JPH05501876A - 腫瘍細胞関連プロコアグラント活性の中和剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 腫瘍細胞関連プロコアゲラント活性の中和剤本発明は、腫瘍の転移を防ぐ薬剤と してのアネキシン群由来の抗凝血性蛋白質の使用に関する。

転移は、腫瘍関連病において重要な問題となっている。転移と呼ばれるこの現象 のメカニズムは、以下のように考えられている。

腫瘍細胞が、その生物の循環系に侵入しくイントラバスキュレーション）、血液 によって運ばれる。これらの悪性細胞は、血小板や血漿凝血因子と相互作用を起 こし、造血システムを活性化する。腫瘍細胞に知られている表面依存プロコアゲ ラント活性が、トロンビン、最終的にはフィブリンポリマーを生成する。さらに 、同様の細胞は、他の宿主細胞とも相互作用を起こす。従って、血小板の固まり やフィブリンの糸に囲まれた腫瘍細胞は、キャピラリー容器のなかに存在するこ とになり腫瘍細胞の表面でのフィブリンウェブの形成の結果、別の免疫反応によ り腫瘍細胞を破壊するのに必要な腫瘍抗原が隠されてしまう。従って、自分自身 をフィブリンネットワークで囲んでしまう腫瘍抗原の能力が、これらの細胞の転 移活性に重要な役割を果たしていると言える。腫瘍酵素は蛋白質分解的に血管の 壁を攻撃し、腫瘍細胞を循環系から脱出させる（イクストラパスキュレーション ）。

ついで、二次腫瘍が形成される。

明らかに、このメカニズムの重要な因子は、循環腫瘍細胞かフィブリンネットワ ークを形成してキャピラリー容器の中に入り、および、またはその生物の免疫防 御から逃れる能力にある。フランガ（Ｆｌａｎｇａ）等（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ　２４：５５５８−５５６７　（１９８５））は、因子Ｘを活性化すること により凝血を開始しうる特定のかんプロコアゲラント活性剤を単離し、その特性 を明らかにした。直接因子Ｘを活性化する別のかんプロコアゲラント活性剤も単 離されている。腫瘍細胞による凝血システムの活性化の分野の研究は、Ｃａｎｃ ｅｒ　Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　３：９９−１１６（１９８４） に纏められている。

本発明の目的は、腫瘍細胞のプロコアゲラント活性に対する活性物質を提供する ことにある。フィブリンの生成は、最終的にフィブリノーゲンをフィブリンに転 換するトロンビンを生成する一連の酵素反応の最終ステップである。種々のプロ コアゲラント反応、例えば因子ＸａおよびＶａによるプロトロンビンの活性化は 、凝血因子が結合するリン脂質表面によって触媒される。すべての種類のリン脂 質が凝血を触媒できるわけではない。そのリン脂質表面の荷電がその程度を決定 していると考えられる。ホスファチジルセリン等の負に帯電したリン脂質は、高 いプロコアゲラント活性を有している。

リン脂質に結合し、リン脂質表面に依存する過程を阻害する蛋白質のなかには、 リン脂質への結合がＣａ”＋依存である蛋白質群がある。

アネキシンとして知られているこの蛋白質群には、リポコルチン■に加えてカル バクチンＩ、プロティン■、リポコルチン■、ｐ６フーカレレクトリン、血液抗 凝血性蛋白質（ＶＡＣ）およびＩＢＣ，ＰＡＰ、ＰＡＰ　Ｉ、ＰＰ４．　エンド ネキシン■およびリポコルチンＶが含まれている。また、これらの蛋白質の誘導 体も同様の性質を有している。

おそらくアネキシンに共通した構造的特徴が、Ｃａ２＋およびリン脂質結合性に 関係する。この一般的性質はすべてのアネキシンに当てはまるが、Ｃａ”や種々 のリン脂質に対するアフィニティーに関しては個性がある。

アネキシンの生理学的機能は、膜関連プロセスに関連する。ＶＡＣの凝血阻害効 果の基本的メカニズムは、ＶＡＣのリン脂質表面への結合によるリン脂質の触媒 能の阻害と、それによるその表面上でのクロット促進複合体の生成の阻害として 知られている。

他のアネキシンも凝血を阻害できるが、ＶＡＣがもっとも効果的なインヒビター である。

驚くべきことに、アネキシン、特にＶＡＣは、腫瘍細胞のプロコアゲラント活性 を阻害することが分かった。

プロコアゲラント活性に関するアネキシンの中和効果は、種々の結腸腫瘍細胞で 示された。特定の量の結腸細胞のプロコアゲラント活性は、ＶＡＣαにより投与 量依存的に阻害される（第２図）。細胞数と凝血時間の関係から（第１図）、２ １０ｎＭのＶＡＣαは、６ＸＩＯ’細胞／ｍｌのプロコアゲラント活性の９９％ を中和すると計算される。ＶＡＣαにより中和された結腸細胞をＣａ”存在下で 遠心し、ついでＴＢＳＡで洗浄すると、それらの細胞の凝血検定におけるプロコ アゲラント活性は見られない。しかし、その液体がＣａ’＋の代わりにＥＤＴＡ を含むならば、その細胞は通常のプロコアゲラント活性を示した。

これらの結果は、ＶＡＣαがプロコアゲラント活性に重要な表面部位にＣａ　ｔ 　＋依存的に結合することにより腫瘍細胞に関連するプロコアゲラント活性を中 和することを示している。また、今日までＶＡＣαに対する他の表面レセプター が見つかっていないことから、おそらくリン脂質も腫瘍関連のプロコアゲラント 活性に寄与しているであろう。

このように、ＶＡＣαは、トロンビンを誘導し、最終的にフィブリンを生成する 反応の開始、および、または進行に関する腫瘍の表面の部位に結合することによ り腫瘍細胞のプロコアゲラント活性を阻害する。ＶＡＣαだけでなく他のアネキ シンもＣａ”＋依存的にリン脂質に結合するので、ＶＡＣαで得られた結果は他 のアネキシンにも当てはまる。

アネキシンが腫瘍細胞に本質的なプロコアゲラント活性を阻害するという事実か ら、それらは腫瘍細胞の転移の絶対的必要条件であるフィブリンネットへの腫瘍 細胞のカプセル化を阻害する。この中和効果により、アネキシンは腫瘍細胞の転 移を阻害しうろことから、結果的にこれらは抗転移活性を有する強力な活性物質 ということが出来る。ＶＡＣは、この種の特に適した活性物質である。

したがって、本発明の目的は、アネキシン群から選択される抗凝血性蛋白質を使 用することにより達成される。

本発明に使用しうる活性物質、特にＶＡＣは、遊離形だけでなく塩、特に医薬的 に許容しうる塩として存在しつる。これらは、遊離アミン基を有する多くのアミ ノ酸残基を含んでいるので、本発明の化合物は、たとえば、酸付加塩の形で存在 しうる。この酸付加塩は、特に従来の治療的に許容しうる酸を付加した生理学的 に許容しうる塩である。無機酸の例には、塩酸などのハロゲン化水素酸、硫酸、 燐酸、ピロ燐酸等が含まれ、有機酸の例には、特にベンゼン−１またはｐ−トル エンスルホン酸等のスルホン酸、メタンスルホン酸等の低級アルカンスルホン酸 、および酢酸、乳酸、パルミチン酸およびステアリン酸等のカルボン酸が含まれ る。

また、この化合物は、遊離カルボキシル基を有するアミノ酸を含むので、金属塩 、特にナトリウム、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ金属またはアルカ リ土類金属塩、またはアンモニアまたは生理学的に許容しうる有機窒素塩基由来 のアンモニウム塩としても存在しうる。さらに、これらは遊離カルボキシル基お よび遊離アミノ基を含むことから、内部塩としても存在しうる。

本発明の試薬は、たとえば、静脈、皮膚、皮下または筋肉注射など非経口的に、 または局部的に投与しつる。

各投与量および投与計画は、個々の評価に依存して最良のものが決定される。

関連する因子を決定するのに必要な方法は、当分野でよく知られている。通常の 状況で、注射に使用する本発明の薬剤の治療効果量は、体重キログラム当たり約 ０．００５から約０．５ミリグラムの範囲である。特に、体重キログラム当たり 約０．０１から約０．１ミリグラム、さらに体重キログラム当たり約０．Ｏｌか ら０．０５ミリグラムの範囲が好ましい。この薬剤は、静脈、筋肉、または皮下 注射で投与する。従って、単一投与の形態の非経口投与用の医薬製剤には、投与 経路に依存して投与量たり約０．４から約７．５ミリグラムの活性物質が含まれ る。また、本発明の医薬組成物には、活性物質に加えてｐＨを約３．５から８に 維持する燐酸バッファなどのバッファ、およびこれを等張液とする塩化ナトリウ ム、マンニトール、またはソルビトールが含まれる。これらは凍結乾燥するか、 または溶液に調製されるが、溶液には抗菌性保存剤、たとえば、０．　２−０． 　３％メチル−またはエチル−４−ハイドロキシベンゾエートが含まれる。局所 的使用に適した調製物は、水溶液、ローション、またはゲル、油状溶液またはサ スペンション、またはグリースまたは特にエマルジョン状軟膏の形を取る。溶液 状の調製物は、たとえば、本発明の活性物質をｐＨ４−６，５の水性バッファ溶 液に溶かし、必要ならば他の活性物質、たとえば抗炎症剤、および、またはポリ マー粘性剤、たとえばポリビニルピロリドン、および、または保存剤を添加して 得られる。活性物質の濃度は、溶液１０ミリリツトルまたはゲルｌログラム当た り約０、　１から約１．　５ミリグラム、好ましくは０．２５から１．　０ミリ グラムである。

局所的使用を目的とした油状調製物は、たとえば本発明の活性物質をオイル、場 合によってはステアリン酸アルミニウムなどの膨潤剤、および、またはＨＬＢ（ 親水−疎水バランス）１０以下の界面活性剤、たとえばグリセ［トールモ、ノス テア１戸〜１・、ソルビタンモノラウ１）−ト、ソルビタン七ノステア１ノーｌ −または゛ソルビタンモノオレー１・等の多価アルコールの脂肪酸モノエステル を添加１−、たオイルに懸濁する。−とにより得る３、グリース軟膏は、たとえ ば本発明の活性物質を、場合によ〕ではＨＩ、■３１０以下の界面活性剤を添加 しこ塗布可能なグリースペースに懸濁することにより得る。エマルジョン軟膏は 、本発明の活性物質の水溶液をＨＬＢＩＯ以丁の界面活性剤を添加した柔らかい 塗布可能なグリースペースに分散させることで得る。また、局所調製物にも保存 剤を含ませることができる。活性物質濃度は、約１０ｇのベース当たりＯ，Ｉか ら１．５ｍｇ、好ましくは０．２５から１．Ｏｍｇである。

本発明は、腫瘍細胞関連プロコアゲラント活性を中和４恥ことを目的とする、場 合によっては賦形剤、および／またはギヤリヤー、および／または安定化剤を伴 うアネキシンおよびその天然に存在する誘導体または類似体、または化学的また は遺伝子工学的に合成したアネキンン、またはその誘導体または類似体からなる 群から選択される薬剤、および 該アネキシンが以下の配列式。

ｌ　５　１０　１５ ト＋ｅｔ：　Ａｈａ　Ｇ　１ｎ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｒｑ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｖ ａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　ｃｌｙ　ＰｉｋｅＡｓｐ　Ｇｌｕ　Ａ ｒｇ　ムｌａ　Ａｓｐ　Ａｌａ　ＸＸ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｌ ａ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　ＧＩＹＬｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ 　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｑ Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ａｒｑ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　 Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　ＬｅｕＰｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａ ｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌ ｅｕ　Ｔｈｒ　ＧｌｙＬｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｖａ ｌ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　ＳｅｒＡｒｇ　ＬｅｕＴｙｒＡ ｓｐＡｌａＴｙｒＧｌｕＴ、１ｅｕＬｙｓＨ】５ＡｌａＬｅｕＬＹＳＧｌ”ｌ’ ＡｌａＧＩＹＴｈｒ１．１０　１．１５　１２０ ＡＳｎＧコｕＴ、ｙｓＶａｌｌ−ｅｕＴｈｒＧｌｕＩｌｅｌｌｅＡｌａＳｅｒＡ ｒｇＴｈｒＰｒｏＧｌｕＧｌｕＬｅｕＡｒｇＡｌａＩｌｅＬｙｓＧｌｎＶａｌＴ ｙｒＧｌｕＧｌｕＧｌｕＴｙｒＧｌｙＳｅｒＳｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　 Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇ］、ｙ　Ｔｙｒ 　Ｔｙｒ　Ｇ１ｎ１５５　１６０　１．６５ Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇ］、ｎ　八ｌａ 　ＡＳｎ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　ＡｌａＧ］Ｙ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　 Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　八ｌａ　Ｇｌｎ　 Ａｌａ　Ｌｅｕ　ＰｈｅＧ１ｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｔ ｒｐ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　−Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　ｌ１ｅ２ ００　２０５　２１Ｃ Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　 Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　ＰｈｅＡｓｐ　ＬＹＳ　Ｔｙｒ　Ｍ ｅｔ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｇ ｌｕ　Ｔｈｒ　ｌ１ｅ八Ｓｐ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓ ｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａ）ａ　’ｚ’ａ１Ｖ ａｌ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　八ｌａ　Ｔ ｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　ＴＭ　Ｌｅｕ２６０　２６５　、’７０ Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　＋４ｅｔ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ 　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　ｌ１ｅＡｒｇ　Ｖａｌ　Ｍｅ七Ｖ ａｌ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａ ｓｎ　ｒｌｅ　ＡｒｇＬｙｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｈ ｅ　八ｌａ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　ｌ１ｅＬｙｓ 　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ 　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ式中、ＸＸは、ＧｌｕまたはＡｓｐ を示し、また場合によっては、部位１のメチオニンが切断しており、また場合に よっては部位２のアラニンがプロ・ツクされており、および／または場合によっ ては例えば、部位３１６のシスティン間の分子間ジスルフィド結合によって凝集 している。

で表されるアネキシン、または生物学的に活性なその誘導体または類似体で、場 合によっては賦形剤、および、またはキャリヤー、および、または安定化剤を伴 うものであることを特徴とする腫瘍細胞関連プロコアゲラント活性を中和するこ とを目的とした薬剤に関する。

また、本発明は、腫瘍の転移を防ぐことを目的とする、場合によっては賦形剤、 および／またはキャリヤー、および／または安定化剤を伴う、アネキシンおよび 天然に存在するその誘導体または類似体、または化学的または遺伝子工学的に合 成したアネキシンまたはその誘導体または類似体からなる群から選択される抗凝 血剤、および 該抗凝血剤が以下の配列式 ％式％ ］ Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　 Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｖａ１２４５　．２５０　２５５ ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　 Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　ＬｅｕＴｙｒ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｍ ｅｔ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　八ｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｔ ｈｒ　Ｌｅｕ　ＺｌｅＡｒｇ　Ｖａｌ　Ｍｅセ　ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｒｑ　Ｓｅ ｒ　Ｇｌｕ　Ｚｌｅ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　ＡｒｇＬｙｓ 　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ 　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｍｅヒ　エ１ｅＬｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　 Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　 Ｌｅｕ　ＬｅｕＣｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　”式中、ＸＸは、Ｇ ｌｕまたはＡｓｐを示し、また場合によっては、部位１のメチオニンが切断して おり、また場合によっては部位２のアラニンがブロックされており、および、ま たは場合によっては例えば、部位３１６のシスティン間の分子間ジスルフィド結 合によって凝集している。

で表されるアネキシン、または生物学的に活性なその誘導体または類似体で、場 合によっては賦形剤、および／またはキャリヤー、および／または安定化剤を伴 うものであることを特徴とする腫瘍の転移を防ぐことを目的とした医薬組成物に 関する。

また、本発明は、腫瘍の転移を防ぐことを目的とする、場合によっては賦形剤、 および／またはキャリヤー、および／または安定化剤を伴う、アネキシンおよび 天然に存在するその誘導体または類似体、または化学的または遺伝子工学的に合 成したアネキシンまたはその誘導体または類似体からなる群から選択される抗凝 血剤の使用、 該抗凝血剤が以下の配列式 ％式％ （式中、ＸＸは、ＧｌｕまたはＡｓｐを示し、また場合によっては、部位ｌのメ チオニンが切断しており、また場合によっては部位２のアラニンがブロックされ ており、および、または場合によっては例えば、部位３１６のシスティン間の分 子間ジスルフィド結合によって凝集している）で表されるアネキシン、または生 物学的に活性なその誘導体または類似体で、場合によっては賦形剤、および／ま たはキャリヤー、および／または安定化剤を伴うものであることを特徴とする腫 瘍の転移を防ぐことを目的とした抗凝血剤の使用、 腫瘍の転移を防ぐことを目的とした医薬組成物を調製することを目的とする、場 合によっては賦形剤、および／またはキャリヤー、および／または安定化剤を伴 う、アネキシンおよび天然に存在するその誘導体または類似体、または化学的ま たは遺伝子工学的に合成したアネキシンまたはその誘導体または類似体からなる 群から選択される抗凝血剤の使用、および腫瘍の転移を防ぐことを目的とした医 薬組成物を調製することを目的とする、場合によっては賦形剤、および、または キャリヤー、および、または安定化剤を伴う、アネキシンおよび天然に存在する その誘導体または類似体、または化学的または遺伝子工学的に合成したアネキシ ンまたはその誘導体または類似体からなる群から選択される抗凝血剤で、以下の 配列式：％式％ Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　ｌ１ｉｓ　八ｌａ 　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　ＴｈｒＧｌｕＬｅｕＡｒｇＡｌａ ＩｌｅＬｙｓらＩｎＶａｌＴｙｒＧｌｕＧｉｕＧｌｕＴｙｒＧｌｙＳｅｒＳｅｒ 　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　ＧＩＹ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ 　Ｓｅｒ　ＧｌｙＴｙｒ　Ｔｙｒ　Ｇ１ｎ１５５　１６０　ｉ６５ ＡｒｇＭｅｔＬｅｕＶａｌＶａｌＬｅｕＬｅｕＧｉｎＡｌａＡｓｎＡｒｇＡｓｐ ＰｒｏＡｓｐＡｌａＧｌｙ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ 　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ａ、１ａ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ１Ｂ５ 　１９０　１９５ Ｇｉｎ　八ｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　 Ａｓｐ　Ｇ）ｕ　Ｇｌｕ　Ｌ）−５Ｐｈｅ　ｌ１ｅＴｈｒ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｇ ｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｒｑ　Ｌ ｙｓ　Ｖａｌ　ＰｈｅＡｓｐＬｙｓＴｙｒＭｅｔＴｈｒＩｌｅＳｅｒＧｌｙＰｈ ｅＧｌｎＩｌｅＧｌｕＧｌｕＴｈｒＩｌｅ２３０　２３５　２４Ｏ ＡＳｐ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　ＧｌｙＡＳｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇ ｌｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａ１Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｉｌ ｅ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｃ４ ｕ　Ｔｈｒ　ＬｅｕＴｙｒ　Ｔｙｒ　八ｌａ　Ｍｅｉ　Ｔ＋ｙｓ　Ｇｌ、ｙ　Ａ ｌａ　らｌｙ　Ｔｈｒ　ＡＳＰ　Ａｓｐ　Ｉ（ｉｓ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　丁１ｅ２ ７５　２Ｂ０　２８５ Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ：　Ｖａｌ、Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ 　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　ＩｌｅＡｒｇｂｙｓ　Ｇｉｕ　？ｎａ　八 ｒｑ　Ｉ−Ｙｓ　ＡＳｎ　）’ｎｅ　Ａｌａ　抽ｃ　、’ｉｅｒ　Ｌｅｕ　Ｕ’ ７Ｌ　ｂｅｔ’　Ｆｌｅｌ：　謔Pｂ ＬＹＳ　ＧＩＹ　ＡＳＰ　Ｔｈｒ　ｓｅｒ　ＧｌＹ　ＡＳＩ）　Ｔｙｒ　ＬＹＳ 　ＬＹＳ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ＬｅｌＪ　ＬｅｌＪ（式中、ＸＸは、Ｇｌ ｕまたはＡｓｐを示し、また場合によっては、部位ｌのメチオニンが切断してお り、また場合によっては部位２のアラニンがブロックされており、および、また は場合によっては例えば、部位３１６のシスティン間の分子間ジスルフィド結合 によって凝集している）で表されるアネキンン、または生物学的に活性なその誘 導体または類似体である抗凝血剤の使用に関する。

以下の実施例は、本発明を説明するものでこれを制限するものではない。

（材料と方法） ＶＡＣαは、ＥＰＡ　Ｏ１８１４６５またはＥＰＡ　０　２９３　５６７と同様 に調製した。ＶＡＣαについて以下のテストを行った。しかし、この結果は他の アネキノン、特にＶＡＣβにも当てはまるものである。

１０％ウノ胎児血清を補ったＲＰｈＩＩ　ｌ　６４０培地中、組織培養フラスコ で結腸腫瘍細胞を培養した。フラスコの底をゴムのワイパーで擦って細胞を回収 し、ＴＢＳＡバフ７７　（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１００ｍＮｆ　ＮａＣ１， ４，５ｒｎｇ／ｍｌ　グルコース、０．５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２ｍ Ｍ　ＣａＣＬ。

ｐＨ７，９）で洗浄後、最後にテスト用に同バッファに懸濁した。この細胞の生 存率は、トリパン・ブルー排除テストで検定した。この操作後、細胞の９５％以 上が生存していた。

（凝血テスト） 特定数の洗浄細胞を５０μｌのクエン酸処理無血小板血漿（ＰＰＰ）に混合する ことにより、結腸細胞の凝血活性を測定した。この混合物を３７℃で２分間攪拌 した。凝血は、ＣａＣＬの添加（最終濃度１０ｍＭ）によって開始した。この混 合物の最終容量は５００μｌであった。凝血は、“ペイトンデュアルウエーブア グレゴメーター”を用い濁度で検定した。

（結果） （結腸細胞に関するプロコアゲラント活性）洗浄した結腸細胞をクエン酸処理し たＰＰＰに加え、その血漿を凝血させた場合、存在する細胞依存の凝血時間が観 測された（第１図）。細胞が無い場合の凝血時間は１５分間以上であったが、８ ＸｌＯ’細胞／ｍ細胞綿胞は、凝血時間を約２分間まで減少した。このプロコア ゲラント活性は、生の細胞によって引き起こされるもので、細胞を遠心するとプ ロコアゲラント活性も共に沈殿化する。

（ＶＡＣαによる結腸細胞関連のプロコアゲラント活性の中和）特定数の結腸細 胞のプロコアゲラント活性は、投与量依存的にＶＡＣαによって阻害された（第 ２図）。細胞数と凝血時間の関係から（第１図）、２１０ｎＭのＶＡＣαは、６ ＸＩＯ’細胞／ｍｌのプロコアゲラント活性の９９％を中和すると計算された。

ＶＡＣαによって中和された細胞をＣａ”存在下で遠心し、ついでＴＢＳＡで洗 浄すると、それらは凝血検定においてプロコアゲラント活性を示さなかった。し かし、もしその液体かＣａ”の代わりにＥＤＴＡを含むならば、その細胞は通常 のプロコアゲラント活性を示した。

（図面の簡単な説明） 第１図　結腸細胞関連のプロコアゲラント活性クエン酸処理した無血小板血漿（ ＰＰＰ）を特定数の結腸細胞を含むＴＢＳＡで希釈した。３７℃、３分間のイン キュベーション後、Ｃａ　Ｃ１ｔを加え（最終濃度１０ｍＭ）凝血時間を測定し た。

第２図　結腸細胞のプロコアゲラント活性に関するＶＡＣαの効果クエン酸処理 した無血小板血漿（Ｐ　Ｐ　Ｐ）を特定数の結腸細胞（最終濃度６×１０６細胞 ／ｍｌまで）および特定量のＶＡＣαを含むＴＢＳＡで希釈した。測定した凝血 時間を第１図と比較し、プロコアゲラント活性結腸細胞の数を外挿した。

自９．１ 結腸綿１）ｉａ／ｍ１（ＸＩＯ’）、対数目盛国際調査報告 −惰−−ｍ−−−ｍＰｃ＋ｒ／ＥＰ９０１０１８６４ＳＡ　４１３４６

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．腫瘍の転移を防ぐことを目的とした、天然に存在するか、もしくは化学的ま たは遺伝子工学的に生成したアネキシンおよびその誘導体および類似体からなる 群から選択される抗凝血剤で、場合によっては、賦形剤、および／またはキャリ ヤー、および／または安定化剤を伴う抗凝血剤。
2. ２．前記抗凝血剤か、以下の配列式： 【配列があります】 （式中、ＸＸは、ＧｌｕまたはＡｓｐを示し、また場合によっては、部位１のメ チオニンが切断されており、また場合によっては部位２のアラニンがブロックさ れており、および／または場合によっては例えば、部位３１６のシステイン間の 分子間ジスルフィド結合によって凝集している）で表されるもの、または生物学 的に活性なその誘導体または類似体で、場合によっては賦形剤、および／または キャリヤー、および、または安定化剤を伴うものであることを特徴とする請求項 １記載の抗凝血剤。
3. ３．腫瘍の転移を防ぐことを目的とした、天然に存在するか、もしくは化学的ま たは遺伝子工学的に生成したアネキシンおよびその誘導体および類似体からなる 群から選択される抗凝血剤で、場合によっては、賦形剤、および、またはキャリ ヤー、および、または安定化剤を伴うものの使用。
4. ４．前記抗凝血剤が、以下の配列式： 【配列があります】 （式中、ＸＸは、ＧｌｕまたはＡｓｐを示し、また場合によっては、部位１のメ チオニンが切断されており、また場合によっては部位２のアラニンがブロックさ れており、および／または場合によっては例えば、部位３１６のシステイン間の 分子間ジスルフィド結合によって凝集している）で表されるもの、または生物学 的に活性なその誘導体または類似体である請求項３記載の抗凝血剤の使用。
5. ５．腫瘍の転移を防ぐことを目的とする医薬組成物の調製を目的とした、天然に 存在するか、もしくは化学的または遺伝子工学的に生成したアネキシンおよびそ の誘導体および類似体からなる群から選択される抗凝血剤の使用。
6. ６．前記抗凝血剤が、以下の配列式： 【配列があります】 （式中、ＸＸは、ＧｌｕまたはＡＳＰを示し、また場合によっては、部位１のメ チオニンか切断されており、また場合によっては部位２のアラニンがブロックさ れており、および、または場合によっては例えば、部位３１６のシステイン間の 分子間ジスルフィド結合によって凝集している）で表されるもの、または生物学 的に活性なその誘導体または類似体である請求項５記載の抗凝血剤の使用。
7. ７．腫瘍細胞関連プロコアグラント活性を中和することを目的とした、天然に存 在するか、もしくは化学的または遺伝子工学的に生成したアネキシンおよびその 誘導体および類似体からなる群から選択される薬剤で、場合によっては、賦形剤 、および、またはキャリヤー、および、または安定化剤を伴う薬剤。
8. ８．前記薬剤が、以下の配列式： 【配列があります】 （式中、ＸＸは、ＧＩｕまたはＡｓｐを示し、また場合によっては、部位１のメ チオニンが切断されており、また場合によっては部位２のアラニンかブロックさ れており、および、または場合によっては例えば、部位３１６のシステイン間の 分子間ジスルフィド結合によって凝集している）で表されるもの、または生物学 的に活性なその誘導体または類似体で、場合によっては、賦形剤、および／また はキャリヤー、および／または安定化剤を伴うものあることを特徴とする請求項 ７記載の薬剤。