JPH05501950A - 変異株仮性狂犬病ウィルス及びそれを含有するワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 変異性仮性狂犬病ウィルス及びそれを含有するワクチン本発明は、天然には存在 せず、かつ、■またはそれ以上の変異を含有するゲノムを有する仮性狂犬病ウィ ルス（ＰＲＶ）に関する。

仮性狂犬病は、ウマを除いては全家畜動物の疾病であり、特にブタ及びウシにお いては大きな損害を与える。ブタは仮性狂犬病ウィルス、オーエスキー病ウィル スとも呼ばれるヘルペスウィルスの天然宿主である。ブタでは、ＰＲＶの感染は 、呼吸器官の疾病及び脳炎を引き起こし、その結果、死に至らしめることがある 。

動物は、経鼻的にＰＲＶに感染する。ウィルスは、呼吸器及び消化管の上方部分 の粘膜で最初に増殖した後、神経を通って脳に拡がる。感染の苛酷さは、急性か ら潜在性まで多様であり、主としてウィルスの病原性及び感染した動物の年齢に 依る。

感染した動物の死亡と成長遅延によってもたらされる経済的損失を制限するため に予防接種が行われている。この目的のためには、弱毒生ウィルスを主体とする ワクチンや不活化ウィルスを主体とするワクチンが有用である。弱毒生ウイルス ワクチンは、一般に、より容易に調製でき、従って、不活化ウィルスワクチンよ り高価ではないので好ましい。

当初に開発された弱毒生ウィルスを主体とするワクチンは、種々の不利益を有し ていた。例えば、これらワクチンは、一般的に、組織培養における病原性株の連 続的な継代接種（５０−９００回の接種）によって生産されていたので、ウィル ス中で制御不能な変異が誘発されていた。この結果、そのようなワクチンの組成 は均一なものではなかった。該混合物は、未知の病原性と未知の防御力とを有す る変異ウィルスを含有した。更に、そのようなワクチンは、病原体に逆戻りする 危険性をはらんでいた。

遺伝物質の操作技術の発展は、これら不利益を回避して弱毒生ウィルスのワクチ ンを得る可能性を切り開いた。ＰＲＶゲノムの構造は、文献に記載されているド 対を含有している。それは、２つの逆方向の繰り返し配列とＵｓ及びＵｌと呼ば れる１つは短く１つは長い２つの独特の配列を含有している。ＤＮＡ配列に基づ き、当該ＰＲＶはＤ−ヘルペスウィルスとして分類されてきた。

病原性ＰＲＶ株ＮＩＡ−３のゲノムは、Ｈｉｎｄｌｌｌ及びＢａｍＨＩの制限部 位を示した第１図に概略的に示されている。逆方向の繰り返し配列は、ＴＲＩ及 びＩＲｒとして示されている。長いのと短い独特な配列、即ち、Ｕｓ及びＵｌも 示されている。

Ｊ、　ｇｅｎ、　１ｌｉｒｏｌ、、　６８．５２３−５３４　（１９８７＞は、 ＮｒＡ−３誘導ＰＲＶ欠失変異株を記載している。これら変異株は、大きく低下 した病原性しか有しないが、依然として充分に高い中和抗体滴定量を生じ、それ によって、該変異株はワクチンとしｇｌ及びｇｐ６３をコードする遺伝子の脱機 能化を引き起こしていることが明らかになってきた。また、記載されている変異 株は、Ｈｉｎｄｌ［ｌフラグメン）Ｂの末端当たりでも欠失を有しており、その 欠失はほんの僅かだけ低下した病原性を生ずる。

野生型ＰＲＶのゲノムに比較して、遺伝子操作によって脱機能化されたタンパク キナーゼ及び／または２８に遺伝子を有するゲノムを有するＰＲＶ変異株は、複 製能力のあるウィルスであることが明らかになった。

更に、そのゲノムが脱機能化されたタンパクキナーゼ遺伝子を含有する変異株は 、野生型株に比較して低下した病原性を示し、かつ、良好な免疫原性を有すると いうことが見出された。一方、２８に遺伝子の脱機能化は病原性及び免疫原性に 目立った影響を及ぼさない。

ＰＲＶのタンパクキナーゼ遺伝子及び２８に遺伝子がウィルスの複製において本 質的な機能を有しないという事実は、これら遺伝子の領域の中に有益な変異を導 入することを可能にする。従って、本発明は、天然には存在せず、かつ、タンパ クキナーゼ遺伝子領域及び／または２８に遺伝子領域内にある変異を有するゲノ ムを有する仮性狂犬病ウィルス、そのようなウィルスを含有するワクチン、並び に、ブタを病原体から防御するためのワクチンの製造方法に関し、その製造方法 は、本発明の仮性狂犬病ウィルスを免疫化特性を有する医薬組成物に形成するも のである。

変異とは、天然に存在する仮性狂犬病ウィルスのゲノムの上記領域に存在する遺 伝情報に関して、これら領域における遺伝情報の一定の変化であると理解される 。例えば、変異は、核酸の置換、欠失、挿入または逆転、またはそれらの組み合 わせである。特に、本発明の仮性狂犬病ウィルスは、上記領域の１または両方に おいて欠失及び／または挿入を有している。

タンパクキナーゼ遺伝子は、Ｂａｒｒ、’（Ｉフラグメント１０、換言すると、 糖タンパクｇＸをコードしている配列の上流に局在している。２８にタンパクを コードする配列は、ＩＩＫ遺伝子の下流（ＢａｍＨＩフラグメント７からフラグ メント１２の変わり目）に位置している。

タンパクキナーゼ（ＰＫ）遺伝子のＤＮＡ配列は決定されており、第２図に示し である。そこでは、転写のための開始位置を水平の矢印で示している。ＴＡＴＡ ボンクスコンセンサス配列には下線を付している。ＩＲは逆方向の繰り返し配列 を意味している。ｇＸ遺伝子の開始コドンは、１３９５の位置である。

２８に遺伝子のＤＮＡ配列は、第３図に示しである。転写の開始位置をやはり水 平の矢印で示している。ＴＡＴＡボックスコンセンサス配列には下線を付してい る。ボＩＪ−Ａ−位置には２重の下線を付しである。逆方向の繰り返し配列は、 やはりＩＲで示している。ＤＲは、同方向繰り返し配列（２６ｂ　ｐ）を示して いる。ＩＩＫ遺伝子の終結コドンは、７の位置である。

第４図は、現在知られているように、ＰＲＶのＵｓ領領域７つの遺伝子の位置を 示している。第４Ａ図は、後で説明する脱機能化されたＰＫ遺伝子を有する挿入 変異株のＨｉｎｄｌｌｌフラグメン）Ｂを概略的に記載したものである。ｊｌＥ ４Ｂ図は、後で説明する脱機能化された２８に遺伝子を有する欠失変異株の旦± ｎｄＩ１１フラグメントＢを概略的に記載したものである。

ＰＫ及び２８にタンパクをコードするＤＮＡ配列の位置は、以下のように決定さ れている。

タンパクキナーゼ ｇＸの１１７０ヌクレオチド上流のオープンリーディングフレーム（以下、ＯＲ Ｆで示す）は、完全にＵｓ領域内に存在している（第２図）。生体外での転写／ 翻訳実験で、このＯＲＦの存在が確認されている。１６３の位置の１番目のＡＴ Ｇコドンが翻訳開始コドンとして機能している々仮定すると、これは３９０アミ ノ酸からなるタンパク（４３Ｋ＞を産する。しかしながら、ｍＲＮＡ遺伝子地図 作成実験は、３２５の位置にある３番目のＡＴＧコドンがおそらく最も重要な翻 訳開始点であるということを示している。該タンパクは、３３６アミノ酸（３７ Ｋ）以上の長さを有しているのだろう。

感染後２時間経過してすぐに、この領域からの転写体がＰＲＶに感染した組繊細 胞中に認め得る。これら２．７ｋｂのｍＲＮＡの５′末端は、プライマー延長実 験によって正確に決定されている。２つの転写開始部位が見出された：９５％以 上のｍＲＮＡが２５８．２６０または２６１の位置（それぞれＣ９ＵまたはＡ） で開始し、３７に生成物をコードする。残りのｍＲＮＡは、９９の位置（Ａ）で 開始し、４３に生成物をコードする。

該タンパクは、セリン／トレオニンツノバクキナーゼの保存された領域を含有し ており［５ｃｉｅｎｃｅ　２４１．４２−５２　（１９８８）］　、Ｉ型単純ヘ ルペスウィルス（Ｈ８Ｖ川）のＵｓ３によってコードされたタンパクキナーゼ［ Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、、　１８↓１−１３　（１９８５）’］と相同であ る。従って、このＰＲＶタンパクは、おそら＜ＰＲＶ感染細胞中に見出された３ ８にタンパクキナーゼ［Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１５２．５７−６ ５１１にの７６８ヌクレオチド下流のＯＲＦは、２５６アミノ酸（２８Ｋ）のタ ンパクをコード化する（第３図）。このＯＲＦの存在は、生体外での転写／翻訳 実験において確認されている。２８にタンパクはＨ３Ｖ−ＬのＵｓ２タンパクＣ Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、、　１９８１．１−１３　（１９８５）　］と幾分 相同である。

組織培養細胞の感染後２時間経過してすぐに、２８Ｋに特異的なｍＲＮＡが検出 可能である。しかしながら、該感染後５時間では、転写レベルはかなり増加する 。この１．１５ｋｂのｍＲＮＡの５′末端は、プライマー延長実験によって決定 されている。該ｍＲＮＡは、１４６．１４７．１４８または１４９の位置（それ ぞれＣ，Ａ、ＣまたはＡ）で開始する。また、第３図は逆方向の繰り返し配列の 小部分も示している。それは２６ｂｐの５つの同一の同方向の繰り返し配列（及 びより短い１つの２４ｂｐの同方向の繰り返し配列）を含有している。

変異が存在してもよい本発明のＰＲＶの該領域は、ＰＫタンパクまたは２８にタ ンパクをコード化する遺伝子を含有する核酸配列、並びにこれら遺伝子の５゛及 び３゛末端における核酸配列によって特徴付けられており、それによって、これ ら近接配列はポリペプチドをコード化しない。結果として、該領域も包含される 遺伝子の制御及び発現に重要な配列を含む。

本発明によれば、かかる変異は、ＰＫ遺伝子領域及び／または２８に遺伝子領域 中に存在してもよく、該領域は、第２図に描写したような核酸配列１−１３９４ または第３図に描写したような核酸配列？−１７２５によってそれぞれ特徴付け られている。

好ましくは、該変異は、ＰＫタンパクをコードする遺伝子中に及び／または２８ にタンパクをコードする遺伝子中に存在している。挿入するのに極めて好適な領 域は、第２図に描写した核酸配列１６３−１３３２及び第３図に描写した核酸配 列２３２−９９９である。

好適な変異は、例えば、ＰＲＶとは異なる、ブタで見出された１またはそれ以上 の病原体から誘導した遺伝子の核ｉＭＪｌの挿入である。これらは、即ち、防御 免疫応答の誘発に関連する遺伝情報を含有する核酸配列である。本発明のかかる 組み換えウィルスで動物をワクチン接種した後、該ウィルスは感染した標的細胞 内で増殖することができ、それによって、外来遺伝情報を含有する膨大な数のベ クター粒子を雌牛ずる。続いて、このウィルスは再び標的細胞を感染することが でき、それによって、新たな増殖ラウンドを開始する。その結果、サブユニット ワクチンでワクチン接種した後に一般に得られるよりも多量の外来遺伝子生成物 の供与量を宿主の免疫系に与える。

ＰＲＶとは異なる病原体の遺伝子の挿入は、タンパクキナーゼ遺伝子の領域内で 若しくは２８に遺伝子の領域内でまたはこれら両方の領域内で存在することがで きるが、２８に遺伝子をコード化する核酸配列の脱機能化は、該変異株ＰＲＶの 複製、病原性及び免疫原力に影響を及ぼさないので、ワクチンにおける使用に好 適なＰＲＶ株のゲノム中への挿入の場合には２８に遺伝子の領域が好ましい。

好ましくは、該ＰＲＶベクターは、その外来核酸配列が２８に遺伝子及び／また はタンパクキナーゼ遺伝子の中に導入されたゲノム中において、糖タンパクｇ＋ 遺伝子中及び／またはチミジンキナーゼ遺伝子中での欠失によって弱毒化したＰ ＲＶである。

外来核酸配列の挿入は、上記領域内のいかなる望ましい位置においても起こり得 、それによって、ｉＰＫ遺伝子及び／または２８に遺伝子は完全にまたは部分的 に削除され得る。

ＰＲＶベクター中への挿入のために考慮される遺伝情報は、例えば、ブタコレラ ウィルス、パルボウィルス、伝染性胃腸炎ウィルス、ブタ固有下痢ウィルス及び インフルエンザウィルスの如きウィルス、Ｐａ５ｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏ ｃｉｄａ、　Ｂｏｒｄｅｔｅｌクチリア病原体、またはＬ　ｈｙｏｐｎｅｕｍｏ ｎｉａｅ及びＭ、　１ｙｏｒｈｉｎｉｓの如きマイコプラズマ目等から誘導する ことができる。

ＰＲＶサブゲノミックフラグメント中で病原体の核酸配列をクローニングし、続 いてＰＲＶのゲノム中にこれらを取り組む技術は一般に知られている。これに関 する例として、Ｍ−ｖａｎ　ＺｉｊｌらによってＪ、　Ｖｉｒｏｌ、　６２．２ １９１−２１９５　（１９８８１１に記載されたサブゲノミックフラグメントか しの組み換えＰＲＶの再生を使用する方法が挙げられる。

複製及びウィルス学的特性に関する、ＰＲＶタンパクキナーゼ及び２８に遺伝子 の脱機能化のそれぞれの影響の研究において、含まれるゲノミック領域は、翻訳 停止シグナルを有し更に酵素のための制限部位を含むオリゴヌクレオチドの挿入 によって変異された。なあ、この制限部位はＮＩＡ−３には存在しない。使用し たオリゴヌクレオチドは、式： ％式％ このオリゴヌクレオチドは、可能な３つの解読わくの各々及び両方向中に３つの 翻訳停止コドン、即ち、ＴＡＧを含んでいる。更に、それはＥｃｏＲＩ認識部位 、即ち、ＧＡＡＴＴＣを含有し、更に、該オリゴヌクレオチドは自己相補的配列 である。タンパクをコード化する何らかの遺伝子中へのこの２重鎮オリゴヌクレ オチドの挿入は、いかなる定位においても、いかなる解読わくにおいても、その 遺伝子のｍＲＮＡの翻訳の終結に導く。該オリゴヌクレオチド中でのＥｃ　ｏＲ Ｉ認識部位の存在は（Ｎ　Ｉ　Ａ　−３ゲノム中には存在しない）、該オリゴヌ クレオチドの挿入部位の決定、並びに、該オリゴヌクレオチドが挿入されたクロ ーンの扱いを容易にする。

上記のオリゴヌクレオチドは、ホスホルアミダイト法による合成により公知の方 法で得ることができる。

以下に、本発明のいくつかの変異株の構築及び生物学的特性を詳細に記載した。

１、ＰＲＶ株ＮＩＡ−３のＨｉｎｄｌｌｌフラグメントＢのクローンの構築ｄＡ ＴＰ及びｄＴＴＰの存在下でのＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメだ 。

２、準ランダム部位（ｑｕａｓｉ−ｒａｎｄｏｍ　５ｉｔｅ　）でのクローンの 線状化旦１ｎｄｌｌｌＢクローンの共有的に閉環した環状ＤＮＡ（２５μｇ）を 各場合において以下の制限酵素１種の存在下、３７℃で１５分間インキュベート することによって部分的に消化した：旦旦旦ＩＩ、旦且旦ＩＩＩ及び旦互且Ｉ０ 該消化は、容量が１２５μｌであり、２０ｍＭトリス−ＨＣＩ　、　ｐ　Ｈ７， ５，８ｍＭＭ　ｇ　Ｃｌ　ｘ、５０μｇエチジウムプロミド（ＥｔＢｒ）中の２ ＵＦｎｕＤＩＩ、または、２０ｍＭトリス−ＨＣＬ　ｐＨ７，５，５０ｍＭＮａ ＣＬ　８ｍＭＭｇＣ１２，５μｇ１ｍｌＥｔＢｒ中のＩＵＨａｅｌｌｌ、または 、２０ｍＭ）リス−ＨＣｌ、ｐ　Ｈ７，５，５０ｍＭＮａＣ１，８ｍＭＭｇＣＩ ２．０．５μｇ／ｍ１ＥｔＢｒ中の０．５ＵＲｓａ■のいずれかと共に該ＤＮＡ を含有している溶液中で行った。

これら部分的な消化は、アガロースゲル電気泳動で判定して、約３０％の線状完 全長ＤＮＡフラグメントの形成をもたらした。使用した制限酵素は、完全なりＮ Ａフラグメント全体にわたって分散された認識部位を有するので、このフラクシ ョンは、該クローン内で準ランダム部位において線状化されているものと考え得 る。未消化の閉環した環状ＤＮＡを除くため、この線状ＤＮＡをセシウムクロリ ド（ＥｔＢｒ）の密度勾配遠心分離によって精製し、次いで、１本鎖切片を有す る分子及び１回以上切断された分子を除くため、予備アガロースゲル電気泳動に よって精製した。

３、線状化した旦±ｎ　ｄ　ＩＩＩ−Ｂクローンへのオリゴヌクレオチドの挿入 これら３つの部分消化体の各々のうち、１μｇの線状化したＤＮＡを、１５μｌ 容量中でキナーゼ処理したオリゴヌクレオチド（５０倍モル過剰）０．０３μｇ 完全長フラグメントを形成した。これらフラグメントを予備アガロースゲル電気 泳動及び電気エリューションによって単離した。次いで、３つの部分消化体から 得られたこれらＤＮＡ合成体を結合させた。このＤＮＡのうち、０．５μｇを４ ００μｍ容量中で線状Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ｂフラグメントの両末端における１／２ ＥｃｏＲ１ｍ部位の結紮によって環状化した。この結紮混合液からＤＮＡが析出 し、１０μｍの１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，１ｍＭＥＤＴＡ中に溶解 させた。

ハナーン（）Ｉａｎａｈａｎ）の方法を使用して、このＤＮＡでＥ、　ｃｏｌｉ 株ＤＨ５を形質転換した印ＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　 Ａｐｐｒｏａｃｈ、　Ｉ、Ｒ，Ｌ、　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｔｄ、、Ｕ、に、、ｖ盾戟 B １、　ｐ、　１１９−１３５　（１９８５）　）。これは、それぞわ−準ランダ ム部位に挿入されたオリゴヌクレオチドを有する一連の変異株Ｈｉｎｄｌｌｌ− Ｂを生じた。

４、組み換え体クローンの分析 制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄｌｌｌで消化し、次いで、アガロースゲル電気 泳動を行うことによって、組み換え体クローンの取り込みを試験した。これら組 み換え体クローンの各々にあけるオリゴヌクレオチドの挿入部位を制限酵素Ｂａ 思ＨＩ＋Ｅ旦旦ＲＩ及び旦ｌ±ＩＩ十旦工旦ｄｌｌｌで二重消化し、次いで、ア ガロースゲル電気泳動を行うことによって決定した。

５、変異株仮性狂犬病ウィルスの再構築コスミドベクターｐＪＢＦ中でのウィル スのサブゲノミックフラグメントのクローニング及びサブゲノミックフラグメン トからのＰＲＶの再生をＭ、ｖａｎＺｉｊｌらされているようにして行った。

ベクター配列を含まないウィルス挿入体を得るために、コスミドＤＮＡをＥｃの みならず、コスミドクローンＣ−１７９、Ｃ−２７及びＣ−４４３からのウィル ス挿入体も野生型ＰＲＶｃｏｓＮＩＡ−３の構築のために使用した。これら組み 合わせたフラグメントはＰＲＶの完全な遺伝情報を含有している。

変異株ウィルスの構築のためにコスミドクローンＣ−１７９、Ｃ−２７を使用し 、同じく、Δ２８に変異株の構築のためにＣ−４４３をまたはＰＫ変異株の構築 のためにＣ−４４７（８ｋｂｐの欠失を有するコスミドで、そのためにＨｉｎｄ ｌｌ＋フラグメントＢとの重複部分が減少している）を使用し、そして、最後に 、変異株ＨｉｎｄｌｌｌフラグメントＢを使用した。

第５図に、ＮＩＡ−３の制限酵素切断地図との関連において、これら構築を図示 した。垂直の矢印はオリゴヌクレオチドの挿入部位を示している。

これらフラグメントとのＰＫＩ５のコートランスフェクションは、該フラグメン トの重複している末端間の生体内での相同組み換え後に、Ｈｉｎｄｌｌ！フラグ メン）Ｂ内に導入された変異を有する伝染性ウィルスを与えた。この方法で得ら れた変異株ウィルスをＳＫ６細胞中で３回プラーク精製に付した。次いで、これ −３感染細胞から単離し同じ方法で消化したＤＮＡをアガロース電気泳動によっ て分析した。

６、ＮＩＡ−３ＰＫ−及びΔ２８に変異株の構築上記の技術を使用し、フラグメ ン）Ｃ−１，７９、Ｃ−２７、Ｃ−４４７及びタンパクキナーゼ遺伝子の５′末 端内の翻訳終結オリゴヌクレオチド内に挿入を有するＨ　ｉ　ｎ　ｄ　ｌｌ１Ｂ クローン５４９（第４Ａ図）の組み換えによって、変異株ウィルスＭ１．１０　 （ＰＫ−）を得た。該オリゴヌクレオチドの存在は、ＰＫ−ｍＲＮＡの翻訳の早 期の終結を起こす。

ＰＫ遺伝子内の該オリゴヌクレオチドの挿入の正確な位置のみならず、該オリゴ ヌクレオチド及び近接ウィルスのＤＮＡ配列の取り込みを、サンカー　（Ｓａｎ ｇｅｒ）及びカールソン（Ｃｏｕｌｓｏｎ）の方法［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７４．５４６３−５４６７（１，９７７）　］を 使用するＤＮＡ配列分析によって確認した。

ｐＨ内に挿入した。この組み換えプラスミドの配列分析は、該オリゴヌクレオチ ドの挿入部位のいずれの側にも欠失が存在しないことを示した。該オリゴヌクレ オチドの挿入部位は、第２図に垂直矢印で示したように、ＰＫ転写体の５°末端 に関して塩基対４５７と４５８の間に存在した。

２番目の実験において、ＰＲＶ　ＰＫ−挿入変異株の再構築を繰り返した。該実 験は上記のようにして行った。これは、変異株ウィルスＭ１．１９　（ＰＫ−） をに遺伝子内の２つの位置に挿入された該オリゴヌクレオチドを有する２つのク ローンを産した（Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ−Ｂ−３５１及び３５７）。これらは、 より大きな部分のために２８Ｋが削除された変異株を得るのに使用した。この目 的のため、変遺伝子内では旦盈±１１及び挿入されたオリゴヌクレオチド内では 旦ｃｏＲＩ、第４Ｂ図）、消化後に２つのＤＮＡフラグメントを生じた。変異株 クローン３５７チド挿入部位の間の約０．５ｋｂｐの欠失を有する変異株Ｈｉ　 ｎ　ｄ　ＩＩＩ−Ｂフラグメントを生じた。これは、２８に遺伝子のより大きな 部分の欠失を生じた（ｉ４Ｂ図）。５で説明した技術を使用して、更に株Ｍ１１ ３（Δ２８Ｋ）と命名した変異株ウィルスがクローン３５１−３５７で得られた 。

７、組織培養細胞内でのＰＫ−及びΔ２８にの成育ＳＫ６細胞内で、２８に変異 株ＰＲＶ株は、ＮＩＡ−３の成育に匹敵する成育を示した。ＰＫ−変異株はＮＩ Ａ−３よりも遅い成育を有した。

実験１及び２において、ＰＲＶに対する抗体を有しない１０週齢の子ブタで挿入 変異株Ｍｌ　１０　（ＰＫ−）及び欠失変異株Ｍ１１３（Δ２８Ｋ）の病原性及 び免疫原性を試験した。１０５のＰＦＵを経鼻投与した。子ブタを８〜９匹のグ ループに分けた。実験１では１つの変異株ＭＩＩＯを試験し、実験２では２つの 変異株Ｍ１１３を試験した。各実験において、２つのコントロールグループ、即 ち、株Ｍ２Ｏ９（ｃｏｓＮＩＡ−３＞で感染したグループ（Ｃ）及び感染してい ないグループ（Ａ＞を存在させた。接種後８週間して、免疫原性を確認するため に全ての子ブタを株ＮＩＡ−３で感染させた。１８週齢の感染していないグルー プ（Ａ＞をコントロールとして使用した。

株Ｍ２Ｏ９（ｃｏｓＮＩＡ−３）は、ＮＩＡ−３のコスミドフラグメントＣ−１ ７９、Ｃ−２７、Ｃ−４４３及び旦エユ旧１ｔ−Ｂフラグメントから再生した病 原性ＰＲＶである。

実験３において、ＰＲＶに対する抗体を有しない３週齢の子ブタで、ＭＩＩＯ（ ＰＫ−）の病原性を研究した。Ｍｌ　１９　（ＰＫ、−）のＰＫ遺伝子中の欠損 を修復した後にウィルスが得られたＰＲＶ　ＰＫ”　（Ｍ１２０）の病原性も試 験した。

このレスキュー　（ｒｅｓｃｕｅ）は、５Ｋ−６細胞中で、ＮＩＡ−３ウイルス ＤＮＡのいる。ＰＫ遺伝子の挿入が実験１で記載した病原性低下の唯一の原因で あるならば、ＰＫ遺伝子のレスキューは１つのウィルス、即ち、コントロー１１ 株Ｍ２Ｏ９（ｃｏｓＮＩＡ−３）の病原性特性を有するＭｌ　２０　（ＰＫ”　 ）に導かなけれればならないだろう。試験グループＡ、Ｂ及びＣは、それぞれの 場合において、ＰＲＶに対する抗体を有しない５匹の３適齢ＳＰＦ子ブタから構 成された。ウィルス株Ｍ１１８　（ＰＫ−）、Ｍ１２０　（ＰＫ＋）及びＭ２Ｏ ９（ｃｏｓＮＩＡ−３）それぞれで、グループＡ、Ｂ及びＣの子ブタをそれぞれ 経鼻投与して感染させた。

Ｍ２Ｏ９（ｃｏｓＮＩＡ−３）でのワクチン接種後、症状がないか、または、大 きく減退した食欲、昏睡、嘔吐、くしやみ、重液分泌及び発熱の如き通常の臨床 症状が観察された。また、動物の幾匹かは観察の最中に神経現象を示した。両実 験で６匹中２匹は死亡した。以下の表は病原性データをまとめたものである。

点−Δ Ｎ、　Ｓ、　”　死亡割合　ＭＴＤ　体重増加（ｋｇ）グループ　１８日ロー１ 日目 実験ｌ Ａ　コントロール　−〇／６　１２．５Ｂ　ＭＩＩＯ（ＰＫ−）　−０／７　１ ２．０ＣＭ２Ｏ９（ｃｏｓＮＩＡ−３）　＋　２／６　ｇ、０４，６実験２ Ａ　コントロール　−〇／６　１３．８ＢＭ１１３（Δ２８Ｋ）　＋　５／７　 ７．４　−４．０ＣＭ２Ｏ９→−２／６　１０．０　６．１本神経症状（失調、 麻痺、振せん） 変異株ＭＩＩＯ（ＰＫ口を接種したグループにおいて、ワクチン接種後の臨床症 状は、幾匹かの動物における昏睡、食欲の喪失及び体温の上昇に限られたままで あった。Ｍｌ　１０　（ＰＫ−）の接種後に観察された体温の上昇は、Ｍ２Ｏ９ （ｃｏｓＮＩＡ−３）での感染後よりも明らかに低かった。

株Ｍ１１３（Δ２８Ｋ）で感染した後、重大な疾病の症状、その中でも神経症状 が起きた。該Ｍ１１３グループでは、７匹のうち５匹が死亡した。７日目に３匹 が死亡し、８日目に２匹が死亡した。生き残った子ブタのうち１匹は慢性的に病 んだままであった。

Ｍｌ　１０　（ＰＫ−）で感染したグループの主な体重増加は、感染していない コントロールグループＡの体重増加に匹敵した。これは、この変異株の接種後の 軽い臨床的所見と一致する。

変異株Ｍ１１３（Δ２８Ｋ）での感染のあと体重減少が観察された。Ｍ１１３グ ループの体重曲線は、感染後も生き残った２匹の子ブタの体重曲線の結果である 。これらの子ブタのうち１匹は慢性的に病んだままであり、その体重は徐々に減 少した。他の子ブタの体重は感染後９日目に再び増加し始めた。

Ｍｌ　１０　（ＰＫ−）を接種した後、排出されたウィルスの量の減少を観察し た。

接種後４日して各グループから２匹の子ブタを殺し、ウィルスの単離のため種々 の組！／器官（１匹の子ブタ当たり総数１９）をサンプルにした。結果のまとめ を表Ｂに示した。

このように、この結果は、１００週齢ブタにおいて、株Ｍｌ　１０　（ＰＫ−） は親ウィルスと比較してかなり減少した病原性を示すということを明らかにして いる。対照的に、株Ｍ１１３（Δ２８Ｋ）は親株の病原性に匹敵する病原性を有 している。

青一旦　器官中でのウィルスの複製（接種後４日目）グループ　鼻咽頭領域　Ｃ ，Ｎ、Ｓ、肺実験Ｉ ＢＭｌｌ、０（ＰＫ−）　＋　十　＋ ＣＭ２Ｏ９（ｃｏｓＮＩＡ−３）　＋　＋　＋実験２ ８Ｍ１１３（△２８Ｋ）　十　＋　＋ ＣＭ２Ｏ９（ｃｏｓＮＩＡ−３）　＋　＋　＋実験３の結果 グループＣにおける３週齢の漿液陰性子ブタのＭ２Ｏ９（ｃｏｓＮＩＡ−３）で の経鼻接種後、病原性ＰＲＶ感染の臨床的症状の特徴を観察した。これらは発熱 （該グループの平均体温は６日間４０℃を超えた）、食欲減退、昏睡、嘔吐、く しゃみ、重液分泌の如き一般的な病気の症状のみならず、痙ψ、振せん、協動障 害及び麻痺性症状の如き神経症状であった。５匹の接種した子ブタのうち４匹は 、それぞれ、６．６．７及び７日目に仮性狂犬病のために死亡したく死亡までの 平均日数６．５印。Ｍｌ　２０　（ＰＫ”　）で感染したグループＢの子ブタは 、グループＣで観察された症状と同じ一般的な症状及び神経症状を示した。グル ープＢでは、５匹の接種した子ブタのうち３匹が、それぞれ、６．７及び１２２ 日目仮性狂犬病のために死亡した（死亡までの平均日数８．３印。Ｍｌ　ｌ　９ 　（ＰＫ−）で感染したグループ八では、接種後３及び４日目に病気の温和な一 般的症状だけが観察された°その５匹の子ブタは４０℃より高い平均体温を有し 、１匹の子ブタは接種後５日目で昏睡状態であった。食欲減退は観察されず、第 １ローと第４８日月の間の体重の増加量は、コントロールの子ブタの体重増加に 比較して変化がなかった。

グループＡ、Ｂ及びＣの子ブタは、感染後９日目を含めて１日目から９日目まで ウィルスの混入した唾液を分泌した。各グループの子ブタの口咽頭を拭った綿棒 中において、１日目から９日目までの間に観察されたウィルスの量に大きな差は なかった。

Ｍｌ　１０　（ＰＫ−）及びＭ２Ｏ９（ｃｏｓＮＩＡ−３）で「ワクチン接種」 した子ブタは、「ワクチン接種」後８週間経過した時点で、ＮＩＡ−３での誘発 感染（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ）を非常によく防御した。生育 遅延、臨床的症状、重大な体温の上昇及び食物摂取の低下は観察されなかった。

コントロールの子ブタは、誘発感染後、食欲減退、昏睡、嘔吐、くしゃみ、重液 分泌及び発熱の如き通常の臨床症状を示した。全てのコントロールの子ブタは、 誘発感染に対して生き残った。コントロールの子ブタの生育遅延は１５日であっ た。変異株ウィルスＭ１１０（ＰＫ−）をワクチン接種した子ブタが誘発感染後 ７日間ウィルスを放出したということは、注目すべきことであった。血液中の非 常に高い中和抗体滴定量（１，０００以上）がウィルス放出の期間及び濃度を減 少させたが、後者を完全に防止することはできなかった。観察されたウィルスの 複製は、誘発感染後の血清中和滴定量の増加によって確認された。

ＤＲＹＤＩＫＶＤＶＷＧＡＧＶＩ／ＬＦＥＩＬ　＾　マ　Ｐ試１タンパクキナー ゼ遺伝子のＤＮＡ配列 １％＋Ａｃｃ＾ｃｃｃｔｔｅｃ１ｃａＴｅｔｃｃｃｃｃｔｃｒｃｔｃｃｔｃｎｃ ｃｔｃｔｃｃｗｃｃｃｔＣＴｔｃｔｃｃｃｉｃｔｃｃｃｃｃモ狽モモモモ浮モメ F：：＋２２Ｓ Ｌ２０１ｉｃｔｃｔｃＣｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｔｃｃｃｘｏｃｃ＝ｔｏｃｃｃｃ ｃｎｎｃｔｃｃｃｃｃｃｃｎｃｃｔｃｃｃｃｃｃ＋ｃｃｃｏモ■モモ狽モ■mｕ １２＋ｓ ＋２＋６Ｃ仁ＣＣＩ＋ＣＣＣＡＣＣＡＡＩＡＧＣＣＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＣＡ ＣＣｅＣＣＣＡＣ＋ＣＣ＋ＴｌｌｉＣＡＣＣＡ！ＣＴＣＣ＋`ＣＣＣＣＣＣＣＡ Ｃ：ＡＣＴＣＣＣＣ１１５０２８Ｋ遺伝子のＤＮＡ配列 ｌＮ１ｗ５ｍ５Ｍ＃１Ａａｓｋ（ＩＩ畷””０ｒＴＪ＋Ｊｒｏｎ／ｎＡｌｌｌ５ 国際調査報告

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．天然には存在せず、かつ、タンパクキナーゼ領域、２８Ｋ遺伝子領域または これら領域の両方に変異を含有するゲノムを有する仮性狂犬病ウィルス。
2. ２．該変異が、欠失、挿入または欠失と挿入である請求項１記載の仮性狂犬病ウ イルス。
3. ３．該変異が、タンパクキナーゼ遺伝子、２８Ｋ遺伝子またはこれら遺伝子の両 方に存在する請求項１記載の仮性狂犬病ウィルス。
4. ４．該ゲノムが、ブタに見出される病原体の抗原ペプチド特性をコード化する挿 入を含有する請求項２記載の仮性狂犬病ウィル。
5. ５．機能的ｇＩタンパク、機能的チミジンキナーゼまたはこれらのいずれをも産 生しない請求項１記載の仮性狂犬病ウィルス。
6. ６．株ＮＩＡ−３から誘導された請求項１記載の仮性狂犬病ウィルス。
7. ７．請求項１〜６のいずれか１項に記載の仮性狂犬病ウィルスを含有する、病原 体に対しブタを防御するためのワクチン。
8. ８．請求項１〜６のいずれか１項に記載の仮性狂犬病ウィルスを配合して免疫化 特性を有する医薬組成物を形成することを含む、病原体に対しブタを防御するた めのワクチンを製造する方法。