JPH05501877A

JPH05501877A - 抗ウィルス物質

Info

Publication number: JPH05501877A
Application number: JP2514837A
Authority: JP
Inventors: ステュアート，デレク; フォレスト，ジョン　マーシャル　スコット; ミュラー，ベルナー
Original assignee: Scottish Crop Research Institute
Current assignee: Scottish Crop Research Institute
Priority date: 1989-10-25
Filing date: 1990-10-25
Publication date: 1993-04-08
Also published as: CA2071546A1; DE69027330D1; US5462853A; DE69027330T2; ATE138808T1; RU2082417C1; EP0497825B1; WO1991006311A1; OA09657A; EP0497825A1; AU6615090A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】坑り」Ｊしす区！本発明は抗ウイルス物質及びその利用方法に関する。

ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）及びヒトリンパ球性ウィルス（ＨＴＬＶ）は世界中に深刻なる問題を生じさせ、そしてこれを解決する有効な手段を見い出すことは非常に重要である。抗ウィルス活性について大量の数の物質が調べられ、そしていくつかは有効作用を有すことが実証きれている。患者の治療のために十分なる利点を提供できるような抗ＨＩＶ活性を有す物質を同定することが所望されている。

後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を有す患者の、ジデオキシヌクレオシド例えばアジドチミジン（ＡＺＴ）による抗レトロウイルス化学療法は、一定の患者を助けることが知られている。しかしながら、怒染化細胞中のウィルス性ＤＮＡポリメラーゼを恐らく阻害するであろう化合物ＡＺＴの毒性は、新しい手法を必要とするほどである。１つの手法は、ＣＤ４リセプター又はウィルスの糖タンパク質をブロックすることによってウィルスの吸着及び侵入を妨害する物質の開発である。デキストランスルフェートはヒト免疫不全ウィルス１型（ＨＩＶ−１）による細胞の感染をブロックできることが示されている。その後、その他の硫酸化多糖類、例えばヘパリンスルフェート、コンドロイチンスルフェート及びポリスルフェート化ポリキシランがインビトロ（生体外）において抗ＨＩＶ活性を有すことが見い出された。これらの化合物はウィルス吸着及びシンシチウム（融合細胞）形成を阻害するが、これらの薬剤のウィルスの伝染性における直接的な効果は認められていない。

ＡＩＤＳ及びＡＴＬ（成人Ｔ細胞白血病）の流行的な発生のため、特に体液中においてＨＩＶ及び類似のウィルスをインタクト又はその成分としてのいづれかにて直接的に同定できうる診断の開発が緊急に必要とされている。これらのウィルスは上記の疾病の考えられる原因である。

ＭｕｌｌｅｒらによるＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｃｑｕｉｒｅｄ　Ｉｔｓｕｎｅ　ＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙＳｙｎｄｒｏｓ＋ｅｓ　１：　４５３−４５８において、ｙｉ土区ヱ　サバグリア（Ｇｅｒａｒｄｉａ　且Ｕ紅ｎ）由来のＤ−マンノース特異性レクチンの、ＨＩＶ−１によるＨ９細胞の感染の予防における利用が既に試まれでいる。このレクチンはサンゴ（ｃｏｒａｌ）からの抽出により得られる。しかしながら、これはヒト血液細胞を凝集せしめ、従ってこれは治療剤としては不適当である。

以下の方法はＨＩＶ−１及びＨＴＬＶの検査のために基本的に有用である：１、電子顕微鏡用調製品に基づく直接的な検出；２　特異的抗体を用いる免疫蛍光物質による識別；３、　遺伝子プローブ及びハイブリダイゼーションによるウィルス成分の検出；４、細胞培養におけるウィルスの増殖；及び５、　抗原捕捉アッセイ（Ａｎｔｉｇｅｎ−ｃａｐｔｕｒｅ　ａｓｓａｙ：　ＡＣＡ）又は競合的捕捉、例えばＥＬＩＳＡや従来ＡＣＡは原理においてのみ詳細されていた；ウィルス又はこのウィルスの成分を認識する抗体を固相、例えばガラス又はプラスチックに固定せしめる。その後、ヒトの物質、好ましくは血清又は血漿をこの結合抗体と接触させる。適当にインキュベーションさせた後、固定化抗体とウィルス（又はウィルス成分）との複合体は標識化ウィルス特異的抗体により識別化されうる。

競合捕捉においては抗体を、ウィルス又はウィルス成分を含みうる試験溶液とブレインキュベーションし、そしてこれを固相に結合している同一のウィルス又はその成分と接触させる。

我々は、マンノース特異的レクチンが精度を伴ってウィルス又はその成分を認識させることができることを見い出した。

本発明により、植物ヒガンバナ科（Ａ■ａｒｙｌｌｉｄａ＾ｅ）の球根由来のマンノース特異的レクチンを薬学的に受け入れられる担体との組合せにおいて含んで成る抗ウイルス物質が提供された。

更に本発明により、抗ウイルス物質として利用される植物ヒガンバナ科の球根由来のマンノース特異的レクチンが提供された。

更に本発明により、マンノース（アルファー−１→３）もしくは（アルファー− １→６）マンノース結合を有する糖タンパク質を含むＲＮＡウィルス、例えばＨＩＶ又はＨＴＬＶの処置のための医薬品の製造のための、植物材ヒガンバナの球根由来のマンノース特異的レクチンの利用を提供する。これらのウィルスは好ましくは末端（アルファー−１→３）結合又は内部（アルファー−１→６）もしくは末端（アルファー−１→６）結合である。

更に本発明により、ウィルスに対する予防のためのワクチンが提供され、該ワクチンは植物材ヒガンバナの球根由来のマンノース特異的レクチンの利用により作られる。

該ワクチンはレクチンに対する抗体をインビボ（生体内）又はインビトロのいづれかにて生産せしめることにより作ることが好ましく、従ってこの抗体は該ウィルスに対する種痘のために利用されうる。

該ウィルスはＨＩＶ又はＨＴＬＶのウィルスであることが好ましい。

該レクチンは好ましくはスイセン属（ナルシサスＨｎａｒｃｉ−ｓｓｕｓ）の球根であることが好ましく、そして例えばナルシサスシュードナルシサスレクチン（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ　ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓｌｅｃｔｉｎ　：　ＮＰＬ）でありうる、その他の特定のレクチンの例はり二一コジャムアエスチブム（Ｌｅｕｃｏｊｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ）及びリューコジャムバーナム（Ｌｅｕｃｏｊ　ｕ−ｖｅｒｎｕ＋＋＋）由来のものである。

ＮＰＬ由来のレクチンはＭａｎ（アルファー−１→３　）　Ｍａｎ及びＭａｎ（アルファー−１→５）Ｍａ　ｎ残基に特異的である。アネモネ（ｓｎｏｗｄｒｏｐ）球根由来のレクチンも有効でありうるが、ヒトの血清中に大量に存在するアルファー−２→マクログロブリンに結合する傾向に基づ（欠点を有する。

ＮＦＬによる試験は３μｓ／ｍｌ（約０．３μＭ）にて、ＨＩＶ感染の阻害において有効率５０％であることが実証された。

該レクチンの抽出はＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ　Ｐｌａｎｔａｒｕｓ　７３　：　５２−５７（”Ｒｅ１ａｔｅｄ　ｍａｎｎｏｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｉｅｃｔｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　５ｐｅ−ｃｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆａｍｉｌｙ　Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａ’）　Ｅｌｓ　Ｊ　Ｍ　Ｖａｎ　Ｄａｍｍｅ。

＾ｎｔ、ｈｏｎｙ　Ｋ　Ａ１１ｅｎと一１１１ｙ　Ｊ　Ｐｅｕｍａｎｓにおいて開示の方法により行なわれることができ、本論文は本明細書に参照文献として組入れる。

レクチンに関する試験方法はＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｃｑｕｉｒｅｄ　Ｉａ＋ｍｕｎｅＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　５ｙａｄｒｏｓｉｅｓ　１　：　４５３　４５８　（＠Ｔｈｅ　Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−ｓｐｅ−ｃｉｆｉｃ　Ｌｅｅｔｉｎ　ｆｒｏｓ　Ｇｅｒａｒｄｉａ　旦胆■田ｈｌｏｃｋｓ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｏｆＨｕｍａｎ　Ｉｓ＋ｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓ　Ｔｙｐｅ　１　ｔｏ　８９　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄｈｕｍａｎ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ’）　Ｗｅｒｎｅｒ　Ｅ　Ｇ　Ｍｕｌｌｅｒ、にａｒｉｎＲｅｎｎｅｉｓｅｎ、　Ｍａｔｔｈｉａｓ　Ｉ（Ｋｒｅｕｔｅｒ、　Ｈｅ１ｎｚ　Ｃ５ｃｈｒｏｄｅｒ　とＩｒｆｉｎＷｉｎｋｌｅｒにおいて開示の方法により行なわれることが好ましく、本論文は本明細書に参照文献として組入れる。

更に本発明により、Ｍａｎ（アルファー−１→３）Ｍａｎ又はＭａｎ（アルファ一−−１→６）Ｍａｎ結合を有する垢タンパク質を含むＲＮＡウィルスについての、マンノース特異的レクチンを含む診断用Ｔｈ質が提供される。

又、本発明はＭａｎ（アルファー−１→３）Ｍａ　ｎ又はＭａｎ（アルファ一− −川→６）Ｍａｎ結合を有す糖タンパク譬を含むＲＮＡウィルスについての診断方法であって、抗原捕捉又は競合捕捉アッセイにおいて前記の診断用物質を利用することを含んで成る方法に関する。

本発明はまた、ＲＮＡウィルスのＭａｎ（アルファー−１−＋３）Ｍａｎ又はＭａｎ（アル７ｙ　−−１→６）Ｍａｎ結合の検出のための検査キットであって、マンノース特異的レクチンを含むものを提供する。

該レクチンは人工的な材料、ガラスピーズ又はプラスチック材料のストリップ上に固相させることが好ましい、その後、この固相化レクチンを一定量のヒト試料、血清又は培地と適当な時間にわたってインキュベートさせる。中性ｐＨの溶液による洗浄後、このレクチン−ウィルス（又はウィルス成分）複合体は、該ウィルス（又はその成分）に特異的な抗体を用い、確立されている方法「サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ　（Ｅ　Ｌ　Ｉ　ＳＡ）　Ｊ　（Ｗａｌｋｅｒ、　Ｊ　Ｍ　：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕ−１ａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ；　１巻、　Ｕｒｂａｎａ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃ１１ｈｔｏｎ；　１９８４）において１　定量されうる。

更に、該レクチンを直接的に標識化することがある０例えば以降の標識物質が利用できうる；放射活性ヨウ素１２５、フルオレセインイソチオシアネート又は酵素例えばペルオキシダーゼ（Ｎｏｗｏｔｎｙ、　Ａ、　：　Ｂａ５ｉｃ　Ｅｘｅｒｃｉｓｅｓ　ｉｎ　ｆ＊ｕｎｏｃｈｅｓｉｓ−ｔｒｙ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ− ｖｅｒｌａｇ、　Ｂｅｒｌｉｎ　；　１９７９）　ｅ定量のために利用できる方法は：放射活性の評価（放射性標識の場合）、蛍光定量法（フルオレセインイソチオシアネート標識抗体について）又は特定の基質との酵素活性（上記の場合、水素ペルオキシダーゼ）である。

該新規診断法により得られる精度は高い。更に、このクラスのレクチンの原材料は安価である利点がある。

本発明の態様を以下の実施例において例示することにより詳細する。

夫隻鼾ナルンサスシュードナルシサス（ＮＦＬ）由来のレクチンはｖａｎ　Ｄａｍｒａｅら（１９８８）により詳細の通りに精製した。

−ウーイルス基ＨＩＶ−１のＨＴ　Ｌ　Ｖ−１［［Ｂ　（Ｐｏｐｏｖｉｃら、１９８４）株、並びに２種のＨＩＶ−２株、ＨＩ　Ｖ　２ＳＴ　（ＫＯｎｇら、１９８８）及びＨＩ　Ｖ　−２１，＋５（Ｋａｎｋｉら、１９８８）を試験した。

ＨＩＶ粒子はＰｏｐｏｖｉｃら（１９８４）に詳細の通り、ＨＴ　Ｌ　Ｖ−ＩＩＩＢ感染化Ｈ９細胞の培地より調製した。

放射性標識ウィルスは以下の通りに調製した。２週間を経た（２ｗｅｅｋｓ　ｏｌｄ）　ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−Ｉｔ［Ｂ感染化Ｈ９ａｌｌ胞（Ｐｏｐｏｖｉｃら、１９８４）を、５０　ｎＣｉ／ｓ＋１の（ｓｓ３３メチオニンを含む培地中で２日間インキュベートした。低速遠心（４，ＯＯＯＸｇ：１０分：４℃）により無細胞上清液を得た。次にこれを０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ１ｌ衝液（ｐＨ７，４；　Ｏ，ＩＮのＮａＣ１；０、ＯＯＩＭのＥＤＴＡ）に対して５時間、４°Ｃで透析し、そしてウィルス粒子をベックマンＴｉ−４５０−ターにおいて３０，０００ｒｐｍ＋で２時間（４°Ｃ）の遠心により集めた。

得られるペレットを３ｍｌの線状スクロース勾配にて２４時間詳細の通りＣＰｏｐｏｖｉｃら、１９８４）に遠心にかけた。１．１８〜１．１５ｇ／ｍｌの密度の範囲内の両分を集めた。この比放射活性は１．３と２．９Ｘ１０−”のＣｉ− ピリオン（ウィルス粒子）の間にあった。この粒子を電子顕微鏡的に測定した（Ｐｏｐｏｖｉｃら、１９８４）　、第２精製工程、ニコデンズ（ｌｉｙｃｏｄｅｎｚ）遠心勾配法を通用してピリオンを調製した（Ｖｉｌｍｅｒら、１９８４）。

この工程の後、このウィルス調製品の比活性はスクロース遠心勾配により得られるものと同一であった。このことは細胞膜がウィルス粒子と一緒に沈降しなかった一指標である。

とウィルスの感ヒトＴ−細胞系Ｍ　Ｔ　−２（Ｈａｒａｄａら、１９８５）　、ＣＥ　Ｍ　（ＮａｒａとＦｉｓｃｈｉｎｇｅｒ、　１９８９）　、Ａ　Ｔ　Ｈ８（ＭｉｔｓｕｙａとＢｒｏｄｅｒ、１９８８）及びＨ９（Ｐｏｐｏｖｉｃら、１９８４）　、ヒト単球系Ｕ９３７　（ｆ：ｚｅｋｏｖｉｔｚら、１９８９）　、並びにＣＥＭとＢ細胞系１７４との体細胞バイブリド培養＠３０［ｏｎｇら、１９８８）を、１５％の修生血清の添加されたＲＰＭ１１６４０培地（Ｍｕｌｌｅｒら、１９８８）中で増殖させた。この培養物を高温雰囲気中で、大気中の５％ＣＯ□にて３７ ℃で維持せしめた。

ＨＩ♂Ｌニュ」１竪：この細胞をルーチン的にｌＸｌ０’細胞／ｍｌの濃度で植え付け、そしてＨＩＶ−１ウイルスをこれに加え、ＭＴ−’２細胞当り０．０３の中間組織培養感染投与量（ＴＣＩＤｓ。）、ＣＥＭ又はＵ９３７細胞当り０．１２のＴＣＩＤ、。の感染多重度（Ｍｏｌ）とさせた。この細胞を、試験化合物の存在下又は非存在下において７日間インキュベートした。このインキュベーションの際、非怒染化ＭＴ２細胞は２．９１の倍増ステップ（ｄｏｕｂｌｉｎｇ　５ｔｅｐ）、ＣＥＭ細胞は２．１４の倍増ステノブ、そしてＵ９３７＄［［Ｉ胞は１．９３の倍増ステップであった。感染化細胞は以下の倍増ステ・ノブであった。ＭＴ−２／ＨＴＬＶ〜ＩＩＩＢ：０．０９．ＣＥＭ／ＨＴＬＶ−ＩＩ［Ｂ　：　０．０４　；そしてＵ９３７／ＨＴＬＶ−Ｉ［［Ｂ：０．０８゜何らかの記載がない限り、透明にコンディションされた（ｃｌａｒｉｆｉｅｄ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）　ＨＩ　Ｖ　−１培養流体を種々の化合物と予備処理せしめ（３６°Ｃで３０分）、その後表示の化合物及びウィルス濃度となるように細胞に加えた。このウィルス調製品は１００μｍの容量において該化合物と一緒にブレインキュベートせしめた（細胞培養実験中に最終的に存在する量よりも１０倍高い濃度）。

旦土エニ」」１しＨＩ　Ｖ　−２’テ生産性ＣＥＭＸ１７４細胞及びＨＩＶ　２ＭＳ生産性Ｕ９３７細胞を１０，０ＯＯｒａｄによって照射せしめ、その後４Ｘ１０’個の細胞／最終アッセイ容量■ｌにて２Ｘ１０’個のＡＴＨ８細胞と一緒に共培養せしめた。７日間のインキュベーション後、ＡＴＨ８細胞のみが生存しており、そしてそれらの密度を調べた。該試験化合物は該照射細胞に、ＡＴＨ８細胞を加える３０分前に加えた。

非感染化コントロールにおいて、ＡＴＨ８細胞は７日間のインキュベーションにわたり２．０１の倍増ステップであった。

鼓ｌ：細胞濃度はＸＴＴ比色分析システム（Ｓｃｕｄｉｅｒｏら、１９８Ｂ）　、その後のＥＬＩＳＡ−リーダー（Ｂｉｏ−ＲＡＤ、　＃３５５０型；プログラムＮ（１ＭＲＩ［ＩＢ装備）による評価を利用して評価した。増殖カーブを検量化させるため、細胞を電気的に測定だ（サイトコンブ（Ｃｙｔｏｃｏｍｐ）カウンター、ミカエリス型（Ｍｏｄｅｌ　Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ））、倍増ステップ数はＭｕｌｌｅｒら、１９７５に詳細の通りに測定した。

５０％細胞保護濃度（ＩＣ６゜）は、７日間のインキュベーションにわたってＨＩＶ感染化細胞の細胞増殖を非感染化細胞の増殖速度の５０％に達しめる濃度を示す。５０％細胞毒素性濃度（ＴＣ，。）は、感染化細胞の増殖速度を５０％下げる濃度を示す。この値は非感染化細胞のＴＣ，。と通常類似する。これらの５０％値はロジット（ｌｏｇｉｔ）回帰により計算される（Ｓａｃｈｓ、　１９８４）、抗ウイルス指数（ＡＩ）はＴｃ５ｏ：ＩＣ，。比から計算する。

シンシチウム悸　ア・セイこのアッセイはＭａｔｔｈｅｗら、１９８７に詳細の通りに行った。

全部で１×ｌＯＳ個のＨＴＬＶ−Ｉ［［Ｂ−感染化Ｈ９細胞を１×１０Ｓ個の非感染化ジャーカッ）　（Ｊｕｒｋａ　ｔ）細胞と、最終容量１００μｌにおいて、該化合物の存在下又は非存在下におけるいづれかにて混合せしめた。５及び２４時間後、シンシチウム形成（共有細胞膜内に４個より多くの核として定義）を半定量的に評点した（Ｌｉｆｓｏｎら、１９８６）　ニーはシンジチア無し；１＋は若干のシンジチア；２＋は複数の中間的な大きさのシンジチア；３＋は全てではないがほとんどが顕微鏡視野において大きいシンジチア；　（倍率：Ｘ４００）；そして４＋は調べた全ての視野内での真人な数の大きいシンジチア、を示す。

ウィルス−の　八　− ＩＸＩＯ’個のＭＴ−２細胞を１＋＋＋１の結合アッセイ緩衝液（２０ａＭのリン酸−Ｎａ、１ｍＭのＣａＣ１ｚ、１３０＋＋ＭのＮａＣ１，２％（Ｗ／Ｖ）の牛血清アルブミン［Ｍｕｌｌｅｒら、１９８２）　）に懸濁させた。次に２０μ ｌの標識化ウィルス（約２５Ｘ１０’ｄｐ＊／アンセイ（最終））を加え、そして５％のＣＯ！中で３７℃にて０〜６０分インキュベートした。次にこの細胞を遠心しく２，０００ｇ；１０分；４℃）そして放射活性を測定した。

ウィルス調製品は１０ｔ１１のナルシサスレクチン溶液と１藍金跋菫非感染化ＭＴ−２細胞又はＨＴＬＶ−１［［Ｂ感染化ＭＴ−２細胞（感染は前記の通り３日間行っている）への結合を同じように調べた。最終容量１ｍｌの結合緩衝液中のＭＴ−２細胞（ＩＸＩＯ’個）を４℃で３０分間プレインキュベートした。

次にこの細胞懸濁物を遠心により（２，０００ｇ；１０分；４℃）２回洗浄し、そしてこの細胞の１■阿のＣａ”″の存在下又は非存在下においてＮＦＬと１ｍｌの容量中でインキュベートした（４℃で１時間）、最後に、この細胞を遠心により結合緩衝液で２回洗浄し、そして細胞結合性放射活性を測定した。バックグランド値（細胞は含まないがＣａ”°の存在下でのアッセイ）は５０ｄｐｍ　＋ｓｌであった。

ナルシサスレクチンの　ＨＩＶ・抗ＨＩＶ活性について、±／Ｌ／　＞　ｆ　Ｘレクチンをまず細胞保護アッセイに適用することにより試験した（細胞密度はＸＴＴテトラゾリウム／ホルマザンアッセイにより測定した）。

表１に示す通り、このマンノース特異的ナルシサスレクチンは＞１４〜〉４６の間のＡＩを伴うがなりの抗−ＨＩＶ−ＩＩＩ　胞保１　作用ヲ示Ｌ　タ。ＣＥＭＸ１７４／ＨＩＶ−２ｓｔとＵ９３７／ＨＩ　Ｖ　２ｎｓ系においては、ＡＩはそれぞれ〉１５と〉１２であることが測定された。更に、ＮＰＬは１１００ｔＩ／ｓ＋Ｉ迄細胞障害作用を示さなかったが、ＡＺＴは約９μ／ｍｌの濃度で５０％細胞障害作用を引き起こした（表１）、比較ノタメ、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ− ２に対すルＡｚＴの阻害活性を表に含ませた。

ナルシサスレクチンによる、シンジチア無／　のジャーカット細胞とＨＴＬＶ− Ｉ［ＩＢ生産性Ｈ９細胞との共インキュベーション中での、シンシチウム誘発アッセイへの±ＪＬ／　−、／　＋　７．レクチンの添加は強くシンシチウム形成を阻害した（表２）、３μｇ／醜ｌのレクチンの濃度では、シンシチウム形成は全く見られなかった。

ルシサスレクチンによる　ＭＴ−２へのＨＩＶ−１の詰ｊ駆υ１電更に、す」夕とユ２２レクチンの添加（２０μｇ／ｍｌ）はほぼ完全にＨＩＶ− １（ＨＴＬＶ−１［［Ｂ）粒子＜７）ＭＴ−２細胞への結合を阻止した０図１はナルシサスレクチンの、ＭＴ−２細胞へのＨＩＶ−１の結合性における効果を示す。（ｓｓ３）メチオニン標識化ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−Ｉ［［Ｂ）をＭＴ−２細胞と一緒に、あらゆる更なる化合物の非存在下又は２０μｇ／■ｌのフ」タトｉノ、レクチンの存在下のいづれかでインキュベートせしめた。このサンプルを０−６０分後に採取し、そしてＭＴ−２細胞に結合している放射活性を前記の通りに測定した。

本実施例はＨＩＶへの結合性、並びにＨＩＶ−１及びＨＩ　Ｖ　−２による細胞の感染の予防におけるＮＰＬの働きを示す。

ＮＦＬ　４．９７　＞１００　＞２０　２．１８　＞１００　＞４６　７．３１　＞２００　＞７４ＨＩＶユ１ＣＥＭＸ　１７４／ＨＩＶ−２３Ｔ　ｔｌＰ３７／ＨＩＶ−２ｓｓＡＺＴ　０．０２３　Ｂ、７　３７８　０．０９４　９．１　９７ＮＦＬ　６．５８　＞１００　＞１５　８．５７　＞１００　＞１２２ンシ悸ちル瓜１．０　１＋　１＋３、　０−−− 丈酉２準入レクチごの、ＨＩ　Ｖ−１のＭＴ−２細胞への結合への効果は図１において示した。（”Ｓ）メチオニン標識化ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−１［ＩＢ）を、いかなる更なる化合物の非存在下（実線・）又は２０μｇの±／Ｉ／　’ｙ　 ”ｔ　Ｚレクチン（実線×）のいづれかでＭＴ−２細胞とインキュベートした。

このサンプルを０−６０分後に採取し、そしてＭＴ−２細胞に結合している放射活性を前記の通りに測定した。

図２はＨＴＶによる感染に対する処置において利用するだめの、内在イメージ（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｉｍａｇｅ）抗イデイオタイプ抗体の生産の図解を示す、レクチンＮＰＬＩＯはリセプタ一部位１４．１６を介してＨＩＶウィルス１２のエンベロープ糖タンパク質に結合できる。従ってこのレクチンを感受性マウスに誘入セしめて抗レクチン抗体１８を作ることができる。

これらの抗体のい（つかはウィルスエンベロープ糖タンパク質すセプター部位を擬態し、そしてそれらはアフィニティークロマトグラフィー及び該レクチンを擬態する抗イデイオタイプ抗体を発生させることができる能力によって選別される（Ｗｅｉｌｅｒら、１９９０　；　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）。

選別した該抗体はワクチンとして、又は感染化患者の治療のための抗−抗レクチン抗体を生産するよう同系マウスを免疫化させるために利用されうる。他方、この選別抗体は、マウスの肺臓からの細胞とのインビトロでの培養によって抗−抗レクチン抗体を生産するために利用されうる。

ＨＩＶ又は類似のウィルスに対するワクチンを作るための化合′＃ＪＮＰＬの利用は、該化合物を高性能液体クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、そしてこれを適切な免疫ルートによって不ズミ抗体を発生せしめるために利用することによって成し遂げられうる。

もしこの生成物が低い抗原性である場合、それらを免疫化の前に担体タンパク質と結合させることができ、又はそれがだめならばインビトロでネズミ細胞系を免疫化させることができる（Ｖａｕｘら、１９８８　；　Ｎａｔｕｒｅ　３３６．３６−４２）　。

該ウィルスリセプター部位の内在イメージを擬態する抗体を次にアフィニティークロマトグラフィー、及び／又はそれらの活性抗−イディオタイプ抗体を提供する能力によって選別する（Ｗｅｌｅｒら、１９９０　；　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）。

最後に、該ワクチンは適当なルートにより、免疫刺激複合物又はその他のアジユバントと一緒に投与されうる（Ｔａｋａｈａｓｉら、１９９０；　Ｎａｔｕｒｅ　３４４．８７３　８７５）。

図３の参照において、宿主の膜２８上の部位に結合できるウィルス２４は、マウスにおいて抗ウイルスモノクローナル抗体のライブラリーを生産せしめるための免疫原として利用できる。該ウィルス２４上のりセブター結合部位に対するモノクローナル抗体２２を、その中和能力の理由により選別する。抗ウイルスモノクローナル抗体２２を同系感受性マウスに注射すると、抗原結合部位２８に特異性を有す、抗−ウィルスモノクローナル抗体２２の抗−抗体（抗−イディオタイプ抗体）２６が作られる。抗イディオタ・イブ抗体２６のサブセントは、本来のウィルスのりセプター結合部位と類似する構造を有する。従ってこのような「内在イメージ」抗−イディオタイプ抗体２６は細胞膜リセプターと反応する。

更に、このような「内在イメージ」抗イデイオタイプ抗体２６による免疫化は、仇−仇イディオタイア仇俸τ冗王ごせることができ、そのうちのいくつかはウィルス２４の結合部位に特異的に反応するであろう。

例えば、レクチンを精製できたら、それを抗レクチン抗体を生産するようマウスに注射することがある。このような抗体は多数の手段、例えばインビトロで第２マウスを免疫化せしめること、又はマウスの肺臓から細胞を採取してインビトロで培養することによるインビトロにて利用されうる。

更なる実施例は、診断における本発明の利用を例示する。

！簾■又植物ナルシサス　ニレシサス由来のレクチンはｖａｎ　Ｄａｍｗｅら、１９８８に詳細の通りに単離できる。このレクチンはＤ−マンノースを特異的に認識する。

診断としての検出は、アウターローニー／ダブルゲル拡散アッセイ（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ、　０．　；　Ａｃｔａ　Ｐａｔｈｏｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５ｃａｎｄ。

２６：　５０７．１９４９）により成し遂げられる。生理食塩水中の１％の寒天をガラスシャーレにまき、そして固形化させる。その後、７ｍｍの間隔で径３＋ｗｍのウェルを開ける。１つのウェルに２０μｌのレクチン（２μｇ／曽１）を入れ、そして隣りのウェルに２０μｌのウィルスタンパク質（２μｇ／ｍｌ）を入れる０選ばれたウィルスタンパク質はＨＩＶ−１由来のｇＰ１２０であった。

ｇｐ１２０はＭａｔｔｈｅｗｓら、１９８７に詳細の通りに単離した。このシャーレをモイストチャンバー内で室温にて２日間放置し、その後沈殿線がはっきり見られた。

このような沈殿の形成は典型的な特異的認識反応の明白なる指標である。

ｍユＨＩＶウィルス及びその成分はダブルゲル拡散試験においてレクチンと特異的に反応する。本実施例において、該±土シサスレクチンが診断工程に含まれうることを実証する。

ポリスチレン製マイクロタイタープレート（平底９６穴）のウェルに１００ｕｌの該丈」仙乙並１ヨレクチン溶液（生理食塩水中に２０Ｍｇ／−１）を加えた。

このプレートを室温で１６６時間インキュベートた０次にこのウェルを、Ｏ，１ＭのＮａＣ１及び０．０２Ｍのトリス〔ヒドロキシメチルコアミノメタンを含む０．５％のツイーン８０水溶液ｐＨ７，４で洗浄した。ツイーン８０は未結合レクチンを除去するための、Ｓｉｇｍａ　（Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，ＵＳＡ）より入手したものである０次にこのウェルに１００μｌの試験溶液（以下参照）、即ち、ＡＩＤＳ患者の血清又はＨＩＶ−４タンパクｉｉｇｐ１２０の溶液を加えた。室温で８時間のインキュベーション後、未結合物を除去するためにそれらを上記のツイーン８０によって順次（３×５分）洗浄せしめた。その後、ＨＩＶ −１特異的ｇｐ１２０に対するポリクローナル抗体１００μｌをこのウェルに加えた（該ポリクローナル抗体はウサギにおいて生産：Ｆａ　Ｂｉｏｃｈｒｏｍｅ、　Ｂｅｒｌｉｎより入手）、この工程に利用した抗体はビオチニル化されていた。これは１０ｎｇ／ｍｌの濃度で利用した。室温で６０分間インキュベーション後、このウェルを再びツイーン溶液で洗浄しく３×５分）、そして１：５００のアビジン−ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇ＋ｗａ　Ｌｔｄ）　ｉ９液１００ｕｌと更に６０分間インキュベーションした０次にこのウェルをツイーン溶液で洗浄しく３×５分）、そしてペルオキシダーゼ基質１００μｌを加えた。これは０．０３％の水素ペルオキシダーゼ水溶液及び８ｓ＋Ｈの４−クロロ−１−ナフトールエタノール性溶液より成る（１：１で混合）、室温で１時間インキュベーションした後、波長４１４ｎｍでの吸光度を光度計によって測定した０次の表に典型的な実験結果を示す。

ＡＩＤＳ患者の血清　１：１　３．６８１：２　１．８２１：４　０．８５ｔ’ｓ　Ｏ，４３ｔｉｔｓ　Ｏ，１８１：３２　０．０９ｇｐ１２０　０．０５　１．３９０．０２５　０．６４０．０１２５　０．３２０、　ＯＯ５０，１２０，００２５０，０６吸光度はブランク（健康な大由来のコントロール血液もしくはヒト血清アルブミン）又は同一濃度に対して測定した。

この表より、該詳細の抗原捕捉アッセイはＨＩＶ−１ウイルス又はその抗原の１つ、ｇｐ１２０の存在を、精度を伴って検出せしめることが出来ることが明らかである。

１施■土ＨＩＶタンパク質を基礎とする捕捉アッセイにおけるナルシサスシュードナルシサス由来のレクチンの包含。

ポリ塩化ビニル製９６六マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ）をＯ，１ｍｌのＨＩＶタンパク質（０，１ＭのＮａ−炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，６）中において１０Ｍｇ／ｍｌ）で被覆せしめた。

高温雰囲気下で４℃にて１２時間のインキュベーション後、このタンパク質溶液を除去し、そしてこのウェルに希釈溶液（１ａ＋＋１のＣａＣ１，及び０．０２％のアジ化Ｎａの添加された、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の３％の牛血清アルブミン）を加えた。室温で２時間インキュベーションさせた後、このプレートをＰＢＳにより２回洗浄した。

その後、このプレートを１００μｌの抗原試験溶液と３７℃で２時間インキュベートした。この抗原試験溶液は、一定量のアルカリホスファターゼの結合したナルシサスシュードナルシサスレクチンＮＦＬ　（５ｎｇ）５０μＩ及び希釈溶液（前記）中における増大する濃度の遊！ｇｐ１２０（０〜Ｌｏｎｇ）５０μｌより成る。ＮＰＬ及び遊１１ｇｐ１２０より成る該試験溶液はＨＴＶタンパク質被覆ウェルに加える前に、高温雰囲気下においてブレインキュベートさせた（２０ °Ｃで２時間）。

実験の一系列において、酵素結合ＮＰＬ　５０μｌをまずこの被覆ウェルに加えた。ＰＢＳ　５０μｌでの洗浄工程の１０分後、逐次的に遊離ｇｐ　１２０を加えた。

ＨＩＶタンパク質被覆プレートと３７°Ｃで６０分にわたる、（１）ブレインキュベートせしめた物質のサンプル（ＮＰＬ及び遊離ｇｐ１２０）とのインキュベーション、又は（２）該成分の逐次添加後のインキュベーション（該プレートのＮＰＬとの第１インキユベーシヨン及びｇｐ１２０による洗浄段階）の後、このウェルをＰＢＳ中の０．０５％のツイーン２０により２回、その後ｌＯ■門のジェタノールアミン（ｐＨ９，５，０，５＋ｓＭのＭｇＣ１，含有）により２回洗浄した。

このプレートを乾燥させた後、５０μｌのアルカリ性基質溶液を加えた。この反応を０．１ＭのＥＤＴＡ　５０μ】の添加により停止させ、そしてＥＬＩＳＡリーダーにおいて４０５ｎｍにて吸光度を測定した。

図４はＨＩＶタンパク質を基礎とする捕捉アッセイの検量線である。マイクロタイタープレートのＨＩＶタンパク質被覆ウェルを一定量のアルカリホスファターゼ結合ＮＦＬ　（ナルシサスシュードナルシサスレクチン）（５ｎｇ）及び増大する量（ＯＬｏｎｇ）の遊離ｇＰ１２０とインキュベートした。

該成分は２通りの方法において加えた。即ち、（ｉ）ＮＰＬ及びｇｐ１２０をまずブレインキュベートし、その後該被覆ウェルに加えること（ＮＰＬ／ｇｐ　１２０　（プレインキュヘ−ト）Ｌ又は（１１）該成分を逐次的に、即ち、まずＮＦＬを該被覆ウェルに加え、その後ｇＰ１２０を加えること（ＮＰＬ＋ｇｐ　１２０　（逐次）〕である。インキュベーション及びアルカリホスファターゼ基質溶液の逐次添加の後、該固相支持体に結合している免疫複合物をＥＬＩＳＡリーダーにおいて吸光度を測定することにより定量した。５回の平行実験の平均値を示す；ＳＤは１２％以下であった。

参考文献Ｅｚｅｋｏｖｉｔｚ　ＲＡ、　Ｋｕｈｌｍａｎ　Ｍ、　Ｇｒｏｏｐｍａｎ　Ｊ　ＦとＢｙｒｎ　ＲＡ　（１９８９）Ａ　ｈｕ＋ｓａｎ　ｓｅｒｕｍ　ｍａｎｎｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１ｎｈｉｂｉｔｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒ。

１ｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ、Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　１６９＋　１８５−１９６゜Ｈａｒａｄａ　Ｓ、　Ｋｏｙａｎａｇｉ　ＹとＹａｓ＋ａｍｏｔｏ　Ｎ　（１９８５）　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｆＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ　ｉｎ　ＨＴＬＶ−１−ｃａｒｒｙｉｎｇ　ＭＴ−２ａｎｄ　ＭＴ−４ａｎｄ　ａｐｐ−１ｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ａ　ｐｌａｑｕｅ　ａｓｓａｙ、５ｃｉｅｎｃｅ　２２９．　５６３−５６６゜Ｋａｎｋｉ　Ｐ、　Ｂａｒｉｎ　ＦとＥｓ５ｅｘ　Ｍ　（１９８８）　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙｔｏ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ＨＩＶ−２１ｓｏｌａｔｅｓ、Ｆｏｕｒｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅ−ｒｅｎｃｅ　ｏｎ　ＡＩＤＳ；　５ｔｏｃｋｈｏｌ曙；　Ａｂｓｔｒａｃｔ　＃　１６５９゜Ｋｏｎｇ　Ｌ　Ｉ、　Ｌｅｅ　Ｓ　’４．　Ｋａｐｐｅｓ　Ｊ　Ｃ，Ｐａｒｋｉｎ　Ｊ　Ｓ、　Ｄｅｃｋｅｒ　Ｄ。

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Claims

【特許請求の範囲】

１．植物科ヒガンバナの球根由来のマンノース特異的レクチンを、薬学担体との組合せにおいて含んで成る、抗ウィルス物質。
２．抗ウィルス物質として利用するための、植物科ヒガンバナの球根由来のマンノース特異的レクチン。
３．Ｍａｎ（アルファー−１→３）Ｍａｎ又はＭａｎ（アルファー−１→６）Ｍａｎ結合を含むＲＮＡウィルスの処置のための薬剤の製造のための、植物科ヒガンバナの球根由来のマンノース特異的レクチンの利用方法。
４．前記のレクチンがナルシサス（スイセン属）由来である、請求項１，２又は３に記載の物質又はその利用方法。
５．前記のレクチンがナルシサスシェードナルシサスである、請求項４に記載の物質又はその利用方法。
６．Ｍａｎ（アルファー−１→３）Ｍａｎ又はＭａｎ（アルファー−１→６）Ｍａｎ結合を有する糖タンパク質を含むＲＮＡウィルスに対するワクチンを製造する方法であって、処理方法として植物科ヒガンバナの球根由来のレクチンに対する抗体を製造せしめ、そしてその後該抗体から抗一抗レクチンを製造せしめることを含んで成る方法。
７．Ｍａｎ（アルファー−１→３）Ｍａｎ又はＭａｎ（アルファー−１→６）Ｍａｎ結合を有する糖タンパク質を含むＲＮＡウィルスに対する診断用物質であって、マンノース特異的レクチンを含む物質。
８．前記のレクチンがナルシサスシュードナルシサス由来である、請求項７に記載の診断用物質。
９．Ｍａｎ（アルファー−１→３）Ｍａｎ又はＭａｎ（アルファー−１→６）Ｍａｎ結合を有する糖タンパク質を含むＲＮＡウィルスについての診断方法であって、請求項７又は８に記載の物質をアッセイにおいて利用することを含んで成る方法。
１０．Ｍａｎ（アルファー−１→３）ＭａｎもしくはＭａｎ（アルファー−１→ ６）Ｍａｎ結合を有する糖タンパク質を含むＲＮＡウィルス又はその成分の検出のための検査キットであって、マンノース特異的レクチンを含んで成るキット。
１１．前記のレクチンが植物科ヒガンバナの球根に由来する、請求項１０に記載の検査キット。
１２．前記のレクチンがナルシサスシェードナルシサスに由来する、請求項１１に記載の検査キット。