JPH05501657A - 牧草の酵素処理 - Google Patents

牧草の酵素処理

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JPH05501657A JP3513261A JP51326191A JPH05501657A JP H05501657 A JPH05501657 A JP H05501657A JP 3513261 A JP3513261 A JP 3513261A JP 51326191 A JP51326191 A JP 51326191A JP H05501657 A JPH05501657 A JP H05501657A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 牧草の酵素処理 本発明は、農業分野、特に飼料の牧草の酵素処理の改良法に関する。
（関連分野） 自然および人工乾燥につづく牧草処理技術の改善は、牧草の保存性に関して幅広 く行われている。西ヨーロッパでは、冬に保存された牧草の６０％（乾燥物とし て約８０００万トン）が、貯蔵されている。アメリカでは、年間８０００万トン （乾燥物）が、貯蔵されている。また、東ヨーロッパやカナダでも牧草の貯蔵が 幅広く行われている。
しかし、醗酵（特に酪酸醗酵）や空気による劣化による水の放出や栄養低下は、 動物飼料生産で高い効率が必要になるにつれ、大きな問題となってきた。これら の問題は、穀物の種類、気候条件、使用可能な技術などの因子に依存する事が多 い。最近の酪農農業における生産限界や、特定の国における家畜用飼料の種類や 量を間接的に制限する環境規制は、高品質の牧草を栽培する必要性を強調してい る（スポルストラ（Ｓｐｏｅｌｓｔｒａ）、Ｓ、Ｆ、（１９９１）ＥＧＦ会議の 進展ご２０００年へ向けての牧草保存”、ブロンスウエイグ、ドイツ）。
草（ライグラスなど）、穀物（とうもろこし、さとうきび、小麦など）および豆 類（アルファルファ、クローバなど）が、貯蔵用牧草としてもっともよく使用さ れる。比較的少量だが、ビートトップやシュガービートパルブも使用される。
とうもろこしは、よく貯蔵されるか、空気による劣化を起こしゃすい。草、特に 多年生のライグラスは、しばしばひどく醗酵し、またその結果として緩衝能に対 して水溶性炭水化物の比が小さいため、貯蔵後、酪酸醗酵を受けやすい。酪酸醗 酵は、牧草の乾燥重量を減少させ、栄養価、ひいては家畜の生産を減少させる。
不都合な酪酸醗酵を避けるため、草は、平均ｋｇ当たり５００　ｇＤＭ　（乾燥 物）となるように、地中で腐らせる。また、ｋｇ当たり３５０　ｇＤＭ以下のＤ Ｍ含量の場合は、酵素などの添加物を使用する。
現在、牧草保存性の改良、特に、セルラーゼやヘミセルラーゼなど細胞壁消化酵 素の添加による消化の促進に関する研究が続けられている。セルラーゼやヘミセ ルラーゼを作用させると、植物細胞壁から水溶性炭化水素が放出され、牧草中に 存在する酪酸バクテリアによる醗酵で酪酸を生産する基質が提供される。これら の酵素もおそら（植物細胞壁の生分解を担っており、酪酸バクテリアで処理され る細胞からさらに水溶性炭水化物やその他の物質を放出する。さらに牧草貯蔵中 の植物細胞壁の前消化処理は、ルーメン中での消化を速め、消化性を高め、摂取 する動物の栄養となる炭水化物の量を増加させる。
また、牧草中に存在する酪酸バクテリアによる酪酸の生産（および酢酸）は、牧 草のｐＨを低下させる。一般に約ｐＨ４，５、時には約ｐＨ４，０までものｐＨ の低下は、イーストや酪酸生産菌など多くの不都合な微生物の増殖に好ましくな い環境を提供し、この事により、牧草の保存やその栄養価の維持に適している。
さらに、酪酸バクテリアは、プロピオティクスとして働き、牧草を摂取した動物 の腸内フローラの増加に役立つ。
全部ではないにしろ、はとんどの酵素調製物は菌類由来の粗醪酵産物である。
これらの酵素調製物には、多種多様の酵素活性が含まれる。
たとえば、ペニシリウム　へルクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｖｅｒｒｕ ｃｕｌｏｓｕｍ）変異株から得られるセルラーゼ調製物については、とりわけ、 牧草生産などの工業プロセスでのセルロースおよびヘミセルロースの部分または 完全分解への応用に関して、東ドイツ特許出願ＤＤ−２７８３５９（１９９０年 ５月２日刊行）に報告されている。このセルラーゼ調製物が、β−グルコシダー セ、キシラナーゼおよびアミラーセ活性とともに高いセルロース分解活性を含ん でいることが示されている。
バクテリアに水溶性炭水化物源を提供する事を目的とした、牧草中の多糖類およ びオリゴ糖を分解しうる酵素をコードする外来ＤＮＡでトランスホームした酪酸 バクテリアを含む牧草用のプロピオティクス接種物は、ＰＣＴ出願ＷＯ３９１０ １９７０（１９８９年５月９日刊行）に報告されている。
（発明の概要） 本発明に従い、牧草の貯蔵に用いられる酵素調製物中に存在する多くの酵素活性 のうちのエンドキシラナーゼ活性は、特に水溶性炭水化物の放出に関連しており 、この事が、酪酸バクテリアの醗酵作用を通して牧草の保存や栄養の改善をもた らすことが分かった。さらに、十分量のエンドキシラナーゼを他の酵素活性有り 、または無しの条件下で補った牧草は、至適な保存性と栄養価を提供することが 分かった。また、劣化した牧草とは反対にこの方法で保存した牧草を動物はよく 食べることが観察された。これら全ての因子は、家畜生産効率を増加させる。
このように、本発明は、貯蔵した植物細胞物質（飼料）からの水溶性炭水化物を 放出し、その結果、酪酸バクテリアによる酪酸および酢酸の生産を増加し、牧草 の保存性および栄養価を改善するのに有効な量のエンドキシラナーゼを添加した 牧草組成物を提供する。このエンドキシラナーゼは、基本的に他の酵素活性を含 まない形で添加することが望ましい。
貯蔵した飼料は必ずしも貯蔵に適した量の酪酸バクテリアを含んでいないので、 本発明は、牧草の保存性を増加し、かつ、このように処理した牧草組成物を摂取 した動物の腸フローラを増加させることを目的としたプロピオティクスとして働 くのに十分な量の、補充物として含めた酪酸バクテリア接種物も含む牧草組成物 を提供する。
また、本発明は、酪酸バクテリアによる酪酸及び酢酸の生産に使用される牧草内 の水溶性炭水化物の量を増加するのに有効な量のエンドキシラナーゼを牧草に添 加したことを特徴とする牧草の保存法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、牧草を摂取した動物が利用する貯蔵植物細胞物質から水溶性 炭水化物を放出するのに有効な量のエンドキシラナーゼ活性を補うことにより牧 草の栄養価を改良する方法を提供することを目的とする。また、牧草中に存在す るエンドキシラナーゼは、動物自身に必須の酵素を補足的に提供する。
また、本発明は、植物細胞壁を少なくとも部分的に分解し、予備消化するのに有 効な量のエンドキシラナーゼを補った牧草の少なくとも一部を含む飼料で飼育す る動物の生体内（乾燥）牧草消化性の改善方法を提供する。
（図面の簡単な説明） 図トアスペルギラス　ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）ＤＳ１６ ８１３　（ＣＢＳ３２３．９０）から得られる培養濾過物のＨＰＬＣ溶出パター ン。この菌株は、後にアスペルギラス　ツビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉ　Ｉ　ｌ ｕｓｔｕｂｏｇｅｎｓ　ｉ　ｓ）種に再分類された。
（発明の詳細な説明） 本発明に従い、貯蔵する牧草に酪酸バクテリアによって使用されるか、またはこ の牧草を摂取した動物が栄養としている水溶性炭水化物の量を有意に増加するの に有効な量のエンドキシラナーゼを補い、そして、（プロピオティクスとしての ）酪酸バクテリアによる酪酸および酢酸（酪酸は酢酸に比べて多量に生産される ）の瀞酵生産量を増加するような品質の向上および牧草組成や栄養価の維持に有 効なｐＨの低下を誘導する。これらの因子は、飼料生産効率の改善に寄与する。
本発明以前には、エンドキシラナーゼが牧草生産の改良に重要な働きを果たして いることはよ（知られていなかった。また、貯蔵される飼料への実質的に他の酵 素活性（特に、他の細胞壁分解酵素活性）を含まない形でのエンドキシラナーゼ の添加は、保存性がよいばかりではなく、栄養価も改善された牧草を提供するこ とも知られていなかった。
本発明にしたがった牧草組成物は、飼料ｋｇ当たり５０００ユニット以上のエン ドキシラナーゼ活性を含むことが望ましい。エンドキシラナーゼは、飼料貯蔵の 過程で酸性ｐＨでの最高の酵素効率が維持される条件を保証するためｐＨ３，５ −６，０に維持することが望ましい。先に述べたように、エンドキシラナーゼは 、一般に実質的に他の酵素活性、特に細胞壁分解活性を含まない形で添加するこ とが望ましい。
また、貯蔵する飼料への実質的に他の酵素活性を含まないエンドキシラナーゼ活 性の補填は、しばしば望ましい効果を挙げるために第二の酵素活性を補填した酵 素混合物の代替法として商業的に魅力的なものである。本明細書で定義されてい るようにご実質的に他の酵素を含まない”という語句は、本酵素調製物の全蛋白 質の大部分（すなわち、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％）が、 エンドキシラナーゼであることを示している。
たとえば、エンドキシラナーゼ活性物は、ヨーロッパ特許出願ＮＯ，９０２０２ ０２０，５（１９９０，７，２４登録）（参考として引用する）に述べられてい るように、組み換えＤＮＡ技術で大量に生産しうる。別に、エンドキシラナーゼ の生産は、キシランを含む誘導培地の使用などエンドキシラナーゼ生産微生物の 醗酵条件を調整することにより増加しつる。本発明で使用するエンドキシラナー ゼは、繊維状菌類、特にアスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉ　Ｉ　Ｉｕｓ）　、ジ スポロトリカム（Ｄｉｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃ ｉｌｌｉｕｍ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）　、フサリウム（Ｆ ｕｓａｒｉｕｍ）およびトリコデルマ（Ｔｒ　ｉ　ｃｈｏｄｅ　ｒｍａ）　、も っとも好ましくは、アスペルギラス　ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉ［Ｉｕｓ　ｎｉｇ ｅｒ）、アスペルギラス　アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉ　１ｌｕｓ　ａｗａｍｏｒ ｉ）、アスペルギラスアクリータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔ ｕｓ）、アスペルギラス　ツビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｕｂｉｇ ｅｎｓｉｓ）、ジスポロトリカム　ジモルフォスポラム（Ｄｉｓｐｏｒｏｔｒｉ ｃｈｕｍ　ｄｉｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｍ）およびトリコデルマ　リーセイ（Ｔ ｒ　ｉ　ｃｈｏｄｅ　ｒｍａｒｅｅｓｅｉ）からなる群から選択される繊維状真 菌類から得ることが好ましい。
本発明で使用するエンドキシラナーゼは、本発明には本質的ではない検定法、例 えばスポットテスト検定法などで同定しうる。この方法にしたがって、エンドキ シラナーゼを生産するよう誘導した（例えば、オートスベルトキシランなどで） 微生物の培養物から得られる濾液のエンドキシラナーゼ活性を検定する。溶出フ ラクションをクエン酸−燐酸バッファ（実施例１．１参照）および樫由来のキシ ランを含む寒天フィルム上に滴下する。このフィルムをインキュベーションした のち、エンドキシラナーゼ活性があるなら寒天フィルム状の各液滴の位置が透明 となる。
また、レザース（Ｌｅａｔｈｅｒｓ）、Ｔ、Ｄ、等（１９８４）Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌ、Ｂｉｏｅｎｇ、Ｓｙｍｐ、、１４．２２５に述べられているように、エ ンドキシラナーゼが含まれていると思われる酵素溶液にキシラン含有溶液を作用 させ、還元糖を分光学的に分析することにより、該酵素を同定できる。
ここでは、エンドキシラナーゼ活性ｌユニットを、３９℃、ｐＨ３，５で、毎分 タンパク質１ｍｇ当たり放出されるキシロース当量（μｍｏ　ｌ）と定義する。
タンパク質の測定は、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）、Ｍ、Ｍ、（１９ ７６）Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、７２，２４８に述べられている方法にした がって行った。標準タンパク質としてウシ免疫γ−グロブリン（ＢＩｇＧ）を使 用した。
一度同定したのちは、エンドキシラナーゼ生産誘導条件でエンドキシラナーゼ生 産生物を醗酵し、この生産生物の培養濾液から目的の酵素活性物を単離し、望ま しい場合は、本発明には本質的ではない従来法で精製することが出来る。例えば 、培養濾液からエンドキシラナーゼを分取精製するには、アフィニティーおよび 、またはイオン交換クロマトグラフィーを使用するのが好ましい。
また、本発明の別の態様では、エンドキシラナーゼを含む市販用の酵素調製物の 補填を具体化している。飼料ｋｇ当たり５ｏｏｏｏユニット以上のエンドキシラ ナーゼ活性を提供するよう該酵素を添加することが望ましい。
また、別の態様では、牧草にさらに保存性を高める添加剤として、酪酸バクテリ アを含む牧草組成物が提供される。酪酸バクテリアは、ラクトバチルス（Ｌｕｃ ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ｊ＝ンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、 ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｕｓ）、ペジオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃ ｃｕｓ）およびリューコノストク（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｅ）からなる群から選 択することが好ましい。本発明に従う、もっとも好ましい酪酸バクテリアは、ラ クトバチルス　プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕ ｍ）、ラクトバチルス　アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉ ｄｏｐｈｉ　ｒｕｓ）　、ラクトバチルス　プレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉ　１ １ｕｓｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス　バルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉ　 ｆｌｕｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス　ファーメンタム（Ｌａｃｔ ｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、およびラクトバチルス　ラクチス （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　１ａｃｔｉｓ）からなる群から選ばれる。
本発明に従う牧草へのエンドキシラナーゼの添加は、当業者によく知られている 草、穀物および豆類など全ての貯蔵植物に応用できる。しかし、通常飼料は、酵 素が植物細胞物質に働かないように、ＤＭ含量は飼料ｋｇ当たり３５０ｇ以下明 を提供するもので、本発明の範囲を制限するものではない。用いた数字には細心 の注意を払ったが、実験誤差やばらつきがあることは考慮しなければならない。
指示しないかぎり、温度は℃で示し、圧力は大気圧である。
（実施例１）アスペルギラスッピゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉ　ｌ　ｌｕｓ　ｔｕ ｂｉｇｅｎｓｉｓ）エンドキシラナーゼの精製Ｉリットル当たり３０ｇ　オート スベルトキシラン（シグマ）、７．５ｇＮＨイＮＯ！　、０．５ｇＫＣｌ、ｏ、 ５ｇＭｇ５ｏ４　、Ｉ　ｓｇＫＨｔＰＯ＊　、および０．５ｇイーストエクスト ラクト（ｐＨ６，０）を含む培地中アスペルギラス　ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌ ｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）ＤＳ１６８１３　（ＤＢＳ３２３．９０゜１９９０年７月 ２０日オランダ、バーン、セントラル　プリュー　ポア　シメルカルチャーに登 録、後に、Ａ、ツビゲンシス（ｔｕｂｉｇｅｎｓ　ｉｓ）に属すると分類された 。カスタースーバン　ソメレン（Ｋｕｓｔｅｒｓ−ｖａｎ　Ｓｏｍｅｒｅｎ）等 、（１９９１）Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ、１９．２１）を培養することにより、そ の培地から精製した。培養濾液を約３５ｍ１にまで濃縮し、ついで、５０ｍ１ア ミコンモジユール中のシアフロＰＭＩＯフィルターで限外濾過し脱塩した。
上清をｌｏｍｌにまで濃縮し、その濃縮物を２５ｍ１の２５ｍＭトリス−ＨＣＪ バッファ（ｐＨ７，０）で二度洗浄する。洗浄後、濃縮物の容積を２５ｍ１とす る。
この濃縮物１ｍｌをシンクロバクＡＸ３００カラム（サイズｌＯＸ１０Ｘ２５０ に注入し、以下のＨＰＬＣ条件にしたがって溶出した。
溶出速度：　２ｍｌ／ｍｉｎ。
溶出パンツ７Ａ：　２５ｍＭ）リス−ＨＣｌ　ｐＨ７，０溶出バツフアＢ　：　 ２５ｍＭ）リス−ＨＣｌ　ｐＨ７，０＋１Ｍ　ＮａＣ１溶出勾配二時間（分）　 ％Ａ　％Ｂ 各１ｍｌのフラクションを採取した。溶出した蛋白質の検出は、２８０ｎｍにお ける連続的ＵＶ吸収測定で行った。この溶出パターンを図１に示す。
スポットテストで各フラクションのエンドキシラナーゼ活性を検定した。このス ポットテストでは、まず、０．５％オートスベルトキシラン（シグマ）を含む１ ２ｍ１のクエン酸−燐酸バッフ７（９００ｍｌの０．２Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４およ び１２５ｍ１の０．５Ｍクエン酸を混合し、そのｐＨを０．５Ｍ　クエン酸また は０．２Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４を用いて５．６に調整する）を１８０ｍｇの寒天（ ディフコ）に加え、１００℃に加熱して寒天を溶解する。６０℃に冷却してから 、この寒天混合物をアガロースゲルボンドフィルムに均等に拡げる。溶出フラク ションの液滴をこのフィルム上に乗せ、３０℃で３０分間インキュベートする。
エンドキシラナーゼ活性がある場合は、寒天フィルム上の個々の液滴部分が透明 になる。
採取した全エンドキシラナーゼ活性の定量は、基質として５０ｍＭ酢酸ナトリウ ム（ｐＨ５，０）中のオートスベルトキシランを用い、レザース（Ｌｅａｔｈｅ ｒｓ）等、（１９８４）に述べられているマイクロアッセイで採用した所定の時 間に生産される還元糖の量を測定することで行った。活性ユニットもレザース（ Ｌｅａｔｈｅｒｓ）（上述）の定義にしたがった。
溶出フラクションのエクソキシラーゼ活性は、ｐＨ５，０，３０℃で基質として ｐ−ニトロ−フェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド（０，３ｍＭ、シグマ）を用 いたポータネン（Ｐｏｕｔａｎｅｎ）およびパルス（Ｐｕｌｓ）の方法で測定し た。
スポットテストにより、ビークＢ、　ＦおよびＫに対応する溶出フラクションが 、エンドキシラナーゼ活性を含むことが示された。全キシラナーゼ検定法は、ビ ークＢ、Ｆ、　ＨおよびＫの溶出フラクションに活性があることを示した。ピー クＢおよびＨの溶出フラクションに、エンドキシラナーゼ活性があることが分か った。
さらに、ピークＦ（ＸＹＬ２蛋白質）およびＫ（ＸＹＬＡ　蛋白質）の溶出フラ クションは、イオン交換クロマトグラフィーを繰り返して精製した。
（実施例２） 験用サイロに入れて、分析するまで室温で三ケ月貯蔵した。
未貯蔵の草ｋｇ当たり蛋白質０．２ｇの濃度となるように、酵素調製物セルラー ゼＡＢＣ−７を添加した（飼料ｋｇ当たり３２００ユニツトのエンドキシラナー ゼに相当する。蛋白質含量は、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）、Ｍ、Ｍ 。
（上述）の方法を用いて測定した。）。セルラーゼＡＢＣ−７は、トリコデルマ リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）から生産した市販の酵素調 製物であり、ＭＡＸＡＺＹＭ　ＣＬ−２０００（ＩＢＩＳ、Ｎ、Ｖ、、リスライ ク、オランダ）という名称で販売されている。この製品の酵素活性を表１にまと めた。
表１　セルラーゼＡＢＣ−７の酵素活性活性　測定物質　比活性 μｍｏ　ｌ　ｅ／分・蛋白質ｍｇ ＣＭＣアーセ　グルコース当量　０．７９アビセラーゼ　グルコース当量　０． １１エントキンラーセ　キシロース当量　１６．０エキソキノラーセ　ｐ−ニト ロフェノール　０．４８エキソアラビノース　ｐ−二トロフェノール　０．５１ アセチルステラーセ　ｐ−ニトロフェノール　０．１６ボリガラクトウロナーゼ 　ガラクトース当量　３．５６グルクロニダーセ　ｐ−ニトロフェノール　０． ００３α−アミラーゼ　グルコース　０．２５表２　草、コントロール牧草およ びセルラーゼＡＢＣ−７とのインキュベーション後の酵素処理牧草の平均（Ｎ＝ ３）組成牧草 コントロール　セルラーゼ 草　ＡＢＣ−７ 乾燥物　（ｇ／ｋｇ）　２７３　２６９　２５９＊灰　（ｇ／ｋｇ　ＤＭ）　１ ２４　１２４　１３５＊乳酸　（ｇ／ｋｇ　ＤＭ）　−４５，５５９，４＊エタ ノール　（ｇ／ｋｇ　ＤＭ）　−７，３３１９，１＊酢酸　（ｇ／ｋｇ　ＤＭ） 　−４６，９８２，ｇ＊粗繊維　（ｇ／ｋｇ　ＤＭ）　２５８　２６２　１９４ ＊中性洗浄繊維　（ｇ／ｋｇ　ＤＭ）　５２３　４４６　３５１＊酸性洗浄繊維 　（ｇ／ｋｇ　ＤＭ）　２７９　２８１　２０４＊酸性洗浄リグニン（ｇ／ｋｇ 　ＤＭ）　１７，５　１５．９　１８．５＊重量損失　（ｇ／ｋｇ　ＤＭ）　− ４９，９７６，３＊ＮＨ３Ｎ／全Ｎ（ｗｔ　％Ｎ−トータル）　−２６２０＊ｐ Ｈ−５，４２４，７２ セルラーセＡＢＣ−７は、大部分の細胞壁成分を醒酵可能な炭水化物に加水分解 する。この事で、水溶性炭水化物の放出が起こり牧草の品質が向上する。　この 事は、コントロールと比べた乳酸濃度の増加、粗繊維含量の低下、中性洗浄繊維 含量の低下、酸性洗浄繊維含量の低下、ｐＨの低下、アンモニア価の低下で示さ れる。
（実施例３） 実施例２で述べたように、多年生イギリスライグラスを調製し、１リツトルの実 験用サイロに入れて分析するまで、室温で三ケ月貯蔵する。
未処理の草ｋｇ当たり蛋白質０．００５ｇ（８０ユニツトのエンドキシラナーセ 活性）：蛋白質０．０２５ｇ（４００ユニツトのエンドキシラナーセ活性）、蛋 白質０．０５ｇ（８００ユニツトのエンドキシラナーセ活性）；蛋白質０．０７ ５　ｇ（１２００ユニツトのエンドキシラナーセ活性）の濃度となるように、セ ルラーゼＡＢＣ−７（表１参照）を添加する（全ての蛋白質含量は、ブラ・ソド フオード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）、Ｍ、Ｍ、（上述）の方法で測定した。）。
この結果を表３に示す。
（実施例４） 実施例２に従い多年生のイギリスライグラスを調製し、１リツトルの実験用サイ ロに入れ、分析するまで室温で三カ月貯蔵した。
この実験では、アスペルギラス　ツビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｕ ｂｉｇｅｎｓｉｓ）由来の精製したエンドキシラナーゼ（飼料ｋｇ当たり比活性 ５００ユニツトのエンドキシラナーゼ活性（ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆ。
ｒｄ）の蛋白質側法、上述）、実施例１参照）とセルラーゼＡＢＣ−７調製物を 合わせてエンドキシラナーゼ活性を高め、草に添加した。この草に添加した酵素 調合物中のエンドキシラナーセ濃度は、草ｋｇ（未処理）当たり蛋白質０．０５ ｇ（２５０，０００ユニツトエンドキシラナーセ活性）であり、またセルラーセ ＡＢＣ−７濃度は１ｋｇ当たり蛋白質０．２００ｇ（３２００ユニツトエンドキ シラナーゼ活性）であった（蛋白質含量は、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒ ｄ）。
Ｍ、Ｍ、（：上述）の方法で測定した。）。
この結果を表４に示す。
表４　草および牧草の平均（Ｎ＝３）組成牧草 コントロール　セルラーゼ　セルラーセ草　ＡＢＣ−７エンドキシ ラナーゼ 乾燥物　（ｇ／ｋｇ）　２７３　２６９　２５９＊　２５９＊灰　（ｇ／ｋｇ　 ＤＭ）　１２４　１２４　１３６＊　１３３＊乳酸　（ｇ／ｋｇ　ＤＭ）　−４ ５，５５９，４＊　１０１＊エタノール（ｇ／ｋｇ　ＤＭ）　−７，３３１９， １＊　７．８１＊酢酸　（ｇ／ｋｇ　ＤＭ）　−４６，９８２，８＊　４６．６ ＊租繊維　（ｇ／ｋｇ　ＤＭ）　２５８　２６２　１９４＊　１９２＊ＮＤＦ　 （ｇ／ｋｇＤＭ）　５２３　４４６　３５１＊　３４４＊ＡＤＦ　（ｇ／ｋｇＤ Ｍ）　２７９　２８１　２０４＊　２０５＊ＡＤＬ　（ｇ／ｋｇＤＭ）　１７． ５　１５．９　１ｇ、５＊　１７．３重量損失　（ｇ／ｋｇ　ＤＭ）　−４９， ９７６，３＊　４６．４！１．−Ｎ／全Ｎ（ｗｔ％Ｎ−）−タル）　−２６２０ ＊　２０＊ｐＨ−５，４２４，７２＊４．３９＊ 驚（べきことに、セルラーセＡＢＣ−７調製物へのエンドキシラナーゼの添加は 、貯蔵した車中に高濃度の乳酸を生成し、結果的にｐＨを低下させた。
さらに、エタノールおよび酢酸の醗酵が抑制され、二酸化炭素と揮発性脂肪酸の 生成による重量損失も抑えられた。
（実施例５） 多年生のイギリスライグラスを実施例２に従って調製し、１リツトルの実験用サ イロに入れ分析するまで室温で三ケ月貯蔵した。
飼料ｋｇ当たり蛋白質０．０１０ｇ、　０．０５０ｇおよび０．２００ｇの濃度 で精製したエンドキシラナーゼを添加した（ブラッドフォード（Ｂ　ｒ　ａ　ｄ 　ｆ　ｏ　ｒ　ｄ）蛋白質測定法、上述）。
この結果を表５に示す。
表５は、牧草改良物中へのエンドキシラナーセ添加の有効性を明白に示している 。このデータは、補填するエンドキシラナーゼ活性量の増加に従い、貯蔵した車 中の乳酸のうどが実質的に増加することを示している。酢酸含量のわずかな増加 も見られる。乳酸含量の増加に加えてこの事が、ｐＨを低下させ、牧草の保存性 に効果をあげている。エタノール生産（望ましくないイースト醗酵に由来する） に有意な増加は見られなかった。さらに、このデータは、細胞壁の生体高分子パ ラメーターの有意な低下を示しており（コントロールと比較して、粗繊維含量の 低下、中性洗浄繊維含量の低下、酸性洗浄繊維含量の低下）、エンドキシラナー セ処理した牧草を消費する乳酸菌および動物が使用しうる醗酵可能な糖の増加を 招（。また、細胞壁物質の予備消化は、貯蔵した飼料の消化性を増加する。
−光学密度（ａ、ｕ、） −ＮａＣ１勾配ＣＭ） 要約書 本発明は、エンドキシラナーセ活性を添加した牧草組成物を提供する。本発明に したがい飼料産物にエンドキシラナーセを添加することにより、乳酸菌に使用さ れるか、または牧草を摂取した動物の栄養となる水溶性炭水化物の量が有意に増 加した牧草が生成し、乳酸菌による乳酸および酢酸の醗酵的生産が増加して、結 果的に牧草組成物の保存に効果的なｐＨの低下が起こる。また、さらに乳酸菌の 摂取物を含む牧草組成物が提供される。
国際調査報告　。、□／ｋｌ＋　０１７゜。１，６国際調査報告

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. １．飼料ｋｇ（未処理物）当たり５０，０００ユニット以上のエンドキシラナー ゼ活性を含むエンドキシラナーゼ含有牧草組成物。
  2. ２．前記エンドキシラナーゼが、繊維状真菌類に由来することを特徴とする請求 項１記載の牧草組成物。
  3. ３．前記エンドキシラナーゼが、アスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、 ジスポロトリカム（Ｄｉｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉ ｃｉｌｌｉｕ　ｍ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、フサリウム（ Ｆｕｓａｒｉｕｍ）およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）からなる属 から選ばれる繊維状真菌類に由来することを特徴とする請求項２記載の牧草組成 物。
  4. ４．前記エンドキシラナーゼか、アスペルギラスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ ｓｎｉｇｅｒ）、アスペルギラスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｗａｍｏ ｒｉ）、アスペルギラスアクリータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｃｕｌｅａｔ ｕｓ）、アスペルギラスツビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｕｂｉｇｅ ｎｓｉｓ）、ジスポロトリカムジモルフォスポラム（Ｄｉｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈ ｕｍ　ｄｉｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｍ）およびトリコデルマリーセイ（Ｔｒｉｃ ｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）からなる種から選ばれる繊維状真菌類に由来す ることを特徴とする請求項３記載の牧草組成物。
  5. ５．前記エンドキシラナーゼが、ｐＨ３．５−６．０の至適ｐＨ値を有すること を特徴とする請求項１記載の牧草組成物。
  6. ６．乳酸菌接種物を含むことを特徴とする請求項１記載の牧草組成物。
  7. ７．前記乳酸菌が、ラクトバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ 　ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルスチシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉ ｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルスブレビス（Ｌａｃｔｏｂ ａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルスブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂ ａｃｉｌｌｕｓ　ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルスファーメンタム（Ｌ ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）およびラクトバチルスラクチ ス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌａｃｔｉｓ）からなる群から選ばれること を特徴とする請求項６記載の牧草組成物。
  8. ８．前記エンドキシラナーゼが、実質的に他の酵素を含まない形で飼料に添加さ れることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項記載の牧草組成物。
  9. ９．乳酸菌による乳酸および酢酸の生産を目的として牧草中に存在する水溶性炭 水化物の量を増加するのに有効な量のエンドキシラナーゼを牧草に添加すること を特徴とする牧草の保存方法。
  10. １０．少なくとも部分的に植物細胞壁の分解に有効な量のエンドラナーゼを添加 した牧草を含む飼料を動物に摂取させることによる、該動物体内での牧草の消化 性を改善する方法。
  11. １１．牧草を摂取した動物に利用されることを目的として、貯蔵植物細胞物質か ら水溶性炭水化物を放出するのに有効な量のエンドキシラナーゼを牧草に添加す ることによる牧草の栄養価の改善方法。
  12. １２．牧草調製物におけるエンドキシラナーゼの使用。
  13. １３．牧草の処理を目的とした、少なくとも５０重量パーセントのエンドキシラ ナーゼを含む組成物。
  14. １４．飼料ｋｇ（未処理物）当たり５０，０００ユニット以上のエンドキシラナ ーゼで処理した牧草。
  15. １５．請求項１４記載の牧草を含む動物飼料組成物。
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