JPH0550278B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、試験試料中の白血球細胞、エステラ
ーゼ及びプロテアーゼのような分析対象物の存在
を測定するために有用な新規組成物及び試験具に
関する。本発明は特に尿のような体液中の白血球
濃度を検出するのに有用であり、上記試験のため
の実験室的操作を、顕微鏡による観察を必要とす
る煩雑な計数操作から迅速かつ簡便な浸漬−読取
り操作へと変えるものである。患者の尿中に異常
に高濃度の白血球が存在する場合は、腎臓もしく
は泌尿生殖路感染のような病的症状又は他の機能
障害を示唆している可能性がある。従つて、正確
な尿白血球についての情報は、上記病理学的症状
の診断及び処置の際に医者にとつて極めて有用な
手段となりうる。 従来、医療専門家は尿沈渣物又は非遠心分離化
尿中の白血球母集団を計数する目視測定法に頼つ
てきたが、この方法は遠心分離機及び顕微鏡のよ
うな高価な装置と同時に臨床医側に法外な時間消
費を要求するものである。更に従来法は非溶解細
胞のみを測定するという短所をもつ。尿系に現わ
れる白血球は、広範囲の細胞溶解に好都合な条件
の影響を受けやすい。例えば、異常に高いPHの尿
中においては白血球の半減期は60分と低いことも
あることが知られている。溶解細胞は目視検査法
においては検出されないので、誤つた低い測定及
び誤つた負の結果となりうる。 顕微鏡による白血球分析の二手法−尿沈渣及び
非遠心分離化均質化尿−のうち、前者が明らかに
最も望ましい。信頼しうる結果が後者により得ら
れることもあるが、尿沈渣観察法が実際の圧倒的
多数において用いられる。ここで必要とされるこ
とは、尿試料を遠心分離し、沈渣物を単離し顕微
鏡検査に付すことである。分析者は次に視野内に
現われる白血球の数を計数する。この作業は上皮
細胞及び塩粒子のような沈渣中の他の尿成分の存
在により更に煩雑なものになる。沈渣成分の含有
量が様々なので試料の非均質性及び顕微鏡装置の
光学倍率が異なることをはじめとする他の複雑な
要因と相俟つて、最終測定に著しい誤差を招くこ
ともある。 従つて、白血球測定の迅速かつ簡便な方法、即
ち、費用のかかる装置と同時に時間がかかる手法
の必要性を排除するもの、及び細胞が非溶解又は
溶解にかかわらず、エステラーゼ、プロテアーゼ
又は白血球細胞に対して正確な応答をなすものは
実際、技術水準に大きな進歩をもたらすことにな
るであろうことは明らかである。本発明はこのよ
うな進歩をもたらす。更に本発明は白血球を見出
す能力にではなく、それらが示す酵素活性に基づ
くものであり、従つて実質的に上記の不正確さを
持たない。 本発明以前は、加水分解性分析対象物の測定方
法は、エステラーゼ又はプロテアーゼにより加水
分解されると着色アルコール生成物を生成する発
色性エステルを含み、この非分解エステルは遊離
アルコールとは異る色を呈するものであつた。こ
れらの系の多くは促進剤化合物及びジアゾニウム
塩カツプリング剤を含んでいた。 発色性エステル かくして、酵素活性により開裂すると色又は他
の検出可能な種の形成をもたらすある種のエステ
ル類の使用を開示する文献が、従来技術において
存在する。英国特許第1128371号は体液中の加水
分解性酵素を検出するのに有用な色原体としてイ
ンドキシル及びチオインドキシルエステル類の使
用を開示している。酵素がエステルを開裂して遊
離インドキシルが発生し、これが次に酸化され
て、容易に観察しうる青色色素である２分子体生
成物インジゴを生成する。上記活性は他の酵素の
うちとりわけコリネステラーゼによるものといわ
れる。この特許は又、エステル基質のインドキシ
ル部分の他に、酸残基が、検出されるべき酵素と
特に関連して選ばれることを教示している。例え
ば、エステラーゼ又はリパーゼの検出のために酸
残基はそれぞれ酢酸エステル、ラウリン酸エステ
ル又はステアリン酸エステルでもよいと述べてい
る。ホスフアターゼ又はサルフアターゼのような
酵素を検出するためにはアシル残基は無機物であ
つてよい。従つてこの英国特許はエステル分解酵
素を測定するために基質として発色性エステルの
使用を教示しており、上記エステルはエステルの
アルコール部分としてインドキシル又はチオイン
ドキシルを含み、アシル部分は測定される特定の
酵素に合せる。 アシル残基がＮ−保護化アミノ酸又はペプチド
からなるエステルに対する、エステラーゼの特異
性を立証する２文献以上に、注意深いアシル残基
の選択の効果を明らかに例示するものは他にな
い。例えばジヤノフ（Janoff）等、プロツク．ソ
ク・エクスペル・バイオル・メド（Proc.Soc.
Exper.Biol.Med.）136：1045〜1049（1971）はア
ラニンエステルがヒト白血球から得たエステラー
ゼに対して特異的基質であることを教示してい
る。具体的には、この文献はヒト白血球顆粒の抽
出物はＮ−アセチル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニ
ル−Ｌ−アラニンメチルエステルを加水分解でき
ることを教示している。更に、Ｌ−アラニン−ｐ
−ニトロフエニルエステルは同様に加水分解され
て黄色のｐ−ニトロフエノール着色型を生成し
た。 同様に、スウイートマン（Sweetman）等、ジ
ヤール・ヒスト・ソク（Jour.Hist.Soc.、22：
327−339）は１−ナフチル Ｎ−アセチル−DL
−アラニン、１−ナフチル Ｎ−アセチル−Ｌ−
アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニン及び１−
ナフチル酪酸エステルを使用してエステラーゼの
存在を立証することを教示している。 ベーリンガー・マンハイム・ジーエムビーエツ
チ（Boehringer Mannheim GmbH）に譲渡さ
れた米国特許第4278763号はこれらの教示を併合
して、白血球エステラーゼ活性のための従来の発
色性基質の更に別の例としてアミノ酸又はペプチ
ドのインドキシル又はチオインドキシルエステル
に到達している。ジヤノフ及びスウイートマンの
文献と同様に、ベーリンガー特許はそれらのエス
テル分解傾向においてプロテアーゼ及びエステラ
ーゼの等価性を教示している。 促進剤 エステル加水分解反応は無数のアルコール類を
はじめとする多くの求核剤の存在により活性化さ
れることが知られている。従つてフエニル酢酸エ
ステル及びｐ−ニトロフエニル酢酸エステルのエ
ステラーゼによる加水分解速度はメタノール又は
ブタノールを添加すると2.5〜5.5倍増加する。グ
リーンズエイド（Greenzaid）及びジエンクス
（Zencks）｛バイオケミストリ（Biochemistry）
10(7)、1210−1222（1971）｝。更に、この効果はｎ
−アルキル基の長さと共に増加する。ワイン
（Wynne）及びシヤラチン（Shalatin）、｛ヨー
ル・ジエー・バイオケム Eur.J.Biochem.）
31：554−560（1972）｝。 特に、このアルコールの活性化効果はアミノ酸
エステルについて観察されてきた。ｐ−ニトロフ
エニル−Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニネートの加水
分解はメタノールの存在によつて活性化（促進）
される。フアストレツツ（Fastrez）及びフエル
シユト（Fersht）、｛バイオケミストリ
（Biochemistry）、12(11)、2025〜2034（1973）｝。高
分子量アルコールはｐ−ニトロフエニル−ｔ−
BOC−Ｌ−チロシネートのエステラーゼ誘起加
水分解速度を増加させる。アツシエ（Ashe）及
びチンメルマン（Zimmerman）、｛バイオケム
（Biochem.）及びバイオフイズ・リス・コム
（Biophs.Res.Comm.），75(1)、194−199（1977）｝。
米国特許第4299917号の開示はある種の金属錯体、
ピリジン誘導体及びイミダゾール類のような他の
公知のエステル加水分解活性化剤について述べて
いる。 ジアゾニウム塩カツプリング剤 フエノール及び擬フエノールとカツプリングし
てアゾ色素を生成するある種のジアゾニウム塩の
使用も又知られている。マーチネツト
（Martinet）及びドルニア（Dornier）｛コンプ
ト・レンド（Compt.）（Rend.），170，592
（1920）｝。上記手法はエステラーゼ分析に用いら
れ、これによりインドキシルエステルはエステラ
ーゼにより加水分解されてインドキシルを生成
し、これが順次ジアゾニウム塩とカツプリングし
て対応するアゾ色素を形成する。ホルト（Holt）
及びヒツクス（Hicks）、｛ジエー・セル・バイオ
ル（J.Cell Biol.）29、261−366（1966）｝；ゴスロ
ー（Gossrau）、｛ヒストケミストリ
（Histochemistry）、57、323−342（1978）｝；西独
公開公報第3017721号（1980年５月９日出願）。 白血球、エステラーゼ又はプロテアーゼ検出用
組成物中にカツプリング剤として用いられること
が知られているジアゾニウム塩は、ジアゾカチオ
ンに対する外来性アニオンによるものである。更
に、これまで検討してきた調製物は各々、ジアゾ
ニウム塩と反応しうる、試料中に存在するフエノ
ール性化合物又は他の化合物の存在により妨害又
は不正確さをもつという欠点を少なくともある程
度有する。上記妨害は誤つた負の試験結果となり
うる。 要 約 本発明に至る技術開発の背景を要約すると、溶
液中の加水分解性酵素及び白血球細胞を測定する
ためのいくつかの方法が知られている。尿中白血
球母集団の測定には、例えば、顕微鏡が長い間好
ましい方法であつた。従つて、技術者は尿試料の
顕微鏡スライドを作成し、顕微鏡の視野内の白血
球細胞の数を計測することを要求された： 操作は法外な時間消費並びに顕微鏡及び遠心分
離機のような高価な装置を必要とした。 化学的及び生化学的手法は、診断において白血
球を試験するための顕微鏡に急速に挑戦しつつあ
り、かつ研究室において昔からある手段である。
化学試験のかなめの役を担つてきた発色性エステ
ルは次のアルコール部分及びアシル部分を含む。 アルコール アシル基 （フエノール）部分 インドキシル 酢酸エステル チオインドキシル 酪酸エステル ｐ−ニトロフエニル ラウリル酸エステル α−ナフトール ステアリン酸エステル アミノ酸 ベプチド 上記エステルを利用する化学はジアゾニウム塩
カツプリング剤と同様に種々の加水分解促進剤に
より助けられてきた。促進剤として多くのアルコ
ールが用いられてきたが、ある種の金属錯体、ピ
リジン誘導体及びイミダゾールも同様である。ジ
アゾニウムカチオンとイオン結合又は会合してい
る適切な外来性アニオンを有するジアゾニウムカ
チオンは上記化学のためのカツプリング剤として
周知であり、それにより、エステルの加水分解の
際生成するアルコール（フエノール）はジアゾニ
ウム塩とカツプリングしてアゾ色素を形成する。
しかしながら、ジアゾニウム塩と反応する、試料
中のフエノール及び他の化合物によるジアゾニウ
ム塩に対する妨害のために誤つた負の又は誤つた
低い試験結果が得られることがあることも又知ら
れている。 本発明は、試験試料中の白血球、エステラーゼ
又はプロテアーゼの存在を測定するための新規な
試験組成物、試験具及び方法を提供する。本組成
物は上記分析対象物と相互反応して検出可能な応
答をなすことが可能なエステル、及び構造： 式中、A^-はアニオンであり、Ｒは同一でも異
なつていてもよいが、Ｈ、低級アルキル、アリー
ルであるか、又はＲの両者が一緒になつて縮合環
系を形成し、式中、R′はＨ、OH又は低級アルキ
ルである、 を有するジアゾニウム塩からなる。本試験具は本
組成物を包含せしめた担体マトリツクスからな
る。本方法は試験試料と本試験具を接触させ、つ
いで検出可能な応答を観察することからなる。 定 義 本論議において用いられるいくつかの用語につ
いて、読者がそれらのそれぞれの意味を確実に知
るためにこの際述べておくべきである。かくして
次の定義は本発明の範囲を明らかにし、かつ、そ
の調製及び使用を可能にするために提供される。 (1) 語句“Ｎ−保護化−アミノ酸残基”及び“Ｎ
−保護化−ペプチド残基”は２つの点で定義を
要する。“Ｎ−保護化”はアミノ酸又はペプチ
ドのアミノ基の化学に関連し、これにより窒素
原子に結合している水素がアセチル、ｐ−トル
エンスルホニル（トシル）及びtert−フチロキ
シカルボニル（ｔ−BOC）並びに従来公知の
他のＮ−保護基のような保護基によつて置換さ
れているものである。 語句“アミノ酸基”及び“ペプチド残基”に
より、そのカルボキシル基の−OHがないアミ
ノ酸又はペプチド分子を意味する。 (2) 語句“アリール”により芳香性を有する任意
の環系を意味する。この語句には、ナフチルの
ような縮合環系と同様にピロール、フエニルお
よびピリジンのような５−及び６−員環が含ま
れる。従つて、この芳香族環系は複素環式又は
同素環式であつてもよく、かつ、白血球細胞、
エステラーゼ又はプロテアーゼの存在下の組成
物の加水分解能を置換基が妨害しないならば、
置換されていても置換されていなくてもよい。
上記置換基の選択は日常の実験室的決定に任さ
れることであり、本開示に与えられている。 (3) 本開示に用いられる語句“低級アルキル”は
１ないし６個の炭素原子を含むアルキル部分で
ある。低級アルキルの意味には、メチル、エチ
ル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチ
ル、sec−ブチル、tert−ブチル並びにペンチ
ル及びヘキシルのすべての異性体が含まれる。
これらは非置換でもよく、又はそれらが組成物
もしくは試験具の、白血球細胞、エステラーゼ
もしくはプロテアーゼの検出能を妨害しないな
らば置換されていてもよい。 (4) “適切な緩衡物質”により、水性試験試料と
接触した際、結果として少なくとも約７のPHを
もたらす緩衡剤を意味する。好ましくは、緩衡
剤は約７〜10、及び最適には8.5〜9.0の範囲の
PHを生じさせることができるものであり、ホウ
酸−NaOH、バイシン｛Ｎ，Ｎ−ビス〔２−
ヒドロキシエチル〕−グリシン｝、又はCHES
｛２−〔Ｎ−シクロヘキシルアミノ〕エタンスル
ホン酸｝は適切な緩衡物質の例である。 (5) 語句“促進剤”はここに述べる発色性エステ
ルの加水分解速度を高めるのに役立つ任意の化
合物に関連する。ピリジン、イミダゾール及び
それらの誘導体；式Dm〔Ｂ（CN）ｎ（NO）ｐ〕
（式中、Ｄはアルカリ金属、Ｂは重金属イオン、
Ｐは０又は１、ｍは２〜５、ｎは４〜８、及び
ｍはｎ及びＢの価数の和である）の金属錯体；
及びアルコール類のような化学的に様々な物質
である。適切なアルコール類は１から約15個の
炭素原子を有する。分枝鎖アルコール類も本発
明の範囲に包含されるが線状アルコール類が分
枝鎖アルコール類より好ましい。 (6) “縮合環系”により、一対の炭素原子を共有
する２個以上の芳香族環を意味する。例えば、
構造： において、両方のＲは協働して縮合環系： 式中、両方のＲは協働して −（CH＝CH−CH＝CH−）を構成する、 を生成することができる。更に別の例は、 式中、両方のＲは協働して −（CH＝Ｃ−CH＝Ｎ−）を構成する、 である。従つて、この縮合環系は多核、芳香族
であり、複素環式又は同素環式であつてもよ
い。 (7) 語句“検出可能な応答”は、直接的観察又は
器のいずれかにより検知されうる、試験手段系
におけるパラメータの変化又は発現を意味する
ものとここでは意図されており、水性試験試料
中の特定の分析対象物の存在の関数である。検
出可能な応答としては色、螢光、反射率、PH、
化学ルミネツセンス及び赤外スペクトルの変化
又は発現がある。 (8) ここに用いられる用語“アニオン”としては
約７〜10の範囲のPHにおいて負に電荷され、構
造（）に示した環に共有結合で結合している
部分が挙げられる。アニオンの定義には、スル
ホニル、カルボニル及びホスホニルが含まれ
る。負電荷を帯びることが可能な部分で共有結
合的に置換されている低級アルキル及びアリー
ル基も又包含され、この置換基を有する基はそ
れ自身、共有結合的に構造（）の環に結合し
ている。後者としてはｎ−ヘキシル−６−スル
ホネート、フエニルカーボネート、およびｎ−
プロピル−３−ホスホネートのような様々な型
が挙げられる。 組成物 本発明の組成物はエステル及びジアゾニウム塩
を含む。これらの成分は広い範囲で選択すること
が許されるが、それぞれ最高結果、すなわち、短
時間での高度な検出応答発現、をもたらす好まし
い実施態様がある。この最高効率化は組成物中に
促進剤を包含させることにより尚一層助長され
る。 (1) エステル 本発明の組成物及び試験具の両者は芳香族又は
擬芳香族フエノールと酸のエステルを含有する。
更に、前記エステルは、白血球、エステラーゼ又
はプロテアーゼの存在下で触媒により加水分解さ
れて、前記フエノール又は擬フエノールを生じ、
次いで前記ジアゾ両性イオンと自由にカツプリン
グすることができものである。本発明に使用する
のに最適ないくつかのエステルとしては、酢酸イ
ンドキシル、酪酸インドキシル、ラウリン酸イン
ドキシル、ステアリン酸インドキシル、Ｎ−保護
化アミノ酸又はペプチドのインドキシルエステル
及びそれらのチオインドキシル類縁体が挙げられ
る。ｐ−ニトロフエニル−Ｎ−トシル−Ｌ−アラ
ニネート、α−ナフチルＮ−保護化アラニネート
エステルも含まれる。エステルの更に別の例とし
ては、構造： 式中、Ａは、その特有の酸の−OH基を持たな
い、エステル形成酸残基、Ｒは低級アルキル、ア
リール、カルボキシル、カルボキシルエステル、
アミド又はシアノであり、Ｒ＊はＨ、低級アルキ
ル又はアリールであり、ＸはＯ，ＳまたはNR＊
である、 を有するものである。 語句“酸残基”にはそれぞれホスホリツク、ス
ルホニツク、カルボニツク及びカルボキシリツ
ク、すなわち、

【式】 【式】

【式】及び

【式】

【式】 が包含される。構造（）に相当するエステル類
としては３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アナラニニルオ
キシ）−５−フエニルピロール、１−メチル−３
−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキシ）−５−フ
エニルピロール、３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニ
ニルオキシ）−５−（ｐ−クロロフエニル）ピロー
ル及び３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキシ）
−５−フエニルチオフエンが挙げられる。 (2) 促進剤 本発明の組成物はエステルの他に先の項におい
て定義したような種々の促進剤を包含してもよ
い。アルコール類が、ここに検討しているエステ
ル類のエステラーゼ及びプロテアーゼによる触媒
加水分解を増大させるのに特に有用であることが
判明している。８ないし15個の炭素原子を有する
アルコール類がこの目的に好ましいが、一方、デ
カノール、ウンデカノール及びドデカノールは、
主として低分子量のアルコールと比較して、蒸発
性が低いために試験具に使用するのに好ましい。 (3) ジアゾニウム塩 本組成物はカツプリング剤として特定のジアゾ
ニウム塩を含む。全体の反応図式におけるこのジ
アゾニウム塩の関与は次例により表すことができ
る： 式中、ArN⁺≡Ｎはジアゾニウム塩（）であ
り、Ａ、Ｒ、R^*及びＸは先に定義したとおりで
ある、 反応生成物は濃い特色のある色を呈すること
ができるアゾ色素である。 従つて、両性イオンはジアゾニウム塩種であ
り、そこではジアゾニウム基に対するカウンター
イオンが環系に共有結合で結合している。上記ア
ニオンの例としては、スルホニル（SO₃ ^-）、カル
ボニル（CO₂ ^-）、ホスホニル（PO₃ ^-）等である。
１−ジアゾナフタレン−４−スルホン酸エステ
ル、１−ジアゾ−２−ナフトール−４−スルホン
酸エステル、１−ジアゾフエニル−３−炭酸エス
テル及び他の多くのもの等の化合物が（）の範
疇に含まれる。１−ジアゾ−２−ナフトール−４
−スルホン酸エステルを用いるのが最も有利であ
ることが判明している。 試験具 上記組成物は、白血球、エステラーゼ又はプロ
テアーゼを測定するに当たりそれだけで使用する
こともできるし、又担体マトリツクスに包含せし
めて試験具を形成し、それによつて分析対象物の
存在についての迅速かつ信頼性のおける評価を行
うための道具を提供することもできる。担体マト
リツクスは通常、しかし必ずしもそうではない
が、ろ紙のような多孔性物質である。業界で認め
られている他の形の担体マトリツクス材はフエル
ト、多孔性セラミツク片、及び織物状又はマツト
状ガラス繊維（米国特許第3846247号）である。
木材、布、スポンジ材及び粘土状物質の使用も又
示唆されている。又担体マトリツクスは種々の重
合体フイルム、ガラス等のように非多孔性であつ
てもよい。すべての上記担体マトリツクス材は、
他のものと同様に、本発明において使用可能であ
る。ろ紙が特に適切であることが判明している。
試験具の好ましい製造方法においては、一片のろ
紙を緩衝水溶液で湿潤させる。この第一浸漬溶液
は、界面活性剤、ポリビニルピロリドンのような
サイズ剤及び他の不活性成分等の種々の処理賦形
剤も又含んでいてもよい。 この含浸ろ紙を次に乾燥し、アセトン又は他の
非水性溶媒中の本エステル及び、望ましいなら
ば、促進剤及び／又はジアゾニウム塩を含む第二
浸漬溶液で湿潤させる。この二度含浸されたろ紙
は次に二回目の乾燥を行い、白血球又は他の分析
対象物の存在に鋭敏な試験具を形成する。 この乾燥された試薬担持担体マトリツクスは必
要ならば支持材上に貼材されてもよい。従つて、
試験具の好ましい実施態様においては、ろ紙担体
マトリツクスに上記組成物を包含せしめ、このマ
トリツクスを長片の透明なポリスチレンフイルム
の一端に固着させる。このマトリツクスは両面接
着テープ｛3Mカンパニーから入手可能なダブ
ル・ステイツク（Double Stick ）｝のような任
意の適切な手段によりフイルムに固着させ、ポリ
スチレンフイルムの他端は把手とて役立つ。使用
に際して、このような試験具はポリスチレンフイ
ルム支持材の自由端により保持され、マトリツク
ス端を試験試料（例えば、尿）中に浸し、ついで
すぐに取り出す。一定時間後、何らかの呈色又は
他の検出可能な応答を観察し、ついで既知濃度の
白血球又は、エステラーゼもしくはプロテアーゼ
活性を有する他の分析対象物に対する応答に対応
する参照標準と比較する。約１〜３分間のインキ
ユベーシヨン時間は、試薬含有ろ紙中で呈色発現
をおこさせうるのに通常十分であることが判明し
ている。 実 験 次の実施例は、読者が本発明物を製造及使用す
るのを更に助けるために提供される。従つて、好
ましい実施態様を実験上の細目にわたつて述べ、
その結果について分析する。実施例は単に説明す
るためのものを意味し、ここに叙述され特許請求
された本発明の範囲を制限することを意図するも
のではない。 (1) 一般的情報 次の、実験についての検討においては、略号を
次に示したように用いる。 ｇ＝グラム Kg＝キログラム Ｌ＝リツトル mL＝ミリリツトル Ｍ＝モル濃度 mM＝ミリモル濃度 Ｎ＝規定 eq＝当量 mol＝グラム分子量（モル） mmol＝グラム分子量×10^-3（ミリモル） aq＝水性の hr＝時間 TLC＝薄層クロマトグラフイー 赤外（IR）スペクトルは、特に断らない限り、
CHCl₃溶液としてパーキン−エルマー・モデル
（Perkin−Elmer Model）710B又は237赤外分光
光度計を用いて得；ポリスチレンフイルムの1602
cm^-1バンドを外部検量標準として用いた。 プロトン磁気共鳴（¹H NMR）スペクトルは、
JEOL FX−900分光計を用いて89.55MHzにおい
て、又はバリアン（Varian）Ｔ−60分光計を用
いて60MHzにおいて得；スペクトルは特に断らな
い限りCDCl₃溶液中で得た。化学シフトは内部基
準のテトラメチルシランからの低磁場のシグマ単
位として報告する。 JEOA X900分光計を用い、フーリエ
（Fourie）変換及び全プロトンの広域バンド・ノ
イズ・デカツプリングを伴う、炭素−13磁気共鳴
（¹³C NMR）スペクトルを22.5MHzにおいて得；
スペクトルは特に断らない限りCDCl₃溶液中で得
た。炭素シフトは内部基準のテトラメチルシラン
からの低磁場ミロン当りのパーツとして報告す
る。 質量スペクトル（MS）は、電子衝突（EI）又
は高速原子衝突（FAB）法のいずれかで操作す
るヒユーレツト−パツカード（Hewlett−
Packard）5985A分光計で得た。高分解能質量ス
ペクトルはAEI MS−902分光計を用いて得た。 有機試薬はアルドリツヒ・ケミカル・カンパニ
ー（Aldrich Chemical Company）より入手し、
特に断らない限り精製せずに用いた。無機試薬は
フイツシヤー・サイエンテイフイツク・カンパニ
ー（Fischer Scientific Company）又は他の大
手の販売業者からのACS試薬等級品であつた。
反応溶媒はACS試薬等級品であり、テトラヒド
ロフラン（THF）はジエー・テイー・ベーカ
ー・ケミカル・カンパニー（J.T.Baker
Chemical Company）からのHPLC等級品であ
つた。ブライン（Brine）は飽和塩化ナトリウム
水溶液を意味する。 薄層クロマトグラフイー（TLC）はイー・メ
ルク（E.Merck）からのシリカゲル60F−254プ
レートを用いて行つた。カラムクロマトグラフイ
ーはイー・メルク（E.Merck）シリカゲル60（70
〜230メツシユ）を用いて行つた。すべての報告
された融点及び沸点は補正されていない。 (2) いくつかの擬フエノール性エステルの製造 次の実験は本発明に有用なエステルの合成を説
明するために行われた。これらの実験は特定の出
発物質及び最終生成物に関連しているが、その操
作はここに開示した広範囲のエステル種に適用で
きると信じられる。 (2)−(1) ３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニルオキシ）
−５−フエニルピロール(4)の合成 ３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキシ）−５
−フエニルピロールの合成は次の反応系列に図示
される。 Ｎ−トシル−Ｌ−アラニン Ｌ−アラニン（100ｇ；1.11mol）をIN水酸化
ナトリウム（水溶液）2.25Lに溶解し、５℃に冷
却し、次いでトルエン450mL中に溶解したｐ−
トルエンスルホニルクロリド（218g；1.11mol）
の溶液を徐々に添加しながら撹拌した。この混合
物を雰囲気温度で20時間撹拌した。層を分離し、
冷却水性層を濃塩酸でPH１に酸性化した。白色固
体状の表記化合物をろ過により採集し、水洗しつ
いで乾燥した。収量178.5ｇ（66％）；mp134−５
℃；IR（CHCl₃）cm^-11726，1340，1165，1095；
¹H NMR（DMSO−D₆）δ1.20（ｄ，Ｊ＝7.3H），
2.40（ｓ，3H），3.85（ｐ，Ｊ＝８，1H），6.4（br
ｓ，1H）（CO₂ Ｈ），7.41（ｄ，J_AB＝8.2H）及び
7.75（ｄ，J_AB＝８，2H）〔パターンの中心：
7.58；ΔV_AB＝20.49PH〕，8.03（br ｄ，Ｊ＝８，
1H）（NH）． Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルクロリド 方法 Ａ Ｎ−トシル−Ｌ−アラニン（12.4ｇ；0.05mol）
及びチオニルクロリド（25mL）の混合物を90分
55℃で加熱し、次に回転蒸発器を用いて40℃で濃
縮した。この赤色固体状残渣を沸騰CCl₄200mL
に溶解し、炉で乾燥したノリツト（Norit ）
211｛（アメリカン・ノリツト・コ・インコーポレ
ーテツド（American Norit Co.，Inc）｝20ｇで
脱色し、ろ過しついで冷却した。乳白色の固体状
の表記生成物をろ過により採集し、ヘキサンで洗
浄しついで乾燥した。収量8.48ｇ（65％）；
mp101−101.5℃；IR IR（CHCl₃）cm^-13360，
3260，3025，1775，1605，1350，1170，910；¹H
NMR（CDCl₃）δ1.48（ｄ，Ｊ＝7.3H），2.43（ｓ，
3H），4.33（ｐ，Ｊ＝８，₁H），5.93（br ｄ，Ｊ＝
8.1H）（NH），7.31（ｄ，J_AB＝8.2H）及び7.76
（ｄ，J_AB＝８，2H）〔パターンの中心7.53；ΔV_AB
＝26.83PH〕． 質量分析：C₁₀H₁₂ClNO₃Sとして 計算値：Ｃ，45.89；Ｈ，4.62；Ｎ，5.35 実験値：Ｃ，46.63；Ｈ，4.90；Ｎ，5.19 方法 Ｂ Ｎ−トシル−Ｌ−アラニン（3.1ｇ；13mmol）
及びチオニルクロリド（6mL）の混合物を90分
50℃で加熱し、次に乾燥ヘキサン50mLで希釈し
た。この混合物を急速撹拌し、冷却しついで固体
状生成物をろ過した。収量3.15ｇ（93％）、mp99
−100℃。IRスペクトルは方法Ａにより製造した
再結晶化物質のスペクトルと同一であつた。 ２−ヒドロキシ−３−（カルボキシメチルアミ
ノ）−ヒドロ桂皮酸ジカリウム塩２水和物(1) アセトン4.5Lに溶解したトランス−桂皮酸
（6.75mol）1.0Kgの撹拌スラリーを先ずNaHCO₃
（2.47Kg；29.4mol；4.39eq）を用いて、次に注意
深く水（4.5L）を用いて処理した。得られた濃厚
な混合物を、04mMのエチレンジアミン四酢酸
（EDTA）ジナトリウム塩水溶液（14.5L；
EDTAジナトリウム２水和物2.17ｇを蒸溜水
14.5Lに溶解して調製）に溶解したオキゾーネ
（OXONE ）モノサルフエート化合物（3.78
Kg；KHSO₅1.825eq含有）溶液を用いて、1.5−
2.0時間に亘つて滴加処理した。この添加中、反
応温度を水浴を用いて24−27℃に維持し、反応−
PHは約7.4であるように注意した。添加終了後、
混合物を更に0.5時間撹拌し、次に約10℃に冷却
した。温度をほぼ10℃に維持しながら、反応物を
濃HCl（〜1.2L）でPH＝２に酸性化し、次に
CH₂Cl₂（5.05L）で処理し、ついで10分間激しく
撹拌した。 混合物を沈降させた後、水層をデカンテーシヨ
ンにより除去し、不溶塩を含む有機層をろ紙を用
いて吸引ろ過した。ろ過された固体をCH₂Cl₂
（1.9L）で洗浄し、ついで水層をこのろ液で抽出
した。ろ過された固体を再びCH₂Cl₂（3.15L）で
洗浄し、ついで水層をこのろ液で抽出した。合せ
たCH₂Cl₂層を水（6.31L）に溶解したKOH（593.3
ｇ）溶液で抽出した−塩基抽出の際分離する固体
を溶解させるため約40℃まで緩かに加熱すること
が必要とされることがしばしばある。CH₂Cl₂層
を次に、水（1.5L）に溶解したKOH（99ｇ）溶液
で抽出し、ついでひとまとめにした塩基抽出物を
グリシン（481.7ｇ；6.416mol；0.95eq）で処理
し、有機層を捨てた。 溶液PHを25％KOH水溶液で11.5に調整し、次
に沸騰するまで加熱した。低沸点液（アセトン及
び水）約900mLを蒸気温度が99℃に達するまで
留去し、それに続いて混合物を２時間還流した。
冷却後、反応混合物をCH₂Cl₂（3.15L）で抽出し、
このCH₂Cl₂相を捨て、水層を減圧下に70℃の浴
槽を用いて蒸発乾固した。残渣を95％EtOH
（8.83L）中で30分沸騰させ、次に撹拌しながら
徐々に放冷すると、生成物が微細結晶として分離
する。これらをろ過し、新しい95％EtOH
（1.26L）で洗浄し、ついで50−60℃の炉中で乾燥
すると表記化合物（1.77Kg；74.6％）が白色結晶
として得られた｛mp＝120−２℃（末補正）｝。 IR（KBr）cm^-13420（br.），1590（br.），1410，
1130，710；¹H NMR（D₂O−TSP）δ3.1（ｓ，
2H），3.89（ｄ，J_AB−＝４，₁H）及び4.52（ｄ，J_AB
＝４，IH）（パターンの中心4.21；ΔV_AB＝18.83
PH．），4.68（Ｓ，6H，交換可能なプロトン），7.4
（ｓ，5H）；TLC R_f＝0.59（EtOH：IMトリエチ
ルアンモニウム炭酸水素塩７：３） 質量分析：C₁₁H₁₅NO₇K₂として 計算値：Ｃ，37.59；Ｈ，4.30；Ｎ，3.99 実験値：Ｃ，37.22；Ｈ，4.24；Ｎ，3.96 Ｎ−アセチル−３−アセトキシ−５−フエニル
ピロール(2) ピリジン（3.0L）に溶解した２−ヒドロキシ−
３−（カルボキシメチルアミノ）−ヒドロ桂皮酸ジ
カリウム塩２水和物(1)（1.0Kg；2.84mol）の懸濁
液を雰囲気温度、不活性ガス雰囲気下に無水酢酸
（4.0L）で処理した。温和な発熱反応が結果とし
ておこり、1.5−2.5時間に亘り反応温度が60−70
℃まで指数関数的に上昇した。いつたん反応が冷
えはじめたら、混合物を120−123℃まで15分間加
熱し、次に雰囲気温度まで１時間にわたり放冷
し、その間に酢酸ピリジニウムが結晶として分離
した。混合物をろ紙を用いて吸引ろ過し、ついで
塩を無色になるままでEtOA_cで洗浄し、ろ液を真
空中で蒸発乾固した。 暗赤色残渣をEtOA_c（3.0L）に溶解し、三回水
洗（各1.0L）し、MgSO₄上で乾燥しついでダル
コ（Darco ）−G60｛アルドリツヒ・ケミカル・
カンパニー（Aldrich Chemical Co.）｝（300ｇ）
で処理した。30分間撹拌後、混合物をセライト
（Celite ）｝｛フイツシヤー・サイエンテイフイ
ツク（Fischer Scientific）｝を用いてろ過しつい
で真空中で蒸発乾固すると赤橙色油状物質を得
た。この油状物質を温めた２−プロパノール
（1.2L）に溶解し、次に一晩雰囲気温度まで徐冷
すると、固体が分離した。結晶状生成物をろ過
し、50％−２−プロパノール水溶液で洗浄し、真
空乾燥するとmpが58−60℃（未補正）の表記化
合物（417ｇ；60％）を得た。一部をEt₂Oに採取
し、ノリツト（Norit）211で処理し、ろ過しつ
いで減圧濃縮した。０℃にしておくと無色微少針
状物質が分離した。これらをろ過し、Et₂O／ヘ
キサン（１：１）で洗浄しついで真空乾燥すると
mpが60−62.5℃（未補正）の分析試料が得られ
た。 IR（CHCl₃cm^-13020，1760，1730，1595，1378，
1320，1220（br.），1030，960，903；¹H NMR
（CDCI₃）δ2.23（ｓ，3H），2.27（ｓ，3H），6.18
（ｄ，Ｊ＝２，1H），7.35（ｓ，5H），7.42（ｄ，Ｊ
＝２，₁H）；HLC Rf＝0.56（トルエン；−ジオキ
サン，４：１）． 質量分析C₁₄H₁₃NO₃として： 計算値：Ｃ，69.12；Ｈ，5.38；Ｎ，5.76 実験値：Ｃ，68.88；Ｈ，5.25；Ｎ，5.53 ３−ヒドロキシ−５−フエニルピロール(3) Ｎ−アセチル−３−アセトキシ−５−フエニル
ピロール(2)（36.8ｇ；0.15mol）の微細粉部を10
分間アルゴン気流中で撹拌することにより酸素を
除去し、次に脱酸素化MeOH（379mL）中に懸濁
し、不活性気体雰囲気下で−６℃｛−15℃メタノ
ール（MeOH）／ドライアイス浴中で｝に冷却
し、次に2N NaOH（300mL）の氷冷脱酸素化溶
液で迅速に処理した。塩基を添加すると反応温度
が直ちに18℃まで上昇し、３分後には反応混合物
は均一になつた。反応混合物が冷えると、化合物
(3)が微細結晶として分離した。脱酸素化された
2Mクエン酸の冷溶液（150mL）を添加15分後、
得られた混合物を10分間撹拌し、次にろ過した。
生成物を空気に露らすのを最低にするように注意
しながら、固体を脱酸素化水（200mL）で完全
に洗浄し、次に一晩真空乾燥すると淡桃色微細針
状物質として表記化合物（22.3ｇ；93.6％）が生
じた。 IR（KBr）cm^-13400，3110，2900，1600，
1580，1555，1480，1268，1180，742，640；¹H
NMR（DMSO−D⁶）δ6.1（ｍ，1H），6.3（ｍ，
1h），7.0−7.7（ｍ，5H），8.0（ｓ，1H），10.4（br
ｓ，1H）；TLC Rf＝0.20−0.28（EtOH：CHCl₃，
１：９）． 質量分析：C₁₀H₉NOとして 計算値：C75.45；Ｈ，5.70；Ｎ，8.80 実験値：C75.30；H.5.69；Ｎ，8.67 ３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキシ）−５
−フエニルピロール(4) ０℃、不活性ガス雰囲気下に維持された、無水
テトラヒドロフラン（THF、450mL）、ピリジン
（43.8mL；0.542mol；1.2eq）及びトリフルオロ
酢酸（85.0mL；1.10mol；2.4eq）の溶液を一部
分３−ヒドロキシ−５−フエニルピロール(3)
（71.5ｇ；0.45mol；1.0eq）で処理し、続いて直
ちに、調製したばかりの、無水THF（450mL）中
のＮ−トシル−Ｌ−アラニニルクロリド（141.0
ｇ；0.54mol；1.2eq）溶液を５−10分かけて滴加
した。得られた混合物を15分間０℃で撹拌した。
次に1.0Mクエン酸水溶液（315mL）及びEt0Ac
（1.35L）の溶液を添加することにより反応物を冷
却した。簡単に混合後、相を分離しついで有機相
をNaCl水溶液（360mL；水1mL当り0.18ｇの
NaCl）で洗浄した。有機相を次に５％NaHCO₃
水溶液（各1.35mL）で２回抽出し、次に、更に
別のNaCl水溶液（360ml；水mL当たり0.18ｇの
NaCl）で洗浄した。赤褐色有機層をMgSO₄（101
ｇ）及びダルコ（Darco）−G60（143ｇ）と共に
雰囲気温度で15分間撹拌し、次にセライト
（Celite）を用いてろ過しついで37℃の浴槽で真
空蒸発乾固すると桃白色固体として(4)が得られ
た。粗生成物を粉砕しついで温（50℃）THF
（250mL）に溶解し、激しく撹拌し、次にｎ−ヘ
キサン（250mL）で希釈した。撹拌を１時間雰
囲気温度で続けると生成物が結晶化した。固体を
ろ過し、ろ液が無色になるまでトルエン（約
1.0L）で洗浄し、次に一晩真空乾燥すると表記化
合物（112ｇ；65％）がmp154.5−155℃の白色粉
末として生じた。 IR（KCI）cm^-13350，3325，1760，1508，1320，
1155，770； ¹H NMR（DMSO−d⁶）δ1.33（ｄ，Ｊ＝７，
3H），2.36（ｓ，3H），4.13（ｐ，Ｊ＝８，1H），
6.25（ｍ，1H），6.73（ｍ，1H），7.05−7.50（ｍ，
5H），7.5−7.85（ｍ，4H），8.42（ｄ，Ｊ＝８，
1H），11.18（br ｓ，1H）；¹³C NMR（DMSO−
d⁶）ppm18.335，21.001，51.370，98.061，
108.336，123.423，126.024，126.610，128.560，
128.756，129.601，132.397，137.600，138.300，
142.737，169.919；〔α〕_D＝−70゜（Ｃ＝1.11，
MeOH）；TLC Rf＝0.45（EtOAc：ヘキサン，
１：１）；TLC Rf＝0.40（トルエン：ジオキサ
ン，４：１）， 質量分析C₂₀H₂₀N₂O₄Sとして： 計算値：Ｃ，62.48；Ｈ，5.24；Ｎ，7.29； 実験値：Ｃ，62.62；Ｈ，5.27；Ｎ，7.30 (2)−(2) ３−（Ｎ−トシルアラニニルオキシ）−５
−フエニルチオフエン(9)の合成 次にアウトラインを示した、報告文献による操
作＊１，＊２を僅かに変形することにより一連の
実験を行つて３−ヒドロキシ−５−フエニルチオ
フエンを製造した。得られたヒドロキシチオフエ
ンを次にＮ−トシル−Ｌ−アラニニルクロリドで
アシル化すると相当するＮ−トシル−Ｌ−アラニ
ネートエステルが収率46％（非最適操作）で得ら
れた。 ３−フエニル−１，２−ジチア−３−シクロペ
ンテン−５−オン(5) 桂皮酸エチル（56.82mmol）10ｇ及び硫黄10ｇ
の懸濁液を、反応中に生成するエタノールを除去
するための蒸溜ヘツド及び受器を備えた50mLフ
ラスコ中で250℃で４時間加熱した。反応混合物
を次に100℃に放冷しついで還流エタノール
500mLに添加した。得られた沈澱物をろ過し、
続いて沸騰アセトン500mLと次に２回エタノー
ル500mLずつと共にすりつぶした。合せた上澄
液を濃縮して黒色固体とし、これをメタノールか
ら結晶化すると暗褐色針状物質が得られた。ノリ
ツト（Norit）を用いてメタノールから２回目の
再結晶を行いついでセライト（Celite）を用いて
ろ過するとmpが113−115℃の淡黄色針状物質
2.023ｇが得られた。 IR（KBr）cm^-11650，1550，1390，1350，
1130，770；¹H NMR（60mHz，CDCl₃）δ6.92
（ｓ，1H），7.58（ｍ，5H）；TLC Rf＝0.5（ジク
ロロメタン）． 質量分析：C₉H₆O₂Sとして； 計算値；Ｃ，55.64；Ｈ，3.11 実験値；Ｃ，55.53；Ｈ，3.47 シス−４−ケト−６−フエニル−３，７−ジチ
ア−５−ノネンジオイツク酸 94℃の硫化ナトリウム９水和物35.48ｇ
（148mmol）の溶融溶液を、３分間に亘り滴加さ
れた6.65ｇの３−フエニル−１，２−ジチア−３
−シクロペンテン−５−オン(5)（34.23mmol）で
処理した。15分後、混合物を、炭酸ナトリウムで
PH8.7に調製された、水60mL中にブロモ酢酸43.6
ｇ（314mmol）を含む氷冷溶液に添加した。得
られた溶液を０℃、PH8.7に45分間保持し、次に
ろ過した。上澄液を０℃に保持しついで5N HCl
溶液でPH3.7に酸化した。得られた混合物を一晩
５℃で撹拌した。上澄液を次にデカンテーシヨン
し、ついで得られた油状物質をエーテルと共にす
りつぶした。油状物質をトルエンと共に蒸発させ
ると、ついには無色泡状物質6.98ｇが得られた
（65％）。この物質を更に精製せずに用いた。 分析試料はエーテル上澄液から得たが、これは
濃縮し、続いて酢酸及びトルエンと共に蒸発さ
せ、ついでエーテルと共にすりつぶすと、mpが
142.5−150℃の黄褐色結晶となつた。 IR（KBr）cm^-11705，1655；¹H NMR（60MHz，
DMSO−D₆）δ2.06（ｓ，CH₃CO₂H不純物）3.30
（ｓ，2H），3.77（ｓ，2H），5.67（ｍ，2H）
（OH），6.37（ｓ，1H），7.43（ｍ，5H）；TLC Rf
＝0.85（クロロホルム：メタノール；酢酸，５：
５：１）． 質量分析：C₁₃H₁₂S₂O₅として： 計算値：Ｃ，50.00；Ｈ，3.88 実験値：Ｃ，50.26；Ｈ，3.98 ３−ヒドロキシ−５−フエニルチオフエン酢酸
エステル(7) 粗シス−４−ケト−６−フエニル−３，７−ジ
チア−５−ノネンジオイツク酸(6)3.40ｇ
（10.9mmol）、酢酸ナトリウム3.40ｇ
（41.5mmol）、及び無水酢酸30mLの強撹拌懸濁液
を１時間還流加熱した。混合物を放冷し、次にろ
過し、溶媒を蒸発させると黒色油状物が得られ
た。この残渣を酢酸エチル75mLに溶解し、炭酸
水素ナトリウム氷冷飽和溶液50mLずつを用いて
３回抽出した。有機層を次に食塩水で洗浄し、硫
酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、ついで溶媒を
蒸発させると黒色固体2.826ｇが得られた。粗生
成物を120−140℃及び0.1mmでの蒸発蒸溜により
精製すると淡橙色油状物質1.235ｇが得られ、こ
の油状物質は放置すると固化した（52％）。 IRcm^-11700，1745；¹H NMR（60MHz，
CDCI₃）δ2.23（ｓ，3H）、7.03（d.J＝２Hz，1H），
7.13（ｄ，Ｊ＝２Hz，1H）；7.23−7.73（ｍ，
5H）；MS（EI，DIP）ｍ／e218（M⁺，12.6％）；
TLC Rf＝0.48（ヘキサン：酢酸エチル，５：
１）． 質量分析：C₁₂H₁₀SO₂・1/2H₂Oとして 計算値：Ｃ，63.41；Ｈ，4.88 実験値：Ｃ，63.78；Ｈ，4.86 ３−ヒドロキシ−５−フエニルチオフエン(8) アルゴン雰囲気下の、３−ヒドロキシ−５−フ
エニルチオフエン酢酸エステル(7)2.126ｇ
（9.74mmol）及びメタノール80mLの混合物をIN
NaOH11mLで処理した。20分後IN HCl 11mL
を添加して反応を停止させ、25℃、12mmで溶媒を
蒸発させて約50mL容量とし、ついで酢酸エチル
100mLで処理した。有機層を分離し、食塩水で
洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過しつい
で溶媒を蒸発させると黒色固体が得られた。この
残渣を酢酸エチル75mL溶解しついでMgSO₄上で
乾燥した。ろ過しついで溶媒を蒸発させると黒色
固体が得られ、これを４回熱ヘキサンと共にすり
つぶし、冷却すると、mp74−75℃の黄色固体が
全量で837mg（49％）得られた。合わせた母液を
濃縮すると固体0.87ｇが得られ、これをSiO₂100
ｇ上でヘキサン；酢酸エチル（７：１）の溶媒混
合物を溶離液としてクロマトグラフイーにかけ
た。再結晶後、更にmp73.5−74℃の生成物380mg
を得た。合せた収量はかくして1.217ｇ（71％）
であつた。mp74.5−75℃（文献＊１，＊２，75
℃，78℃）。 IRcm^-13380，1635：¹H NMR（90MHz，
CDCl₃）δ3.81（ｓ，2H），6.57（ｓ，1H），7.2−
7.7（ｍ，5H）；MS（EI）ｍ／e176.0（70.7％）
TLC Rf＝0.23（ヘキサン：酢酸エチル１：５）． 質量分析：C₁₀H₈OSとして 計算値：Ｃ，68.15；Ｈ，4.57 実験値：Ｃ，68.05；Ｈ，4.70 ＊１ ピー・フリードランダー（P.Friedlander）
及びエス・キールバシンスキ（S.
Kielbasinski）、ケム・ベル（Chem.Ber.）45，
3389（1912）． ＊２ エー・アイ・コサツク（A.I.Kosak）、ア
ール・ジエー・エフ パルチヤツク（R.J.F.
Palchak）、ダブリウ・エイ・ステイール（W.
A.Steele）及びシー・エム・セルヴイツツ（C.
M.Selvitz）、ジヤーナル・アメリカン・ケミカ
ル・ソサイアテイ（J.Amer.Chem.Soc.）76，
4450（1954）。 ３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキシ）−５
−フエニルチオフエン(9) ０℃でアルゴン雰囲気下の、ジクロロメタン
20mL及びピリジン0.61mL（7.5mmol）中に３−
ヒドロキシ−５−フエニルチオフエン(8)440mg
（2.5mmol）を含む溶液を、５分間に亘つて滴加
された、ジクロロメタン10mL中にＮ−トシル−
アラニニルクロリド1.314（5mmol）を含む溶液で
処理した。反応物を0.5時間０℃で撹拌し、次に
クロロホルム100mL中に注いだ。この混合物を
次に順次INクエン酸、水、氷冷炭酸水素ナトリ
ウム溶液、水及び食塩水50mLずつで抽出した。
この混合物を次に硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ
過し、ついで溶媒を蒸発させると褐色油状物質
1.78ｇが得られた。ノリツト（Norit）1.78ｇで
の処理後、トルエンからの結晶化を試みたが成功
しなかつた。残渣を次にSiO₂カラム200ｇ上でジ
クロロメタンを用い流速10mL／分で溶離するこ
とによりクロマトグラフイーにかけた。生成物を
含む画分をプールしついで濃縮すると赤味がかつ
た油状物質951mgが得られた。この生成物をトル
エンから結晶化した。 トルエンから引き続き再結晶を行うと淡黄色固
体として生成物が全量で463mg（46％）得られた。
mp85−87℃。 IR（KCl）cm^-11735，1330，1150；¹H NMR
（90MPH，CDCl₃）δ1.53（ｄ，Ｊ＝７Hz，3H），
1.62（ｓ，3H），4.23（ｍ，1H），5.32（ｄ，Ｊ＝９
Hz，1H），6.84（ｄ，Ｊ＝1.4Hz，1H）；6.88（ｄ，
Ｊ＝1.4Hz，1H），7.23−7.83（ｍ，9H）；MS
（FAB）ｍ／e402（Ｍ＋１，15％）；TLC Rf＝
0.20（ヘキサン−酢酸エチル，４：１）． 質量分析：C₂₀H₁₉NO₄Sとして、 計算値：Ｃ，59.83；Ｈ，4.77；Ｎ，3.59 実験値：Ｃ，59.60；Ｈ，4.77；Ｎ，3.43 (2)−(3) ３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキ
シ）−１−メチル−５−フエニルピロール(13)の
合成 一連の実験を行つて、化合物（）（式中、Ａ
はＮ−トシル−Ｌ−アラニニル、Ｒはフエニル、
R^*はＨ，ＸはNR′及びR′はCH₃）に相当する表
記のエステルを製造した。反応系列は次のようで
ある。 ２−ヒドロキシ−３−（Ｎ−メチルカルボキシ
メチルアミノ）−ヒドロ桂皮酸ジカリウム塩(10) β−フエニルグリシド酸カリウム塩（30ｇ；
0.15mol）、Ｎ−メチルグリシン（13.2ｇ；
015mol）、蒸留水（119mL）及びKOH溶液
（9N；22.3mL）の混合物を３時間還流加熱する
と淡黄色溶液が得られた。反応混合物を減圧下70
℃で蒸発乾固した。残渣を次に95％EtOH
（100mL）から結晶化すると白色固体が得られ、
これを一晩減圧下110℃で乾燥後、白色固体(10)
30.8ｇが生じた（収率63％）。 IR（KCI）cm^-13360（br）．1580，1405，705；
¹H NMR（CD₃OD）δ2.30（ｓ，3H），2.98（ｓ，
2H），3.70（ｄ，Ｊ＝３Hz，1H），4.48（ｄ，Ｊ＝
３Hz，1H），4.92（ｓ，1H），7.40（ｓ，5H）；
TLC Rf＝0.51（EtOH：1Mトリエチルアンモニ
ウム炭酸水素塩，７：３）．（生成物は270℃未満
では融点をもたなかつた。270℃）． ３−アセトキシ−１−メチル−５−フエニピロ
ール(11) ２−ヒドロキシ−３−（Ｎ−メチルカルボキシ
メチルアミノ）−ヒドロ桂皮酸ジカリウム塩(10)
（15.2ｇ，45mmol）、無水酢酸（173mL）及びト
リエチルアミン（308mL）の混合物を90℃で19
時間加熱した。反応混合物は色が濃褐色になつた
が、これをろ過しついで固体をエーテルで洗浄し
た。ろ液を減圧蒸発すると濃褐色残渣が得られ、
これをエーテル（300mL）及び水（200mL）中
に採取した。層を分離し、そのエーテル層を別の
水（200mL）で洗浄した。エーテル層を次に
MgSO₄上で乾燥し、ろ過しついで減圧下に濃縮
すると褐色残渣10.7ｇが得られ、これを蒸発蒸溜
により精製し｛120−135℃；0.03トール
（torr）｝、エーテルから結晶化すると3.0ｇの白色
結晶(11)が生じた（収率30％、mp＝64−65℃）。 IR（CHCl₃）cm^-12990，1750，1570，1518，
1482，1375，1230.（br），1024，910，700；¹H
NMR（CDCl₃）δ2.20（ｓ，3H），3.58（ｓ，3H），
6.10（ｄ，Ｊ＝２Hz，1H），6.75（ｄ，Ｊ＝２Hz，
1H），7.35（ｓ，5H）：TLC Rf＝0.58（ヘキサ
ン：EtOAc7：３） 質量分析：C₁₃H₁₃NO₂として 計算値：Ｃ，72.54；Ｈ，6.10；Ｎ，6.44 実験値：Ｃ，72.57；Ｈ，6.09；Ｎ，6.51 ３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキシ）−１
−メチル−５−フエニルピロール(13) アルゴン下の、脱酸素化メタノール（15.5mL）
及び３−アセトキシ−１−メチル−５−フエニル
ピロール(11)（1.3ｇ、6.2mmol）の混合物に脱酸
素化NaOH（2N，12.5mL）を添加した。反応混
合物を氷浴中で15分間撹拌した。次に脱酸素化ク
エン酸（2M，7mL）を添加しついで得られた混
合物を氷浴中で８分間撹拌した。反応混合物を減
圧濃縮し、次に水20mLを添加し、ついで酢酸エ
テル（EtOAc）（50mL）で２回抽出した。
EtOAc層を合せ、MgSO₄上で乾燥し、ろ過しつ
いで減圧濃縮すると３−ヒドロキシ−１−メチル
−５−フエニルピロール(12)が橙色残渣として得ら
れる。アルゴン下に、無水THF（12.4mL）、ピリ
ジン（0.6mL，7.4mmol，1.2eq）及びトリフル
オロ酢酸（1.2mL，15mmol，2.4eq）の冷溶液を
前記橙色残渣に添加し、続いてすぐに、無水
THF（12.4mL）中に溶解して調製したばかりの、
Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルクロリド（1.2ｇ，
7.4mmol、1.2eq）溶液を添加した。得られた混
合物を１時間０℃で撹拌した。次に、水性クエン
酸（1M、5mL）及びEtOAc（30mL）を添加して
反応を停止した。簡単に混合した後、層を分離し
ついで有機層を順次、飽和NaCl溶液、５％
NaHCO₃で２回及び再び飽和NaCl溶液で洗浄し
た。EtOAc抽出物を次にMgSO₄上で乾燥し、ノ
リツト（Norit）211で処理し、ろ過しついで減
圧濃縮すると粗生成物(13)が橙色残渣として得られ
た。これをヘキサン：EtOAc（１：１）（5mL）
に溶解し、ヘキサン：EtOAc（７：３）で溶離す
ることによりカラム（SiO₂，100ｇ）上でクロマ
トグラフイーにかけると、濃厚な淡橙色油状物質
として(13)１ｇが得られた。この粗生成物の一部を
更に半調製用HPLC（カラム，IBMシリカ，１cm
×25cm；移動相，ヘキサン：EtOAc8：２；流
速、4.0mL／min；圧力，0.2psi）により精製す
ると蜂蜜色の濃厚な油状物質(13)が生じた。 IR（フイルム）cm^-13260，2950，1760，1520，
1350，1170，770；¹H NMR（DMSO−d₆）δ1.28
（ｄ，Ｊ＝７Hz，3H），2.36（ｓ，3H），3.58（ｓ，
3H），5.85（ｄ，Ｊ＝２Hz，1H），6.15（ｍ，1H），
6.74（ｄ，Ｊ＝２Hz，1H），7.30−7.80（ｍ，9H），
8.37（ｄ，Ｊ＝８Hz，1H）；¹³C NMR（DMSO−
d₆δ18.205，20.936，34.917，51.240，100.598，
113.148，126.544，127.000，128.105，128.560，
129.601，130.901，132.202，135.714，138.315，
142.672，169，724；TLC Rf＝0.52（トルエン：
ジオキサン４：１）； 高分解能質量スペクトル，C₂₁H₂₂N₂O₄S 計算値：ｍ／e398.1300， 実験値：ｍ／e398.1297， (2)−(4) ３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキ
シ）−５−（ｐ−クロロフエニル）ピロ−ル(18) 一連の実験を行つて、化合物(1)（式中、ＡはＮ
−トシル−Ｌ−アラニニル、Ｒはｐ−クロロフエ
ニル、R^*はＨ、ＸはNR′及びR′はＨである）に
相当する表記エステル化合物を製造した。反応系
列は次のようである。 トランス−β−（ｐ−クロロフエニル）グリシ
ド酸(14) アセトン260mL中のｐ−クロロ桂皮酸（68.5
ｇ；0.375mol）の撹拌スラリーにNaHCO₃（137
ｇ；1.63mol）を添加し、続いて水260mLを徐々
に添加した。この混合物に、22−27℃で2.5時間
かけて、オキソ−ネ（OXONE ；211ｇ；
0.343mol）．EDTAジナトリウム塩120mg及び水
805mLの混合物を添加しか。５時間後、混合物
を12N冷HCl70mLで酸性化し、約2.5までPHを下
げ、次に酢酸エチル700mLで抽出した。抽出物
を食塩水で洗浄し、MgSO₄で乾燥し、ろ過し、
ついでろ液を減圧で蒸発乾固させた。白色固体が
酢酸エチルから結晶化した： mp121−５℃（72.2ｇ；97％収率）。 ¹H NMR（CDCl₃／DMSO−D₆）δ7.3（ｍ，
4H），4.05（ｄ，Ｊ＝２，1H），及び3.4（ｄ，Ｊ＝
２，1H）． 質量分析：C₉H₇ClO₃として 計算値：Ｃ，54.43；Ｈ，3.55；Cl，17.85 実験値：Ｃ，54.53；Ｈ，3.80；Cl，17.91 ２−ヒドロキシ−３−（カルボキシメチルアミ
ノ）−ｐ−クロロヒドロ桂皮酸ジカリウム塩２
水和物(15) KOH（85％）（46.7ｇ；0.709mol）及び水
400mLの溶液にグリシン（25.9ｇ；0.345mol）、
続いてトランス−β−ｐ−クロロフエニルグリシ
ド酸〓（72.2ｇ；0.3635mol）を添加した。この
混合物を100℃で２時間加熱し、室温まで冷却し
ついで十分にKOHを添加してPHを12まで上げた。
不透明溶液を酢酸エチルで３回抽出し、この抽出
物を次に捨て、明澄な水溶液（約500mL）を70
℃の水浴を用いて減圧下に蒸発乾固した。この固
体を次に熱エタノール約350mLに溶解し、ろ過
し、ついでこのろ液を氷浴中で数時間冷却した。
結晶化した固体をろ集しついでいくらかの冷エタ
ノールで洗浄した：185℃での脱炭酸によりmp93
−５℃（57.2ｇ；41％）．¹H NMR（D₂O−TSP）
δ7.4（ｓ，4H），4.7（ｓ，6H，交換可能なプロト
ン），4.4（ｄ，Ｊ＝４，1H），4.05（d.J＝４，
1H），及び3.1（ｓ，2H）． 質量分析：C₁₁H₁₀ClNO₅K₂・2H₂Oとして 計算値：Ｃ，34.24；Ｈ，3.66；Ｎ，3.63 実験値：Ｃ，34.40；Ｈ，4.03；N.3.42 Ｎ−アセチル−３−アセトキシ−５−（ｐ−ク
ロロフエニル）ピロール(16) ２−ヒドロキシ−３−（カルボキシメチルアミ
ノ）−ｐ−クロロヒドロ桂皮酸ジカリウム塩２水
和物(15)（10ｇ；0.02591mol）に無水酢酸40mL及
びピリジン（30mL）を添加した。この混合物を
ゆるやかに35℃まで加熱するとその時点で溶液は
発熱し67℃まで温度が上昇し、次に下降しはじめ
たので、ここで再び加熱しはじめた。混合物を
121−２℃（内部温度）で１時間加熱し次に冷却
した。反応混合物に酢酸エチル約30mLを添加す
るとほとんどの酢酸ピリジニウム塩が沈澱し、こ
の塩をろ集しついで少量の酢酸エチルで洗浄し
た。ろ液を真空蒸発させて油状物質としてついで
氷水を添加した。生成物をエーテルで抽出し、つ
いでこのエーテル抽出物を順次、冷いクエン酸希
釈水溶液で２回、冷水、冷いNaHCO₃希釈水溶
液で３回、冷水及び食塩水で洗浄し、続いて
MgSO₄上で乾燥及びろ過を行つた。ろ液をダル
コ（Darco）10ｇで処理し、20分間撹拌し次にろ
過した。ろ液を真空蒸発させて抽状物質とした。
この油状物質に２−プロパノール25mLを添加し
た。得られた溶液を冷却してこすると淡黄色結晶
を生じた：mp69−71℃（3.4ｇ；47％）TLC Rf
＝0.61（トルエン：ジオキサン，95：５）。分析試
料は２−プロパノールから再結晶したがmpの変
化は見られなかつた。 IR（KCl）cm^-11755（Ｃ＝Ｏ，エステル）及び
1730（Ｃ＝Ｏ，アミド）；¹H NMR（CDCl₃）δ7.4
（ｍ，5H），6.2（ｄ，Ｊ＝２，1H），2.4（ｓ，3H）
及び2.3（ｓ，3H）． 質量分析：C₁₄H₁₂ClNO₃として 計算値：Ｃ，60.55；Ｈ，4.36；Ｈ，5.04 実験値：Ｃ，60.65；Ｈ，4.55；Ｎ，5.07 ３−ヒドロキシ−５−（ｐ−クロロフエニル）
ピロール(17) Ｎ−アセチル−３−アセトキシ−５−ｐ−クロ
ロフエニルピロール(16)（2.8ｇ；0.01mol）の試料
をN₂気流を用いて10分間脱酸素化した。この固
体を次に脱酸素化メタノール（30mL）に溶解
し、これを次に−８℃まで冷却した。直ちに、水
20mL中のNaOH（1.6ｇ；0.04mol）の冷脱酸素化
溶液を添加し、この溶液を次に僅かに加熱して15
℃とし、次に直ちに−５℃まで冷却した。25分後
明澄溶液を水15mL中のクエン酸（4.2ｇ；
0.02mol）の冷脱酸素化溶液で処理し、ついで温
度が５℃まで短時間で上昇した。−５℃で0.5時間
撹拌後、固体をろ集し冷脱酸素化H₂Oで洗浄し
た。淡縁色生成物を真空下、室温でP₂O₅を用い
て数日間乾燥した（1.3ｇ；68％）；TLC Rf＝
0.19（CHCl₃：EtOH.9：１）；IR（KCl）はＣ＝Ｏ
吸収の証拠を示さなかつた。 質量分析：C₁₀H₈ClNO・1/6H₂Oとして 計算値：Ｃ，61.08；Ｈ，4.27；Ｎ，7.12 実験値：Ｃ，61.36；Ｈ，4.44；Ｎ，6.85 ３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキシ）−５
−（ｐ−クロロフエニル）ピロール(18) N₂により脱酸素化されたTHF（15mL）にピリ
ジン（0.65mL；0.008mol）、トリフルオロ酢酸
（1.27mL；0.0164mol）、及び３−ヒドロキシ−５
−ｐ−クロロフエニルピロール(17)（1.3ｇ；
0.0065mol）を添加した。溶液を０℃〜４℃まで
冷却し、ついでTHF15mL中のＮ−トシル−Ｌ−
アラニニルクロリド（2.1ｇ；0.008mol）の、N₂
により脱酸素化された、冷却（０℃〜−４℃）溶
液を10分間に亘つて添加した。混合物を０℃に１
時間保持した後、氷及び1Nクエン酸100mLの混
合物を添加した。この混合物を酢酸エチルで抽出
し、ついで抽出物を冷飽和食塩水で１回、冷い希
釈NaHCO₃で２回、冷飽和食塩水で１回洗浄し、
これに続いてMgSO₄上で乾燥しろ過した。ろ液
をダルコ（Darco）２ｇで処理しついで10分間撹
拌し、ろ過し、ついでろ液を真空濃縮して赤味が
かつた褐色油状物を得た。ダルコ（Darco）1.3
ｇを用いて２回目の処理を行うと淡赤色油状物質
を生じた。この油状物質をトルエン：シクロヘキ
サン（４：１）に溶解しついで一晩冷蔵庫に入れ
た。淡いサーモンピンク色の結晶が得られた。
（1.45ｇ；53％）；mp113−５℃TLC Rf＝0.47
（Et₂O）；IR（KCl）cm^-11740（Ｃ＝Ｏ，エステ
ル）；¹H NMR（CDCl₃）δ8.4（br ｓ，1H），7.8
−7.2（ｍ，8H），6.7（ｍ，1H），6.2（ｍ，1H），
5.5（ｄ，Ｊ＝9.1H），4.2（p.J＝８，1H），2.4（ｓ，
3H），1.4（ｄ，3H）；MS（EI.DIP）ｍ／e418
（M⁺，2.3％）及び420（M⁺，0.8％）． 質量分析：C₂₀H₁₉ClN₂O₄Sとして 計算値：Ｃ，57.34；Ｈ，4.57；Ｎ，6.69 実験値：Ｃ，57.53；Ｈ，4.58；Ｎ，6.67 (3) 種々の試験具の製造およじ使用 一連の実験を行つて本発明の試験具を製造し、
前出のエステル基質について、その白血球−触媒
加水分解能、それにつづく両性イオン（）との
カツプリングを行う能力、すなわち尿中の白血球
に対する応答性を試験した。各試験具は試験試薬
を含む小さい四角いろ紙からなり、ろ紙はポリス
チレンフイルム片の一端に貼付された。ろ紙には
緩衝液、前述のエステル、促進剤及び両性イオン
カツプリング剤を含浸した。試験された試験具の
各々は尿中白血球について正の試験結果を示すこ
とが判明した。 (3)−(1) エステルが３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラ
ニニルオキシ）−５−フエニルピロール(4)であ
る試験具 尿中白血球の存在に対して鋭敏な試験具を製造
した。この試験具はポリスチレンフイルムの細長
い細片の一端に貼られた小さい四角いろ紙を含
む。このろ紙には発色性エステル、促進剤及びジ
アゾニウム塩をはじめとする種々の成分を含浸さ
せた。12インチ（30.7cm）巾のイートン・アン
ド・デイツクマン（Eaton and Dickman）
＃205ろ紙片を、次のものを含有する水溶液に浸
した：0.4M ホウ酸塩−NaOH緩衝液PH−9.0
2.0％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドンＫ−30
0.2％（ｗ／ｖ）バイオターグ（Bioterg）AS−
40 0.25M NaCl このろ紙を次に、H₂O1インチ（2.6cm）の空気
流圧力で175−200〓のオバリー・エア・ホイル
（Overly Air Foil）ろ紙乾燥器中で７分間乾燥
した。次に、この乾燥ろ紙を、 1.5％（ｖ／ｖ）ｎ−デカノール 0.7mM １−ジアゾ−２−ナフトール−４−ス
ルホネート 1.1mM ３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオ
キシ）−５−フエニルピロール を含むアセトン溶液に含浸した。この含浸にひき
続き、H₂O0.5インチ（1.3cm）の空気流圧力で
150〓のオバリー（Overly）炉中で７分間乾燥し
た。少し黄色がかつた試験紙が得られた。 乾燥含浸ろ紙を、一辺が0.2インチ（0.5cm）の
寸法の正方形に裁断し、４インチ（10.2cm）×２
インチ（5.1cm）の軸配向ポリスチレン片の一端
に貼り付けた。細片へのろ紙の貼付けはダブル・
ステイツク（Double Stick）両面接着剤｛スリ
ーエム（3M）・カンパニー｝を用いて行つた。 (3)−(2) エステルが３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラ
ニニルオキシ）−１−メチル−５−フエニルピ
ロール(13)である試験具 エステル指示薬として１−メチル−３−（Ｎ−
トシル−Ｌ−アラニニルオキシ）−５−フエニル
ピロールを使用し、カツプリング剤が１−ジアゾ
ーナフタレン−４−スルホネートである、尿中白
血球の存在に対して鋭敏な試験具を製造した。 ろ紙｛イートン・アンド・デイツケマン
（Eaton and Dikeman））＃205｝を、 0.4M ホウ酸 2.0％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン（Ｋ−
30） 0.2％（ｖ／ｖ）バイオターグ（Bioterg）AS
−40 0.25M NaCl を含有する第１浸漬水溶液に浸した。ろ紙を含浸
するに先立ち、この溶液をNaOHで滴定してPH
9.0にした。 第二浸漬アセトン溶液は、 0.75mM １−ジアゾ−２−ナフトール−４−
スルホネート 1.3mM １−メチル−３−（Ｎ−トシル−Ｌ−
アラニニルオキシ）−５−フエニルピ
ロリドン 1.5％（ｖ／ｖ）ドデカノール を含有した。 第一浸漬水溶液への含浸に続いて、ろ紙を約５
分間約80℃で乾燥し、第二浸漬溶液に約５分間70
℃で浸漬した。 この二度含浸したろ紙を次に強制空気炉中で５
分間50℃乾燥した。 この乾燥ろ紙を一辺0.2インチ（0.5cm）の寸法
の正方形に裁断し、ついで0.2インチ（0.5cm）×
3.25インチ（8.3cm）の寸法のポリスチレンフイ
ルムの一端に貼付した。貼付はスリーエム
（3M）・カンパニーからの両面テープ、ダブル・
ステイツク（Double Stick）を用いて達成した。
試験具は100個ずつびんに、乾燥保存のためにシ
リカゲル及び分子ふるいと共に貯蔵した。 (3)−(3) エステルが３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラ
ニニルオキシ）−５−（ｐ−クロロフエニル）ピ
ロールである試験具 アセトン溶液がフエニルピロリドンの代りに
1.3mM ３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキ
シ）−５−（ｐ−クロロフエニル）ピロールを含有
していた他は実験(3)−(2)におけると同様にして試
験具を製造した。 (4) 試験具の評価 (3)の実験で製造された試験具を、尿中に存在す
る白血球の検出能の評価に付した。 試験試料を正常なヒトの尿プールから調製し
た。１試料を空試験として使い、採取したばかり
の血液から単離した白血球を２つの別の尿試料に
添加して、それぞれ0.10及び75白血球／μLの濃度
とした。 試験具を迅速に試験試料中に浸漬しついで引き
出した。２分後、顕微鏡を用いて観察して400−
700nm（ナノメートル）のうちの異なる波長で％
反射率を測定した。 試験具のすべてが試験試料中の種々の白血球濃
度に相当する光反射率において明らかに見分けら
れる差異を立証することをデータは示している。
データを次表に示す。

【表】 先に述べたような、本発明の多くの他の修正及
び変更を本発明の精神及び範囲を逸脱することな
く行うことができることは明らかである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 試験試料中の白血球、エステラーゼ又はプロ
   テアーゼの存在を測定するための組成物であつ
   て、 (1) 芳香族フエノール又は擬芳香族フエノールと
   酸のエステルであつて、白血球、エステラーゼ
   又はプロテアーゼの存在下で加水分解されてフ
   エノール又は擬フエノールを生じ、該フエノー
   ル及び擬フエノールは後記ジアゾニウムイオン
   とカツプリングすることができるエステル；及
   び (2) 式 （式中、A^-はアニオンであり、Ｒは同一又
   は異なり、Ｈ、低級アルキルもしくはアリール
   であるか、又はＲの両者が一緒になつて縮合環
   系を形成し、R¹はＨ、OH又は低級アルキルで
   ある）で示されるジアゾニウム塩； からなることを特徴とする組成物。 ２ 前記A^-が、４位にある特許請求の範囲第１
   項記載の組成物。 ３ 前記A^-が、SO₃ ^-である特許請求の範囲第２
   項記載の組成物。 ４ 前記ジアゾニウム塩が、１−ジアゾ−２−ナ
   フトール−４−スルホン酸エステルである特許請
   求の範囲第１項記載の組成物。 ５ 前記エステルが、３−（Ｎ−トシル−Ｌ−ア
   ラニニルオキシ）−５−フエニルピロールである
   特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ６ 前記組成物が、更に促進剤を含む特許請求の
   範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の
   組成物。 ７ 前記促進剤が、約８ないし15個の炭素原子を
   有するアルコールである特許請求の範囲第６項記
   載の組成物。 ８ 試験試料中の白血球、エステラーゼ又はプロ
   テアーゼの存在を測定するための試験具であつ
   て、 (1) 芳香族フエノール又は擬芳香族フエノールと
   酸のエステルであつて、白血球、エステラーゼ
   又はプロテアーゼの存在下で加水分解されて前
   記フエノール又は擬フエノールを生じ、該フエ
   ノール及び擬フエノールは後記ジアゾニウムイ
   オンとカツプリングすることができるエステ
   ル；及び (2) 式 （式中、A^-はアニオンであり、Ｒは同一又
   は異なり、Ｈ、低級アルキルもしくはアリール
   であるか、又はＲの両者が一緒になつて縮合環
   系を形成し、R¹はＨ、OH又は低級アルキルで
   ある）で示されるジアゾニウム塩； からなる組成物を包含した担体マトリツクスであ
   る試験具。 ９ 前記ジアゾニウム塩が、１−ジアゾ−２−ナ
   フトール−４−スルホン酸エステルである特許請
   求の範囲第８項記載の試験具。 １０ 前記組成物が、更に促進剤を含む特許請求
   の範囲第８項記載の試験具。 １１ 前記促進剤が、約８ないし15個の炭素原子
   を有するアルコールである特許請求の範囲第１０
   項記載の試験具。