JPH05502590A - グラム陰性菌におけるクローニング・カートリッジおよび発現ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 グラム陰性菌におけるクローニング・カートリッジおよび発現ベクター 発明の背景 発現プラスミド・ベクターは、細菌細胞における遺伝子発現の研究には不可欠の 道具である。発現ベクターを開発する必要は、遺伝子発現を調べなければならな い、はとんど研究されていない１ＢＮ株おいて急である。上記細菌株に発現ベク ターを導入するには、少なくとも、二つの方法が考えられる。もし既知のものが あれば、天然のプラスミドを、発現ベクターに転換してもよいし、または、広範 なホスト範囲を有する発現ベクターを、上記細菌株に導入してもよい。はとんど 未研究の細菌株の天然プラスミドは、通常、その特徴があまり明らかにされてい ない。

調節的遺伝子発現に必須な遺伝子要素を、発現ベクターに変換するために、他の 供給源から導入しなければならない。、広範なホスト範囲を有する発現ベクター は、グラム陰性菌については、既にいくつか開発されている（総覧については、 下記を参照されたい。

Ｂａｇｄｘ＋ｉ＋ｉａｎ　＋ｔ　ｉｌ、、１９８３．　Ｇ＋ｎ＋　２６　：　２ ７３−２８２：　Ｍｅ＋ｚｏｄ　ｅ＋ｓｌ、、１９８６＋、Ｉａ：　５ｏｋｘｔ ｃｈ、１．Ｒ，１ｎｄ　Ｏ＋ｎ＋ｔａｎ、Ｌ、Ｎ、。

及びＳｃｈｍｉｄｈ！＋＋ｅ＋　Ｉｌ　Ｉｌ、、１９＋１８．　Ｙ＋ｅｌｏ＋＋ ：　Ａ　Ｓｕ＋ｙｅ７　ｏ！Ｍｏｌ＋＋ａｌ＋＋　ＣＩｏｎｉｎｇ　Ｖ＋ｃｌｏ ＋＋　ｓａｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ｕｓｔ＋　（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｒ　＆Ｄｅ＋ｂｔ＋ ｄ＋、　＋ｄ＋、）、Ｂ１１Ｎ！＋ｖｏ＋ｔｂ、　Ｂｏｔｔｏｎ、　ｐｐ、　２ ８７−３３２）　ｏしかしながら、上記ベクター（Ｂｔｇｄｘ＋ｚｒｉｔｎ　＋ ｔ　！１．．　１９８３．　Ｇｓｎｃ２６：　２７３−２ｇ２；　Ｍ＋＋ｍｏｄ 　ｅｔ　！＋、、１９８６ｂ、Ｉ、Ｂｓｃｔｔ＋ｉｏ１．　１６ユ４４７−４５ ４；　Ｆ＋ｚ＋＋＋　Ｉｌ　Ｉｌ、、１９１１６．　Ｇｅ＋ｕ　４８：　１１９ −１３１）の内のほんの一部でのみ、すべての種類の調節的遺伝子の発現が可能 である。

ＮＡＨ７ブラスミドの担持するナフタレン異化遺伝子の調節については、よく調 べられている（総覧については・Ｙｅｎ　ａｎｄＳｒｔｄｓｔ、１９８８、ＣＲ ＣＣ：ｉｔ、Ｒ＋＋、Ｍｉｃ＋＊ｂｉｏ１．、　１５：　２４７−２５８を参照 されたい）。このＮＡＨ７ブラスミドは、Ｐｌ＋ｕｄｏ！１ｌｏｎｉ＋ｐｕｔｉ ｄｉ　ｆＰ、ｐｏｌｉｄｘ　）　Ｇ７　株　（＾ＴＣＣ１，７Ｈ５）の、天然プ ラスミドである。これは、ナフタレンを分解して、クレブス・サイクルの中間代 謝産物に変える異化遺伝子を持っている。この遺伝子は、２個のオペロンで構成 される。東１のオペロンは、ナフタレンをサリチル酸に変換する酵素をコードし ており（上方経路）、稟２のオペロンは、サリチル酸を、アセチルアルデヒドと ピルビン酸に酸化する酵素をコードする（下方経路）。両オペロンは、誘導物質 であるサリチル酸またはその類似体のあるリチル酸ヒドロキシラーゼをコードす る（第１図）。この２個の遺伝子、ｎ＋ｈＲと　ｎ５ｈＧは、逆方向に転写され 、また、そのプロモーターＰ　及びＰＧは、配列を共有する。ＰＧは、Ｎ＊ｈＲ 蛋白質の正の調節の作用を受けるが、ＰＲは、ＮｇｈＲ蛋白質の合成を構成的に １令する。ｎｚｈＲ，ＰＲおよびＢ６のヌクレオチド配列は、すでに、皆決定さ れている（　Ｓｃｈ＋　ｌ　１．　１９ｇ６．　Ｉ。

れるよう、ｎ＋ｈＲ−Ｐ６Ｍ′Ｂ系に基づく細［ＤＮＡ発現単位が示唆されたり 、あるいは、調製されたりということはなかった。

調節され、かつ、効率的な遺伝子発現を可能にする、使用するにももっと便利な 、広範なまたは、狭いホスト範囲を有する新規のベクターは、いまだ開発の必要 がある。遺伝子クローニング、選択、発現に必須な全ての要素を担持するＤＮＡ 制限フラグメントの構築は、発現ベクターの開発を容易なものにするであろう。

そのようなりローニング・カートリッジは、もし構築することができたならば、 次にそれを、広範なまたは狭いホスト範囲を有するレプリコンに挿入して、それ を、発現ベクターに変換することができる。ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＧＢ８９１０ ０３４＋　（公表番号７０８９１０９８２３．　１０−１９−８９　）は、細菌 発現ベクター用の、ＴＯＬプラスミドから得た、ＢＩＲ由来の調節カセットにつ いて記載している。このカセットは、その遺伝子産物ＸｙｌＨの結合部位と、そ れに関連するプロモーター（Ｐ）を含むｘ７１Ｒ遺伝子しか含んでいない。この ｘｙｌＲ／Ｐ　カセットは、レプリコン同士の間を簡単には移送できない。なぜ なら、カセットには選択的マーカーがないからである。さらに、（ｉ）転写ター ミネータ−がないこと、（ｉｉ）クローニング部位が乏しいこと、（ｉ　ｉ　ｉ ）最適な発現を得るよう、外来遺伝子を正確に挿入できるように、プロモーター を処理することができないことがある。特に、（ｉ　］ｉｉに関しては、開始コ ドンをコードするＡＴＧ配列を含むように改変した制限部位がなく、また、プロ モーター領域を、クローン部位から隔てている、〜［，５ｋｂの特徴不明のＤＮ Ａがあるようである（Ｋ＋ｉｌ　ｅｔ　ｉｌ、、Ｉ。

これはおそらく、クローン遺伝子の発現を低下させることになろう。ｕｌＲ／Ｐ 　カセットの調節には、有毒な化学的誘導物質、例えば、トルエンの使用が必要 である。！ＴＩＲ／Ｐ　カセットを用□　Ｕ いた構築体もいくつか述べられているが、そのような構築体の有用性を決定つけ るほどの発現データは発表されていない。したがって、ＰＣＴ／ＧＢ８９／　０ ０３４１に記載されているカセットおよびベクターを含め、これまでに記載され た発現単位の欠陥を修正した新規のクローニングカートリッジおよび発現ベクタ ーを、開発することにたいしては要求がある。

発明の概要 本発明においては、クローニング・カートリッジおよびその誘導体は、Ｎ＋１ｌ ＲＸ１節性遺伝子発現系に基づいて構築され、好結果を収めた。この２種のカー トリッジ（カセットとも呼ぶ）を、広範なホスト範囲を有するプラスミドｐＫＴ ２３１　（８Ｂｄ＋＋ｇｔｉ！ｎｅＬ＊１．　１９８１．　Ｇｅｎｔ　１６：　 ２３７−２４７］　の誘導体上で各種細菌ホストにおいて遺伝子クローニングお よび発現に用いることができるかどうかをテストした。このカートリッジの一つ を担持するプラスミド・ベクターは、現在までにテストしたグラム陰性菌の全て において、いくつかのテスト遺伝子のクローニングおよび誘導可能な発現を可能 にした。クローンされた遺伝子から、高濃変の蛋白質が生産されることも証明さ れた。クローニング・カートリッジに集合したＤＮＡ要素は、グラム陰性菌の遺 伝子のクローニングと発現において、従来得られなかった便利と効率を与える。

さらに、本発明によるクローニング・カートリッジは、〜３．６ｋｂ制限フラグ メントに含まれるものであるが、これによって、各種グラム陰性菌において、効 率的な（例えば、一段階の）発現ベクターの構築が可能になった。

本発明は、クローニング・カートリッジないしカセットに向けられたものであり 、このカートリッジは、ＮａｈＬＩ節発現系に基づき、効率的な遺伝子クローニ ングおよび発現に必須の５要素を含む。本発明によるクローニング・カートリッ ジを構成する五つの要素とは、薬剤耐性をコードする遺伝子、１Ｍ遺伝子、誌■ 遺伝子産物によって調節されるプロモーターＰ６、マルチプルクローニング部位 、および、転写ターミネータ−である。

有用な薬剤耐性遺伝子は、ｐＢＲ３２２プラスミドから得たテトラサイクリン耐 性をコードする遺伝子（（＋＋＋Ｊである。このクロー換えられた。この配列置 換は、本カートリッジの二　のための新規のハイブリッド・プロモーターを生じ 、選択がない場合でも、本発明によるクローニング・カートリッジを担持するプ ラスミドを安定化させる働きを持っていた。本クローニング・カートリッジにお ける　ａ＋ｈＲ遺伝子は、Ｐ、ｐＨｔｉｄａに天然に見られる　ＮＡＨ７プラス ミドから得られる。このものは、蛋白質、ＬｂＲをコードし、この蛋白質は、ナ フタレン分解のための下方経路オペロンのプロモーターＰＧの正の調節をする。

プロモーターＰ６は、ＮａｈＲ蛋白質および、無害で、安価な誘導物質であるサ リチル酸ナトリウムの低濃度（０，３５１１Ｍ以下）の存在下に活性化される。

クローニング・カートリッジのプロモーターＰｃの内部においては、開始コドン をコードするＡＴＧ配列上流の３個のヌクレオチドの配列を変更し、Ｎｄ＋ｌク ローニング部位を形成した。この部位に、さらに、数個の他のクローニング部位 が続く。それらは、順に、５’−ｔｉｐリー　−Ｃ１＋ｆ　−ＸｂｔＩ　−■ｎ Ｉ　−Ｓｘ＋Ｉ　−Ｋｈｏｌ　−３’である。特徴付けされた（ｃｂ＋＋ｘｅｔ ＋＋１ｔｅｄ）遺伝子の５′末端は、コード内容を変えずに、匹［部位に変換す ることができるから、本カートリッジの中に、調節発現のためにクローンできる 。プラスミドｐｃＦＭ１１４６から得た転写ターミネータ−は、ＰＧのマルチプ ルクローニング部位のすぐ下流に置いた。

本発明による、新規の、５要素でポータプルなりローニング・カートリッジは、 〜３．６　ｋｂ　ＥｅｏＲｌ−Ｐｓｌｌ　フラグメントとして集合し、各種の異 なるレプリコンの中に簡単に挿入することができる。このようなりローニング・ カートリッジは、広いかまたは狭いホスト範囲のレプリコンの中に挿入されると 、それを、発現ベクターに変換する。したがって、本発明はまた、本クローニン グ・カートリッジを含む、広いないし狭いホスト範囲のプラスミド・ベクターに も向けられる。特に好ましい態様として、広範なホスト範囲を有する発現ベクタ ーｐＫ１１７２９９がある。

これは、プラスミドｐＫＭＹ２８６の　ＥｃｏＲｉ−Ｐｓｌｌ　フラグメントを 、〜３．６　ｋｂ　ＥｃｏＲｌ−ＰｓｆＥ　クローニング・カートリッジで置換 することによって構築されるものである。特に、プラスミドｐＫＭＹ２Ｊ’９９ 　、その５゛末端に、二Ｉ認識配列（、ＣＡＴＡＴＧ）を含む、または、含むよ うに処理された遺伝子のクローニングおよび発現のために厳密に設計された。未 知の配列の遺伝子を担持する制限フラグメントのクローニングおよび発現のため に、ｐＫＭＹ２９９内のクローニング・カートリッジは、マルチプルクローニン グ部位内部の開始コドンＡＵＧをコードする配列を除去して改変した。ｐＫＭＹ ２９９からのこの誘導体は１．ＫＭＹ３＋９　と名付けられたが、これは、改変 クローニング・カートリッジを含む。

この配列除去は、遺伝子発現において、ｐＫＭＹ３１］におけるＰＧプロモータ ーからの、誤りの翻訳開始を防ぐ。

本発明のクローニング・カートリッジを含む発現ベクターの産物を簡単に検定で きる、各種起源の遺伝子を、ｐＫＩＪＹ２９９ないし　ｐＫＭ７３１９の発現ベ クター内にクローンした。調節された（例えば、誘導可能な）遺伝子発現が、種 々のグラム陰性ホスト細胞で観察され−た。ある種の遺伝子産物の過剰生産も証 明された。

図の簡単な説明 第１図は、ａｚｈＲ遺伝子と、四遺伝子の一部を含む、プラスミド１ｌＡＩＩ７ の領域から得た、〜Ｌ、７　ｋｂ　ＷｉｎよＩＩＩ　／■瓜　フラグメントの制 限マツプを示す。ＰＲ，Ｐ、は、それぞれｏ＋ｈＲ。

■ｂＧのプロモーターであり、矢印は転写方向を示す。

第２図は、本発明のクローニング・カートリッジを構築する場合の最初の手順（ プラスミドｐＫ１１Ｙ２５６から　９ＫＭＹ２９２）を示す。

第３図は、プラスミドｐＫＩＪＹ２９７　にクローニング・カートリッジを構築 するまでに至るその後の手順（プラスミドｐＫｌｉＹ２９２から　９ＫＭＹ２９ ７）を示す。

第４図は、ｐＫＭ７２９９発現ベクターから、発現ベクターｐＫＭＹ３１９を得 るところを示す。

第５図は、発現ベクター　、Ｋ１１Ｙ２９９および９ＫＭＹ３１９から得られた 蛋白質産物の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。これらのベクターは、Ｐ＋ｅｏｄｏ ＩＩｏｎａ＋　ｐｕｔｉｄ＋　Ｇ５フ２に挿入された本発明のクローニング・カ ートリッジおよび改変手会クローニング・カートリッジを含む。誘導および非誘 導条件下における、ホタルルンフニラーゼの発現が、それぞれ、レーン２．８と ３．９に示される。誘導および非誘導条件下におけるカテコール２．３ジオキシ ゲナーゼの発現が、それぞれ、レーン４．６と５．７に示される。

詳細な説明 本発明によるクローニング・カートリッジは、Ｎ＋ｂＲ頂頭発現系に基づく、効 率的な遺伝子クローニングおよび発現にとって必須の５要素を含むように設計さ れている。便利でポータプルなカートリッジまたはカセットのこれらの５要素は 、薬剤耐ターに簡単に挿入することができる。高頻度切断制限酵素Ｒ＋＋ｌ　に たいする認識部位は、ｎｘｈＧコード領域より上流の３塩基対にある（第１図） 。本クローニング・カートリッジ構築の最初の手順は、このＲ＋＋１部位を、５ ｃｘｌ制限部位に変換することであって、この部位は、マルチプルクローニング 部位を挿入し、Ｅ、Ｃｏ±ニブラスミド　ｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａ＋　ｅｌ 　！１．．　＋９７７゜ＧＥ口ｃ２：　９５−１１３）の　ｌｅｔ　遺伝子を、 ＰＲ領領域隣に配置するのに便利である。

ており、ここに引用することによって、その全体をここに含遺伝子、Ｒ６および 匣遺伝子の〜２０Ｇ塩基対（ｂｐ）を含む〜５．３　ｋｂ　Ｐ＋ｔｌ挿入体を担 持する。ｐＫＭＹ２５６　ＤＮＡを、酵素ユＮｌおよび゛」島１で消化し、自己 連結させると、　ＰＲ”Ｇを含む〜４００　ｂｐ　５ｌｌｌ−？ｔｌが、ｐＵｃ ｌ目ニクローンされる。得られたプラスミドを１．ＫＭＹ２８８と名付けた（第 ２図）。

ｐＫＭｙ２８８においては、プロモーターＰ　およびＰＧｌよ、〜２００ｂｐ　 ５ｘｌｉ−？＋ｌ　フラグメントにある（東２図）。このフラグメれ、Ｐ　にお ける　Ｒ１１１部位は、コ１部位に変換される（第２図〕。新たに形成されたプ ラスミドを、ｐＫ［Ｙ２８９　と名付けた（第２図）。

＋＋！’遺伝子を、ＰＲの隣に置くために、ＰＲおよびＲ６を担持する、ｐＫＭ Ｙ２８９の〜１７０　ｂｐ」ｇｌｌｉ−箪［フラグメントを用い、トランスポゾ ンＴａ５（Ｓ＋＋ｇｋａｖｔ　＋ｔ　ｈｌ、、１９８２．　ＰＴＯＣ。

Ｎ１ｔ１．　Ａｃｚｄ、Ｓｅｉ、ＵＳＡ　７９：？４５０−７４５４）のコピー を担持する、ｐ８１１３２２中の〜４．４　ｋｂ　Ｂｇｌｌｌ−鉦！、■　フラ グメントを置換した（蔦２図）。得られたプラスミドを、ｐＫｉｌＹ２９＋　と 名付けた（罵２図〕。ｐＫ１１Ｙ２９２　と名付けた、ｐＫＭＹ２９＋の誘導体 は、■見向のＨｉｎｄｌｌｌ　１１１位と、二「遺伝子のプロモーター内のＨｉ ｎｄｌ１１部位の間に介在する配列を除去することによって構築した（第２図） 。この手順により、　ｔｅｔ’遺伝子は、ＰＲのすぐ下流に配置された。

次の手順において、マルチプルクローニング部位が、ＰＧ内に新たに形成された 二１部位に挿入され、転写ターミネータ−が、クローニング部位の末端に挿入さ れた。大部分の細菌遺伝子においては、ヌクレオチド配列ＡＴＧが、開始コドン を特定する。このトリヌクレオチドと、それに先立つ配列は、部位特異的突然変 異により、遺伝子のコード特性に影響を与えずに制限エンドヌクレアーゼＮｄ＋ Ｉ　（ＣＡＴＡ丁Ｇ）の認識部位に変換することができる。このようにして修飾 された遺伝子を受け入れるために、Ｉｌｄ＋　１部位を同様に、プロモーターと 、遺伝子コード領域の５゛末端との接合部で発現ベクター内に形成する。他の制 限部位を、クローンされた遺伝子の３′末端を容れるため、口ｅ１部位の下流に 導入してもよい。そのような発現系では、転写開始部位と、遺伝子コード領域の 間の距離は、クローンされる遺伝子によらず、不変である。プロモーターＰ２を 修飾し、３゛末端にＮｄｓ　ｌ制限部位を、さらにその後にその他のクローニン グ部位をいくつか含むようにした。

下記の配列を含むオリゴヌクレオチドを合成し、ｐＫＭＹ２９２のこの配列を挿 入することによって、二（部位は、Ｐｏに天然に見られる　Ｒ１１１部位に変換 され、Ｒ＋ｘ１部位とコード領域間の距離は回復し、Ｐ、配列の３′末端に　Ｎ ｄ＋ｌ　クローニング部位が生成し、Ｎｄ＋１部位のすぐ下流に、その他のクロ ーニング部位がいくつか置かれるようになった。得られたプラスミドを、ｐＫＭ Ｙ２９３と名付けた（第３図）。

Ｅ、＋ｏｌｉプラスミドｐｃＦＪｌ　１４６については、ともに係属中で、共通 に譲渡されたアメリカ特許出願第−−号、１９９０年９月−日出願に記載されて おり、引用することによって、その全部をここに含めることにするが、このもの は、他の系に簡単に取り込むことのできる転写ターミネータ−を担持している。

転写ターミネータ−の、その他の供給源は、共通に譲渡されたアメリカ特許出願 第４．７１０．４７３号に記載されており、引用することによって、ここに含め ることにする。転写ターミネータ−の下流には、酵素１［；［にたいする制限部 位があり、転写ターミネータ−のすぐ上流には、マルチプルクローニング部位が あり、その中には、Ｅ＋ｏＲ１部位、Ｘｈｏ１部位、その他、いくつかの制限部 位が含まれる（第３図）。ｐｃＦ１ｉ１１４６の転写ターミネータ−は、ｐＫＭ Ｙ２９３のマルチプルクローニング部位のすぐ下流に、２段階を経て、置かれる 。　ｔｉｔ　遺伝子、Ｐ、Ｐ、マルチブＧ ルクローニング部位を担持する、ｐＫＭＹ２９３のＢ＋ｐＭＩＩ−？ｔｌ　フラ グメントを、先ず、プラスミド　ｐ［Ｉｃ９　（Ｙｉ＋ｉ＋＋　ａ口ｄ　Ｍｃ＋ ＋ｉＢ。

３図）。得られたプラスミドを、ｐＫＭＹ２９４と名付けた（第３図）。次の段 階では、ｐＫＭＹ２９４の　Ｅ＋ｏＲ１−１ｂユＩフラグメントを、ｐｃＦＭｌ １４６の立Ｒ［および皿（部位にクローンし、　ＰＧのマルチプルクローニング 部位のすぐ下流に転写ターミネータ−を置いた（第３図）。得られたプラスミド を、ｐＫＭ７２９５と名付けた（第３図）。

残りの手順を経ることによって、転写ターミネータ−の下流に、ユニーク（ａｎ ｉｑａ＋）なりローニング部位が得られ、凹遺伝子が回復した。ｐＫＭＹ２９５ においては、転写ターミネータ−の下流の　Ｂｇｌｌ！部位は、本クローニング ・カートリッジでユニークな制限部位と交換する必要があった。これは、カート リッジを、レプリコン間に移送する都合からである。この目的を達するたて切断 し、その後、末端充填、プラント末端連結を行なって、構築した（第３図）。工 （遺伝子、Ｐ、Ｐ、マルチプルＧ ２９５の」三Ｒ１−Ｂｇｔ　ｉｆ　フラグメントを、ｐ４ＭＹ５１３の二ＲＩお よびＢ＋ｍＨ１部位にクローンし、Ｌ１２［部位を除去し、破壊されたＢｇｌ１ １部位の隣に、ユニークな　ｐ＋ｔ１部位を取り込んだ（第３図）。得られたプ ラスミドを９ＫＭＹ２９６と名付けた（第３図）。

ｐＫＭＹ２９６において、狂■内部の）ｌｉｎｄｌｌ１ｇ位から下流の、ｎｘｈ Ｒ遺伝子部分は、依然として欠けている。凹遺伝子の正確かつ、便利な集合を確 保するために、ｐＫＭＹ５Ｌ２　と名付けるインジケーター・プラスミドを構築 した。これは、ナフタレン・ジオキシゲナーゼ遺伝子クラスター、および、プラ スミドＮＡＨ７由来の、ＮａｈＲ調節性プロモーターを含む。誘導物質であるサ リチル酸ナトリウムと、ＮａｈＲ蛋白質の存在下で、ｐＫＭＹ５１２のナフタレ ン・ジオキシゲナーゼ遺伝子は働き出すことができ、これが、次に、Ｅ、ｃｏｌ ｉ　においてインディゴ染料の形成を触媒する（Ｅｎｓｌ＋７　＋）　ｉｔ、、 １９８３．　５ｃｉｅｎｃｅ　２２２：　１６７−１６９　）　ｏ　プラスミド ｐＮ４００は、ナフタレン・ジオキシゲナーゼ遺伝子を含むプラフラグメントを 、プラスミド　ｐ［ｌｃｌｇ　（Ｙｔｎｉ＋ｃｈ−Ｐ＋＋ｒｏｎ　ｅｌ　＊１． 。

１１８５、上記）の」見１および−ＢａｍＨ１部位にクローンすることによって 構築される。プラスミド　ｐＫ！ＩＩＹ２３９は、ナフタレン・ジオキシゲナー ゼ遺伝子を含むｐｌ＋４００の〜６．４　ｋｂ　Ｓ旦１　フラグメントを、広範 なホスト範囲を有するプラスミドｐＫＭＹ２２３のＳ＋ｃ１部位に挿入すること によって構築した。プラスミドｐＫＭＹ２２３は、共に係属中の、共通に譲渡さ れたアメリカ特許出願第−−号、って、その全体をここに含めることにする。凹 遺伝子の一部と、ｐＫＭＹ５＋２が得られた。ｔ［１ｎｄｌ１１部位より下流の 　ｎ＋ｈＲ部分を担持する、ｐＫＭＴ２Ｎの〜１．ｉｋｂ［Ｉワーｄｌ１１フラ グメント（′Ｍ２図）を、ｐＫＭＹ２９６の−Ｌす、ｄｌ１１部位に挿入し、ク ローニング。

カートリッジの構築を完了した（第３図）。この段階で、ｐＫＭＹ５１２を有す る（匡工細胞に、サリチル酸ナトリウムの存在下で、インディゴを生産する能力 があるか否かで、所期のプラスミドを選択した。このプラスミドを、ｐＫＶＹ２ ９７　と名付けた（第３図）。このようにして、１）ＨＩＹ２９７においては、 ｌｅｔ’遺伝子、ｎａｈＲ，Ｐｃ　、　マルチプルクローニング部位および転写 ターミネータ−を含む、〜３．６ｋｂεｃｃＲ１−Ｐ＋ｔｌ　フラグメントが、 クローニング・カートリッジとして、成功裡に集合された。

ｐＫＭＹ２９７の〜３．６ｋｂ−卦ユＲ１−ユニＩフラグメントが、様々のホス トにおいてクローニング・カートリッジとして使用できるかどうかをテストする ために、このプラスミドを、広範ホスト範囲を有すルブラスミドＲ３ＦＩＯＩＯ （Ｓｃｈｏｌ＋　Ｎ　Ｉｌ、、１．９Ｎ。

Ｇｅａｅ　７５：　２７１−２Ｈ１から得たレプリコンの中に挿入した。プラス ミドＰＫＴ２３＋　は、Ｒ３ＦＩＯＩＯｉＢ＋ｇｄ＋＋ｔ＋ｉａｎ　！＋　ａｌ 、、１９８１．上記）の誘導体であり、Ｒ９ＦＩＯＩＯレプリコンの供給源とな った。ｐＫＴれているが、両方とも、クローニング・カートリッジのポリリンカ ー中にある。この両部位を、ｐＫＴ２３１から、プラスミドＤＩＩＡを、Ｈｐａ ｌおよび」旦［で消化し、次に、Ｅ、　ｅｏｌｉ　［ｌＮ＾ポリポリーゼＩのＫ １１ｏｖフラグメントで処理して平滑端を形成させ、自己連結させて除去した。

得られたプラスミドは、ｐＫ＆１ＹＨ６と名付けた。広範ホスト範囲を有する発 現ベクターｐＫＭＹ２９９は、ｐＫｉｌＹ２８６中の一トユＲ１−−こり、１フ ラグメントを、３．６ｋｂ±ｏＲ１−」具１クローニング・カートリッジで置換 して得た（東４図）。

ρＫＭＹ２９９においては、Ｐａとマルチプルクローニング部位の間の接合部、 およびクローニング・カートリッジとＲ３Ｆｌ［ｉｌＧレプリコンの間の」旦１ 接合部の、予想されるヌクレオチド配列は、Ｄ　Ｎ　Ａ配列分析により完全に確 認された。Ｎｄｃ　ｌの上流部の、Ｐ、の　７９　ｂｐ、および、この部の下流 １５８　ｂｐの配列も決定された。配列データから明らかになったのは、予想通 り、合成ポリリンカーの５゛末端は、Ｐｃの３°末端に近接するンカー配列は１ ．ＣＦＭ１１４６配列で置き換えられていること、であった（第３図）。Ｐｃよ りも下流には、７個のユニーク制限部位があり、その中には、Ｎｄｇｌがあり、 次に、」」Ｉ、−リｚｌ。

皿１．　Ｋｐｎｌ、Ｓ旦！１−リ」［部位が続く。この制限部位は、５゛・カー トリッジの　５４　ｈｐ　、および、この配列の下列から、クローニング・カー トリッジのＰＳｔｌ末端は、予想通り、ヌクレオチド７７６８　（Ｓｅｈｏｌ＋ 　ｅｌ　ｉｌ、、１９８９．上記）で始まるｇｓＮＨＯＤＮＡの、対応する　Ｐ ｔｔ１部位に連結したことが判明した。

ＥｃｏＲ’ｌ認識配列上流の、ｌｌ５ＦＩＯＩＯレプリコンの３０３　ｂｐおよ び、その配列より下流のクローニング・カートリッジの　３６塩基対について同 様の分析を行なうと、予想通り次のことが判明した。すなわち、クローニング・ カートリッジの　Ｅ（ＯＲ＋末端は、ヌクレオチ！”８６Ｔ６　（Ｓｈｏｌ＋　 ｒｔ　ｘｉ、、１９Ｎ、上記）で始まるＲ５ＦＩＱＩＱ　０１１人の、対応する 　Ｅ（ＯＲ１部位に連結していた。一方、同様の分析によって、Ｒ３ＦＩＯＩＯ ＤＮＡのヌクレオチド１から１６５３までの配列は（Ｓｈｏｏｔ　Ｎ　＋１．、 　１９８９．　上記）　、ｐＫＭＹ２９９においては完全に取り除かれているこ とが分かった。この除去された領域には、ストレプトマイシン耐性を決める、Ｉ ｌｒ＾遺伝子全部、および、匣遺伝子の大部分が含、まれでいた（Ｓｅｈｏｌ＋ 　！＋　１１．、＋９８．９．上記）　。ｐＫＭＹ２８６およびｐＫＴ２３１　 ＤＮＡのｌ１ｌｌｌｕパターンから、この除去は、ここに記載するように、用い たプラスミドｐＫＴ２３１に起こったことが示唆された。各種制限酵素を用いて 、ｐＫＭＹ２８６およびｐＫＭＹ２９９をさらに分析してみても、ｐＫＭＹ２９ ９にはそれ以外の異常は検出されなかった。したがって、プラスミドｐＫ１１Ｙ ２９９は、ヌクレオチドｌ−１６５３を取り除カレ、ヌクＬ、オーｊ−Ｆ　７７ ６８−Ｈ２Ｓを、３．５ｋｂクローニング・カートリッジで置換された、　−パ Ｒ３ＦＩＯＩＯと考えることもできる。

プラスミドｐｉｌ：ＭＹ２９ｇは、５゛末端に四１認織配列を含む、または、含 むように処理された遺伝子の、正確なりローニング、調節された発現を意図して 設計された。未知配列の遺伝子を担持する＃隈フラグメントのクローニングおよ び発現のために、ｐＫＭＹ２９９のクローニング・カートリッジに改変を施した 。ｐｘｉｔｙ２９９のＮｄ＋Ｉ認識配列内部の配列ＡＴＧを、Ｐｃからの遺伝子 発現において、誤りの翻訳開始の起こるのを防止するために取り除いた。これは 、ｐＫｉｌＹ２９９　ＤＮＡを、旦１および」ｌによって消化し、次に、ヤニナ リ（ＬＢ　Ｂｅ１ａ）　ヌクレアーゼで処理し、オーバーハングを除去し、残り のプラスミドＤＮＡを自己連結させて行なった。得られたプラスミドは、ｐＫ１ １Ｙ３１９　と名付けた（第４図）。配列分析から、、ＫＭＹ３１９に残存する ５個のり除去されが、それに加えて、ヤエナリヌクレアーゼは、予想外にも、別 のｓｂｐを除去したことが判明した。ｐＫＭＹ１９の結合部位付近における、予 想配列と、現実に観察された配列を示すと次のようになる。

Ｃ［１す るコード領域を示す（Ｓｈｉｎｅ　＋ｎｄ　Ｄｅｌｇａｒｏｏ、１９７５、Ｎａ ｔｕ＋＋２５４、３４−３８　）。リポソーム結合部位をコードする重要塩基の 内の一つが、ｐＫＭＹ３１９では取り除かれている。このリポソーム結合部位の 破壊は、未知配列遺伝子を含むクローン・フラグメントの発現にｌｌＫＭＹ３１ ９を使用するに当り、有利に作用するかもしれない。５ｈｉＱ＋−Ｄ＋ｌｚ＋ｃ ｏ配列は、通常、遺伝子から、はんの数ｂｐ上流にあり、大抵は、その遺伝子と 共に、フラグメント上にクローンされる。この発現ベクターによってコードされ る、第２のリポソーム結合部位が作用して、発現を抑えるかもしれない（Ｓｃｈ ｒａｄｈｔ　＋ｎｄ　ＭｃＣａｒｔ）＋ｙ、１９８９．　Ｇｅ１Ｉｅ　７８：　 ５９−７２　）。

発現ベクターとしての、ｐＫＭＹ２９９およびｐＫＭＹ３１９の使用を評価する ために、その産物を簡単にアッセイできる、各種起源の遺伝子を、このプラスミ ドにクローンし、その発現をテストした。Ｐｈｏｌｉｎｕｉ　ｐｙ「＋ｌｉ＋　 （ホタル）　ｃＤＮ人とゲノム・クローン（ｄｅＷｕ　Ｎ　１１．、ｉ９ｇ？、 １ｌｏ１．　Ｃａ１１．　Ｂｉｏｌ、、７：７２５−７３７）から構築した、イ ントロン非含有ルンフエラーゼ遺伝子を再構築し、そ母子の発現は、両組み換え ホスト細胞における誘導物質としてのサリチル酸ナトリウムの有無に基づいて分 析した。ルシフェラーゼ活性は、この酵素によって触媒される反応で発生した光 を測定して、定量した。Ｐ、ｐａｌｉｄｘにおけるリシフエラーゼ蛋白質の生産 はまた、粗抽出物について、ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（５ＯＳ −ＰＡＧＥ）を行なって分析した。ｐＫＭＹ５２Ｇを担持する非誘導組み換え土 ｐｕｊｉｄｉ細胞のルシフェラーゼ生産は、ＳＤＳゲル上でやっと認められる程 度のものであった（第５図）。しかしながら、高感度のルシフェラーゼアッセイ （ｄ＋　Ｗｅｔ　＋ｔ　ｔｌ、、１９８７．上記）によって、ｐＫＭＹ５２０を 担持する非誘導組み換え±ｐｏｌｉｄｔおよび±ｃｏｌｉ　ホスト細胞から、比 較的高い酵素活性を検出することができた（第１ｆ表）。同じアッセイ法で調べ ると、組み換え　Ｐ、ｐｏｌｉｄｉホスト細胞では、ルシフェラーゼ活性が、約 ９０倍誘導され（第１Ｉ表）、組み一ゼの量は、全可溶性蛋白質の約３７％を占 めていた（第５図）。上記の結果は、９に１ｉＹ２９９由来の真核遺伝子の調節 的発現が、二つの、異なるグラム陰性菌で行なわれたことを示す。

発現ベクターとしてのｐＫｉｌＹ３１９の使用をテストするために、ＰＩｅａｄ ｏａｏ５ｇ＋　１ｅａｄｏｃｉ＋＋＋　ＫＲＩからの、トルエン・モノオキシゲ ナーゼ（ＴＭＯ）遺伝子クラスター　ｔｍｏＡＢｃＤεＦ１　または、プラスミ ド！１ＡＨ７（総覧については、Ｙｅｎ　＋ｎｄ　５ｅｔｄａｔ、１９８Ｂ、上 記を参照されたし）からの、カテコール２．３−ジオキシゲナーゼ遺伝子を担持 する制限フラグメントを、それぞれ、ｐＫ！、１Ｙ３１９にクローンし、それぞ れから、ｐＫｉｉＹ３４２およびｐＫｉｉＹ５１７を得た。

＋１ＩＯＡＢＣＤεＦ遺伝子クラスターは、共１ｎに係属中で、共通に譲渡され たアメリカ特許出願第−−号、１９９０年９月−日出願に記載、請求されており 、引用して、ここにその全部を含めることにする。ＴＭＯ遺伝子クラスターを担 持する組み換えプラスミドｐＫＭＹ３４２を、いくつかのグラム陰性細菌種に導 入し、また、カテコール２．３−ジオキシゲナーゼ遺伝子を担持するプラスミド ｐＫＭＹ５＋７を、ｊ　Ｎｔｉｄｘ　に導入した。これら遺伝子の発現を、誘導 、非誘導条件下で、測定した。トルエン・モノオキシゲナーゼおよびカテコール ２．３−ジオキシゲナーゼの両方について、有意に高い比活性が、非誘導の培養 体よりも、誘導培養体から観察された。これはテストしたすべての細菌種につい てそうであった（第ｒ、ＩＩＩ表）。この結果は、９ＫｌｌｌＹ３１９が、グラ ム陰性菌における調節された遺伝子発現を実行するのに、発現ベクターとして広 く使用できることを示している。ＮＡＨ７で生産されたカテコール２．３−ジオ キシゲナーゼの濃度と比較すると、ｐＫＭＹ５１７の本酵素では、この実験条件 下で、２５倍の過剰生産が観察された（第１表）。プラスミＦｐＫＭＹ５１７を 有するＰ、ｐｕｌｉｄｘにおけるカテコール２．３−ジオキシゲナーゼ蛋白質の 生産は、細胞の粗抽出物について５ＤＳ−ＰＡＧＥを行なって分析した。生産さ れたカテコール２．３−ジオキシゲナーゼの量は、ゲルのデンシトメータ分析に よって検出すると全可溶性蛋白質の約１０％を占めていた（第５図）。この結果 は、ｐｒｉ１７３１９が、遺伝子産物の過剰生産に有用であることを示している 。

このクローニング・カートリッジの安定性をテストした。これは、ここに記載す るクローニング・カートリッジの要素上し遺伝されないという報告があったため である（Ｂａｇｄｉ＋ａ＋ｉｚｏ　！１え用の「ホットスポット」となり　（Ｉ ａｍ＋＋　ｚｎｄ　Ｋｏｌｏｄｏｔ＋、１９８３゜ｉｎ　Ｍ＋ｅｈ＋ｎｉ＋ｍ＋ 　ｏｆ　ＤＭＡ　Ｒ＋ｐｔｉ＋ａｌｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒ＋ｃｏｍｂｉｎｘｉｉｏ ｎ。

Ｃｏ＋＋ａ＋ｅｌｌｉ、（＋ｄ、１．　ｐｐ、　７６１−７７２．　Ｌｉｆｔ、 Ｎｕ　Ｙｏｌｋ）　、これが、この　ｔｉｔ’遺伝子を担持するプラスミド（Ｋ ｏｌｏｔ　！ｔ　ｔｌ、、［９８９゜上記）の非安定化の原因となっているので はないかと示唆されていた。この配列は、Ｈｉｎｄｌ１１部位を含んでおり、こ のＨｉｎｄｌｌｌ　認識配列を破壊、ないし、その近傍の配列を破壊すると、− 二遺母子を担持するプラスミドは安定化された（Ｋｏｌｏｔξｌ　！１．．　＋ ９８９．上記）。本発明によるクローニング・３図）。この配列置換は、１ｅ１ 　遺伝子にたいし新たなハイブリッド・プロモーターをもたらし、本発明による クローニング・カートリッジのいずれを担持するプラスミドについても、安定化 した。

ここに記載するクローニング・カートリッジのハイブリッド・プロモーターによ り、　ｌ＋１　遺伝子は、テストした全ての菌種において、選択マーカーとして 用いることが可能となった（表２．３．４）。本発明によるクローニング・カー トリッジを担持するプラスミドの安定性をテストするために、ｐＫＭＹ２９９ま たはｐＫ１ｉＹ３１９を有する　Ｐ、ｐａｔｉｄｉに７２４４ＧおよびＰ、ｐａ ｒＩｄＩＧＳ７２ホスト細胞（第１表）、テトラサイクリンを含まないＬブロス 中で、５０世代以上増殖させた。培養物の各々を、Ｌ寒天プレートにストリーク し、単一コロニーを形成させ、各培養物から得た１００コロニーについて、テト ラサイクリン（５０ｍｇ／ｍｌ　）添加し寒天プレートにおいて、テトラサイク リン耐性をテストした。テストしたコロニーの全てが、テトラサイクリン耐性を 示した。この結果は、本発明のクローニング・カートリッジに担持される形管で １！（遺伝子を用いると、両カートリッジのいずれも、または、両カートリッジ を担持するプラスミドのいずれも、選択が無くても、除去されることはないこと を示す。

ここで、下記の実施例によって本発明を、付属の図を参照しながら、説明する。

実施例１ 中間プラスミド、に１ｆＹ２８９の構築Ａ　プラスミド　９ＫＭＹ２５６の調製 プラスミド９ＫＭＹ２５６　（以前は、ｐＫＹ２５６と呼ばれていた）の構築に ついては、共に係属中の、共通に譲渡されたアメリカ特許出願’Ｍ　１７７、６ ３１号に記載されており、ここに、引用することによって、この内容に含めるこ とにする。、Ｋ１１Ｙ２５６構築の開始材料は、Ｙｅｎ　ｚｎｄ　Ｇｏａ＋ｉｌ ｕ＋、［８５，１，Ｂ＋ｃｌＣ＋ｉｏ１．　１６２　：１Ｏ０８−Ｈの記載する プラスミドｐＫＭＹ２１７である。プラスミドｐＫ１１Ｙ２５６は、下記の一連 の手順に従って構築された◇先ず・■旦および凹遺母子を含む、プラスミド　ｐ Ｋ１１Ｙ２１７の〜４．３ｋｂコｄｌ１１フラグメントを、日Ｂｄ＋＋＋＋ｉａ ｎ　ｆｔ　＋１．、　１９８３．　Ｇｈａｅ　２６　＋２７３−Ｈに記載の　９ ＫＴ２４１］　プラスミドの）ｌｉｎｄｌ１１部位にクローンした。この、第１ 手順で得られたプラスミドは、ｐＫ１１Ｙ２１９　と名付けられた。

ｐＫｉｌＹ２２３　と名付けた。次の手順において、■Ｕ遺伝子を含む、ｐＫＭ Ｙ２２３の〜６ｋｂ　Ｐ＋ｔｌフラグメント、〜２００塩基対のｎｇｈＧ遺伝子 、および、カナマイシン耐性を与える遺伝子を、ＹｓａロｃトＰｃ＋＋ｏｎ　ｆ ｔ　＋１．、　１９８５上記、に記載の　ｐａｃｔ９プラスミドのＰｉ１１部位 にクローンした。得られた、〜８．Ｏｋｂのプラスミドを、ｐＫ＆Ｉｌ’２５６ と名付？すだ（第２図）。ｐＫＭＹ２５８における〜６　ｋｂＰＨＩフラグメン トの方向性から、　５ｇ１ｌ　から」Ｒ］にわたる９ＵＣ１９のマルチプルクロ ーニング部位は、＋＋＋ｈＧ遺伝子の？ｌＩ部位のすぐ下流に置かれることにな った。次に、プラスミド＄［ＭＹ２５６を用いて、中間プラスミドｐＫＭＹ２ｇ ９を次のようにして構築した。

Ｂ、プラスミド　ｐＫＭＹ２８８の調製プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノ ノド〕、および、１ｘｃ２遺伝子産物の基質としてのＸ−ｇｚｌ　（５−ブロモ −４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ〜ガラクトノド）を添加した、Ｌ寒天に プレートした。所期の構築体は、無色のコロニーをピックアップし、次いで、ミ ニブレツブ分析することによって、スクリーニングすることができた。このもの は、ＰＲおよびＰｃを担持する、〜４２０　ｂｐ　ＰＩｔｌ−Ｓ＋ｌｌ　フラグ メントを含んでいた。

得られた〜３．ｌｋｂプラスミドは、９ＫＭＹ）Ｈと名付けられ（第３図）、こ れは、９ＵＣ１９（〜２．７　ｋＮ、〜６０　ｂｐの−しりヴエ遺伝子、Ｐ、Ｐ Ｇ、および〜２０Ｇ　ｂｐの−［す」−遺伝子（前記したように、もともとｐＫ Ｙ２＋７から得た）から成る。したがって、プラスミドｐＫｉｌＹ２８８ハ、ｐ ＫＭＹ２５６　ノ〜４２０　ｂｐユｕｌ−Ｓ料１７ラグメントを、ｐＵｃ１９に サブクローンしたものと等価である。

Ｃプラスミド　、ＫＭＹ２８９の調製 プラスミド　ｐＫｌｊｌ’２８８　ＤＩＩＡ　（上ｒｉ！、Ｂ節）を、５ｘｌｌ 　オヨＵ」見１で消化した。プラスミドＩＩＫＭＹ２５６　ＤＮＡ　（上記Ａ節 ）は、ユ旦１．　Ｓｃ＋Ｉ　（Ｒ１１＋　とコンパチブル）およびＸｂ＋ｌ　（ その後の連結において、もとのプラスミドｐＫｉ１２５６の再形成を防ぐため） で消化した。消化されたｐＫＭＹ２８ｇおよびｐＫＭＹ２５６のＤＮＡを混合し 、連結し、Ｅ、ｃｏｌｉ　１１４１０９を形質転換するのに用いた。

形質転換体は、カナマイシン（５０部ｇ／１Ｉｌ）添加り寒天にプレートして選 択した。得られた〜６．８ｋｂプラスミドは、ｐＫＭＹ２８９（第２図）と名づ けな。これは、ｐＫＭＹ２５６　ノー６．６　ｋｂ　５ａｌｌ−５ｃ＋　ｌ　フ ラグメントと、ｐＫＭＹ２Ｎ　ノ〜２００　ｈｐ　Ｓｘｌ！−Ｒ＋＋ｌ　（連結 後、」具１は、　５ｃａｌ　に変換される）フラグメントとを含ム。

コノ−２００ｂｐフラクメントハ、−６０ｂｐ　（７）　ｎｘｂＲ遺伝子、ＰＲ ｌＰＧ（■■遺伝子のＡＴＧ前の、５　ｂｐ配列＾ＣＡＧＣのないもの）を含む 。ｎ＋ｈＧ遺伝子のものは何も残っていない。ｐＫＭＹ８８９の構築において、 ｎｚｂＧ遺伝子のすぐ上流のＲ＋ａ１部位は」］１１部に変換される。これによ って、下記の構築手順において、ある種の操作が可能になる。

実施例２ 中間プラスミド、ＫＭＹ２９３の構築 Ａ、プラスミド　ｐＫＶＹ２９＋の調製プラスミドｐＫＭＹ２８９　ＤＮＡ　（ 実施例１）を、Ｂｇ［Ｉｌ、Ｓｃ＋ｌおよびＰＩｔｌ　（その後の連結工程にお いて、もとのプラスミドｐＫＭＹ　２８９が再形成されるのを防ぐため）で消化 した。プラスミ　ド　ｐ８Ｒ３２２：：Ｔａ５　（Ｓ＋＋ａｋａｔｘ　ｃｌ　ｇ ｌ、、　１９８２．　Ｐｔｏｃ　Ｎｌ１ｌＡｅｘｄ、Ｓｅｉ、ＵＳ人７９：　７ ４５０−７４５４　）　ＤＮＡを、　Ｂｇｌｌ＋オヨヒ」］１で消化した。消化 された９に１１Ｙ２８９およびｐ８Ｒ３２２：：Ｔａ５を混合し、連結し、Ｅ、 　ｅｏｌｉ　１１１０９細胞を形質転換するのに用いた。形質転換体は、テトラ サイクリン（１０μｓ／ｃｌ）添加り寒天にプレートして選択した。得られた〜 ６．［ｋｂプラスミドを、ｐＫＭＹ２９＋　（第２図）と名付けた。これは、複 製に必須なりＮＡＡ　Ｔ　Ｇ　Ｒ（Ｄ　Ｓ　ｂｐ　配列ＡＣＡＧＣ（７）　すｌ 、Ｎもの）を有する、〜４７０　ｂｐ」止　遺伝子にたいして、凹領域の相対位 置を決めることの他に、この手順によって、」［部位に、ポリリンカーを一万Ｂ 、プラスミド　ｐＫＭＹ２９２の調製消化しく　ｐＫＭＹ２９１の再形成を防ぐ ため）、次ぎにこれを用いて、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＩＭｆ０９　ｔｉＥ胞を形質転換 した。形質転換体は、テトラサイクリン（１０部ｇ／ｍｌ）　ｍ加り寒天にプレ ートして選択した。所期の、〜４Ｊｋｂプラスミドを　ｐＫＭＹ２９２　（第２ 図）と名付けた。

遺伝子配列に、所期の方向で、できるだけ接近することができｔ；。

Ｃ，プラスミドｐＫＭＹ２！１３の調製プラスミドｐＫｉｌＹ２９２　［１１１ Ａ　Ｃ前記８節）を、５ｅｘｌおよび」旦１で消化した。ｐＫＭＹ２９２の〜２ ４０　ｈｐ凹！二」豫、１１フラグメ１゛ ントを除去し、これを、下記の配列を持つポリリンカーｌＲ換した。

この二重鎖ポリリンカーは、５’　−Ｒ１！！　−）ｌｄ＋　ｌ　−Ｈ２Ｓ　１ −ＣＩ＋Ｉ　−１ｂｚ　ｌ　−Ｋｐｎ　ｌ　−Ｓｔｃ　Ｉ　−Ｗｈｏ　Ｉ　−Ｓ ａｃ　ＩＩ　−８ｇｌ　Ｉｆ上記配列のポリリンカーの構築に用いられる一本鎖 ＤＮＡフラグメントは、＾８３３ＨＢひＨＡンンセサイザー（人ｐｐｌｉ＋ｄ８ ｉｏ＋７ｓｌｅｔ＋、Ｉｎｃ、、８５０　Ｌｉｎｃｏｌｎ　Ｃｅｎｔｒｅ　Ｄ＋ ｉｗｅ、Ｆａｔｔｅｒ　Ｃ１１ｌ。

ＣＡ９４４０４　）によって化学的に合成した。本分野においては、たくさんの ＤＮＡ合成装置が知られており、このフラグメントの製造に使用できる。さらに 、このフラグメントは、［ｌ１ｋｕ＋＋したがって、従来方法で調製することが できる。合成された一本鎖をアニーリングして、下記のように二重鎖のポリリン カーを形成した。４本の、−不備を、アニーリング用に合成し、これを、１（０ −２Ｈ３１ｍｃｒ）、　１４０−２８（３５５ｅｔ）および１４０−２９（３２ ｍｔ「）。

１４０−３０　（２４ｍｅ＋）　と名付けた。これらは、それぞれ、下記の配列 を持つ。

１４Ｇ−２７５’−ＡＣＣＡＴＡ　ＴＧＧ　ＴＴＡ　ＡＣＡ　ＴＣＧ　ＡＨＣＴ Ａ　ＧＡＧ　ＧＴＡ　Ｃ−３’Ｌ４０−２８　５’　−ＣＴＣＧＧＴ　ＡＣＣＴ ＣＴ　ＡＧＡ　ＡＴＣＧＡＴ　Ｇ丁Ｔ　ＡＡＣＣＡＴ　ＡＴＧ　Ｇτ−３′ ＋４０−２９　５’−ＣＧＡ　ＧＣＴ　ＣＣＴ　ＣＧＡ　ＧＣＣＧＣＧ　ＧＡＣ ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＣＴＧ　ＣＡ−３’１１０−３［１５’−ＧＡＧ　ＡＴＣＴＧ Ｔ　ＣＣＧ　ＣＧＧ　ＣＴＣＧＡＧ　ＧＡＧ−３’鎖１４０−２８および＋４０ −２９の５°末端を、従斎駐、例えば、Ｙｘｌｌｌｏｒｌｌｌ　ｔｌ、、１９了 ７．　８ｉｏｅｈ＋ｍ、Ｌ６：Ｌ７７２−ＩＮＧにより、アニーリング前に、キ ナーゼ処理した（下に、星でマークする）。

アニーリングスキームは次の通り。

テトラサイクリン（１０μｇ／＋ａｌ）添加し寒天プレートにて選択した。ｐＫ １１Ｙ２９３と名付けた、所期の〜４．ｌｋｂプラスミドは、で同定した。ｐ［ ＭＹ２９２　（ＩＮＡは、皿１および−υニア！８の消化には切断されずに残る 。プラスミドｐｏ＋ｙ　２９３は、合成ポリリンカー、Ｐ、ＰＰ！、〜２７０　 ｈｐのｏＪｂＲ遺伝子、および、そのすぐ下流の　ｌｅｔ’遺伝子を含む。この 合成ポリリンカーは、プラスミドＰＫＭＹ２９２の５ｅｘｉ部位における除去さ れた５ｂｐ配列の人ＣＡＧＣを、配列ＡＣＣＡＴで置換して、ポリリンカーに　 ’Ａｄｅ［ｔａＥ位を形成する。したがって、ここに記載の、合成ポリリンカー の挿入によって、（ｉ）Ｓ＋ａ［部位が、　Ｐｃ内に天然に見られるの距離が回 復され、（＋エエ）Ｐｏ配列の３°末端に、Ｎｄ＋１クロ一ニング部位が生成し 、（１ｖ）口ｅ（部位のすぐ下流に、その他の数個のクローニング部位が配置さ れた。

実施例３ 中間プラスミドｐＫＭＹ２９５の構築 Ａ、プラスミド　ｐＫｉｌＹ２９４の調製プラスミドｐＫＭＹ２９３０Ｍ人（実 施例２）を、ｌ旦［およびＢ＋ｐＭｌｌで消化した。さらに、プラスミド　ｐＵ ｃ９　ＤＭＡ　（ＹＢｒｘｓａｄ　Ｍ＋＋＋ｉＢ、１９８２．　Ｇ＋ｎ＋　１９ ：２５９−２６８）　を、　？ｔｌおよび連結し、Ｅ、ｅｏｌｉ　ＩＭＨ９細胞 を形質転換するのに用いた。形質転換体は、テトラサイクリン（１０μｇ／ｌ） およびアンピシリン（５［ＩＱμｇ／ｍｌ）添加り寒天プレートにて選択した。

ｐＫ１１Ｙ２９４（第３図）と名付けた、所期の〜４．８ｋｈプラスミドは、Ｘ ｂｏｌおよびＥｃｏＲＩで消化されたＤＮＡのミニブレツブ分析で同定した。プ ５　スミｌ’　ｐｒｉｌｒ２９４　ハ、ｐＫＭＹ２ｇ３　ｆＪ〜２．Ｑ　ｋｂ　 Ｐ＋ｆｌ−およびＢｘｐＭＩｔ部位が除かれ、士！１部位が、）ｅｔ’遺伝子の 下流に置かれた。

Ｂ、プラスミド　ｐＫＭＹ２９５の調製プラスミドｐＫＭＹ２９４　ＤＮＡ（前 記Ａ節）を、ユ旦Ｉおよびに！ｌｌ渡されたアメリカ特許出！第ｆ７７．６３１ 号に記載されており、ここに引用することによって含まれるものとする。Ｉｈｏ ｌ−ＥｃｏＲＩ消化しｔ　ｐＫＭＹ２９４オー１：　Ｕ　ｐｃＦＭＩＩ４６　Ｄ ＮＡヲａ　合Ｌ、連結シ、これを用いて、Ｅ、　ｅｏｌｉ　ＦＭＳ細胞を形質転 換した。Ｅ、　；ｏｌｉァージ抑制遺伝子、Ｃ１８５７（Ｂｉｔｕｔｌ１口ｔ　 ｓ［、、１９８８，ＢｉＯ／Ｔｃｅｈａｏｌｏｔｒ　６：　６９９−７０６１を 含んでいた。形質転換体は、テトラサイクリン（１（ｌμｇ／ｍｌ）　、カナマ イシン（５０μｇ／ｉｆ）を添加したし寒天にプレートして選択した。

Ｉ得られた〜５０ｇｋｂプラスミドはｐＫＭ７２９５　と名付けた（第３図）。

ユｈｏｌ−ＥｅｏＲｌ−消化したｐ［ＭＹ２９５のミニブレツブ分析から、９Ｋ ＭＹ２９４の〜２．Ｑｋｂフラグメントは、ｐｃＦｕｌ１４６／に成功裡に挿入 されたことが確認された。同時に、」ユ２１−　Ｈｐｔｌ−」旦Ｉ−至Ｉ−コｄ １１１−エ■０１部位を含む、ｐＣＦｕｌ１４６の小セグメントが除去された。

９に１１Ｙ２９５においては、ｐＣＦＭ１１４６の転写ターミネータ−は、ＰＧ のマルチプルクローニング部位のすぐ下流に位置する。

実施例４ 中間プラスミド　ｐＫｌｌＹ２９？の構築Ａ　プラスミド　ｐＫＭＹ２９６の調 製プラスミドｐＫＭＹ２９７構築の開始材料は、プラスミドｐＫＭＹ２９６ＤＮ Ａ（実施例３）とプラスミドｐＫＭＹ５１３　ＤＮＡである。プラスミドｐＨＩ Ｙ５Ｎは、Ｈｉａｄｉ１１部位を下記のように除去してしまったｐＵＣ９フ５ス ミド（Ｙｉ＋ｉ＋！ｇｏｄ　１１ｅｔｔｉｎｇ、ｌＨ２上記）とほぼ同じである 。Ｈ１０ｄｌ１１消化した　ｐＨｃ９　ＯＮＡを、ＤＮＡポリポリーゼＩのＫｌ ＋ｏｏｖフラグメントで処理して、Ｈｉｎｄｌｌｌ消化によって生じた粘着性末 端を充填した。ＫｌｔＨＢ処理ＤＮＡを連結し、Ｈｉｎｄｌｌｌで処理し、これ を用いてＳｕ、ｃｏ堕−Ｎｌｉ０９細胞を形質転換した。形質転換体は、アンビ ンリン（２５Ｑ　μｇ／ｍｌ）添加し寒天プレートにて選択した。選択した。４ 換体のミニブレツブ分析から、このＤＮＡは、Ｊ■ｄ１１１　消化にたいして耐 性を持つことがＴＮ認された。このＨｉｎｄｌ！ｌ耐性プラスミドＤＮＡを、ｐ ＫＪＹ５１３　と名付けた。

よびＢｇｌｌｌで消化した。消化されたＤＮＡを混合し、連結し、その連結混合 物を用いて、Ｅ、ｃｏｌｉ　１Ｍ１０９細胞を形質転換した。

形質転換体は、テトラサイクリン（１０μｇ／ｌ）およびアンピシリン（５００ μｇ／ｍ　ｌ　）を含むし寒天プレートにて選択した。ｐＫ１１Ｙ２９６（第１ θ図）と名付けた、所期の〜５．ｌｋｂプラスミドは、ｐＫＭＹｓ＋３の〜２． ７ｋｂＥ■Ｒ１−ユ旦Ｈ１フラグメントと結合した、ｐＫＭＹ２９５の〜２，４ ｋｈ−駐ユＩＩＩ　−Ｂｇｌｌ［フラグメントを含んでいた。

この連結により、ユ〔］１およびＢ＋ｃｆ１１部位が取り除かれ、転写ターミネ ータ−の下流にユニークなＰＩ１１部位が置かれた。

Ｂ、プラスミド　ρＫＭＹ２９７の調製プラスミドｐＫＭＹ２９６　ＤＮＡ（前 記Ａ節）を、コｄ１１１で消化した。同様ニ、フラスミＦ　ｐＫｉｉＹ２８９　 ＤＮＡ　（実施ｆｐＨ）ヲ、ｆｌｉｎｄｌｌｌで消化した。消化された９ＫＭＹ ２９６およびａＸ猛Ｙ２８９ＤＩＩ＆を混合し、結合し、これを用いて、プラス ミド　９ＫＭＹ５１２を子を再生したプラスミドを含む形質転換体のみを特異的 に選択するためであった。ｐＫＭＹ５１２の構築と、所期の形質転換体の選択に おけるその使用は、下記に記す通、りである。

ｐＫＭＹ５＋２構築の開始材料は、プラスミドｐＮ４００　［１１１＾である。

プラスミドＰＮ４００そのものは、プラスミドＮＡＨ７由来のナフタレン・ジオ キシゲナーゼ遺伝子を含む、プラスミドｐＥ３１７（Ｅｏ＋ｌｅｙ　！＋　１１ ．、ｌＨ３，５ｃｉｅｎｃｅ　２２２：１６７−１６９）　の−７，５ｋｂＰｗ ｕｌｌ　−８ｇ１ｌ１７　ラグメントを、プラスミド　ｐＵｃ１８　山ａｉ＋ｃ ｈ−Ｐ＋＋＋ｏｏ　Ｎ　ｓｌ、、１９０．上記）の」胆Ｉおよび−リｇ＋［１１ 部位１こクローニングすることによって構築した。プラスミドｐＮ４００　ＤＮ Ａを５ａｃｌ　テＭ化し、ナフタレン・ジオキシゲナーゼ遺伝子を含ｐＫＭＹ２ ３１　％　ｆ＝。所Ｘｔｌ　）’７’　ラＸ　ミＦ　ｐＫＭＹ５１２＋１．９Ｋ ＭＹ２３９力λら〜６．Ｌ　ｋｂ　Ｂｇｌｌｌ　−ＥｃｏＰ、ｌフラグメントを 除去し、一部の　ｃａｋＲ遺伝子と、その活性を取り除いて得た。かくして、プ ラスミド９にＭＹ５１２は、ナフタレン・ジオキシゲナーゼ構造遺伝子の全てを 含むが、　ｎ＋ｈｌ１機能遺伝子を含まない。■見違母子産物は、ナフタレン・ ジオキシゲナーゼ構造遺伝子の発現の正の調節をし、この構造遺伝子産物は、Ｅ 、ｃｏｌｉ　において、インディゴの生産を触媒し得る。これについては、Ｅｏ ｉｌｅ７　ｅｔ　ｚｌ、、１９８３上記が示した通りである。もし回連母子産物 がなけれｌｉナフタレン・ジオキシゲナーゼ活性や、インディゴ生産の発現は、 ｐＫＭＹ５１２だけしか持たない形質転換体では、不可能である。形質転換体が 、プラスミドｐＫｉＩＹ５１２、および、ｐＫＭＹ２８９の〜［，１ｋｂ　ｆｔ １ｎｄｌｌｌフラグメントが、適正な方向に挿入されて、　ｎｇｈｌｔ機能遺伝 子を生じるようになっている、プラスミドｐＫＭＹ２８９の誘導体を含む時、そ のような形質転換体は、２個の相補的なプラスミドを含み、ナフタレン・ジオキ シゲナーゼの誘導物質の存在下に、インディゴを生産するこ七ができる。

この相補系を用いて、最初、形質転換体を、５（ｌｔｌμｇ／ｉ　ｌアンピシリ ン（ｐＫＭ７２９６の選択マーカー）、５０μｇ／ｌＩｌ力ナマインン（ｐＫＭ Ｙ５１２　Ｊ択マーカー）、およびナフタレン・ジオギシゲナーゼ遺伝子の誘導 物質として、１．０ｍＭサリチル酸ナトリウムを添加したし寒天プレートにて選 択した。インディゴ生産による、青色コロニーを選択し、さらに分析した。青色 コロニーのミニプレツブＤＮＡを用いて、Ｅ、ｃｏ［ｉ　ＨＢＩＯＩ細胞を形質 転換し、この２次形質転換体を、５００　μｇ／１１アンビンリンのみを添加し たし寒天プレートにて選択した。この２次形質転換体のミドが得られたことが確 認された。このプラスミドをｐＫＭＹ２９７と名付けた（第３図）。

プラスミドｐ［ＭＹ２９７構築の成功により、５個の所望の要素を含む、〜３． ６　ＨＥＣ０ＲＩ　−Ｐ＋ｔ１　クローニング・カートリッジ（または、クロー ニング・カセット）が完成した。このカートリッジは、調節遺伝子、調節遺伝子 によって調節されるプロモーター、マルチプルクローニング部位（ポリリンカー ）、転写ターミネータ−１および、抗生物質耐性をコードする遺伝子をストにお いて、クローニング・カートリッジないしクローニング・カセットとして、有用 であるか否かをテストするために、このフラグメントを、広範ホスト範囲のプラ スミドＲＳＦ１．Ｎ０（Ｓｈａｌ＋　ｅｔ　＋１．、ｊ１８９上記）由来のレプ リコンに挿入した。広範ホスト範囲の発現ベクターｐＫＩＪ７２９９は下記のよ うにして構築した。

Ａ　中間プラスミドｐＫＭＹ２８６の調製プラスミドｐＫＴ２３１　ＤＮＡ　（ 実施例１）を、」見１および」旦［で消化した。」旦［部位は１．ＫＴ２３１の 　ＥｃｏＲＩｉｉＥ位とｒのＫｌｅｎｏｖフラグメントで処理し、平滑端を得た 。に１ｌｏｆ処理ＤＮＡを連結し、これを用いて、Ｅ、ｃＯｄｉ　［１８１０１ 細胞を形質転換した。形質転換体は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加した し寒天プレートにて選択した。得られた〜ｌＩ１．３１ｂプラスミドは、９ＫＭ ７２８６　と名付けた。９ＫＭＹ２８６において、ｐＫＴ２３１からの」■１お よび５Ｊ５１　Ｆ！５位を除去し、これによって、ポリリンカー内の、この二つ の部位を、クローニング部位として使えるようにした。

Ｂ９　プラスミド　ｐＫＭＹ２９９の調製プラスミドｐＫ１１Ｙ２８６　ＤＮＡ （前ｍＡ）を、皿Ｒ（およびユ旦１にて消化した。プラスミド　ｐＫＭＹ２９７ も（実施例４）　、ＥｃｏＲｌおよびＰ＋ｔｌ　にて消化し、さらに、５ｃｔｌ 　（プラスミドｐＫＭＹ２９７の再生を防ぐため）で消化した。消化されたｐＫ ＭＹ２８６およびｐＫＭＹ２９７の［ｌＮ＾を混合し、連結し、これを用いて、 Ｌ−乞［畳。

ＨＢｌｆｌ［細胞を形質転換した。形質転換体は、テトラサイクリン（１０μｔ ／１）を添加したし寒天にプレートして選択した。テトラサイクリン耐性コロニ ーをピックアップし、これを、テトラサイクリン（１０μｇ／ｉりおよびアンピ シリン（５００μｇ／ｌ）添加り寒天にてテストした。テトラサイクリン耐性、 かつ、アンピシリン耐性コロニーをピックアップし、プラスミドｐＫＭＹ２９７ 〜６．Ｌ　ｋｂ　ＥｅｏＲｌ　−Ｐ＋ｔｌ　フラグメントとの連結の有無につい て、ミニブレツブ分析により調べた。このカセットを含む、所期の〜１．７ｋｂ プラスミドを、ｐＫｉｌＹ２９９　と名付けた（第４図）。

ＴＦ９！　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ口に、１９９０年９月２５日寄 託し、受託番号式、Ｔ、Ｃ，Ｃ，６３４２７を与えられた。

ＣプラスミドｐＫＭＹ２９Ｑ　ＤＮＡの選択的配列分析ｐＫＭＹ２９９において 、ＰＧ　とマルチプルクローニング部位との接合部、クローニング・カートリッ ジと　ＲＳＦＩＯＩＯレプリコンとの　Ｐ＋ｌｌ接合部の予想ヌクレオチド配列 は、ＤＮＡ配列分析によって完全に確認された。」旦［部位の上流の、ＰＧの７ ９塩基対、この部位の下流の１５８塩基対の配列を決定した。配列データから、 予想通り、合成ポリリンカーの５゛末端は、Ｐ。

って交換されていることが明らかになった（第３図）。ＰＧの下流には、匹（部 位と、さらにその後に、［［ｐｚｌ、　Ｃ１５ｌ。

Ｘｂｇｌ　、Ｋｐｏｌ、　５ｚｃｌ　オよびＸＩ＋ｏｌを含む７個のユニークな 制母子の厳密な挿入に用いることができる。Ｐ＋ｔｌ認識配列上流のクローニン グ・カートリッジの５４ｂｐおよびこの配列下流のＨＦＩＧＩＯレプリコンの２ ７７　ｂｐを含む３３７　ｈｐの配列を決定し、た。この配列から、クローニン グ・カートリッジのＰＨＩ末端は、予想通り、ヌクレオチド７１６８　（Ｓｅｈ ｏ［！ｅｌ　ｉｆ、、１９ｇ９上記）から始まるＲＳＦＩＯＩＯＤＮＡの対応す る二１部位に連結していることが判明した。

ＥｃｏＲ１認識配列上流のＲ３ＦｌｔｌｌＯレプリコンの　３０３　ｂｐおよび この配列下流のクローニング・カートリッジの　３６　ｂｐについて同様の配列 分析を行なうと、予恵通り、クローニング・カートすることが判明した。一方、 同じ分析で、ＲＳＦＩＯＩＯＤＮＡ　（Ｓｈｏｌ＋ｅｌ　！１．．　ｔ９８９． 上記）＋７１１１し、ｔチド１から１６５３（７）　配列ｉ！、ｐＫＭＹ２９９ では完全に除去されていることが明らかになった。この除去は、用いたプラスミ ド　９に丁２３１に起こったものであることが示唆された。これについては、前 記した通りである。ｐＫｉｉｙ２８６およびｐＫＭＹ２９９について、各種制限 酵素を用いてさらに分析してみても１．Ｋ１１Ｙ２９９にはその他の異常は検出 されなかった。

したがって、ｐＫＭＹ２９９は、ヌクレオチド１から１６５３を取り除かれ、ヌ クレオチド７７６８から　ｇ６７６を、３．６　ｋｂのクローニング・カートリ ッツで置換された、ＲＳＦＩＯＩＯと考えることもできる。

プラスミドｐＫＭＹ２９９は、実施例５に前記した通り、５′末端に口ξＩ認識 配列を含む遺伝子のクローニングおよび発現を意図して設計されたものである。

未知配列の遺伝子を担持する制限フラグメントのクローニングおよび発現のため に、ｐＫｉｌＹ２９９のクローニング・カートリッジに改変を施した。すなわち 、ｐｏｔｙ防止するためである。特に、プラスミドｐＫｉＹ２９９由来のポリリ ンカーのＮｄ＋１　！！！識配列配列内部ＴＧ配列は、下記のようにして除去し た。プラスミドＰＫＭＹ２９９　［１１１人（実施例５）を、」旦１および」旦 １で消化し、次いで、メーカーの指示にしたがって、ヤエナリヌクＬ／７−ゼ（ Ｌｗ　ＥＢｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ＋、３２　Ｔｏｗｅｒ　Ｒｏａｄ。

Ｂｅｙ＋ＣＩ７．　ＭＡ　０１９１５　）で処理し、オーバーハングを除いた。

次止麿ｔ に、このヌクレアーゼ処理したＤＮＡを！し、これを用いて、Ｅ、＋ｏ１ｉ工１ （８１０１細胞を形質転換した。形質転換体は、テトラサイクリン（１０μｇ／ １ｌｌｌ）添加り寒天プレートにて選択した。

Ｎｄｅｌおよび」旦１部位が効果的に除去された、所望のプラスミドは、ｐＫＭ Ｙ３１９　と名付けた（第４図）。Ｅ　ｅｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ中のプラスミド　 ｐＫＭＹ３１９は、八ｍ＋＋１ｃｘｃ　Ｔｙｐ＋　Ｃｕ１ｔｕ「ｅ　Ｃｏ１１ｅ ｃｔｉｏｎに、１９９０年９月２５日寄託し、受託番号＾Ｔ、Ｃ，Ｃ，６３４２ ６を与えられた。ｐＫＭＹ３１９の連合部位近傍（すなわち、ｐＫＭＹ２９９１ ＪＮ＾の、Ｎｄ＋Ｉ、　ＪユＩおよびヤエナリヌクレアーゼ処理後の連結のこと である）の配列を分析すると、−むむ１によって形成された一不備ＡＴオーバー ハングを取り除いた他に、ヤニナリヌクレアーゼが８１１９の配列を除いたこ七 が判明した。この８　ｈｐの中には、ＡＵＧ翻訳開始コドンにたいする、リポソ ーム結合部位５′をコードするのに貫要と考えられるヌクレオチドの少なくとも １個が含まれていた。（このリポソーム結合部位の配列は、Ｙｅｎ　ａｏｄ　５ ｅｔｄ！ｔ、Ｎｇｉ　ｃｇｃ　Ｃｏ１１．　Ｒｅｖ、Ｍｉｃ＋ｏｂｉｏ［、ｆ５ ：２４７−２６７に総覧されている （２５５ページの第４図参照。）　ｐＫＭＹ３１９における結合部位近傍の、予 想配列と、実際に観察された配列は下記の通り。

ｌａｌ このリポソーム結合部位の破壊は、未知配列の遺伝子を含むクローン・フラグメ ントの発現に、ｐＫＭＹ３１９を使用するのに有利であることが判明した。この ようなフラグメントは、その担持する遺伝子にたいするリポソーム結合部位をコ ードする配列をしばしば含む。このような場合、第２のリポソーム結合部位が作 用して、発現を効果的に抑えることがあるかも知れない実施例７ プラスミドＮＡＨ７のカテコール２，３−ジオキシゲナーゼ遺伝子の　ｐＫｉｌ Ｙ３１９由来発現系の構築Ａ、中間プラスミド　ｐＫＭＹ５１４の調製プラスミ ドｐＫＹ６７は、ｎｔｈＧ遺伝子に、Ｔｎ５挿入体を含む・ＮＡ！（７ブラスミ ドである（Ｙ！ｎ　ａｎｄ　Ｇａｎ＋＋ｌｅ＋、＋９８２．　Ｐｔｏｃ、ｆｌａ ｉｌＡｃｉｄ、Ｓｃｉ、ユ９　：８７４−８７８）　、プラスミド　ρにＹ６７ 　ＤＮＡと、ブラスミ　Ｆ　ｐ［１ｃＩ９　ＤＮＡ　（Ｙｘｎｉ＋ｃｈ−Ｐｅ＋ ＋ｏｎ　ｃｌ　ｔｌ、、１９８５．　上記〕　を、Ｘｃｉｌで消化した。消化さ れた　ｐＫＹ６７およびｐＵｃ１９　Ｄｉｆ人を混合し、連結し、これを用いて 、ε、＋ｏｌｉ　ｔｌＢｌｏｌ細胞を形質転換した。形質転換体は、カナマイノ ン（５０μｇ／ｌ）およびアンビンリン（５００μｇ／ｍｌ）添加のし寒天にプ レートして選択した。ｐＫＭＹ５目と名付けた所期の〜５．４ｋｂプラスミドは 、カナマイシン耐性をコードする　Ｔｎ５遺伝子を含む、〜２．７　ｋｂ　Ｋｍ ｘｌ挿入体と、カテコール２，３−ジオキシゲナーゼをコードする　ＮＡｌｌ７ 遺伝上流と下流にマツプされた（Ｇｈｏ＋ｔｌ　ｅｔ　＋１．、ｌＨ７，Ｇｅａ ＋　３３１９−２８　）　、　フ５スミＦ　ｐｃＦＭｌ１４６　ＤＮＡ　（実施 例３）　モ、−（」１を形質転換した。形質転換体は、カナマイシン（５０μｇ ／ｌ）を添加したし寒天に２８℃でプレートして選択した。２８℃では、ｐｃＦ Ｍ１１４６由来の温度誘導可能なλプロモーターは働かず、したター・プレート からレプリカ・プレートを制作した。次ぎに、このレプリカ・プレートを４２℃ でインキュベートし、温度誘導可能なλプロモーターを働かせ、四速母子産物、 すなわち、カテコール２．３−ジオキシゲナーゼの生産を誘導した。コロニーが カテコール２，３−ジオキシゲナーゼを生産していることを検出するために、レ プリカ・プレートに、０．５１１カテコールをスプレーした。このカテコールは 、黄色の産物である２−ヒドロキシムコニック・セミアルデヒドに変換され、黄 色のコロニーが得られる。レプリカ・プレート上の黄色コロニーに対応する、マ スター・プレート上のコロニーをピックアップし、２８℃で増殖させた。このよ うにして、ｐＫＭＹ５１５　と名付けられた〜６．２ｋｂプラスミドが得られた 。これは、ｐＫＭＹ５１１からの〜１．５　ｋｂ　Ｎｃｏｌ−Ｘｈｏｌ　フラグ メントを含んでいた。このフラグメントは、〜４．７　ｋｂ　ｐｃＦＩＪｌ１４ ６　ノＮ＋ｏｌオよびＸｈｏ　１　部位１ｕｌｌ　人クローニングするのに使え ることになる。このクローニングが、プラスミドｐＫＭＹ５１７構築の最終段階 であるが、これについては、下記の０節に述べる。

Ｃ，ＮＡｌｌ７カテコール２，３−ジオキシゲナーゼ遺伝子発現のためのｐ［Ｍ Ｙ５１７の構築 プラスミドｐＫＭＹ５１５　ＤＮＡ　（前記ＢＢ）を、皿［および５１５および ｐＫＭＹ３１９　ＤＮＡを混合し、連結し、これを用いて、辷ｃｏｌｉ　Ｈ８１ ０１細胞を形質転換した。形質転換体は、テトラサイクリン（１０μｇ／ｉｔ） を含むし寒天プレートにて選択した。カテコール２．３−ジオキシゲナーゼを生 産するコロニーを検出するために、プレートにカテコールを、前節Ｂで述べたよ うに、スプレーし、黄色のコロニーを選択した。ＮＡ！（７カテコール２゜３− ジオキシゲナーゼの発現のための、所期の〜１１．２ｋｂプラスミドが得られた 。これを、ｐＫ１１Ｙ５＋７と名付けた。このものは、た。この結果から、ｐＫ １１Ｙ３１９由来の、ｌｌ［ＭＹ５１７の誘導可能プロモーターは、やや洩れや すくなっており、カテコールにたいするきわめて敏感なアッセイを用いると、誘 導がなくとも、ごく小量のカテコール２．３−ジオキシゲナーゼが、ｐＫｉＪＹ ５１７形質転換細胞で容易に検出されることが示唆された。細胞が誘導されると 、大量のカテコール２，３−ジオキシゲナーゼが生産される。これについては、 下記の実施例９に述べる通りである。

Ａ、ｐＬｕ２の調製 二重鎖合成オリゴヌクレオチドを、下記の配列を持つよう調製した。

各−末鎖は、λｐｐｌｉｔｄ　ＢｉａＢＮｅｍ＋モデル３８０Ｂ核酸シンセサイ ザーを用いて合成した。この二本の鎖を、従来の方法、例えば、Ｙ！ａＩｕｔｚ 　ｅｔ　＋１．、　１９７７上記によってアニーリングした。アニーリングした オリゴヌクレオチドの二つの末端は、Ｎｄｃ　ｌおよび１１による開裂で生じイ ＊端と適合性を持っていた。この２重鎖オリゴヌクレオチドを、あらかじめＬｌ ｔｌ　ｍよびＸｂｘｌで消化したｐＵｃ１９　［ＩＳＡ　（Ｙ＋ａｉ＋ｅｈ−Ｐ ＋＋＋ｏｎ　！ｌ　！１．．　上記）と混合し、次いで連結し、これを用いて、 Ｅ、＋ｏｌｉユＩＭ８３細胞（Ｙｉｅｉｃ＋　＋ａｄ１１ｅ＋ｓｉａｇ、１９８ ２．　Ｇ１１ｌ！　１９１２５９−２６８）　を形質転換した。形質転換体は、 アンピッリン（１００８ｇ１０ｆ）、ＩＰＴＧ　（Ｉ　ｍＭ＋およびβ−ｘｉｌ （２ｍｇ／１Ｉｌ）添加のし寒天にプレートして選択した。！ｈｃＺ遺伝子を含 む、ｐＨｃ１９　（７）−２３０ｂｐ　Ｎｄ＋ｉ　Ｘｂｚｌ　７　ラ’）’　ｌ 　ントｂ＜、連結の間に、合成オリゴヌクレオチドによって置換された、この所 期の形質転換体はアノピシリン耐性で、無色であった。この形質転換体コロニー のＤＮＡのミニブレツブ分析によって、予期されたＮｄ＋ｌおよびＸｂ＋　１部 位を含む〜２．ｓｋｂプラスミドの存在が確認された。そのような単離体の一つ を、１．ｌ［１６と名付けた。

このようにして、プラスミド９ＡＤ６は、開始コドン（合成的にタルルシフニラ ーゼの５′末端のコード配列を含む（ｄ＋Ｗｅｔ　ｅｔ！１．、　１９Ｎ、　１ １ｏ１．Ｃ＋１１．　Ｂｉｏｌ、、７：７２５−７３７）。

完全ナホタルルシフニラーゼ遺伝子を構築するために、プラスミド９ＡＤ６　Ｄ ｌ１人をＮｄｅｌ　およびユロ１で消化し、合成オリゴヌクレオチド挿入体を放 出した。従来の方法により、小さな挿入フラグメントを、１０％ポリアクリルア ミド・ゲルから単離した。プラスミド　ｐｌＤ２０１　（ｄｏｌｔ　ｅｌ　＋１ ．、　１９ｇ？、上Ｅ）　ハ、ゲノムＤＮＡ−ｃＤＮＡ融合体をプラスミドｐ［ １ｃｉ９にクローンして構築した、ＰｈｏｔｉｎｌＩ＋　ｐＢ＋ｌｉ＋　（ホタ ル）の、イントロン無しの、ルシフェラーゼ遺伝子の全長を含む。プラスミドｐ Ｊ０２１１１　ＤＮＡを、韮（および」廿１で消化した。ホタルルシフェラーゼ 遺伝子コード配列の大部分（すなわち、コドン１６（ヌクレオ従って０７％アガ ロースから分離した。完全なホタルルシフェＩｂＪｌ　トｒｂｇｌ−Ｋｕｌ）を 、あらかじめｔｉｄａｌ　（ｐｃＦＭｌ１５６）ＡＴＧで）およびＫｐａｌで消 化したプラスミドｐｃＦｊｌｌｓ６　ＤＮＡと混合した。プラスミド　ｐｃＦＪ ｌ１５６　は、Ｂｕ＋ｎｅｔｌ＋　１１　！１．．　［９ｇ８．８ｉｏ／τ！ｃ ｂｎｏｌｏＨ６：６９９−７９６の記載する、プラスミド　ｐｃＦＭ４７２２　 と同一であり、誘導可能な　Ｐ、プロモーター、リポソーム結合部位、クローニ ングクラスター、Ｅ、＝ｏｌｉ複製オリジン、転写ターミネータ−、プラスミド ・コピー数調節遺伝子、および、カナマ体は、５０μｇ／ｍ　ｌカナマイシンを 含むし寒天プレートにて選択した。所期の〜５，４ｋｂプラスミドを、ｐＬｕ２ と名付けた。制限エンドヌクレアーゼで消化した７　ｐＬｕ２　ＤＮＡをミニブ レツブ分析することによって、〜１．７　ｋｂ　Ｎ＋ｌ＋Ｉ−Ｘｂ＋ｌ−Ｋｐｎ ｌ挿入体が、うまくｐｃＦＭｌ１５６にクローンされていたことが確認された。

このようにして、旦１−１（旦１−立ｌ−ＥｅｏＲｌ　−Ｎ旦Ｌ−Ｋ旦１　リン カ−を、ｐｃＦｉｌｌｌｓ６から除去した。結合のためｐＡＤ６から精製した小 フラグメントの多数コピーがひよっとして挿入されている可能性があるので、プ ラスミドｌｌＬｕ２　ＤＮＡをＤＮＡ配列分析にかけた。この配列分析によって 、ｐＡＤ６の小フラグメントに単一コピーが挿入されたことが明らかになり、ま た、ルシフェラーゼの所期のコード配列が確認された。

Ｂ、プラスミド　ｐＫＭＹ５２０の調製プラスミド１ｌＬＯ２ＯＮＡ　Ｉ前節Ａ ）を、ＪΩ１およびＡ＋ｐ７１ｇで消化した（８ｏ＋ｈ＋ｉａＢ＋　Ｃ！Ｌ　Ｎ ｏ、８［４２５３）　ａ　’Ａ＋ｐ７１８は、を混合し、連結し、これを用いて 、Ｅ、ｃｏｌｉ　）ＩＢＩＯ［細胞を形質転換した。形質転換体は、テトラサイ クリン（１０μｇ／ｍｌ）　ヲｆｔ−加したし寒天プレートにて選択した。コロ ニーをピックアップし、ルシフェラーゼ活性の有無についてスクリーニングし、 下記のようにミニブレツブ分析した。ピックアップした各コロニーを、ＩＧμｇ ／ｍｌのテトラサイクリンを添加したしグロスＳｍｌ中で１５時間増殖させた。

各々のルシフェラーゼ活性を、実施例１０の方法にしたがってアッセイした。検 出可能なルシフェラーゼ活性を有するものについて、ミニブレツブＤＮＡを消化 するのにＨ目ｄ１１１およびＡ＋ｐ７Ｌ８を用いたミニブレツブ分析でチェック した。　所期のプラスミドには、３個のフラグメントが含まれていた。〜１．１ 　ｋｈ　Ｈｉｎｄ［ｌｌフラグメント、〜２．２ｋｂの大きさを持ち、ｐＫＭＹ ５２０　と名付けられた。このようにして、プラスミドｐＫ１１Ｙｓ２［１は、 ｐＬｕ２由来で、ｐＫＭＹ２９９の　Ｎｄｅｌ　およりテコール２．３−ジオキ シゲナーゼアッセイ細胞を、０４％グルタミン酸を含む５０１のＰＡＳ培養液（ ＣｈＪｋ＋１ｈｔＮ７　Ｃ１！１．．　１９７３．　Ｐ＋ｏｃ、Ｌｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｋｉ、ＵＳＡ７０：１１３７−１１４０　）　、または、５０　ｍｌのし ブロス中で、Ｏｊ５ｍｉｌサリチル酸ナトリウム（誘導物質〕の存在下、または 非存在下に、３０℃で約１３−４４時間増殖させた。細胞を、遠心によって収集 し、ペレットを、ｐＨ８，３，１００ｍＭ燐酸ナトリウム・バッファー　２０の １で洗浄した。細胞を、酵素の安定化のため１０％ｆＹ／Ｙ）　アセトンを含む 同じバッファー５ＩＩｌ中に再懸濁した。再懸濁細胞を、Ｈｒｚｌ　ＳｙＩ＋ｅ ｔｎｓ　ＵＩｌ＋ｓ＋ｏｃｉｃ＋、Ｉｃｅ。

（Ｐｌａｉｎｒｉｅｖ、Ｋｅｙ　ｒｏｃｋ；モデルｖ−３７５として入手できる ）製造の細胞破壊器を用いて超音波処理した。１パルス１０秒で５パルス、各パ ルス間隔１分で行なった。超音波処理後、懸濁液を、Ｂｅｃｋｍｘｏ　Ｉｎ＋ｔ ｒｕＩＩｅｎｌ＋、ＩｎＣ，（Ｓａｗｅｚｅｌ、Ｎｌ　０８８７５］　１２−２ １遠心器で、ｊ＾２０ｔ：Ｉ−ターを用いて、１５．０００　ｒｐＨで３０分遠 心した。

これによって、アッセイおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析用の粗抽出物が得うした。

ペレットを捨て、上清（粗抽出物）を、カテコール２．３−ジオキソゲナーゼ活 性のアッセイに用いた。方法は、下記のようにほぼ、５ｚｌａ−Ｔ＋ｅｐ！ｔ　 ＋ｎｄ　Ｅｖａｎｓ、１９７１．　Ｅａｒ、ＩＢｉｏ＋ｂｅｍ、　２０：４Ｑ３ −４１３に従った。アッセイ用の全容量は１ｍｌであった。粗抽出物（または抽 出物の適当な希釈液）の　１−１０μｌを、３．３ｍＭのカテコール（基質）１ ００μｍと混合し、次ぎにアブセイバッファー（１００ｍＭ燐酸ナトリウムｐＨ ８，３，１０％（ｖ／マ）アセトンを含む）で　１１に希釈した。黄色物の形成 、すなわち、２−ヒトＯキンムコニック・セミアルデヒド（吸光係数Ｅ　＝　３ ３．４ｍＭ−’ｃｍ−’）の形成を、ベックマン［１Ｏ−７０分光計を用いて０ Ｄ３７５で測定した。また、この粗抽出物の分液を用いて、蛋白質濃度の定量を 行なった。これは、８ｘｄｔｏ＋ｄ、＋９７６゜人口ｘ１．　Ｂｉｏｃｂｅｍ、 ７２：２４８の方法により、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌｉｂｏ＋＋ｔｏ＋ｉ＋＋。

Ｒｉｃｂｍｏａ［、ＣＡ　９４Ｎ４より人手した、Ｂｉｏ−Ｒｓｄ蛋白質定量キ ットを用いて行なった。計算したり活性（μ　ｍＧＩ！／１ｌ１１０／ｌｌ１ｇ ）を下記の東１表に示す。ＰｊＧＩり０１株（Ｙｅｎ　ｚｎｄ　Ｇｎｎ＋ａｌｔ ５　１９８２．　Ｐ：ＱＣ含むＰｚＩｌｄｏｓｏｎ＋＋　、川内Ｇ１３４３であ る。ＰｐＹＩＧＯ６株は、プラスミドｐＫＭＹ５１？　（実施例７）を含むＰｓ ｅｕｄｏｍｏｎＪ＋　ｐｕｔｉｄｘ　Ｇ５＋２（Ｓｈｉｈｘｍ　＋ｔ　＋１．、 　１９７３．　Ｉ、Ｂｘｃｔｅ＋ｉｏ１．　１１６　：９４４−９４９）である 。

第１表は、この２つの株に由来する細胞を、Ｐｃプロモーター誘導物質の存在下 （例えば、０．３５ｆｆｉＭサリチル酸ナトリウム）に増殖させた時、有意な量 の酵素活性のあるカテコール２．３−ジオキシゲナーゼが発現されたことを示す 。プラスミド９ＫＭＹ５１７は、ＮＡＨ７ブラスミド由来の、カテコール２，３ −ジオキシゲナーゼを含む。非誘導の　ｐＫＭＹ５１７含有細胞でも、検出可能 なレベルのカテコール２，３−ジオキシゲナーゼ活性を示す。

このことから、誘導可能なプロモーターは、いくぶん「洩れやすい　ｉｌｉ＋ｋ ｒ）Ｊ　（すなわち、小量の酵素が、■Ｕ遺伝子の誘導物質が無くとも作られる ）ことが分かる。しかし、第１表の結果は明らかに、ｐＫＭＹ５ｊ７を含む細胞 が、誘導物質の存在下に増殖すると、最高レベルのカテコール２．３〜ジオキシ ゲナーゼ活性が観察されることを示す。

第１表 Ｐ＋＋ｉｄｏｍｏｎｘ＋　ｐｉｉｄｘにおける、　ＮＡｌ１７由来プラスミド　 ＮＡＨ７、および、プラスミド・ベクター９ＫＭＹ３１９のカテコール２，３− ジオキシゲナーゼ遺伝子の発現 カテコール比活性 ２．３ジオキシゲナーゼ プラスミド　ホスト細胞　（μｍｏｌ−ロー１．　ＩＩｇ−１，）９ＫＭＹ５ｉ ７非誘導　Ｐ、ｐａｌｉｄｘ　Ｇ５？２　［，７９ＫＭＴＳ１７誘導　Ｐ、ｐａ ｌｉｄｘ　Ｇ５７２　２０．０この結果から、ｐＫＭＹ３１９は、調節された遺 伝子発現を達成する発現ベクターとして宵月であることが証明された。ＮＡＩ（ ７から得られたカテコール２．３−ジヒドロゲナーゼのレベルと、ｐＫＭＹ５＋ ７から得られたものとを比較すると、実験条件下で２５倍の過剰生産が認められ た（第１表）。プラスミド、ＫＭＹ５１７を有するＰ、ｐａｔｉｄＪで生成され るその他の蛋白質にたいする、カテコール２，３−ジヒドロゲナーゼの相対的生 産量を、ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲルによって分析した（第５図）。５ＤＳ −ＰＡＧＥは、はぼ、Ｌｓｅｍｍｘｌｉ、１９７Ｇ、ＮＪｌａｒｅ　２旦６８０ −６８５１：従って行なった。蛋白質サンプル（前記のように調製された粗抽出 物）を、ゲルにロードする前に２％ＳＤＳ、５％２−メルカプトエタノール、Ｌ Ｏ％グリセロール、００２％プロモフニノールブルー、および、６２．５　ａＭ 　Ｔｒｉｍ−Ｃｌ　（ｐｆｌ　６．８）を含むローテンクハッファー中で、６５ ℃で、１５分加熱した。ゲルをクマラン−ブルーで染色し、レーザー密度計で走 査した（υ目＋ｘｓｃｘａ　ＩＬ、　Ｐｈｘ＋ａｎｃｉ＋ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｅ ｈａｏｌｏＨ，ｌ口ｅ、、Ｐｉ＋ｃａｌｘ曹ｔ７．　ｔｌｌ　０８８５４　）　 。これ；こよって、蛋白質の相対的生産量を定量した。第５図に示すように、レ ーン１．１０は分子量標準である（鶏卵白リゾチーム、１４、４００、大豆トリ プンンインヒビター、２１．５００＋牛カルボニツクアンヒドラーゼ、３１．０ ００：鶏卵白オフアルブミン４２，６９９．血清アルブミン、６６、２００．ウ サギ筋フォスフォリラーゼｂ１９７、４００）。レーン４と５は、ＰＡＳ　ｌこ おける　ＰｐＹ１００６のそれぞれ誘導、非誘導の場合である。レーン８と９は 、Ｌブロスにおける　ＰｐＹ１００６のそれぞれ誘導、非誘導の場合である。カ テコール２．３−ジオキシゲナーゼのほぼ同割合が、培養体をＰＡＳ培養液の中 で増殖させ〆ても、Ｌグロスの中で増殖させても、生成した。カテコール２，３ −ジオキシゲナーゼの生成量は、細胞の全可溶性蛋白質の〜［０％を占めたく第 ５図、レーン４と８〕。この結果から、ｐＫＭＹ３１９発現ベクターは、遺伝子 産物の過剰生産にとって有効であることが実証された。

ＰｐＹＩＱＯＧ株細胞を、１０μｇ／ｎｌのテトラサイクリンを含む、５０１の Ｌブロス中で、３０℃で増殖させ、誘導物質としての、０．３５ｗＭサリチル酸 ナトリウムの存在下、または、非存在下にＯ，０，５５０＝約４５の密度に至ら しめた。Ｐ９ＹＩ００９株は、プラスミドｐＫＭＹ５２０を含むＰ＋ｅｕｄｏｍ ｏｎｓ＋　ｐａｌｉｄｘ　Ｇ５７２　（Ｓｈｘｈｘｍ　ｃｌＩｌ、上記）である 。細胞懸濁液の分岐（３−１０μｍ）を、キュベツト中で、水とアッセイバッフ ァー３０μｍと、全容量［００μｍに混合した。キュベツトを、ルミノメータ− １例えば、Ｌ［１ＭＡＣ８１０ＣＯＵＮＴＥＲ１１２５００（ＬＵｉｌＡＣＢ、 Ｙ、、Ｐ。Ｏ，ＢＯ！　３１１０１゜６３７０　ＡＣＬａｎｄｇ＋＋＊［、オラ ンダ）に装着した。発光反応は、５１Ｍクエン酸バッファー、ｐＨ５，５中１ｍ １ｌのルシフェリン（Ｓｉｇｍｉ　Ｃｂ＋ｉｉ＋ｔｌ、Ｓｔ、Ｌｏａｉｘ、ＭＯ ６３１７８）　１００　ｔｔ　ｌ　、および、水中　１００ｍＭγＡＴＰＩｆｌ Ｑμ［を注入して、開始した。

（ＢＩＯＣＯ［ｌＮＴＥ１１　Ｍ　２５００は、マイクロプロセッサ−によって コントロールされる、きわめて高感度のフォトン・カウンターであり、このよう な分析では、ｒＡ２モード」で操作した。）生成した光は、ルミノメータによっ て、相対光単位（ＲＬ　Ｕ）で表されて表示された。（Ｂｉｏｃｏｏｎ＋＋＋メ ーカーの指示によれば、光増倍管は、１００μｍの　ＬＵＭＩＴ−ＰＭ中の　２ ００　ｐｇ　ＡＴＰが７．２００ＲＬＵを与えるように較正する。）データは、 ルシフェラーゼの比活性（ＲＬσ／μｇ蛋白質）として表された。蛋白質濃度は 、Ｂｒ！ｄｌｏｔｄ、１９７６、　上記の方法と、Ｂ１０−Ｒｉｄ蛋白質定量キ ットヲ用いて、実施例９に記載したやり方で測定した。蛋白質定量前に、細胞を 、Ｏ，ＩＮ　Ｎ＋Ｏ［Ｉに再懸濁し、沸騰水浴で２０分間インキュベートし、蛋 白質を変性させた。

第１１表 Ｐ＋＋ａｄｏｍｏ口＋＋　ｐａｌｉｄｘおよびＥ＋ｃｂｅ「ｉｃｈｉｇ　ｅｏｌ ｉにおける、発現ベクター　ｐＫｉｌＹ２９９による、ホタルＰｈｏｔｉｎａ＋ 　ｐ７＋＋ｌｉ＋のルシフェラーゼ遺伝子の発現 ルシフェラーゼの比活性 プラスミド　ホスト細胞　（μｇ蛋白質当り　ＲＬＵ）　’山７５２Ｇ非誘導　 Ｐ、　ｐａｌ山Ｇ５７２　４．５ｘｌＯ’ａ、プラスミドｐＫＭＹ５２０は、ホ タルルシフェラーゼ遺伝子を含む挿入体を担持するρＫＭＹ２９９である。

ｂ１本実施例１０で記載した通りに、Ｌブロス中で増殖した細胞。

Ｃ，ルシフェラーゼ遺伝子を有さない細胞は、μｇ蛋白質当り３０　ＲＬσ未満 のバックグラウンド値を与えた。

Ｐ、ｐａｔｉｄｘにおけるルシフェラーゼ蛋白質生成も、５ＤＳ−ＰＡＧＥによ り分析した。方法は、カテコール２．３−ジオキシゲナーゼの分析に関して、実 施例９で記載したものに従った。９ＫＭＹ５２Ｇを有する、非誘導のｐ、　ｐＩ ｌｔｉｄｉ細胞におけるルシフェラーゼの生成は、細胞を、ＰＡＳ培養液で（第 ５図、レーン３）、または、Ｌブロスで（第５図、レーン７）増殖させた場合、 ＳＤＳゲル上でかろうじて見える程度であった。一方、高感度のルシフェラーゼ アッセイを用いると、上の案ｒ■表に示すとおり、ｐ［ＭＹ５２０を有する非誘 導のＰ、　ｐｕｌｉｄｉないし　Ｅ、ｃｏｌｉ細胞から１比較的高度の酵素活性 を検出することができた。このアッセイかになった（第１Ｉ表）。Ｓ［１Ｓ−Ｐ ＡＧＥ分析から、ｐＫＭＹ５２０を有する、被誘導Ｐ、ｐｎｌｉｄａにおいて生 成されたルシフエラーゼの量は、全可溶性蛋白質の〜３７％を占めた。これは、 細胞を、ＰＡＳ培養液（第５図、レーン２）で育成しても、Ｌブロス（第５図、 レーン６）で増殖しても変わらなかった。上記の結果から、２種の、異なるグラ ム陰性ホスト細胞において、ｐＫＭＹ２９９由来の真核遺伝子が調節的に発現さ れることが証明された。

ｐＫＭＹ３＋９除去発現系構築およびアッセイ？＋ｕｄｏｏｏｎ＋＋　ａｅｎＱ ｏｃｉｎ＋　Ｈ［由来の　ＩｃＯ八ＢへＤＥＦ遺伝子クラスターは、クローンさ れ、配列決定されている。これについては、共に係属中の、共通に譲渡されたア メリカ特許出願第−−号、１９９０年９月−日出願に記載されているとおりであ り、引用することにより、ここに組み込むことにする。グラム陰性薗における調 節された発現ベクターとしてｐＫＭＹ３１９が有用であるかをさらにテストする ために、Ｐ、ｍ＋ｎｄｏｃｉｎｔ　ＫＲＩ由来のＴＭ○遺伝子クラスターを担持 する制限フラグメントを、ｐＫＭＹ３１９にクローンした。特に、ｌＫＭＹｊｌ ＋は、ＴＭＯ遺伝子クラスターを担持する、ｐＫＭｙ３＋＋の〜４，７ｋｂ皿１ −　Ｓ旦［フラグメントを、ｐＫＭＹ３１９にクローンすることによって構築し た。プラスミドｐＫｊＹ３４１ハ、ＴＭＯ遺伝子クラスターを担持する、ｐＫ１ １Ｙ３３６　ｃｖ〜４．７　ｋｂ　Ｘｂ＋１−８！ｍ［Ｉｌフラグメントを、Ｅ 、ｃｏｌｉベクターｐＴ？−５にクローンすることによって構築した。この　ｐ Ｋｉ１７３３６の構築は、前に引用した、共に係属中の、共通に譲渡された出願 に詳しく述べられている。ｌｌＫＭＴ３４２　［ＩＮ＾を制限酵素で分析するこ とにより、ｐＫ１１Ｙ３１９のマルチプルクローニング部位由来の５ａｃｌ−Ｋ ｐｎｌ−Ｘｂ＋ｌ　Ｕ　ンカーニよッテ結合された、Ｘｂ＋ｌ−５ｉｃｌフラグ メントの２個のコピーが、　ｐＫＭＹ３１９にクローンされていたことが判明し た。次ぎに、ＴＭ○遺伝子クラスターを担持する　ｐＫｌｌｌＹ３４２組み換え プラスミドを、下記の東Ｉｎ表に示すように、いくつかのグラム陰性細菌種に導 入した。ＴＭＯ遺伝子の発現は、誘導および非誘導条件下で測定した。トルエン ・モノオキシゲナーゼ定量法（アッセイ）については、既に、共に係属中の、共 通に譲渡されたアメリカ特許出願第−−号、１９９０年９月−日出願、に記載さ れており、前に引用して、ここに含めた。第１ＩＩ表から明かなように、テスト した全ての細菌種について、非誘導培養体に比べ、トルエン・モノオキシゲナー ゼの、有意に高い比活性が、誘導培養体から観察された。この結果から、グラム 陰性園における調節された発現を達成する発現ベクターとしてｐＫｉｌＹ３１９ の広範な有用性が実証された。

第１１１表 グラム陰性菌における、プラスミド・ベクターｐＫＭＹ３１９由来Ｐ＋ｅａｄｏ ｍｏａｚ＋　ｍ！ｎｄｏｃｉａｘ　ＫＲＩの、トルエン・モノオキシゲナーゼ遺 伝子クラスター＾ＢＣＤＥＦの発現トルエン・モノオキシゲ不−ゼｂ 細菌種１　の比活性（ｎｍｏｌｅ　ｍｔｎ　ｔｎｇ　）Ｅ＋＋ｈｅｒｉｅｈｉｚ 　＋ｏｌｉ　Ｙ５２５０　非誘導　０，９ａ　細菌種はすべて組み換えプラスミ ドρＫＭＹ３４２を含む。このものは、Ｐ、　ｍｅｙｄｏｃｉａｚ　ＫＲＩ　由 来のトルエン・モノオキシゲナーゼ遺伝子クラスターを含む挿入体を担持する　 ｐＫ１１Ｙ３１９である。

ｐＫＭＹ３４２を導入した親種は、すべて、天然の単離種である。

ｂ、＋−ルエン誘導、非誘導上ｌＩ！ｎｄｏｅｉｎｘ　［２１細胞の比活性は、 それぞれ、３０．　０．５　ｏｍｏｌ＋　ｗｉｎ−’　ｍｇ　−’ｔ’あった。

」ΩＩ認識部位は、ＡＴＧ配列で終わるのであるから、配列ＡＴＧで始まる遺伝 子の５′末端を、血１部位を生成するように変更すれば、それは、その遺伝子の コード特性に変化をもたらさない。これは、発現用遺伝子の正確なりａ−ニング にとって適切な５°末端制限部位を設けるのに理想的なやり方であり、しかも、 たかだか３個のヌクレオチドの変更しか必要としない。遺伝子の開始コドンをコ ードする配列ＡＴＧにたいして５゛である３個のヌクレオチドは、部位指向性突 然変異によって、特異的に、ＣＡＴに変換することができる。これによって、ｐ ＫｉｌＹ２９９広範ホスト範囲の発現系にクローンされる」旦［認識部位が形成 されたことになる。

部位指向性突然変異は、従来方法（例えば、Ｓ！ｌＩｂ＋ｏｏｋ　Ｎｔｌ、、１ ９８９．　ｉｌｏｌｅｃａｌｉｒＣｌｏｏｉｎｇ−Ａ　ＬｘｂｏＨｔｔｏ＋７１ １ｘｏａ＋ｌｆｓ！＋ｏｎｄ　Ｅｄ口ｉ０ｎ］、Ｃコｌｄ　Ｓｐｒｉｌｌｇ　Ｈ ｚ＋ｂｏ＋　Ｌｘｂｏ＋１ｔｏ＋７　Ｐ！Ｉ１１゜Ｈ４の第１５章、また、ＣＧ ！＋！０１　Ｐ４Ｏ１０（０：ｌ　ｉｎすｏｌ＋＋ａｌａ＋８ｉｏｌｏｇ７．　 Ａｕ＋ｕｂｅｌ　ｅｔ　＋１．、　＋ｄ＋、、　１９８９．　Ｇ：　ＩＬａｒ　 Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ＾ｌ５ｏｃｌ＋＋ｔｓ　ｉｏｄ　７ｉｌ＋７−１ａＨ＋＋ ＋ｉ＋ｎＣｅの東８章参照）、または、下記の諸手類を経ることによって達成す ることができる。すなわち、（ｉ）コード領域のすぐ内部に制限領域を配置する 、（１１）合成ヌクレオチド・リンカ−を、この制限部位に付着させる。このリ ンカ−は、この遺伝子の読み取りフレームを回復し、その５゛　末端に　Ｎｄ＋ １部位を含むものである。後者のＢｏ＋ｏｅｔｔｅ　ｅｌ　＋１．、　１９８ｇ 、上記、まタハ、上の実施例８に見ることができる。このような改変遺伝子は、 本発明にしたがって、ｐＫＭ７２９９広範ホスト範囲の発現系にクローンするの に有用である。

百 Ｆ工ＧＩＪＲＥ　４ 要　約 肩部されるプロモーターＰＧ１マルチプルクローニング部位、転写ターミネータ −１およびテトラサイクリン耐性を与える遺伝子を含むクローニング・カートリ ッジ。このカートリッジは、適当なプラスミドに挿入して、新規の発現ベクター を形成することができ、しかも、そのベクターにおいては、高度の遺伝子発現が 、安価で、無害な誘導物質を低濃度で用いることによって誘導可能である。

国際調査報告 Ｐｅｒ／＋１５９１１０６００６

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. １．プラスミドＮＡＨ７由来の正の調節遺伝子ｎａｈＲ．ｎａｈＲによって調節 されるプロモーターＰＧ、マルチプルクローニング部位、転写ターミネーター、 および、テトラサイクリン耐性を与える修飾遺伝子を含むクローニング・カート リッジ。
2. ２．プロモーターＰＧは、開始コドンをコードするＡＴＧ配列の上流に、Ｎｄｅ ｌクローニング部位を生じるように変更された、３個のヌクレオチドの配列を含 む請求の範囲第１項に記載のクローニング・カートリッジ。
3. ３．さらに、特徴付けされたクローン遺伝子を含み、その遺伝子の５′末端が、 その遺伝子のコードを変えることなしにＮｄｅｌ部位に変更されている請求の範 囲第２項に記載のクローニング・カートリッジ。
4. ４．特徴付けされたクローン遺伝子が、ルシフェラーゼである請求の範囲第３項 に記載のクローニング・カートリッジ。
5. ５．ＡＴＧ配列が取り除かれている請求の範囲第２項に記載のクローニング・カ ートリッジ。
6. ６．さらに、遺伝子、または、遺伝子クラスターを含む、クローン制限フラグメ ントを含む請求の範囲第５項に記載のクローニング・カートリッジ。
7. ７．クローン制限フラグメントが、カテコール２，３−ジオキシゲナーゼをコー ドする遺伝子を含む請求の範囲第６項に記載のクローニング・カートリッジ。
8. ８．クローン制限フラグメントが、トルエン・モノオキシゲナーゼをコードする 遺伝子を含む請求の範囲第６項に記載のクローニング・カートリッジ。
9. ９．請求の範囲第１項に記載のクローニング・カートリッジを含む細菌発現ベク ター。
10. １０．請求の範囲第２項に記載のクローニング・カートリッジを含む細菌発現ベ クター。
11. １１．請求の範囲第３項に記載のクローニング・カートリッジを含む細菌発現ベ クター。
12. １２．請求の範囲第５項に記載のクローニング・カートリッジを含む細菌発現ベ クター。
13. １３．請求の範囲第６項に記載のクローニング・カートリッジを含む細菌発現ベ クター。
14. １４．ｐＫＭＹ２９９を含む細菌発現系。
15. １５．ｐＫＭＹ３１９を含む細菌発現系。
16. １６．請求の範囲第１項に記載のクローニング・カートリッジを含み、異種遺伝 子に作動的に結合している細菌ＤＮＡ発現単位。
17. １７．請求の範囲第２項に記載のクローニング・カートリッジを含み、異種遺伝 子に作動的に結合している細菌ＤＮＡ発現単位。
18. １８．請求の範囲第５項に記載のクローニング・カートリッジを含み、異種遺伝 子に作動的に結合している細菌ＤＮＡ発現単位。
19. １９．請求の範囲第９項に記載の細菌発現ベクターによって形質転換されたホス ト細胞。
20. ２０．請求の範囲第１０項に記載の細菌発現ベクターによって形質転換されたホ スト細胞。
21. ２１．請求の範囲第１１項に記載の細菌発現ベクターによって形質転換されたホ スト細胞。
22. ２２．請求の範囲第１２項に記載の細菌発現ベクターによって形質転換されたホ スト細胞。
23. ２３．請求の範囲第１３項に記載の細菌発現ベクターによって形質転換されたホ スト細胞。
24. ２４．請求の範囲第１４項に記載の細菌発現ベクターによって形質転換されたホ スト細胞。
25. ２５．請求の範囲第１５項に記載の細菌発現ベクターによって形質転換されたホ スト細胞。
26. ２６．請求の範囲第１６項に記載の細菌発現ベクターによって形質転換されたホ スト細胞。
27. ２７．請求の範囲第１７項に記載の細菌発現ベクターによって形質転換されたホ スト細胞。
28. ２８．請求の範囲第１８項に記載の細菌発現ベクターによって形質転換されたホ スト細胞。
29. ２９．細菌ホスト細胞に、蛋白質を誘導的に発現させる方法であって、 （ａ）ホスト細胞を、請求の範囲第１６項に記載の細菌ＤＮＡ発現単位で形質転 換し、 （ｂ）形質転換されたホスト細胞を、適当な培養液中で増殖させ、 （ｃ）誘導物質を添加することによって、形質転換されたホスト細胞に、蛋白質 を発現するよう誘導することからなる該方法。
30. ３０．ホスト細胞が、グラム陰性菌細胞である請求の範囲第２９項に記載の方法 。
31. ３１．誘導物質が、サリチル酸ナトリウム、または、サリチル酸ナトリウム類似 体である請求の範囲第３０項に記載の方法。