JPS60224500A - エステル分解酵素及び／又はタンパク質分解酵素の検出用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、例えば体液中のエステル分解および／または
タンパク質分解酵素の分析検出用試剤に関し、エステル
は適当な方法で試験試剤、特に試験片に組み込まれてい
る。本発明の試剤は、酵素の発色性基質（適当なフェノ
ール類のアミノ酸エステルまタハペプチドエステル）お
よび適切な場合はフェノール類とカップリングして色を
生ずるジアゾニウム塩以外に、アミノ酸エステルまたは
ペプチドエステルの酵素的分解の促進剤としてウンデカ
ノールをも含んでいる。この試剤は白血球、特に尿中の
白血球の検出に好適に用いられる。

体液、特に尿中の白血球の検出祉、腎臓および尿・生殖
管の病気の診断に大変重要である。この検出は元来、遠
心分離しない尿または尿沈渣中の白血球を数えて行った
が、この二つの方法では損われない白血球だけが記録さ
れる。所が白血球の溶解速度は尿の媒質によって大幅な
変動を受け易く、従って例えば、強アルカリ性の尿中で
は、白血球の半減期は僅か６０分であることが知られて
いる。このことは測定した白血球数が少な過ぎることを
意味する。この溶解誤差はさておいて、遠心分離しない
均質化された尿中の白血球の拍１微鈍による定量的測定
に従えば、血球計算板に正確な値が得られる。しかしな
がらこの方法は面倒で時間がかかり、訓練された係員が
必要なので、実際上まれに用いられるだけである。

従って、医学的に実施される尿中の白血球の好ましい測
定法は、いわゆる尿沈渣についての視野法であった。そ
のためには遠心分離によって先ず試料（沈渣）を得なけ
ればならなかった。しかし尿の他の成分もそれによって
濃縮され、例えば塩分や上皮細胞のような成分のために
、白血球の顕微鉋、による計数がかなり困難になる。ま
た沈渣含有量の変動、沈渣の不均質性および顕微鐘の光
学的設泪の相違によって、白血球の計数の際に比較的大
きな誤差（数百チまで及ぶことがある）が生じた。゛ このような画点を避けるために、種々の体液中の白血球
を検出する原理として、酵素反応を利用するいくつかの
試みが既になされている。それというのも白血球は幅広
く広がった酵素スペクトルを有しているからである。

このように、例えばドイツ公開明細舎弟２，８２６．９
６５号および第２，８３６，６４４号からは、体液中の
白血球検出用試剤が知られておシ、そこでは白血球中に
存在するエステル分解および／またはタンパク質分解活
性が分析目的に利用されている。

白血球のエステラーゼおよび／またはプロテアーゼの基
質としてはスルホンフタレインエステルまたはアゾ染料
エステルが用いられる。酵素反応で遊離する染料は次に
既知の方法で測定される。しかしこれらの刊行物に記載
されている試剤は、低濃度の白血球について用いる時は
反応時間が長過ぎるため、実際上の目的には未だ感度が
低過ぎる。

プロテアーゼおよびエステラーゼの種々の検出法はｉｎ
化学的および細胞化学的酵素学からも知られている（例
えばニー・ジー・イー・ピアース（Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｐｅａ
ｒｌＩｅ）著：組織化学の理論と応用第３版、チャーチ
ル・リビングストーン、エジンバーアーロンドンーニュ
ーヨーク（Ｃｈｕｒｏｈｉｌｌ　Ｌｉｖ−ｉｎｇｓｔｏ
ｎｅ、　Ｅｄｊｎｂｕｒｇｈ　−Ｌｏｎｄｏｎ　−Ｎｅ
ｗ　Ｙｏｒｋ　）１９６８年参照）。一般に検出には無
色かまたは僅かに着色したエステルが用いられ、このエ
ステルは酵素によって無色の岐および同様に無色のアル
コール（フェノール）類成分に分解される。それからこ
のフェノール類成分は次の反応、例えばジアゾニウム塩
とのカップリングまたは酸化によって着色生成物に変換
される。例えばエフ・シュマルツル（Ｆ、Ｓｃｈｍａｌ
ｚｌ）およびエイチφブラウンシュタイナー（ｌ（，１
３ｒａｕｎｓｔｅｉｎｅｒ）は例えば、クリソ・ブシー
ル（Ｋ１１ｎ、Ｗ８ｏｈｒ　）　４６　、６４２　（１
９６１３）に、基質としてのナフトール−ＡＳ　−Ｄ−
クロロアセテートと遊離したナフトールと反応して着色
したアゾ化合物を生ずるジアゾニウム塩とを用いた白血
球エステラーゼの特殊な細胞化学的検出法について述べ
ている。

しかしこのような型の二成分系は、例えば尿のような体
液中の白血球の迅速且つ簡単な検出には不適当であるこ
とがわかった。それというのもこれらの感度が低過ぎる
からで、１μｔについて、５０００個の白血球を含む試
料でも反応を示さない。

英国特許第Ａ−１１１２８，３７１号および欧州特許第
Ａ−１２，９５７号は、体液中の加水分解酵素の検出用
の発色性基質として、インドキシルエステルおよぎチオ
インドキシルエステルを用いることを開示している。基
質が酵素によって分解すると、遊離のインドキシルが生
じ、次にこれが酸化されて容易に検出できる青色染料の
インジゴになる。欧州特許第Ａ−１２，９５７号に基い
た商業的に利用できる試験は、Ｎ−トシル−Ｌ−アラニ
ンインドキシルエステルを含浸させた沖紙片から成って
いて、この試験片を白血球を含んだ尿試料に浸すと、色
が青くなる。しかし着色の終結点に竣し、試験を評価で
きるまでの待ち時間が長いことが、このυす品の大きな
欠点である。

欧州特許第Ａ−１４，９２９号は、酵素的分解反応に用
いる神々の促進剤（ピリジン誘導体、イミダゾール誘導
体、アルカリ土類金属錯体）について述べているが、イ
ンドキシルの酸化が完了する凍での時間が比較的長いこ
と、および試１験の感度が低いこと（検出限界：μｔに
ついて数十個の白血球）が欠点となっている。欧州特許
第Ａ−３４，３２３号に従って、白血球酵素の基質とし
て、ロイコ−インドアニリンのエステルを使用すること
についても、同じことがあてはまる。

欧州特許第Ａ　−３９，８８０号は、上述したジアゾニ
ウム塩とのカップリンクによる検出原理と、欧州特許第
Ａ−１２，９５７号および同第Ａ　−１４，９２９号に
よる基質との組合せを提示している。この方法では白血
球の抄出限界をかなり小さくすることができるが、実用
上望ましい１５〜２０白血球／μｔ　という検出感度は
まだ達成されない。

それ故、本発明の目的は、白血球の酵素による基質の酵
素的分解が促進される結果、尿中の白血球が感度よく月
つより迅速に検出されるようなエステル分解酵素用の新
しい促進剤を見出すことであった。そして驚くべきこと
には、ｎ−ウンデカノールが白血球の酵素を著しく活性
化させることが今回わかった。欧州特許ＭＡ　−１４，
９２９号には白血球酵素の有力な活性剤としてアルコー
ル類が開示されており、該アルコ・−ル１９ｊは、欧州
判許第Ａ−７，４０４号、同第Ａ　−８，４２８号およ
び同第Ａ−１２，９５７号に記載のアリールエステルの
分解をかなシ促進すると記されている。以前に既に記載
されてい駁ジー・ゴモリ（Ｇ、Ｇｏｍｏｒｉ）　、ジェ
ー・ヒストケムφサイトケム（Ｊ、Ｈｉｓｔｏｅｈｅｍ
、（：ｙｔｏ−ｃｈｅｍ、）　６．　４６９（１９５３
）；エイテ拳しフラー（Ｈ。

ＬＶｆｆｌｅｒ　）、　クリン・ヴオッヘンシュル（）
（ｌｉｎ・Ｗｏｃｈｅｎａｅｈｒ、）　３９．１１２０
　（１９６１）並びにエル・フィッサー（Ｌ、Ｖｉｓｓ
ｓｒ　）およびイー・プロウド（Ｅ、Ｂｌｏｕｔ）、フ
ェト・プσり（Ｆｅｄ、”　ｐｒｏｃ、）　２８゜４０
７　（１９６９）、　並ヒにバイオキム・バイオフィズ
ーアクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃ
ｔａ　）　２６８゜２５７（１９７２）、並びにエフ会
スウィートマン（Ｆ。

Ｓｗｓｅｔｍａｎ）およびエル・オルンシュタイン（Ｌ
２０ｒｎｓｔ＠ｉｎ）、　シェー嗜ヒストケム・サイト
ヶム（Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、ｃｙｔｏａｈｅｍ、）
　２３．３２７（１９７４））基質の酵素的分解もアル
コール類によって著しく活性化される。

欧州特許第Ａ　−１４，９２９号には、一般式がＲ−Ｏ
Ｈ（但１．、Ｒはアルキル基）のアルコール類が活性剤
として記されている。

その出願に例示されているのは、ヘキサノール、ヘプタ
ツール、オクタツール、ノナノール、デカノール、ドデ
カノール、トリデカノールなどであるが、驚くべきこと
には今回、欧州特許第Ａ−１４゜９２９号に記載されて
いないｎ−ウンデカノールが、白血球酵素の活性化の点
で、上述のすべてのアルコール類よシもすぐれているこ
とがわかった。

このウンデカノールは、好ましくは液状試験において１
０−４〜１重量％、好ましくは１ｏ−３〜０．１重量％
の旋回（いずれの場合も試験溶液に対して）で用いる。

下記の試験具の製造では、０．０１〜１゜重量％、好ま
しくは０．５〜５ア丁量チの汲度でウンデカノールを含
浸液に加える。

本発明は、エステル分解および／またはタンパク質分解
酵素を検出する試剤に関するもので、この試剤は、（ａ
）酵素の発色性基質としてフェノール類のアミノ酸エス
テルまたはペプチドエステル、（ｂ）成分（ａ）のアミ
ノ酸エステル結合またはペプチドエステル結合の酵素的
分解を促進する物質としてアルコール、更に適切な場合
に（Ｃ）ジアゾニウム塩、適切な場合に（ｄ）緩衝液、
また適切な場合に（＠）ｍ体および／または普通の添加
物を含んでいて、促進物質としてｎ−ウンデカノールを
用いる仁とを特徴とするものである。

最後に、本発明はまた液体試料、特に体液中のエステル
および／またはタンパク質分解酵素を検出する方法に関
し、その特徴とする所は、本発明の試剤に試料を接触さ
せ、生じる呈色反応を測定することである。

本発明に使用されるべきｎ−ウンデカノールは、以前に
既に記述されている〔ジー・ゴモＩＪ（Ｑ。

Ｑｏｍｏｒｉ　）、ジェー・ヒストケム・サイトケム（
Ｊ。

ＨｉｓＬｏｏｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｎｎ、）　６，
４６９（１９５３）、エイチーＬ／７ラー（Ｈ＝　ＬＭ
ｆｆｌｅｒ　）、クリ７−ヴオノヘンシｘ　ル（Ｋ１１
ｎ、Ｗｏｃｈｅｎａｅｈｒ、）　３９．１１２０（１９
６１）。

エル・フィッサ−（Ｌ、　Ｖｉｓｓｅｒ）およびイー・
プロウド（Ｅ、　Ｂｌｏｕｔ）、　フェト・ブロク（Ｆ
ｅｄ、Ｐｒｏｅ、）２８、４０７（１９６９）並びにバ
イオキム・バイオフィズ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｅｔａ　）　２６８゜２５７（１９
７２）並びにエフ・スウィートマン（Ｆ。

３ｗｅｓｔｍａｎ　）およびエル・オルンシュタイン（
Ｌ。

０ｒｎｓＬｅｉｎ　）、ジエー・ヒストケム命すイトケ
ム（Ｊ、ｄｌｌｔｏｏｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、）
　２３．３２７（１９７４）基質の分解のみならず、欧
州特許第Ａ−７，４０４，８，４２８，１２，９５７，
１４，９２９，３４、３２３および３９．８８０号に記
載されている基質の白血球酵素による酵素的分解を促進
する。

本発明の試剤中の好適な発色性基質としては、平行する
出願に記載されている次のような一般式を有する化合物
も含まれる。

式中、 Ｘ、およびＸ、は同しかまたは異なっていて窒素または
イオウを表わす。但しＸＩおよびＸ、は同時にイオウを
表わさない。

Ｒ，は水素、または場合によって分校状化した、炭素原
子数１〜６個のアルキル基を表わし、これら社場合によ
ってはハロゲンまたは水酸基で徴、換されていてもよい
。

Ｒ，によびＲ３は同じかまたは異なっていて、水素、Ｃ
１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ３〜Ｃ８のアルコキシ基、Ｃ
１〜Ｃ６のアシル基、ハロゲン、トリフルオロメチル、
ニトロ、Ｓｏ、ｆ（％シアノ、Ｃ１〜Ｃ８のアシル−ア
ミノ基、アルキル基のそれぞれがＣ８〜Ｃ６のジアルキ
ルアミノ基またはＣ６〜ＣｔＯのアリール基で、これら
はまたＣ３〜らのアルキル基、Ｃ，−Ｃ，のアルコキシ
基、ハロゲン、シアン、ニトロ、トリフルオロメチル、
Ｓｏ、Ｈ、Ｃ，〜Ｃ０のアシル基またはＣ８〜Ｃ６のジ
アルキルアミノ基で置換されていてモヨく、または Ｒ，およびＲ８は一緒になって縮合芳香環、好ましくは
ベンゼン環を形成し、これも同様に一つまたは二つの基
Ｒ７で定義したような基で置換されてもよく、 Ａはアミノ酸基またはペプチド基を表わし、Ｇは水素ま
たは好ましくは、ペプチド化学における普通の窒素保ｄ
基またはそのような基から誘導される窒素保護基を表わ
す。

一般式（６）を有する好適な化合物は、Ｘｌがイオウを
表わし、Ｘ！が窒素を表わすものである。Ｒ１が水素を
表わす式（６）の化合物、及びＲ１およびＲ３（同じか
または異なっている）が水素、Ｃ，％　Ｃ，のアルキル
、Ｃ１〜Ｃ７のアルコキシ、ハロゲン、アルキル基のそ
れぞれがＣ８〜Ｃ４のジアルキルアミノ基またはベンゼ
ン基を表わす式ＯＩ）の化合物が一層好適である。

式（ＩＯの化合物中のエステル基は、５−位にあるのが
特に好オしい。

本発明によシ好適とされるその他の発色性基質は、平行
する出願に同様に記されている化合物で、　□次のよう
な一般式を有するものである。

式中、 Ｋ３およびＫ４はＮまた祉ＣＨを表わす。但し、いずれ
の場合でもＫ３または為の一方はＮを表わす。

Ｒ４１Ｒ１１およびＲ６は同じかまたは異なっていて、
水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ８〜ＣＩ、のアルコ
キシ基、Ｃ，−Ｃ，のアシル基、ハロゲン、トリフルオ
ロメチル、ニトロ、８０３Ｈ，シアノ、Ｃ８〜Ｃ６のア
シルアミノ基、アルキル基のそれぞれがＣＩ〜Ｃ６のジ
アルキルアミノ基、またはｃ、　−ｙ　ｃ、。のアリー
ル基を表わしこれらはＣ１〜Ｃ０のアルキル基、Ｃ，−
Ｃ，のアルコキシ基、ハロゲン、シアノ、ニトロ、トリ
フルオロメチル、５Ｏ３Ｈ％　”Ｉ〜Ｃ６のアシル基ま
たはアルキル基のそれぞれがＣ１〜Ｃ１ｌのジアルキル
アミノ基で置換されてもよく、または Ｒ６およびＲ６は一緒になって縮合芳香環、好ましくは
ベンゼン環を形成し、これらは１または２個の基Ｒ４で
定義したような基で置換されてもよく、ＡおよびＧは式
（ＩＩ）の場合で上述したような意味を有する。

一般式ＯＩＯ紮有する化合物においては、Ｘ、は好まし
くはＣＨを表わし、為は好ましくは窒素を表わす。Ｒ４
，Ｒ，およびＲ６は同じかまたは異なっていて、好まし
くは水素、Ｃ０〜Ｃ４のアルキル、Ｃ１〜Ｃ４のアルコ
キシ、アシルアミノ（ここで酸基ハｅｔ〜Ｃ０の脂肪族
オたは芳香族でもよい。）、Ｃ１〜Ｃ４のジアルキルア
ミノ、ニトロ、シアノ、ハロゲンまたはアリールを表わ
し、これらは場合によってはＣ８〜Ｃ４のアルキル、Ｃ
１〜Ｃ４のアルコキシまたはノーロゲンで置換されてい
てもよい。特に好適なのは、Ｒ４゜馬およびＲ６が水素
、ＣＩ〜Ｃ４のアルキル、フェニル或いはハロゲンであ
るか、または烏およびＲ６が一緒になって綜合ベンゼン
環を形成するものである０ 本発明の試剤の適当な発色性基質としては、その他、次
のような一般式を有する化合物がある。

Ｏ 式中、 Ｒ４＊　Ｒ１１＋　Ｒ８＊　ＡおよびＧは式（ホ）の場
合に述べたような意味を有する。

一般式（［Ｉ）、ａｉ）および幌においては、Ｇ−Ａ−
は好ましくは次のような一般式を有する基を表わす。

１ Ｒ，−ｆ（Ｎ−Ｃ）ｌ−Ｃ− Ｒフ 式中、 Ｒ１は水素、または１〜１５個、好ましくは１〜９個の
炭素原子を有し、寸た場合によっては水酸基、メルカプ
トまたはカルボキシル基で置換されている、場合によっ
て分枝状化したアルギル、シクロアルキルまたはアリー
ル基を表わし、Ｒ６Ｉ′ｉ水素、または好ましくは−Ｃ
Ｏ−アルキル、−ＣＯ−アルアルキル、−ＣＯ−アリー
ル、−ＳＯ，−アルキル或いは−ＳＯ！−アリール（ア
ルキル基は１〜゛９個好ましくは１〜６個の炭素原子を
有する＠鎖状または分枝状で、アリール基は好ましくは
、場合によっては、Ｃｌ−Ｃ４のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ
４のアルコキシ基またはハロゲンで置換されたベンゼン
環を表わす。）を表わす。

Ｇ−Ａ−は、特に好ましくは慣用の窒素保繰基を有する
、天然産のアミノ酸またはこのようなアミノ酸の２〜８
個のペプチドの基を表わす。

このアミノ酸基は、ここではＬ一体でもＤ一体でもまた
ラセミ体であってもよい。特に好ましい基ハクリシン、
アラニン、バリン、ロイシン、インロイシン、フェニル
アラニン、およびチロシンの基で、し体はいずれの場合
でも特に好適である。

存在するどんな遊離の水酸基もアシル化、好ましくくけ
アセチル化してもよい。

Ａの定義におけるペプチド基は、例えばジー、トリー、
テトラ−１およびペンタペプチド、好捷しくはジーおよ
びトリペプチドを意味し、好適なアミノ酸成分は前記の
ようなアミノ酸である。

一般式（６）、■および幌を有する基質は対応するフェ
ノール類と、一般式Ｇ−Ａ−ＯＲ（式中、ＧおよびＡは
前述のような意味を有する。）を有するアミノ酸或いは
ペプチド、またはこれらの適当な反応性誘導体とを、ペ
プチド化学において普通に用いられる方法で反応させる
ことによってイせられる。

適当な反応性誘導体の例としては、例えば、クロロギ酸
エチル、または例えばペンタクロロフェニルエステルも
しくはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルのよ
うな活性エステルとの酸塩化物およびペプチド合成にお
いて通常使用される混合酸無水物がある。

不発・明の試剤は、好ましくは、フェノール類（酵素的
分解中に遊離する）と反応する発色剤として、次のよう
な一般式を有するジアゾニウム塩を含んでいる。

Ｒ′４Ｒ１ 式中、 Ｒ／、は低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキル
メルカプト、ヒドロキシ、ニトロ、シアン、トリフルオ
ロメチル、Ｃ１〜Ｃ８のアルキルスルホンアミド、アリ
ールスルホンアミド、０１〜Ｃ８のアルキルスルホン、
アリールスルホン、スルホン酸またはカロン酸もしくは
カルボン酸、Ｎ−モルホリノ、Ｎ−チオモルホリノ、Ｎ
−ピロリジノ、マタ場合によってＮ′−アルキル化され
たＮ−ピペラジノまたはＮ−ピペリジノ基、ハロゲンま
たは水素を表わし、 Ｒ′３は低級アルキル、低級アルコキシ、アリールオキ
シ、低級アルキルメルカプト、アルキルアミノもしくは
ジアルキルアミノ、ヒドロキシル、ニトロ、シアノ、Ｃ
１〜Ｃ＠のアルキルスルホンアミド−アリールスルホン
アミド、ｃ、−ｃ、のアルキルスルホン、アリールスル
ホン、スルホン酸もＬ＜Ｕカルボン酸、Ｎ−モルホリノ
、Ｎ−チオモルホリノ、またはＮ−ピロリジノ、また場
合によって、Ｎ′−アルキル化されたＮ−ピペラジノま
たはＮ−ピペリジノ、またはフェニルアミノ基、場合に
よっては低級アルキルもしくは低級アルコキシ基で置換
されたフェニル基、ハロゲンまたは水素を表わし、１？
’、　、　Ｒ７およびＲ１，は同じかまたは異なったも
ので、各々低級アルキル、低級アルコキシ、ニトロ、Ｃ
３〜Ｃ８のアルキルスルホンアミド、アリールスルホン
アミド、Ｃ８〜Ｃ６のアルキルスルホン、アリールスル
ホン、スルホン酸もしくはカルボン酸または低級アルキ
ルメルカプト基、ハロゲンまたは水素を表わし、Ｘは安
定化陰イオンを表わす。

尚、どんな場合でも、Ｒ１〜Ｒ／、の二つの隣接した基
が環化して、場合によっては゛ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ１１
のアルキル、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ、もしくはニトロ
、スルホン酸またはカルボン酸基で置換された、ベンゼ
ン環を形成し、その結果ナフタリン系のジアゾニウム塩
を形成することもできる。

一般式（ト）において、好ましくは、 Ｒ’ｌはＣ１〜Ｃ４のアルキル、Ｃ１〜Ｃ４のアルコキ
シ、ヒドロキシル、ニトロ、ハロゲンまたは水素を表わ
し、 Ｒ′３はＣｌ−０４のアルキル、Ｃ１〜Ｃ４のアルコキ
シ、アリールオキシ、Ｃ１〜Ｃ４のアルキルアミノ、ア
ルキル基のそれぞれが０１〜Ｃ４のジアルキルアミノ、
ニトロ、Ｃ１〜Ｃ４のアルキルスルホンアミド、アリー
ルスルホンアミド、Ｃ８〜Ｃ４のアルキルスルホン、ア
リールスルホン、Ｎ−モルホリノ、Ｎ−ピロリジノ、フ
ェニルアミノ、もしくはスルホンｆｋ？　基ｔたは水素
を表わし、 Ｒ’２．Ｒ−およびＲ′、は同しかまたは異なっていて
もより、Ｃ７〜Ｃ４のアルキル、Ｃｌ−Ｃ４のアルコキ
シ、Ｃ８〜Ｃ４のアルキルアミノ、アルキル基のそれぞ
れがＣ，−Ｃ４のジアルキルアミノ、ニトロ、Ｃ３〜Ｃ
４のアルキルスルホンアミド、アリールスルホンアミド
もしくはスルホン酸基、ノ・ロゲン、または水素を表わ
す。

いずれの場合でもＲ；〜Ｈ／、の二つの隣接した基は、
場合によっては環化して、場合により・・ロゲン、また
はＣ１〜Ｃ１のアルキル、Ｃｌ−０４のアルコキシ、ニ
トロ、またはスルホン酸基で置換されたベンゼン環を形
成してもよい。

（ト）式に関しては、各々の場合のアリールは６〜１２
個、好ましくは６個の炭素原子を有する芳香族基を表わ
し、場合によってはハロゲン、Ｃ４〜Ｃ４のアルキルま
たはＣ８〜Ｃ４のアルコキシで置換されていてもよい。

一般式（ト）を有するジアゾニウム塩はそれ自体既知で
あり、本来既知の方法（ホウペンーヴエイル（）ｌｏｕ
ｂｅｎ−Ｗｅｙｌ　）：有機化学の手法、第Ｘ／　３巻
）によって合成することができる。

本発明のタンパク質分解酵素および特に白血球酵素検出
用の試剤は、適当な緩衝系を含んでいることが好ましい
。この目的のために可能な系としては、例えばリン酸塩
、ホウ酸塩、炭皺塩／重炭酸塩、炭酸塩、バルビッール
酸塩、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（
−トリス）、２−アミン−２−メチル−プロパン−１，
３−ジオール（−アメジオール）またはアミノ酸緩衝液
があシ、ｐＨ値と容錆はル則として、？１１１１足酒液
中または試験片上において６〜１０、好ましくは７〜９
の一１値が羅立するようにがぶ。

場合によっては、本発明の試剤に、さらに洗剤を一部に
用いるのが有利であるかも知れ々い。というのもこうす
ることによって、一層物質な色の分布と一層襲い着色が
得られるからである。使用できる洗剤としては、陽イオ
ン性および陰イオン性洗剤、並びに両性および非イオン
性洗剤がある。

ここに記述してもよい例としては、ベンジル−ジメチル
−テトラデシルアンモニウムクロリド、ドテシル偵Ｃ岐
ナトリウム、ゼフィロール、ポリビニルピロリドン、ヘ
パリノイド（ｂｅｐａｒｉｎｏｉｄ　）、および塩基性
アミノ酸を含むホモポリアミノ酸またはコポリアミノ酸
〔イーΦ力チャルスキー（Ｅ、Ｋｌｌ−ｔｏｈａｌｇｋ
ｉ）およびエム・セラ（Ｍ、　５ｅｌａ　）　；アトパ
ンシス・オプ・プロティン・ケミストリー（Ａｄｖａｎ
ｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
）１３．　２４３　〜４９２（１，９５８）　；並びに
シー・ビー・アンフインゼン（Ｃ０Ｂ、　Ａｎｆｉｎｓ
ｅｎ）、エム・エル・アンソン（Ｍ。

Ｌ、Ａｎｓｏｎ）、ジェー・ティー・エドサール（Ｊ、
Ｔ。

Ｅｄｓａｌｌ）およびケー・バイレイ（Ｋ、　Ｂａ１ｌ
ｅｙ）（＠集者）；アカデミツク・プレス拳インク・パ
ブリッシャース（Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ、　■
ｎｃ、ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）。

ニューヨーク、ニューヨーク（Ｎｅｗ　ｌ’ｏｒｋ、　
Ｎ、Ｙ、）、］および逐次ポリアミノ酸がある。使用で
きる塩基性アミノ酸は、側鎖にアミン基またはグアニド
基を有するアミノ酸である。その中には特にアルギニン
の他にリジンおよびオルニチン、さらに例えばジアミノ
酸、ジアミノプロピオン酸またはジアミノピメリン酸な
どのような天然タンパク質中に生じない塩基性アミノ酸
も含まれる。ポリアミノ酸の成分となるアミノ酸は、ラ
セミ体でも、または光学活性のＤ一体もしくはＬ一体で
もよい。ポリアミノ酸の分子量は、１，０００〜２．．
０００，０００で、好ましくは、５，０００〜５００　
、０００である。塩基性アミノ酸の含有量はポリアミノ
酸に対して５〜１００モルチ、好ましくは２０〜１００
モルチである。

適切な場合は、前述の洗剤の二つ以上の混合物も用いる
こともできる。

洗剤は、好ましくは液状試験において１０〜１０−１重
量％、特に好ましくはｘｆ’〜１０−２重量−の濃度で
用いる。また含浸溶液中の含有量は、０．０１〜１０重
量％が好ましく、特に好ましいのは０．１〜５重量％で
ある。

白血球測定の際は、周囲に固定した試薬混合物の助けに
よって上記の洗剤を用いるのが特に有利である。という
のは、こうすることによって、一層物質な色の分布と、
一層濃い着色が得られるからである。

本発明の試剤では、上記の色々彦試剤は本来既知の型の
不活性担体に絹み込ませるのが好ましく、特に好ましい
担体マ）　ＩＪソックス、例えば特にＦ紙、またプラス
チック製の膜、ガラス繊維のマット（米国特許明細書記
３，８４６，２４７号）、多孔性のセラミック片、合成
不織布、スポンジ状材料（米国特許明細書記３，５５２
，９２８号）、フェルト、織物、木材、セルロースまた
はシリカゲルのような多孔性材料である。

この目的のために、例えば水、メタノール、エタノール
、アセトン、ジメチルホルムアミドまたはジメチルスル
ホキシドのような容易に除去できる適当な溶媒に、上記
の試薬を溶かした溶液を上記の担体に含浸させる。この
操作は別個の２工程で行うことが好ましい。即ち、緩衝
液やその他の水溶性添加物を含んだ水溶液を先ず材料に
含浸させる。次に、これに、一般式（ト）を有する酵素
の発色性基質および活性剤の溶液を含浸させる。しかる
。含浸液または被験液体はいずれの場合でも１０〜１０
−１　モル／１．　特に１０〜１０　モル／ｌ　の濃度
の発色性基質およびジアゾニウム塩、並びに０．０１〜
１０重ｆｉ′チ、特に０．５〜５重邪”チの湿度のウン
デカノールを含有することが好ましい。

マトリックスとして沖紙を用いる場合は、出来上った試
験紙はそのまま使えるが、また本来既知の方法で把持部
材に張りつけたり、または好ましくは例えばドイツ公開
明細舎弟２，１１８，４５５号に従って、プラスナック
と細かい網の目の網織物との間に封止してもよい。

フィルムで被慎した試験片を作るには、例えばポリビニ
ルエステルまたはポリアミドのようなフィルム形成物質
の溶液または分散液にすべての試薬をいれて、均質に混
合することが好ましい。そしてこの混合物の泡層をプラ
スチック製の押体の上に塗シ、乾燥する。乾燥後、得ら
れたフィルム被接試験片を切断して、そのまま使用して
もよく、または本来既知の方法で把持部祠に張υつけて
もよく、または例えばドイツ公開明細４．第２，１１８
゜４５５号に従って、プラスチックと細かい網の目の網
織物との間に封止してもよい。

本発明のエステル分解および／またはタンパク質分解酵
素、特に白血球酵素検出のだめの診断用試剤は、普通の
薬学的伶加物を上記の試験試剤の成分に加え、混合物を
粒状にすることによって、粉末状混合物または試薬錠剤
の形に作ることができる。このようなタイプの添加剤の
例としては、例えは単糖類、少糖類、多糖類のような炭
水化物、マンニトール、ソルビトール、キシリトールの
ような糖アルコール、またはポリエチレングリコール、
ポリビニルピロリドンのようなその他の可溶性不活性化
合物がある。粉末状混合物捷たは観？Ｖ錠剤の最終重量
は、通常、約５０〜２００弘好１しくは５０〜８０■で
ある。

それぞれ約５〜２０　＋＋ｙ、好１しくは約１０ｒｑの
全重量を有する凍結乾燥物を作るには、記載に必要なす
べての試薬の他に、例えばポリビニルピロリドンのよう
な普通の賦形剤、また適切な場合は、例えばマンニトー
ル、ソルビトール、キシリトールのような他の添加剤を
含んだ溶液を佃結乾燥する。

本発明の診断用試剤で溶液状のものは、試験に必要なす
べての試薬を含んでいる・ことが好ましい。

使用できる溶剤としては、水および、例えばメタノール
、エタノール、アセトン、ジメチルホルムアミドのよう
な水溶性有様溶剤と水との混合物がある。貯蔵上の理由
から、試験に要する試薬を二つ以上の溶液に分けて、実
際試験する間だけ一緒にするのが得策であろう。

このようにして作った診断用試剤は、被験体液に浸した
シ、対象となる体液に加えた後、色の形成によってエス
テル分解および／またはタンパク質分解酵素、特に白血
球酵素の存在を迅速月っ簡単に検出でき、その色の形成
は視覚によって、または例えば反射率光度測定法または
セル中で光度測定的に測定される。セル毎の白血球酵素
の活性は、本仙的に一定のパラメータと見なすことがで
きるので、被験体液の白血球の濃度は、形成した色の濃
さから測定できる。白血球酵素の活性は、白血球の溶解
後も十分保持されるので、この際損なわれない白血球も
溶解した白血球も共に記録される。従って溶解誤差は全
く起らない。

次の実施例は本発明の説明に役立つものである。

尚、別に指定しない限シ、記載しである量は重量部また
は重量％である。

実施説明客 基質に応じ、溶解剤として５０〜２５０μｔのＮ−メチ
ルピロリドンを、間融となっている緩衝液２．２５−に
加え、緩衝液を用いてその溶液の容量を２．５−とした
。次に、５〜ｌｏｏｒｎｇのｎ−ウンデカノールを１−
〇Ｎ−メチルピロリドンに溶がした溶液５μｔおよび２
キの　ドデシル硫酸す）　ＩＪウム（ＳＤＳ）またはそ
の他の洗剤４〜を１−の水またはＮ−メチルピロリドン
に溶がした溶液５μｔを反応混合物に加えた。十分に攪
拌後、１０’モルの、！’ＪｔをＮ−メチルピロリドン
、ジメチルホルムアミドまたはジメチルスルホキシドに
溶がした溶液５μｔを反応溶液に加え、白血球の慰濁液
を加えた後、指足した波長における吸光度の増加を連続
的に監視した。また基質の自然加水分解は、白血球を加
えない対照群で、吸光度の増加によって測定する。

反応速度を測定するために、酵・素反応で得られた吸光
度の増加から自然加水分解について測定した値を差引く
。基質の分解についての絶対値（モル数／分）は、モル
吸光係数によって吸光度の差から算出できる。

実施例　１ Ｐ紙（例えはイートン・アンド・ダイクマン（ｐａｔｏ
ｎ　ａｎｄ　［）ｉｋｅｍａｎ　）２０５　）に下記の
溶液を順次含浸させた後、６０℃で乾燥した。

−ｊ：ｉｉ；１２１．ｊ１！１；１１．−１！（エニ３
％のポリビニルピロリドンを含む０．１Ｍ　）　ＩＪス
ス−ヒドロキシメチル）−アミノメタン／塩酸緩衝液（
ｐＨ−８，８） 溶液２：無水アセトンｊｔ中に７．５・１０モルのＮ−
）シルーＬ−アラニン　５−ヒドロキシ−１゜２−ベン
ズイソチアゾリルエステル、１０モルの２．４−ジメト
キシベンゼンジアゾニウムテトラフルオボレートおよび
３，５２のｎ−ウンデカノールを含むもの。

白血球を含む尿中に浸すと、赤褐色に変化する淡黄色の
試験紙が得られる。

実施例　２ ８ＤＳまたは平均分子量１４　、０００のボＩＪ　ＩＪ
レジン加えた−８８の０．１　Ｍ　）リス−（ヒドロキ
シメチル）−アミノメタン／塩酸緩衝液中の白血球によ
るＮ−）シルーＬ−アラニンインドキシルエステルの酵
素的分解に対するアルカノール類の促進作用（３６ｏｎ
ｍで測定）。

第１表 ０、１　Ｍ　）リス−（ヒドロキシメチル）−アミノメ
タン／塩酸緩衝液（ＰＨ８，８）中で、５０μｔのＮ−
メチルピロリドン／試験群および１０μｍ／試験のＳＤ
Ｓの存在の下に、白血球によるＮ−）シルーＬ−７ラニ
ンインドキシルエステルの分解に対するｎ−ウンデカノ
ールの促進作用の濃度依存性（３６０ｎｍで測定）。

第２表 実施例　４ ０、ＩＭ）リス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン
／塩酸緩衝液こｐＨ８，４）中で、１００μｔのＮ−メ
チルピロリドンの存在下における白血球によるＮ−トシ
ル−し−アラニン　５−ヒドロキシ−１，２−ベンズイ
ソチアゾリルエステルの分解の活性剤および洗剤の添加
による促進作用（３２５ｎｍで測定）。

第３表 実施例　５ ０、１　Ｍ　）リス−（ヒドロキシメチル）−アミノメ
タン塩酸緩衝液（ｍ　ｓ、　ｓ　）中で、２５０μｔの
Ｎ−メチルピロリドンの存在下における白血球によるＮ
−）シルーＬ−アラニン　３−ヒドロキシ−５−フェニ
ルピロールエステルの分解の活性剤および洗剤の添加に
よる促進作用（３３０ｎｍで測定美第４表 ゼフィロールは約５０チ濃度の水溶液として用いた。

実施例　６ 枠々の０．１　Ｍ緩衝液（ｍ８．４）中における白血球
によるＮ−トシル−Ｌ−アラニン　３−ヒドロキシ−５
−フェニルビロールエステルの分解の、２５０μｔのＮ
−メチルピロリドン、並びに活性剤および洗剤の添加に
よる促進作用（３３０ｎｍで測定）。

第５シに トリス−トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン
塩酸緩衝液、ＢＤＴＡ−ベンジル−ジメチル−テトラデ
シルアミン塙酸塩、ポリアミノ酸の平均分子量は括弧内
に示しである。

Ｎ−）シルーＬ−アラニルエステル製造の一般操作説明
書 いずれの場合でもこのエステルは、粉末状炭酸カリウム
の存在下に、無水メチルエチルケトンまたは無水トルエ
ン中で、Ｎ−トシル−Ｌ−アラニルクロリドをフェノー
ル類と反応させて製造した。

約５５℃で６〜１２時間攪拌後、４０〜７０％のフェノ
ールが反応していた。フェノール：　Ｋ、Ｃｏ。

：酸塩化物のモル比は通常１：１．５：１．５であった
。また−値は全反応時間中、約７であった。仕上げのた
めに５０℃で炭酸カリウムをＦ別後、真空中で溶剤を留
去した。生成物はシリカゲル−溶離剤（石油エーテル：
アセトン＝・約９　：　１　）ヲ用いるカラムクロマト
グラフィー、′次いで再結晶によって精製した。

Ｌ−ｐ−トシルアラニン 文献；イー嗜フィノシ−ｙ　−（Ｅ、　Ｆｉｓｃｌｔｅ
ｒ）およびダプリュ’リプシッツ（Ｗ、　Ｌｉｐｓｃｈ
ｉｔｇ）、　Ｂ　、　４８゜３６２（１９１５） ８３、７　Ｆ　（０，９３モル）のＬ−アラニンを約２
Ｎの水酸化ナトリウム溶液４６５ｔｎｔに溶解した。

Ｐ−トルエンスルホニルクロＩＪ　）”　１８６　Ｆ　
（０、９７６モル）を、約７０〜７２℃で少しずつ２０
分かけてこの溶液に加えた。このスルホニルクロリド添
加中は、自動滴定装置を用い、約２Ｎの水酸化ナトリウ
ム溶液で反応混合物の−１を１０に保った。ここで２Ｎ
水酸化ナトリウム溶液５６〇−が消費された。反応混合
物の−が最早変化しなくなったら、混合物を１５〜５℃
に冷却し、３７チ濃度の塩酸で…を３にした。分離した
生成物を吸引沢過し、湿ったＦ塊を２，３５０−の水か
ら再沈澱させた。収量：融点１３２〜１３５℃のＬ−ｐ
−）ジルアラニン１８５．５Ｆ（理嗣量の８２％）ｐ−
）シルーＬ−アラニルクロリド 透明な溶液が生ずるまで、１５８゜ｌｊ’（０，６５モ
ル）のＬ−ｐ−）ジルアラニンを４０℃で３５０ｍ１の
塩化チオニル中で攪拌した。次に、過剰の塩化チオニル
を水流ポンプの真空下で留去した。フラスコ中の残渣を
３００−の蒸留トルエンにとった。透明な僅かに黄味が
かった溶液が得られ、これを９００−の攪拌したナフサ
に注いだ。酸無水物が沈殿した。翌日これを吸引治過し
、軽ガソリンで洗浄し、真空デシケータ−内で塩化カル
シウム／水酸化カリウム上で乾燥した。

収量：融点８１〜８３℃の殆んど無色の結晶１５５ｆ（
理論量の９１ｑ１＋）。

手続補止書 昭和６０年５月１５日 特許庁長官　志　賀　学　殿 １、事件の表示 昭和６０年特許願第　６９２４４号 ２、発明の名称 エステル分解および／またはタンパク質分解酵素の検出
のための試剤、方法及び活性剤 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　マイルス・ラボラトリーズ・ インコーホレーテッド ４、代理人 ５、補正命令の日付　自発

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）　（＆）酵素の発色性基質として、フェノール類の
   アミノ酸エステルまたはペプチドエステルおよび、（ｂ
   ）成分（−）のアミノ酸エステル結合またはペプチドエ
   ステル結合の酵素的分解を促進する物質として、アルコ
   ールを含有するエステル分解および／またはタンパク質
   分解酵素検出用の試剤であって、促進物質としてｎ−ウ
   ンデカノールを含むことを特徴とする試剤。 ２）試薬が不活性相体に、好ましくは試験片の形で包含
   されていることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の試剤。 ３）液体試料、特に体液中のエステル分解および／また
   はタンパク質分解酵素の検出法であって、該試料を特許
   請求の範囲第１項または第２項記載の試剤と接触させ、
   生じる呈色反応を測定するととを特徴とする検出法。 ４）発色性の、フェノール類のアミノ酸エステルまたは
   ペプチドエステルの分解によるエステル分解および／ｌ
   たはタンパク質分解酵素の検出に用いる活性剤であって
   、ｎ−ウンデカノールからなることを特徴とする活性剤
   。