 （Ｃ）調性　単鎖 （Ｄ）形態　線状 （ｉｉ）分子タイプ　ｍＲＮＡのｃＤＮＡ（ｉｉｉ）仮定部分　な　し くｉｖ）アンチセンス　な　し くｖ）断片タイプ　不明 （ｖｉ）起源 （Ａ）生　物　ハシバミ（ハシバミ属の種（Ｃｏｒｙｌｕｓ　ｓｐ、））（ｖｉ ｉ）直接のソース （Ａ）アレルゴン社（Ａｌｌｅｒｇｏｎ　ＡＢ）　（エンゲルホルム、スウェー デン（ＥＮＧＥＬＨＯＬＭ、　５ＷＥＤＥＮ）　）から得た花粉（ｖｉｉｉ）ゲ ノム中の位置　不明 （ｉｘ）特　徴　不明 （ｘ）出版物の情報　不明 （ｘｉ）配列内容　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１９配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ ｏ、　）　２０（ｉ）配列特性 （Ａ）鎖　長　１６０アミノ酸 （Ｂｌタイプ　アミノ酸 （Ｃ）調性　単鎖 （Ｄ）形態　線状 （ｉｉ）分子タイプ　ポリペプチド （ｉｉｉ）仮定　なし くｉｖ）アンチセンス　不明 （Ｖ）断片タイプ　不明 （ｖｉ）起源 （Ａ）生　物　ハシバミ（ハシバミ属の種（Ｃｏｒｙｔｕｓ　ｓｐ、））（ｖｉ ｉ）直接のソース （Ａ）アレルゴン社（Ａｌｌｅｒｇｏｎ　ＡＢ）　（エンゲルホルム、スウェー 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　１６０↑ｙｒ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ入ＩＪＬ　ＨＬｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　入１ａ　 Ｔｙｒ　入ｇｎ図　面 図　２ ｋＤ　ＢＮ１２３４５６７８９ ｋＤ　ＢＮ１２３４　５６７８９ ６９．０＞ ｋＤ　ＢＮ１２３４５６７８９ 轡 ６９．０）− ３０，０＞ ２１．５＞ １４．３＞　−１１−・１ ｋＤ　Ｂ　Ｎ　１２３　４５６７８９ ６９．０＞ ３０．０Ｔｈ ｋＤ　ＢＮｌ　２３４　５６７８９ ３０．０） ６９．０＞ ム ｋＤ　ＢＮ１２３４５６７８９ ６９．０ｍ− ム ｋＤ　ＢＮ１２３４５６７８９ ｒＢｅｔｖｌ　ＢＳＡ　Ｂ ｋＤ　１２３４５ＣＢ　１２３４５ＣＢ　１２３４５ＣＢ要約書 本発明は、ハンノキ類Ａｉｎｕｓ　ｓｐ、のアレルゲンＡ１ｎｇＩ、ハシバミの アレルゲンＣａｒ　ａ　Ｉ、カバおよびブナ目の地の植物のアレルゲンＢｅｔｖ Ｉの抗原性を示すポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子およびそのような りＮＡ配列と緊縮条件下でハイブリダイズする核酸または遺伝子コードの縮重に よりそのような配列から派生する配列とともに、それらの少な（とも１つのエピ トープよりなるポリペプチドを提供する。 国際調査報告 国際調査報告

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. １．ブナ目の木のアレルゲンの少なくとも１種のエピトープを有するポリペプチ ドをコードするＤＮＡを含み、該アレルゲンがＡｌｎｇＩ、ＣｏｒａＩあるいは ＢｅｔｖＩよりなる群から選ばれる組換えＤＮＡ分子。
2. ２．前記アレルゲンＡｌｎｇＩ、ＣｏｒａＩまたはＢｅｔｖＩが、カバ、ハンノ キ、ハシバミおよびナラ類よりなる群から選ばれる請求項１の組換えＤＮＡ分子 。
3. ３．前記アレルゲンのエピトープが、以下の群から選ばれたアミノ酸配列を有す る請求項１の組換えＤＮＡ分子。 【配列があります】
4. ４．配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．）２で示されるヌクレオチド配列に少 なくとも６０％の相同性を有する請求項１の組換えＤＮＡ分子。
5. ５．前記アレルゲンが、ハンノキのＡｌｎｇＩアレルゲンである請求項１の組換 えＤＮＡ分子。
6. ６．ポリペプチドのコードが、ＡｌｎｇＩアレルゲンの全アミノ酸配列を有する 請求項１、２、３、４または５の組換えＤＮＡ分子。
7. ７．ポリペプチドのコードが、配列認識番号（ＳＥＱＩＤ　Ｎｏ．）３により配 列リストで定義されたアミノ酸配列の全部または一部を有する請求項５の組換え ＤＮＡ分子。
8. ８．前記アレルゲンがハシバミのＣｏｒａＩアレルゲンである請求項１の組換え ＤＮＡ分子。
9. ９．ＣｏｒａＩアレルゲンの全アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする 請求項１または８の組換えＤＮＡ分子。
10. １０．配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．）１０、１３、１６および１９で示 されるヌクレオチド配列と少なくとも６０％の相同性を有する請求項１の組換え ＤＮＡ分子。
11. １１．配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．）１１、１４、１７および２０によ って配列リストで定義されたアミノ酸配列の全部または一部を有するポリペプチ ドをコードする請求項８の組換えＤＮＡ分子。
12. １２．前記アレルゲンが、カバのＢｅｔｖＩアレルゲンである請求項１の組換え ＤＮＡ分子。
13. １３．配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．）２２で示されるヌクレオチドと少 なくとも６０％の相同性を有する請求項１の組換えＤＮＡ分子。
14. １４．配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．）２３で定義されたアミノ酸配列の 全部または一部を有するポリペプチドをコードする請求項１２の組換体ＤＮＡ分 子。
15. １５．請求項３に記載したアレルゲンのエピトープの内の１種をコードする請求 項３の組換えＤＮＡ分子。
16. １６．樹木の花粉のアレルギーのある個体の血清由来のＩｇＥを同じかまたは同 程度に結合する能力を示すＡｌｎｇＩ、ＣｏｒａＩまたはＢｅｔｖＩアレルゲン の少なくとも１種のエピトープを有するポリペプチド。
17. １７．形質転換体の原核または真核宿主生物中で、前記ポリペプチドを生成する 請求項１〜１５のいずれかのＤＮＡを複製し、かつ発現を誘導する能力のある複 製可能原核または真核発現ベクター（ベクヒル）。
18. １８．宿主生物中で前記ポリペプチドを生成する請求項１〜１５のいずれかのＤ ＮＡを複製し、かつ発現を誘導する能力のある発現ベクターを用いて形質転換し た原核または真核宿主生物。
19. １９．前記生物が、エッシュリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ） である請求項１８の宿主生物。
20. ２０．宿主生物中で前記ポリペプチドを生成する請求項１〜１５のいずれかのＤ ＮＡを複製し、かつ発現を誘導する能力のある発現ベクターを含有する原核また は真核宿主生物を培養することを含む、ＡｌｎｇＩ、ＣｏｒａＩまたはＢｅｔｖ Ｉアレルゲンの少なくとも１種のエピトープを有するポリペプチドを生成する方 法。
21. ２１．ＡｌｎｇＩ、ＣｏｒａＩまたはＢｅｔｖＩアレルゲンの少なくとも１種の エピトープを有し、かつ請求項２０の方法によって生成されたポリペプチドを含 む組成物。
22. ２２．ＡｌｎｇＩアレルゲンの少なくとも１種のエピトープを有し、かつ配列認 識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．）３によって配列リストで定義さたアミノ酸配列 にしたがって化学的合成によって生成されたポリペプチドを含む組成物。
23. ２３．ＣｏｒａＩアレルゲンの少なくとも１種のエピトープを有し、かつ配列リ ストの配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．）１１、１４、１７および２０で定 義さたアミノ酸配列にしたがって化学的合成によって生成されたポリペプチドを 含む組成物。
24. ２４．ＢｅｔｖＩアレルゲンの少なくとも１種のエピトープを有し、かつ配列リ ストの配列認識番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．）２３によって定義さたアミノ酸配 列にしたがって化学的合成によって生成されたポリペプチドを含む組成物。
25. ２５．請求項３に記載されたアミノ酸配列を伴なう少なくとも１種のエピトープ を有する、ブナ目の木の花粉の単離されたアレルゲン性ペプチド。
26. ２６．過敏症の個体に投与され、その個体中で、ブナ目の樹木の花粉に対するア レルギー反応を変成する能力のある請求項６、７、８、９、１１、１２、１４ま たは２５のペプチド。
27. ２７．ブナ目の樹木の花粉に対する修飽Ｔ細胞（モディファイイング　Ｔ−セル ）応答能力のある請求項２６のペプチド。
28. ２８．アレルギー反応に干渉を与える能力のある請求項６、７、８、９、１１、 １２、１４または２５の単離されたペプチド。
29. ２９．請求項２１の組成物と哺乳類の血清を接触させ、かつ、血清中のＩｇＥ抗 体とＡｌｎｇＩ、ＣｏｒａＩまたはＢｅｔｖＩアレルゲンの内の少なくとも１つ のエピトープを有する前記ポリペプチドの間の免疫学的反応を検出することを含 む、ＩｇＥ抗体を検出する方法。
30. ３０．哺乳類の気管、結膜、皮膚、鼻腔または経口誘発のために請求項２１の組 成物を用いて該哺乳類を刺激すること、および組織と前記ポリペプチドの間の免 疫学的反応を検出することを含む、ＡｌｎｇＩ、ＣｏｒａＩまたはＢｅｔｖＩア レルゲンに対するアレルギー反応を検出する方法。
31. ３１．哺乳類の細胞を請求項２１の組成物と接触させること、および該細胞と前 記ポリペプチドの間の反応を検出することを含む、ＡｌｎｇＩ、ＣｏｒａＩまた はＢｅｔｖＩアレルゲンに対する細胞反応を生体内（インビトロ）で検出する方 法。
32. ３２．ＡｌｎｇＩ、ＣｏｒａＩまたはＢｅｔｖＩアレルゲンに対して前記哺乳類 を減感作するために、有効量の請求項２１の組成物を投与することを含む、花粉 アレルギーにかかった哺乳類を処置する方法。