JPH07502173A

JPH07502173A - 偽性狂犬病ウイルスワクチン

Info

Publication number: JPH07502173A
Application number: JP6507576A
Authority: JP
Inventors: メツテンライター，トーマス・クリストフ
Original assignee: アクゾ・ノベル・エヌ・ベー
Priority date: 1992-10-06
Filing date: 1993-10-06
Publication date: 1995-03-09
Also published as: EP0619840A1; WO1994008000A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】偏性狂犬病ウィルスワクチン本発明は、偏性狂犬病ウィルス（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ　ｖｉｒｕｓ。

ＰｒＶ）突然変異体、ＰｒＶ　ＤＮＡを含む組換えＤＮＡ分子、該組換えＤＮＡ分子を用いて形質転換された宿主細胞、該突然変異体に感染させた細胞培養物、ＰｒＶ突然変異体から誘導されるワクチン、及び、動物が天然偽性狂犬病ウィルスに対して予防接種されているかまたはこれに感染しているかを区別する方法に係わる。

偏性狂犬病ウィルスはヘルペスウィルスグループの一員である。該ウィルスは、養豚場において特に仔ブタに深刻な経済的損失を誘起し、動物成体においては潜伏感染をもたらすアウジェスキー病の原因物質である。ＰｒＶ感染の視認し得る顕著な特徴は激しい掻痒感であり、これは一般に、宿主の関与領域を断簡する結果となる。激しい興奮、発作及び麻痺といった脳を髄炎の全ての症状のあと死亡するが、これは一般に、臨床徴候の開始後数日以内に起こる。

従来のワクチン製造における研究・開発は、生体ウィルスではなくてウィルスサブユニットをベースとするワクチンにつながる研究に重点を置く傾向にあった。

この変性生ウイルスワクチンからの逸脱は一部には、サブユニットワクチンは感染性生ウィルスを含み得ないことからその安全性が認識されていることによる。

サブユニットワクチンを開発する別の理由は、ワクチンを装備すると共に、予防接種された動物と感染動物とを区別する診断試験の開発が可能となることである。

サブユニットワクチンには限界がある。サブユニットワクチンは、生ウィルスによって生成されるものと比較して少数のウィルス抗原しか含まない。この少数の抗原が、予防接種した動物において短期間の弱い免疫応答を生成する。

しかしながらこのことは、被接種動物を感染動物と識別し得るが故に、一部では有利である。予防接種によって、ワクチン中に存在する抗原の限定されたスペクトルに対する抗体の産生のみが刺激される。動物の血清をサンプリングすることにより、予防接種した動物はワクチン中に含まれる抗原に対する抗体しか有さないが、野生型ウィルスに感染した動物はより広範囲の抗原に対する抗体を有するであろうことを示し得る。

変性ウィルス生ワクチンは、より多くの抗原を含み、従ってより強力な免疫応答が得られるという利点を有する。継代の間に未制御の突然変異が起こり、毒性及び免疫性において不均一のウィルス粒子の集団がもたらされる可能性がある。より重要なことには、このような従来の弱毒化ウィルスは毒性に復帰し得、予防接種した動物に疾患をもたらし、病原体が他の動物に拡散する可能性があることは良（知られている。

遺伝子の診断ツールに装備されるウィルスを弱毒化するために該遺伝子を欠失させる方法は、現在使用されているＰｒＶワクチン及び天然ＰｒＶとは区別され得るワクチンを提供する。

ＰｒＶ型のヘルペスウィルスはコア内に、逆方向反復配列によって非反復長鎖領域ＵＬと非反復短鎖領域ＵＳとに分離されている分子量約９０Ｘ　１０’ダルトン（Ｄ）の二重鎖ＤＮＡ分子を含む（Ｓｈｅｌｄｒｉｃ、　Ｐ、　ａｎｄ　Ｎ、　Ｂｅｒｔｈｅｌｏｔ、　１９７５、　Ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｈｒｏｍｏｓｏａ＋ｅ　ｏｆ　ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘ　ｖｉｒｕｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　５ｙＩＩｌｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ。

３９　：　６６７−６７８）。

突然変異体の配列決定、ｍＲＮＡのマツピング及び分析から、ヘルペスウィルスゲノムが少なくとも７５の読み取り枠（ＯＲＦ）をコードし、このうちの６９がＵＬ及びＵＳ配列内にあることが示されている（　ＭｃＧｅｏｃｈ、　Ｄ、　Ｊ、　、　Ｍ、　Ａ、　Ｄａｌｒｙｍｐｌｅ、＾、　Ｊ、Ｄａｖｉｓｏｎ、＾、Ｄｏｌａｎ、　Ｍ、Ｃ，Ｆｒａｍｅ、　Ｄ、ＭｃＮａｂ、　Ｌ。

Ｊ、Ｐｅｒｒｙ、Ｊ、Ｅ、５ｃｏｔｔ　ａｎｄ　Ｐ、Ｔａｙｌｏｒ、１９８８．　Ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｌｏｎｇ　ｕｎｉｑｕｅ　ｒｅｇｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｅｏｆ　ｈｅｒｐｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　１．　Ｊ、　Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、　６９　：１５３１−１５７４　；　ｆａｇｎｅｒ、　Ｅ、　Ｋ、　、　１９８４．　Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ　Ｈ３Ｖ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ、　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｇｅｎｅｓ、　ｐ、４５−１０４、Ｉｎ　：　Ｂ、Ｒｏｉｚｍａｎ（編）、　Ｔｈｅ　Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ、ｖｏｌ、３．　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、）。

ヘルペスウィルスのゲノムは制限酵素フラグメントに関して一般に参照される。

偏性狂犬病ウィルスについては、最近、ＢａｍＨＩフラグメント１１及び１６の配列が公表された（Ｋｌｕｐｐ、　Ｂ、Ｇ、　ａｎｄ　Ｔ、Ｃ，Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ、　１９９１．５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｇＨｇｅｎｅ　ｏｆ　Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ　Ｖｉｒｕｓ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１８２ニア３２−７４１）。

最近、外来遺伝子のためのベクターとしてのＰｒＶの使用を開示した米国特許が発行された（米国特許第５．０３７．７４２号）。ｇＩＩＩ領域はこの目的で特異的に使用される。米国特許第５０４７２３７号には、ｇｌ）Ｘ配列中に突然変異を含むウィルスワクチンが開示されている。欧州特許第０１４１４５８号には、ｇＩ−突然変異体が記載されている。

本発明の目的は、不適当に弱毒化された病原性微生物を用いて動物を予防接種する危険性なしに与え得る、変性生ワクチンの調製に使用し得るＰｒＶ突然変異体を提供することである。更に、弱毒化病原体が毒性状態に復帰し、被接種動物に疾患をもたらす危険性及び病原体が他の動物に拡散し得る可能性は、突然変異ウィルスを使用することにより低減され得る。

更に、本発明ＰｒＶ突然変異体によって、種々の抗原性成分の不利な相互干渉の危険性のない多価ワクチンが可能となり得る。

本発明の別の目的は、野生株とは区別し得るＰｒＶワクチンウィルスを提供することである。毒性ウィルスの拡散を低減する適当な手段を講じ得るよう、ＰｒＶワクチンを用いて予防接種した動物と野生型ウィルスに感染したものとを区別することは重要である。

両目的は、配列番号２に示したポリペプチドをコードする読み取り枠（ＯＲＦ）のＤＮＡ配列を含む領域に広がるＰｒＶゲノムの部分内に、組換えＤＮＡ技術によって得られる突然変異を含むＰｒＶ突然変異体を提供することにより達成される。

本明細書において使用される組換えＤＮＡ技術なる用語は、（コーディング）配列または変更配列の新規の組合せを含むＤＮＡ分子を作製し、それらを、変性された配列を連続増殖し得る宿主微生物または細胞中に組込むために使用し得るベクター中に挿入するためのｉｎ　ｖｉｔｒｏ技術を指す。

“ポリペプチド“なる用語はアミノ酸の分子鎖を指すものであり、特定長の産物を指すものではな（、必要であれば例えばグリコジル化、アミド化、カルボキシル化またはリン酸化によってｉｎ　ｖｉｖｏまたはｉｎ　ｖｉｔｒｏで修飾し得るものであり、従って特にペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質はポリペプチドの定義に含まれる。

突然変異は、上記領域において遺伝情報が、組換えＤＮＡ技術によって、天然ＰｒＶのゲノムの該領域中に存在する遺伝情報に関して変更されていることと理解される。

突然変異は特に、配列番号２に示した抗原性または機能性ポリペプチドを生成することができないＰｒＶ突然変異体、または挿入異種核酸配列を含むＰｒＶ突然変異体をもたらす核酸の置換、欠失、挿入もしくは逆位、またはこれらの組合せである。突然変異は更に、上述の配列番号２のポリペプチドから逸脱しており別の抗原性または機能性を示すポリペプチドを産生ずる結果となり得る。

突然変異は、１つの欠失及び／または１つの挿入及び／または１つ以上のヌクレオチド置換であるのが最も好ましい。

ここで好ましい置換は、３７位にあるＨｉｓをコードするコドンがＡｒｇをコードするコドンに変更され、３５５位にあるＧｌｕをコードするコドンがＡｓｐをコードするコドンに変更され、且つ３７５位にあるＶａｌをコードするコドンがＡｌａをコードするコドンに変更されるような置換の組合せである。

遺伝子間配列内に位置するＯＲＦのための調節エレメント内にも突然変異が起こり得、そうするとポリペプチドの発現が不良となり得る。

ＰｒＶ突然変異体のゲノムにおける欠失は全ＯＲＦからなってもよい。

本発明のＰｒＶ突然変異体は、核酸配列をゲノム中に挿入し、それによって配列番号２に示したポリペプチドの発現を妨害または変更することにより得てもよい。

ＰｒＶウィルスのＢａｍＨＩ　４フラグメントは、９３８２ヌクレオチド塩基対におよぶ核酸配列からなる（ＧｅｎＢａｎｋ　Ｄａｔａ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ、ＬＯＯ６７６）　ｏこの配列は特に以下の２つの読み取り枠を含む：ａ、５２５アミノ酸を有する配列番号２に示したポリペプチドを逆方向にコードする、塩基対番号７６０から塩基対番号２３３３に位置する０ＲＦ−１゜ｂ、１６１アミノ酸を有するポリペプチドをこの方向にコードする、塩基対番号２４４０から塩基対番号２９２１に位置する０ＲＦ−２゜本発明において参照される（挿入）領域（配列番号１）はＰＲＶゲノム内ではこれまで同定されていなかった。驚くべきことに、ＰｒＶの必須機能を破壊することな（この領域において突然変異が許容されることが見い出された。

特に、それぞれのコドンを変更する結果となるＡ　１１６からＧ　Ｉ　＋　１１％　Ａ　１０６５からＣｌ０６５％及びＴＩ＋２４からＣ１１！４へのヌクレオチド置換は、得られたＰｒＶ突然変異体が親ウィルスより毒性が低いように配列番号２に示したポリペプチドから逸脱した機能性を有するポリペプチドの発現をもたらすことが見い出された。

上述のヌクレオチド置換の結果、誘導されるＯＲＦ遺伝子産物において３つのアミノ酸が変更され、３７位のＨｉｓはＡｒｇで置換され、３５５位のＧｌｕはＡｓｐで置換され、３７５位のＶａｌはＡｌａで置換される。

予期せずして、上述の領域内に突然変異、特に先に略述した置換を導入すると、その防御性に影響することなく生きたＰｒＶ突然変異体の毒性が著しく低下されることが判明した。この知見から、例えば上述の領域内に欠失、挿入または置換を導入することにより、弱毒化ＰｒＶ突然変異体を得る可能性が与えられる。

本発明の好ましい実施態様においては、ＰｒＶ突然変異体は、配列番号１に示した核酸配列を有するＰｒＶゲノムの部分に突然変異を有する。

配列番号２のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列において、偽性狂犬病ウィルス個体間に自然変異が存在し得ることを理解されたい。かかる変異によって、ＯＲＦ内の１つ以上のヌクレオチドが変更し得るが、ＯＲＦは依然として機能性ポリペプチドをコードする。

更に、遺伝子操作技術を使用し、依然として機能性ポリペプチドをコードする、配列番号１に示した配列に関連するＤＮＡ配列をもたらす上述の変異を生み出し得る可能性もある。かかる対応核酸配列中に突然変異を含むＰｒＶ突然変異も本発明の範囲内に含まれることは明らかである。

本発明のＰｒＶ突然変異体は株Ｋａから誘導されるが、Ｎｌ＾−３、ＲＩＣＥ、　７５Ｖ１９またはＰｈｙｌａｘｉａのごとき任意のＰｒＶ株を使用してＰｒＶ突然変異体を作製し得る。

ＰｒＶ突然変異体には、本明細書に定義するＤＮＡ配列内に挿入が与えられ得る。

本発明の１つの態様によれば、かかる挿入物は、配列番号２に示したポリペプチドの発現を阻害または変更するのみであらねばならない。これは例えば、３で割り切れない数の塩基対を挿入し、それによって読み取り枠をシフトさせるか、終結コドンを含む配列を挿入するか、または無意味な配列を挿入することにより行ない得る。

或いは、挿入物は、ポリペプチドをコードする異種核酸配列からなる。

かかる有効な組換えＰｒＶ突然変異体においては、異種核酸配列をゲノムＰｒＶ配列の許容される位置または領域内、即ち、感染または複製に必要なもののごときＰｒＶの必須機能を破壊することな（異種配列の組込みに使用し得る位置または領域内に組込みことが前提である。かかる領域を挿入領域と称する。

本明細書において使用される“組換えＰｒＶ突然変異体”なる用語は、異種核酸配列、即ちＰｒＶに天然に存在する遺伝子の核酸配列と同一でない核酸配列を含むＤＮＡをウィルスゲノム中に組み込むことにより遺伝子的に改変された感染性ウィルスを指す。

細胞が組換えＰｒＶ突然変異体に感染すると、該細胞は異種遺伝子を異種ポリペプチドの形態で発現し得る。

本発明において言及される挿入領域はＰｒＶゲノム内ではこれまでに同定されていない。驚くべきことに、異種ＤＮＡを組込むような突然変異が、ＰｒＶの必須機能を破壊することなくこの領域において許容される。

要約すると、実質的に上述した挿入領域は、欠失を導入したり、または所望であれば該領域からＤＮＡ配列を欠失させた後に異種核酸配列を組込むことに使用することもできるし、また該領域内に他の突然変異を導入するために使用することもできるＰｒＶゲノム内の領域に位置することを特徴とする。

本発明のＰＲＶゲノム内に組込まれる異種核酸配列は、例えばウィルス、原核細胞、真核細胞または合成といった任意の供給源から誘導し得る。前記異種核酸配列は、ＰｒＶゲノム中に挿入された後に疾患に対する免疫を誘導すべく適用され得る病原体、好ましくはブタ病原体から誘導し得る。

パルボウィルス、腸疾患発症性大腸菌、口蹄疫ウィルス（ｆｏｏｔ　ａｎｄ　ｍｏｕｔｈ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉｒｕｓ）　、気管支敗血症菌、ＭＹｃｏｐｌａｓａ＋ａ　ｈｙｏｐｎｅｕａ＋ｏｎｉａｅ、　Ｐａ５ｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａまたは５ｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ　５ｕｉｓのポリペプチドをコードする核酸配列は、ＰＲＶゲノムの挿入領域内への組込みに好ましいと考えられる。

更に、医薬または診断用途、特にリンホカイン、インターフェロンもしくはサイトカインのごときイムノモジュレータ−またはβ−ガラクトシダーゼもしくはスーパーオキシドジスムターゼのごときマーカー酵素に対するポリペプチドをコードする異種核酸配列を前記挿入領域内に組込み得る。

組換えＰｒＶ突然変異体における異種核酸配列の発現には、異種核酸配列に操作的に結合された適当なプロモーターが必須条件となる。プロモーターの選択は、組換えＰｒＶに感染した細胞中で遺伝子転写を誘導し得る任意の真核細胞、原核細胞またはウィルス由来のプロモーター、例えばレトロウィルスＬＴＲのプロモーター（Ｇｏｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９．６７７７−６７８１．１９８２）　、ＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎ　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２０９．　１４２２−１４２７）またはサイトメガロウィルス即時型初期プロモーター（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）　（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃｅ１ｌ　４１．５２１−５３０．１９８５）　ｌ、−まで及びことは当業者ニハ明らかである。

ｉｎ　ｖｉｖｏ相同組相同波術を使用し、突然変異配列をもつ核酸配列をＰｒＶゲノム中に導入することができる。

この方法の最初のステップは、ＰｒＶゲノムＤＮＡと組換えるための組換えＤＮＡ分子の構築を含む。かかる組換えＤＮＡ分子は任意の適当なプラスミド、コスミドまたはファージから誘導することができるが、プラスミドが最も好ましく、上述のごときＰｒＶゲノムの部分のＤＮＡを含むＰｒＶ　ＤＮＡのフラグメントからなる。

必要によっては調節配列と組み合わせて、欠失させたりまたは異種核酸配列を挿入することにより、上記フラグメント内に突然変異を導入し得る。

上述のごときＰｒＶゲノムの部分のＤＮＡ配列は、ウィルスＰｒＶゲノムとｉｎ νｉｖｏ相同組換えが起こるのに適当な長さ、例えば５０〜３０００ｂｐのＰｒＶ核酸配列によってフランキングされるのが好ましい。

このように得られた組換えＤＮＡ分子は、突然変異をＰｒＶゲノム中に導入するのに適している。

所望であれば、同じまたは異なる病原体から誘導される２種以上の異種核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子を作製することができ、ＰｒＶ核酸配列によってフランキングされているかかる配列を挿入領域配列中に組込む。このような組換えＤＮＡ分子を使用し、２種以上の抗原性ポリペプチドを発現する組換えＰｒＶを生産して多価ワクチンを提供することができる。

次に、例えばブタ腎細胞またはＶＥＲＯ細胞といった細胞をＰｒＶ　ＤＮＡを用いてトランスフェクトしたり、上述のごとき組換えＤＮＡ分子の存在下に野生型ＰｒＶに感染させ、それによって、組換えＤＮＡ分子中の配列とＰｒＶゲノム中の対応配列との間で組換えを起こすことができる。

組換えは、プラスミド配列を含まない適当なフランキングＰｒＶ配列によってフランキングされた突然変異配列を含む核酸配列を用いて細胞を同時トランスフェクトすることによっても実施し得る。次いで組換えウィルス子孫を細胞培養において生産し、例えばハイブリダイゼーション１こよって、または突然変異を含む核酸配列と同時に組み込まれた遺伝子によってコードされる酵素活性を検出することによって、例えば遺伝子型または表現型につ０て選択し得る。突然変異が位置する核酸配列をコードするポリペプチドの不在を検出することも可能である。

同様に、挿入された異種核酸配列によってコードされるポリペプチドの存在を検出することもできる。

ネオマイシン、ゲンタマイシンまたはマイコフェノール酸のごとき化合物に対する耐性に基づき、組換えウィルスを明確に選択し得る。選択された組換えＰｒＶを細胞培養において大規模に培養し、次いで前記ＰｒＶｉこよって発現される物質、即ち異種ポリペプチドを含む組換えＰｒＶを回収することができる。

上述のごとき組換えＤＮＡ分子を用いて形質転換された宿主細胞も本発明の一部を構成する。

本発明の別の部分は、本発明のＰｒＶ突然突然変異二番染した細胞培養物によって構成される。

本発明の生きたＰｒＶ突然変異体は、動物、特（こブタを予防接種するために使用し得る。突然変異方（欠失であるＰｒＶ突然変異体を用いて予防接種する場合、配列番号２に示したＰｒＶポリペプチドは発現されないが、被接種宿主においてＰｒＶ突然変異体の複製は依然として行われるのが好ましい。

特定の病原体の１種以上の異種ポリペプチドを発現するＰｒＶ突然変異体を用いて予防接種を実施する場合、被接種宿主内で組換えＰｒＶが複製され、ＰｒＶポリペプチドと共に異種ポリペプチドをｉｎ　ｖｉｖｏで発現するのが好ましい。

被接種宿主中で発現されたポリペプチドはＰｒＶ及び該特定病原体の両方に対する免疫応答を誘発する。特定病原体から誘導された異種ポリペプチドが防御免疫応答を刺激し得る場合、本発明の組換えＰｒＶ突然変異体を接種された動物は、その後の該病原体による感染及びＰｒＶによる感染に対して免疫がある。本発明のＰｒＶゲノムの挿入領域中に組み込まれた異種核酸配列はｉｎ　ｖｉｖｏで連続的に発現され、病原体に対して確実で、安全で且つ長期持続性の免疫を与える。

１種以上の異種ポリペプチドを含みそれらを発現する本発明のＰｒＶ突然変異体は一価または多価ワクチンとして作用し得る。

生ワクチンの調製のためには、本発明のＰｒＶ突然変異体をブタ由来の細胞培養物上またはＶＥＲＯ細胞上で増殖させ得る。このように増殖させたウィルスを、組繊細胞培養液及び／または細胞を回収することにより採集し得る。

生ワクチンは懸濁液の形態で調製してもよいし、凍結乾燥してもよい。

免疫原として有効な量のＰｒＶ突然変異体に加え、本発明ワクチンは医薬的に容認可能な担体または希釈剤を含み得る。

本発明に有効な医薬的に容認可能な担体または希釈剤の例としては、５ＰＧＡのごとき安定化剤、炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、澱粉、スクロース、グルコース、デキストラン）、アルブミンまたはカゼインのごときタンパク質、ウシ血清またはスキムミルクのごときタンパク質含有物質、及び緩衝液（例えばリン酸緩衝液）が挙げられる。

必要によっては、アジュバント活性を有する１種以上の化合物をワクチンに加えてもよい。適当なアジュノクントとしては、例えばアルミニウムの水酸化物、リン酸塩または酸化物、油性エマルジョン（例えばＢａｙｏｌ　Ｆ（Ｒ）またはＭａｒｅｏｌ　５２（Ｒ））　、サポニンまたはビタミンＥ可溶化物（５ｏｌｕｂｉ１ｉｓａｔｅ）が挙げられる。

投与に有効な用量は年齢、体重及び投与形態に応じて変化する。適当な用量は例えば約１０２〜１０’ｐｆｕ／動物である。

本発明のＰｒＶ突然変異体を使用して不活化ワクチンを調製することもできる。

動物に投与するためには、本発明のＰｒＶ突然変異体は特に鼻腔内、皮肉、皮下または筋肉内に投与し得る。

本発明の別の目的は、サブユニットワクチン、即ち、本発明のＰｒＶ突然変異体によって発現される異種ポリペプチドを含む医薬及び診断製剤を製造することである。これは、前記ＰｒＶ突然変異体に感染させた細胞を、異種ポリペプチドの発現を促進する条件下に培養することにより達成し得る。次いで、異種ポリペプチドを慣用方法を用いて用途に応じた所定の程度にまで精製し、免疫、治療または診断活性を有する製剤に加工することができる。

上述の特定病原体に対する能動免疫は、健康な動物における防御処置として適用される。特定病原体に既に感染している動物を、抗原性ポリペプチドをコードする該特定病原体から誘導される異種遺伝子を含む本発明のＰｒＶ突然変異体によって誘発された抗体を含む抗血清を用いて治療し得ることは言うまでもない。本発明のＰｒＶ突然変異体に対する抗血清は、適当な免疫応答を誘発するために有効量の前記ＰｒＶ突然変異体を用いて動物、例えばブタを免疫することにより調製し得る。次いで、動物から採血し、抗血清を調製し得る。

本発明は更に、本発明のワクチンを用いて予防接種された動物を、天然ＰｒＶに感染した動物と区別する方法を提供する。この方法は、動物の体液を、通常天然ＰｒＶに感染した動物の体液中で発現され且つその中を循環する抗原の存在について分析し、体液中に存在する抗原を同定し、前記抗原を、本発明の偽性狂犬病ウィルス突然変異体に感染させた動物の体液中で発現し且つその中を循環する抗原と相関させることからなる。動物において天然ＰｒＶによって通常発現される抗原の存在はＰｒＶ感染の指標となり、一方、本発明のＰｒＶ突然変異体にはもはや含まれないものを除く同様の抗原の存在は、本発明のワクチンを用いて予防接種されており天然偽性狂犬病ウィルスには感染していない動物の指標となる。

抗原の存在を判定及び同定することは、直接的には体液中の抗原を検出することにより、また間接的には該抗原に特異的な体液中の抗体を検出することにより行ない得る。

特に、本発明のＰｒＶ突然変異体を含むワクチンを用いて予防接種された動物と、天然ウィルスに感染した動物とを区別することは、動物においてＰｒＶ突然変異体及び天然ＰｒＶの両方によって通常発現される、配列番号２に示したポリペプチド及び少なくとも１種の他の抗原の存在について体液を分析することにより行ない得る。

体液中に存在する抗原または抗体を同定し、前記抗原またはポリペプチドの存在または不在を決定する。天然ウィルスに感染した動物において通常発現される抗原またはかかる抗原に対する抗体が存在し且つ配列番号２に示したポリペプチドまたはかかるポリペプチドに対する抗体が不在であることが、本発明のワクチンを用いて予防接種されているが天然ＰｒＶには感染していない動物の指標である。

本発明の別の態様は、動物の体液中にある本発明のＰｒＶ突然変異体を天然ＰｒＶ突然変異体と区別する試験キットである。かかる試験キットは、配列番号２に示したポリペプチドまたはそれに対する抗体を検出するのに適した化合物と、本発明のＰｒＶ突然変異体及び天然ＰｒＶ株の両方によって発現される抗原またはかかる抗原に対する抗体を検出するのに適した化合物とを含む。

動物が天然ＰｒＶに感染しているかどうかを判定する別の試験も実施し得る。この場合、配列番号２に示したポリペプチドに由来する抗原またはこれに対する抗体の存在についての試験が、動物が天然ＰｒＶに感染しているかどうかを示し得る。

従って、配列番号２に示したポリペプチドに由来する抗原またはこれに対する抗体の存在についての試験のみを含む試験キットも本発明の一部を構成する。

実施例１、ウィルス及び細胞培養毒性ＰＲＶ株Ｋａ及び突然変異ＰＲＶ株を、Ｍａｄｉｎ　Ｄａｒｂｙウシ腎細胞（ＭＤＢＫ、　ＡＴＣＣＣＣＬ　２２１）または５Ｋ−６ブタ腎細胞において増殖及びプラーク精製した。

細胞を、１０％ウシ新生仔血清（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　Ｍａｎｎｈｅｉｍ。

ＲＦＧ）　、１００単位／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイ／ンを含むイーグル最少必須培地（ＭＥＩＩＩ）中に維持した。

ウィルス増殖のために、ダルベツコ改良最少必須培地（ＤＭＥＭ）中でＢＨＫ　（ハムスター乳仔腎）細胞を使用した。分画遠心法及び最近記載された１２〜５２％（ｖ／ｖ）スクロース濃度勾配による沈降速度法（Ｌｕｋａｃｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５）によっピリオンバンドを吸引し、０．２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　５＋ｏＭ　ＥＤＴ＾、０゜１５Ｍ　ＮａＣ１を用いて希釈し、５Ｗ２７　ｏ−ター（Ｂｅｃｋｍａｎ）において２５．ＯＯＯＲＰＭ、４℃で１時間ペレット化することにより濃縮した。

２、サブクローニング及び配列分析野生型偽性狂犬病ウィルス株ＫａのＢａｍＨＩフラグメント４を、３．８ｋｂ　ＢａｍＨＩ／Ｓａｌ　Ｉフラグメント、２．７ｋｂ　’Ｓａｌ　Ｉフラグメント及び２．９ｋｂ　Ｓａｔ　Ｉフラグメントとして、バクテリオファージＭ１３ｍｐ１８由来の複数のクローニング部位を導入しておいたｐＢＲ３２２誘導体中にサブクローニングした。全ＢａｍＨＩ−４７ラグメントの左側末端及び右側末端の配列を決定した。更に配列決定するために、市販のキット（Ｐｈａｒ＋＊ａｃｉａ。

Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、　Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、エキソヌクレアーゼＩＩＩ／ヌクレアーゼＳｔ消化（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、　Ｓ、、　１９８６．　Ｕｎｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ＩＩＩ　ｃｒｅａｔｅｄ　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔｓ　ｆｏｒ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、Ｇｅｎｅ　２８：３５１−３５９）によって、ネステッドセット（ｎｅｓｔｅｄ　５ｅｔ）の重複した欠失サブクローンを調製した。ＤＮＡ配列分析は、二重鎖プラスミドＤＮＡ　（Ｈａｔｔｏｒｉ、Ｍ、ａｎｄ　５ａｋａｋｉ、Ｙ、、１９８６．　Ｄｉｄｅｏｘｙｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ｕｓｉｎｇ　ｄｅｎａｔｕｒｅｄ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｔｅｍｐｌａｔｅｓ。

＾ｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１５２：　２３２−２３８）においてｐＢＲ３２２特異的オリゴヌクレオチド（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）をプライマーとして使用し、チェインターミネータ−法（ｄｉｄｅｏｘｙ　ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ）　（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ、　ａｎｄＣｏｕｌｓｏｎ、＾、Ｒ，，１９７７、ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４　：　５４６３−５４６７）によって実施した。偏性狂犬病ウィルスＤＮＡの高Ｇ＋Ｃ含有量から生じるバンド圧縮を最少限に抑制するため、配列決定反応においてｄＧＴＰに代えて７−ジアザ−２゛−デオキシ−ＧＴＰを使用した（Ｍｉｚｕｓａｖａ　Ｓ、、　ＮｉｓｈＮ１５ｈｉ、　Ｓ、　ａｎｄＳｅｅｌａ、　Ｆ、、　１９８６．　Ｉｍｐｒｏｖｃ＋＋ｅｎｔ　ｏｆ　ｄｉｄｅｏｘｙ　ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｂｙ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｄｅｏｘｙ−７−ｄｅａｚａｑｕａｎｏｓｉｎｅ　ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｉｎ　ｐｌａｃｅ　ｏｆ　ｄＧＴＰ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１４．１３１９−１３２４）　、配列決定産物を３５３−ｄＡＴＰ（＾ｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｕｃｈｌｅｒ、　Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて標識し、電気泳動によって分離したフラグメントをオートラジオグラフィーによって可視化した。別々のクローンにおいて少なくとも２回、両つィルスＤＮＡ鎖の配列を決定した。Ｂａａ＋ＨＩ −１５に対するＢａｍ［ｌＩフラグメント４の向きを、ＢａｍＨＩ−１５結合部を含む５ａｉｌフラグメントの部分配列決定によって判定した。

得られた配列を、ＶＡＸ／ＶＭＳバージョン７．１のｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏ＋１ｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ　ｓｏｆｔｗａｒｅ　ｐａｃｋａｇｅ　（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、　Ｊ、、 ■ａｅｂｅｒｌｆ、　Ｐ、　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈｉｅｓ。

０、、１９８４．　Ａ　ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　ｓｅｔ　ｏｆ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ＷＡＸ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２　：　３８７−３９５）を使用して翻訳した。配列は２つの読み取り枠を含むことが判明した。

第１読み取り枠（配列番号１）ＯＲＦ−１は塩基対番号７６０から塩基対番号２３３３に認められる。開始コドンは塩基対２３３３に位置しており、これは、塩基対番号２４４０から塩基対番号２９２１に認められる第２読み取り枠０ＲＦ− ２とは転写方向が反対であることを示している。

２つの読み取り枠間の遺伝子間開列はＡＴに富む配列を含んでおり、これは恐らく調節エレメントとして機能するだろう。

３、毒性マーカーの決定無毒性ＰＲＹ　Ｂａｒｔｈａ株はゲノム中に３種の傷（１ｅｓｉｏｎ）を有する。第１に、糖タンパク質ｇ！及びｇｐ６３の発現に影響するＵＳ領域内の欠失（Ｌｏｍｎｉｃｚｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　４９゜９７０−９７９（１９８４））。第２に、非必須ｇＩＩＩ糖タンノチン質における突然変異（Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６２．２７１２−２７１７（１９８８））　、第３に、まだ明確にされていないＢａｍＨＩ −４フラグメントの作用（Ｌｏｍｉｎｉｃｚｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、６１゜７９６−８０１（１９８７））。この欠陥の厳密な特性を定義するため、Ｂａｒｔｈａ及び野生型Ｋａｐｌａｎ株の両方のＢａｍＨＩ−４７ラグメントの配列を決定した。ＢａｍＨＩ−４フラグメントの３．８ｋｂ　ＢａｍＨＩ／Ｓａｌ　Ｉ　、　２．７ｋｂ　Ｓａｔ　Ｉ　／Ｓａｔ　Ｉ及び２．９ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ　／Ｓａｔ　ＩサブフラグメントをｐＢＲ３２２中にサブクローニングした。第１に、ＢａｍＨＩ−４フラグメントの左右の末端の配列を決定した。第２に、市販のキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、　Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してエキソヌクレアーゼＩＩＩ／ヌクレアーゼＳ１消化によって、ネステッドセットの重複した欠失サブクローンを調製した。別々のクローンにおいて２回、両つィルスＤＮＡ鎖の配列を決定した。完全なりａｍＨＩ−４７ラグメントから得たネステッド欠失サブクローンを使用し、Ｓａｌ　１部位と重なり合う配列を決定した。ｐＢＲ３２２特異的オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用するチェインターミネータ−法によってＤＮＡ配列分析を実施した。Ｂａｒｔｈａ株と野生型Ｋａｐｌａｎ株の３．８ｋｂ　ＢａｍＨＩ／Ｓａｌ　Ｉサブフラグメントの配列を比較すると、ＯＲＦ　（配列番号１）の領域内に７つのヌクレオチド変更が明らかとなり、このうち３つはＯＲＦのアミノ酸を変更する結果となった（表１）。

表１０ＲＦ−２、続＜ＯＲＦのＮ末端部分または複数開始点コンセンサス（ｏｒｉ　ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）内にはアミノ酸の変更は認められなかった。かかるアミノ酸配列の変更によってＢａｒｔｈａ株の毒性低下が惹起されるかどうか判定するため、上述のＯＲＦに対応するＢａｒｔｈａ株のＯＲＦをＫａｐｌａｎ株の０ＲＦ（配列番号１）で置き換えた。このマーカーレスキュー実験においては、ｇＩＩＩ及びｇ　Ｉ　／ｇｐ６３欠陥が既に修復されたＢａｒｔｈａ株を使用した。

（７つの突然変異は含まない）　Ｋａｐｌａｎ株の完全な３．８ｋｂ　ＢａｍＨＩ／Ｓａｌ　ＩフラグメントをｐＢＲ３２２中にサブクローニングした。このフラグメントをＢａｒｔｈａ株のＢａｍＨＩ／Ｓａｌ　Ｉフラグメントと、ｇＩＩＩ　−ｇ　Ｉ　／　ｇｐ６３修復Ｂａｒｔｈａ突然変異体及び３．８ｋｂフラグメントで同時トランスフェクトすることにより交換した。３．８ｋｂ　Ｋａｐｌａｎフラグメントを含むＢａｒｔｈａクローンを選択し、３回のプラーク精製によって更に精製した。

Ｂａｒｔｈａ株、ｇＩＩＩ及びｇ　Ｉ　／ｇｐ６３欠陥が修復されたＢａｒｔｈａ株、並びに、ｇＩＩＩ、　ｇ　Ｉ　／ｇｐ６３及びＯＲＦ欠陥が修復されたＢａｒｔｈａ株を用いた動物実験を実施し、ブタにおけるががる欠陥のＰＲＶの毒性への影響を判定した。この実験において、Ｂａｒｔｈａ株は無毒性であることが立証され、ｇＩＩＩ及びｇｌ／ｇｐ６３欠陥が修復されたＢａｒｔｈａ株は極めて穏やかな毒性であることが立証された。ＯＲＦを修復すると完全に毒性のＰＲＶ株となった。ＢａｍＨＩ−４フラグメントの他の部分の修復は毒性に全く影響しなかった（図１）。

４、読み取り枠における欠失及び挿入の構築ＯＲＦ　ＰＲＹ　Ｋａｐｌａｎ突然変異体を構築するため、ＢａｍＨＩ−４の左側の３．８ｋｂ　Ｂａｍ１ｌＩ　／　Ｓａｌ　ＩフラグメントをｐＢＲ３２２の複数のクローニング部位中にクローニングした。次いで、ＢａｍＨＩを用いて切断し、フレノウ充填し、再連結することにより、左側ＢａｍＨＩ部位を欠失させた。Ｂｓｔ−ＸＩ／　Ｓｔｕ　Ｉを用いて切断すると、ＯＲＦ内で１２６ｂｐが欠失する結果となった。この欠失において、リンカ−挿入によって単一のＢａｍ■■部位が形成された。この新たなりａｍＨＩ部位に、ｇＸ−βＧａ１発現カセット（Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌ　Ｍｅｔｈ、、　３０．５５−６６（１９９０））を挿入した。βＧａｌカセットを含むＯＲＦをＰＲＶ　Ｋａｐｌａｎ株による同時トランスフェクションに使用した。

青色に染色された全てのプラークを単離し、制限分析及びサザンブロッティングによってチェックし、３回のプラーク精製によって更に精製した。

図面の説明２．７ｋｂｐ、　２．９ｋｂｐのｓａｌ　Ｉサブフラグメント及び３．８ｋｂｐのＢａｍＨＩ／Ｓａｌ　Ｉサブフラグメントを使用するＢａｍＨＩ−４のサブフラグメントのマーカーレスキュー実験。Ｂａａ＋ＨＩ制限部位の位置が図の中央部に示されている。

ＢａｍＨＩ−４フラグメント内のＯＲＦの位置は白い四角で示されている。マーカーレスキュー実験の結果（＋または−）は図の下部にまとめて示されている。

配列表（１）一般情報：（＋）出願人・（Ａ）名称：　ＡＫＺＯＮ、　ｌ’。

（Ｂ）番地：　Ｖｅｌｐｅｒｗｅｇ　７６（Ｃ）市、＾ｒｎｈｅ讃（Ｅ）国・オランダ（Ｆ）郵便番号　ＮＬ−６８２４８Ｍ（ｉｎ発明の名称：偽性狂犬病ウィルスワクチン（ｉｉス）配列の数・２（］Ｖ）コンピュータ読取り形態：（Ａ）媒体のタイプ　フロッピーディスク（Ｂ）コンピュータ：　ＩＢＭ　ＰＣコンパチブル（Ｃ）ｔヘレ−ティンクンステ１．　：　ＰＣ−ＤＯＳ／ＪＩＳ− ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア　Ｐａｔｅｎｔｌｎ　リリース＃１．０．バージョン＄１．２５（ＥＰＯ）（ｖｉ）先願データ・（Ａ）出１１ｔｉ番号＋　ＥＰ　９２．２０３．０７９．６（Ｂ）出１１日：　１９９２年１θ月６日（２）配列番号・１（ｉ）配列の特徴（Ａ）配列の長さ。１５７８塩基対（Ｂ）配列の型・核酸（Ｃ）鎖の数　二本鎖（Ｄ）トボロノー　直鎖状（ｉｉ）配列の種類、ゲノムＤＮＡ（ｖｉ）起源。

（Ａ）生物基：偽性狂犬病ウィルス（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ　ｖｉｒｕｓ）（Ｂ）抹：　Ｋａｐｌａｎ（ｘｉ）配列・ＣＴＣＣＴＧＧＣＣＧ　ＡＧＣＣＣにＣＣＡＴ　ＣＧＴＧＣＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＧＧＧＣＴ　ＴＣＧＴＧＴＡＣＧＣＣＧＴＧＡＡＣＧＡＧ@４８０（２）配列番号・２（ｉｆ）配列の種類：タンパク質Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｈｌｓ　Ｖａｔ　Ｈｌｓ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｐｈａｌ　５　１０　工５Ｔ’ｙｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｒｑ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｐｈａ　ｖａｌ　Ｈｌｌｌ　Ｇｕｙ　０１１０７■ １１ｅ　Ｖａｔ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｈｌｓ　Ａｒｑ　Ａｒｑ　Ｓａｒ　Ａｒｑ　Ｇｌｕ　Ｘｉｓ　ＧｌｙＬｙｓ　Ｐｈｅ　ｃｔｙ　論ｕＴｈｒ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｘｑ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｎ　’！’ｙｒ　Ｖ≠P 人ｒｑ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　ｋｒｑ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ６５　７０　７５　ＢｏＳｅｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　ＡＩＩｐ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　？ｈ■ Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌ（Ｉｕ　ＣｙＩ　Ｇｌｙ　ｈＸｑ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａ１１ｐ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ａｓ１ｐ　Ｐｒｏ　■■ ｔ＠ｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　ＣＹｓ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ＾ｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　ＴｈｒＬｅｕ　Ｖａｌ　ＨＬｓ　Ａｓｐ　Ａｘｑ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ａｌａ　ＧｌｕＰｒｏ　Ａｌａ　ＸＬａ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｉｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈａ　Ｖａｌ　’！’ｙｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｇ撃■ ＾１ａ　ｃｙｓ　Ｐｈｓ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｔ’ｙｒ　Ｌａｕ　Ｓａｒ　にｌｕ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　５ｌ撃撃■ Ｌ＠ｕ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　ｋｕ　Ｐｈａ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　ＸＬｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｍａｌ　ＡｒｇＰｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｖａｎ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　ＧｌｙＧ１７　＾【ｑ＾ｌａ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｓｅｒ　ＶａＩ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　入１ａ　Ｇｌｕ＾ｒ９　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　八ｌａ　Ｔｈｒ　ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　入ｒｑ　Ｔｙｒ２２５　２コ０　２３５　２４０１１＠　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｒｑ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｇｉｙ　Ｇｌｙ　５ｓｒ　Ｌｅｕ　５ｅｒＬｅｕ　Ｇｉｎ　Ｍａｔ　Ｌａｕ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌ”１１　八ｌａ　Ａｓｐ　入１ａ　工Ｉｓ　Ｌｅｕ　入窒■ Ａｒｑ　入１ａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　入１ａ　Ｓｅｒ　入ｓｐ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　八ｌａ　Ｖａｎ　ＶａＩ　Ｇｌｕ　入１ａｖａｌ　Ｓａｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｐｈａ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　５ｅｒＬｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ｘ１＠　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ３０５　コ１０　３１５　３２０ ’Ｉ’ｒｐ　Ｈｌｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　５！ｒ　Ｃｙｓｔ　’ｒｙｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　ＧｌｙＭｅｔ　Ｌａｕ　ｈａｐ　`ｒ９コ２５　３３０　３３５Ｌ＠ｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　入ｌａ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ３４０　３４５　コ５０Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　ｋｒｑ　Ａｌａ　Ａｌａｌミコ５　：１６０　コロ５Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　ｖａｌ　入Ｓｎ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｒｑ　Ｃ１ｕ　入１ａ　Ｔｈｒ　Ｖａ１Ｐｈ＊　Ｇｌｙ　ＧＬｕ　ＶａＬ　Ｍｅｔ　Ａｒｑ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｖａｎ　Ａｓｎ　Ａｌａ＾ｌａ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ａｌａ：１８５　３９０　コ９５　４００Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｘｌａ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｈ１ｓ＾１ａ　Ａｒｑ　Ｇｌｕ　Ｍｐ　八１ａ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｍｅｔ　５ｅｒ＾ｓｐ　八ｌａ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　八ｌａ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　入１ａ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ八ｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　八ｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　’ｒｙｒ　Ａｌａ　ＧＩＹ　Ａｒｑ　Ｇｌｙ　Ｌｅ■ ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ＾１ａＶａｌ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　八ｌａ　Ｐｈａ　Ｇｌｙ　Ａｊｌｐ　ｓｅｒ　Ｐｒｏ　＾１■ Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　ｃｌｎ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈａ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ

Claims

【特許請求の範囲】

１．偽性狂犬病ウイルス（ＰｒＶ）突然変異体の製造方法であって、ＰｒＶゲノムの配列番号２に示したポリペプチドをコードする読み取り枠（ＯＲＦ）内に、組換えＤＮＡ技術によって突然変異を導入することを特徴とする方法。
２．前記突然変異をｉｎ　ｖｉｖｏ相同組換えによって導入することを特徴とする請求項１に記載の方法。
３．ＰｒＶゲノムＤＮＡと、前記突然変異が導入されているＯＲＦを含むＤＮＡ分子とで宿主細胞を同時トランスフェクトすることを特徴とする請求項２に記載の方法。
４．前記突然変異が欠失、挿入または置換であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
５．前記置換が、コドンＨｉｓ３７からＡｒｇ３７へ、コドンＧｌｕ３５■からＡｓｐ３５■へ、及びコドンＶａｌ３７■からＡｌａ３７■への変更からなることを特徴とする請求項４に記載の方法。
６．前記突然変異が、ブタ病原体の抗原をコードする異種核酸配列の挿入からなることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
７．請求項１に記載のＯＲＦのＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子。
８．前記ＯＲＦが突然変異を含むことを特徴とする請求項７に記載の組換えＤＮＡ分子。
９．請求項７または８に記載の組換えＤＮＡ分子を用いて形質転換された宿主細胞。
１０．配列番号２に示されたポリペプチドをコードする読み取り枠内に欠失または挿入を含むことを特徴とするＰｒＶ突然変異体。
１１．請求項１から６のいずれか一項に記載の方法に従って調製されたＰｒＶ突然変異体または請求項１０に記載のＰｒＶ突然変異体から誘導された、ブタにおける感染性疾患に対処する上で有効なワクチン。