JPH0825890B2

JPH0825890B2 - 抗ウイルス剤

Info

Publication number: JPH0825890B2
Application number: JP62152092A
Authority: JP
Inventors: 教文杉田; 浩一新村; 義春小口; 国孝広瀬; 謙一松永; 稔大原; 成明武藤; 淳二角地; 孝雄古荘; 親雄吉汲; 正明高橋
Original assignee: 呉羽化学工業株式会社
Priority date: 1987-06-18
Filing date: 1987-06-18
Publication date: 1996-03-13
Anticipated expiration: 2011-03-13
Also published as: US4985543A; JPS63316730A; EP0295955A2; EP0295955A3; CA1338849C

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、植物種子から抽出される血球凝集素すなわ
ちレクチン類を有効成分とする抗レトロウイルス剤に関
する。

近年、Ｂ型肝炎、成人Ｔ細胞白血病さらにはAIDS（Ac
quired Immunodeficiency Syndrome）と、次々にウイル
ス病が話題の焦点となっている。ウイルス病に対しては
これまでワクチンによる予防接種で対応し、天然痘根絶
をはじめ、黄熱病、ポリオウイルスの制圧がなされてき
た。しかしAIDSなどのような持続感染や潜伏感染が問題
となる病気に対してはワクチンだけでは対応出来ず、安
全ですぐれた効果を示す抗ウイルス剤の開発が期待され
ているのが現状である。そこで、本発明者らは各種の薬
剤を鋭意検討したところ、驚くべきことに本発明のレク
チン類が抗レトロウイルス作用の薬理効果を有している
ことを見出して本発明に至ったものである。

ここでレクチン類とは、細胞凝集、分裂誘発機能活性
化、細胞障害などの効果を及ぼす物質を言う。植物種子
から抽出される血球凝集素すなわちレクチン類（以下本
物質と略称する。）が、HIVの吸着阻害活性、RTase阻害
活性を有することを見出した。本発明でレクチン類が得
られる双子葉植物網はＭkelaの分類（O.Mkela,Ann.
Med.Exp.Biol.,FENN35Supl.II（1957）；森良一、大沢
利昭共著「レクチン」講談社昭和51年６月10日発行）に
よって分けられる２群、３群に属するものの内、２群か
らは、Abrus precatorius,Calpuria aeggptiana,Fomes
formentarius（ツリガネタケ）,Maackia amurensis（イ
ヌエンジュ）,Phaseolus lunatas（リママメ）,Phaseol
us vulgaris（インゲンマメ）からなるものが選ばれ、
３群からは、Canavalia ensiformis（タチナタマメ）,J
ack bean（ナタマメ）,Cerastrium fomentosusからなる
ものが選ばれる。

特に、イヌエンジュ、ナタマメに属する属のものが好
ましい。

抽出に際して用いる水系溶媒とは水又は水に可溶な有
機溶媒、酸、塩基又は塩のいずれかを少量、例えば10％
程度以下含有する水溶液から選択される１種又は２種以
上の組合せよりなるものである。有機溶媒としてはメタ
ノール、エタノール、イソプロピルアルコールなどが主
として用いられる。酸としては、塩酸、硫酸、酢酸など
である。塩基としてはアンモニヤ、苛性ソーダ、苛性カ
リ、炭酸ソーダなどである。

抽出は原料（乾燥基準）に対して５倍乃至200倍量の
抽出液を使用し、通常は４℃乃至150℃で20分乃至20時
間処理するものである。

精製処理工程とは、塩析、アフィニティクロマトグラ
フィー、透析、限外濾過、逆滲透処理、ゲル濾過、有機
溶媒による沈澱処理などの１種又は２種以上の方法の適
用により低分子物を除去することを意味するものであ
る。工学的には加圧による膜分離法である限外濾過法、
逆滲透処理法の単独又は組合せが特に好ましい。又場合
により塩析工程後これらの処理を行ってもよい。

塩析工程に用いる塩析剤は硫安、食塩、塩化カリ、炭
酸バリウム等であるが、硫安の使用が最も好ましい。又
塩析工程の後処理として透析、限外濾過、ゲル濾過、逆
滲透処理等のいずれか１つ又はこれらの２以上の工程の
組合せが必要である。

アフィニティクロマトグラフィーは、担体にデキスト
ラン、アガロース、ポリアクリルアミドゲル等を用い、
それ単独か或いはそれらの担体に化学的手法で精製され
るレクチンに特異性の高い糖鎖構造を有する物質を固定
化したカラムが通常用いられる。

透析は通常セロファン膜、コロジオン膜などの半透膜
を用いて実施されるものである。ゲル濾過はデキストラ
ン又はポリアクリルアミドゲルなどを充填したカラムを
用いて実施する。セファデックス、バイオゲルの名称で
販売せられている充填剤が通常用いられる。

限外濾過、逆滲透圧法はいずれも加圧下で膜を用いて
分画する方法である。前者は0.5〜5Kg/cm²、後者は20〜
35Kg/cm²で行うのが通常である。

有機溶媒による沈澱法はメタノール、エタノール、イ
ソプロパノール、アセトンなどを用いるのが一般的であ
る。又、上記操作に加えて必要に応じイオン交換処理を
行っても良い。

上記精製操作が終った後は噴霧乾燥、凍結乾燥などで
水分を除去した後製品化するものである。

尚本物質を、アルカリ性水溶液で処理すると、驚くべ
きことには抗レトロウイルス効果が増強されるので更に
好ましい。

本物質を５倍乃至200倍量の0.01N乃至5Nの好ましくは
0.1乃至2Nのアルカリ性水溶液で、40℃乃至250℃、好ま
しくは60℃乃至200℃最も好ましくは100℃乃至150℃で
５分乃至２時間、好ましくは10分乃至１時間処理する。
次に該処理液を中和し、精製処理工程を行なう。精製処
理工程は、前記の塩析透析、限外濾過、逆滲透処理、ゲ
ル濾過、有機溶媒による沈澱処理などの１種又は２種以
上の方法の適用により行なうことが出来る。条件は前記
と同じである。

上記精製操作が終った後は、噴霧乾燥、凍結乾燥など
で水分を除去した後製品化する。

また、本物質をジエチルアミノエチル（DEAE）−セル
ロース等のイオン交換セルロース等を用いたクロマトグ
ラフィーで更に精製を行うと、その吸着物質中塩、アル
カリ等で溶出される画分は抗レトロウイルス効果が強い
ものが得られるのでより好ましい。

本物質はα−ナフトール硫酸反応、インドール硫酸反
応、アンスロン硫酸反応、フェノール硫酸反応及び又は
ローリィーフォーリン法、塩酸加水分解後のニンヒドリ
ン反応で陽性を示す。元素分析の結果、炭素20〜55％、
水素３〜９％、窒素0.1〜16.0％を主成分として含有す
る。

pHは6.0〜7.5である。

本物質の糖成分は少なくともグルコース、Ｎ−アセチ
ルグルコサミンを含み、蛋白成分としては少なくともグ
ルタミン酸、アスパラギン酸、リジンを含有する。

赤外線吸収スペクトルを測定すると、3600〜3200cm^-1
付近に水酸基の吸収及び又は1700〜1600cm^-1付近にアミ
ド基に由来する吸収を認めることが出来た。

本物質は水系溶媒に可溶で、有機溶媒に不溶である。
水系溶媒は水又は水を主体として水に可溶のアルコー
ル、酸、塩基等を含むものであり、有機溶媒はクロロホ
ルム、ベンゼン、エーテル等を言う。

本物質は白色又は褐色で分子量はゲル濾過クロマトグ
ラフィーにより10³〜３×10⁶である。

ラット（呑竜系）４〜５週令、体重100〜150gのもの
を用い、本物質を1000mg/Kg経口投与し、７日間観察を
行ったが全匹生存していた。

本物質はその毒性が極めて低く且つ副作用も殆んど生
起しないなど安全な物質である。

一般にウイルスは、標的細胞に吸着し、ウイルスの核
酸が細胞内に注入され、さらに細胞のゲノムにインテグ
レートされる過程を経てウイルスが複製されることが知
られている。また、特にレトロウイルスについては、細
胞のゲノムにインテグレートされる前に、ウイルス由来
の核酸であるRNAから、逆転写酵素の作用によってDNAに
転写される過程が必要である。本発明者等は、本物質が
HIV（Human Immunodeficiency virus）のヒト由来リン
パ系細胞への吸着および、それに引き続く感染を阻害す
ること、および、逆転写酵素活性を阻害することを見出
した。すなわち、HIVを50〜1000μg/mlの濃度の本物質
で０℃にて２時間処理した後HIVを洗浄し、MT−４細胞
に加えて感染させ、３日間培養後のHIV抗原陽性細胞を
測定する方法にて、本物質の効果を検討したところ、本
物質による前処理により、HIV抗原陽性細胞がほとんど
消失し、HIVのヒト由来リンパ系細胞に対する強い吸着
阻害効果が認められた。一方、本物質の逆転写酵素活性
に及ぼす影響をラット肝臓全メッセンジャーRNAを鋳型
として測定したところ、本物質500μg/mlの添加により
強い逆転写酵素活性の阻害がみられた。

これらのことは、本物質がウイルスの感染を阻害する
作用をもつこと、特に逆転写酵素をもつレトロウイルス
の感染を阻害すること、就中、HIV感染によって引き起
こされるAIDSに有効であることを示すものである。

抗ウイルス剤としてすでに使用されている３′−アジ
ド−３′−デオキシチミジン（AZT）の場合、正常細胞
に対しても分裂阻害作用を示す副作用がみられるが、本
物質は急性毒性も極めて低く、安全な物質であり、ウイ
ルス感染、特にレトロウイルス感染を阻害する作用を示
すことにより抗ウイルス剤として有用である。即ちウイ
ルス感染症、特にレトロウイルス感染症、就中AIDSに有
効である。

本物質は、抗レトロウイルス剤として用いる場合、任
意の剤型にすることができる。又、投与も各経路で行な
われる。更に本発明の薬剤は、抗ウイルス剤として用い
られている前記のAZTなどとの併用においても効力を減
ずることがなく、これら他の薬剤との併用は有効な手段
として使用し得る。

経口投与の場合には、それに適用される錠剤、顆粒
剤、散剤、カプセル剤などは、それらの組成物中に製剤
上一般に使用される結合剤、包含剤、賦形剤、潤滑剤、
崩壊剤、湿潤剤のような添加物を含有していてもよく、
又経口用液体製剤として用いる場合は、内用水剤、振盪
合剤、懸濁液剤、乳剤、シロップ剤の形態であってもよ
く、又使用する前に再溶解させる乾燥生成物の形態であ
ってもよい。さらに、このような液体製剤は普通用いら
れる添加剤、保存剤のいずれを含有してもよい。注射用
の場合には、その組成物は安定剤、緩衝剤、保存剤、等
張化剤などの添加剤を含んでいてもよく、単位投与量ア
ンプル、又は多投与量容器中で提供される。なお、上記
組成物は水溶液、懸濁液、溶液、油性または水性ベヒク
ル中の乳液のような形態であってもよく、一方活性成分
は使用する前に適当なベヒクルたとえば発熱物質不含の
滅菌した水で再溶解させる粉末であってもよい。

本発明の抗レトロウイルス剤は人間及び動物に経口的
または非経口的に投与される。経口的投与は舌下投与を
包含する。非経口的投与は注射例えば皮下、筋肉、静脈
注射、点滴などを含む。本発明の抗レトロウイルス剤の
投与量は動物か人間により、また年齢、個人差、病状な
どに影響されるので、場合によっては下記範囲外の量を
投与する場合も生ずるが、一般に人間を対象とする場
合、本物質の経口投与量は体重1Kg、１日当り0.1〜1000
mg、好ましくは１〜100mgを１回から３回に分けて投与
する。

以下、実施例を示す。

実施例１よく砕いたイヌエンジュ（Maackia amurensis）種子1
00gを生理食塩水１に懸濁し、１夜４℃で攪拌したの
ち、遠心分離により沈渣と上澄液に分けた。上澄液に0.
5飽和となる様に硫安を加え２時間程攪拌し、遠心分離
により沈澱と上澄液に分けた。上澄液には更に0.8飽和
となる様に硫酸アンモニウムを加えよく攪拌した。遠心
分離により沈澱を集め、0.15M食塩含有0.001Mリン酸緩
衝液（pH7.0）に溶かし、セファロース4B−ブタ甲状腺
チログロブリン糖ペプチドのカラムにのせ、上記リン酸
緩衝液にて溶出を行った。初めに不活性のタンパクの大
きなピークが溶出されたのちのタンパクピークを集め
た。限外濾過により塩類を除き、凍結乾燥により白色粉
末を得た。

実施例２よく砕いて乾燥させたナタマメ（Jack Bean）200gを
１の1M NaCl（pH7.0）に溶かし、４℃で10時間抽出し
た。抽出液を遠心分離して上澄液と沈渣に分けた。上澄
液を30％硫安飽和（pH7.0）にして、４℃２時間放置
後、遠心分離によって沈渣を除去した。得られた上澄液
を80％硫安飽和（pH7.0）として４℃で６時間攪拌し、
この混合物を遠心分離によって分離し、沈渣を集めた。
この沈渣を少量の水に溶かし、水に対して１時間、次い
で1M NaCl（pH7.0）に対して10時間透析を行なった。こ
の透析内液を1M NaCl,pH7.0で平衡化したSephadex G−7
5（４×50cm）にかけ、カラムを同液でよく洗った。

1M NaCl,0.1Mグルコースで溶出すると目的物が得られ
る。この溶出液を限外濾過により脱塩し、凍結乾燥する
ことによって白色粉末を得た。

多種豆類より新しく抽出された物質の物理化学的性質
を示しているのが表−１である。本表において、フェノ
ール硫酸呈色反応は糖類の存在を表わし、ローリィーフ
ォーリン法はペプチド結合の存在を示している。分子量
についてはゲル濾過法によって平均的に多く存在する画
分を記載した。

実施例３実施例１〜２で得られた物質について、レトロウイル
スが特異的に保持する逆転写酵素の阻害度を以下の方法
により測定した。

本物質はすべて凍結乾燥品10mgを滅菌蒸留水10mlに溶
解した（濃度:1mg/ml）。

１μの20mM D.T.T.（ジメチルスレイトール：シグ
マ社製）、５μの５倍濃度酵素反応液（250mM Tris−
HCl（pH8.3）−250mM KCl−40mM MgCl₂）、１μの3d
NTP溶液（1mM dATP−1mM dGTP−1mM dTTP:シグマ社
製）、２μの100μg/mlオリゴ（dT）_12〜18（PL−bio
chemicals社）、１μのメッセンジャーRNA（正常ラッ
ト肝臓由来:1μg/μ）、0.5μのRNase Inhibitor
（16unit/μ：宝酒造社製）と１μの［α−³²P］dC
TP（〜800Ci/mmol,10μCi/μ：アマシャムジャパン社
製）を1.5ml容量のエッペンドルフチューブに加え、37
℃ウォーターバス中においた。

５分後、先に調製した1mg/ml濃度の本物質12.5μを
反応チューブに添加し、更に、１μの逆転写酵素（７
ユニット／μ：宝酒造社製、Rous associated virus
由来）を加え、最終反応液量を25μとして、37℃で反
応させた。

１時間後５μの反応液を2cm×2cmのDEAE紙（東洋濾
紙社製）にしみこませ、風乾後、濾紙１枚あたり10mlの
0.5M−Na₂HPO₄水溶液に浸し、振盪しながら濾紙上のDNA
合成に使用されなかった［α−³²P］dCTPを洗浄した
（この操作を５分間おきに５回実施した）。

その後10mlの液体シンチレーションカクテル（アマシ
ャムジャパン社製）の入っているガラスバイヤル瓶に上
記DEAE紙を入れ、シンチレーションカウンター（アロカ
社製）にて１分間放射活性（c.p.m.）をカウントした。

逆転写酵素活性阻害率（％）は以下の式により求め
た。

Co:本物質非添加の放射活性 Cs:本物質添加の放射活性各本物質の逆転写酵素活性阻害率を表−１に示す。

実施例、４本物質によるHIV（AIDSウイルス）のヒトリンパ球へ
の吸着阻害は以下の方法により実施した（尚、すべての
操作は無菌条件下で行なった）。

HIV（Human Immunodeficiency Virus）浮遊液1mlと本
物質溶液（800μg/ml）1mlを試験管に入れ、氷中に静置
した。２時間後試験管から1mlのウイルス浮遊液をと
り、ヒトリンパ球由来細胞株MT−４［Jpn.J.Cancer Re
s.（Gann），28,219−229（1982）］に多重感染度（M.
O.I.）≒２でウイルスを吸着させた。遠心（毎分2,000
回転,10分間）後、上澄液をすて沈澱したMT−４細胞を2
0％FCSを含むRPMI1640（Gibco Labora tories,NY）中
に、細胞濃度２×10⁵/mlになるように浮遊させた。

96穴プレートに上記MT−４細胞浮遊液を100μずつ
分注して、空気中５％CO₂、37℃の条件下で培養した。
培養３日目に間接蛍光抗体法によりHIV吸着細胞と非吸
着細胞を算出した。

すなわちMT−４細胞をメタノール処理により固定化
し、抗HIV感染患者血清と37℃で反応させた。30分後PBS
で細胞を洗浄し、フルオレッセインイソチオシアネート
結合ウサギ抗ヒトIgG（免疫グロブリン）と37℃で反応
させた。

蛍光顕微鏡下で500個のMT−４細胞を観察し、蛍光陽
性細胞をHIV吸着細胞として算出した。

HIV吸着阻害率（％）は次式により求めた。

その結果を表−１に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者大原稔東京都板橋区富士見町19−25 (72)発明者武藤成明東京都葛飾区東堀切３の23の２ (72)発明者角地淳二東京都世田谷区南烏山６−16−31−406 (72)発明者古荘孝雄東京都町田市旭町１−６−13 (72)発明者吉汲親雄東京都国立市東２−19−46 (72)発明者高橋正明東京都港区高輪１−５−33−314 (56)参考文献特開昭61−165334（ＪＰ，Ａ) 特開昭56−68615（ＪＰ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】双子葉植物綱の、Makelaによる分類によっ
て示されるもので２群の、Abrus precatorius,Calpuria
aeggptiana,Fomes formentarius（ツリガネタケ）,Maa
ckia amurensis（イヌエンジュ）,Phaseolus lunatas
（リママメ）,Phaseolus vulgaris（インゲンマメ）、
及び、Makelaによる分類によって示されるもので３群
の、Canavalia ensiformis（タチナタマメ）,Jack bean
（ナタマメ）,Cerastrium fomentosusから選ばれる植物
より得られるレクチン類を有効成分として含有する抗レ
トロウイルス剤。
【請求項２】抗エイズイルス剤であることを特徴とする
特許請求の範囲第１項に記載の抗レトロウイルス剤。
【請求項３】レクチン類はナフトール硫酸反応、インド
ール硫酸反応、アンスロン硫酸反応、フェノール硫酸反
応及び又はローリィーフォーリン法、塩酸加水分解後の
ニンヒドリン反応が陽性を示し、元素分析で炭素20〜55
％、水素３〜９％、窒素0.1〜16.0％を示し、pHは6.0〜
7.5であり、糖成分は少なくともグルコース、Ｎ−アセ
チルグルコサミンを含み、蛋白成分としては少なくとも
グルタミン酸、アスパラギン酸、リジンを含み、赤外線
吸収スペクトルで3600〜3200cm^-1及び又は1700〜1600cm
^-1付近に吸収が認められ、水に可溶でクロロホルム、ベ
ンゼン、エーテルに不溶であり、ゲル濾過クロマトグラ
フィーによる分子量が10³〜３×10⁶であることを特徴と
する特許請求の範囲第１項に記載の抗レトロウィルス
剤。
【請求項４】双子葉植物綱はイヌエンジュ及びナタマメ
の属する属から選ばれたものであることを特徴とする特
許請求の範囲第１項に記載の抗レトロウィルス剤。