JPH05502877A - 抗凝血剤の診断薬としての使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗凝血剤の診断薬としての使用 本発明は、薬剤、特に検出可能な物質でラベル化されたアネキシン（ａｎｎｅｘ ｉｎｅｓ）及び診断のためにそれを使用することに関する。

血液は血漿媒体中に分散した非結合細胞からなる。細胞の内容物は、いわゆる原 形質膜によって、回りを囲んでいる血漿から分離されている。これら膜は、二重 層の形でリン脂質からできており、この二重層を部分的に貫通しているかまたは それから突き出ているタンパクと結合している。

多種のリン脂質は、該二重層の外殻及び内殻の上に不規則に分配されていないで 、非対称な形状でその細胞によって保持されている（７．　８）。ところが、ホ スファチジルコリン（−ＰＣ）及びスフィンゴミエリン（ＳＰＨ）は、外殻の優 位種であり、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン （Ｐ　Ｅ）及びホスファチジルイノシトール（ＰＩ）は、細胞質ゾルに面してい る内側の殻に広く位置している。この非対称のエネルギー消耗状態は、例外的な 生理学的重要事項に属する。ＰＣ及びＳＰＨは、リン脂質類の最も不活性な種類 であり、他の種類とは全く対照的に、血漿成分の存在下で例外的な中立的挙動を 示す。血漿タンパクに関連のある外殻のこの反応活性欠如は、血液が液体のまま で存在できることを保証するための絶対的必須条件である。凝血カスケードに属 する特別の血漿タンパク、即ち、いわゆる凝血因子は、事実、それらが活性化し たときに液状の血液を固体状態に転化することができる（９）。これら凝血因子 は、ホスファチジルセリンの如きリン脂質によって活性化され得る。

多くの場合、例えば、血管に損傷が生じた後は、生存の危機を挙げるまでもなく 、凝血因子が活性化される必要がある。そういう状況において、特別な血液細胞 、即ち、血小板は、凝血因子の活性化を促進する外殻にホスファチジルセリンを 輸送する活性化メカニズムによって、その膜の非対称性を放棄してしまう（］０ ）。

血小板血漿膜の外殻のリン脂質組成におけるこの系統的変化は、例えば、スコツ ト症候群によって示されるように、血流遮断において主要な生理学的重要事項に 属する（４１）。

しかしながら、生理学は病理学をも包含する：従って、血液の血流遮断は、ある 場合には、動脈、冠状動脈及び静脈血栓症において起こるように、病的状態に陥 るかも知れない。

これら血流遮断障害は通常イオジオバシック（ｉｏｄｉｏｐａｔｈｉｃ）であり 、医師がそれらの発生を予測し及び予防処理を開始するのを不可能にしている。

本発明の目的は、血流遮断障害を早期に認知することを助ける薬剤を提供するこ とであった。

徴候の進展とは異なり、障害の進展は通常ゆっくりとしている。徴候かなく経過 するこの段階の間、即ち、前血栓状態の間は、凝血系の継続的活性化が局部的に 起こっている。この局部的な活性化に関連して、その周辺には、活性化の初期の 段階で血小板の発生が起こる。これら血小板は、既に、それらの外側の血漿膜殻 のリン脂質組成を変化させ始めている。ホスファチジルセリンは外殻に存在して いる。それ故、このいわゆる前血栓状態を診断できる薬剤は、極めて臨床的に重 要なものであるといえる。

本発明の更なる目的は、ホスファチジルコリンからホスファチジルセリンを特異 的に区別することのできるアジュバントを提供することであった。

周辺で弱く活性化された血小板の発生に加えて、充分に活性化された血小板は、 血管壁が病的状態にあるところならどこでにも蓄積するであろう。この局在化は 、血流遮断系の活性化の引き金と考えることができる。この異常点の局在化及び この点での血栓形成は、主要な治療的評価に属するであろう。

従って、本発明の更なる目的は、血流遮断系の活性化の開始点及び／または血栓 をそれによって突き止め得る薬剤を提供することであった。

血液凝血メカニズムは、反応の終わりが最終的に線維素原を繊維素に転化するト ロンビンを形成することである酵素反応のカスケードを構成する。例えば、因子 Ｘａ及びＶａによるプロトロンビンの活性化の如き多様な前凝血反応は、凝固因 子が結合しているリン脂質表面によって触媒される。

リン脂質に結合しリン脂質表面に依存するプロセスに支障を来すタンパクは、リ ン脂質に対するそれらの結合においてＣａ”＋依存性である１つの類を構成して いる。

アネキシンとしても知られているこの類は、リボコルチンエ、カルバクチン■、 タンパク■、リボコルチン■、ｐ６フーカレレクトリン（ｃａｌｅｌｅｃｔｒｉ ｎ）　、血管抗凝血タンパク（ｖＡＣ）及びＩＢＣｉ：加エテ、ＰＡＰ、ＰＡＰ Ｌ　ＰＰ４、エンドネキシン（ｅｎｄｏｎｅｘｉｎ）　Ｉ［及びリボコルチンＶ を含む。

アネキシンにとって共通の構造的特徴は、おそらくそれらのＣａ２°類似特性及 びリン脂質結合特性に基礎を置いている。この一般的特性は、全てのアネキノン に当てはまるとはいえ、Ｃａｔ＋及び多様なタイプのリン脂質についてのそれら の親和性に関して明確な個別性が存在する。

アネキシンの生理学的機能は、膜関連プロセスに関するものである。ＶＡＣの抗 凝血作用の基本的メカニズムは、リン脂質の表面へのＶＡＣの結合によるリン脂 質の触媒能力の阻害であり、それによって、リン脂質表面上での凝血促進複合体 の形成を妨げるものとして認識された。

結合性の研究によって、ＶＡＣはカルシウム依存的に前凝血性リン脂質と可逆的 に結合するということがわかってきた。

Ｃｄ”、Ｚｎ”、Ｍｎ”＋及びＣｏ”“の系列の他の２価のカチオンも結合に関 して正の作用を有しているが、Ｃａ”″の大きさとは同じではない。

更にまた、驚いたことに、リン脂質上へのＶＡＣの吸着はＣａ”及びＺｎ”イオ ンの存在下で異常な程に正に影響を受けるということがわかった。

驚いたことに、血漿カルシウム濃度で、ＶＡＣはホスファチジルセリンと結合す るが、ホスファチジルコリン及びスフィンゴミエリンとは結合しないということ が分かった。従って、ＶＡＣはそれらの外側の膜の外皮中でＰＳと共に周辺の血 小板を特異的に認識し結合するであろう。更にまた、ＶＡＣは血液にＰＳを提供 している血管系におけるそれらの位置を特異的に認識するであろう。

リン脂質中でのこの差別的挙動は、上記のように、ＶＡＣを他のアネキシンのよ うに前血栓団を早期に認知するための理想的な薬剤にする。

驚いたことに、本発明によって、血管系の前血栓状態を最初に認知することが可 能である。この診断法は物質、即ち、正常状態とは異なる血小板の前血栓状態を 認識できる薬剤の特異性によって可能となる。該前血栓状態は、前血栓性の血小 板のみの外皮がホスファチジルセリンを示すという点で血小板の正常な状態と異 なるので、この原理は、ホスファチジルセリンをホスファチジルコリンと特異的 に区別することのできる如何なる薬剤によっても本発明に従って利用される。

本発明で使用することのできる薬剤は、ホスファチジルセリンについての特異性 によって特徴付けられ〜この特異性は本明細書に記載した結合性試験によって決 定することができる。

本発明の薬剤の特異性を使用することによって、血流遮断系の活性化の開始点及 び／または血栓を突き止めることも可能である。

結局、本発明は、さしあたり、健康を脅かすことになるかも知れない状態を早期 に診断することによって、相応しい治療学的検査を採用するのを可能にする薬剤 を提供する。

本発明の好ましい薬剤は、抗凝血性ポリペプチドであって、それらはリン脂質ホ スファチジルセリンに対して必要な特異性を有するものであることが条件である 。

アネキシン類、特にＶＡＣか特に好ましい。

本発明の薬剤、特にＶＡＣまたは他のアネキシンを診断薬として使用できるよう に、それらは公知の方法でラベル化される。好適なラベル化は、例えば、蛍光基 でのラベル化または放射性ラベル化によって行うことができる。使用するのに都 合のよい蛍光マーカーはフルオレセインイソチオシアネートであり、一方、使用 するのに都合のよい放射性マーカーはハロゲンの放射性同位元素、特にヨウ素の 放射性同位元素、例えば、＋１■または！３Ｉであり、または鉛、水銀、タリウ ム、テクネチウムまタハインシウム（””ｐ　ｂ、　””Ｈｇ、　”’Ｔ　１． ’・ｓ　Ｔ　ｃ　、　ｌ　Ｉ　ＩＩｎ）である。

フルオレセインインチオシアネート〔セルバ（Ｓｅｒｖａ）　）は、公知の方法 （１３）でＶＡＣをラベル化するのに使用することができる。また、ラベル化は ＭＲＴ（磁気共鳴画像）システムで検出可能な常磁性造影剤（ｐａｒａｍａｇｎ ｅｔｉｃ　ｃｏｎｔｒａｓｔａｇｅｎｔ　）によっても可能である。ＭＲＩシス テムで検出可能な診断薬として複合体を供給することのできるガドリニウム、コ バルト、ニッケル、マンガンまたは鉄の錯体を使用することが可能である。かか るシステムにおいては、存機体中における元素の核スピンベクターを調整するた めに強い磁場か使用される。次いで、該磁場は壊され、それは核をその最初の状 態に戻す。このプロセスは観察され記録される。

このようにして検出可能なマーカーを付された抗凝血性ポリペプチドは、次いで 、動脈または静脈を経由して投与される。投与される量は、充分なインキュベー ジタン時間のあとに続く測定にとって満足できる量でなければならない。

前血栓状態を診断するために、本発明のラベル化されたポリペプチドまたは薬剤 を、適宜、血漿カルシウム濃度を低下させない更なる抗凝血剤、例えば、ヘパリ ンの存在下で、試験されるべき血液に体外から加え、次いで、特定のタイプの細 胞と結合したラベルを分析するのである。

本発明のラベル化されたポリペプチドは、血液等張性水溶液中でまたはアジュバ ントと共に本発明の目的のために使用することかできる。アジュバントには、例 えば、ツイーン（ＴＷＥＥＮ）　８０、アルギニン、リン酸緩衝液及び生理的に 和合性のある保存剤か挙げられる。他の物質も当業者によく知られており、使用 することができる。

放射性ラベル化は、例えば、公知のヨウ素化法（１２）または通常のタロラミン −Ｔ法を使用して行われる。その８日間の半減期からみて、１１がインビボでの 診断に推奨できる。放射性ラベル化された薬剤は血液等張性水溶液中に溶解する 。無菌濾過後に注射する。注射してから１．２．４及び７日後に、例えば、Ｉｌ ｌ　Ｉに対するガンマカメラで全身シンチグラフを撮る。

アネキンンの真性壓と同じく、本発明のために変更した型を使用することも可能 である。

特にＥＰＡ　０２９３５６７に記載した突然変異体に関して参照されるべきであ る。更にまた、リン脂質ホスファチジルセリン／ホスファチジルコリンに特異的 であり、従って、含まれる血小板の前血栓状態を認知できるそのフラグメントま たは化学的に修飾したアネキシン誘導体を使用することもできる。

本発明は、具体的には 一アネキシン類由来の抗凝血ポリペプチド、好ましくは検出可能なラベルを育す るＶＡＣ −検出可能なラベルとして、蛍光ラベル、好ましくはフルオレセインイソチオン アネート：ハロゲン、テクネチウム、鉛、水銀、タリウムまたはインジウムの放 射性同位元素、特に好ましくは１３１１またはＩｔｓ　Ｉまたは常磁性造影剤を 含有する抗凝血ポリペプチド 一ホスファチジルコリンからホスファチジルセリンを区別するための上記の如き 抗凝血ポリペプチド 一診断薬として使用するための上記の抗凝血ポリペプチド−血流遮断系の活性化 の開始点を突き止める方法であって、ａ）検出可能なラベルを備えたアネキシン 類由来の抗凝血ポリペプチドまたは薬剤、好ましくはＶＡＣを、好ましくは動脈 または静脈経路で系に投与し、ｂ）インキュベーション時間経過後、前記ポリペ プチドの分布を、体外でガンマ−シンチレーションカメラでまたは磁気共鳴測定 法によって観察する方法、−前血栓状態を診断する方法であって、ａ）試験する 血液を検出可能なマーカーを存するアネキシン類由来の抗凝血ポリペプチドまた は薬剤、好ましくはＶＡＣと体外で混合し、ｂ）特異的な細胞のタイプと結合し たラベルを分析する方法−検出可能なマーカーを育するアネキシン類由来の抗凝 血ポリペプチド、好ましくはＶＡＣ以外に、更に、例えば、生理食塩水、ツイー ン８０、アルギニン及び／またはリン酸緩衝液、適宜使用される血漿カルシウム 濃度を低下させない抗凝血剤、好ましくは〜くリンを含有する薬剤−ホスファチ ジルコリンからホスファチジルセリンを区別することができる本発明の薬剤また は抗凝血剤を含有する、前血栓状態または血流遮断系の活性化の開始点及び／ま たは血栓を診断学的に検出するためのキット−ホスファチジルコリンからホスフ ァチジルセリンを区別するための本発明の抗凝血ポリペプチドまたは薬剤の使用 −前血栓状態または血流遮断系の障害の開始点または血栓の診断のための本発明 の抗凝血ポリペプチドまたは薬剤の使用ＶＡＣはＥＰＡ　０１８１４６５または ＥＰＡ　０２９３５６７のいずれかと同様にして作成した。

以下の実験はＶＡＣαで行ったか、その結果は他のアネキシン、特にＶＡＣβに も当てはまる。

脂質 ジオレオイル−ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ，Ｎｏ、　Ｐ−１０１３）、ジ オレオイルーホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ、　Ｎｏ、　Ｐ−０５ １０）、カルシオリビン（ＣＬ、　Ｎｏ、　Ｃ−５６４６）、ジオレオイル−ホ スファチジルグリセロール（ＤＯＰＣ；、　Ｎｏ−Ｐ−９６６４）、ホスファチ ジルイノシトール（Ｐ　１．　Ｎｏ、　Ｐ−０６３９）、ジオレオイル−ホスフ ァチジン酸（ＤＯＰＡ、　Ｎｏ、　Ｐ−２７６７）、ステアリルアミン（ＳＡ、 　Ｓ−６７５５）及び卵黄スフィンゴミエリン（Ｓ−０７５６）をシグマ化学社 から入手した。

ＤＯＰＣ及びＤＯＰＥの純度は、薄層クロマトグラフィーで試験した。ジオしオ イル−ホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）は（１）に従いＤＯＰＣを転化させて 合成した。１４ｃｍラベル化ＤＯＰＳ　Ｃ比活性１００．０００６９ｍ１μｇ） をアマジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社から入手した。

シリコンプレート上へのリン脂質二重層の調製コルセル（Ｃｏｒｓｅｌ）ら（２ ）に記載されているようにして「ラングミュアーーフィルムバランスノ　〔ラウ ダ（Ｌａｕｄａ）タイプＦＷ−１）を使用し、リン脂質二重層を適用した。親水 性シリコンプレートを３０％クロモ硫酸及び水中で２４時間処理し、５０％エタ ノール／水中に保存した。使用する前に、それらを洗浄剤及び水で完全Ｉこ洗浄 した。フィルムバランスを鉱物質除去した水と５０μＭ　ＣａＣｌ１ｔで満たし た。クロロホルム中に約２ｇ／ｌのリン脂質を含有する２０μｌの溶液をこの支 持体に適用した。二重層中のＤＯＰＳフラクションをＤＯＰＣと混合した１４Ｃ −ラベル化ＤＯＰＳで試験した。満たされた二重層をシンチレーション洗浄剤（ デュポン・フォーミュラ９８９）でシリコンプレートから除去して、シンチレー ションカウンター中で総放射能を測定した。

楕円偏光測定器による結合性測定 リン脂質二重層上へのＶＡＣの吸着を記載されているように（２，３）自動楕円 偏光測定器で測定した。

結合性試験は５ｍｌの攪拌した緩衝液（０，０５Ｍｈリス／ＨＣ１；　０．　Ｉ Ｍ　ＮａＣ１；ｐＨ＝７．５　；Ｔ＝２０°Ｃ）を含有する親水性キュベツト中 で行った。２価のカチオンを塩化物として段階的に添加した。

ＶＡＣ濃度＜０．１μｇ／ｍｌで、ＶＡＣについて適度な緩衝能を付与するため に特異的ＶＡＣ濃度を含有した緩衝液を連続的に添加した。

吸着したフィルムの屈折率及び厚みｄを偏光データ及び分析データを組み合わせ て決定した（４）。吸着したタンパク層の量ｒは偏光したローレンツ−ローレン ツ式（１）を使用して屈折率及び厚みから決定した（３．　５）　：（１）　ｒ ＝３ｄ（ｎ”−ｎｂ”）／［（ｎ”＋２）（ｒ（ｎｂ”＋２）　−ｖ（ｎｂ’− １））］＋ｎｂは緩衝液の屈折率である。ｒ＝０．２５４及びｖ＝０．７１の値 を比モル屈折能及び比体積に使用した（３）。

結果 リン脂質へのＶＡＣの結合についての２価カチオンの効果ＶＡＣは、カルシウム 濃度に依存して２０％ＤＯＰＳ／８０％ＤＯＰＣからなるリン脂質膜に結合する 。続いてＥＤＴＡを添加すると即座に及び完全に脱着した（第１図）。フリーの Ｃａ”＋濃度を変化させることによって、吸着量及び吸着速度に如何なる目立っ た変化をもたらすこともなく、数回吸着を開始させることができた。従って、吸 着または脱着によって起こるＶＡＣ分子またはリン脂質二重層に対する非可逆的 変化はありそうもない。牛ユベットをＣａ”“を含まない緩衝液で軽く洗浄する と、結合は完全に元に戻った。

リン脂質へのＶＡＣ結合のＣａ！ゝ依存性を第２図に示す。該Ｃａ１供与量一活 性曲線は、１／２の最大ＶＡＣ吸着が達成されるＣａ”＋濃度：［Ｃａ”］＋／ ｌをはっきりと示している。［Ｃａ　”］　＋ｙｔ値はリン脂質表面の組成に依 存している。

１００％、２０％、５％及び１％ＤＯＰＳを含有するリン脂質表面で、それぞれ ・３６ｕＭ、２２０μＭ、１．５−及び８．６−の【Ｃａ″＋１１７雪値が測定 された（表１）。

これらの結果は、特に５３μジの［Ｃａ　”ｌ　ｗｔ値によく一致しており、そ れはＰ　Ｓ／Ｐ　Ｃ小胞の等モル混合物に結合したエンドネキシンＩ［（＝ＶＡ Ｃ）について測定されたものである（６）。吸着されたタンパクの最大量（ｒｍ ｘ）は膜のＤＯＰＳフラクションに依存しておらず、約０．２１７μｇ／ｃｔｎ ”に達した。Ｃａ、”濃度が３ｒｒＭまで、純粋なりＯＰＣ二重層では吸着は検 出されなかった。

異なる濃度のリン脂質二重層へのＶＡＣの吸着を第５図に示す。純粋なりＯＰＣ 二重層では実質的にＶＡＣの吸着が見られないということか明確に示されている 。

ステアリルアミド（ＳＡ）へのＶＡＣの吸着も弱い。

Ｃａ”＋以外のカチオンでの実験では、リン脂質へのＶＡＣの結合は優れてＣａ ”。

特異的であることが分かる（第３図）。Ｃｄ”、Ｚｎ”、Ｍｎ”ゝ及びＣ０２“ は、あまり進展した結合を示さない、　Ｂ　ａ　ｌ　ｔ−及びＭ　ｇ　！−＋よ 如何なる影響も示さない。

カチオンのこの特性はある程度まではそのイオン半径に関係付けることかできる 。

亜鉛の相乗作用 高濃度の亜鉛イオン（１−）は僅かな程度であるがＶＡＣ吸着を促進するが（第 ３図）：５０μにでは吸着に関してほんの僅かな効果も有さない。驚いたことに 、この濃度はＣａ”存在下で結合に影響を及ぼし、ある相乗効果か存在する。

［Ｃａ”ｌ、、−値は、１％ＤＯＰＳＬか有さない二重層について８．６−から ２．７菌に下がる（［Ｚｎ”］＝５０μＭ）（第４図）。５０ｔｔＭ　［Ｚｎ” ］は、血漿亜鉛濃度の正常範囲内である。

ａ）ＶＡＣを公知の方法でフルオレセイン基、例えば、フルオレセインイソチオ シアネートでラベル化する；この場合ＶＡＣ−ＦＩＴＣが得られる。

ｂ）血漿カルシウム濃度を減少させない抗凝血剤（例えば、〜くリン）及びＶＡ Ｃ−Ｆ　ＴＴＣを含有するプラスチック製試験管に患者の血液を入れる。

Ｃ）混合後、ＦＡＣＳ　（蛍光励起細胞ソーター）を使用して血液細胞を分析す る。

この分析は、特異的タイプの細胞と結合した蛍光の強度を決定する。

ｄ）この分析の概要は、ＶＡＣ−ＦＩＴＣと結合した血小板の量、即ち、ＰＳに 曝された血小板の量を示すものであり、従って、前血栓状態の存在を示すもので ある。この方法によって、健康を脅かす状態が早期に認知され、結果として初期 段階の治療か可能になるのである。

ａ）ＶＡＣを公知の方法を使用して短命放射性同位元素、例えば、ＤＩ　Ｉでラ ベル化する。”’Ｉ−ＶＡＣが得られる。

ｂ）”１−ＶＡＣを患者に静脈投与する。

Ｃ）一定時間インキュベートしたのち、患者の身体の全体または一部をシンチグ ラフィーに曝す。広視野ガンマカメラを使用して放射能の分布を観察することか できる。

ｄ）”’Ｉ−ＶＡＣの蓄積した血管部位が血栓の進行している点を指示している 。

適当な血栓防止処置または血栓軽減処置を早期にとることができる。

２回蒸留したｉｆの水に２４．５　ｇのリン酸二水素ナトリウム引水和物を溶解 し、２回蒸留した１１の水に３５．５　ｇのリン酸水素二ナトリウムを溶かした 溶液をｐＨが７．５になるまで加えた。

２回蒸留した１１の水に２．７６ｇのリン酸二水素ナトリウム・ｌ水和物を溶解 し、２回蒸留したｌｌの水に２．．８４ｇのリン酸水素二ナトリウムを溶かした 溶液をｐＨが７．２になるまで加えた。溶離緩衝液は１１のこの緩衝液に８、７ ７　ｇのＮａ（、ｊ’　（１５０ｍｍｏ［）を添加することによって調製した。

１、１．３．　精製用カラムの平衡化 約３０ｍ１の溶離緩衝液でＰＤ−１０カラム（セファデックスＧ２５、メセルス ・ファルマシア社製）を平衡化した。

１．１．４．　反応容器の調製 ５０ｍ１の高純度ジクロロメタンに２ｍｇのｌ０ＤＯ−ＧＥＮ　（分子マス（ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｓｓ）　＋　４３２．０９　ｇ／ｍｏｌ）を溶解した。

１．５ｍｌ容のエッペンドルフ容器に２００μｌのこの溶液をピペットで採り、 ３７℃で溶媒を蒸発させた（恒温ブロック）。このようにして、８μｇ　（１， ８５ｘ　１０−”ｍｍｏｌ）のｌ０ＤＯ−ＧＥＮを反応容器の内壁に精巧に分散 した。

１、１．５．　ラベル化に使用したＶＡＣ−α使用した出発原料は、４ｍｌの２ ０ｒＩｎＯ１／Ｉ！リン酸ナトリウム緩衝液＋１５０ａｎｏｌ／１Ｎａｃｉ’　 （’ｐＨ７，２，１ｍｌの２回蒸留した水で希釈）に５０ｍｇのＶＡＣ−αを溶 解した溶液であった。分子マスＶＡＣ−α　３４０００　ｇ／ｍｏ＋。

クツ製のＮａ＋２’Ｌ比活性は１５．９　Ｃｊ／［のヨウ素＝　１．９８　ｋＣ ｊ／ｍｍｏｌ　１／２Ｉ２であり、０．１１５μｇヨードに対応する（９．２　 ｘ　１０−’ｍｏｌ　ｌ／２１２）。

この活性Ｎａｌを５．５　μｆのＯ，１ｍｏｌ／ＪＮａＯＨ中に溶解した。

１．２．ヨウ素化 全作業は鉛処理ガラススクリーンのうしろで該同位元素を除去しながら行ツタ。

１．１．５．１：記載したＶＡＣ−ａ溶液２０μ！！（＝２００μｇ）をｌＯＤ 。

−ＧＥＮで前処理した反応容器の中に移した。この容器を密閉し、周囲温度で２ ０分間振った。次いで、その反応溶液を準備したＰＤ−１０カラム（＋、　１． ３．を参照）にピペットで適用した。該反応容器を５００μｌの溶離緩衝液（１ ，１，２，を参照）で再度軽く洗浄し、この溶液もＰＤ−１０カラムに適用した 。流出した溶離液は捨てた。

１．３．精製 ２分間隔で溶離緩衝液（１，１，２−を参照）の０．５ｍｌアリコツトを適用す ることによッテ、ＶＡＣ−ａ（”’Ｉ］をフリー（Ｄ””Ｉ／Ｎａ”’Ｉから分 離した。

１２フラクションを採取して、この精製工程を完結した。実験室モニター（ＧＭ Ｚ）を使用してフラクションの相対的活性濃度を測定した（第７図）。

フラクション６と７を混合し、溶離緩衝液で正確に２［ｍｌに調整してから１０ ０μｍ分量ずつに分割し、−２０″Ｃで凍結した。これらの物質は、分析及び開 発研究用にこれらの分量で利用できるように保存した。

あることか測定された。

１００μ１分割物を解凍したのち、５０μ！のこの［”ｓｌｌ　ＶＡＣ−α溶液 を９５０μｌの不活性ＶＡＣ−α溶液（１，１，５，を参照）にピペットで加え 、完全に混合し、そしてその５０μｌを測定のためにＬＳＣカウンター（ベック マン製）中に配置した。２４．５１［Ｂｑ　（＝０．６６３＋ｎＣ１）　／　２ ．０ｍｌ全溶液。

２．１２．　比活性 濃度及び総放射能の測定から、比活性３４１．５ＭＢｑ／■＝　１１．６１ＴＢ ｑ１０ｎｏｌ　（９，２３ｍＣｉ／ｍｇ＝　３１３．８　Ｃｉ／１ｍｏｌ）を得 た。

２．２．３．　ＴＣＡＣ上析出法るタンパク結合放射能の測定１００μｌのＶＡ Ｃ−α溶液を５０μｌの３％ＢＳＡ溶液及び１５０μｌの４０％水性トリクロロ 酢酸と混合し、完全に震盪し冷蔵庫中で６０分間立てて置いた。析出物を遠心分 離によって除去した。上溝液のアリコツトをＬＳＣカウンターで測定した。

結果：９９．３％の放射能が析出物中に存した。

２、　Ｚ　４．　放射能収率 加えｔ、：、　６７．３　ＲＪＢｑ（７）うち、２４．５１ＢＱがＶＡＣ−ａ中 に認メラレタ。従ッて、放射能収率は３６．４％であった。

２．３．修飾の程度 比活性及び使用した不活性ＶＡＣ−αの量から、統計上６のうちｌのＶＡＣ−α 分子がｌ！Ｋ１元素でラベル化されていた。

Ｚｎ、同−性及び純度 ５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（勾配ゲル７→１７、非還元条件）及び続く銀染色〔オーク レイ（Ｑａｋｌｅｙ）法〕によるゲル評価法、オートラジオグラフィー及びリニ アーアナライザー（パートホールドＬ８２８２製、プローブＬＢ２８２０）の下 での検出（第８図）を使用して、使用したＶＡＣ−αとの比較によって該物質を 調べた。該物質は同一であり、２量体生成物の比率は不活性チャージのために許 容される限度である８％よりもかなり下回った。

添付図面の説明 ＶＡＣの交互する吸着及び脱着。２０％ＤＯＰＳ／８０％ＤＯＰＣＩＪン脂質二 重層上でのＶＡＣ（１μｊ７／ｍｌ）の吸着。Ｃａ”の添加（３，４，６ｒｆＭ ）は↑またはによって示されている。

第２図ニリン脂質表面上でのＶＡＣの吸着についてのリン脂質組成及びＣａ”濃 度の影響。

０１００％ＤＯＰＳ　；・２０％ＤＯＰＳ；△５％ＤＯＰＳ＋口１％ＤＯＰＳ、 １００％ＤＯＰＣ；ＤＯＰＣで全ての混合を補充した。

［ＶＡＣ］＝１μｇ／ｍｌ。

第３図　ＶＡＣの吸着に関する２価イオンの効北特定のイオンの存在下（１また は３［１１Ｍ）での２０％ＤＯＰＳ及び８０％ＤＯＰＣの二重層上でのＶＡＣ吸 着。

［ｖＡｃｌ＝Ｉｔｔｇ／ｍ１０ 第４図　リン脂質表面上でのＶＡＣのＣａ”“依存吸着についてのＺｎ”の相乗 効果。５０　μＭ　Ｚｎ”の存在下での１％ＤＯＰＳ及び９９％ＤＯＰＣ上での ＶＡＣ吸着についてのＣａ”“の効果。

［ＶＡＣ］＝　１　ｕ　ｇ／ｍｌ。

第５図二組成を変動させたリン脂質二重層上でのＶＡＣの吸着。

純粋なまたは８０％のジオしオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）が混ざっ たジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）　、カルシオリピン（ＣＬ） 及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、８０％のＤＯ ＰＣが混ざったジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ホスフ ァチジルイノシトール（Ｐ　Ｉ）及びステアリルアミン（ＳＡ）または純粋なり ＯＰＣ上でのＶＡＣ吸着。［ＶＡＣ］＝　ｌ　ｔｔ　ｇ／ｍｌ　；　［Ｃａ　” ］＝　３％ｍ。

第６図　１．３．４．６−テトラクロロ−３α−６α−ジフエニル−グリコール ’）ル（ｌ０ＤＯ−ＧＥＮ）。

表１ シリコンプレートに適用したリン脂質二重層の評価フィルム　リン脂質の量　活 　性　ＤＯＰＳバランス上の　く楕円偏光側　フラクション１４Ｃ−ＤＯＰＳ　 定器による）　測定された％　μｇ／ａｍ！　ＤＰＭ　％ ２　０．３９６　４５３　１．９ ５　０．４０９　１１３３　’４．５ ２０　０．４０１　５００６　２０ １００　０．４４２　２７１７４　９９計算した混合液をフィルムバランス上に 置いた。二重層の量を楕円偏光測定器で測定し、＋４ｃラベル化ＤＯＰＳをベッ クマン６Ｓ３８０１シンチレーシヨンカウンター（ｓ、ｄ＜２％）を使用して測 定し、自然放射能（６０ＤＰＭ）で補正した。二重層中のＤＯＰＳフラクション を式２を使用して計算した。

ＤＯＰＳの比活性は、Ｉ　Ｏ０，０００ＤＰＭ、μｇ″１であり、リン脂質（こ よって占められた面積は０．６２ｃｍ’であった。

表２ 種々の脂質表面に対する最大ＶＡＣ結合量の１／２値ＤＯＰＳ（＋００）　０． １９５＋０．０２５　０．０３６＋０．０１３ＤＯＰＳ　／　ＤＯＰＣ（２０／ ８０）　０．２２２　＋　０．０１４　０．２２　±０．０６ＤＯＰＳ　／　Ｄ ＯＰＣ（５／９５）　’　０．２２９　＋　０．００４　１．５　±０．５ＤＯ ＰＳ　／　ＤＯＰＣ（１／９９）　０．２３４　＋　０．００７　８．６　±２ ．５カルノオＩＪヒフ　／　ＤＯＰＣ（２０／８０）　０．２０９　＋　０．０ １１　０．０３９　＋　０．０２２ＤＯＰＧ／ＤＯＰＣ（２０／８０）　０．２ １２＋０．００３　０．Ｉ５５＋０．０２７ＰＩ　／　ＤＯＰＣ（２０／８０） 　０．２２］　＋　０．００５　０．４７　＋　０．０５ＤＯＰＡ　／　ＤＯＰ Ｃ（２０／８０）　０．２０７±０．００６　０．７５　＋０．２６ＤＯＰＥ　 ／　ＤＯＰＣ（２０／８０）　０．２１３±０．００３　０．８６　±０．２１ スフィンゴミｘｌｌン　／　ＤＯＰＣ（２０／８０）　０．２２５　＋　０．０ １４　７　＋　３ＤＯＰＣ（１００）　ｎ、　ｄ、　＞３０　ｍＭ１／２最大Ｖ ＡＣ結合濃度［Ｃａｌ＋］、、、に帰着するカルシウム濃度と共に特定したリン 脂質表面上の最大ＶＡＣ吸着量（ｒｍａｘ）を、少なくとも３つの異なる実験の 平均値として、対応する標準偏差と共に示した。

ｎ、ｄ、＝決定不乱 引用文献 １、コツプリアス（Ｃｏｎｆｕｒｉｕｓ、Ｐ）　＆ラバール（Ｚｗａａｌ、　Ｒ ，Ｆ、　Ａ、Ｘｌ９７７）　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　４８８、−壮。

２、コルセル（Ｃｏｒｓｅｌ、　Ｊ、　Ｗ、　）、ウィレムス（Ｗｉ　ｌ　Ｉｅ ｍｓ、　Ｇ、　ＡＬ　）、コツプ（Ｋｏｐ、　Ｊ、　Ｍ、　l、　）、 キュイバース（Ｃｕｙｐｅｒｓ、Ｐ、Ａ、）＆へルメンス（Ｈｅｒｍｅｎｓ、　 Ｗ、　Ｔｈ、　）（１９８６）　Ｊ、Ｃｏ１１ｏｉｄ　１ｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｓ ｃｉ、１１１．５４４−５５４゜３、　キュイバース、コルセル、ジャンセン（ Ｊａｎｓｓｅｎ、　Ｍ、Ｐ、）、コツプ、ヘルメンス＆ヘムカー（Ｈｅｍｋｅｒ 、Ｈ，Ｃ，）　（１９８３）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌ！、２５８．２４ ２６−２４３１゜４、マツククラッキン（ＭｃＣｒａｃｋｉｎ、　Ｆ、　Ｌ、　 ）、バッサグリア（Ｐａｓｓａｇｌｉａ、　Ｅ、　）、ストロンベルブ（Ｓｔｏ ｍｂｅｒｇ、Ｒ，Ｒ，）　＆スタインベルブ（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ、　Ｈ，Ｌ、 　）（＋９６３）　Ｊ、　Ｒｅｓ、　Ｎａｔ、　Ｂｕｒ、　５ｔａｎｄ、　５ｅ ｃｔ、　Ａ　６７．３−３７７゜５、　コツプ、キュイバース、リンドハウト化 １ｎｄｈｏｕｔ、　Ｔｈ、　）、ヘルメンス＆ヘムカー　（１９８４）　Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５９．１３９９３−１３９９８゜６、　ンエラエプ フ７−（Ｓｃｈｌａｅｐｆｅｒ、　Ｄ、　Ｄ、　）、　メールマン（Ｍｅｈｌｏ ｍｎ、　Ｔ、　）、バーゲス（Ｂｕｒｇｅｓｓ、　Ｗ、　Ｈ，）　＆／’イグラ ー（Ｈａｉｇｌｅｒ、Ｈ，Ｔ、）　（１９８７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４．６０７８−６０８２゜７、　才ブ・デン・カンブ（Ｏ ｐ　ｄｅｎ　Ｋａｒｎｐｊ、Ａ、Ｆ、）　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ 、　＋９７９．４８４７−７１゜ ８、ラバールＢｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　１９７８．５１ ５：　１６３−２０５゜９、　ジャクマンＵａｃｋｓｏｎ、　Ｃ，Ｍ、　）とネ マージン（Ｎｅｍｅｒｓｏｎ、Ｙ、）　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

１９８０．４９：　７６５−８１１゜ １０、ベバース（Ｂｅｖｅｒｓ、　Ｅ、　Ｍ、　）、フンフリアスとラバールＢ ｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ１９８３．７３６：　５７−６６ ゜ 比　ロージング（Ｒｏｓｉｎｇ、　Ｊ、　）、〜く−ス、コツプリアス、ヘムカ ー、キャン・ジエイヤン（ｃａｎ　Ｄｉｅｉ　ｊｅｎ、　Ｇ、　）、ウニイス（ Ｗｅｉ　ｓｓ、　Ｈ，Ｊ、　）とラバール、Ｂｌｏｏｄ　１９８５．６５：　１ ５５７−１５６１゜ １２、フレイカー（Ｆｒａｋｅｒ　Ｐ、　Ｊ、　）、スペック（Ｓｐｅｃｋ、　 Ｊ、　Ｃ，）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅ刀B ＋７８−１７９゜ ＦＩＧ、１ ｔ　１ｍ１ｎｌ Ｏ，０１０，１１１０１００ ＦＩＧ、３ ＦＩＧ　５ 叩和カラム フラクション ］］ 要約書 本発明は、薬剤、特に検出可能な物質でラベル化されたアネキシン及び診断のた めにそれを使用することに関する。

国際調査報告 ４―拳閤糟−−自−Ｌ１１１１’Ｙ／ｌ’Ｄｏｎｚｎｔｖｃ’＋ｗ−ｍ−ｍ　ａ ｍｍｍ　ｓ−、ＰＣＴ／ＥＰ　９０１０２２５７国際調査報告 “°°“−”“°”°”°゛°′°”°“−一“”゛パ“”°°”ｖ−ｃ＋＋“ Ｉｓ　ｎｗａ　ａ−一“−°”Σ”１７ｎ７４’ｘ°“′−マーＩｕｒＣ−−− 門−ｍＰ自＋ｔｅｌｅｌｌ１ｗＩＩｉＮＭｍｙｌｉｔ−嗜・１ｍ＋＋ｎｓ瞼ｕ＋ 電ＩＩｕ＋ｈｎｗｈｉｃｈａｎｍｓ門瞭■Pｇｖ鴨−ｒｋｐｒＩＩ−瞭−ｍｅａ ｌ１ｍａｔｍＮｌ＆

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．検出可能なマーカーを有することを特徴とするアネキシン類由来の抗凝血ポ リペプチド。
2. ２．ＶＡＣであることを特徴とする請求項１記載の抗凝血ポリペプチド。
3. ３．検出可能なマーカーとして、蛍光ラベル、好ましくはフルオレセインイソチ オシアネート；ハロゲン、テクネチウム、鉛、水銀、タリウムまたはインジウム の放射性同位元素、特に好ましくは１３１Ｉまたは１２５Ｉ；または常磁性造影 剤が使用されることを特徴とする請求項１または２記載の抗凝血ポリペプチド。
4. ４．ホスファチジルコリンからホスファチジルセリンを区別するための請求項１ 〜３のいずれか１項に記載の抗凝血ポリペプチド。
5. ５．診断薬として使用するための請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗凝血ポ リペプチド。
6. ６．血流遮断系の活性化の開始点を検出する方法であって、ａ）検出可能なラベ ルを備えたアネキシン類由来の抗凝血ポリペプチドを系の中に導入し、 ｂ）インキュベーション時間経過後に前記ポリペプチドの分布を観察することを 特徴とする方法。
7. ７．抗凝血ポリペプチドがＶＡＣであることを特徴とする請求項５記載の方法。
8. ８．放射性同位元素、好ましくは、１２５Ｉ，１２３Ｉ，１３１Ｉ，１１１Ｉｎ ，９９ｍＴｃ，２０３Ｐｂ，１９９Ｈｇまたは２０１Ｔ１のうち１つの放射性同 位元素が使用されるか、または、常磁性造影剤が使用されることを特徴とする請 求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. ９．抗凝血ポリペプチドが動脈または静脈経路で投与されることを特徴とする請 求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. １０．前記ポリペプチドの分布を、ガンマーシンチレーションカメラまたは磁気 共鳴測定法を使用して、体外で観察することを特徴とする請求項５〜９のいずれ か１項に記載の方法。
11. １１．前血栓状態を診断する方法であって、ａ）試験する血液を検出可能なマー カーを有するアネキシン類由来の抗凝血ポリペプチドと体外で混合し、 ｂ）特異的なタイプの細胞と結合したラベルを分析することを特徴とする方法。
12. １２．抗凝血ポリペプチドがＶＡＣであることを特徴とする請求項１１記載の方 法。
13. １３．検出可能なマーカーとして、蛍光基、放射性同位元素、好ましくは、１２ ５Ｉ，１２３Ｉ，１３１Ｉ，１１１Ｉｎ，９９ｍＴｃ，２０３Ｐｂ，１９９Ｈｇ または２０１Ｔ１のうち１つの放射性同位元素が使用されることを特徴とする請 求項１１または１２記載の方法。
14. １４．検出可能なラベルを有するアネキシン類由来の抗凝血ポリペプチド以外に 、更に、アジュバントを含有することを特徴とする薬剤。
15. １５．抗凝血ポリペプチドがＶＡＣであることを特徴とする請求項１４記載の薬 剤。
16. １６．アジュバントとして、生理食塩水、ツィーン８０、アルギニン及び／また はリン酸緩衝液が使用されることを特徴とする請求項１４または１５記載の薬剤 。
17. １７．更に、血漿カルシウム濃度を低下させない抗凝血剤、好ましくはへパリン が使用されることを特徴とする請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の薬剤。
18. １８．診断薬として使用するための請求項１６または１７記載の薬剤。
19. １９．抗凝血ポリペプチドの代わりに、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載 の薬剤の１を使用することを特徴とする請求項６〜１３のいずれか１項に記載の 方法。
20. ２０．ホスファチジルコリンからホスファチジルセリンを区別することができる 請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の薬剤または請求項１〜３のいずれか１ 項に記載の抗凝血ポリペプチドを含有する、前血栓状態または血流遮断系の活性 化の開始点及び／または血栓の診断学的検出のためのキット。
21. ２１．ホスファチジルコリンからホスファチジルセリンを区別するための請求項 １〜３のいずれか１項に記載の抗凝血ポリペプチドまたは請求項１４〜１７のい ずれか１項に記載の薬剤の使用。
22. ２２．前血栓状態または血流遮断系の障害の開始点または血栓の診断のための請 求項１〜３のいずれか１項に記載の抗凝血ポリペプチドまたは請求項１４〜１７ のいずれか１項に記載の薬剤の使用。