JPH087201B2 - ハイドロキシアパタイトへの吸着クロマトグラフィーによる初乳の処理方法、得られた初乳の活性フラクション、および活性フラクションを含む細胞培地 - Google Patents
ハイドロキシアパタイトへの吸着クロマトグラフィーによる初乳の処理方法、得られた初乳の活性フラクション、および活性フラクションを含む細胞培地Info
- Publication number
- JPH087201B2 JPH087201B2 JP51111391A JP51111391A JPH087201B2 JP H087201 B2 JPH087201 B2 JP H087201B2 JP 51111391 A JP51111391 A JP 51111391A JP 51111391 A JP51111391 A JP 51111391A JP H087201 B2 JPH087201 B2 JP H087201B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- colostrum
- hydroxyapatite
- cells
- exchanger
- active fraction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; PREPARATION THEREOF
- A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
- A23C9/20—Dietetic milk products not covered by groups A23C9/12 - A23C9/18
- A23C9/206—Colostrum; Human milk
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; PREPARATION THEREOF
- A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
- A23C9/14—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations in which the chemical composition of the milk is modified by non-chemical treatment
- A23C9/146—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations in which the chemical composition of the milk is modified by non-chemical treatment by ion-exchange
- A23C9/1465—Chromatographic separation of protein or lactose fraction; Adsorption of protein or lactose fraction followed by elution
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
- C12N5/0037—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/70—Undefined extracts
- C12N2500/80—Undefined extracts from animals
- C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Position Input By Displaying (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、初乳の処理、特に増殖因子に富みプロテア
ーゼのない初乳のフラクションを得ることに関する。特
に処理法の他に処理によって得られる初乳のフラクショ
ンに関する。更に本発明は増殖因子に富み、プロテアー
ゼが少ない初乳フラクション、いわゆる活性フラクショ
ンおよびその培養培地での使用に関する。
ーゼのない初乳のフラクションを得ることに関する。特
に処理法の他に処理によって得られる初乳のフラクショ
ンに関する。更に本発明は増殖因子に富み、プロテアー
ゼが少ない初乳フラクション、いわゆる活性フラクショ
ンおよびその培養培地での使用に関する。
先行技術 細胞培養の分野では、血清は細胞増殖促進に最もよく
使用される添加剤である。この生物学的液体は組織の細
胞の栄養、増殖、生育に必要な因子を含んでいる。その
活性は実はよく知られておらずその成分は一つ一つ非常
に異なっている。更に、それは高価な生成物であり、供
給は変動しがちである。従って、目的は完全に定義され
た細胞培養培地の発展を促進出来る、血清の代替物を見
い出すことである。
使用される添加剤である。この生物学的液体は組織の細
胞の栄養、増殖、生育に必要な因子を含んでいる。その
活性は実はよく知られておらずその成分は一つ一つ非常
に異なっている。更に、それは高価な生成物であり、供
給は変動しがちである。従って、目的は完全に定義され
た細胞培養培地の発展を促進出来る、血清の代替物を見
い出すことである。
血清を乳のフラクションまたはメウシの乳糖フラクシ
ョンのような乳成分で代替することは既に提案されてい
る。例えば、FR−Ａ−2586699号公報では、乳フラクシ
ョンは少なくとも27000の分子量を持ち、超遠心分離で
除去可能なタイプの不溶性脂質を含まない成分から成つ
ている。そのようなフラクションは乳の超遠心分離と他
の分離法によって可溶性タンパク質を含んだ透明な乳相
を得、これを約50〜27000ダルトンの開口のある膜で限
外濾過させて得ることができる。
ョンのような乳成分で代替することは既に提案されてい
る。例えば、FR−Ａ−2586699号公報では、乳フラクシ
ョンは少なくとも27000の分子量を持ち、超遠心分離で
除去可能なタイプの不溶性脂質を含まない成分から成つ
ている。そのようなフラクションは乳の超遠心分離と他
の分離法によって可溶性タンパク質を含んだ透明な乳相
を得、これを約50〜27000ダルトンの開口のある膜で限
外濾過させて得ることができる。
乳製品の中で、初乳すなわち誕生後数日間は乳腺に貯
っている液体を血清の代替にすることが提案されてい
る。US−Ａ−4440860号公報では、特に活性増殖因子と
して分子量20000以下で等電点が4.4−4.8の初乳のフラ
クションが述べられている。該フラクションは脱脂操作
後、初乳をPH4.3の酢酸で２時間接触させ、遠心分離で
沈澱を除去し、等電点で精製し、ゲルで濾過し、好まし
くは電気泳動で濃縮される。
っている液体を血清の代替にすることが提案されてい
る。US−Ａ−4440860号公報では、特に活性増殖因子と
して分子量20000以下で等電点が4.4−4.8の初乳のフラ
クションが述べられている。該フラクションは脱脂操作
後、初乳をPH4.3の酢酸で２時間接触させ、遠心分離で
沈澱を除去し、等電点で精製し、ゲルで濾過し、好まし
くは電気泳動で濃縮される。
上記方法は、分子量に基づく成分選別に適用できる。
別法は初乳の主要な増殖因子を分離させる方法であ
る。それらはYuen Shing、Michael Klagsbrum著の雑誌
（分子内分泌学87/0335）の中の「牛の初乳から得られ
る増殖因子の精製及び特色」と、Yuen Shing、Susan De
vision、Michael Klagsbrum著の雑誌（酵素学方法1987
年146巻PP42〜48）の中の「乳から得られるポリペプチ
ド増殖因子の精製」に記載されている。これらの著者に
よるとメウシの初乳の場合、主要な増殖因子は分子量約
30000のBCGF（牛初乳増殖因子）であり、ヒトの初乳の
場合、分子量約20000のPDGF（ヒト血小板由来増殖因
子）である。
る。それらはYuen Shing、Michael Klagsbrum著の雑誌
（分子内分泌学87/0335）の中の「牛の初乳から得られ
る増殖因子の精製及び特色」と、Yuen Shing、Susan De
vision、Michael Klagsbrum著の雑誌（酵素学方法1987
年146巻PP42〜48）の中の「乳から得られるポリペプチ
ド増殖因子の精製」に記載されている。これらの著者に
よるとメウシの初乳の場合、主要な増殖因子は分子量約
30000のBCGF（牛初乳増殖因子）であり、ヒトの初乳の
場合、分子量約20000のPDGF（ヒト血小板由来増殖因
子）である。
メウシの初乳の主要増殖因子を分離する方法には一連
の手順がある。すなわち脱脂、酸処理と沸騰による沈
澱、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動ク
ロマトグラフィーあるいは別の脱脂、濾過、イオン交換
クロマトグラフィー、等電点電気泳動クロマトグラフィ
ーである。この手順の後、双方ともHPLC逆相分離が続
く。前記方法によれば、得られる増殖因子の収率は約１
％であり、各種の手順中に最初の初乳中の増殖因子の99
％が失活したことになる。
の手順がある。すなわち脱脂、酸処理と沸騰による沈
澱、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動ク
ロマトグラフィーあるいは別の脱脂、濾過、イオン交換
クロマトグラフィー、等電点電気泳動クロマトグラフィ
ーである。この手順の後、双方ともHPLC逆相分離が続
く。前記方法によれば、得られる増殖因子の収率は約１
％であり、各種の手順中に最初の初乳中の増殖因子の99
％が失活したことになる。
発明の要約 本出願の目的は前記の方法で求められるものと異な
る。出願人の第一の目的は、主要な増殖因子を特に精製
することなしに、増殖因子に富み、さらにはプロテアー
ゼの少ない初乳フラクションを試み、得ることである。
る。出願人の第一の目的は、主要な増殖因子を特に精製
することなしに、増殖因子に富み、さらにはプロテアー
ゼの少ない初乳フラクションを試み、得ることである。
出願人は、ペプチドを加水分解する酵素であるプロテ
アーゼが、増殖因子に富んだ初乳フラクションの良い状
態での保存をやがて妨げ、このことが該フラクションの
活性を徐々に減少させる原因となることを発見した。
アーゼが、増殖因子に富んだ初乳フラクションの良い状
態での保存をやがて妨げ、このことが該フラクションの
活性を徐々に減少させる原因となることを発見した。
該目的は、本発明によって達成される。初乳処理の該
方法として、よく知られているのは、陽イオン交換クロ
マトグラフィー工程である。本発明によれば、陽イオン
交換体からの溶出によってシフトされた初乳の一部は、
ハイドロキシアパタイトの吸着クロマトグラフィーに供
せられ、ハイデロキシアパタイト上に保持されたそのフ
ラクションは、溶出によって回収される。
方法として、よく知られているのは、陽イオン交換クロ
マトグラフィー工程である。本発明によれば、陽イオン
交換体からの溶出によってシフトされた初乳の一部は、
ハイドロキシアパタイトの吸着クロマトグラフィーに供
せられ、ハイデロキシアパタイト上に保持されたそのフ
ラクションは、溶出によって回収される。
ハイドロキシアパタイトは結晶化した燐酸第三カルシ
ウムであり、それがタンパク質を分別するための吸着剤
として使用されることは公知である。
ウムであり、それがタンパク質を分別するための吸着剤
として使用されることは公知である。
本発明の価値はハイドロキシアパタイトの使用は増殖
因子の増加に寄与するだけでなく、結果的に増加したフ
ラクションからプロテアーゼの除去を可能にしたことを
実験し証明したことである。
因子の増加に寄与するだけでなく、結果的に増加したフ
ラクションからプロテアーゼの除去を可能にしたことを
実験し証明したことである。
さらに特にハイドロキシアパタイトに捕捉されたフラ
クションは最大500mMの濃度の燐酸塩緩衝液による洗浄
によって回収される。
クションは最大500mMの濃度の燐酸塩緩衝液による洗浄
によって回収される。
例えば、その方法は、約PH6.8、最大濃度50mMの燐酸
塩緩衝液でハイドロキシアパタイトの第１回洗浄、続い
て約PH6.8、濃度100mMの燐酸塩緩衝液で２回目の洗浄を
することを含む。２回目の洗浄で増殖因子に富み、プロ
テアーゼが少ない初乳フラクションが得られる。好まし
くは該フラクションは脱塩、濃縮そして凍結乾燥あるい
は微粒化により凍結または乾燥される。
塩緩衝液でハイドロキシアパタイトの第１回洗浄、続い
て約PH6.8、濃度100mMの燐酸塩緩衝液で２回目の洗浄を
することを含む。２回目の洗浄で増殖因子に富み、プロ
テアーゼが少ない初乳フラクションが得られる。好まし
くは該フラクションは脱塩、濃縮そして凍結乾燥あるい
は微粒化により凍結または乾燥される。
好ましいのは、スルフォン酸基を持つ陽イオン交換
体、最大濃度0.1Mの酢酸ソーダ溶液による交換体の第１
回洗浄後の約0.5Mの酢酸ソーダ溶液による交換体の洗浄
によって得られた、該交換体からシフトされた初乳の一
部である。
体、最大濃度0.1Mの酢酸ソーダ溶液による交換体の第１
回洗浄後の約0.5Mの酢酸ソーダ溶液による交換体の洗浄
によって得られた、該交換体からシフトされた初乳の一
部である。
好ましいのは、陽イオン交換クロマトグラフィーの前
に行われる唯一の操作は初乳の脂肪含量を最大2g/に
する脱脂操作である。
に行われる唯一の操作は初乳の脂肪含量を最大2g/に
する脱脂操作である。
本発明の好適実施態様は次の一連の操作が初乳に実施
されることである。
されることである。
a.最大2g/の脂肪含量にする脱脂 b.スルホン酸基を持つ交換体上を脱脂された初乳が通液 c.最大0.1Mの酢酸ソーダ溶液で交換体の第１回の洗浄 d.0.5Mの酢酸ソーダ溶液で交換体の２回目の洗浄 e.約10mMに平衡させたハイドロキシアパタイト上を２回
目の洗浄相当部分（ｄ）が通液、脱塩および濃縮 f.約pH6.8、最大50mMの燐酸塩緩衝液でハイドロキシア
パタイトの第１回の洗浄 g.約pH6.8、100mMの燐酸塩緩衝液でハイドロキシアパタ
イトの２回目の洗浄 h.2回目の洗浄相当物（ｇ）の脱塩、濃縮および凍結ま
たは乾燥 生成する初乳フラクション、いわゆる活性フラクショ
ンは最初の初乳に含まれる全増殖因子の50％以上を含
み、プロテアーゼを実質的に含まない。
目の洗浄相当部分（ｄ）が通液、脱塩および濃縮 f.約pH6.8、最大50mMの燐酸塩緩衝液でハイドロキシア
パタイトの第１回の洗浄 g.約pH6.8、100mMの燐酸塩緩衝液でハイドロキシアパタ
イトの２回目の洗浄 h.2回目の洗浄相当物（ｇ）の脱塩、濃縮および凍結ま
たは乾燥 生成する初乳フラクション、いわゆる活性フラクショ
ンは最初の初乳に含まれる全増殖因子の50％以上を含
み、プロテアーゼを実質的に含まない。
本発明の他の目的は細胞増殖を促進する添加剤である
数種の活性フラクションを含む細胞培養培地を保護する
ことである。関係する細胞型は真核生物細胞の中の繊維
芽細胞、ハイブリドーマ、上皮様細胞、内皮細胞、肝細
胞、リンパ球、マクロファージ、脂肪細胞、造血細胞、
顆粒細胞、心臓細胞、神経細胞、筋肉細胞、皮膚細胞、
表皮ケラチン細胞、メラノサイト、軟骨細胞、昆虫細胞
である。
数種の活性フラクションを含む細胞培養培地を保護する
ことである。関係する細胞型は真核生物細胞の中の繊維
芽細胞、ハイブリドーマ、上皮様細胞、内皮細胞、肝細
胞、リンパ球、マクロファージ、脂肪細胞、造血細胞、
顆粒細胞、心臓細胞、神経細胞、筋肉細胞、皮膚細胞、
表皮ケラチン細胞、メラノサイト、軟骨細胞、昆虫細胞
である。
特に好ましい細胞培養培地は牛胎児血清とある活性フ
ラクションを含むものである。活性フラクションと血清
の相互作用が、同等の細胞増殖に使用される血清の使用
量をかなり減らすことを可能にする。活性フラクション
は医薬や化粧品のような他の分野でも使用される。
ラクションを含むものである。活性フラクションと血清
の相互作用が、同等の細胞増殖に使用される血清の使用
量をかなり減らすことを可能にする。活性フラクション
は医薬や化粧品のような他の分野でも使用される。
発明実施のための最適態様 本発明の他の便宜と特徴はハイドロキシアパタイトへ
の初乳の処理例を述べた以後の記述から、より簡単に理
解できるであろう。
の初乳の処理例を述べた以後の記述から、より簡単に理
解できるであろう。
初乳なる語は、出産後７日以内に得られた泌乳と血清
構成物の混合物を意味する。それはメウシあるいは他の
哺乳類から得られる。
構成物の混合物を意味する。それはメウシあるいは他の
哺乳類から得られる。
メウシの初乳の場合は、脂質のほとんどを除去するた
めに790rev/minで遠心分離して脱脂する。2g/以下の
脂質含有量の脱脂された初乳１リットルを前処理せず
に、PHARMACIA社が販売元のSP−SEPHADEXC−50のスルホ
ン酸基を持って、陽イオン交換樹脂15gに接触させる。P
Hは6.3。接触は少なくとも４時間、４℃で攪拌しながら
実施される。
めに790rev/minで遠心分離して脱脂する。2g/以下の
脂質含有量の脱脂された初乳１リットルを前処理せず
に、PHARMACIA社が販売元のSP−SEPHADEXC−50のスルホ
ン酸基を持って、陽イオン交換樹脂15gに接触させる。P
Hは6.3。接触は少なくとも４時間、４℃で攪拌しながら
実施される。
器内に残った脱脂された初乳部分は、スルフォン酸基
を持つ樹脂によって捕捉されなかった全成分を含んでい
る。該初乳部は実質的に増殖因子を含まないが、それに
も関わらず、他の成分、すなわち初乳の免疫グロブリ
ン、糖、酵素やプロテオースペプトンに富んでいるので
有用である。該初乳はそのままあるいは該成分の分離後
に利用される。
を持つ樹脂によって捕捉されなかった全成分を含んでい
る。該初乳部は実質的に増殖因子を含まないが、それに
も関わらず、他の成分、すなわち初乳の免疫グロブリ
ン、糖、酵素やプロテオースペプトンに富んでいるので
有用である。該初乳はそのままあるいは該成分の分離後
に利用される。
器を除去した後、樹脂はまず0.1M酢酸ソーダ溶液で洗
浄される。この最初の洗浄の目的は樹脂表面から、実際
にスルホン酸基によるイオン交換で捕捉されない成分を
除去することである。
浄される。この最初の洗浄の目的は樹脂表面から、実際
にスルホン酸基によるイオン交換で捕捉されない成分を
除去することである。
次に、２回目の樹脂の洗浄を0.5M酢酸ソーダ溶液で行
う。この洗浄の意味は、樹脂のスルホン酸基によるイオ
ン交換で捕捉されなかった初乳成分の一部をシフトする
ことである。このようなシフトは、スルフォン酸基に対
する各成分の親和剤、交換動力学、立体効果といったい
ろいろなパラメーターに依存する。
う。この洗浄の意味は、樹脂のスルホン酸基によるイオ
ン交換で捕捉されなかった初乳成分の一部をシフトする
ことである。このようなシフトは、スルフォン酸基に対
する各成分の親和剤、交換動力学、立体効果といったい
ろいろなパラメーターに依存する。
最後に、３回目の樹脂の洗浄を1.0M酢酸ソーダ溶液で
行う。
行う。
0.5Mおよび1.0Mの２つの酢酸ソーダ洗浄溶液はそれぞ
れ限外濾過、透析、電解透析または分子スクリーニング
で脱塩され、それから分子量5000を区分出来る限外濾過
によって濃縮される。
れ限外濾過、透析、電解透析または分子スクリーニング
で脱塩され、それから分子量5000を区分出来る限外濾過
によって濃縮される。
最初の脱脂された初乳と0.5M洗浄および1.0洗浄によ
る２つのフラクションとの比較分析によって、次の事が
明らかになった。２つのフラクションには、脱脂された
初乳に含まれる増殖因子の80％以上が含まれ、もう一方
では0.5Mの洗浄のフラクションには脱脂された初乳に含
まれる増殖因子の73.2％が含まれる。該フラクションに
はまたラクトペルオキシダーゼ、ラクトトランスフェリ
ン、チゾチームやプロテアーゼといった他の成分が含ま
れている。
る２つのフラクションとの比較分析によって、次の事が
明らかになった。２つのフラクションには、脱脂された
初乳に含まれる増殖因子の80％以上が含まれ、もう一方
では0.5Mの洗浄のフラクションには脱脂された初乳に含
まれる増殖因子の73.2％が含まれる。該フラクションに
はまたラクトペルオキシダーゼ、ラクトトランスフェリ
ン、チゾチームやプロテアーゼといった他の成分が含ま
れている。
下記の表１は脱脂された初乳（Ａ）と0.5M溶出フラク
ションとの比較結果を示している。
ションとの比較結果を示している。
タンパク含量はPETERSONによって改善されたLOWRY法
で分析された。増殖因子単位はＵで分裂促進活量といわ
れるが、最大結合量の半分に相当するトリエチル化メチ
ルチミジンとの結合に必要なタンパク質の量に等しい。
で分析された。増殖因子単位はＵで分裂促進活量といわ
れるが、最大結合量の半分に相当するトリエチル化メチ
ルチミジンとの結合に必要なタンパク質の量に等しい。
前出のフラクション（Ｂ）は脱塩され濃縮されて、pH
6.8で10mMの燐酸緩衝液で予め調製されたハイドロキシ
アパタイトカラムに注入される。ゲル状のハイドロキシ
アパタイトの量はフラクション中に含まれるタンパク質
の量の関数として決められるが、ハイドロキシアパタイ
トゲル１ミリリッター当りせいぜい40mgである。
6.8で10mMの燐酸緩衝液で予め調製されたハイドロキシ
アパタイトカラムに注入される。ゲル状のハイドロキシ
アパタイトの量はフラクション中に含まれるタンパク質
の量の関数として決められるが、ハイドロキシアパタイ
トゲル１ミリリッター当りせいぜい40mgである。
そして、ハイドロキシアパタイトカラムはpH6.8の３
種の燐酸緩衝液で徐々に高濃度にして溶出される。それ
ぞれ、最初は50mM、２回目は100mMそして３回目は500m
M。
種の燐酸緩衝液で徐々に高濃度にして溶出される。それ
ぞれ、最初は50mM、２回目は100mMそして３回目は500m
M。
得られた各フラクションは脱塩され、濃縮され、凍結
される。50mMと500mMフラクションは見かけ上プロテア
ーゼ全量含んでいる。100mMフラクションのみ実質的に
プロテアーゼを含まない。
される。50mMと500mMフラクションは見かけ上プロテア
ーゼ全量含んでいる。100mMフラクションのみ実質的に
プロテアーゼを含まない。
第２のフラクションは100mM溶液での溶出に相当する
が、活性フラクションと呼ばれていて、増殖因子に富ん
だ唯一の物である。
が、活性フラクションと呼ばれていて、増殖因子に富ん
だ唯一の物である。
下記の表２は、前出の活性フラクション（Ｃ）に関す
る情報を合わせて表１を補足したものである。
る情報を合わせて表１を補足したものである。
脱脂した初乳（Ａ）に比較して、活性フラクション
（Ｃ）は比活量が極めて大きい点で異なっている。
（Ｃ）は比活量が極めて大きい点で異なっている。
比較は活性フラクションと、細胞増殖の促進剤として
最も広く用いられている添加剤であるメウシの胎児の血
清との間で行われた。この趣旨で、トリチル化チミジン
の結合テストが、CCL39繊維芽細胞鎖に対する各々の分
裂促進活性を知るために使用された。この比較から活性
フラクション（117.6U/タンパク質1mg）の比活量は、牛
胎児の血清（15U/タンパク質1mg）のそれより明らかに
高いことから明らかである。この事は添加剤の導入とと
もに導入されたタンパク質をしばしば培養培地から除く
必要があり限り、活性フラクションにとって真の利点で
ある。それは活性フラクションの場合には除去すべきタ
ンパク質の量が少ないからである。
最も広く用いられている添加剤であるメウシの胎児の血
清との間で行われた。この趣旨で、トリチル化チミジン
の結合テストが、CCL39繊維芽細胞鎖に対する各々の分
裂促進活性を知るために使用された。この比較から活性
フラクション（117.6U/タンパク質1mg）の比活量は、牛
胎児の血清（15U/タンパク質1mg）のそれより明らかに
高いことから明らかである。この事は添加剤の導入とと
もに導入されたタンパク質をしばしば培養培地から除く
必要があり限り、活性フラクションにとって真の利点で
ある。それは活性フラクションの場合には除去すべきタ
ンパク質の量が少ないからである。
活性フラクションは細胞培養培地、例えば2.2g/重
炭酸ソーダ、1vol％グルタミン酸、0.4vol％ペニシリ
ン、0.4％ストレプトマイシン、0.5％菌類を添加したME
M培地（Eagleの最小培地）中のメウシの血清との代替ま
たは組合せに有用である。
炭酸ソーダ、1vol％グルタミン酸、0.4vol％ペニシリ
ン、0.4％ストレプトマイシン、0.5％菌類を添加したME
M培地（Eagleの最小培地）中のメウシの血清との代替ま
たは組合せに有用である。
活性フラクションはメウシの胎児血清を完全にするCC
L39繊維芽細胞培地の増殖添加剤として用いられた。し
かしながら最初にフィプロネクチンで処理するか否かに
かかわらず、培養プレートには１枚当り16万の細胞、あ
る量の活性フラクションを含んでいる2mlの培地の割合
で植え付けられた。例えば繊維芽細胞培養培地中に１％
のメウシの胎児の血清と１％の活性フラクション（1g/
タンパク質１）を添加させると、同じ培地に約９％の
メウシの胎児の血清を添加して得られるのに相当する細
胞増殖を可能にする。
L39繊維芽細胞培地の増殖添加剤として用いられた。し
かしながら最初にフィプロネクチンで処理するか否かに
かかわらず、培養プレートには１枚当り16万の細胞、あ
る量の活性フラクションを含んでいる2mlの培地の割合
で植え付けられた。例えば繊維芽細胞培養培地中に１％
のメウシの胎児の血清と１％の活性フラクション（1g/
タンパク質１）を添加させると、同じ培地に約９％の
メウシの胎児の血清を添加して得られるのに相当する細
胞増殖を可能にする。
本発明は限定無しの実施例に伸べられた実施態様に限
定されるものではなく、全ての異なる態様をも包含す
る。特にクレームされた処理条件は記述されたものに限
定されない。スルホン酸基以外の官能基を持つ交換体や
樹脂ではない他のタイプの陽イオン交換体も使用するこ
とができる。陽イオン交換体上に捕捉された初乳部分の
シフトは、該交換体の再生に係わるあらゆる常法で可能
であり、ケースバイケースで適当な操作が決定される。
定されるものではなく、全ての異なる態様をも包含す
る。特にクレームされた処理条件は記述されたものに限
定されない。スルホン酸基以外の官能基を持つ交換体や
樹脂ではない他のタイプの陽イオン交換体も使用するこ
とができる。陽イオン交換体上に捕捉された初乳部分の
シフトは、該交換体の再生に係わるあらゆる常法で可能
であり、ケースバイケースで適当な操作が決定される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 30/02 Ｂ (72)発明者 モンリュール ジャン フランス国59650 ヴィルヌーブ ダスク、 リュ ブックリ 145 (72)発明者 トマ ダニエル フランス国60150 ヴィレル スュール クーダン、アレ ドゥ レタン ドメーヌ ドゥ リムデルリュー 33
Claims (10)
- 【請求項１】陽イオン交換クロマトグラフィーの少なく
とも１回の操作からなる初乳の処理方法において、陽イ
オン交換体からの溶出によってシフトされた初乳の一部
を、ハイドロキシアパタイトによる吸着クロマトグラフ
ィーに供し、ハイドロキシアパタイトに捕捉されたフラ
クションが溶出により回収されることを特徴とする少く
とも陽イオン交換クロマトグラフィー操作を含む初乳の
処理方法。 - 【請求項２】ハイドロキシアパタイトに捕捉されたフラ
クションが、最大濃度500mMの燐酸塩緩衝液で洗浄回収
されることを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】最大濃度500mMの燐酸塩緩衝液によるハイ
ドロキシアパタイトの第１回洗浄に引き続く、約100mM
濃度の燐酸塩緩衝液による第２回洗浄により回収され
た、増殖因子に富み、且つプロテアーゼが少ない活性フ
ラクションに相当することを特徴とする請求項２記載の
方法。 - 【請求項４】活性フラクションが脱塩され、濃縮され、
凍結あるいは乾燥されることを特徴とする請求項３に記
載された方法。 - 【請求項５】陽イオン交換体がスルホン酸基を有し、該
交換体からシフトされた初乳の一部が最大0.1Mの酢酸ソ
ーダ溶液による交換体の第１回洗浄後、約0.5Mの酢酸ソ
ーダ溶液による交換体の洗浄によって得られることを特
徴とする請求項１乃至４のいずれかの方法。 - 【請求項６】陽イオン交換クロマトグラフィーに先だっ
て実行される唯一の操作が初乳の脂肪含量を最大2g/
にする脱脂操作であることを特徴とする請求項１の方
法。 - 【請求項７】下記連続操作が初乳に対し実行されること
を特徴とする請求項６の方法。 a.脂肪含量を最大2g/にする脱脂 b.脱脂された初乳をスルホン酸基を持つ交換体に通液 c.最大濃度0.1Mの酢酸ソーダ溶液による交換体の第１回
洗浄 d.約0.5M濃度の酢酸ソーダ溶液による交換体の第２回洗
浄 e.約10mMの燐酸塩緩衝液に平衡させたハイドロキシアパ
タイト上を２回目の洗浄相当部分（ｄ）が通液、脱塩お
よび濃縮 f.pH約6.8、最大50mM濃度の燐酸塩緩衝液によるハイド
ロキシアパタイトの第１回の洗浄 g.pH約6.8、約50mM濃度の燐酸塩緩衝液によるハイドロ
キシアパタイトの第２回洗浄 h.2回目の洗浄（ｇ）で生成した部分と活性フラクショ
ンの脱塩、濃縮と凍結あるいは乾燥 - 【請求項８】最初の初乳の増殖因子の50％以上を含み、
プロテアーゼを事実上含まないことを特徴とする請求項
３または７のいづれか１つの方法によって得られた初乳
の活性フラクション - 【請求項９】請求項８のある活性フラクションを含み、
それが細胞増殖を促進する添加剤となることを特徴とす
る細胞培養培地。 - 【請求項１０】真核生物細胞の中の繊維芽細胞、ハイブ
リドーマ、上皮様細胞、内皮細胞、肝細胞、リンパ球、
マクロファージ、脂肪細胞、造血細胞、顆粒細胞、心臓
細胞、神経細胞、筋肉細胞、皮膚細胞、表皮ケラチン細
胞、メラノサイト、軟骨細胞、昆虫細胞の培養に関する
請求項９記載の培地。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9008573A FR2663816B1 (fr) | 1990-06-28 | 1990-06-28 | Procede de traitement du colostrum par chromatographie d'adsorption sur hydroxyapatite, fraction active de colostrum obtenue et milieu cellulaire contenant ladite fraction active. |
| FR90/08573 | 1990-06-28 | ||
| PCT/FR1991/000502 WO1992000014A1 (fr) | 1990-06-28 | 1991-06-24 | Procede de traitement du colostrum par chromatographie d'adsorption sur hydroxyapatite, fraction active de colostrum obtenue et milieu cellulaire contenant ladite fraction active |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05502946A JPH05502946A (ja) | 1993-05-20 |
| JPH087201B2 true JPH087201B2 (ja) | 1996-01-29 |
Family
ID=9398416
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51111391A Expired - Fee Related JPH087201B2 (ja) | 1990-06-28 | 1991-06-24 | ハイドロキシアパタイトへの吸着クロマトグラフィーによる初乳の処理方法、得られた初乳の活性フラクション、および活性フラクションを含む細胞培地 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0489884B1 (ja) |
| JP (1) | JPH087201B2 (ja) |
| DE (1) | DE69101305T2 (ja) |
| FR (1) | FR2663816B1 (ja) |
| WO (1) | WO1992000014A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994023017A1 (en) * | 1993-04-01 | 1994-10-13 | Viable Bioproducts Ltd. | A composition useful as additive to a cell culture medium, comprising colostrum and serum |
| AUPM534794A0 (en) * | 1994-04-28 | 1994-05-19 | Gropep Pty Ltd | Modified milk growth factor |
| DE69622566T2 (de) | 1995-07-17 | 2003-01-30 | Flying Null Ltd., Harston | Verbesserungen mit bezug auf magnetischen etikettes oder marker |
| CA2387686A1 (en) * | 1999-10-06 | 2001-04-12 | Campina B.V. | Process for obtaining growth factor preparations (tgf-beta and igf-1) from milk products having low mutual cross-contamination |
| EP1625877A3 (en) * | 2004-08-09 | 2006-03-08 | Friesland Brands B.V. | Functional milk fraction |
| MX2024005465A (es) | 2021-11-05 | 2024-05-22 | Frieslandcampina Nederland Bv | Uso de tgf en la prevencion de una infeccion virica de las vias respiratorias. |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS553721A (en) * | 1978-06-21 | 1980-01-11 | Morinaga Milk Ind Co Ltd | Production of powder of colostrum |
| US4440860A (en) * | 1980-01-18 | 1984-04-03 | The Children's Medical Center Corporation | Stimulating cell growth |
| FR2487642B2 (fr) * | 1980-07-31 | 1985-10-18 | Bel Fromageries | Procede de preparation de fractions proteiques par ultrafiltration et chromatographie d'exclusion et d'echange d'ions |
| FR2520235A1 (fr) * | 1982-01-27 | 1983-07-29 | Bel Fromageries | Procede de separation d'immunoglobulines a partir de colostrum |
-
1990
- 1990-06-28 FR FR9008573A patent/FR2663816B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-06-24 EP EP91912035A patent/EP0489884B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-24 JP JP51111391A patent/JPH087201B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-06-24 DE DE69101305T patent/DE69101305T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-06-24 WO PCT/FR1991/000502 patent/WO1992000014A1/fr not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0489884B1 (fr) | 1994-03-02 |
| DE69101305D1 (de) | 1994-04-07 |
| FR2663816B1 (fr) | 1993-08-06 |
| JPH05502946A (ja) | 1993-05-20 |
| EP0489884A1 (fr) | 1992-06-17 |
| DE69101305T2 (de) | 1994-08-25 |
| WO1992000014A1 (fr) | 1992-01-09 |
| FR2663816A1 (fr) | 1992-01-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5516675A (en) | Separation of lactoperoxidase, secretory component and lactoferrin from milk or whey with a cation exchange resin | |
| EP0923308B1 (en) | Purification of biologically active peptides from milk | |
| US5077067A (en) | Process for the selective and quantitative elimination of lactoglobulins from a starting material containing whey proteins | |
| Francis et al. | Extraction from cheese whey by cation-exchange chromatography of factors that stimulate the growth of mammalian cells | |
| JPH08510721A (ja) | 乳からの対象化合物の単離 | |
| US6194208B1 (en) | Modified milk growth factor | |
| JPS60214738A (ja) | 生物活性を有する抽出液の調製方法 | |
| EP0758380B1 (en) | A process for separating milk clotting enzymes | |
| JPH087201B2 (ja) | ハイドロキシアパタイトへの吸着クロマトグラフィーによる初乳の処理方法、得られた初乳の活性フラクション、および活性フラクションを含む細胞培地 | |
| Zittle et al. | The fat-globule membrane of milk: Alkaline phosphatase and xanthine oxidase in skimmilk and cream | |
| AU6232999A (en) | Process for obtaining growth factor preparations (tgf-beta and igf-1) from milk products having low mutual cross-contamination | |
| JP2568151B2 (ja) | アンジオジェニンの単離方法 | |
| CA2682371A1 (en) | Method for selective fractionation of growth factors from dairy products | |
| EP0595993A1 (en) | Isolation of charged particles from fluids | |
| Ozaki et al. | Connectin, an Elastic Protein of Muscle: A Connectin-Like Protein from the Plasmodium Physarum polycephalum | |
| EP0085220A2 (en) | Method for purification of anterior pituitary hormones | |
| US4610815A (en) | Process for producing and obtaining anaphylatoxin- and cocytotaxin-containing leucotaxine preparations and of anaphylatoxin and cocytotaxin proteins in molecularly homogeneous, biologically active form | |
| SU1243730A1 (ru) | Способ выделени иммунодепрессора из тканей млекопитающих | |
| JP2985158B2 (ja) | 活性の高いラクテニン画分の回収方法 | |
| Kulbe et al. | [81] Simultaneous purification of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, 3-phosphoglycerate kinase, and phosphoglycerate mutase from pig liver and muscle | |
| JPH04275300A (ja) | 初乳由来の特異的吸着画分含有組成物 | |
| JPH05239091A (ja) | ビトロネクチンの製造方法 | |
| JPH07267994A (ja) | 新規蛋白質及びその製造法 | |
| JPS61229894A (ja) | ヒト胎盤中に含まれる成長因子及びその単離方法 | |
| AU2376292A (en) | Isolation of charged particles from fluids |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080129 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090129 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090129 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100129 Year of fee payment: 14 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100129 Year of fee payment: 14 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110129 Year of fee payment: 15 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |