JPH05502946A - ハイドロキシアパタイトへの吸着クロマトグラフィーによる初乳の処理方法、得られた初乳の活性フラクション、および活性フラクションを含む細胞培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 られた初乳の活性フラクション、および活性フラクションを含む細胞培地技術分 野 本発明は、初乳の処理、特に増殖因子に富みプロテアーゼのない初乳のフラクシ ョンを得ることに関する。特に処理法の他に処理によって得られる初乳のフラク ションに関する。更に本発明は増殖因子に富み、プロテアーゼが少ない初乳フラ クション、いわゆる活性フラクションおよびその培養培地での使用に関する。

先行技術 細胞培養の分野では、血清は細胞増殖促進に最もよく使用される添加剤である。

この生物学的液体は組織の細胞の栄養、増殖、生育に必要な因子を含んでいる。

その活性は実はよく知られておらずその成分は一つ一つ非常に異なっている。更 に、それは高価な生成物であり、供給は変動しがちである。従って、目的は完全 に定義された細胞培養培地の発展を促進出来る、血清の代替物を見い出すことで ある。

血清を乳のフラクションまたはメウンの乳糖フラクションのような乳成分で代替 することは既に提案されている。例えば、ＦＲ−Ａ−２５８６６９９号公報では 、乳フラクションは少なくとも２７０００の分子量を持ち、超遠心分離で除去可 能なタイプの不溶性脂質を含まない成分から成っている。そのようなフラクショ ンは乳の超遠心分離と他の分離法によって可溶性タンパク質を含んだ透明な労相 を得、これを約５０〜２７０００ダルトンの開口のある膜で限外濾過させて得る ことができる。

乳製品の中で、初乳すなわち誕生後数日間は乳腺に貯っている液体を血清の代替 にすることか提案されている。ＵＳ−Ａ−４４４０８６０号公報では、特に活性 増殖因子として分子量２００００以下で等電点が４．１−４．　８の初乳のフラ クションが述べられている。該フラクションは脱脂操作後、初乳をＰＨ４，３の 酢酸で２時間接触させ、遠心分離で沈澱を除去し、等電点て精製し、ゲルで濾過 し、好ましくは電気泳動て濃縮される。

上記方法は、分子量に基つく成分選別に適用できる。

別法は初乳の主要な増殖因子を分離させる方法である。それらはＹｕｅｎ　Ｓｈ ｉｎｇ。

帽ｃｂａｅｌ　Ｋｌａｇ＋ｂ＋ｕｍ著の雑誌（分子内分泌学８７１０３３５）の 中の「牛の初乳がら得らレル増殖因子の精製及び特色」と、Ｙｕｅｎ　５ｈｉｎ 、　５ｕｕｎ　Ｄｍｓｉａｎ、　Ｍｉｃｈａｅｌにｌａｇ山ｕｍ著の雑誌（酵素 学方法１９８７年１４６巻ＰＰ４２〜４８）の中の「乳がら得られるポ１パプチ ト増殖因子の精製」に記載されている。これらの著者らによるとメウシの初乳の 場合、主要な増殖因子は分子量約３００００のＢＣＧＦ　（牛初乳増殖因子）で あり、ヒトの初乳の場合、分子量約２００００のＰＤＧＦ　（ヒト血小板由来増 殖因子）である。

メウシの初乳の主要増殖因子を分離する方法には一連の手順がある。すなわち脱 脂、酸処理と沸騰による沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、等電、点電気泳 動クロマトグラフィーあるいは別の切り濾過、イオン交換クロマトグラフィー、 等電点電気泳動クロマトグラフィーである。この手順の後、双方ともＥ（ＰＬＣ 逆相分離が続く。前記方法によれば、得られる増殖因子の収率は約１％であり、 各種の手順中に最初の初乳中の増殖因子の９９％が失活したことになる。

発明の要約 本出願の目的は前記の方法でめられるものと異なる。出願人の第一の目的は、主 要な増殖因子を特に精製することなしに、増殖因子に富み、さらにはプ。テアー ゼの少ない初乳フラクションを試み、得ることである。

出願人は、ペプチドを加水分解する酵素であるプロテアーゼが、増殖因子に富ん だ初乳フラクションの良い状態での保存をやがて妨げ、このことが該フラクショ ンの活性を徐々に減少させる原因となることを発見した。

該目的は、本発明によって達成される。初乳処理の該方法として、よく知られて いるのは、陽イオン交換クロマトグラフィ一工程である。本発明によれば、陽イ オン交換体からの溶出によってシフトされた初乳の一部は、ハイドロキシアパタ イトの吸着クロマトグラフィーに供せられ、ハイゾロキンアパタイト上に保持さ れたそのフラクションは、溶出によって回収される。

ハイドロキシアパタイトは結晶化した燐酸第三カルシウムであり、それがタンパ ク質を分別するための吸着剤として使用されることは公知である。

本発明の価値はハイドロキシアパタイトの使用は増殖因子の増加に寄与するたけ てなく、結果的に増加したフラクションからプロテアーゼの除去を可能にしたこ とを実験し証明したことである。

さらに特にハイド０キンアパタイトに捕捉されたフラクションは最大５００ｍＭ の濃度の燐酸塩緩衝液による洗浄によって回収される。

例えば、その方法は、約ＰＨ６，８、最大濃度５０ｍＭの燐酸塩緩衝液でハイド ロキンアパタイトの第１回洗浄、続いて約ＰＨ６，８、濃度１００ｍＭの燐酸塩 緩衝液で２回目の洗浄をすることを含む。２回目の洗浄で増殖因子に富み、プロ テアーゼか少ない初乳フラクションが得られる。好ましくは該フラクションは脱 塩、濃縮そして凍結乾燥あるいは微粒化により凍結または乾燥される。

好ましいのは、スルフ中ン酸基を持つ陽イオン交換体、最大濃度０．１Ｍの酢酸 ソーダ溶液による交換体の第１回洗浄後の約０．５Ｍの酢酸ソーダ溶液による交 換体の洗浄によって得られた、該交換体からシフトされた初乳の一部である。

好ましいのは、陽イオン交換クロマトグラフィーの前に行われる唯一の操作は初 乳の脂肪含量を最大２ｇ／’［にする脱脂操作である。

本発明の好適実施態様は次の一連の操作が初乳に実施されることである。

ａ、最大２ｇ／ｌの脂肪含量にする脱脂ｂ　スルホン酸基を持つ交換体上を脱脂 された初乳が通液Ｃ４最大０．１Ｍの酢酸ソーダ溶液で交換体の第１回の洗浄ｄ 、０．　５Ｍの酢酸ソーダ溶液で交換体の２回目の洗浄ｅ　約１０ｍＭに平衡さ せたハイドロキシアパタイト上を２回目の洗浄相当部分（ｄ）が通液、脱塩およ び濃縮 ｆ、約ｐＨ６，８、最大５０ｍＭの燐酸塩緩衝液でハイドロキシアパタイトの第 １回の洗浄 ｇ、約ｐＨ６，訳　１００ｍＭの燐酸塩緩衝液でハイドロキンアパタイトの２回 目の洗浄 り、２回目の洗浄相当物（ｇ）の脱塩、濃縮および凍結または乾燥生成する初乳 フラクション、いわゆる活性フラクションは最初の初乳に含まれる全増殖因子の ５０％以上を含み、プロテアーゼを実質的に含まない。

本発明の他の目的は細胞増殖を促進する添加剤である数種の活性フラクションを 含む細胞培養培地を保護することである。関係する細胞型は真核生物細胞の中の 繊維芽細胞、ハイブリドーマ、上皮様細胞、内皮細胞、肝細胞、リンパ球、マク ロファージ、脂肪細胞、造血細胞、順位細胞、心臓細胞、神経細胞、筋肉細胞、 皮膚細胞、表皮ケラチン細胞、メラノサイト、軟骨細胞、昆虫細胞である。

特に好ましい細胞培養培地は牛胎児血清とある活性フラクションを含むものであ る。活性フラクションと血清の相互作用が、同等の細胞増殖に使用される血清の 使用量をかなり減らすことを可能にする。活性フラクションは医薬や化粧品のよ うな他の分野でも使用される。

発明実施のための最適態様 本発明の他の便宜と特徴はハイドロキシアパタイトへの初乳の処理例を述へた以 後の記述から、より簡単に理解できるであろう。

初乳なる語は、出産後７日以内に得られた泌乳と血清構成物の混合物を意味する 。それはメウシあるいは他の哺乳類から得られる。

メウシの初乳の場合は、脂質のほとんどを除去するために７９０　ｒｅｖ／ｍｉ ｎで遠心分離して脱脂する。２ｇ／ｌ以下の脂質含有量の脱脂された初乳１リツ トルを前処理セずニ、ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ社が販売元の５Ｐ−３ＥＰＨＡＤＥＸ Ｃ−５０のスルホン酸基を持って、陽イオン交換樹脂１５ｇに接触させる。ＰＨ は６゜３゜接触は少なくとも４時間、４℃で撹拌ｔながら実施される。

器内に残った脱脂された初乳部分は、スルフォン酸基を持つ樹脂によって捕捉さ れなかった全成分を含んでいる。該初乳部は実質的に増殖因子を含まないが、そ れにも関わらず、他の成分、すなわち初乳の免疫グロブロリン、糖、酵素やプロ テオースペプトンに富んでいるので有用である。該初乳はそのままあるいは該成 分の分離後に利用される。

器を除去した後、樹脂はまず０．１Ｍ酢酸ソーダ溶液で洗浄される。この最初の 洗浄の目的は樹脂表面から、実際にスルホン酸基によるイオン交換で捕捉されな い成分を除去することである。

次に、２回目の樹脂の洗浄を０．５Ｍ酢酸ソーダ溶液で行う。この洗浄の意味は 、樹脂のスルホン酸基によるイオン交換で捕捉されなかった初乳成分の一部をシ フトすることである。このようなシフトは、スルフォン酸基に対する各成分の親 和性、交換動力学、立体効果といったいろいろなパラメーターに依存する。

最後に、３回目の樹脂の洗浄を１．０Ｍ酢酸ソーダ溶液で行う。

０．５Ｍおよび１．０Ｍの２つの酢酸ソーダ洗浄溶液はそれぞれ限外濾過、透析 、電解透析または分子スクリーニングで脱塩さね、それから分子量５０００を区 分出来る限外濾過によって濃縮される。

最初の脱脂された初乳と０．５Ｍ洗浄および１．０洗浄による２つのフラクショ ンとの比較分析によって、次の事が明らかになった。２つのフラクションには、 脱脂された初乳に含まれる増殖因子の８０％以上が含まね、もう一方では０．　 ５Ｍ洗浄のフラクションには脱脂された初乳に含まれる増殖因子の７３．２％が 含まれる。該フラクションにはまたラクトペルオキシダーゼ、ラクトトランスフ ェリン、リゾチームやプロテアーゼといった他の成分が含まれている。

下記の表１は脱脂された初乳（Ａ）と１５Ｍ溶出フラクションとの比較結果を示 している。

表１ （Ａ）脱脂化された初乳　（Ｂ）０．５Ｍ溶出フラクション全タンパク質ｍ　ｇ 　！３０．０００　１．６２０全活量　Ｕ　１３０．０００　９５．２５６比活 量　Ｕ／ｍｇ１５８．６ 活量収率　％　ｔｏｏ　７３．２ タンパク含量はＰＥＴＥＲ３ＯＮによって改善されたＬＯＷＲＹ法で分析された 。増殖因子単位はＵて分裂促進活量といわれるが、最大結合量の半分に相当する トリエチル化メチルチミジンとの結合に必要なタンパク質の量に等しい。

前出のフラクション（Ｂ）は脱塩され濃縮されて、ｐＨ６，８で１．ＯｍＭの燐 酸緩衝液で予め調製されたハイドロキノアパタイトカラムに注入される。ゲル状 のハイドロキシアパタイトの量はフラクション中に含まれるタンパク質の量の関 数として決められるが、ハイドロキシアパタイトゲル１ミリリツター当りぜいぜ い４０ｍｇである。

そして、ハイドロキシアパタイトカラムはｐＨ６，８の３種の燐酸緩衝液で徐々 に高濃度にして溶出される。それぞれ、最初は５０ｍＭ、２回目ｉ；！１００ｍ Ｍそして３回目は５００ｍＭ０ 得られた各フラクションは脱塩さべ濃縮され、凍結される。５０ｍＭと５００ｍ Ｍフラクションは見かけ上プロテアーゼ全量含んでいる。１００ｍＭフラクショ ンのみ実質的にプロテアーゼを含まない。

第２のフラクションは１００ｍＭ溶液での溶出に相当するが、活性フラクション と呼ばれていて、増殖因子に富んだ唯一の物である。

下記の表２は、前出の活性フラクション（Ｃ）に関する情報を合わせて表１を補 足したものである。

表２ （Ａ）厖酊ヒさ　（Ｂ）０．５Ｍイオ　（Ｃ）　領　１Ｍハイれた初乳　ン交換 溶出　ドロタルサイ 溶出 全タンパク質ｍ　ｇ　１３０．０００　１．６２０　６４８全活量　Ｕ　１３０ ．０００　９５．２５６　７６．２０５比活量　Ｕ／ｍｇ　ｌ　５８．８　１１ ７．６活量収率　％　１００　１３．２　５９脱脂した初乳（Ａ）に比較して、 活性フラクション（Ｃ）は死活量が極めて大きい点で異なっている。

比較は活性フラクションと、細胞増殖の促進剤として最も広く用いられている添 加剤であるメウシの胎児の血清との間で行われた。この趣旨で、トリチル化チミ ジンの結合テストが、ＣＣＬ３９繊維芽細胞鎖に対する各々の分裂促進活性を知 るために使用された。この比較から活性フラクション（１１７，６Ｕ／タンパク 質１ｍｇ）の死活量は、牛胎児の血清（１５Ｕ／タンパク質１ｍｇ）のそれより 明らかに高いことから明らかである。この事は添加剤の導入とともに導入された タンパク質をしばしば培養培地から除（必要があり限り、活性フラクションにと って真の利点である。それは活性フラクションの場合には除去すべきタンパク質 の量が少ないからである。

活性フラクションは細胞培養培地、例えば２．２ｇ／１重炭酸ソーダ、１ｖｏｌ ％グルタミン酸、０．　４ｖｏｌ　％ペニシリン、０４％ストレプトマイシン、 ０゜５％菌類を添加したＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅの最小培地）中のメウンの血清 との代替または組合せに有用である。

活性フラクションはメウシの胎児血清を完全にするＣＣＬ３９繊維芽細胞培地の 増殖添加剤として用いられた。しかしながら最初にフィブロネクチンで処理する か否かにかかわらず、培養プレートには１枚当り１６万の細胞、ある量の活性フ ラクションを含んでいる２ｍｌの培地の割合で植え付けられた。例えば繊維芽細 胞培養培地中に１％のメウンの胎児の血清と１％の活性フラクション（１，ｇ／ タンパク質１１）を添加させると、同じ培地に約９％のメウンの胎児の血清を添 加して得られるのに相当する細胞増殖を可能にする。

本発明は限定無しの実施例に述べられた実施態様に限定されるものではなく、全 ての異なる態様をも包含する。特にクレームされた処理条件は記述されたものに 限定されない。スルホン酸基以外の官能基を持つ交換体や樹脂ではない他のタイ プの陽イオン交換体も使用することができる。陽イオン交換体上に捕捉された初 乳部分のシフトは、該交換体の再生に係わるあらゆる常法で可能であり、ケース バイケースで適当な操作が決定される。

要約書 好ましくは脱脂された初乳をスルホン酸基を有する樹脂のような陽イオン交換体 と接触させ、溶出によってシフトした交換体部分をハイドロキシアパタイトでの 吸着クロマトグラフィーに供し、ハイドロキンアパタイトに捕捉されたフラクシ ョンを最大５００ｒｎＭ、好ましくは約１００ｍＭ濃度の燐酸塩緩衝液で洗浄し 、溶出することによって活性クラクションを回収することからなる初乳を処理す る方法。

捕捉されたフラクションは活性フラクションといわれ、最初の初乳の増殖因子の 半分以上を含有し、実質的にプロテアーゼを含まない。

それは細胞培養培地の添加剤として、特にメウシの胎児の血清の代替として使用 される。

国際調査報告 国際調査報告 ス国６２４６０　デイヴイヨン、リュ　ボデ口　８ｕ国５９７００　マルコ　ア ン　バロエル、リュ　ドウ　ラ　ビス国６０１５０　ヴイレル　スユール　クー ダン、アレ　ドウドメーヌ　ドウ　リムデルリュー　３３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　陽イオン交換クロマトグラフィーの少なくとも１回の操作からなる初乳の処 理方法において、陽イオン交換体からの溶出によってシフトされた初乳の一部を 、ハイドロキシアパタイトによる吸着クロマトグラフィーに供し、ハイドロキシ アパタイトに捕捉されたフラクションが溶出により回収されることを特徴とする 少くとも陽イオン交換クロマトグラフィー操作を含む初乳の処理方法。 ２　ハイドロキシアパタイトに捕捉されたフラクションが、最大濃度５００ｍＭ の燐酸塩緩衝液で洗浄回収されることを特徴とする請求項１記載の方法。 ３　最大濃度５００ｍＭの燐酸塩緩衝液によるハイドロキシアパタイトの第１回 洗浄に引き続く、約１００ｍＭ濃度の燐酸塩緩衝液による第２回洗浄により回収 された、増殖因子に富み、且つプロテアーゼが少ない活性フラクションに相当す ることを特徴とする請求項２記載の方法。 ４　活性フラクションが脱塩され、濃縮され、凍結あるいは乾燥されることを特 徴とする請求項３に記載された方法。 ５　陽イオン交換体がスルホン酸基を有し、該交換体からシフトされた初乳の一 部が最大０．１Ｍの酢酸ソーダ溶液による交換体の第１回洗浄後、約０．５Ｍの 酢酸ソーダ溶液による交換体の洗浄によって得られることを特徴とする請求項１ 乃至４のいずれかの方法。 ６　陽イオン交換クロマトグラフィーに先だって実行される唯一の操作が初乳の 脂肪含量を最大２ｇ／１にする脱脂操作であることを特徴とする請求項１の方法 。 ７　下記連続操作が初乳に対し実行されることを特徴とする請求項６の方法。 ａ．脂肪含量を最大２ｇ／１にする脱脂ｂ．脱脂された初乳をスルホン酸基を持 つ交換体に通液ｃ．最大濃度０．１Ｍの酢酸ソーダ溶液による交換体の第１回洗 浄ｄ．約０．５Ｍ濃度の酢酸ソーダ溶液による交換体の第２回洗浄ｅ．約１０ｍ Ｍの燐酸塩緩衝液に平衡させたハイドロキシアパタイト上を２回目の洗浄相当部 分（ｄ）が通液、脱塩および濃縮ｆ．ｐＨ約６．８、最大５０ｍＭ濃度の燐酸塩 緩衝液によるハイドロキシアパタイトの第１回の洗浄 ｇ．ｐＨ約６．８、約５０ｍＭ濃度の燐酸塩緩衝液によるハイドロキシアパタイ トの第２回洗浄 ｈ．２回目の洗浄（ｇ）で生成した部分と活性フラクションの脱塩、濃縮と凍結 あるいは乾繰 ８　最初の初乳の増殖因子の５０％以上を含み、プロテアーゼを事実上含まない ことを特徴とする請求項３または７のいづれか１つの方法によって得られた初乳 の活性フラクション ９　請求項８のある活性フラクションを含み、それが細胞増殖を促進する添加剤 となることを特徴とする細胞培養培地。 １０　真核生物細胞の中の繊維芽細胞、ハイブリドーマ、上皮様細胞、内皮細胞 、肝細胞、リンパ球、マクロファージ、脂肪細胞、造血細胞、顆粒細胞、心臓細 胞、神経細胞、筋肉細胞、皮膚細胞、表皮ケラチン細胞、メラノサイト、軟骨細 胞、昆虫細胞の培養に関する請求項９記載の培地。