JPS60227698A - 白血球、エステラーゼ又はプロテアーゼの存在を測定するための組成物及び試験具 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は白血球細胞、エステラーゼ及びプロテアーゼの
ような分析対象物の存在についての試験試料の試験にお
いて有用な新規組成物及び試験具に関する。本発明は特
に尿のような体液中の白血球濃度を検出するのに有用で
あり、上記試験のための実験室的操作を、顕微鏡による
観察を必要とする煩雑な計数操作から迅速かつ簡便な浸
漬−読取り操作へと変えるものである。患者の尿中に異
常に高濃度の白血球が存在する場合は、腎臓もしくは泌
尿生殖路感染のような病的症状又は他の機能障害を示唆
している可能性がある。従って、正確な尿白血球につい
ての情報は、上記病理学的症状の診断及び処置の際に医
者にとって極めて有用な手段となりうる。 従来、医療専門家は尿沈渣物又は非遠心分離化尿中の白
血球母集団を計数する目視測定法に頼ってきたが、この
方法は遠心分離機及び顕微鏡のような高価な装置と同時
に臨床医側に法外な時間消費を要求するものである。更
に従来法は非溶解細胞のみを測定するという短所をもつ
。原糸に現われる白血球は、広範囲の細胞溶解に好都合
な条件の影響を受けやすい。例えば、異常に高いｐＨの
尿中においては白血球の半減期は６０分と低いこともあ
ることが知られている。溶解細胞は目視検査法において
は検出されないので、誤った低い測定及び誤った負の結
果となりうる。 顕微鏡による白血球分析の二手法−尿沈渣及び非遠心分
離化均質比圧−のうち、前者が明らかに最も望ましい。 信頼しうる結果が後者により得られることもあるが、尿
沈渣観察法が実際の圧倒的多数において用いられる。こ
こで必要とされることば、尿試料を遠心分離し、沈渣物
を単離し顕微鏡検査に付すことである。分析者は次に視
野内に現われる白血球の数を計数する。この作業は上皮
細胞及び塩粒子のような沈渣中の他の尿成分の存在によ
り更に煩雑なものになる。沈渣成分の含有量が様々なの
で試料の非均質性及び顕微鏡装置の光学倍率が異なるこ
とをはじめとする他の複雑な要因と相俟って、最終測定
に著しい誤差を招くこともある。 従って、白血球測定の迅速かつ簡便な方法、即ち、費用
のかかる装置と同時に時間がかかる手法の必要性を排除
するもの、及び細胞が非溶解又目″ン容角靭こかかわら
ず、エステラーゼ、プロテアーゼ又は白血球細胞に対し
て正確な応答をなすものは実際、技術水準に大きな進歩
をもたらすことになるであろうことは明らかである。本
発明はこのような進歩をもたらす。更に本発明は白血球
を見出す能力にではなく、それらが示す酵素活性に基づ
くものであり、従って実質的に」−記の不正確さを持た
ない。 本発明以前は、加水分解性分析対象物の測定方法は、エ
ステラーゼ又はプロテアーゼにより加水分解されると着
色アルコール生成物を生成する発色性エステルを含み、
この非分解エステルは遊離アルコールとは異る色を呈す
るものであった。これらの系の多くは促進剤化合物及び
ジアゾニウム塩カップリング剤を含んでいた。 発車１＋：エステル かくして、酵素活性により開裂すると色又は他の検出可
能な種の形成をもたらすある種のエステル類の使用を開
示する文献が、従来技術において存在する。英国特許第
１．．１２８，３７１号は体液中の加水分解性酵素を検
出するのに有用な色原体としてインドキシル及びチオイ
ンドキシルエステル類の使用を開示している。酵素がエ
ステルを開裂して遊離インドキシルが発生し、これが次
に酸化されて、容易に観察しうる青色色素である２分子
体生成物インジゴを生成する。上記活性は他の酵素のう
ちとりわけコリネステラーゼによるものといわれる。こ
の特許は又、エステル基質のインドキシル部分の他に、
酸残基が、検出されるべき酵素と特に関連して選ばれる
ことを教示している。例えば、エステラーゼ又はリパー
ゼの検出のために酸残基はそれぞれ酢酸エステル、ラウ
リン酸エステル又はステアリン酸エステルでもよいと述
べている。 ホスファターゼ又はザルファターゼのような酵素を検出
するためにはアシル残基は無機物であってよい。従って
この英国特許はエステル分解酵素を測定するために基質
として発色性エステルの使用を教示しており、上記エス
テルはエステルのアルコール部分としてインドキシル又
はチオインドキシルを含み、アシル部分は測定される特
定の酵素に合せる。 アシル残基がＮ−保護化アミノ酸又はペプチドからなる
エステルに対する、エステラーゼの特異性を立証する２
文献以上に、注意深いアシル残基の選択の効果を明らか
に例示するものは他にない。 例えばジャノフ（Ｊａｎｏｆｆ）等、ブロック、ツク・
エクスペル・ハイオル・メト（Ｐ　ｒｏｃ、　Ｓ　ｏｃ
。 Ｅｘｐｅｒ、　Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、　）　１３６　：１
０４５〜１０４９　（１９７１）はアラニンエステルが
ヒト白血球から得たエステラーゼに対して特異的基質で
あることを教示している。具体的には、この文献はヒト
白血球顆粒の抽出物はＮ−アセチル−し−７−７ニルー
し一アラニルーし一アラニンメチルエステルを加水分解
できることを教示している。 更に、Ｌ−アラニン−ｐ−ニトロフェニルエステルは同
様に加水分解されて黄色のｐ−二トロフェノール着色型
を生成した。 同様に、スウイートマン（Ｓ　＋ｑｅｅｔｍａｎ　）等
＼ジャール・ヒスト、ツク（Ｊｏｕｒ、Ｔ（ｉｓｔ、Ｓ
ｏｃ、、２２：３２７−３３９）ば１−ナフチル　Ｎ−
アセチル−ＤＬ−アラニン、１−ナフチル　Ｎ−アセチ
ル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニン及び１
−ナフチル酪酸エステルを使用してエステラーゼの存在
を立証することを教示している。 ベーリンガー・マンハイム・ジーエムビーエソチ（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　ＧｍｂＨ）に譲
渡された米国特許第４．２７８，７６３号はこれらの教
示を併合して、　白血球エステラーゼ活性のための従来
の発色性基質の更に別の例としてアミノ酸又はペプチド
のインドキシル又はチオインドキシルエステルに到達し
ている。ジャノフ及びスウィートマンの文献と同様に、
ヘーリンガー特許はそれらのエステル分解傾向において
プロテアーゼ及びエステラーゼの等価性を教示している
。 イｇｉ＋、ｉメｉｌ＋ エステル加水分解反応は無数のアルコール類をはしめと
する多くの核剤の存在により活性化されることが知られ
ている。従ってフェニル酢酸エステル及びｐ−二トロフ
ェニル酢酸エステルのエステラーゼによる加水分解速度
はメタノール又はブタノールを添加すると２．５〜５．
５倍増加する。 グリーンズエイド（Ｇｒｅｅｎｚａｉｄ）及びジエンク
ス（Ｚｅｎｃｋｓ　）　（バイオケミストリ（旧ｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｖｊ＋）１０　（７）、１２１０−１２２２
　（１９７］、））。 更に、この効果はｎ−アルキル基の長さと共に増加する
。ワイン（Ｗｙｎｎｅ）及びシャラチン（Ｓｈａｌａｔ
ｉｎ　）、（ヨール・シェー・ハイオケムＥｕｒ、Ｊ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　３１：５５４−５６０（１９７２
）ｌ。 特に、このアルコールの活性化効果はアミノ酸エステル
について観察されてきた。ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−ア
セチル−し−アラニネ−１・の加水分解はメタノールの
存在によって活性化（促進）される。ファストレツツ（
Ｆａｓｔｒｅｚ）及びフェルシュド　（Ｆｅｒｓｈｔ　
）、　（バイオケミストリ（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）、１２　（１１）、２０２５〜２０３４　（１９７
３）ｌ。高分子量アルコールばｐ−ニトロフェニル−１
−ＢＯＣ−Ｌ−チロシネートのエステラーゼ誘起加水分
；ｔ￥速度を増加させる。ア゛ンシコニ（Ａｓｈｅ　）
及びチンメルマン（Ｚ　ｉｍｍｃｒｍａｎ）、（ハイオ
ケム（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）及びハイオフィス・リス・
コム（Ｂｉｏｐｈｓ　、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、）　、７５
　（１）、１９４−１９９　（１９７７）ｌ。米国特許
第４．２９９，９１７号の開示はある種の金属錯体、ピ
リジン誘導体及びイミダゾール類のような他の公知のエ
ステル加水分解活性化剤について述べている。 シアゾニヴ握蕩カップリン久弁１ フェノール及び擬フェノールとカップリングしてアゾ色
素を生成するある種のジアゾニウム塩の使用も又知られ
ている。マーチネット（Ｍａｒｔｉｎｅｔ）及びトノ？
ニア（Ｄｏｒｎｉｅｒ）　（コンブト・レンド（Ｃｏｍ
ｐｌ、、　）　（Ｒｅｎｄ、）　、１７０．　５９２（
１９２０））。上記手法ばエステラーゼ分析に用いられ
、これによりインＩＳキシルエステルばエステラーゼに
より加水分解されてインドキシルを生成し、これが順次
ジアゾニウム塩とカップリングして対応するアゾ色素を
形成する。ボルト１ （Ｈｏｏｔ　）及びヒツクス（Ｈｉｃｋｓ）、（ジェー
・セル−ハイオル（、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）　２
９．２６］−３６６（１９６６））　ｉゴスロー（Ｇｏ
ｓｓｒａｕ）、（ヒストケミストリ　（Ｈｉｓｔｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ　）　、５７．３２３−３４２　（１９
７８））；西独公開公報第３０１７７２１号（１９８０
年５月９日出願）。 白血球、エステラーゼ又はプロテアーゼ検出用組成物中
にカップリング剤として用いられることが知られている
ジアゾニウム塩は、ジアゾカチオンに対する外来性アニ
オンによるものである。更に、これまで検討してきた調
製物は各々、ジアゾニウム塩と反応しうる、試料中に存
在するフェノール性化合物又は他の化合物の存在により
妨害又は不正確さをもつという欠点を少なくともある程
度有する。上記妨害は誤った負の試験結果となりうる。 叉絢 本発明に至る技術開発の背景を要約すると、溶液中の加
水分解性酵素及び白血球細胞を測定するためのいくつか
の方法が知られている。尿中白面２ 球母集団の測定には、例えば、顕微鏡が長い間好ましい
方法であった。従って、技術者は尿試料の顕微鏡スライ
ドを作成し、顕微鏡の視野内の白血球細胞の数を計測す
ることを要求された；操作は法外な時間消費並びに顕微
鏡及び遠心分離機のような高価な装置を必要とした。 化学的及び生化学的手法は、診断において白血球を試験
するための顕微鏡に急速に挑戦しつつあり、かつ研究室
において昔からある手段である。 化学試験のかなめの役を担ってきた発色性エステルは次
のアルコール部分及びアシル部分を含む。 インドキシル　酢酸エステル チオインドキシル　酪酸ニステル ル−二Ｉ・ロフェニル　ラウリル酸エステルα−ナフト
ール　ステアリン酸エステルアミノ酸 ヘプチド 上記エステルを利用する化学はジアゾニウム塩カップリ
ング剤と同様に種々の加水分解促進剤により助けられて
きた。促進剤として多くのアルコールが用いられてきた
が、ある種の金属錯体、ピリジン誘導体及びイミダゾー
ルも同様である。ジアゾニウムカチオンとイオン結合又
ムｊ会合している適切な外来性アニオンを有するジアゾ
ニウムカチオンは上記化学のためのカップリング剤とし
て周知であり、それにより、エステルの加水分解の際生
成するアルコール（フエ′ノール）はジアゾニウム塩と
カップリングしてアブ色素を形成する。 しかしながら、ジアゾニウム塩と反応する、試料中のフ
ェノール及び他の化合物によるジアゾニウム塩に対する
妨害のために誤った負の又は誤った低い試験結果が得ら
れることがあることも又知られている。 本発明は、試験試料中の白血球、コ：ステラーセ又はプ
ロテアーゼの存在を測定するだめの新規な試験組成物、
試験具及び方法゛を提供する。本組成物は上記分析対象
物と相互反応して検出可能な応答をなすことが可能なエ
ステル、及び構造−２ 式中、Ａ−はアニオンであり、Ｒば同一でも異なってい
てもよいが、Ｈ１低級アルキル、アリールであるか、又
はＲの両者が協働して縮合環系を形成し、式中、Ｒ′は
旧ＯＨ又は低級アルキルである、 を有するジアゾニウム塩からなる。本試験具は本組成物
を包含せしめた１１体マトリックスからなる。 本方法は試験試料と本試験具を接触させ、ついて検出可
能な応答を観察することからなる。 窟−希 本論議において用いられるいくつかの用語について、読
者がそれらのそれぞれの意味を確実に知るためにこの上
述べておくべきである。かくして次の定義は本発明の範
囲を明らかにし、かつ、その調製及び使用を可能にする
ために提供される。 ５ （１）　語句“Ｎ−保護化−アミノ酸残基゛及び“Ｎ−
保護化−ペプチド残基”は２つの点で定義を要する。“
Ｎ−保護化゛はアミノ酸又はペプチドのアミノ基の化学
に関連し、これにより窒素原子に結合している水素がア
セチル、ｐ−１−ルエンスルホニル（トシル）及びｔｅ
ｒｔ−ブチロキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）並びに従来
公知の他のＮ−保護基のような保護基によって置換され
ているものである。 語句“アミノ酸基”及び“ペプチド残基”により、その
カルボキシル基の−ＯＨがないアミノ酸又はペプチド分
子を意味する。 （２）　語句“アリール゛により芳香性を有する任意の
環系を意味する。この語句には、ナフチルのような縮合
環系と同様にピロール、フェニルおよびピリジルのよう
な５−及び６−員環が含まれる。従って、この芳香族環
系は複素環式又は同素環式であってもよく、かつ、白血
球細胞、エステラーゼ又はプロテアーゼの存在下の＆Ｉ
］成物酸物水分解能を置換基が妨害しないならば、置換
されて６ いても置換されていなくてもよい。」二記置換基の選択
は日常の実験室的決定に任されることであり、本開示に
与えられている。 （３）　本開示に用いられる語句“低級アルキル”は１
ないし６個の炭素原子を含むアルキル部分である。低級
アルキルの意味には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、
イソプロピル、ｎ−ブチル、５ｅｃ−ブチル・ｔｅｒｔ
−ブチル並びにペンチル及びヘキシルのすべての異性体
が含まれる。これらは非置換でもよく、又はそれらが組
成物もしくは試験具の、白血球細胞、エステラーゼもし
くはプロテアーゼの検出能を妨害しないならば置換され
ていてもよい。 （４）　“適切な緩衝物質”により、水性試験試料と接
触した際、結果として少なくとも約７のｐＨをもたらす
緩衝剤を意味する。好ましくは、緩衝剤は約７〜１０、
及び最適には８．５〜９．０の範囲のｐＨを生しさせる
ことができるものであり、ホウ酸−ＮａＯＨ，バイシン
（Ｎ、Ｎ−ビス〔２−ヒドロキシエチル〕〜グリシン）
、又はｃｏＥ’ｓ（２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノコ
エタンスルポン酸）は適切な緩衝物質の例である。 （５）　語句パ促進剤゛圃ここに述べる発色性エステル
の加水分解速度を高めるのに役立つ任意の化合物に関連
する。ピリジン、イミダゾール及びそれらの誘導体；式
Ｄｍ　（Ｂ（ＣＮ）ｎ（Ｎｏ）ｔ＋　）　（式中、Ｄは
アルカリ金属、Ｂは重金属イオン、Ｐば０又は１、ｍは
２〜５、ｎは４〜８、及びｍはｎ及びＢの価数の和であ
る）の金属錯体；及びアルコール類のような化学的に様
々な物質である。適切なアルコール類は１から約１５個
の炭素原子を有する。分枝鎖アルコール類も本発明の範
囲に包含されるが線状アルコール類が分枝鎖アルコール
類より好ましい。 （６）　“縮合環系”により、一対の炭素原子を共有す
る２個以上の芳香族環を意味する。例えば、構造： Ｎ′＋； において、両方のＲは協（す」して縮合環系：Ｎ： 式中、両方のＲは協働して −（−ＣＨ＝　ＣＩ（−ＣＨ＝　ＣＨ÷を構成する、を
生成することができる。更に別の例は、Ｎ： 式中、両方のＲば協働して −（−ＣＩ−１＝ｃ−ＣＨ＝Ｎ−３−を構成する、であ
る。従って、この縮合環系は多核、芳香族であり、複素
環式又は同素環式であってもよい。 （７）　語′リパ検出可能な応答パは、直接的観察又は
計器のいずれかにより検知されうる、試験子９ 段系におけるパラメータの変化又は発現を意味するもの
とここでは意図されており、水性試験域ネ」中の特定の
分析対象物の存在の関数である。検出可能な応答として
は色、螢光、反射率、ｐ　Ｈ１化学ルミネッセンス及び
赤外スペクトルの変化又は発現がある。 （８）　ここに用いられる用語°゛アニオン”としては
約７〜１０の範囲のｐＨにおいて負に電荷され、構造（
１）に示した環に共有結合で結合している部分が挙げら
れる。アニオンの定義には、スルホニル、カルボニル及
びホスホニルが含まれる。 負電荷を帯びることが可能な部分て共有結合的に置換さ
れている低級アルキル及びアリール基も又包含され、こ
の置換基を有する基はそれ自身、共有結合的に構造（Ｉ
）の環に結合している。後者としてはｎ−へキシル−６
−スルホネート、フェニルカーボネート、およびｎ−プ
ロピル−３−ホスホネートのような様々な型が挙げられ
る。 則戊腹 本発明の３、■酸物はエステル及びジアゾニウム塩０ を含む。これらの成分は広い範囲で選択することが許さ
れるが、それぞれが液筒結果、すなわち、短時間での高
度な検出応答発現、をもたらす好ましい実施態様がある
。この最高効率化は組成物中に促進剤を包含させること
により尚一層助長される。 （１）エステル 本発明の組成物及び試験具の両者は芳香族又は擬芳香族
フェノールと酸のエステルを含有する。 更に、前記エステルは、白血球、エステラーゼ又はプロ
テアーゼの存在下で触媒により加水分解されて、前記フ
ェノール又は擬フェノールを生じ、次いで前記ジアゾ両
性イオンと自由にカップリンクすることができるもので
ある。本発明に使用するのに最適ないくつかのエステル
としては、酢酸インド′キシル、酪酸インドキシル、ラ
ウリン酸インドキシル、ステアリン酸インド′キシル、
Ｎ−保５ｉｐ　（ｌｓアミノ酸又はベプチ１〜のインド
キシルエステル及びそれらのチオインドキシル類縁体が
挙げられる。ｐ−二トロフェニルーＮ−トシル−し−ア
ラニネート、α−ナフチノＩ　Ｎ−保護化アラニネート
エステルも含量れる。エステルの更に別の例としては、
構造： 式中、Ａは、その特有の酸の−ＯＨ基を持たない、エス
テル形成酸残基、Ｒは低級アルキル、了り−ル、カルボ
キシル、カルボキシルエステル、アミド又はシアノであ
り、Ｒ＊はＨ１低級アルキル又はアリールであり、Ｘは
Ｏ，ＳまたはＮＲ＊である、 を有するものである。 語句“酸残基”にはそれぞれホスポリツク、スルホニ゛
ンク、カルボニ゛ンク及びカルボ＝ｌ−シリツク、すな
わち、 が包含される。構造（Ｖ）に相当するエステル類キシ）
−５−フェニルピロール、】−メチル−３−（Ｎ−１シ
ル−し−アラニニルオキシ）−５＝フエニルピロール、
３−（Ｎ−１−シルーＬ−アラニニルオキシ）−５−（
ｐ−クロロフェニル）ピロール及び３−（Ｎ−１−シル
ー■、−アラニニルオキシ）−５−フェニルチオフェン
が挙げられる。 （２）促進剤 本発明の組成物はエステルの他に先の項において定義し
たような種々の促進剤を包含してもよい。 アルコール類が、ここに検討しているエステル類のエス
テラーゼ及びプロテアーゼによる触媒加水分解を増大さ
せるのに特に有用であることが判明している。８ないし
１５個の炭素原子を有するアルコール類がこの目的に好
ましいが、一方、デカノール、ウンデカノール及びドデ
カノールは、主として低分子量のアルコールと比較して
、蒸発性が低いために試験具に使用するのに好ましい。 （３）ジアゾニウム塩 本組成物はカップリング剤として特定のジアゾとしてｆ
’１３−（Ｎ−ｒ　’／）’　Ｌ　ｌ　７　／　−−−
ノｖａ３ ニウム塩を含む。全体の反応図式におけるこのジアゾニ
ウム塩の関与は次側により表すことができる： 式中、ＡｒＮ”ｉ：Ｎはジアゾニウム塩（■）であり、
Ａ、Ｐ、Ｒ”及びＸは先に定義したとおりである、 反応生成物■は濃い特色のある色を呈することができる
アゾ色素である。 従って、両性イオンはジアゾニウム塩種であり、そこで
はジアゾニウム基に対するカウンターイオンが環系に共
有結合で結合している。上記アニオンの例としては、ス
ルホニル（ＳＯ３−）　、カルボニル（ＣＯ２−）　、
ホスホニル（ＰＯ：ｌ−）等である。１−ジアブナフタ
レン−４−スルホン酸工４ ステル、］−］シアシー２−ナフ１−−ルー４−スルポ
ン酸エステル１−ジアゾフェニル−３−炭酸エステル及
び他の多くのもの等の化合物が（１）の範曜に含まれる
。■−ジアゾー２−ナフト−ルー４−スルポン酸エステ
ルを用いるのが最も有利であることが判明している。 １帽貧艮 上記に：目酸物は、白血球、エステラーゼ又はプロテア
ーゼを測定するに当たりそれだけで使用することもでき
るし、又担体マトリックスに包含せしめて試験具を形成
し、それによって分析対象物の存在についての迅速かつ
信頼性のおける評価を行うための道具を提供することも
できる。担体マトリックスは通常、しかし必ずしもそう
でばないが、ろ紙のような多孔性物質である。業界で認
められている他の形の担体マトリックス材はフェルト、
多孔性セラミック片、及び織物状又はマット状ガラス繊
維（米国特許第３，８４６，２４７号）である。木）Ａ
、布、スポンジ材及び粘土状物質の使用も又示唆されて
いる。又担体７１−リツクスは種々の千合体フィルム、
ガラス等のように非多孔性であってもよい。すべてのに
記担体マトリックス祠は、他のものと同様に、本発明に
おいて使用可能である。 ろ紙が特に適切であることが判明している。試験具の好
ましい製造方法においては、−片のろ紙を緩衝水溶液で
湿潤させる。この第−浸漬溶液は、界面活性剤、ポリビ
ニルピロリドンのようなザイス剤及び他の不活性成分等
の種々の処理賦形剤も又含んでいてもよい。 この含浸ろ祇を次に乾燥し、アセＩ・ン又は他の非水性
溶媒中の本エステル及び、望ましいならば、促進剤及び
／又はジアゾニウム塩を含む第二浸漬溶液で湿潤させる
。この二度含浸されたろ紙は次に二回目の乾燥を行い、
白血球又は他の分析対象物の存在に鋭敏な試験具を形成
する。 この乾燥された試薬担持担体マトリックスは必要ならば
支持材上に貼付されてもよい。従って、試験具の好まし
い実施態様においては、ろ紙担体マトリックスに上記組
成物を包含せしめ、ごの７１−リツクスを長片の透明な
ポリスチレンフィルムの一端に固着さ−Ｕる。このマト
リックスは両面接着テープ（３Ｍカンパニーから入手可
能なダブル・スティック　（Ｄ　ｏｕｂｌｅ　Ｓ　ｔｉ
ｃｋ■））のような任意の適切な手段によりフィルムに
固着させ、ポリスチレンフィルムの（ｌｈ　ｒｒＲ，ｉ
は把手とて役立つ。使用に際して、このよ・うな試験具
はポリスチレンフィルム支持材の自由ｖ：１（により保
持され、マトリックスフ：）１を試験試料（例えば、尿
）中に浸し、ついてすくに取り出す。一定時間後、何ら
かの呈色又は他の検出可能な応答を観察し、ついで既知
深度の白血球又Ｇ才、エステラーゼもしくはプロテアー
ゼ活性を有する他の分析対象物に対する応答に対応する
参１（（（標〈（ｔと比較する。約１〜３分間のインキ
ュベーション時間は、試薬含有ろ紙中で呈色発現をおこ
させうるのに１ｆｆ）常十分であることが判明している
。 矢放 次の実施例は、読者が本発明物を製造及使用するのを更
に助ｉＪるために提供される。従って、好ましい実施態
様を実験」−の細目にわたって述へ、７ その結果について分析する。実施例は単に説明するだめ
のものを意味し、ここに叙述され特許請求された本発明
の範囲を制限することを意図するものではない。 （１）一般的情報 次の、実験についての検討においては、略号を次に示し
たように用いる。 ｇ　−グラム ｋｇ　−キログラム Ｌ　−リットル ｍ　Ｌ　−ミリリットル Ｍ　−モル濃度 ｍＭ　−ミリモル濃度 Ｎ　−規定 ｅｑ　−当量 ｍｏｌ　−グラム分子量（モル） ｍｉｎｏｌ　−グラム分子量Ｘ　１０’−３（ミリモル
）ａｑ　−水性の ｈｒ　−時間 ＴＬＣ−薄層クロマトグラフィー ８ 赤外Ｎ　Ｒ）スペクトルは、特に断らない限り、ＣｌＩ
Ｃ４：＋　？’４　’／（９，（！：してパーキン−エ
ルマー・モテル（Ｐｅｒｋｉｎ　−Ｅｌｍｅｒ　Ｍｏｄ
ｅｌ）　７　］　ＯＢ又は２３７赤外分光光度計を用い
て得；ポリスチレンフィルムの１６Ｑ２ｃｍ−’ハント
′を外部検量標準として用いた。 プロトン磁気共鳴（’ＨＮＭＲ）スペクトルば、ＪＥＯ
Ｌ　ＦＸ−９００分光計を用いて８９．５５ＭＨ□にお
いて、又はハリアン（Ｖａｒｉａｎ　）　Ｔ　−６０分
光計を用いて６０ＭＨ２において得；スペクトルは特に
断らない限りＣＤＣｌ３溶液中で得た。化学シフトは内
部基準のテトラメチルシランからの低磁場のシグマ単位
として報告する。 ＪＥＯＡ　Ｘ９００分光計を用い、フーリエ（Ｆｏｕｒ
ｉｅ　）変換及び全プロトンの広域ハンド・ノイズ・デ
カップリングを伴う、炭素−１３磁気共鳴Ｃ３ＣＮＭＲ
）スペク１ヘルを２２．５ＭＨ２において得；スペクト
ルは特に断らない限りＣＤＣ７！３溶液中で得た。炭素
シフトは内部基準のテトラメチルシランからの低磁場ミ
ロン当りのパーツとして報告する。 質量スペクトル（ＭＳ）は、電子衝突（ＥＩ）又は高速
原子術部（ＦＡＢ）法のいずれかで操作するヒユーシソ
１−−バツカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）
　５９８５　Ａ分光計で得た。高分解能質量スペクトル
はＡＥＩ　ＭＳ−９０２分光計を用いて得た。 有機試薬はアルドリツヒ・ケミカル・カンパニー　（Ａ
　１ｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ＞
より入手し、特に断らない限り精製せずに用いた。無機
試薬はフィッシャー・ザイエンテイフイツク・カンパニ
（Ｆ　１ｓｃｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏｍｐ
ａｎｙ　）又は他の大手の販売業者からのＡＣ３試薬等
級品であった。反応溶媒はＡＣ３試薬等級品であり、テ
トラヒドロフラン（ＴＴ（Ｆ）はシエー・ティー・・＼
−カー・ケミカル・カンパニー　（Ｊ　、　Ｔ、　Ｂａ
ｋｅｒＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ　）からのＴ
−Ｔ　Ｐ　Ｌ　Ｃ等級品であった。ブライン（Ｂｒｉｎ
ｅ）は飽和塩化ナトラム水溶液を意味する 薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）ばイー・メルク（Ｅ
、　Ｍｅｒｃｋ）からのシリカケル６０Ｆ−１５−、Ａ
−プレー１−を用いて行った。カラムクロマ１〜グラフ
イーはイー・メルク（Ｅ、　Ｍｅｒｃｋ）シリカゲル６
０（７’０〜２３０メツシユ）を用いて行った。すべて
の報告された融点及び沸点は補正されていない。 （２）いくつかの擬フェノール性エステルの製造次の実
験は本発明に有用なエステルの合成を説明するために行
われた。ごれらの実験は特定の出発物質及び最終生成物
に関連しているが、その操作はここに開示した広範囲の
エステル種に適用できると信しられる。 戊 ３−（Ｎ−１〜シル−■、−アラニニルオキシ）−５−
フェニルピロールの合成は次の反応系列に図示される。 １ ２ Ｎ−１−々ＪダｌＩ−二づ一汗ヨＺ ■、−アラニン（１００ＦＪ　ｉ　１．１１ｍｏｌ）を
ＩＮ水酸化すトリウム（水溶？ｆｆ１）２゜２５■５に
溶解し、５℃に冷却し、次いでトルエン４５０ｍＬ中に
溶解したｐ−ｌ〜ルエンスルポニルクロリド（２１８ｇ
　；　１．１１ｍｏｌ　）の溶液を徐々に添加しながら
攪拌した。この混合物を雰囲気温度で２０時間攪拌した
。層を分離し、冷却水性層を濃塩酸でｐＨ１に酸性化し
た。白色固体状の表記化合物をろ過により採集し、水洗
しついで乾燥した。収量１７８．．５ｇ（６６％）；ｍ
ｐ１３４−５°Ｃ；　Ｔ　Ｒ（ＣｕＣｌ２　）ｃｍ−’
１７２６，１３４０．１１６５；、１０９５ｉ’ＨＮＭ
Ｒ（ＤＭＳＯＤ６　）　δ　１．２０（ｄ。 Ｊ＝７，３Ｈ１，，２，，４０（ｓ、３Ｈ）、３．８５
（ｐ、、Ｊ＝８．］　Ｈ）、６．４　（ｂｒ　ｓ；ＩＩ
Ｈ）（ＣＣ１ｚ　Ｔ（）　＋’　７．４１　（（］、、
ｙＡＢ−８＋　２　Ｈ）及び７．７５　（ｄ、ＪＡＢ＝
８．２Ｈ）（パターンの中心：　７．５８　；ΔＶＡｎ
＝２０．４９Ｉ−１２）　、８．’０．３（ｂｒ　ｄ、
Ｊ−８；　ｌ　Ｈ）　（ＮＨ）。 Ｎ′−トシル−Ｉ７−ラー５トモ、丑ルクロリ」プＬ

【
Ｎ Ｎ−トシル−１７−アラニン（１２，４ｇ　；　０．０
５ｍｏｌ）及びチオニルクロリド（２５ｍＬ）の混合物
を９０分５５°Ｃで加熱し、次に四転菌発器を用いて４
０°Ｃで濃縮した。この赤色固体状残渣を沸騰ＣＣ１２
’　４２００　ｍ　ｌ−に溶解し、炉で乾燥したノリッ
ト　（Ｎｏｒｉρ）２１１（（アメリカン・ノリット・
コ・インコーホレーテッド（ＡｍｅｒｉｃａｎＮｏｒｉ
ｔ　Ｃｏ　、　、Ｉｎｃ、　）　ｌ　２０ｇで脱色し、
ろ過しついで冷却した。乳白色の固体状の表記生成物を
ろ過により採集し、ヘキサンで洗浄しついで乾燥した。 収量８．４８ｇ（６５％）；ｍｐｌｏｌ−１０１，５°
Ｃ；ＩＲＩＲ（ＣＨＣ１３）ｃｍ−’３３６０．３２６
０，３０２５．１７７５゜１６０５．１３５０，１１７
０，９１０；’Ｉ（ＮＭＲ（ＣＤＣ１ｉ）　δ１．４８
　（ｄ、、Ｊ＝７，３Ｈ）。 ２．４３　（ｓ、３Ｈ）、４．３３　（ｐ、Ｊ＝８゜Ｉ
Ｈ）　、　５．９３　（ｂｒ　ｄ、　Ｊ＝８．　ＬＨ）
　（ＮＨ）７．３１　（ｄ、ＪＡＢ＝８，２Ｈ）及び７
．７６（ｄ。 ＪＡＢ＝８．２１（）　Ｃパターンの中心７．５３．Δ
Ｖ、１゜−２６，８３）１　ｚ　ｌ］　。 質量分析：　ＣｌｏＨ１□ＣｎＮ０３Ｓとして計算値：
Ｃ，４５，８９；Ｈ，４，６２ｉＮ、５．３５実験値：
Ｃ，４６，ｆｉ３　；Ｈ，４，９０：Ｎ、５．１９方法
−Ｗ Ｎ−トシル−■７−アラニン（３，１ｇ　；　１３ｍｍ
ｏｌ）及びチオニルクロリド（６ｍ１．）の混合物を９
０分５０℃で加熱し、次に乾燥ヘキサン５０　ｍ　Ｌで
希釈した。この混合物を急速攪拌し、冷却しついで固体
状生成物をろ過した。収量３．１５ｇ（９３％）、ｍｐ
９９−１００℃。ＩＲスペクトルは方法へにより製造し
た再結晶化物質のスペクトルと同一であった。 アセトン４．５　Ｌに熔解したトランス−桂皮酸（６，
７５ｍｏｌ）　１．旧（ｇの攪拌スラリーを先ずＮａＨ
ＣＯ３（２，４７ｋ　ｇ　；　２９．４ｍｏｌ　；　４
．３９ｅｑ）を用いて、次に注意深く水（４，５Ｌ）を
用い５ て処理した。得られた濃厚な混合物を、０４ｍＭのエチ
レンジアミン四酢酸（ＥＤＴ八）シナ１〜リウム塩水溶
液（１４，５Ｌ　；　ＥＤＴＡジナトリウム２水和物２
．１７ｇを蒸溜水１４．５Ｌに溶解して調製）に溶解し
たオキゾーネ（ＯＸ　ＯＮ　Ｅ■）モノサルフェート化
合物（３，７８ｋ　ｇ　；ＫＨ３Ｏ５１，８２５ｅｑ含
有）溶液を用いて、１．５−２．０時間に亘って滴加処
理した。この添加中、反応温度を水浴を用いて２４−２
７℃に維持し、反応−ｐＨは約７．４であるように注意
した。添加終了後、混合物を更に０．５時間攪拌し、次
に約１０°Ｃに冷却した。温度をほぼ１０°Ｃに維持し
ながら、反応物をＦｆＨＣｊ！　（〜１．２Ｌ）Ｔ：　
ｐＨ＝２に酸性化し、次にＣＨ，Ｃ７！２　（５，０５
Ｌ）で処理し、ついで１０分間激しく攪拌した。 混合物を沈降させた後、水層をデカンテーションにより
除去し、不溶塩を含む有機層をろ紙を用いて吸引ろ過し
た。ろ過された固体をＣＨ２Ｃｌ□（１，９Ｌ）で洗浄
し、ついで水層をこのろ液で抽出した。ろ過された固体
を再びＣＨ２Ｃｌ２（３，１５６ Ｌ）で洗浄し、ついで水層をこのろ液で抽出した。 合せたＣＨ２Ｃｌ□層を水（６，３１Ｌ）に溶解したＫ
ＯＨ（５９３，３ｇ）溶液で抽出した一塩基抽出の際分
離する固体を溶解させるため約４０℃まで緩かに加熱す
ることが必要とされることがしばしばある。ＣＨ□Ｃｌ
　ｚ層を次に、水（１，５Ｌ）に溶解したＫＯＨ（９９
ｇ）溶液で抽出し、ついでひとまとめにした塩基抽出物
をグリシン（４８１，７ｇ　；　６．４１６ｍｏｌ　；
　０．９５ｅｑ）で処理し、有機層を捨てた。 溶液ｐＨを２５％ＫＯＨ水溶液で１１．５に調整し、次
に沸騰するまで加熱した。低沸点液（アセトン及び水）
約９００ｍＬを蒸気温度が９９℃に達するまで留去し、
それに続いて混合物を２時間還流した。冷却後、反応混
合物をＣＨ２Ｃｌ□（３，１５Ｌ）で抽出し、このＣＨ
２Ｃｌ２相を捨て、水層を減圧下に７０℃の浴槽を用い
て蒸発乾固した。残渣を９５％Ｅ　ｔ　ＯＨ（８，８３
Ｌ）中で３０分沸騰させ、次に攪拌しながら徐々に放冷
すると、生成物が微細結晶として分離する。これらをろ
過し、新しい９５％Ｅ　ｔ　ＯＨ（１，２６Ｌ）で洗浄
し、ついで５０−６０°Ｃの炉中で乾燥すると表記化合
物（１，７７Ｋｇ；７４．６％）が白色結晶として得ら
れた（ｍｐ＝１２０−２°Ｃ（未補正））。 Ｔ　Ｒ（ＫＢｒ　）　ｃｍ−’３４．２０　（ｂｒ、）
　。 １５９０（ｂｒ、）　、　１４１０．　１　］３０．　
７１０　；’Ｔ−ＩＮＭＲ（Ｄ２０−ＴＳＰ）　δ３．
１　（ｓ、２Ｈ）。 ３゜８９　（ｄ、ＪＡＥ　＝４．　’Ｌ　Ｈ）及び４．
５２（ｄ。 Ｊａｎ−４，ＩＨ）　（パターンの中心４．２１ｉ△Ｖ
ＡＢ＝　１８．８３　Ｈ２，）　、４．６８　（ｓ、６
　Ｈ，交換可能なプロトン）、７．４　（ｓ、５Ｈ）；
Ｔｌ−７ＣＲ（＝０．５９　（ＥｔＯＨ：　ＩＭ）リエ
チルアンモニウム炭酸水素塩７：３） 質量分析：　Ｃｌ＋　ＨＩ　５Ｎ　０７　Ｋ　２として
計算値：Ｃ，３７，５９；旧　４．３０　ｉ　Ｎ、３．
９９実験値：Ｃ，３７，２２；旧　４．２４　；　Ｎ、
３．９６Ｎ−アセチル−３−アセトキシ−５−フェニル
ピロール（２） ピリジン（３，ＯＬ）に？容解した２−ヒドロキシ−３
−（カルボキシメチルアミノ）−ヒドロ桂皮酸ジカリウ
ム塩２水和物（１）　（］、Ｏｋｇ；２．８４、ｍｏｌ
）の懸濁液を雰囲気温度、不活性ガス雰囲気下に無水酢
酸（４，０ｒ−）で処理した。温和な発熱反応が結果と
しておこり、１．５−２．５時間に亘り反応温度が６０
−７０°Ｃまで指数関数的に」二昇した。いったん反応
が冷えはしめたら、混合物を１２０−１２３°Ｃまで１
５分間加熱し、次に雰囲気温度まで１時間にわたり放冷
し、その間に酢酸ピリジニラＪ、が結晶として分離した
。混合物をろ紙を用いて吸引ろ過し、ついで塩を無色に
なるまでＦ、ｔｏＡＣで洗浄し、ろ液を真空中で蒸発乾
固した。 貼赤色残渣をＥＩＯＡＣ（３，０１−）に溶解し、三回
水洗（各］、０Ｌ）Ｌ、Ｍｇ５Ｏ，上で乾燥しついでタ
ルコ（ＤａｒｃｏＧ）　）　−Ｇ　６０　（アルドリソ
ヒ・ケミカル・カンパニー（Δ１ｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍ
ｉｃ２１Ｃｏ、）ｌ　（３００ｇ＞で処理した。３０分
間攪拌後、混合物をセライト（Ｃｅｌｉｔｅ■）　（フ
ィッシャー・→Ｊ−イエンテイフイツク　（Ｆ　１ｓｃ
ｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　）　ｌを用いてろ過しつ
いで真空中で９ 蒸発乾固すると赤橙色油状物資を得た。この油状物質を
温めた２−プロパツール（１，２Ｌ）に溶解し、次に一
晩雰囲気温度まで徐冷すると、固体が分離した。結晶状
生成物をろ過し、５０％−２−プロパツール水溶液で洗
浄し、真空乾燥するとｍｐが５８−６０℃（未補正）の
表記化合物（４１７ｇ；６０％）を得た。一部をＢｔｚ
Ｏに採取し、フリント（Ｎｏｒｉｔ）　２１１で処理し
、ろ過しついで減圧濃縮した。０°Ｃにしておくと無色
微少針状物質が分離した。これらをろ過し、Ｅｔ２０／
ヘキサン（１：　１）で洗浄しついで真空乾燥するとｍ
ｐが６０−６２．５℃（未補正）の分析試料が得られた
。 ＴＲ（ＣＨＣＩ＊ｃｍ−’３０２０，１７６０゜１７３
０．１５９５，１３７８．１３２０，１２２０（ｂｒ、
）、１０３０，９６０，９０３；’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩ
３　）　δ２．２３　（ｓ、３）（）　。 ２．２７　（Ｓ、３Ｈ）、６．１８　（ｄ、Ｊ＝２．］
　Ｈ）。 ７．３５　（ｓ、５Ｈ）、７．４２　（ｄ、Ｊ＝２゜Ｉ
Ｈ）；ＴＬＣＲｆ−０，５６（トルエン二−ジ第０ キサン、４：１）。 質量分析ＣＩｓ■ＬｘＮＯｘとして： 計算値：Ｃ，６９，１２；Ｈ，５，３８；Ｎ、５．７６
実験値：Ｃ，６８，８８、Ｈ，５，２５、Ｎ、　５．５
３３−ヒト′ロキシー５−フェニルピロール（３）Ｎ−
アセチル−３−アセトキシ−５−フェニルピロール（２
）　（３６，８ｇ　；　０．　］　５ｍｏｌ　）の微細
粉部を１０分間アルゴン気流中で攪拌することにより酸
素を除去し、次に脱酸素化ＭｅＯＨ（３７９ｍＬ）中に
懸濁し、不活性気体雰囲気下で一６℃（−１５℃メタノ
ール（ＭｅＯＨ）／ドライアイス浴中で）に冷却し、次
に２　Ｎ　Ｎａ０Ｉ（（３００ｍ　１．、　）の水冷脱
酸素化溶液で迅速に処理した。塩２ｊ（を添加すると反
応温度が直ちに１８°Ｃまで上昇し、３分後には反応混
合物は均一になった。反応混合物が冷えると、化合物（
３）が微細結晶として分離した。脱酸素化された２Ｍク
エン酸の冷溶液（１５０ｍＬ）を添加１５分後、得られ
た混合物を１０分間攪拌し、次にろ過した。生成物を空
気に露らずのを最低にするように注意しながら、固体を
脱酸素化水（２００ｍｌ−）で完全に洗ン争し、次に一
晩真空乾燥すると淡桃色微細針状物質として表記化合物
（２２，３ｇ　；　９３．６％）が生した。 ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ−’３４００，３１１０゜２９００
．１６００．１５８０，１５５５，１４８０゜１２６８
．１１８０，７４２，６４（１；’Ｔ（ＮＭＲ（ＤＭＳ
Ｏ−Ｄ’）　６６．１　（ｍ、ＬＨ）　、６．３（ｍ、
］、　ｈ）　、７．０−７．７　（ｍ、５Ｈ）　、８．
０（ｓ、ＬＨ）、１０．４　（ｂｒ　ｓ、ＬＨ）；　Ｔ
ＬＣＲｆ＝０．２０　０．２８　（ＥｔＯＨ：ＣＨＣｌ
：＋　。 １：９）。 質量分析：’Ｃ＋ａＨｑＮＯとして 計算値：Ｃ７５，４５、Ｈ，５，７０、Ｎ、８．８Ｑ実
験値：Ｃ１５，３０；Ｈ，５，６９；Ｎ、８．６７０℃
、不活性ガス雰囲気下に維持された、無水テトラヒトｏ
７ラン（ＴＨＦ、４５０ｍＬ）、ピリジン（４３，８ｍ
Ｌ　；　０．５４２ｍｏｌ　；　１．２　ｅ　ｑ）及び
トリフルオロ酢酸（８５，０ｍ　Ｌ　；　１．１．０ｍ
ｏｌ；２．４ｅｑ）の溶液を一部分３−ヒドロキシー５
−フェニルピロール（３）　（７１，５ｇ；　０．４５
ｍｏｌ；１．［］ｅｑ）で処理し、続いて直しに、調製
したばかりの、無水ＴＨＦ　（４５０ｒｎＬ）中のＮ−
トシル−Ｌ−アラニニルクを目ノド（１４１，０ｇ；Ｑ
、　５４　ｍｏｌ　；　１．２　ｅｑ）ン容液を５−１
０分かげて滴力口した。得られノこ混合物を１５分間θ
℃で攪拌した。次に１，０Ｍクエン酸水溶液（３１５ｍ
Ｌ）及びＥｔＯＡ、ｃ　（＋、、３５　Ｌ）の溶液を添
加することにより反応物を冷却した。簡単に混合後、相
を分離しついて有１幾相をＮａＣｌ１！水溶液（３６’
ＯｍＬ；水１ｍＬ当り０．１８　［＜のＮａＣｅ）で洗
浄した。 有機相を次に５％Ｎ　ａ　ＨＣ０３水溶液（各１．３５
ｍ　１．）で２回抽出し、次に、更に別のＮａＣβ水溶
液（３６０ｍｌ；水ｍ　Ｉ−当たり０．１８　ｇのＮａ
Ｃａ）で洗浄した。赤褐色有機層をＭｇ５Ｏａ　（１０
１ｇ）及びダルコ（Ｄａｒｃｏ）　−０６０（１４３ｇ
）と共に雰囲気温度で１５分間攪拌し１次にセライト（
Ｃｅｌｉｌ、ｅ　）を用いてろ過しついて３７°Ｃの浴
槽で真空蒸発乾固すると桃白色固体として（４）３ が得られた。粗生成物を粉砕しついで湯（５０°Ｃ）Ｔ
ＨＦ　（２５０ｍＬ）に溶解し、激しく攪拌し。 次にね一ヘキサン（２５０ｍＬ）で希釈した。攪拌を１
時間雰囲気温度で続けると生成物が結晶化した。固体を
ろ過し、ろ液が無色になるまでトルエン（約１．ＯＬ）
で洗浄し、次に一晩真空乾燥すると表記化合物（１１２
ｇ；６５％）がｍ　ｐ　１．５４．５−１５５℃の白色
粉末として生した。 ＩＲ（ＫＣＴ）ｃｍ−’３３５０．３３２５゜１７６０
．１５０８，１３２０，１１５５，７７０；’ＨＮＭＲ
（ＤＭＳＯ−δ６）　δ１．３３　（ｄ。 Ｊ−７，３Ｈ）　、２．３６　（ｓ、３１（）　、４．
１３（ｐ、Ｊ＝８．Ｉ　Ｈ）、６．２５　（ｍ、Ｉ　Ｈ
）。 ６．７３（ｍ、Ｉ　Ｈ）　、７．０５−７．５０　（ｍ
、５Ｈ）　。 ７．５−７．８５　（ｍ、４　Ｈ）　、８．４２　（ｄ
、、Ｊ＝８゜ＩＨ）、１１．１８　（ｂｒ　ｓ、ＩＨ）
；１′３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−δ６）　ｐ　ｐｍ　１８
．３３５．　２１．００１゜５１．３７０．９８．０６
１，１０８．３３’６゜１２３、／１２３，１２６．０
２４，１２６．６１０゜１２８．５６０　、　１２８．
７５６．　１２９．６０１゜４ １３２．３９７．１３７，６００．　１３８．３８０．
　］／１２．７３７゜１６９．９　１９；Ｃα〕　。＝
　−７０°　（Ｃ−１，］　１．ＭｅＯＨ）　；ＴＬＣ
Ｒｆ　＝０．　４５（ＥｔＯＡｃ　：　ヘキサノ、ｌ　
：　］、）　ｉ　Ｔｌ、ＣＲｒ　＝０．　４０　（、Ｉ
−ルエン：ジオキザン、４：１）。 質量分析　Ｃ２ＱＨ２ＯＮ２０４Ｓとして：計算値：Ｃ
，６２，４８，Ｈ，，５，２４；Ｎ、７．２９ｉ 実験値：Ｃ，６２，５２，Ｈ，５，２７；Ｎ、７．３０ 次にアウトラインを示した、報告文献による操作＊ｌ、
＊’ｌを僅かに変形することにより一連の実験を行って
３−ヒドロキシ−５−フェニルチオフェンを製造した。 得られたヒドロキシチオフェンを次にＮ−１−シル−し
一アラニニルクロリドでアシル化すると相当するＮ−ト
シル−Ｌ−アラニネートエステルが収率４６％（非最適
操作）で得られた。 ３−フェニル−】、２−ジチア−３−シクロペン桂皮酸
エチル（５６，８２ｍｍｏ＋）　１０　ｇ及び硫黄１０
ｇの懸ン罰液を、反応中に／１成するエタノールを除去
するための蒸溜ヘット及び受器を備えた５　０ｍ１−フ
ラスコ中で２５０°Ｃて４時間加熱した。 反応混合物を次に］００°Ｃに放冷しついで還流エタノ
ール５００　ｍ　Ｌに添加した。得られた沈澱物をろ過
し、続いて沸胎アセトン５００ｍＩＬと次に２回エタノ
ール５００ｍＬず゛つと共にすりつぶした。合せた」二
澄液を濃縮して黒色固体とし、これをメタノールから結
晶化すると暗褐色針状物質が得られた。ノリット（Ｎｏ
ｒｉｔ）を用いてメタノールから２回口の再結晶を行い
ついでセライｌ−（Ｃｅ１ｉｔｒ＋）を用いてろ過する
とｍｐが１１３−１１５°Ｃの淡黄色針状物質２．０２
３ｇが得られた。 ＪＲ（ＫＢｒ）ｃｍ−’１６５０．１５５０．１３９０
゜１３５０．１１３０，７７０；’ＨＮＭＲ（６０ｒｎ
　Ｈｚ　、　ＣＤ　Ｃ１，）　６６．　９２　（ｓ、　
ＩＨ）　。 ７゜５８　（ｍ、５Ｈ）：ＴＬＣＲｆ　＝０．５７ （ジクロロメタン）。 質量分析；Ｃ７Ｈ６０□Ｓとして； 計算値；ｃ、５５．　６４．；Ｈ，３，１］実験値；ｃ
、５５．５３；Ｈ，３，４７９４°Ｃの硫化ナトリウム
９水和物３５．４８ｇ（１４８ｍｍｏｌ）の溶融溶液を
、５分間に亘り滴加された６、　６５　ｇの３−フェニ
ル−１，２−ジチア−３−シクロペンテン−５−オン（
５）　（３４，２３ｍｍｏｌ）で処理した。１５分後、
混合物を、炭酸ナトリウムでｐＨ８，７に調製された、
水６０ｍｌ、中にブロモ酢酸４３．　６　ｇ　（３１４
，ｍｍｏｌ）を含む水冷溶液に添加した。得られた溶液
を０℃、ｐＨ８，７に４５分間保持し、次にろ過した。 上澄液を０℃に保持しついで５Ｎ’ｆ（ＣＩ温溶液ｐＨ
３，７に酸化した。得られた混合物を一晩５℃で攪拌し
た。上澄液を次にデカンテーションし、ついで得られた
油状物質をエーテルと共にすりつふした。 油状物質をトルエンと共に蒸発させると、ついに８ ば無色泡状物質６．９８　ｇが得られた（６５％）。 この物質を更に楕製廿ずに用いた。 分析試料はエーテル上澄液から得たが、これは濃縮し、
続いて酢酸及びトルエンと共に蒸発させ、ついてエーテ
ルと共にすりつぶすと、ｍｐが１４２、５−１．５０°
Ｃの黄褐色結晶となった。 ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ−’１７０５，１６５５；’ＨＮＭ
Ｒ（６０Ｍ）Ｉｚ、ＤＭＳＯＤ６）δ２．０６　（Ｓ、
ＣＨ３ＣＯ２Ｈ不純物）３．３０（ｓ、’２Ｈ）、３．
７７　（ｓ、２Ｈ）、５．６７　（ｍ。 ２Ｈ）　（ＯＨ）　、６．３７　（ｓ、Ｉ　Ｈ）　、７
．４３（ｍ、５１（）　：ＴＩ−ＣＲｆ　＝０．８５　
（クロロホルム：メタノール；酢酸、５：５：１）。 質量分析：　Ｃ＋　、ＨＩ　２　Ｓ　２０　ｓとして：
計算値：Ｃ，５０，００；Ｈ，３，８８実験値：Ｃ，５
０，２６ｉＨ，３，９８３−ヒドロキシ−５−フェニル
チオフェン酢酸エステルり工 粗シスー４−ケト−６−フェニル−３，７−シチアー５
−ノネンジオイック酸（６）３．４０ｇ（１０，９ｍｍ
ｏｌ　）　、酢酸ナトリウム３．４０　ｇＣ旧５ｍ＋ｎ
ｏｌ’）、及び無水酢酸３０　ｍ　Ｉ−の強攪拌懸濁液
を１時間還流加熱した。混合物を放冷し、次にろ過し、
溶媒を蒸発させると黒色油状物が得られた。この残渣を
酢酸エチル７５ｍＬに溶解し、炭酸水素ナトリウム水冷
飽和溶液５０　ｍ　Ｌずつを用いて３回抽出した。有機
層を次に食塩水で洗浄し、硫酸ナト′リウム上で乾燥し
、ろ過し、ついで溶媒を蒸発させると黒色固体２．８２
６　ｇが得られた。１′■生成物を１２０−１４０“ｃ
及びＱ、１ｍｍでの蒸発薄情により精製すると淡橙色油
状物質１．２３５ｇが得られ、この油状物質は放置する
と固化した（５２％）。 ＴＲｃｍ−’１７００．１７４５；’ＨＮＭＲ（６０Ｍ
Ｈｚ　、ＣＤＣＴ３）　６２．２３　（ｓ、３Ｈ）、７
．０３　（ｄ、、Ｊ＝２Ｈｚ、Ｉ　Ｈ）　、７．１３　
（ｄ。 Ｊ＝２Ｈｚ　、ＬＨ）；７．２３−７．７３　（ｍ。 ５Ｈ）；ＭＳ　（Ｅ　Ｔ、Ｄ　Ｉ　Ｐ＞　ｍ／ｅ　２１
８　（Ｍ”。 １２．６％）　；ＴＩ−ｃ　Ｒｆ＝０．４８　（ヘキサ
ン：酢酸エチル、５：１）。 質量分析＋　Ｃｌ２１（＋０Ｓ　０２　・１　／　２　
Ｈ２Ｏとして計算値：Ｃ，６３，４］　；Ｈ，４，８８
実験値：Ｃ，６３，７８ｉＨ，４，８６μｓ−ヒドロキ
シ−５−フェニルチオフェン（，１３）アルゴン雰囲気
下の、３−ヒドロキシ−５−フェニルチオフェン酢酸エ
ステル（７）２．１２６ｇ（９，７４ｍｍｏ＋　）及び
メタノール８０　ｍ　Ｔ−の混合物をＩ　Ｎ　ＮａＯＨ
１１ｍＬで処理した。２０分後Ｔ　Ｎ　ＨＣＩ　Ｉ　］
　ｍｍＴ−を添加して反応を停止させ、２５℃、１２ｍ
ｍで溶媒を蒸発させて約５０ｍＬ容量とし、ついで酢酸
エチル１００ｍＬで処理した。有機層を分離し、食塩水
で洗浄し、硫酸す１−リウム上で乾燥し、ろ過しついで
溶媒を蒸発させると黒色固体が得られた。この残渣を酢
酸エチル７５ｍＬに溶解しついてＭｇ５ＯＡ上で乾燥し
た。ろ過しついで溶媒を蒸発させると黒色固体が得られ
、これを４回熱へキサンと共にすりつぶし、冷却すると
、ｍｐ７４−７５°Ｃの黄色固体が全量で８３７ｍｇ（
４，９％）得られた。合わせた母液を濃縮すると固体０
．８７　ｇが得られ、これを１ ＳｊＯｚ１００ｇ上でヘキサン；酢酸エチル（７：１）
の溶媒混合物を溶離液としてクロマトグラフィーにかけ
た。再結晶後、更にｍｐ７３．５−７４℃の生成物３８
０ｍｇを得た。合せた収量はかくして１．２１７ｇ（７
１％）であった。ｍｐ１４．５′　−７５°Ｃ（文献＊
Ｌ　＊２．７５℃、７８℃）。 ＩＲｃｍ−’３３８０，１６３５：’ＨＮＭＲ（９０Ｍ
Ｈ２、ＣＤＣｊ３）　δ３．８１＜ｓ。 ２Ｆ（）、６．５７　（ｓ、　’Ｉ　Ｈ）　、７．２−
７．７　（ｍ。 ５Ｈ）；ＭＳ　（ＥＴ）ｍ／ｅ１７６．０　（７０，７
％）ＴＬＣＲｆ　＝０．２３　（ヘキサン：酢酸エチル
１　：　５）　。 質量分析：ＣｌＯＨ［ｌＯ３として 計算値：Ｃ，６８，１５；Ｈ，４，５７実験値：Ｃ，６
８，０５；Ｈ，４，７０＊１）ピー・フリードランダー
（Ｐ、Ｆｒ１ｅｄｌａｎｄ−ｅｒ）及びニス・キールハ
シンスキ（Ｓ　、　Ｋ　１ｅｌｂａｓ−ｉｎｓｋｉ）　
、ケム・ヘル（Ｃｈｅｍ、Ｂｅｒ、　）　４５゜３３’
８９　（１９１２）　。 ＊２）ニー・アイ・コサツク（Ａ、Ｔ、Ｋｏｓａｋ）、
２ アール・ジエー・エフ　パルチャック（Ｒ，Ｊ。 Ｆ　、　Ｐ　ａｌｃｈａｋ）　、ダブリウ・エイ・ステ
イール（Ｗ、　Ａ　、Ｓ　ｔｅｅｌｅ）及びシー・エム
・セルヴイツツ（Ｃ，Ｍ、　５ｅｌｖｉｔｚ）　、ジャ
ーナル・アメリカン・ケミカル・ソサイアテイ　（Ｊ、
　Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ。 Ｓｏｃ、）７６．４４５０　（１９５４）。 ０°Ｃてアルゴン雰囲気下の、ジクロロメタン２０ｍＬ
及びピリジン０．６１　ｍＬ　（７，５ｍｍｏｌ　）中
に３−ヒドロキシ−５−フェニルチオフェン（８）４４
０ｍｇ　（２，５ｍｍｏ＋　）を含む溶液を、５分間に
亘って滴加された、ジクロロメタン１０ｍＬ中にＮ−１
〜シル−し−アラニニルクロリド１．３１４（５ｍｍｏ
＋）を含む溶液で処理した。反応物を０゜５時間０℃で
攪拌し、次にクロロボルム１００ｍＬ中に注いだ。この
混合物を次に順次ＩＮクエン酸、水、水冷炭酸水素す１
〜リウム溶液、水及び食塩水５０ｍＬずつで抽出した。 この混合物を次に硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、
ついで溶媒を蒸発させると褐色油状物質１．７８ｇが得
られた。 ノリット（Ｎｏｒｉｔ）　１．７８　ｇでの処理後、ト
ルエンからの結晶化を試みたが成功しなかった。残渣を
次に５ｉ０２力ラム２００ｇ上でジクロロメタンを用い
流速ｌＱｍＬ／分で溶離することによりクロマトグラフ
ィーにかげた。生成物を含む画分をプールしついで濃縮
すると赤味がかった油状物質９５１ｍｇが得られた。こ
の生成物をトルエンから結晶化した。 １〜ルエンから引き続き再結晶を行うと淡黄色固体とし
て生成物が全量で４６３ｍｇ＜４．６％）得られた。ｍ
ｐ８５−８７℃。 ＪＲ（ＫＣＩ）ｃｍ−’１７３５，１３３０゜Ｌ１５０
：’ＨＮＭＲ（９０ＭＨｚ　、ＣＤＣＩ、）δ１．５３
　（ｄ、Ｊ＝ＩＨｚ　、３Ｈ）、１．６２　（ｓ。 ３Ｈ）、４．２３　（ｍ、ＩＨ）、５．３２　（ｄ、Ｊ
＝９Ｈ２、ＬＨ）、６．８４　（ｄ、Ｊ＝１．４］Ｈｚ
　。 ＩＨ）；６．８８　（ｄ、Ｊ＝１．４Ｈ２、ＩＨ）、７
．２３−　７．８３　（ｍ、９Ｈ）；ＭＳ　（ＦＡＢ）
ｍ／ｅ４０２　（Ｍ−１−１，１５％）　；ＴＬＣＲｆ
＝０．２０（ヘキサン−酢酸エチル、４：１）。 質量分析：　ＣｚｏＨ＋ｑＮＯｎＳとして、計算イ直　
：Ｃ，５９，８３；Ｈ，４，７７；Ｎ、３．５９ 実験値：Ｃ，５９，６０；ト１．４．７７；Ｎ、３．４
３ 一連の実験を行って、化合物（■）（式中、ＡハＮ’−
トシル−Ｔ５−アラニニル、Ｒばフェニル、Ｒ′はＨ，
ＸばＮＲ及びＲはＣＨ３）に相当する表記のエステルを
製造した。反応系列は次のようである。 ５ ６ β−フェニルグリシド酸カリウム塩（３０ｇｉｏ。１５
ｍｏｌ）、Ｎ−メチルグリシン（１３，２ｇ；０、１５
ｍｏ＋　）　、蒸留水（１１９ｍＬ）及びＫ　ＯＨ溶液
（９Ｎ　；　２２．３ｍＬ）の混合物を３時間還流加熱
すると淡黄色溶液が得られた。反応混合物を減圧下７０
℃で、蒸発乾固した。残渣を次に９５％Ｅ　ｔ　ＯＨ（
１００ｍＬ）から結晶化すると白色固体が得られ、これ
を−晩減圧下１１０°Ｃで乾燥後、白色固体（１０）３
０．８ｇが生じた（収率６３％）。 ＩＲ（ＫＣＩ）ｃｍ−’３３６０　（ｂｒ）、１５８０
゜１４０５．７０５ｉ’ＨＮＭＲ（ＣＤ３０Ｄ）　δ２
．３０　（ｓ、３Ｈ）、２．９８　（ｓ、２Ｈ）、３．
７０（ｄ、Ｊ＝３Ｈｚ　、Ｉ　Ｈ）、４．４８　（ｄ、
Ｊ−３１−（ｚ、ＩＨ）　、４．９２　（ｓ、ＩＨ）　
、７．４０　（ｓ。 ５Ｈ）；Ｔｒ−ＣＲｆ＝０．５１　（ＥｔＯＨ：１Ｍト
リエチルアンモニウム炭酸水素塩、７：３）。 （生成物は２７０℃未満で番ｊ融点をもたなかった。 ２７０℃）。 ３−アセ１ヘキシ−１−メチル−５−フェニルロールニ
←し」→− ２−ヒドロキシ−３−（Ｎ−メチルカルボキシメチルア
ミノ）−ヒドロ桂皮酸ジカリウム塩（１０）（１５，２
ｇ、４６ｍｍｏｌ）　、無水酢酸（１７３ｍＬ）及び１
〜リエチルアミン（３０８ｍ　Ｌ　）の混合物を９０°
Ｃで１９時間加熱した。反応混合物は色が濃褐色になっ
たが、これをろ過しついで固体をエーテルで洗浄した。 ろ液を減圧ｆ発すると濃褐色残渣が得られ、これをエー
テル（３００ｍＬ＞及び水（２００ｍＬ）中に採取した
。層を分離し、そのエーテル層を別の水（２００ｍＬ）
で洗浄した。エーテル層を次にＭｇＳＯ４上で乾燥し、
ろ過しついで減圧下に濃縮すると褐色残渣１０．７　ｇ
が得られ、これを蒸発薄情により精製しく１２０−１３
５℃、０．０３）−ル（ｔｏｒｒ））、エーテルから結
晶化すると３．０ｇの白色結晶（１１）が生じた（収率
３０％、ｍｐ−６４−６５℃）。 ＩＲ（ＣＨＣ］３　）ｃｍ−’２９９０．　１７５０゜
１５７０、　１５１８．　１４８２．　１３７５゜］２
３０．（ｂｒ）、１０２４．　９１０．　７００　；’
ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１３）　δ２．２０　（ｓ、３Ｈ）　
。 ３’；５８　（ｓ、３Ｈ）、６．１　０　（ｄ、Ｊ＝２
Ｈ，ｚ　。 ／ＩＨ）　、　６．７５　（ｄ、　Ｊ＝２Ｈｚ　、　Ｌ
Ｈ）　、　７．３５（ｓ、５Ｈ）：ＴＩ−ＣＲＴ＝０．
５８　（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ　７：３） 質量分析：Ｃｌ５Ｈ１３ＮＯ２として 計算値：Ｃ，７２，５４，；Ｈ，６，１０ｉＮ、６．　
４４ 実験値：Ｃ，７２，５７；Ｈ，６，０９ｉＮ、６．　５
１ アルゴン下の、脱酸素化メタノール（１５，５ｍＬ）及
び３−アセトキシ−１−メチル−５−フェニルピロール
（１１）　（１，３ｇ、６．２ｍｍｏｌ）の混合物に脱
酸素化ＮａＯＨ（２Ｎ、１２．５ｍＬ）を添加した。反
応混合物を水浴中で１５分間攪拌９ した。次に脱酸素化クエン酸（２Ｍ、７ｍＬ）を添加し
ついで得られた混合物を水浴中で８分間攪拌した。反応
混合物を減圧濃縮し、次に水２０ｍＬを　添加し、つい
で酢酸エテル（ＥｔＯＡｃ）（５０ｍ　Ｌ　）で２回抽
出した。ＥｔＯＡｃ層を合せ、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、
ろ過しついで減圧濃縮すると３−ヒドロキシ−１−メチ
ル−５−フェニルピロール（１２）が橙色残渣として得
られる。アルゴン下に、無水ＴＨＦ　（１２，４ｍＬ）
　、ピリジン（０，６ｍＬ、７．４ｍｍｏｌ、１．２ｅ
ｑ）及び１−リフルオロ酢酸（１，２ｍ１−、　１５ｍ
ｍｏ１．　２．４ｅｑ）の冷溶液を前記橙色残渣に添加
し、続いてすぐに、無水ＴＨＦ　（１２，４ｍＬ）中に
溶解して調製したばかりの、Ｎ−トシル−し−アラニニ
ルクロリド（１，２ｇ　、　’７．４．　ｍｍｏｌ、１
．２ｅｑ）溶液を添加した。 得られた混合物を１時間０℃で攪拌した。次に、水性ク
エン酸（ＩＭ、５．ｍＬ）及びＥｔＯＡｃ（’３０ｍＬ
）を添加して反応を停止した。簡単に混合し７た後、層
を分離しついで有機層を順次、飽和ＮａＣｌ溶液、５％
Ｎ　ａ　ＨＣＯ３で２回及び再び０ 飽和ＮａＣ１溶液で洗浄した。ＥｔＯＡｃ抽出物を次に
Ｍｇ　Ｓ　Ｏａ上で乾燥し、ノリット（Ｎｏｒｉｔ）２
１１で処理し、ろ過しついで減圧濃縮すると粗生成物（
１３）が橙色残渣として得られた。これをヘキサン：Ｅ
ｔＯＡｃ　（１：　１）（５ｍＬ）に？岩屑し、ヘキサ
ン：　ＥｔＯＡｃ　（７：　３）で？容離することによ
りカラム（Ｓｉ０２　、　１００　ｇ）上でクロマトグ
ラフィーにかけると、濃厚な淡橙色油状物質として（１
３）Ｉｇが得られた。この粗生成物の一部を更に半調製
用ＨＰＬＣ（カラム。 ＩＢＭシリカ、１ｃｍＸ２５ｃｍ；移動相、ヘキサン：
ＥｔＯＡｃ３　：　２；流速、　４．０　ｍ　Ｌ　／ｍ
ｉｎ　；圧力、０．２ｐｓｉ）により精製すると蜂蜜色
の濃厚な油状物質（１３）が生じた。 ＩＲ（フィルム）ｃｍ−’３２６０，２９５０゜１７６
０．１５２０，１３５０，１１７０゜７７０；’ＨＮＭ
Ｒ（ＤＭＳＯ−δ６）　δ１．２８（ｄ、Ｊ＝７Ｈｚ、
３Ｈ）、２．３６　（ｓ、３Ｈ）。 ３．５８　（ｓ、３Ｈ）、５．８５　（ｄ、Ｊ＝２Ｈｚ
。 ＩＨ）、６．１５　（ｍ、ＩＨ）、６．７４　（ｄ、Ｊ
＝２Ｈｚ、Ｉ　Ｈ）　、　７．３　０−７．８　０　（
ｍ、　９　トＴ）　。 ８’、；３７（ｄ、Ｊ＝８Ｈｚ、ＬＨ）　；”ＣＮＭＲ
（ＤＭＳＣ）−ｄ６　）　δ　１８．２０５．　２０．
９３６゜３４．９１７．　５１．２４０．　１００．５
９８．　］、１３．１．ｉ、８゜１　２６．５４４．　
１２７．０００．　１　２８．１０５゜１２８．５６０
．　１２９．６０１．　１’３０．９０１゜１３２．２
０２．　１　３５．７１４．　１３８．３１５゜１　４
２．６７２．　１　６９；７２４　、ＴＬＣＲｆ　−Ｑ
：５２（）ルエン：ジオキサン　４．：１）；高分解能
質量スペクトル、Ｃ２１Ｈ２□Ｎ２０４Ｓ計算値：ｍ／
ｅ　３９８．１．３００゜実験値：ｍ／ｅ３９８．１２
９７゜ ル（１８） 一連の実験を行って、化合物（Ｉ）（式中、ＡはＮ−ト
シル−Ｌ−アラニニル、Ｒはｐ−クロロフェニル、Ｒ１
ばＨ，ＸはＮｄ及びＲ′はＨである）に相当する表記エ
ステル化合物を製造した。 反応系列は次のようである。 ３ トランス−β−（ｐ−クロロ桂皮酸２ｂ）？：リシド段
工１４） アセトン２６０ｍＬ中のｐ−クロロ桂皮酸（６８，５ｇ
；０．３７５川ｏ１　）の攪拌スラリーにＮａＴ（ＣＯ
３（１３７ｇ　ｉ　１．６３ｍｏｌ　）を添加し、続い
て水２６０ｍＬを徐々に添加した。この混合物に、２１
−２７℃で２．５時間かけて、オキソーネ（○Ｘ０ＮＥ
■；２１１ｇ；０．３４３ｍｏｌ　）。 ＥＤＴＡジナトリウム塩１２０ｍｇ及び水８０５ｍＬの
混合物を添加しか。５時間後、混合物を１２Ｎ冷ＨＣＩ
Ｉ　７０ｍＬで酸性化し、約２．５までｐＨを下げ、次
に酢酸エチル７００　ｍ　ｌ−で抽出した。抽出物を食
塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ３で乾燥し、ろ過し、ついでろ
液を減圧で蒸発乾固さ・已た。 白色固体が酢酸エチルから結晶化した：ｍｐｌ’２１−
５℃（７２，２ｇ；９７％収率）。 ’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩ３／ＤＭＳＯ−Ｄ６　）　δ７．
３　（ｍ、４Ｈ）、４．０５　（ｄ、Ｊ＝２．ＬＨ）。 及び３．４　（ｄ、Ｊ＝２．ＬＨ）。 質量分析：Ｃ７Ｈ１ＣＩＯ：ｌとして ４ 計算値：　Ｃ，５４，４，３、Ｈ，３，５５：Ｃ１，１
７，８５ 実験値：Ｃ，５／１．５３　ｉＨ，３，８０。 ｃｌ、１７．９１ 和物（１５） ＫＯＨ（８５′Ｖｏ）　（４６，７ｇ　；’０．７０９
ｍｏ＋）及び水４００ｍＬの溶液にグリシン（２５，９
ｇ。 ０．３４５ｍｏｌ　）　、続いてトランス−β−ｐ−り
。 ロフェニルグリシド酸（１４）（７２，２ｇ；　。 ０、：３６３５ｍｏｌ　）を添加した。この混合物を１
００°Ｃで２時間加熱し、室温まで冷却しついで十分に
ＫＯ）Ｔを添加してｐＨを１２まで上げた。不透明溶液
を酢酸エチルで３回抽出し、この抽出物を次に捨て、明
澄な水溶液（約５００ｍＬ）を７０°Ｃの水浴を用いて
減圧下に蒸発乾固した。この固体を次に熱エタノール約
３５（１ｍＬ、に溶解し、ろ過し、ついでこのろ液を水
浴中で数時間冷却した。 結晶化した固体をろ集しついでいくらかの冷エタノール
で洗浄した＝１８５°Ｃての脱炭酸によりｍｐ９３−５
℃（５７，２ｇ；４１％）、’ＨＮＭＲ（Ｄ２０−ＴＳ
Ｐ）　δ７．４　（ｓ、４Ｈ）　、４．７（ｓ、６Ｈ，
交換可能なプロトン）、４．、ｌ（ｄ。 Ｊ＝４．ＩＨ）、４．０５　（ｄ、Ｊ＝４．１８）。 及び３．１　（ｓ、２Ｈ）。 質量分析：Ｃ，、Ｈ，。ＣＩ　Ｎ　０５Ｋ２　・２Ｈ２
０として計算値：Ｃ，３４，２４、Ｈ，３，６６；Ｎ、
３．６３ 実験値：Ｃ，３４，４０；Ｈ，４，０３゜Ｎ、３．４２ ２−ヒドロキシ−３−（カルボキシメチルアミノ）−ｐ
−クロロヒドロ桂皮酸ジカリウム塩２水和物（１５）（
１０ｇ；０．０２５９１ｍｏｌ）に無水酢酸４０ｍＬ及
びピリジン（３０ｍＬ）を添加した。この混合物をゆる
やかに３５°Ｃまで加熱するとその時点で溶液は発熱し
６７℃まで温度が＝上昇し、次に下降しはじめたので、
ここで再び加熱しはじめた。混合物を１２１−２°Ｃ（
内部温度）で１時間加熱し次に冷却した。反応混合物に
酢酸エチル約３０　ｍ　ｌ−を添加するとほとんどの酢
酸ピリジニウム塩が沈澱し、この塩をろ集しついて少量
の酢酸エチルで洗浄した。ろ液を真空蒸発させて油状物
質としてついで氷水を添加した。生成物をエーテルで抽
出し、ついてこのエーテル抽出物を順次、冷いクエン酸
希釈水溶液で２回、冷水、冷いＮａＨＣＱ３希釈水溶液
で３回、冷水及び食塩水で洗浄し、続いてＭ２ＳＯ４−
にで乾燥及びろ過を行った。ろ液をダルコ　（Ｄａｒｃ
ｏ）　１０　ｇで処理し、２０分間攪拌し次にろ過した
。ろ液を真空蒸発させて油状物質とした。この油状物質
に２−プロパノール２５ｍＬを添加した。得られた溶液
を冷却してこすると淡黄色結晶を生した：ｍｐ６９７１
℃（３，４ｇ；４７％）；ＴＬＣＲｆ−０，６１（）ル
エン：シオキサン、９５：５）。分析試料ば２−プロパ
ツールから再結晶したがｍｐの変化は見られなかった。 Ｉ　Ｒ（ＫＣｌ）　ｃｍ−’１７５５　（Ｃ＝０．エス
テ６フ ル）及び１７３０　（Ｃ−０，アミド）ｉ’ＨＮＭＲ（
ＣＤＣＩ　３　）　δ７，４．　（ｍ、５Ｈ）　、６．
２　（ｄ。 Ｊ＝２．ＩＨ）、２．４　（ｓ、３Ｈ）及び２．３（ｓ
、３Ｈ）。 質量分析：Ｃ＋４１［（＋□ＣＩＮ○３として計算値：
Ｃ，６０，５５、Ｈ，４，３６。 Ｈ，５，０４ 実験値：Ｃ，６０，６５；Ｈ，４，５５。 Ｎ、５．０７ Ｎ−アセチル−３−アセトキシ−５−ｐ−クロロフェニ
ルピロール（１６）　（２，８ｇ　；０．０１ｍｏｌ）
の試料をＮ２気流を用いて１０分間脱酸素化した。 この固体を次に脱酸素化メタノール（３０ｍＬ）に溶解
し、これを次に一８°Ｃまで冷却した。直ちに、水２０
ｍＬ中のＮａＯＨ（１，６ｇ　ｉ　Ｏ，０４ｍｏ＋）の
冷脱酸素化溶液を添加し、この溶液を次に僅かに加熱し
て１５℃とし、次に直ちに一５℃まで冷却した。２５分
後明澄溶液を水１５ｍＬ中のクエ８ ン酸（４，２ｇ　；　０．０２ｍｏｌ　）の冷脱酸素化
溶液で処理し、ついで温度が５°Ｃまで短時間で上昇し
た。 −５℃で０．５時間攪拌後、固体をろ集し冷脱酸素化Ｈ
２０で洗浄した。淡緑色生成物を真空下、室温でＰ２Ｏ
５を用いて数日間乾燥した四、３ｇ；６８％）　；　Ｔ
ｌ−ＣＲｆ　＝０．１９　（ＣＨＣ１３：ＥｔｏＨ，９
：　１）；　ＩＲ（Ｋｃｌ）はＣ＝Ｏ吸収の証拠を示さ
なかった。 質量分析：　Ｃ，１ｌＨ８ｃ’ｌ　Ｎｏ　・１　／６　
Ｈ２Ｏとして計算値：Ｃ，６１，０８；Ｈ，４，２７；
Ｎ、７．１２ 実験値：Ｃ，６１，３６；Ｈ，４，４４；Ｎ、６．８５ Ｎ２により脱酸素化されたＴＨＦ（１５ｍＬ）にピリジ
ン（０，６５ｍＬ　Ｈ０，００８ｍｏｌ　）　、）リフ
ルオロ酢酸（１，２７ｍＬ　；　０．０１６４ｍｏｌ　
）、及び３−ヒドロキシ−５−ｐ−クロロフェニルピロ
ール（１７）　（１，３ｇ　；　０．００６５ｍｏｌ　
）を添加した。溶液を０℃〜４°Ｃまで冷却し、ついで
ＴＩ（Ｆ１５ｍＬ中のＮ−トシル−Ｉ−−アラニュルク
ロリド（２，１ｇ　；　０．　ＯＯ８ｍｏ＋）の、Ｎ２
により脱酸素化された、冷却（０°Ｃ〜−４°Ｃ）溶液
を１０分間に亘って添加した。混合物を０°Ｃに１時間
保持した後、氷及びＩＮクエン酸１００ｍＴ−の混合物
を添加した。この混合物を酢酸エチルで抽出し、ついで
抽出物を冷飽和食塩水で１回、冷い希釈ＮａＨＣ○３で
２回、冷飽和食塩水で１回洗浄し、これに続いてＭ　ｇ
　Ｓ　ＯＡ上で乾燥しろ過した。 ろ液をダルコ（Ｄａｒｃｏ）　２　ｇで処理しついで１
０分間攪拌し、ろ過し、ついでろ液を真空濃縮して赤味
がかった褐色油状物を得た。ダルコ（Ｄａｒｃｏ）１．
３ｇを用いて２回目の処理を行うと淡赤色油状物質を生
じた。この油状物質をトルエン；シクロヘキサン（４：
１）に溶解しついで一晩冷蔵庫に入れた。淡い　サーモ
ンピンク色の結晶が得られた。（１，４５ｇ；５３％）
；ｍｐＨ３−５°ＣＴＬＣＲｆ　＝０．４．７　（Ｅｔ
２０）ｉ　ＩＲ（ＫＣＩ）ｃｍ−’ｌ　７４０　（Ｃ＝
０．エステル）　；’Ｉ（ＮＭＲ（ＣＤＣＩ、）　δ８
．４　（ｂｒ　ｓ、ＩＨ）　、７゜８−７．２　（ｍ、
８Ｈ）　、６．７　（ｍ、Ｉ　Ｈ）　、６．２　（ｍ。 ＩＩ（）　、　５．５　（ｄ、　、Ｊ＝９．　ＩＨ）　
、　４．２　（ｐ。 Ｊ　＝８．　１．ｌ−１）　、２．４　（ｓ、３Ｈ）　
、１．４　（ｄ。 ３Ｈ）　；ＭＳ　（Ｅｌ、ＤＩＰ）ｍ／ｅ　４］８（Ｍ
”、２．３％）及び４２０　（Ｍ”　、０．８％）。 質量分析：　Ｃ２ｏＨ＋ｑＣＩ　Ｎ２０４Ｓとして計算
イ直　：Ｃ，５７，３４；Ｈ，，１，５７Ｎ、６．６９ 実験イ直　：Ｃ，５７，５３；Ｈ，４，５Ｂ　。 Ｎ、６．６７ （３）種々の試験具の製造およし使用 一連の実験を行って本発明の試験具を製造し、前出のエ
ステル基質について、その白血球−触媒加水分解能、そ
れにつづく両性イオン（１）とのカップリングを行う能
力、すなわち尿中の白血球に対する応答性を試験した。 各試験具は試験試薬を含む小さい四角いろ紙からなり、
ろ紙はポリスチレンフィルム片の一端に貼付された。ろ
紙には緩衝液、前述のエステル、促進剤及び両性イオン
１ カップリング剤を含浸した。試験された試験具の各々は
尿中白血球について正の試験結果を示すことが判明した
。 尿中白血球の存在に対して鋭敏な試験具を製造した。こ
の試験具はポリスチレンフィルムの細長い細片の一端に
貼られた小さい四角いろ紙を含む。 このろ紙には発色性エステル、促進剤及びジアゾニウム
塩をはじめとする種々の成分を含浸させた。 １２インチ（３０，７ｃｍ）巾のイートン・アンド・デ
ィックマン（Ｅａｔｏｎ　ａｎｄ　Ｄｉｃｋｍａｎ）　
＃　２０５ろ紙片を、次のものを含有する水溶液に浸し
た：０．４Ｍ　ホウ酸塩−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ−９，０
２、Ｏ％（Ｗ／’／　）ポリヒニルピロリドンに−３０
０，２％（ＷんＶ）バイオターグ（Ｂ　ｉｏｔｅｒｇ）
　ＡＳ−４０００，２５Ｍ　ＮａＣ］ このろ紙を次に、Ｈ２Ｏ１インチ（２，６ｃｍ）の空気
流圧力で１７５−２００６Ｆのオハリー・工２ ア・ホイル（Ｏｖｅｒｌｙ　Ａｉｒ　Ｆｏｉｌ　）ろ紙
乾燥器中で７分間乾燥した。次に、この乾燥ろ紙を、１
．５％（ｖ／ｖ）ｎ−デカノール ０．７ｍＭ　１−ジアゾ−２−ナフトール−４−スルホ
ネート １．１ｍＭ　３−（Ｎ−トシル−アラニニルオキシ）−
５−フェニルピロール を含むアセトン溶液に含浸した。この含浸にひき続き、
Ｈ２Ｏ０，５インチ（１，３ｃｍ）の空気流圧力で１５
０下のオバリー（Ｏｖｅｒｌｙ　）炉中で７分間乾燥し
た。少し黄色がかった試験紙が得られた。 乾燥含浸ろ紙を、−辺が０．２インチ（０，５ｃｍ）の
寸法の正方形に裁断し、４インチ（１０，２ｃｍ）×２
インチ（５，１ｃｍ）の軸配向ポリスチレン片の一端に
貼り付けた。細片へのろ紙の貼付けはダブル・スティッ
ク（Ｄｏｕｂｌｅ　Ｓ　ｔｉｃｋ）両面接着剤（スリー
エム（３Ｍ）・カンパニー）を用いて行った。 ルビロール（１３）である試験具 エステル指示薬として１−メチル−３−（Ｎ−）シル−
し一アラニニルオキシ）−５−フェニルピロールを使用
し、カップリング剤が１−ジアゾ−ナフタレン−４−ス
ルホネートである、尿中白血球の存在に対して鋭敏な試
験具を製造した。 ろ紙（イートン・アンド・ディソケマン（Ｅ　ａ　ｔｏ
ｎａｎｄ　Ｄｉｋｅｍａｎ）　＃　２０５　）を、０．
４Ｍ　ホウ酸 ２．０％（Ｗ／Ｖ）ホリビニルピロリドン（Ｋ−３０）
０．２％（Ｖ／Ｖ）ハイオターグ（Ｂｉｏｔｅｒｇ）八
Ｓ−４００，２５Ｍ　ＮａＣ１ を含有する第１浸漬水溶液に浸した。ろ紙を含浸するに
先立ち、この溶液をＮａＯＨで滴定してｐＨ９，０にし
た。 第二浸漬アセトン溶液は、 ０．７５ｍＭ　１−ジアゾ−２−ナフトール−４−スル
ボネート １．３ｍＭ　１−メチル−３−（Ｎ−）シルーＬ−アラ
ニニルオキシ）−５−フ ェニルピロリドン １．５％（Ｖ／Ｖ）　ドデカノール を含有した。 第一浸漬水溶液への含浸に続いて、ろ紙を約５分間約８
０°Ｃで乾燥し、第二浸漬溶液に約５分間７０°Ｃで浸
漬した。 この二度含浸したろ紙を次に強制空気炉中で５分間５０
°Ｃ乾燥した。 この乾燥ろ紙を一辺０．２インチ（０，５ｃｍ）の寸法
の正方形に裁断し、ついで０．２インチ（０，５ｃｍ）
Ｘ３．２５インチ（８，３ｃｍ）の寸法のポリスチレン
フィルムの一端に貼付した。貼付はスリーエム（３Ｍ）
・カンパニーからの両面テープ、ダブル・スティック（
Ｄｏｕｂｌｅ　５ｔｉｃｋ）を用いて達成した。試験具
は１００個ずつびんに、乾燥保存のためにシリカゲル及
び分子ふるいと共に貯蔵した。 アセトン溶液がフェニルピロリドンの代りに５ １．３ｍＭ　３−（Ｎ　−トシル−Ｌ−７’ラニニルオ
＋シ）−５−（ｐ−クロロフェニル）ピロールを含有し
ていた他は実験（３）−（２）におけると同様にして試
験具を製造した。 （４）試験具の評価 （３）の実験で製造された試験具を、尿中に存在する白
血球の検出能の評価に付した。 試験試料を正常なヒトの尿プールから調製した。 １試料を空試験として使い、採取したばかりの血液から
単離した白血球を２つの別の尿試料に添加して、それぞ
れ０．１０及び７５白血球／μＬの濃度とした。 試験具を迅速に試験試料中に浸漬しついで引き出した。 ２分後、顕微鏡を用いて観察して４００７００ｎｍ（ナ
ノメートル）のうちの異なる波長で％反射率を測定した
。 試験具のすべてが試験試料中の種々の白血球濃度に相当
する光反射率において明らかに見分けられる差異を立証
することをデータは示している。 データを次表に示す。 ６ 実験番号　白血球濃度　％反射率 （Ｕ胞／μＩ−）　５５５ｎｍにおいて３、ビ　０　〜 １０−１　２　− ３．２　０　６７ １０　６４ ７５　６０ ３．３　０　６１ １０　５１ ７５　４２ ＊目視観察：　１０−１２細胞／μＬで生成する紫色；
空試験は色の変化を示さなかった。 先に述べたような、本発明の多くの他の修正及び変更を
本発明の精神及び範囲を逸脱することなく行うことがで
きることは明らかである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試験試料中の白血球、エステラーゼ及びプロテアー
   ゼより選択された分析対象物の存在を測定するための組
   成物において、前記組成物が、前記分析対象物と相互反
   応すると検出可能な応答をなすことができるエステル及
   び 式中、Ａ−はアニオンであり、Ｒは同一でも異なってい
   てもよいが、Ｈ１低級アルキル、了り−ルであるか、又
   はＲの両者が協働して縮合環系を形成し、式中、Ｒ′は
   旧０Ｈ又は低級アルキルである、 を有するジアゾニウム塩 からなることを特徴とする組成物。 ２、前記Ａ−が４位にある特許請求の範囲第１項記載の
   組成物。 ３、前記Ａ−がＳ０３である特許請求の範囲第２項記載
   の組成物。 ４、前記ジアゾニウム塩が１−ジアゾ−２−ナフト−ル
   −４−スルボン酸エステルである特許請求の範囲第１項
   記載の組成物。 ５、前記エステルが３−（Ｎ−１−シル−し一アラニニ
   ルオキシ）−５−フェニルピロールテアル特許請求の範
   囲第１項記載の組成物。 ６、前記組成物が更に促進剤を含む特許請求の範囲第１
   項ないし第５項のいずれかに記載の組成物。 ７、前記促進剤が約８ないし１５個の炭素原子を有する
   アルコールである特許請求の範囲第６項記載の組成物。 ８、前記促進剤が約８ないし１５個の炭素原子を存する
   アルコールであり、かつ前記ジアゾニウム塩が１−ジア
   ゾ−２−ナフトール−４−スルホン酸エステルである特
   許請求の範囲第６項記載の３．■酸物。 ９、白血球、エステラーゼ又はプロテアーゼの存在を測
   定するための試験具において、特許請求の範囲第１項な
   いし第５項のいずれかの３、■酸物を包含せしめた担体
   マトリックスよりなることを特徴とする試験具。 １０、前記組成物が更に促進剤を含む特許請求の範囲第
   ９項記載の試験具。 １１、前記促進剤が約８ないし１５個の炭素原子を有す
   るアルコールである特許請求の範囲第１０項記載の試験
   具。 １２、前記ジアゾニウム塩が１−ジアゾ−２−ナフト−
   ルー４−スルホン酸エステルである特許請求の範囲第１
   １項記載の試験具。 １３、試験試料中の白血球、エステラーゼ又はプロテア
   ーゼの存在を測定するための方法において、前記方法が
   、前記試料を特許請求の範囲第９項記載の試験具と接触
   させ、ついで検出可能な応答を観察することからなるこ
   とを特徴とする方法。 １４、試験試料中の白血球、エステラーゼ又はプロテア
   ーゼの存在を測定するだめの方法において、前記方法が
   、前記試料を特許請求の範囲第１０項記載の試（整置と
   接触させ、ついて検出可能な応答を観察することからな
   ることを特徴とする方法。 １５、試験試料中の白血球、エステラーゼ又はプロテア
   ーゼの存在を測定するための方法において、前記方法が
   、前記試料を特許請求の範囲第１１項記載の試験具と接
   触させ、ついで検出可能な応答を観察することからなる
   ことを特徴とする方法。 １６、試験試料中の白血球、エステラーゼ又はプロテア
   ーゼの存在を測定するための方法において、前記方法が
   、前記試料を特許請求の範囲第１２項記載の試験具と接
   触さゼ、ついで検出可能な応答を観察することからなる
   ことを特徴とする方法。