JPH05502018A - 免疫系活性化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 傷害、感染、および炎症性疾患に対する代謝応答は、傷害や感染の範囲と程度を 制限し創傷治癒を促進すると考えられる様々な生理的変化で構成される［ポンボ セリ（Ｊ、　Ｊ、　Ｐｏｍｐ。

するあるいは生物に対する限定的特異性を伴う一般的および定型的反応パターン を特徴とする。この応答の際にみられる生理的変化としては、末梢組織がらのア ミノ酸の易動化増大とそれに引き続く肝タンパク質合成増大、血液中における好 中球増多を伴う顕著な白血球増多、並びに血漿微量金属の再分布などが挙げられ る。内分泌的変化の一部としては、血漿インシュリン、グルカゴン、およびグル ココルチコイドの上昇などが挙げられる。発熱および負の窒素平衡も傷害や感染 に対する代謝応答の指標であるＥポンポセリ（Ｊ、　Ｊ、　Ｐｏｍｐｏｓｅ代謝 応答は細胞媒介物質によって制御される。少数のこれら細胞媒介物質としては、 インターロイキン−１アルフアおよびベータ（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子アルフ ァ／力ヶクチン（ＴＮＦ）　、腫瘍壊死因子ベータ／リンホトキシン、コロニー 刺激因子（ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＣＦ）、およびガンマインター フェロンなとか挙げられる。これらの媒介物質すなわちモノカインは、単核食細 胞と呼ばれる細胞によって宿主の傷害や感染に応答して分泌される。

細胞防御機構に関与する主な免疫媒介物質はリンホカインのインターロイキン− １（ＩＬ−１）であり、このものは単核食細胞によって合成される。様々な臨床 状態における感染に対する非特異的抵抗を強化するためにＩＬ−］を使う無数の 研究が行われてきた［ポンポセリ（Ｐｏｍｐｏｓｅｌｌｉ）ら、Ｊ、　Ｐａｒｅ ｎｔ、Ｅｎｔ、Ｎｕｔｒ、、　１２（２）：２１２−２１８　（１９８８）　］ 　。　ＩＬ−１およびその他の細胞媒介物質のヒトにおける使用に関連する主な 問題は、免疫制御ネットワークの微妙なバランスが破壊される結果生じるという 毒性および副作用である［ファウシ（Ｆａｕｃｉ　）　ら、Ａｎａｌｓ、ｏｆ　 −１ｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１０６：４２１−４３３（１９８７） ］。したかって、モモノカイの放出を刺激することによってそれらの内因性応答 を模倣する方かモノカインを外来的に投与するよりも合理的、生理的、かつ効果 的であろう。

免疫を損なわれた者、例えば化学療法や放射線療法の患者、エイズなとの免疫不 全性の疾患や障害をもつ患者、あるいは年齢６５歳以上の群は、術後合併症やそ の他の合併症の危険性が高い患者の大きな１群を構成している。これらの合併症 は処置や手術に起因する二次的４惑染か主な原因であり、患者の罹患率および死 亡率の点で重大な意味かある。

タンパク質栄養不良の者、負傷者、および免疫を損なわれた者は、栄養が十分て 免疫か正常な患者にあっては生体か白血球の関与する体液性防御機構および細胞 性防御機構を構成する能力を強化するところの必要な代謝応答を感染や傷害に対 して発揮する能力が実質的に失われている。実際、タンパク質栄養不良は細菌感 染の発生頻度と重症度の増大と直接関連づけられている［モルダワ−１ｏ１ｄａ ｗｅｒ）ら、Ｊ、　ＴｈｅｏｒＢｉｏｌ、、　１０６：１１９〜＋３３　（＋９ ８４）　コ　。

微生物由来物質あるいは植物由来物質によって免疫細胞媒介物質の産生を刺激す ることによって疾患を治療したり防止することが最近の関心の的となっている。

例えば、酵母細胞壁グルカンは哺乳動物における免疫系のいくつかの側面を刺激 する能力を有する。この効果の機構が明らかにされており、末梢血白血球および 血管外マクロファージ上に存在する特異的グルカン受容体が関与している［クシ ツブ（Ｃｚｏｐ、　Ｊ、に、　）　、Ｐａｔｈ、［ｍｍｕｎｏｐａｔｈ、　Ｒｅ ｓ、、　５：２８６−２９６　（１９８６）］　。この受容体をグルカンで活性 化すると宿主防御の増幅が刺激されるが、これには主にマクロファージとマクロ ファージ由来産生物によって媒介される一連の相互作用が関与し、これによって 患者の感染抵抗性が高まる。

酵母生物の細胞壁は、β（１−３）グルコース単位の骨格鎖にβ（１−６）結合 による低い度合いの分子間および分子内分枝が付いたものから成る多糖類である β−結合グルカンから主として成る。主に高度分枝β（１−６）グルカンから成 るマイナーな成分が主成分と密接に関連しており、両者が−緒になってアルカリ 不溶性グルカン画分を構成している。

β−グルカンの構造および／または製法については、マナ（１９７９）］によっ て述べられている。ホスホリル化グルカンを治療目的に使用することが米国特許 第４，７３９．０４６号でジルジオ（ＤｉＬｕｚｉｏ　）によって、および米国 特許第４，７６１．４０２号でウィリアムス（Ｗｉ　Ｉ　ｌ　ｉａｍｓ）らによ って述へられている。

発明の要旨 本発明は、天然および既存の市販グルカン製剤を包含する既報グルカンと比へて 有意に強化された免疫生物活性を有する一部の修飾酵母グルカンを利用して被験 者における免疫応答を刺激する方法に関するものである。天然原料と比較して高 いβ（１−６）　β（１−３）グリコシド結合比を有する免疫を損なわれている か疾患、入院、年齢あるいはその他の医学的素因による感染の危険に曝されてい る個体（動物またはヒト）における免疫応答の賦活化に特に有効である。本発明 の方法は、個体の免疫応答を賦活化するとともにその個体の宿主防御の改善に必 要な一連の現象を誘導するのに十分な量の修飾グルカン（ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｇ ｌｕｃａｎｓ）をその個体に投与するものである。

本方法で用いられる修飾グルカン（ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｇｌｕｃａｎｓ）は、天 然（未修飾）グルカンより高いβ（１−６）／β（ｌ−３）結合比を有する修飾 された酵母由来炭水化物ポリマーである。本方法で用いられるグルカンは、それ らまたはそれらを産生ずる生物（例えば酵母細胞）を処理することによって、構 造中のβ（１−６）／β（１−３）結合比を上げるべく修飾される。修飾β−グ ルカンは、今日までに報告されている天然の細菌グルカン、植物グルカン、およ び真菌グルカンや、ザイモサン（Ｚｙｍｏｓａｎ、　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃ ａｌ　Ｃｏ。Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ。

ＭＯ）やグルカン−Ｐ　（Ｇｌｕｃａｎ−Ｐ、　Ａｃｃｕｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ　ａｎｄ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃａｒｐ、、　Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、　 ＣＴ）などの野生型酵母細胞壁製剤とは、該修飾グルカンの一次構造が計生堅製 剤より高度の分岐（すなわちβ（１−６）結合かより多い）を有するという点で 構造的および機能的に異なる。このより高レベルの分岐は、より拡張した立体配 座と、より上昇した水性媒体中溶解度を修飾グルカンに与える。例えば、修飾グ ルカンの水溶液は野生型グルカンより大きい水動態容量（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍ ｉｃｖｏｌｕｍｅ　）を育する。修飾グルカンのもつ変化された構造と立体配座 か示す最も有意な影響は、ザイモサン賞食作用の競合的阻害により測定した場合 、野生型グルカン製剤より約１５倍大きい親和性で単球マクロファージのβ−グ ルカン受容体と結合し活性化する能力である。

修飾グルカンは天然物であり、誘導体化されたり化学的に修飾されていない。す なわち、天然グルカン上には存在しないいかなる官能基をも含んでいない。した がって、修飾グルカン製剤を利用した本方法は、微生物の侵入と感染に対する抵 抗性を強化するためにヒトおよび動物に安全かつ効果的に投与する方法を提供す る。

図面の簡単な説明 図１は、β（１−３）結合骨格と単一のβ（１−６）結合分岐分子を示すグルカ ンポリマー中の一般的な繰り返し単位の概略図である。

図２は、直鎖状β（１−３）結合グルカンの”Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。

図３は、可溶性修飾グルカンの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを天然の直鎖状グルカ ンおよび分枝グルカンの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルと比較したものである。

図４は、β（１−３）結合骨格とβ（１−６）結合側鎖を示す修飾グルカン分子 の概略図である。

図５は、グルカン製剤を摂取する単球の百分率によって測定したヒト単球中にお ける會食能力の刺激のレベルを様々なグルカン製剤と比較したグラフである。

粒子によるヒト好中球中のロイコトリエンＢ、（ＬＴＢ、　）の合成の誘導を示 すグラフである。

図７は、Ｓ、　ＣｅｒｅＶｉＳｉａｅ　Ｒ４由来の修飾グルカン粒子・およびグ ルカン−Ｐによるヒト単球中のＴＮＦの誘導を示すグラ母抽出物（ＹＥ）グルカ ンによる単球のザイモサン摂取に及ぼす用量依存性阻害効果を示すグラフである 。

図９は、修飾グルカンの単回静脈投与（５ｍ　ｇ／マウス）後のマウスにおける 末梢血の全白血球数および分画白血球数の変化を示すグラフである。

図１０は、修飾グルカンの頻回皮下投与（５ｍｇ／マウス／日ｘ４日）後のマウ スにおける末梢血の全白血球数および分画白血球数の変化を示すグラフである。

図１１は、マウスにおけるＥ、　ｃｏｌｉ敗血症モデルにおける修飾グルカンの 可動性を示すグラフである。

図１２は、６．７５Ｇｙ”Ｃｏを照射したマウスにおける造血増殖に及ぼすＳ、 　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｒ４由来修飾グルカンおよびグルカン−Ｐの影響を比 較したグラフである。

図１３は、８．２５Ｇｙ”Ｃｏを照射したマウスの３０日図１４は、６．７５Ｇ ｙ”Ｃｏを照射したマウスにおける内在性膵臓コロニー形成単位（Ｅ−ＣＦＵ） の刺激に及ぼす修飾グルカンまたはグルカン−Ｆの単回投与の影響を示すグラフ である。

発明の詳細な説明 本方法において有用な修飾β−グルカンは、細菌、植物、および真菌に由来する 天然野生型グルカンに対してより高いβ（１−６）／β（＋−３）結合比を存す るβ−グルカンである。本発明のグルカン（以下［修飾β−グルカンＪまたはｒ 修飾グルカンＪという）は天然グルカンよりマクロファージ活性化特性か向上さ れているので、より強力な免疫応答活性化をもたらす。修飾β−グルカンは酵母 細胞なとのグルカン含有細胞の細胞壁に由来するものであり、グルカン構造中に 存在するβ（１−６）分岐の程度を上昇させるべく処理されたものである。

免疫調整特性（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を 存するグルカンポリマーはいずれも共通のβ（＋−３）結合直鎖状グルコース骨 格を有する。レンチナンやスクレログルカン（ＳＣ−Ｉｅｒｏｇｌｕｃａｎ）な ど多くの種類も骨格中にグルコース単位のＣ−６炭素原子から規則的に分かれた 分岐を含んでいる。表１は、免疫調整特性を育する複数のグルカン、およびそれ らの報告済みの一般的結合構造をまとめたものである。

表１ 免疫活性を有するグルカン グルカン　起源　結合 原料の起源（例えば生物）に関わらず、表１に挙げた分岐グルカンはいずれも、 図１に示したようにβ（１−６）結合によって骨格鎖と結合している分岐の位置 に単一のグルコース単位を含んでいる。

グルカン中の結合タイプと構造を決定する際の一般的な手法は炭素１３核磁気共 鳴スペクトル分析法（”Ｃ−ＮＭＲ）である。得られたスペクトル中の１ｆｆＣ シグナルの数と相対強度を用いてグルカンポリマー中の結合配置と位置を決定す ることができる。例えば、グリコシド結合に関与している炭素原子の化学シフト （シグナル）は、対応する未結合炭素と比べて下向きに強くシフトされる（９ｐ ｐｍまで）。図２は、直鎖状β（１−３）結合グルカンポリマーについて観察さ れたものとしてこの現象を証明している。スペクトルは、β（ｌ−３）結合グル コース単位の６個の炭素原子から得られた６つのシグナルを示している。矢印（ １’　と３゛）はＤ−グルコースの場合のＣ−１およびＣ−３ソゲナルの位置を 示しており、β（１−３）グリコンド結合に関与する炭素原子Ｃ−１とＣ−３に ついて起きるシフトを証明している。表１に挙げたグルカンを用いた広範なＮＭ Ｒ研究が実施されており、これをそれらの構造を比較する上で有用な手法にして いる修飾グルカンの構造の相違は、それらの”Ｃ−ＮＭＲスペクトルで明白に証 明することができる。図３は、「修飾」グルカンの”Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図 示するとともに既報の免疫活性を有するグルカンについて報告されている１３ｃ シグナルの位置をまとめたものである（表１参照）。表１に挙げたグルカンはい ずれも、β（１−３）結合グルコース部分の６ｇの炭素シグナルを共有している 。第２に、すべての既報の分岐グルカン（例えばレンチナン、スクレログルカン 、スキシフイラン）はいずれも、図３に影ボックスとして示した特有のシグナル を約７ｏｐｐｒｎの位置にもたらす。このシグナルは、分岐点の位置で図１中Ｃ −６″として示したＣ−６原子（３，６−ジー〇−置換Ｃ−６）を表しており、 β（１−６）グリコシド結合に関与しているがゆえに、６１ｐｐｍの位置にある Ｃ−６シグナルに対して相対的に位置ずれしている。

修飾グルカンは、さらに約６９ｐｐｍの位置にも穎著なソゲナル（白ボックス、 図４ではＣ−６’　として示している）を含んでおり、これは分岐の内部β（１ −６）結合グルコース部分を表し、複数個のグルコース単位を含有する分岐の存 在を証明している。表２は、既存のグルカンについて報告されている構造パラメ ータを修飾グルカンのそれらと比較したものである。

表２ グルカンの分岐・結合構造 カードラン　ＯＯＱ スクレログルカン０．３３（１／３）　Ｉ　０　、　３３スキシフイラン０．３ ３（＋／３）　ｌ　Ｏ，３３レンチナン　０．４０（２１５）　１　０．　４０ 修飾グルカン”　０．５０（１／２）　２　１．００３ジー！−７ス（Ｓ、　Ｊ ａｍａｓ）らの米国特許出願第０７／３３３．６３０におけるＳ、　ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ　Ｒ４からの調製したがって、免疫活性を向上させた本発明の修飾グ ルカンは、既存の既報の天然グルカンより高くしたβ（１−６）／β（１−３） 結合比と１個以上のグルコース単位を含有する分岐とを有するものとして特徴づ けられる。

本方法において有用な修飾グルカンは、ジャマス（Ｊａｍａｓ）らによって米国 特許第４，８１０，６４６号、１９８９年４月１５日出願の同時係属中の米国特 許出願第０７／３３３．６３０号、およびいずれも１９８９年１月１７日出願の ０？／２９７．９８２号と０７／２９７，７５２号で、またジ製された修飾グル カンであり、これらすへてか教唆する内容は参照することにより本願に含まれる 。表２に示したように、修飾グルカンは０．４０より大きいβ（１−６）／β（ １−３）結合比と分岐頻度を存する。

との系統の酵母から得られる修飾β−グルカンでも用いることができるが、Ｓ、 　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが好ましい系統である。修飾β−グルカンは、例えばＳ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　、Ｓａ本方法において特 に有用な修飾β−グルカンは、ジャマス７／３３３．６３０号に述べられている 突然変異体系統の酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ：５ｉａｅ　Ｒ ４（ＮＲＲＬ　Ｙ　−１５９０３）に由来する高度分岐β−グルカンである。こ れらの修飾グルカンは、天然および市販グルカン製剤と比べて強化され性を有す る。さらに詳しくは、マクロファージ活性化特性はグルカン分子上に存在するβ （１−６）分岐の程度とタイプに関係するということがわかっている。例えば、 突然変異体酵母系統Ｓ、　ＣｅｒｅＶｉＳｉａｅ　Ｒ４に由来する修飾グルカン は、表２に示したように野生型β−グルカンより有意に多くのβ（１−６）分岐 を存し、野生型および非修飾グルカン製剤よりも強力かつ顧著な免疫応答を賦活 する。

「天然グルカン」および「野生型グルカン」という用語は、グルカンポリマーそ のものあるいはそれを産生ずる生物（例えば細菌、酵母細胞）がそのグルカンの 構造、特にβ（ｌ−６）／β（１−３）結合の比率を変化させるへく処理された り修飾されたりしていないグルカンおよびグルカン製剤を包含する意味を有する 。天然および野生型グルカンとしては、例えばザイモサン、レンチナン、および グルカン−Ｐなと既報の市販製剤が含まれる。

特定のグルカン製剤の比活性あるいは効能は、主にそれか認識され単球β−グル カン受容体に結合する能力に依存するであろう。β（１−６）を多くした修飾グ ルカンは、ヒト単球および好中球のグルカン受容体に対する親和性か増大してい る。該修飾グルカンのこのような増大した生物活性は、調製方法あるいはポリマ ーの状態すなわち粒子状であるか可溶性であるかに関わらず保存される。

本願において用いるとおり、「修飾β−グルカン」および「修飾グルカン」とい う用語は本修飾β−グルカンの生物学的に許容される類縁体を包含するものとし て理解されるべきである。「類縁体」という用語は、修飾β−グルカンと同じ生 物学的効果を存する化学的に関連のある構造体を包含する本発明は具体的には、 修飾β−グルカンまたはその誘導体を含有する組成物の経口または非経口投与に より個体（動物またはヒト）における免疫系を刺激する方法を目指したものであ る。本方法は、例えば負傷したり、免疫が損なわれていたり、あるいはタンパク 質栄養不良の状態にある個体あるいは患者の免疫応答を上昇させる上で効果的で ある。免疫が損なわれている個体とは、例えばウィルス、細菌、真菌、および原 生動物なとの感染性物質による攻撃に対する正常な細胞性あるいは体液性防御を 行う能力が低下あるいは減少している者であると一般に定義される。タンパク質 栄養不良の個体とは、デシリットルあたり（ｇ／ｄｌ）約３，２グラム未満の血 清アルブミンレベルおよび／または通常の体重の１０％を超える非意図的体重減 少を有する者であると一般に定義される。

より詳しくは、本発明の方法は、手術、傷害、疾病、放射線療法または化学療法 、あるいはその他の免疫系に悪影響を及ぼす状態に起因する感染の危険性が高く なっている動物またはヒトを治療的あるいは予防的に処置するために用いること ができる。本方法は、ＨＩＶ感染（エイズ）など正常な代謝免疫応答を低下また は抑制させる疾患あるいは障害を有する患者の治療に有用である。例えば、本方 法は化学療法または放射線療法を受けているか生体の感染に対する正常な代謝応 答を妄動化（ｍｏｂｉｌｉｚｅ）させる能力の低下をもたらす疾患、障害、ある いは処置（ｔ　ｒｅａ　ｔｍｅｎ　ｔ　）ゆえの二次的感染や術後合併症の発現 の危険性が高くなっている患者における代謝免疫応答をあらかしめ開始させるた めに用いることができる。修飾グルカン製剤による処置は、宿主の正常な免疫防 御を妄動化させることで処置宿主（ｔｒｅａｔｅｄ　ｈｏｓｔ）における感染か らの保護の度合いを強化する上で特に有効であることか示されている。

本方法においては、修飾グルカンは患者に投与され、その結果、主にマクロファ ージおよびマクロファージ由来産生物によって媒介される一連の相互作用を伴う 宿主防御の増幅をもたらす。これら測定可能な応答の一部としては、食細胞活性 、炎症因子（ロイコトリエン）の放出、リゾチーム酵素の放出、インターロイキ ン−１，４、および６の放出、コロニー刺激因子の放出、造血増殖、腫瘍壊死因 子（ＴＮＦ）の放出、および抗原提示（ａｎｔｉｇｅｎ　ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉ ｏｎ）の強化が挙げら応答を活性化する能力を測定した。これらの修飾製剤は、 下記のグルカン物質と比へて存意に強化された生物活性を示した。マナーズ（Ｍ ａｎｎｅｒｓ　）らの手順［Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、ユ３５：１９−３６　（ １９７３）　］に従って調製したアルカリ不溶性非１ω飾野生型グルカン、市販 の粒子状酵母細胞壁製剤であるサイモサン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ ｏ、）　、およびＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｒ４の親系統であるＳ、　ｃｅ ｒｅｖｉｓｉａｅ　Ａ３６４Ａ　（米国特許第４，８１０，６４６号）に由来し Ｒ４製剤より低いβ（１−６）／β（１−３）結合比を有する非修飾全グルカン 粒子。図５に示した結果は、ヒト単球における食作用を誘導する修飾グルカンの 増加効果を示す。強化された食作用は、１細胞あたり３個以上のグ　−単球の合 計数および１つの単球集団あたり摂取されたグルカン粒子の合計数の両方の点か らみて強化された食作用刺激を示した。他のグルカン製剤より存意に高いβ（１ −６）／β（１−３）結合比を存しているＲ４グルカン製剤の修飾構造はより大 きなグルカン受容体親和性を存し、より高い比活性をもたらしている。

別の態様において、好中球について、様々なグルカン製剤とともに保温した際の 炎症媒介物質ロイコトリエンＢ、（ＬＴＢ、’）の産生を測定した。図６に示し たように、修飾Ｒ４グルカン製剤（ＷＧＰ−Ｒ４）は、Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉ ａｅ　Ａ３６４Ａ由来のグルカン粒子（ＷＧＰ−Ａ３６４Ａ）より高レベルであ ってザイモサンより実質的に高いレベルのＬＴＢ４合成を誘導した。これらの結 果は、Ｓ、　に２ｒｅｙｉｓｉａｅ　Ｒ４に由来する修飾グルカンが、非修飾天 然グルカンと比較すると単球のグルカン受容体に対する親和性が増大しているこ とを示すものである。

もう一つの態様において、Ｒ４修飾グルカンの水溶性製剤を、本願と同時に出願 された（代理人の事件番号ＡＢＹ８９−０３）同時係属中の米国特許出願第　号 でジャマス（Ｊａｍａｓ　）らによって述へられているプロセスを用いて部分酸 加水分解によって調製したか、その教唆するところのものは参照することにより 本願に包含される。この可溶性製剤のグルカン受容体に対する親和性を、それか グルカン受容体を競合的に占存しその結果サイモサン粒子の取り込みを阻害する 能力を測定することによって決定した。摂取の５０％の阻害を得るのに要する可 溶性グルカンの濃度を測定した。

表３は、可溶化修飾グルカン製剤およびその他の天然可溶性グルカンの受容体親 和性のデータをまとめたものである。

」ユ 単球グルカン受容体に対する可溶性グルカンの単球親和性におけるザイモサン摂 取の阻害大麦β−グルカン＋　６５　１ ラミナリン（藻類）’　３２　２ イースト抽出　３５　１９ グルカン 非修飾グルカン（Ａ３６４Ａ）　１　、　５　４３修飾グルカン（Ｒ４）　０． １　６５０１　Ｃｚｏｐ　ａｎｄ　Ａｕ５ｔｅｎ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉ ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ。

本発明の修飾グルカン組成物は、予防処置として手術、化学療法、あるいはその 他の患者を感染の危機に曝す現象の例えば７２時間前までに投与することができ る。修飾グルカン製剤は、上記現象の後に、栄養不良の患者の場合は例えば９６ 時間までの期間、化学療法の際に起きるような慢性免疫抑制状態にある個体に対 してはさらに長い期間にわたり投与してもよい。この処置により、患者の非特異 性および特異性宿主防御が修飾β−グルカン製剤によって刺激されて内在性奴介 物質（例えばＩ　Ｌ−ｉ　ＴＮＦ）が産生じそれらか一連の代謝現象を媒介する のであるが、その代謝現象としては抗原に応答する形でのリンパ球活性の賦活、 食作用におけるマクロファージ活性、コロニー刺激因子の放出、および単球と好 中球からのリゾチームとロイコトリエンの産生の増大が含まれる。

これらの代謝機能は、術後合併症に関連する二次的感染に対抗する際に、および 化学療法、放射線療法、腎不全、エイズ、およびその他の障害に関連する免疫応 答抑制状態を改善させる際に直接的に役に立つ。したがって、負傷していたり免 疫が損なわれていたりタンパク質栄養不良の患者は十分な体液性防御および細胞 性防御を行うことかでき、二次的感染に対する生存率が向上する。

修飾β−グルカンの投与はいくつかの理由によりＩＬ−１やコロニー刺激因子な とのサイトカインの直接的外部投与よりも有利である。サイトカインは主に組換 え遺伝子技術手法によって製造されるが、精製が困難で高くつき、著しい毒性と 悪い副作用をもたらす。修飾グルカン製剤の投与は、様々な細胞媒介物質の内因 性放出をバランスのとれた比率で刺激する。

本発明の方法において投与される組成物は、修飾β−グルカン以外の他の成分を 任意に含むことができる。特定の組成物に含まれる他の成分は、主にその組成物 の投与の仕方によって決定される。例えば、錠剤の形で経口的に投与される組成 物は、修飾β−グルカン以外にも充填剤（例えば乳糖）、結合剤（例えばカルボ キシメチルセルロース、アラビアガム、ゼラチン）、アジュバント、着香剤、着 色剤、およびコーチング剤（例えばワックスまたは可塑剤）を含むことができる 。液剤の形で投与される組成物は、全β−グルカン、および任意に乳化剤、着香 剤および／または着色剤を含むことができる。非経口投与用組成物は、水、滅菌 食塩水、ＰＢＳ、デキストロース、あるいはその他の生物学的に許容される担体 中に混合、溶解、または乳化することかできる。

修飾グルカン製剤の投与の経路は、経口、腸溶、非経口、静脈内、皮下、腹腔内 、筋肉内、局所、または鼻腔内とすることができる。組成物を投与する形感（例 えば粉末、錠剤、カプセル、溶液、乳液）はそれを投与する経路に依存するであ ろう。投与する組成物の量は個体ごとに決められ、少なくとも一部は患者内の感 染または傷害の程度、患者の状感あるいは全体的健康状懸、患者の体重および手 術前にある時間、化学療法またはその他の高リスク処置を考慮した上で決められ るであろう。一般に、単回投与では、体重１キログラムあたり約０．００１ない し約２００．００ｍｇの修飾グルカンを含有することが好ましいであろう。

一般に、本発明の組成物は、個体の免疫応答を刺激するために必要に応じて定期 的にその個体に投与することができる。医療分野に習熟した者であれば、患者の 健康状悪と処置対象の疾患や障害に応して組成物の投与期間と用皿を決めること ができるであろう。上記の通り、該組成物は、感染に対して生体が妄動化させる 正常な代謝防圓をあらかじめ開始させるための予防処置として用いてもよい。

免疫応答の向上をもたらす修飾グルカンを利用する本方法は、個体の免疫系を治 療的にあるいは予防的に妄動化させる上で特に有効である。

下記の実施例によって本発明をさらに詳しく説明するが、これら実施例はいかな る意味においても本発明を限定するものではない。

下記のグルカン製剤につき、ヒト単球における食作用を誘導する能力を試験した 。

（１）ザイモサン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｓｔ、 　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）−市販の酵母細胞壁製剤。

（２）アルカリ不溶性グルカンーマナーズ（Ｍａｎｎｅｒｓ　）らのら調製した もの。

（３）ＷＧＰ−Ａ３６４　Ａ−ジャ７ス（Ｊａｍａｓ　）らによって米国特許第 ４，８１０，６４６号て述へられている方法に従特許第４，８１０，６４６号お よび同時係属中の米国特許出願第０７／３３３，６３０号）から調製した全グル カン粒子これらの製剤を細胞に対する粒子の比約５ないし５０にそれぞれ対応す る５ｘｌＯ’／ｍｌないし６ｘｌＯ”／ｍ１（０，０１ｍｇ／ｍｌないし０．３ ｍｇ／ｍりのグルカン粒子濃度で付着性（ａｄｈｅｒｅｎ　ｔ　）ヒト単球とと もに３７°Ｃて保温した。少なくとも３００個の単球によって摂取されたグルカ ン粒子の数を１０００倍の光学顧微鏡を用いる直視観察によって測定した。図６ に示した結果は、細胞１個あたり３個以上（≧３）のグルカン粒子を摂取した単 球の百分率として表している。突然変異体系統Ｒ４由来の全グルカン粒子（ＷＰ Ｇ−Ｒ４）は、グルカンを摂取した単球の合計数および１つの単球集団あたり摂 取されたグルカン粒子の合計数の両方の点からみて食作用の刺激を強化した。

修飾グルカンによるマクロファージ分泌活性の刺激強化３ｍｇ／ｍｌヘキソース 当量のグルカン製剤とともに３７°Ｃで４５分間保温した際のヒト好中球につき 、炎症媒介物質ロイコトリエンＢ、（ＬＴＢ、）の産生を測定した。ＬＴＢ４産 生は、クシツブとオーステン（Ｃｚｏｐ　ａｎｄ　Ａｕ５ｔｅｎ　）の手順［Ｃ ｚｏｐ　ａｎｄ　Ａｕ５ｔｅｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、、　８２：２７５１−２７５５　（１９８５）　］に従い放射免疫測定（ ＲＩＡ）によって測定した。修飾グルカンＷＧＰ−Ｒ４は、他のいかなる供試グ ルカン製剤より著しく高いレベルのＬＴＢ４を誘導した。結果を図６に示す。

グルカン製剤ＷＧＰ−Ｒ４、およびパン酵母由来の粒子状製剤グルカニ／　−Ｐ 　（Ｇｌｕｃａｎ−Ｐ、　Ａｃｃｕｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　５ｃ ｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、　ＣＴ）に より活性化した際のヒト単球につき、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の発現を測定した 。精製単核細胞製剤から単離したヒト単球を５．１５、および５０μｇ／ｍｌの グルカン製剤とともに保温した。単球上清と細胞を３回凍結融解し、超音波処理 し、ミラー−グランＮＦを測定した。図７に示した結果はＴＮＦの合計産生量（ すなわち分泌されたＴＮＦと細胞関連ＴＮＦ）を示す。

図７に示したように、修飾グルカンＷＧＰ−Ｒ４は、ＴＮＦ産生によって測定し て単球を活性化する能力が大いに強化されている。

実施例３ 単球β−グルカン受容体に対する修飾グルカンの親和性グルカン分子が認識され 単球のβ−グルカン受容体に結合する能力はそれらの生物学的活性に不可欠であ る。突然変異体系統Ｒ４由来の修飾グルカン（ＷＧＰ−Ｒ４）は、パン酵母由来 の天然グルカンと比較して単球のグルカン受容体に対する親和性の増大を示した ［ジャヌス（Ｊａｎｕｓｚ）ら、Ｊ、　ｏｆＩｍｍｕｎｏｌ、、１３７：３２７ ０−３２７６　（１９８６）コ　。

ＷＧＰ−Ｒ４の水溶性修飾グルカン製剤を、本願と同時に出願され（代理人の事 件番号ＡＢＹ８９−０３）かつ参照として本願に含まれる同時係属中の米国特許 出願第号でジャマス（Ｊａｍａｓ　）らによって述べられているプロセスを用い て調製した。ヒト単球を様々な濃度の可溶性グルカンとともに１５分間保温し、 洗浄して未結合グルカンを除去した後、ザイモサンとともに３０分間保温した。

単層を固定および染色した後、ザイモサンを摂取した単球の百分率を決定した。

β−グルカン受容体に対するグルカン製剤の親和性を、それらが競合的に受容体 を占存することによって単球によるザイモサンの取り込みを阻害する能力に従っ て測定した。ザイモサン摂取の５０％阻害を得るのに要したグルカンの濃度を調 べることによって試料を比較した。

受容体に対する修飾グルカンＷＧＰ−Ｒ４の親和性が有意に強化されたことは、 ザイモサン摂取の５０％阻害を得るのに要した濃度が低かったことからみて明白 である。図８に示した結果は、修飾グルカンＷＣ；Ｐ−Ｒ４はパン酵母由来可溶 性グルカン（３，５μｇ／ｍ１）（ＹＥグルカン）よりはるかに高い親和性（０ ，１μｇ／ｍｌ）で単球β−グルカン受容体に結合することを証明しており、活 性が３５倍上昇したことを示す。

修飾グルカンのイン・ビボ投与が末梢血白血球（ＷＢＣ）数に及ぼす影響をマウ スで特徴づけた。Ｒ４系統由来の修飾グルカンの可溶性製剤を雄性ＣＤ−１マウ スに静脈内ＭＶ）および皮下（Ｓ　Ｃ）投与し、合計血球数および分画血球数（ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔｓ）を規則的時間間隔でモニ ターした。

特に単回ＩＶ投与後に合計ＷＢＣ数に大きな増加がみられた。図９と図１０に結 果をまとめたが、合計ＷＢＣ数の急速な（く６時間）増大があって、最も大きな 増加（＋２Ｘおよび６Ｘ）はそれぞれ単球数および顆粒球数で起きたことを示し ている。これは、ヒト単球上に高親和性β−グルカン受容体が存在することを示 唆するイン・ビトロのデータと一致する。頻回投与ＳＣ処方（図１０）は、４８ 時間目から始まって治療開始後１４４４４時間目−クに達した合計ＷＢＣの増加 を誘起した。合計数の増加は、この期間における末梢血単球集団の増加と一致し ていた。平均単球数は上口時間における３２０／ｍｍ’から１４４４４時間目約 ８０００／ｍｍ’まで２４倍の増加を示した。

免疫学的に無傷の宿主を腹部手術後によく起きるような重ＦｉｆＦｆ、染から保 護する上での修飾グルカンの有効性を特徴つけるために、マウスにおける敗血症 モデルを作成した。

モデルは、修飾グルカンのＩＶ投与２４時間後に、経胸腔的心臓穿刺を用いる単 回丸薬（ｓｉｎｇｌｅ　ｂｏｌｕｓ　１ｎｊｅｃｔｉｏｎ）によってＯ，１ｍｌ のＥ、　ｃｏｌｉ系統ＴＶＤＬ−ラット懸濁液（約１０’ＣＦＵ／ｍｌ）をマウ スに腹腔内抗原投与する方式を用いた。マウスをケージに戻し、飼料と水を自由 に（ａｄ　ｆｉｂｉｔｕｍ）摂取させた。１０匹のマウスから成る対照群には、 修飾グルカン投与時にＯ，１ｍｌの滅菌食塩水を注射した。処置群と食塩水対照 群について、抗原投与４８時間後の死亡率を記録した。図１１に示した結果は、 修飾グルカンは０６０１　ｍ　ｇ／マウス（０，５ｍｇ／ｋｇ体重）という低い 用」て食塩水対照群と比較して死亡率を有意に低下させた（ｐ＜０．０５）こと を示している。

修飾グルカンの造血効果の強化 致死的となる可能性のある放射線照射の２４時間府に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ ｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｒ４がら産生されたグルカン粒子（ＷＧＰ−Ｒ４ ）およびグルカン−Ｐ　（Ｇｌｕｃａｎ−Ｐ、　Ａｃｃｕｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ　ａｎｄ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をマウスに 単回ＩＶ投与（Ｓｒｎｇ）によって投与した。これらの条件下では、対照食塩水 を投与されたマウスは放射線で誘導された骨髄抑制に起因する感染性合併症で死 亡した。これらのグルカンが造血増殖と回復の刺激に及はした影響は平均膵臓重 量の増加に反映された。図１２は、修飾グルカンによってより高度の刺激か引き 起こされたことを示す。この作用は、グルカン−Ｐ群の生存率が７０％であった のに対して修飾グルカン（ＷＧＰ−Ｒ４）を投与された群は９０％の生存率であ ったことを示す図１３の３０日生存率データによって裏付けられる。

Ｒ４系統由来の修飾グルカンのもつ強化された刺激活性は、該修飾グルカンの可 溶性製剤でもみられた。＠Ｏｃｏ照射曝露前に単回ＴＶ注射（５ｍｇ／マウス） によりＲ４系統由来の可溶化修飾グルカンをマウスに投与した。内在性膵臓コロ ニー形成単位（Ｅ−ＣＦＵ）を計数することによって造血幹細胞の刺激と回復を 測定した。図１４に示した通り、修飾可溶性グルカンは既報［バッチエンとマツ クビルティー（Ｐａｔｃｈｅｎ　ａｎｄ　ＭａｃＶｉｌｔｉｅ　）　、ＪＢｉｏ ｔ、　Ｒｅ５ｐ、　Ｍｏｄｌ、　＋９８６　］の可可溶復製であるパン酵母由来 グルカン〜Ｆと比べて存意に高いレベルの造血細胞増殖をもたらした。

均等物 当業者は、通常の実験を用いるだけで、本願中に述べられている特定の材料およ び成分と同等である多くの物質を認識するか、または確認し得るであろう。この ような均等物は下記請求項の範囲に含まれるものとする。

区　１ 図　２ ’ｂ叡ノｍｌ　ｘ　１０Ｅ−７ 図　６ 屈＾、　ＵＱ／ｍ１ 口　８ Ｅベロロ に田囚図 遅叫肯体　０．０１　０．１　１　５ 重量、　ｒｒｙｍｏｕｓｅ 閃　１１ γ、し刀ン−Ｐ　ＷＧＰ−Ｒ４“１婢４１４に→こγし７］−／−Ｐ　ＷＧＰ− Ｒ４主づ髪４【１孔？トＩＤｇ 補正書の写しく翻訳文）提出ＩＦ（特許法第１８４条の８）平成４年り月８日１

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．個体の免疫応答を刺激するに十分な量の修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）β−グル カンを個体に投与することからなる、個体の免疫系応答の誘起方法。
2. ２．個体が負傷しているか、免疫が損なわれているか、あるいはタンパク質栄養 不良の状態にあるものである請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）β−グルカンが経口でまたは非経口で投与される ものである請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）グルカンの投与の態様が、静脈内投与、皮下投与 、筋肉内投与および腹腔内投与からなる群から選ばれる非経口の態様である請求 の範囲第３項記載の方法。
5. ５．　個体への修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）β−グルカンの投与量が、（ｉ）抗原 応答におけるリンパ球の活性、（ｉｉ）貧食作用におけるマクロファージ活性、 （ｉｉｉ）コロニー刺激因子の放出およびサイトカイン類の放出、（ｉｖ）単球 および好中球からのりゾチーム、ロイコトリエン産生、並びに、（Ｖ）多形核白 血球による貧食作用を刺激するのに十分なものである請求の範囲第１項記載の方 法。
6. ６．個体への修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）β−グルカンの投与量が、体重１キログ ラムあたり約０．００１ないし約２００ｍｇのβ−グルカンである請求の範囲第 ５項記載の方法。
7. ７．修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）β−グルカンが野性型グルカンに対しより高いβ （１−６）／β（１−３）結合比を有するものである請求の範囲第１項記載の方 法。
8. ８．修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）β−グルカンが０．４０より大きい分枝頻度を有 するものである請求の範囲第７項記載の方法。
9. ９．修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）β−グルカンが分枝あたり１以上のグルカン単位 を含有するものである請求の範囲第８項記載の方法。
10. １０．　修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）β−グルカンがＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの 系統（ｓｔｒａｉｎ）から由来するものである請求の範囲第１項記載の方法。
11. １１．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの系統（ｓｔｒａｉｎ）がＲ４（ＮＲＲＬＹ− １５９０３）系統である請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．感染に対する宿主防御の改善に十分な量の修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）β− グルカンを非経口投与することからなる、負傷しているか、免疫が損なわれてい るか、タンパク質栄養不良であるか、または老化している個体における免疫応答 の誘起方法。
13. １３．　修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）β−グルカンが滅菌液、注射剤、または静脈 内点滴として投与される請求の範囲第１２項記載の方法。
14. １４．個体の免疫応答を強化するのに十分な量の修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）β− グルカンを個体に非経口投与することからなる、二次的感染の危険性を有する個 体の二次的感染の防止方法。
15. １５．個体が切迫した手術に直面しているものである請求の範囲第１４項記載の 方法。
16. １６．個体が化学療法または放射線療法を受けているか、受けようとしているも のである請求の範囲第１４項記載の方法。
17. １７．個体が腎臓透析、腹膜透析または血液透析を受けているものである請求の 範囲第１４項記載の方法。
18. １８．個体が免疫の低下する疾患に罹患したものである請求の範囲第１４項記載 の方法。
19. １９．個体が免疫を損なわれているものである請求の範囲第１４項記載の方法。
20. ２０．個体がタンパク質栄養不良である請求の範囲第１４項記載の方法。