JPH0550295B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ 細胞膜、核酸、脂質及び細胞質成分が除去さ
れている細胞外マトリクスの形で主成分としてコ
ラーゲン及びエラスチンを有する体由来構造体を
含んで成る無菌体移植片。

２ 前記移植片が、該移植片が付加される体部分
の組織構造と適合する大きさ寸法にされている請
求の範囲第１項記載の体移植片。

３ 前記移植片が、前記体構造体が体から取り出
される直後であつて実質的な化学架橋又はその変
化に先立つて洗剤により処理される請求の範囲第
１項記載の無菌体移植片。

４ 前記洗剤が変性洗浄及び非変性洗剤を含んで
成ることさらに含んで成る請求の範囲第３項記載
の無菌体移植片。

５ 無菌の体移植片の調製方法であつて、細胞
膜、核酸、脂質及び細胞質を除去しそして１つの
主要成分としてコラーゲンを有する細胞外マトリ
クスを形成するために体組織を処理し、そして前
記組織を体に移植するために適当な大きさ及び形
状に維持しながら該組織を少なくとも１種類の洗
剤で処理することを含んで成る方法。

６ 前記組織を非変性第１洗剤で処理して細胞質
性細胞膜を除去するが核膜を除去せず、この間に
細胞外マトリクスの破壊を回避し、そして該組織
を変性第２洗剤で抽出する請求の範囲第５項記載
の方法。

７ 前記第２洗剤が変性洗剤であり、そして前記
第１洗剤とは別に第２段階において適用される請
求の範囲第５項記載の方法。

８ 前記第２洗剤が強陰イオン性洗剤であり、そ
して体移植片として使用するために前記組織を無
菌形に維持しながら該洗剤を除去する請求の範囲
第５項記載の方法。

９ 前記陰イオン性洗剤が、炭素原子数７〜22個
を有する分枝鎖又は直鎖のスルホン化アルカンも
しくはスルホン化アルキラレン又は硫酸化高級脂
肪族アルコールの水溶性塩である請求の範囲第８
項記載の方法。

１０ 前記洗剤がドデシル硫酸ナトリウムである
請求の範囲第９項記載の方法。

１１ 体に移植する前に前記体組織を架橋するこ
とをさらに含んで成る請求の範囲第８項記載の方
法。

１２ 前記第１洗剤がプロテアーゼ阻害剤と混合
される請求の範囲第８項記載の方法。

１３ 前記第１洗剤がDNアーゼと混合される請
求の範囲第８項記載の方法。

１４ 前記体移植片が血管移植片である請求の範
囲第８項記載の方法。

１５ 前記体移植片が骨移植片である請求の範囲
第８項記載の方法。

１６ 前記体移植片が歯移植片である請求の範囲
第８項記載の方法。

１７ 前記体移植片が皮膚移植片である請求の範
囲第８項記載の方法。

１８ 体を修復するために生体に全構造体を移植
する方法であつて、該構造体がコラーゲンを多く
含む細胞外マトリクスの形であつて、核酸、脂質
及び細胞質成分が除去されており、その主成分と
してコラーゲンが残されており、前記の除去が少
なくとも１種類の洗剤を使用することによつて行
われ、この方法が生体に前記構造体を移植するこ
とを含んで成る方法。

１９ 前記全構造体が血管移植片である請求の範
囲第１８項記載の方法。

２０ 前記構造体が歯である請求の範囲第１８項
記載の方法。

２１ 前記構造体が皮膚の領域である請求の範囲
第１８項記載の方法。

２２ 体組織から体移植片を形成する方法におい
て、該体組織を架橋又は該組織の不所望の悪化に
先立つて変性洗剤で処理し、そして生体における
移植に使用するために適当な前記体移植片をそれ
から形成することを含んでなる方法。

２３ 前記体組織を第１の非変性洗剤、及び第２
の変性洗剤で処理することを含んで成る請求の範
囲第２２項記載の方法。

２４ 前記洗剤が順次使用され、そしてプロテア
ーゼ阻害剤が前記第１洗剤と共に使用される請求
の範囲第２３項記載の方法。

２５ DNアーゼが前記第１洗剤と混合される請
求の範囲第２４項記載の方法。

２６ 前記第２洗剤が強陰イオン性洗剤であり、
この洗剤が７〜22個の炭素原子を含む分枝鎖又は
直鎖のスルホン化アルカンもしくはスルホン化ア
ルキラレン又は硫酸化高級脂肪族アルコールの水
溶性塩である請求の範囲第２３項記載の方法。

２７ 洗剤で処理された体移植片の使用方法であ
つて、体部分を修復し又は置換するために生体に
前記細胞外マトリクスを移植することを含んで成
り、ここで該マトリクウが体と適合し、非抗原性
であり、そして再細胞形成が可能なように設計さ
れている方法。

２８ 細胞膜、核酸、脂質及び細胞質成分が除去
されている細胞外マトリクスの形で主成分として
コラーゲンを有する体由来の構造体を含んで成る
無菌体移植片。

関連する出願 この出願は1983年６月10日に出願された米国特
許出願第503203号の一部継続出願である。

発明の背景 多くの種類の体移植片（body implant）、例え
ば血管代替物、皮膚被膜及び被覆、並びにその他
のものが医療的使用のために知られている。移植
材料は合成材料でもよく、又は移植される種と同
一種もしくは異る種からの体組織でもよい。体組
織及び構造体が移植される場合、それらを供与体
から新鮮な状態で使用することができるが、多く
の場合、後で使用するために移植組織を貯蔵する
ための幾つかの手段を有することが好ましい。

へその緒が緩衝液中で貯蔵しそしてグルタルア
ルデヒドで固定した後に血管移植片として使用す
るために示唆されている。牛の頚動脈が、後で移
植するためのコラーゲン性材料を形成するために
フアイシン（ficin）で処理されている。他の場
合、移植されるべき架橋された体材料から脂質が
抽出されている。米国特許第4323358号は、まず
グルタルアルデヒドで処理された体移植材料のド
デシル硫酸ナトリウム処理の使用を記載してい
る。この処理は架橋後にのみ行われ、そして移植
後の鉱化作用（minerali−zation）を阻害する。
これらの公知の方法はそれぞれがなんらかの利点
を有するとしても、すべての受領のために適当
な、全体として許容されるそして再現性のある血
管移植片をもたらさない。組織培養における補完
物及び補助物としての生物マトリクスの使用が、
米国特許第4352887号を含む多くのものに示唆さ
れている。コラーゲンを多く含有する材料を残し
ながら細胞膜、核酸、脂質及び細胞質成分を除去
するための洗剤処理を含む一連の段階による体構
造物の処理後の組織培養のために生物マトリクス
繊維が使用される。科学的研究のために適当な細
胞外マトリクスを得るために、種々の洗剤段階に
よる体構造全体の処理が示唆されている。この主
題についての報文には次のものが含まれる：K.
ブレンデル及びE.メーザン“血管基礎膜：洗剤の
使用により分離された材料の調製及び性質”セレ
ブラルミクロバスクラーチユアー（The
Cerebral Microvasculature）、1980、89−103
頁；E.C.アールソン、K.ブレンデル、J.J.ヘーレ
及びE.メーザン“腎糸球体及び細管からの分離さ
れた基礎膜並びに脳及び網膜ミクロベツセルの超
構造的及び生化学的分析”、ジヤーナルオブウル
トラストラクチユアーリザーチ（Journal of
Ultrastructure Research）、62、26−53（1978）；
R.C.ドハメル、E.メーザン、K.ブレンデル、“ウ
シ脳及び腎毛細血管基礎膜及び分別抽出物の電子
顕微鏡的特徴付け”、ビブリオテカアナトミカ
（Biblio−theca Anatomica）、No.20、134−137
頁；E.メーザン、K.ブレンデル、J.J.ヘーレ及び
E.C.カールソン“超構造的及び化学的に純粋な基
礎膜の超音波を用いない分離のための鋭敏な方
法”、バイオロジーアンドチエミストリーオブベ
ースメントメンブレン（Biology and
Chemistry of Basement Membranes）1978、
17−30頁；E.メーザン、R.B.ナーゲル、P.ジヨン
ソン、C.ワグナー、R.ホワイド及びK.ブレンデ
ル、“細胞不含の及び組織構造的に無傷の基礎膜
の構造的及び機能的性質”、フロンテアズオブマ
トリクスバイオロジー（Froutiers of Matrix
Biology）、Vol7、101−119頁（1979）；E.メーザ
ン、J.T.ヘーレ及びK.ブレンデル、“幾つかの組
織から組織学的及び化学的に純粋な基礎膜を分離
するための簡単で鋭敏で非破壊的な方法”、ライ
フサイエンス（Life sciences）、Vol17、1721−
1732（1975）；K.ブレンデル、E.メーザン及びR.
B.ナーゲル“細胞不含かん流腎臓：基礎膜透過
性モデル”、バイオロジーアンドケミストリーオ
ブベースメントメンブランス（Biology and
Chemistry of Basement Membranes）、177−
193頁（1978）；R.クツタン、R.D.スパル、R.C.
ドハメル、I.G.シペス、E.メーザン及びK.ブレン
デル、“胞状細胞外マトリクス及び導入された基
礎膜の調製及び組成”、ラング（Lung）（1981）
159：333−345；並びにR.C.ドハメル、E.メーザ
ン及びK.ブレンデル、“ウシ腎基礎膜からのポリ
ペプチドの２集団の選択的可溶化”、エクスプア
イリザーチ（Exp.Eye Res.）（1983）36、257−
267。

従来技術は、コラーゲンの含量が多くそして広
範囲の機能を有する広範囲の特定の生体部位にお
いて体修復及び適合性をもたらす細胞不含細胞外
マトリクスに形成するために処理された体移植片
の使用により得られる実質的な利点を認識してい
なかつた。

発明の概要 この発明の目的は、細胞膜、核酸、脂質、及び
細胞質成分が除去された細胞外マトリクスの形で
主成分としてコラーゲンを有する体由来構造体を
含んで成る無菌の体移植片を提供することであ
る。

この発明の目的は、生体由来の、体構造を置き
換えそして修復することができ、そして体に対し
て抗原的でない新規な体移植片を提供することで
ある。

この発明の他の目的は、選択された体構造を修
復しそして置き換えるために他の体に移植するこ
とができるように体組織を処理するための改良さ
れた方法を提供することである。

この発明の前記以外の目的は、体から採取され
た構造体から細胞外マトリクスを形成するための
改良された方法を提供すること、及び体中でこれ
らのマトリクス材料を使用する方法を提供するこ
とである。

この発明の方法は、細胞外マトリクス形の構造
体を得るために変性洗剤により処理された体組織
由来体移植片を形成することを広く含む。

細胞膜、核酸、脂質及び細胞質成分を除去しそ
して主成分としてコラーゲンを有する細胞外マト
リクスを形成するために体組織を処理し、そして
体移植片として使用するために適する体組織を製
造するための好ましい方法においては、細胞外マ
トリクスの変性を回避しながら細胞膜を除去し、
しかし核膜を除去しないように第１の非変性洗剤
が使用される。次に、第２の強力な変性洗剤を用
いて核膜を溶解し、その後で、体移植片として使
用するために組織を無菌形に保持しながら両洗剤
を除去する。好ましくは、第１の洗剤はプロテア
ーゼ阻害剤と共に使用され、そして添加された
DNアーゼを有していてもよく有していなくても
よい。すなわち、体組織の第１浸漬は細胞膜を除
去しそして脂質を破壊するが、細胞中に存在する
プロテアーゼが存在するコラーゲンを消化し又は
破壊することを許容しない。天然DNアーゼ又は
添加されたDNアーゼによつてDNAが部分的に
可溶化されそして部分的に除去されてもよい。

第２段階において、好ましくは第１の洗剤を洗
浄除去した後に、変性洗剤を用いて残留蛋白質を
ほぐしそしてそれらを可溶化し、そして又核膜を
除去する。非変性洗剤による第１浸漬の使用によ
りDNAの部分的加水分解及び組織材料からの部
分的除去が可能となり、その結果非常に粘稠な
DNAが第２の洗剤の作用を妨害することがない。
非常に粘稠なDNAは第２の洗剤段階における完
全な除去に先立つて変性される。

次の段階において、洗剤を好ましくは十分な洗
浄によつて除去する。この洗浄は室温において数
時間又は数日間行うことができる。

第３段階において、形成された細胞外マトリク
スをエチレンオキシド又は照射のような公知の方
法により殺菌し、そして次の使用のために無菌的
に保持することができる。

この発明に従つて処理された頚動脈管のごとき
全構造体は、次の使用のために凍結乾燥すること
ができ、又は常用の条件下で液体基剤中に無菌的
に保持することができる。ある場合には、組織構
造体について知られているように、グルタルアル
デヒド処理又は他の架橋処理を用いることができ
る。このような架橋は幾つかの移植片において好
ましいであろう。体移植片が、これらが代替し又
は修復しつつある組織と生物学的に関連する組織
構造（histoarchitecture）を維持することができ
ることがこの発明の特徴である。体移植片は、強
さ、レジリエンス、密度、不溶性及び透過性のご
とき物理的性質を維持する。生物学的に関連ある
空間的配置を有する物理的形状において、細胞外
マトリクスの一次構造は、新細胞の制御された内
側への増殖のために重要な幾つかのコラーゲン及
び蛋白質と共に維持される。移植片及び他の組織
は、体に再移植された場合に再細胞充実のための
適切な導管として機能することができ、そして再
細胞充実は生物学的に関連ある態様で生じ、移植
片及び他の組織の自然の物理的性質の多くを維持
する移植片が得られる。組織移植において使用す
る場合、移植片は、非常に小さい直径（100マイ
クロメーター未満）におけるほか、流血と血栓形
成性の強い相互作用を示さない。

この発明の体組織片は細胞不含細胞外マトリク
スであり、このマトリクスは強さ及び弾性に関す
る物理的性質を保持しているもとの組織のかなり
の部分を含み、そして主としてコラーゲンである
が、さらにグリコサミノグリカン、並びに基礎膜
複合体、ラミニン及びフイブロネクチンのごとき
コラーゲンと密接に関連する蛋白質も含む。骨以
外の体組織、そして特に血管及び靭帯から形成さ
れるこの発明の無細胞細胞外マトリクスにおい
て、エラスチンがコラーゲンと共に主たる成分で
あるが、通常はコラーゲンよりは幾分少ない。こ
れは組織のタイプにより変り、そして靭帯のごと
き幾つかの組織においてはコラーゲンよりエラス
チンが多い。この明細書において使用する場合、
細胞外マトリクスは、少なくとも１つの洗剤によ
り抽出されることによつて形成された、このパラ
グラフにおいて上記したような材料を意味する。

好ましい態様の記載 ブタ、ウシ、イヌ、ウマ等のごとき動物及びヒ
トからの天然の体組織を、この発明の体移植片を
形成するための出発物質として使用することがで
きる。実際にはヒトのための移植片を取扱う場合
には出発材料を得るための種は他の哺乳動物であ
るが、出発材料用として、移植されるものと同一
の種を使用する場合に最小の抗原性がしばしば得
られる。出発組織は、その材料が移植されようと
している組織と同一であることが好ましい。例え
ば、他の体からのこの発明に従つて処理された血
管弁材料により血管弁を置き換えることができ
る。動脈及び静脈を置き換えるために動脈及び静
脈を使用することができる、等である。骨及び歯
を置き換えるために骨及び歯を使用することがで
き、そして皮膚を置き換えるために皮膚を使用す
ることができる。しかしながら、多くの場合、例
えば皮膚移植の場合、種々の高強度組織材料、例
えば火傷等の被覆のために皮膚移植片として使用
することができる心膜及び硬膜を使用することが
できる。

すべての場合に、体移植片は、剖検又は屠殺の
際に得られる体組織から、防腐剤、タンニン剤又
は有害な酵素処理による前固定を用いないで形成
される。好ましくは、処理されるべき組織は新鮮
な状態で得られ、そしてこの発明の方法に従つて
すぐに処理される。

基本的には、酵素、固定剤、蛋白質変性剤、架
橋剤、殺菌剤等による処理によつてあらかじめ変
性されていない組織から細胞成分を除去するため
に洗剤を用いる。組織を洗剤で処理した後、洗剤
残渣を除去し、無菌的に維持することができる殺
菌された移植片を得るため、及びある場合には、
移植片に改良された物理的性質を加えるために、
例えばある種の組織タイプにおいて増加した強さ
を得るために架橋を行うために、追加の段階が行
われる。

体移植は４つの一般的なタイプに属し、これに
は血管補填、例えば頚動脈管置換、及び体におけ
る一般的静脈及び動脈置換、心臓弁及びパツチ、
火傷の被覆及びドレツシング、並びに歯及び骨移
植が含まれる。好ましい体移植片には、ヒトにお
ける移植のための、体外移植されたヒトの動脈か
らの血管補填及びヒトのヘソの緒；ヒトにおける
移植のための、霊長類、イヌ及び他の動物からの
動脈管及び静脈管；ヒトにおける移植のための、
体外移植されたヒト静脈管からの弁を伴う静脈補
填完全体、又はヒトにおける移植のための動物静
脈管からの弁を伴う静脈補填完全体が含まれる。
心臓弁はヒトにおける移植のためにヒトの剖検又
は供与組織から得ることができ、又は入手源はヒ
トにおける移植のために屠殺場での動物組織であ
つてもよい。ヒト剖検供与組織からの心膜、心膜
のう、硬膜、網、腸間膜及び結膜を外科的再構成
において使用することができる。ヒト剖検及び動
物組織からの骨片、軟骨及び靭帯を外科的再構成
において使用することができる。歯移植片を得、
処理し、そしてヒト歯槽に再移植して補てつを得
ることができる。動物由来の皮膚又は消化管を火
傷の被覆のために使用することができる。細胞外
マトリクスに富む新たに体外移植された組織、例
えば動脈管、静脈管、へその緒、皮膚、骨、歯、
軟骨、腸壁、靭帯等が使用のために好ましい。他
の体移植片がこの発明に従つて形成され得る。使
用されるもとの体組織及び構造体は、要求される
非免疫原性、非血栓形成性、及び指示される再細
胞化のために好ましい表面特性を有する材料を得
るためにこの発明の洗剤によつて処理することが
できるものである。筋肉組織は使用のために好ま
しくない。

好ましい洗剤処理法に従えば、摘出された生組
織は好ましくは非変性洗剤、例えばトリトンＸ−
100（ペンシルバニア、フイラデルフイアのローム
アンドハース社の商標）の溶液、例えば１％溶液
（但し0.1〜20％溶液も許容される）に浸漬され
る。第１浸漬洗剤の目的は脂質を破壊することに
よつて細胞膜及び蛋白質を除去することである。
透明な洗液が得られるまで、溶剤を好ましくは少
なくとも２回又は３回、そして好ましくはさらに
多数回取り替える。この第１洗浄段階は好ましく
は、室温において、最初の３〜５時間の間浸漬洗
剤を１時間ごとに取り替えながら行う。温度は大
きく変えることができ、10時間〜数日間１℃〜40
℃とすることができる。PHは６と８の間に維持す
るのが好ましいが、４と９の間で変えることがで
きる。ある場合には、細胞外マトリクスの変性を
防止するため、そして好ましくは天然に存在する
プロテアーゼがコラーゲンを攻撃するのを防止す
るためにプロテアーゼ阻害剤を用いる。ある場合
には、天然のプロテアーゼ阻害物質が十分な保護
をもたらす。

プロテアーゼ阻害剤は、コラーゲンナーゼ阻害
剤、例えば１〜25ミリモル濃度のエチレンジアミ
ン四酢酸、スルヒドリルプロテアーゼ阻害剤、例
えば１〜25マイクロモル濃度のNEM、及びセリ
ンプロテアーゼ阻害剤、例えば0.2〜１マイクロ
モル濃度のPMSFを含むことができる。温度は、
洗剤のクラフト点より高温、又は相分離が生じな
い温度に維持する。好ましくは、10〜30℃の温度
において１〜24時間行う。

ある場合には、第１洗剤と共にDNアーゼを使
いることができる。こうすることによつて、天然
存在するDNアーゼ又は添加されたDNアーゼに
より、存在するDNAが可溶化され、そして部分
的に除去されることが可能となる。DNアーゼが
添加されない場合でもDNAが除去され、そして
可溶化される。DNアーゼは、もし添加されれ
ば、核膜を通過しそして核に入ることができる。
第１洗剤処理段階後に残留するDNAは非粘稠形
であり、この形は、第２洗剤段階中に、処理され
た材料中に存在する蛋白質及び洗剤の拡散を制限
するように機能しない。

第１洗剤段階の後、痕跡量の洗剤を除去するた
めに水洗浄を行うのが好ましい。使用する第２洗
剤に対する可能性ある遮断作用を防止するのが好
ましいが、ある場合にはこれを省略することがで
きる。

その臨界ミセル濃度より高い濃度において使用
することができる変性洗剤への浸漬を伴つて第２
洗剤段階が用いられる。このような浸漬は、１〜
７日間又はさらに長期間にわたつて用いることが
でき、ほとんどの小体組織構造体、例えば長さが
10〜15cmの動脈管については３日間が好ましい。

しばしば１％に達する洗剤濃度をもつて、４〜
30℃の温度を用いることができる。10〜30℃にお
いて３日間浸漬するのが好ましい。

第２洗剤段階は架橋されていない蛋白質をほぐ
し、そしてこの蛋白質を可溶化し、これを核膜と
共に除去する。

次に、蒸留水を用いて第２変性洗剤を洗浄除去
する。しばしば、すすぎ及び洗浄のために塩溶液
を用いて組織の生理的条件を体条件のもとに維持
することができる。好ましくはアルコール、例え
ば70％エタノールを洗浄溶液として加えて、殺菌
剤として、そして痕跡の洗剤を除去する場合の助
剤として機能させることができる。

洗浄後、この発明に従つて処理された体組織を
70％アルコール中に貯蔵し、凍結乾燥し、グルタ
ルアルデヒドで固定し、さらにエチレンオキシ
ド、ガス殺菌又はガンマー線照射により殺菌する
ことができ、これらはすべて体に再移植すべき体
組織の処理のために当業界において知られてい
る。

第１及び第２洗剤段階において、使用される洗
剤は多くてもよく、そして種々の常用の添加剤、
例えば殺菌剤を使用することができることを理解
すべきである。

幾つかの場合には、第２洗剤段階のみを使用す
ればよく、これによつて体組織から十分な物質が
除去され、体移植片として使用するための細胞外
マトリクスの形で機能するようになる。他の場合
には、第１洗剤段階のみを行えばよいが、但し、
第２段階において変性洗剤を使用するのが好まし
い。ある場合には、非変性洗剤と共に穏和な変性
洗剤を１段階で使用することができ、例えばトリ
トンＸ−100と組合わせてデオキシコレートを使
用することができる。

非変性洗剤のために使用することができる多く
の洗剤の内、他のポリオキシエチレンエーテルを
使用することができ、トリトンＸ−100はポリオ
キシエチレンエーテルである１つの商標製品であ
る。トリンＸ−114を使用することができる。シ
エルケミカル社により製造されるオクチルフエノ
ールオキシドNP−40を使用することもでき、同
様にトウイーン系のポリオキシエチレンソルビタ
ンである、例えばトウイーン20、トウイーン40及
びトウイーン60を使用することができる。ウイル
ミントン、デラウエアのICIアメリカ社により製
造されるポリオキシエチレンエーテルBrij35も使
用することができる。一般に、第１段階において
は、非変性の、細胞質膜又は細胞膜を破壊するが
核膜を破壊しない任意の洗剤を使用することがで
きる。内生ヌクレアーゼ（DNアーゼ）の活性化
又は外来性ヌクレアーゼの侵入を許容しながら第
１段階を通して核膜が物理的に無傷の状態に維持
されることが重要である。核膜が溶解する前に核
DNAが加水分解されることを洗剤が許容しなけ
ればDNAが放出される。DNAは粘稠であり、そ
して蛋白質を捕捉することができ、そして次の抽
出段階を不可能にはしないにしても一層困難にす
る。

核膜及び核内容物を溶解することができる第２
洗剤は好ましくはドデシル硫酸ナトリウム、又は
炭素原子数７〜22のスルホン化アルカンもしくは
スルホン化アルキルレン又は硫酸化高級脂肪族ア
ルコールの水溶性塩の水溶液と共に形成される洗
剤である。アルキル単位は直鎖でも分枝鎖でもよ
く、そして好ましくは、ラウリル硫酸、ミリスチ
ル硫酸、セチル硫酸、ステリル硫酸及びオレイル
硫酸の水溶性塩を包含するアルキル硫酸塩が使用
される。所望によりいずれかの洗剤段階において
２種類又はそれより多くの洗剤の混合物を使用す
ることができる。適当な塩には、C7−22アルキ
ル硫酸もしくはスルホン酸、又はアルキラレンス
ルホン酸のナトリウム塩、カリウム塩、リチウム
塩及びアンモニウム塩、並びにアミン塩、例えば
ラウリル硫酸トリエチルアミンが含まれる。洗剤
の濃度は好ましくは0.5〜10％の範囲である。こ
の出願において使用される「変性洗剤」なる語に
は、蛋白質を変性しもしくはほぐし又は核膜を溶
解する洗剤が含まれる。好ましくは、これらの変
性洗剤は陰イオン性洗剤である。変性洗剤として
有用な他の洗剤には0.5〜４％の濃度のデオキシ
コレートが含まれる。低PHにおける低い不溶性の
ため、デオキシコレート溶液は好ましくはPH８
に、しかし常に約PH７〜約PH９の範囲内に緩衝化
されなければならない。

好ましくは制細菌剤が全期間を通して、又は少
なくとも第１洗剤段階において使用され、そして
水と共に除去され得る。0.01〜0.5％の濃度にお
けるナトリウムアジドが好ましい。マーキユロク
ロム及び抗生物質を使用することもできる。この
方法に代えて、すべての溶液を熱により殺菌し、
そして全工程を無菌条件下で行うことができる。

細胞外マトリクスの蛋白質分解的損傷を最小に
するために２つの方法が用いられる。１つの方法
においては、多量の溶液を使用し、そしてトリト
ン溶液又は第１洗剤を頻繁に取り替えることによ
り、放出されたプロテアーゼを急速に稀釈しそし
て洗浄する。第２の方法においては、１又は複数
のプロテアーゼ阻害剤を第１洗剤と共に含める。
下に記載する阻害剤の添加により上に検討した幾
つかのクラスのプロテアーゼを阻害することがで
きる。

(a) セリン−依存性プロテアーゼは、活性化され
た有機ホスフエート及びチオホスフエート、例
えばフエニルメチルスルホニルフルオリド
（PMSF）又はジイソプロピルホスホフロリデ
ートにより阻害される。

(b) スルヒドリルー依存性プロテアーゼは、スル
ヒドリル基の阻害剤、例えばＮ−エチルマレイ
ミド（NEM）、グルシドール、エタクリン酸
等により阻害される。

(c) ２価陽イオン依存性プロテアーゼは、キレー
ト剤、例えばエチレンジアミン四酢酸
（EDTA）、エチレングリコール−ビス（β−
アミノ−エチルエーテル）Ｎ，Ｎ，N′，N′−
四酢酸により阻害される。

(d) 酸性プロテアーゼは中性PHにおいて阻害され
る。

イヌ頚動脈管を処理する場合には0.2ｍモルの
PMSFのみで十分であるが、処理される組織に一
層活性なプロテアーゼが存在する場合には、多数
の阻害剤、例えばPH6.5〜8.5の緩衝液中0.2ｍモル
PMSF、１〜25ｍモルNEM、１〜25ｍモル
EPTAを用いるのが好ましい。

この発明の体組織構造体を前記のように洗剤で
処理した後、これらを常法に従つて体に移植する
ことができる。すなわち、血管移植片を調製し人
体中の頚動脈及び他の動脈並びに静脈と取り替え
ることができる。イヌの血管移植片及び他の管状
材料は長期間わたつて利用できそして長期間にわ
たつて好ましい特性をもたらす。

この発明の上記の及び他の目的、利点及び特徴
は、この発明の細胞外マトリクス体移植片を調製
しそして使用する理論的及び実際的例の下記の記
載から一層よく理解されよう。

例 １ 少なくとも20cm分枝していないヒト頚動脈管、
諭精管動脈管（spermatic arteries）及び他の動
脈を、剖検の際に無菌技法を用いて摘出する。摘
出後にすべての動脈を0.8％塩溶液によりひたし
血液及び凝固物を除去する。次に２個の洗浄され
た血管を、１％トリトンＸ−100溶液を200ml収容
する無菌密閉パンに移す。この液及びその後のす
べての溶液はオートクレーブ殺菌する。トリトン
Ｘ−100溶液はさらに0.02％ナトリウムアジド、
１ｍＭジナトリウムエチレンジアミノテトラアセ
テート（EDTA）及び１ｍＭのＮ−エチルマレ
イミド（NEM）を含有する。血管外部移植片を
この溶液中で、室温において回転シエーカー中で
振とうすることにより撹拌する。溶液は１時間ご
とに３時間にわたり取り替える。この時点で、溶
液を0.5ｍＭフエニルメチルスルホニルフルオリ
ドを含有する１％トリトンＸ−100溶液と取り替
え、この液中で血管外部移植片を１時間撹拌す
る。この処理の後、血管を0.02％ナトリウムアジ
ドを含有する１％トリトンＸ−100に移し、そし
て次の４日間にわたり毎日抽出剤を取り替えなが
らインキユベートする。この期間の後、細胞外血
管マトリクスを、殺菌した再蒸留水を多数回取り
替えながら十分に洗浄し、そして24時間ずつ数回
70％エタノールに暴露し、最後に70％アルコール
中に、移植のための調製まで貯蔵する。70％エタ
ノール中での貯蔵は長期間にわたつて可能であ
る。移植の前に、血管移植片を0.9％塩溶液中で
これを数回取り替えながら洗浄し、そして次に少
量のヘパリン化食塩溶液に浸漬する。移植は血管
外科における標準的方法により行う。トリトンＸ
−100に４日間暴露する代りに、トリトンＸ−100
に１日間暴露し、次に１％ドデシル硫酸ナトリウ
ムに３日間暴露することもできる。

これらの処理における相違は組織学的測的によ
つては明らかでないが、移植された細胞性、血管
性、細胞外マトリクスの再細胞形成及びターンオ
ーバーにおいて重要であろう。

例 ２ ヒトのへその緒を、分娩直後の胎盤から切り取
つた後凍結する。損傷された緒又はその他不適当
な緒は廃棄する。さらに処理することが適当であ
ると認められる緒を、無菌的に観察しながらへそ
の緒の片方にカニユーレを付け、そして再循環的
組織をかん流することができ、同時にかん流液に
組織をひたすことができる装置に連結した。次
に、１％トリトンＸ−100の無菌溶液を、カニユ
ーレを付した緒を通して数時間ゆつくりとかん流
する。第１のかん流液を廃棄した後、PH7.5の燐
酸緩衝化生理的塩溶液中0.02％ナトリウムアジ
ド、１ｍＭジナトリウムメチレンジアミノテトラ
アセテート、１ｍＭのＮ−エチルマレイミド、及
び0.5ｍＭフエニルメチルスルホニルフルオリド
を含有する１％トリトンＸ−100と取り替え、こ
れを緒を通して24時間循環せしめる。この溶液を
新鮮な同一の溶液と取り替え、さらに１日間かん
流を続ける。３日目に、かん流液を、１％ドデシ
ル硫酸ナトリウム、0.02％ナトリウムアジドを含
有しそして燐酸緩衝化塩溶液により320ミリオス
モルに調整された溶液と取り替える。この溶液
を、へその緒を通して毎日取り替えながら３日間
かん流する。４回目の24時間の終点において、へ
その緒を、フイルターにより無菌化した逆浸透水
により、洗剤の存在（泡）が視覚的に観察できな
くなるまで洗浄する。この方法は非循環的かん流
法により行う。次に、へその緒をPH7.5に燐酸緩
衝化された生理的塩溶液にもどし、そして活性炭
フイルターを用いながら循環法によりかん流し、
そして次に小粒子フイルターにより最後の痕跡の
洗剤を除去する。この操作に続いて、内側にステ
ンレス鋼網心を入れて、0.1〜0.5バールの圧力に
おいて、１％グルタルアルデヒド及び１％塩化ナ
トリウムを含有する溶液を用いて引延し固定を行
う。この引延し固定段階は室温において24時間以
内で行う。固定の後、過された逆浸透水で洗浄
し、そしてキヤツピング、すなわち分離されたヒ
トへその緒の細胞外マトリクスが水中アミノ酸又
は蛋白質の溶液に暴露され、その結果これらが露
出したグルタルアルデヒド部位に結合し、表面の
変性と反応性部位のカバリングが同時に達成され
るような方法を行う。このキヤツピング浴から材
料を洗浄浴に返し、そして次に最終貯蔵溶液中に
入れる。外科手術のための調製に際し、ヒトへそ
の緒細胞外マトリクスを貯蔵溶液から取り出し、
そして無菌塩水で洗浄しそしてひたし、そして次
にヘパリン化無菌塩水で洗浄する。すべての操作
は無菌条件下で行い、すべての装置はオートクレ
ーブ殺菌し、すべての溶液はオートクレーブ殺菌
又はフイルター除菌する。

例 ３ 剖検に際してヒトの心臓弁を無菌技法を用いて
注意深く摘出し、そして付着しているすべての組
織を除去する。次に、弁を、例１に示した溶液中
に、同じ順序及び同様の時間にわたつて浮べる。
機械的なみがき、及びブラシ処理により周囲に存
在する筋組織の残留物を除去する。次に弁を、洗
浄されそして殺菌された適当な貯蔵器中に浸漬す
る。すべての仕事をフイルター及びUV殺菌され
た空気層流を有するフード中で行う。

例 ４ 管状組織、例えば血管及び複合弁をこの方法に
より処理して対応する無細胞マトリクス材料を得
ることができるのみならず、膜状組織シート、例
えば心膜、網、腸間膜、結膜等、剖検の際にヒト
から得たもの、屠殺場でウシ、ブタ、ヒツジ等か
ら得たもの、又は実験において大実験室動物から
得たものを、実質上同様にして処理することがで
きる。筋組織が結合組織マトリクスに隣接してい
る場合には、追加の機械的操作、例えば層の切断
及び筋組織残留物を除去するための引つかきが必
要となる。これらの操作は、洗剤抽出操作が完了
する前、操作中又はその後に行うことができる。

例 ５ 骨の小片、軟骨の薄片及び靭帯から、例１に記
載したのと同じ方法によつて細胞を除去し、そし
て得られた細胞外骨、軟骨及び靭帯マトリクス材
料を骨及び軟骨の脊柱再構成の外科的融合におい
て使用する。この発明の方法中に骨の無機成分を
無傷の状態に保持するため、使用する溶液をヒド
ロキシアパタイトで飽和する。これはこの材料を
負荷したカートリツジを通すことにより行う。

例 ６ ヒトの歯の再移植はこの発明の方法の他の応用
である。ここでは、抜き取つた、又は裂離した歯
を例１において上記した方法と同様の溶液で逐次
処理する。歯の冠に小孔をあけ、そしてこの孔を
通して歯根を介して、歯が入れられた外浴から洗
剤液を吸い込む。歯の鉱物質を浪費しないため
に、ヒドロキシアパタイト又はフルオロアパタイ
トを抽出剤と接触するように置く。十分洗浄工程
が抽出剤のすべての痕跡を除去する。最後に、再
移植の前に殺菌を行う。歯科室においてこの方法
を行うことを可能にするためにキツトを開発する
ことができる。

例 ７ 屠殺場においてブタから皮膚を得る場合、40℃
を超える熱水を動物にかけないことが重要であ
る。死後できるだけ早く全皮を得、そして実験室
に運び、６インチ幅のストリツプに切断し、そし
て１％トリトンＸ−100溶液を用いて機械的に洗
浄する。次に、かみそりにより毛を除去し、そし
てストリツプを１％ドデシル硫酸ナトリウム溶液
（ストリツプの体積の約10倍）に浸漬する。ドデ
シル硫酸ナトリウム溶液を合計144時間にわたつ
て48時間ごとに取り替え、そして同時にストリツ
プを浴壁にこすりつけ、存在するかもしれない色
素及び皮下脂肪組織の残存物と共にケラチン層を
除去する。この時点で皮膚のストリツプは完全に
白色であるが、物理的強さ、寸法及び一般的外観
に関し、そのもとの性質を保持している。こんど
はストリツプを皮膚切除器（デルマトーム）で割
り、そして約1000μｍ厚の上層をフイルターによ
り無菌化した逆浸透水により十分に洗浄する。次
に、洗浄したストリツプを70％エタノールに144
時間浸漬し、そしてこのアルコールを48時間ごと
に取り替える。この処理の終点において、ストリ
ツプを逆浸透水により再度洗浄し、そして次に１
％グルタルアルデヒドの浴に24時間浸漬する。こ
の後、周到な無菌条件を用いて無菌RO水により
過剰のグルタルアルデヒドを洗浄除去する。次に
このストリツプを引き延ばした平な状態で凍結乾
燥し、そしてエチレンオキシド殺菌したプラスチ
ツクバツグに詰める。この方法に代えて、ブタ皮
膚の細胞外マトリクスをグルタルアルデヒド段階
の前に凍結乾燥し、そしてこの段階で凍結乾燥
し、次にエチレンオキシド殺菌し（＜40℃）そし
て無菌プラスチツクバツグに詰めることができ
る。

凍結乾燥したブタ皮膚細胞外マトリクスは、乾
燥状態で冷暗所に保持された場合、無限の商品寿
命を有する。材料の再構成は抗生物質を含有する
無菌塩溶液中に浸漬することによつて行われる。
この材料は、広範囲の第３度の火傷の一時的被覆
のために使用することができる。

例 ８ 屠殺された動物から新しく得られ、洗浄され、
そして長手方向に切り裂かれ、次に粘膜組織のほ
とんどを除去するために内側がみがかれた小腸の
片から火傷被覆材を製造することができる。次
に、これらの前洗浄された小腸ストリツプを例７
に記載したのと同様にしてドデシル硫酸ナトリウ
ム溶液に浸漬する。この洗剤暴露期間の終点にお
いて、ストリツプの両側を磨き付着している平滑
筋層の残留物を除去する。次に、得られた消化管
細胞外マトリクス材料を例 に記載したようにア
ルコールに浸漬し、そして無菌RO水により十分
に洗浄する。この処理に続いて、30〜50％のエタ
ノールを含有する１％グルタルアルデヒド溶液に
浸漬する。この溶液は混合された固定無菌及び貯
蔵溶液である。

再構成のために、消化管細胞外マトリクススト
リツプは食塩溶液に浸漬し、この溶液を数回交換
する。最後に、ストリツプを抗生物質食塩溶液に
浸漬し、そして大範囲の第３度火傷に湿適用す
る。

例 ９ 無細胞血管マトリクス（AVM）を次のように
して製造する。

天然の頚動脈の給源として成グレイハウンドを
使用する。この動物にキシラジン（xyiazine）
（1.0mg／1b）を前投与し、そしてペントバルビト
ールナトリウム（11.0mg／1b）の静脈内投与によ
り麻酔した。動物に挿管し、そしてボリユームベ
ンチレーター（ハーバードポンプ）上に置く。同
頚動脈管を動員し、そして１つの中線切開により
無菌的外科手法を用いて採取した。外移植された
頚動脈は分枝しておらず、そして平均３〜４mmの
外直径及び12〜15cmの長さを有した。この動脈管
を食塩溶液で洗浄した後洗剤処理する。動脈管を
１％トリトンＸ−100、0.02％ナトリウムアジド、
新しく溶解した２ｍＭフエニルメチルスルホニル
フルオリド（PMSF）、５ｍＭのMgCl₂中にて室
温で１時間インキユベートした。動脈管を１時間
ごとに３時間にわたり新鮮な同一溶液に移した。
トリトン処理の後、動脈管を１％ドデシル硫酸ナ
トリウム（SDS）に72時間インキユベートし、毎
日交換した。次に、得られたAVMを、まず蒸留
水中で、次に70％エタノール中で24時間にわたり
十分に洗浄することにより残留洗剤のすべての痕
跡を除去した。架橋すべきAVMを蒸留水中で再
水和し、さらに処理した。洗剤処理、並びに水及
びエタノール洗浄を、回転シエーカー上で滑動す
ることにより行つた。動脈管を、300mlの溶液中
で８〜12ロツトで行つた。これらの動脈管は、第
１表において「抽出・非架橋」と記載する。

上記の抽出されたイヌの頚動脈管の幾つかを、
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
−カルボジイミドHClの１％溶液中に25℃にて60
分間にわたつて浸漬し、そして水で洗浄し、その
後でこれらを５％グリシン溶液、又は部分的にＮ
−脱硫酸されたヘパリンの５％溶液のいずれかに
暴露する。これらの処理の後に、蒸留水、そして
次に塩溶液、次に水中で十分に洗浄した。この処
理の後、化学的に変性された無細胞血管マトリク
ス材料を、蒸留水及びヘパリン化食塩溶液中で前
移植洗浄するまで、70％エタノール中で貯蔵す
る。カルボジイミド処理された動脈管を第１表に
おいて「抽出・架橋」と記載し、そしてグループ
は動脈管のヘパリン化され処理されたバツチで
ある。

外科手術法 移植片の収集 成グレイハウンドを、ペントバルビタールナト
リウムの静脈内注射により麻酔し、次にＴ−61静
死剤により静死させた。

首の前側中線切開を行い、胸部から甲状動脈分
岐までの右及び左の全頚動脈管の両側切離を可能
にした。頚動脈管を摘出し、そしてヘパリン化食
塩水で十分に洗浄した。

各外科移植片を個々にヘパリン化食塩溶液に入
れ、そしてラベルを付した後冷蔵した。すべての
外移植片をできるだけ迅速に氷上に移し、さらに
処理した。

使用した移植片の平均長さは10〜15cmであり、
これを後で約５cmの断片に切断した。

外科的移植 体重20〜40Kgの成雄雑種犬に、手術に先立ち３
日間毎日300mgのアスピリンを与え、そして予定
された手術前24時間断食させ、前麻酔としてケタ
ミンHCl（100mg）を筋肉内に投与した。ペントバ
ルビタールナトリウム（20mg／Kg体重）の静脈内
注射により麻酔を行つた。静脈滴注ユニツトを置
き、手術中の液体置換として５％グルコースを含
む乳酸化リンゲル液を用いた。通常、各犬は手術
中及び術後に500〜1000mlを受理した。気管内チ
ユーブを入れ、そして人工呼吸器に連結した。首
部をそり、そしてブラシ洗浄及びベタジン溶液の
適用を５分間行うことによつて無菌手術の用意を
行つた。無菌ドレープを置き、そして他の器具を
セツトした。標準的無菌技法を用いながら首に腹
側中線切開を行い、右総動脈（right common
carotid、RCC）を露出した。RCCの短い長さの
切除に続き、２％リドカインHClの局所適用を行
つた後、ストラタム−ゴウルド（Stratham−
Gould）流れ検知子及び流量計SP2204を用いて
血流速定値を記録した。RCCの切除を甲状動脈
分岐におよそ15〜20cm近くまで拡大した。移植片
が位置すべき領域の内側及び外側に一時的動脈瘤
クリツプを適用した。次に、クリツプ間において
RCCを鋭利な虹彩鋏できれいに切断し、そして
動脈管をヘパリン化食塩水で洗浄した。

ザイス手術用顕微鏡を用いて、移植片及び頚動
脈端を手入れし、そして間置端対端配置のために
適合させた。移植片の長さは約５cmであつた。標
準的微小血管技法を用いて、９−０単糸ナイロン
上135ミクロン針を用いながら端対端吻合を行つ
た。各吻合のために16中断縫合（interrupted
sutures）を置いた。空気を除去するために逆流
かん流技法を用い、そして宿主及び移植片動脈管
の最終再かん流を行つた。２％リドカインHClの
局所適用に続いて、移植片の再かん流の後他方の
血流測定を記録した。比較のため再かん流後の移
植片の長さを測定した。吸収性ポリグルコール酸
縫合材料により閉じる前にバシトラシン溶液を傷
の内又は周囲に自由に適用した。犬は600000ユニ
ツトのペニシリンＧプロカイル、術後５日間にわ
たる毎日0.75ｇのジヒドロストレプトマイシンサ
ルフエート、術後５日間にわたる毎日300mgのア
スピリン、及び術後30日間にわたる毎日300mgの
アスピリンを与えられた。

移植片の収得 最初の手術の３ケ月（90日）目に、各犬を24時
間絶食させた後移植片を収得した。

ケタミンHCl前麻酔及びペントバルビタールナ
トリウム麻酔の後、古い中線切開部を再切開し、
RCC及びLCCの両側切離を可能にした。各頚動
脈の短い長さの切離を極近位領域において行う移
植片の開放性を決定し、そしてリドカインの局所
適用の後RCC（移植）及びLCC（対照）の血流測
定を記録した。移植片を傷つけないように十分に
注意深く、移植片を含むRCの十分な長さを切断
して、かん流−固定方法を促進し、そしてかん流
−固定中における細動脈及び外膜管を通しての血
の逆流に対する保険とする。

移植片の各端から３〜５cm残して、甲状分岐の
近位でそれに隣接して宿主の頚動脈に鉗子を適用
する。次に、胸部に極めて近くでRCCを結紮す
る。結紮部の移植片側に動脈カテーテルを挿入
し、そして他の結紮部と正しい位置に強く結びつ
ける。カテーテルを、60c.c.のシリンジを末端に有
する３方止コツクと直接連結する。挿入した場
合、シリンジ及びカテーテルに洗浄媒体（ヘパリ
ン化食塩溶液）を満たす。遠位鉗子が開放される
場合、一定の平衡圧がシリンジに適用され、そし
てライン内圧力計により300mmHgのレベルにモニ
ターされる。第１シリンジが空になる場合、遠位
鉗子が止コツクと同時に閉じられ、内部圧がトラ
ツプされる。第２洗浄シリンジを止コツクに連結
し、そして適用されたシリンジ圧をその圧に維持
しながら遠位鉗子及び止コツクを再び開く。60c.c.
シリンジによる４回の洗浄が行われるまでこれを
反復する。第５シリンジはカルノフスキーの固定
剤を含有し、そして先行する４回の洗浄と全く同
様にかん流される。但し、シリンジが空になると
き、遠位鉗子に加えて移植片に３〜５cm近位に他
の鉗子が適用される。固定剤がセグメント中に加
圧状態でトラツプされ、そしてこのセグメントの
外側をカルノフスキー中に15〜20分間浸漬する間
そのまま保持される。固定剤の最終かん流の直後
に犬を静死させる。

最初の固定期間の後、セグメントを無傷のまま
でクランプにより取り出し、そして１時間固定浴
に入れ、この後切断し、又は冷固定剤中に貯蔵し
て後で切断する。切断しそして後で電子顕微鏡観
察する場合に適切な方向に保持するために近位端
又は遠位端を標識する。

移植片の切断 宿主の動脈端を伴う無傷の移植片を、カルフフ
スキー固定剤にひたしたガーゼに横たえる。近位
端から始めて、大きな止血鉗子にかたく固定され
た新しい両刃かみそりにより、標本を近位吻合部
から約15cmのところで切断（transsect）する。
この切断を、標本にそつて５〜８mm間隔で続け
る。各吻合部が宿主及び移植片の両者の十分な領
域を示すことを保証するように各切断が行われる
ように最初に注意深く計画する。各セクシヨンの
壁を長手方向に切断し、全管腔表面を露出させ
る。露出された管腔をさらに２回長手方向に切断
し、露出された管腔表面の３個の同一の標本にす
る。これらの片を、小径の培養チユーブの底に近
位端が置かれるように置く。ゆるやかに詰められ
たガーゼ片を標本の上に挿入しチユーブ中でのそ
の方向を保持する。チユーブを新鮮で透明なカル
ノフスキー固定剤で満たし、そしてチユーブの底
部から空気を除去する。次にチユーブをラベル
し、電子顕微鏡観察のために調製するまで冷蔵庫
に貯蔵する。

【表】 例９は、この発明の洗剤処理血管移植片を体移
植片として使用した場合の成功を例示するもので
ある。しかしながら、処理されたすべてのイヌが
生存したわけではないことに注意すべきである。
試験を反復する場合、幾つかのケースにおいて、
そしてある試行中に、わずか68％の移植片が開放
状態に維持される。失敗した移植片の幾つかは物
理的徴候を示し、これは失敗が微小手術技法の使
用により訂正し得る縫合過程に関連する機械的問
題に基くと信じられる。移植片が頚動脈のために
移植される場合、微小手術技法が好ましい。

例９は変更された洗剤技法を用いて反復するこ
とができる。例えば供与体頚動脈管をグレイハウ
ンド犬から外科的に取り出し、塩溶液で洗浄し、
そして凍結することができる。第２段階におい
て、動脈管を解凍し、そして３％トリトンＸ−
100、0.2％ナトリウムアジド、新しく溶解した２
ｍＭ PMSFに３時間インキユベートし、この新
鮮な溶液をさらに３時間使用し、次に溶液の第３
次交換を行い、室温にて一夜暴露する。１％トリ
トンＸ−100、0.02％ナトリウムアジド、２ｍＭ
PMSF、20ｍＭ燐酸緩衝液（PH6.0）中で３時
間室温において脾臓DNアーゼ（10マイクログ
ラム／ml）と共にインキユベートする。次に４％
デオキシコール酸中で室温にて一夜インキユベー
トする。次に材料を１％炭酸水素ナトリウムで洗
浄し、次に50％エタノールで洗浄してデオキシコ
ール酸を除去する。蒸留水中で水和を行い、次に
所望により表面又は架橋変形を行う。

架橋は、１％グルタルアルデヒドに中性PHにて
24時間室温において暴露し、次に移植片を蒸留水
にて数回洗浄することにより行う。残留アルデヒ
ドは、20mlの硼酸緩衝液（PH９）中200mgのナト
リウムボロハイドレートで、室温にて１時間還元
し、次に蒸留水で洗浄することによりブロツクす
ることができる。変性され架橋された補填材は、
外科的使用のために必要とされるまで70％エタノ
ール中に貯蔵することができる。この方法に従つ
て調製された移植片はイヌにおける生物学的移植
片として頚動脈代替物として有用であることが見
出される。

この発明の特定の例を記載したが、多くの変法
が可能であろう。細胞不含マトリクスの体移植片
を体に移植する前に洗剤処理し、抗原性材料を除
去し、なお体構造体として機能することができる
前形成された材料を得ることが重要である。

12〜15cmの長さの血管移植片が0.5〜60mmの口
径を有することが好ましく、又はより小さい直径
を有することが好ましく、0.5〜４mmの範囲が最
も好ましい。このような管状構造は、体移植片と
して使用される場合に置き代えられる管の組織構
造と一致する。これらは細胞の再増殖を可能に
し、そして非常に多くの場合に高い開放性をもた
らす。同様に、他の体移植片が、体に移植される
前に細胞不含マトリクスとして形成された場合、
すでに記載したすべての体チユーブ、心臓内膜及
び層、皮膚等を含む体の部分を修復するために非
常に有用である。哺乳動物体にマトリクス構造を
挿入するために標準的移植手術法を用いることが
できる。