JPH05503003A - 潜在性関与ペプチドおよびその使用 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 潜在性関与ペプチドおよびその使用 発明の分野 本発明は、潜在性に関与しているペプチド、および治療学的に有意な量でそれを 製造するための手段および方法、ならびに該ペプチドの利用法に関する。

背景技術の説明 βトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−β群）は多機能性のサイトカインで あり、造血、神経、心臓、線維芽細胞および膿瘍細胞を含む多くの型の細胞によ り産生され、様々な組織起源に由来する細胞の成長および分化を調節することか でき［５ｐｏｒｎら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３３°５３２　（１９８６）］、種 々のストローマ要素の形成および同化を刺激することができる。免疫学的な視点 から特に重要なものとしてはＴＧＦ−βの強力な免疫抑制活性が挙げられ、これ には次のものが含まれる　リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）および細胞毒性 Ｔリンパ成長因子に応答する抗原−活性化されたＢリンパ球の増殖の阻害［Ｐ］ がＴＧＦ−βを産生するという観察は、正常な免疫学的監視を避けるためのこれ ら腫瘍の機序か存在しうろことを示唆する。この負の免疫調節は、ある種の形質 転換されたセルラインが自己分泌の様式でＴＧＦ−βに応答する能力を喪失した という観察［Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら。

Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１０５　：　９６５　（１９８７）　＋　ＭｃＭａｈ ｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４６：　４６６５　（１９８６）］およびＴＧ Ｆ−βがストローマ形成を刺激し、腫瘍の免疫監視を低下させるという観察と組 み合わせると、新生物の調節解現在、少なくとも５形態のＴＧＦ−β、即ちＴＧ Ｆ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４およびＴＧＦ−β５が同 定されている。この群のＴＧ、Ｆ−βを種々の種（例えば、ヒト、マウス、ミド リザル、ブタ、ウシ、ニワトリおよびカエル）から、および種々の体供給源（例 えば、骨、血小板または胎盤）から精製するための、組換え細胞培養においてそ れを産生させるための、およびその活性２月ｌＯ日公開）、Ｎｏ、　１６９．０ １６　（１９８６年１月２２日公開）、Ｎｏ、２６８．５６１　（１９８８年５ 月２５日公開）、およびＮｏ、２６７．４６３　（１９８８年５月１８日公開） 、米国特許Ｎ　ｏ、　４．７７４．３２２　；　Ｃｈｅｉｒｅｔｚら［Ｃｅ１ｌ 　４８　：　４０９−４１５　（１９８７）３　：　Ｊａ７）］　；　Ｄｅｒｙ ｎｃｋら［Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、１５　：　３１８８−３１８９ 　（１９８７）］　：　Ｄｅｒｙｎｃｋら［Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、１ ５　：　３１８７　（１９８７）］　；　Ｄｅｒｙｎｃｋら［ＥＭＢＯＪ、７： 　３７３７−３７４３　（１９８ｇ）Ｉ　；　５ｅｙｅｄｉｎら［Ｊ、Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ、２６１　：　５６９３−５６９５　（１９８６）コ；　Ｍａｄｉｓ ｅｎら［い透η　１−８　（１９８８）］ならびにＲａｎｋｓらｊＰｒｏｃ、　 Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　８５　：　７９−８２　（１９ ８ｇ）コを参照。

ＴＧＦ−β１の活性型は、３９０アミノ酸前駆体のカルボキン末端１１２アミノ 酸の二世体化により形成されるホモ二量体である：Ｄｅｒｙｎｃｋら、　Ｎａｔ ｕｒｅ　（止揚）〕。ＴＧＦ−β２は４１４アミノ酸の前駆体型を有しており、 ＴＧＦ−βｌの活性型と約７０％の相同性を有するカルボキン末端１１２アミノ 酸がらホモ二量体へとブロセ／ングされるＩａｒｑｕａｒｄｔら、Ｊ、Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ、２６２：　１２１２７　（１９８７）］。ＴＧ６：　１６３３　（ ＋９８７冗から精製されており、組換えヒトＴＧＦ−β２がクローン化されてい る［ｄｅＭａｒｔｌｎら（止揚）］。組換えＴＧＦ−β１がクローン化され［Ｄ ｅｒｙｎｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ　（止揚）］、チャイニーズハム最も最近になっ て発見された形態のＴＧＦ−βであるＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４およびＴＧＦ −β５はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより同定された。こ れらの３種の推定タンパク質のどれも天然の供給源から単離されていないが、ノ ーザン・プロットは対応するｍＲＮＡの発現を示す。ヒトおよびブタのＴＧＦ− β３がクローン化され、既に記載されている［Ｄｅｒｙｎｃｋら、　ＥＭＢＯＪ 、７　：　３７３７−３７４３　（１９８８）：　ｔｅｎ　Ｄｉｊｋｅら、Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　ＵＳＡ亜：　４７１５　（１９８８ ）］。ＴＧＦ−β４およびＴＧＦ−β５は、それぞれニワトリ軟骨細胞ｃＤＮＡ ライブラリーからＣＪａｋｏｗｌｅｗら、　Ｍｏ１ｅｃＥｎｄｏｃｒｉｎｏ１． ２　：　１１８６−１１９５　（１９８８）］、およびカエル卵母細胞ｃＤＮＡ ライブラリーからクローン化された。■またはそれ以上の別の型のＴＧＦ−β配 列から得たプローブを用いてカエル卵母細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ ングすることができる。ＴＧＦ−β４ｍＲＮＡはニワｌ−ＩＪ胚軟骨細胞におい て検出可能であるが、成長している胚またはニワトリ胚線維芽細胞におけるＴＧ Ｆ−β３ｍＲＮＡよりはるかに少ない。ＴＧＦ−β５ｍＲＮＡは神経胚状態を過 ぎたカエル胚およびアフリカッメガエルのオタマジャクシ（Ｘ　Ｔ　Ｃ）細胞に おいて発現される。

ＴＧＦ−βは、多種多様の正常および新生細胞の両方に対して数多くの調節作用 を有することが示されている。ＴＧＦ−βは、細胞の増殖、分化、および細胞機 能における他の重要な過程を刺激または阻害することができるので、多機能性で ある［Ｍ、５ｐｏｒｎ、　５ｃｉｅｎｃｅ２３３　：　５３２　（１９８６）］ 。ＴＧＦ−βおよびその作用の総説については、びＲｏｂｅｒｔｓ′ＬＮａｔｕ ｒｅ　３３２　：　２１７−２１９　（１９８８）］およびＲｏｂｅｒｔｓらＩ Ｒｅｃｅｎｔ天然のＴＧＦ−β１は生物学的に潜在性の形態で造られることが多 く（この形態に限定されるわけではない）、変性剤、例えば尿素、熱、プラスミ ン、高塩、エンドグリコンダーゼＦ、カテプンンＤ１１Ｖ型コラゲナーゼ、共培 養された内皮細胞および周皮細抱、ウロキナーゼなどのプラスミノーゲン活性化 因子、刺激された破骨細胞、または両極端のｐＨなどによってインビトロで活性 化することがで形質転換およびＫｉｒｓｔｅｎ肉騰ウィルスで形質転換された正 常ラノトβ”ｉ　、’　Ｋｅｓｋｉ−Ｏｊａら［Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１０ ７直６　Ｐａｒｔ　３）、１９８８．　５０ａ；”ヒト肺腺癌セルラインからの 潜在性ＴＧＦ−β”］　；　ＭｉｙａｚｏｎｏおよびＨｅ１ｄｉｎ［Ｊ、Ｃｅ１ １．Ｂｉｏｃｈｅｍ、５ｕｐｐ、　９　（１３ｐａｒｔ　Ｂ）　１９８９．　ｐ 、９２］ならひにＭｉｙａｚｏｎｏおよびＨｅ１ｄｉｎ［Ｎａｔｕｒｅ　３３ｇ 　：　１５Ｂ−１６０（１９８９）　；　”ヒト血小板からの潜在性ＴＧＦ−β およびその炭水化物構造”］：　Ｐｉｒｃｈｅｒら［見ｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐ ｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、１３６　：　３０−３７　（１９８６）　；” ヒト血液血小板からの潜在性ＴＧＦ−β”］を参照。さらに、Ｌａｗｒｅｎｃｅ ら［Ｊ、　Ｃｅ１ｌ。

Ｍｅｅｔｉｎｇ　Ａｂｓｔｒａｃｔ　（１９８９年５月１８−２０日）ｉ　：　 ＤａｎｉｅｌｐｏｕｒらＥＪ、　Ｃｅ１１．　ＰｈＬ−１２よ−１３８：　７９ −８６　（１９＆９）コ　；　ＷａｋｅｆｉｅｌｄらＣＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 、２６３　：　７６４６−７６５４　（１９８８）ｉ　：およびＭｉｙａｚｏｎ ｏら［Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、　２６３：　６４０７−６４１５（１９８Ｂ） ］を祭照。

いくつかのグループがヒト血小板から分泌された潜在型ＴＧＦ−βｌの特徴を調 へている。Ｐｉｒｃｈｅｒら（１９８６、止揚）は、これか４００Ｋｄの見かけ 分子量を有すると記載した。さらに最近になって、これは約２３５　Ｋｄの３成 分複合体として特徴付けられている：これによれば、活性なＴＧＦ−β１（２５ Ｋｄ二量体）はプロセシングされた前駆体の残りの部分（７５Ｋｄ二世体）と非 共有結合によって結合しており、これが次に１２５〜１６０　Ｋｄの非関連タン パク質にジスルフィド結合している［Ｖａｋｅｆ　１ｅｌｄら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ、　２６３　（止揚）　ＨＭｉｙａｚｏｎｏら（止揚）　：　Ｍｉｙ ａｚｏｎｏら（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、５ｕｐｐ、　Ｑ　（１２Ｐａｒ ｔ＾）、１９８ｇ、ｐ、２Ｑｏ）；　Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら（Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、５ｕｐｐ１．　１１Ａ・０．４６　（１９８７）コ。１２５〜１ ６０　Ｋｄの結合タンパク質の機能は解明されていない。最近の特徴付けにより 、これは少なくとも１４のＥＧＦ様の繰返しと６つの潜在的なＮ−グリコジル化 部位およびカルシウム結合ドメインを含むことがわかっている［Ｋａｎｚａｋｉ ら、”ＴＧＦ−β”、ＮＹ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｍｅｅｔｉｎｇ　ａｂｓｔｒａ ｃｔ　（１９８９年５月１８−２０日）：　Ｍｉｙａｚｏｎｏ、”Ｔ　Ｇ　Ｆ　 −β″、ＮＹ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｍｅｅｔｉｎｇ　ａｂｓｔｒａｃｔ　（１９ ８９年５月１８−２０日）］。培養中に多くの細胞により分泌される潜在性ＴＧ Ｆ−βは類似の構造を有しており二Ｗａｋｅｆ　１ｅｌｄら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、　（止揚）］、これか、ＴＧＦ−βｌがインビボで標的細胞によって 恐らく最初に認識されるであろう形態である。ＴＧＦ−βの前駆体の残余部分が 前駆体領域における配列の保存に基づいて重要かつ独立した生物学的機能を有す るかもしれないことが示唆されていたＥＲｏｂｅｒｔｓら、　Ｒｅｃｅｎｔ　Ｐ ｒｏｇｅｒｓｓ　ｉｎ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（止揚）］。さら に、前駆体ＴＧＦ−β１の３３位における突然変異が、成熟ＴＧＦ−β１の収量 を高めることが報告されており、前駆体の”プロ”領域の装置化が潜在性を付与 するのに必要であると示唆されている［Ｂｒｕｎｎｅｒら。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６４　：　１３６６０−１３６６４　（１９８９ ）］。

高分子量複合体としてブタ血小板から精製された潜在性型のＴＧＦ−βが分析さ れた。成熟ＴＧＦ−β二量体は、非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で２１０Ｋｄの成分 に非共有結合によって結合する。ジチオトレイトールによる還元により、この大 きな成分は４０Ｋｄおよ潜在性ＴＧＦ−βを形成しうる別の血小板由来分子が日 本特許公開Ｎ　ｏ、　６３−１９６６００（１９８８年８月１５日公開）に記載 されている。これは約４６Ｋｄの糖タンパク質サブユニットであり、４またはそ れ以上の分子と会合して可逆的に面小板上のＴＧＦ−βに結合しくＴＧＦ−β活 性をコントロールする）、熱および酸に安定であり、ジチオトレイトールまたは トリプシンで処理したときにはそのＴＧＦ−β阻害活性を失う。さらに別の血小 板由来の潜在性ＴＧＦ−βが日本特許公開Ｎｏ、　６３−１５０３００（１９８ ８年６月２２日公開）に開示されている。この糖タンパク質は約４４　Ｋｄの分 子量を有しており、ＴＧＦ−βに可逆的に結合してＴＧＦ−β活性を阻害し、熱 および酸に安定であり、ジチオトレイトールま°たはトリプシンによる処理によ ってＴＧＦ−β阻害活性を失う。

さらに、約４４０ｋｄの分子量を有するラット血小板由来のＴＧＦ−βに対する 遮蔽タンパク質がＮａｋａｍｕｒａら［Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　 Ｒｅｓ。

Ｃｏ＋ｎ＋ｎｕｎ、１４１　：　１７６−１８４　（１９８６）］により開示さ れている。さらに分析することにより、この遮蔽タンパク質は、ジスルフィド結 合により結合した３９Ｋｄおよび１０５〜１２０Ｋｄの２つのサブユニットから なり１８０〜２１０Ｋｄの複合体を形成していることが明らかになった［０ｋａ ｄａら、　Ｃｅ１ｌ　５ｔｒｕｃｔ、Ｆｕｎｃｔ、１３（６）：　６１５　（１ ９８ｇ）；　０ｋａｄａら、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２４２：　２４０− ２４４　（１９８９）コ。この３９ＫｄサブユニツトのＮ末端配列が、ＴＧＦ− β前駆体のＮ末端部分（転写された前駆体の開始部位から３０残基分）と同一で あることが見い出された。

１８０〜２１０Ｋｄ成分は遮蔽活性を有することが見い出されたが、３９Ｋｄお よび１０５〜ｌ　２０　Ｋｄ酸成分活性を有さず、著者らは、その２４３頁にお いて１８０〜２１０Ｋｄ成分がＴＧＦ−βを遮蔽するための最小活性単位である と結論した。

インビボでの活性化の機序はわかっていないが、タンパク質加水分解または解離 が関与しているのであろうＣＬｙｏｎｓら、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ１１０６：　 １６５９−１６６５　（１９８８）；　Ｋｅｓｋｉ−Ｏｊａら、　Ｊ、Ｃｅ１ｌ 　Ｂｉｏｃｈｅｍ、５ｕｐｐ１．　４ハ：　０．６０　（１９８７）コ。ＴＧＦ −βｌのレセプターはほとんどか偏在して発現されるので、ＴＧＦ−βｌの作用 に対する襟的限定はレセプターよりも活性化機序の存在または非存在によって規 定されているのかもしれないし１Ｊａｋｅｆ　１ｅｌｄら、　Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂ ｉｏｌ、１０５：　９６５−９７５　（１９８７）］、また、潜在性形態の活性 化がＴＧＦ−β１作用における主要な調節段階であろうと予測されている。

最近、血清中の潜在型ＴＧＦ−βか、トロンビン、好中球およびトリプシンを含 む血清エンドプロテアーゼを循環系がら除去することに関与している主要な血清 タンパク質であるα２−マクログロブリンに結合したＴＧＦ−βからなることが 報告された［０’　ＣｏｎｎｏｒおよびＷａｋｅｆｉｅｌｄ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ ｈｅｍ、２６２：　１４０９０−１４０９９　（１９８７）；　Ｈｕａｎｇら。

Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、４６（６）：　２０２４　（１９８７）；　）Ｉｕａｎｇら 、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｎ、２６３：　１５３５−１５４１　（１９８ｇ）Ｅ 。α２−マクログロブリンにょるＴＧＦ−βｌおよびＴＧＦ−β２活性の特異な 阻害が、Ｄａｎｉｅｌｐｏｕｒｔ４よび５ｐｏｒｎ［Ｊ。

Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３Ｂ：　８３　（１９８９）］により観察された 。ＴＧＦ−β１は血小板中にその前駆体のＮＨ２−末端部分とＴＧＦ−β１結合 タンパク賃を含む潜在性複合体で貯蔵され、モしてα２−マクログロブリンを含 む他のタンパク質かスカベンジャーとして作用し、放出されたＴＧＦ−β１を不 活性化しうるちのと仮定されている。最も最近の発見によれば、ＴＧＦ−βとα ２−マクログロブリンの相互作用は、以前に仮定されたようなＴＧＦ−βとα２ −マクログロブ９２１６体の除去を導かないことか示されている［Ｐｈ１ｌｉｐ およびＯ′Ｃｏｎｎｏｒ−ＭｃＣｏｕｒｔ、　”　Ｔ　Ｇ　Ｆ−β″、　）ＩＹ 　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｍｅｅｔｉｎｇ　ａｂｓｔｒａｃｔ　（１９８９年５月１ ８−２０日）］。著者らは、この複合体が、ＴＧＦ−βの内分泌作用において重 要な役割を果すＴＧＦ−βの循環潜在型を表すのであろうと示唆している。

全ＴＧＦ−β１前駆体の暗号領域は、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＧｅｎ ｔｒｙら（上掲）およびＬｙｏｎｓら、　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１０７　（ ６ｐａｒｔ３）　１９８ｇ、　５１ａ　；サルＴＧＦ−βに対してコにおいて、 また、ヒト腎ｒｓ　Ｌ：　（＋９８９）　；ヒトＴＧＦ−β１に対して］におい て成功裏に発現された。血小板ＴＧＦ−β１と同様に、組換えＴＧＦ−β１は生 物学的潜在型で分泌される。組換え潜在型は、活性化のために一時的な酸性化を 必要とする。イム／プロット分析およびゲル濾過により、組換え潜在性ＴＧＦ− βｌは１００　Ｋｄの複合体であり、ここで、活性な２５ＫｄのＴＧＦ−βはプ ロセシングされた前駆体の残りの７５Ｋｄと非共何結合によって結合し、これか ら生合成により切断されることか示される。血小板の潜在性複合体とは異なり、 組換えの潜在性複合体は１３５　Ｋｄ酸成分含んでいない。Ｇｅｎｔｒｙらは、 極めて安定に見えるトランスフエク７：ＩンされたＣＨＯ細胞の培養培地中に、 成熟ＴＧＦ−βを欠く前駆体配列を高レベルで検出した。

Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら［Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ　（上掲）］は、７５Ｋ ｄおよび２５Ｋｄ成分がジスルフィド結合により共有結合している潜在性ヒトＴ ＧＦ−β１の他の１００Ｋｄ種のほぼ等しい割合での分泌を観察した。

この分子種は固有の生物活性をほとんど持たないようであるが、時間とともに恐 らくはジスルフィド交換反応によって活性なＴＧＦ−β１をゆっくりと放出する 。同様のジスルフィド結合種がＴＧＦ−のか、もしくは細胞プロセシング機序の 過負荷のために蓄積した正常な生合成中間体であるのかは明らかでない。

また、最近になって潜在型のＴＧＦ−β２が適当なベクターでトランスフエタン ヨンされたＣｏＳ細胞において製造されているｒＭａｄｉｓｅｎら、　ＤＩＩＡ 　８：　２０５−２１２　（１９８９）］。さらに、著者らは、ＴＧＦ−β１の 潜在性関与ペプチドをコードしているＤＮＡを成熟ＴＧＦ−β２をフードしてい るＤＮＡに融合してＣＩ（○細胞において発現させると、活性化の後に成熟ＴＧ Ｆ−β２か分泌される結果になることを見い出した。即ち、ＴＧＦ−βｌのアミ ノ末端前駆体部分内に含まれるプロセシングシグナルは、成熟ＴＧＦ−β２の産 生において機能することができる。

ある著者らは、培養中の細胞および血小板の両方が酸処理により不可逆的に活性 化される潜在型のＴＧＦ−βを放出すると記載しているｊｇＬｙｏｎｓら、Ｊ、 Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、５ｕＰｌ）１．　Ｏ（１２ｐａｒｔ　Ａ）、１９８ ８年１月２４−３０日１゜他の者は、組換えならびに天然の潜在性ＴＧＦ−βに 関して、活性化が不可逆的であることから、複合体が解離したときの前駆体部分 の立体配座の変化が恐らく存在して、２５Ｋｄの活性分子がもはや前駆体部分に 結合しえないことを示唆している［ＬｙＯｎＳら。

び血小板腹合体の活性化を可逆的なものとして特徴付けている［ｆａｋｅｆｉｅ ｌｄら、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１９８９　（上掲）およびｗａｋｅ ｆ　１ｅｌｄら、睦ｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ　（上掲）コ。

外部投与および内部産生された活性なＴＧＦ−βの両者の作用に対するＴＧＦ− βの組換え潜在性関与ペプチドの明白な阻害効果に鑑みて、活性なＴＧＦ−βの 有害作用をインビボで阻害する際に使用するために治療学的に許容しうる供給源 から商業的に有用な量でこのようなペプチドを提供すること、即ち、他の天然（ 供給源）タンパク質を全く含まない潜在性関与ペプチドを提供することが本発明 の目的である。

また、潜在性関与ペプチドのアミノ酸配列および他の変異体（このペプチドの生 物学的活性に実質的に悪影響を及ぼさない）を製造することも本発明の目的であ る。

さらに、潜在性関与ペプチドを成熟ＴＧＦ−βと組合せることによって治療投与 用の潜在性ＴＧＦ−β型を製造することも本発明の目的である。

本発明のこれらおよびその他の目的は本明細書全体から明らかとなるであろう。

発明の要約 本発明は、非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥで測定したときに約７５，０００の分子量を 有し、成熟ＴＧＦ−βの生物学的活性に拮抗しうる潜在性関与ペプチドをコード している配列であって、成熟ＴＧＦ−βをコードしない配列を含有する単離され た核酸配列を提供するものである。

さらに、本発明は、上記の核酸配列を含有する発現ベクター（該配列は該ベクタ ーで形質転換された宿主によって認識される制御配列に機能的に結合している） 、および該発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供するものである。

別の態様においては、本発明は、前駆体ＴＧＦ−βに関連した性質を保持してい てＴＧＦ−βの生物学的活性に拮抗することが可能であるように、潜在性関与ペ プチドのアミノ酸配列を十分に複製するアミノ酸配列を有する潜在性関与ペプチ ドをコードしているＤＮＡ配列であって、成熟ＴＧＦ−βをコードしない配列を 含有する単離されたＤＮＡ配列を提供するものである。

さらに別の態様においては、本発明は、潜在性関与ペプチドの製造方法であって 、形質転換された宿主細胞を培養して宿主細胞培養物中でペプチドをコードして いる核酸を発現させることからなる方法を提供するものである。

他の態様においては、本発明は、供給源のタンパク質を全く含まない潜在性関与 ペプチドを提供するものである。

さらに他の態様においては、本発明は、薬学的に許容しうる担体中に治療学的有 効量の上記ペプチドを含有するＴＧＦ−β活性に拮抗させるのに有用な医薬組成 物を提供するものである。

また、別の態様においては、本発明は、この医薬組成物の有効量を哺乳動物に投 与することからなるＴＧＦ−βの活性に拮抗するための方法を提供するものであ る。

さらに、別の態様においては、本発明は、ＴＧＦ−β活性を有する医薬組成物で あって、薬学的に許容しうる担体中に治療学的有効量のペプチドと治療学的有効 量の成熟ＴＧＦ−βを含有するＴＧＦ−β活性を有するものとして有用な医薬組 成物を提供するものである。

また、他の態様においては、ＴＧＦ−β治療を必要としている哺乳動物の治療方 法であって、哺乳動物に治療学的有効量のペプチドと治療学的有効量の成熟ＴＧ Ｆ−βを投与することからなる方法が提供される。

さらに、他の態様においては、患者の血清中の成熟ＴＧＦ−βの存在によって検 出しつる状態の存在の診断方法であって、ラベルされた形態の本発明の潜在性関 与ペプチドを血清に加え、血清中のペプチドと成熟ＴＧＦ−βのラベルされた複 合体の存在を検出することからなる方法が提供される。

本発明によって、組換え法による熱−不安定な潜在性関与ペプチドおよび／また はその誘導体の製造、ならびにこのような製造に関係した産物および方法が可能 となる。本明細書に開示した方法によって製造される潜在性関与ペプチドは、外 因性または内因性供給源の由来を問わず、循環系、組織、もしくは他の部分にお ける過剰な活性ＴＧＦ−βを除去および不活性化することにより、ＴＧＦ−β活 性をフントロールするのに有用であると考えられる。これは、例えば、過剰な線 維症を特徴とするようなある種の疾患の病因にＴＧＦ−βの活性化が関係してい る状況において用いることができる。さらに、潜在性関与ペプチドは、ＴＧＦ− βによって引き起こされるかまたはＴＧＦ−βの産生に由来する他の有害な状態 を処置するのに、例えば、ＴＧＦ−βが関与する自己針ｉ・機序により自律的に 増殖する腫瘍の抑制において、もしくは免疫抑制の反転において有用である。本 ペプチドは診断薬としても使用することができる。

潜在性ＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−βの活性（成熟）部分および潜在性関与ペプチド を個々に発現および精製することにより組換えによって製造することができる。

共に加えると、これらのタンパク質は再会合して不活性な（潜在性の）複合体か 形成される。この複合体は、活性化が可能な部位にＴＧＦ−βを放出するのに有 用と考えられ、この潜在型を用いたときには、成熟ＴＧＦ−β単独を用いたとき に観察される活性スペクトルとは異なる活性スペクトルが観察されるであろう。

このような態様の１つにおいては、複合体を全身的に投与してＴＧＦ−βをその レセプター部位（活性化が起こっているのが普通である）に指向させ、これによ り所望でない全身滲出を防止し、免疫抑制および骨形成などの所望のＴＧＦ−β 活性を得る。

潜在性関与ペプチドの他の用途は当業者には明らかであろう。

図面の簡単な説明 図１は、潜在型のＴＧＦ−βおよびその標準的な命名法を示す。

完全長のプレプロＴＧＦ−β（単量体型であると二量体型であるとを問わない） を”前駆体”と呼ぶ。”潜在性関与ペプチド”の語は、組換えにより製造された 成熟ＴＧＦ−βを欠く潜在性ＴＧＦ−β複合体の部分を指す（ここで、組換え＊ 合体は”小さな潜在性ＴＧＦ−β？！！合体”および”ＴＧＦ−βジスルフィド 結合複合体”を含む）。インビボで産生された“大きな潜在性ＴＧＦ−β複合体 “中の潜在性関与ペプチドにジスルフィド結合している１２５〜１６０Ｋｄ結合 タンパク質は、”結合タンパク質”と呼ぶ。

図２は、潜在性関与ペプチド用の最終発現ベクターを構築するための出発ベクタ ーとして用いられるベクターｐｓＶＩ−ｔＰＡの構築を示すものである。

図３は、ベクターｐｓ　Ｖ　＋　２−ｔＰＡの構築を示すものである。

図４は、ベクターｐｓＶ１３−ｔＰＡの構築を示すものである。

図５は、ベクターｐｓＶＩ５−ｔＰＡの構築を示すものである。

図６は、ベクターｐｓｖ１６Ｂ−ｔＰＡの構築を示すものである。

図７は、潜在性関与ペプチドをフードしている遺伝子が好都合に挿入される一般 的な発現ベクターｐＳＶＩ５Ｂ５の構築を示すものである。

図８は、潜在性関与ペプチドの完全なヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列 を示すものである。ペプチドの予想アミノ酸をＤＮＡ配列の下に示し、ペプチド 配列のＮ−末端の最初の残基から数字を付している。成熟ＴＧＦ−β配列は含ま れていない。負の数はシグナル配列を示し、正の数は分泌ペプチドの配列を示す 。

図９は、哺乳動物宿主細胞を形質転換して潜在性関与ペプチドを産生させるため に用いるｐｓＶＩ５８５由来の発現ベクターｐｓＶ１６Ｂ−ＬＡＰ−ＡＲＧｉよ びｐｓＶ１６Ｂ−ＬＡＰ−３ＥＲの構築を示すものである。

図１０は、ミンク肺線維芽細胞検定法よって測定したときの生物活性ＴＧＦ−β の量（ｎｇ／ｍｌ）を、熱−活性化ＴＧＦ−β上清の希釈間の関数として（丸） 、およびこの熱−活性化ＴＧＦ−βに熱−不活性化した潜在性関与ペプチドを加 えたとき（破線を伴う四角）、もしくは未処理の潜在性関与ペプチドを加えたと きく実線を伴う四角）に分けて示すものである。

図１１は、ヒトＴ　Ｇ　’Ｆ−β１、ヒトＴＧＦ−β２、ヒトＴＧＦ−β３、ヒ ョフＴＧＦ−β４、およびカエルＴＧＦ−β５の配列を示すものである。

（以下、余白） 好ましい態様の説明 本明細書中で用いる”潜在性関与ペプチド”または”ＬＡＰ″は、非還元ゲルの ５ＤＳ−ＰＡＧＥで測定したときに約７５Ｋｄ（即ち、７５〜約７８Ｋｄ）の分 子量を有し、図８のアミノ酸配列を有する組換えによって製造されたＴＧＦ−β （即ち、ＴＧＦ−β群の任意のＴＧＦ−β）の前駆体部分、ならびに対応する組 換えＬＡＰの生物学的活性を有するそれらの類似体および変異体を指す。組換え ＬＡＰの生物学的活性は、成熟ＴＧＦ−βの生物学的活性に拮抗しつる任意の類 似体または変異体によって共有されている。示されている生物学的活性を持たな いＬＡＰ、例えば熱処理によって分解されたＬＡＰは除外される。このＬＡＰは 二量体分子であり、還元５ＤＳ−ＰＡＧＥで約３７〜３９Ｋｄの分子量を有する 還元時単量体を生成する。変異体はこの二量体の性質を保持している必要はない 。

類似体または変異体は、組換えＬＡＰのアミノ酸配列、グリコジル化またはその 池の特徴が共有結合によって、または非共有結合によって修飾された分子と定義 される。従って、変異体は約７０Ｋｄの分子量を何していてもよいし、有してい なくてもよい（例えば、β−メルカプトエタノールまたはジチオトレイトールな との還元剤の非存在下で行なった５ＤＳ−ＰＡＧＥでＣ測定したとき）。例えば 、組換えＬＡＰ配列を有するグリフ／ル化されていないＬＡＰは非還元５ＤＳ− ＰＡＧＥで比較的低い分子量を有するであろう。アミノ酸配列変異体には、図８ の配列のアレルたけでなく、その予め決定した突然変異体か含まれる。通常、ア ミノ酸配列変異体は、図８の組換えＬＡＰの配列に対して、少なくとも約８０％ の配列が同一、より普通には少なくとも約９０％の配列が同一であるアミノ酸配 列を有している。以降においては、特に記すことがなければ、ＬＡＰの語は組換 えによって得た配列、変異体型、あるいは分子中の生物学的に活性な部位（群） に相当する断片のいずれかを意味するものとする。

従って、本発明の範囲内に含まれるのは、図８に示されるヒト組換えＬＡＰアミ ノ酸配列配列するＬＡＰ、他の種に由来する類似のＬＡＰタンパク質（例えば、 ラン、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネズミ、不）ＬＡＰなと）、ＴＧＦ−β２な どの他の型のＴＧＦ−βに由来するＬＡＰ配列し例えば、Ｍａｄｉｓｅｎら、喝 （上記）を参照］、およびこれらＬＡＰ分子の生物学的に活性なアミノ酸配列変 異体（ＬＡＰの生物学的活性を示すＬＡＰのアレルおよびインビトロ生成の共有 結合誘導体を含む）である。

本明細書で用いる”ＴＧＦ−β”の語は、任意の種に由来する任意のＴＧＦ−β の完全長の天然アミノ酸配列を有する上記した一部の分子を意味する。本明細書 におけるこのようなＴＧＦ−βへの言及は、ＴＧＦ−β１、Ｔ’ＧＦ−β２、Ｔ ＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４およびＴＧＦ−β５（これらの配列は図１１に示され ている）を含む現在同定されている形態のいずれか、ならびに将来において同定 されるＴＧＦ−β種（既知ＴＧＦ−βのいずれかの配列から導かれ、７５％また はそれ以上の残基が同一であるポリペプチドを含む）を言及するものであること は理解されよう。さらに具体的な用語である”ＴＧＦ−βビ、”ＴＧＦ−β２″ およびＴＧＦ−β３″は、文献に記載されているＴＧＦ−βを意味する［例えば 、Ｄｅｒｙｎｃｋら、　ＮａｔｕｒｅＴＧＦ−β群の構成員は、分子の成熟部分 に９個のシスティン残基を有し、成熟領域において他の既知のＴＧＦ−β配列と 少なくとも６５％の配列の同一性を有し、そして同一のレセプターを競合するで あろうものと定義される。さらに、これらの全ては、Ｎ−末端）近くに相同性の 高い領域を有し、後にプロセシングによっテ除去されるであろう前駆体の部分中 に３個の／スティン残基の保存を示すさらに大きな前駆体としてコードされてい るようである。また、ＴＧＦ−β群は４または５個の塩基性アミノ酸のプロセシ ング部位を有しているよってある。

本明細書で用いるＴＧＦ−β活性の”中和”の語は、ミンク肺線維芽細胞セルラ イン（例えば、Ｍｖ−３Ｄ９およびＣＣＬ６４）の３Ｈ−チミジン取込みの阻害 によって測定したときのＴＧＦ−βの中和を意味する。

”ＴＧＦ−βの生物学的活性に拮抗する”の表現は、文献に記載されているよう なＴＧＦ−βの活性を遮断すること、例えば、望ましくない成長阻害、免疫抑制 、ストローマ形成（このストローマ要素には、炎症性細胞、内皮細胞および線維 芽細胞が含まれる）、または成熟ＴＧＦ−βの固定非依存性の成長促進活性の少 なくとも１つ、を実質的に阻害することを意味する。従って、ＬＡＰは、腫瘍お よびサプレッサーリンパ様細胞（Ｔ！ＩＢＩＩＩ）によって産生される全ての内 生放出ＴＧＦ−βの活性を遮断することができる。この作用を有するＬＡＰ分子 の同定は上記の中和試験による。

本発明の方法および組成物を用いる治療または予防によって処置される状態の例 には、内生のＴＧＦ−β産生による免疫系の抑制によって引き起こされる状態が 含まれる［後天性免疫不全症候群、重度の損傷、火傷および病気（ウィルスまた は細菌感染症など）に起因する急性免疫不全、資性線維症、ＴＧＦ−βの産生ま たは過産生による多器官の全身性疾患、およびＴＧＦ−βを産生する腫瘍か含ま れる］。このような状態には、増殖かＴＧＦ−βによって阻害されるリンパ様お よび骨Ｎ様系統の細胞の増殖に起因する状態は含まれない（例えば、Ｂｕｒｋｉ ｔｔリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂｍ胞リすパ騰、および種々の骨髄法白血病） 。

また、このような状態には、循環ＴＧＦ−βまたは局所的な部位で活性化された ＴＧＦ−βによって引き起こされる疾患、例えば慢性の顆粒形成または過増殖に 関係した疾患（例えば、線維症疾患であり、あらゆる器官の線維症、例えば硬皮 症、ならびに肺、腎臓、腹腔および肝臓の線維症を含む）、および過剰の活性Ｔ ＧＦ−βによって引き起こされる疾患、例えば過剰のＴＧＦ−β２によって引き 起こされる硝子体網膜症が含まれる。さらに含まれるのは、ＴＧＦ−βおよび後 記する別の哺乳動物免疫機能の調節物質によって引き起こされる病気および副作 用の阻害である。

”哺乳動物免疫機能の調節物質”の表現は哺乳動物の免疫機能を調節するサイト カイン類および成長因子類を意味するものであり、インターロイキン、膿瘍壊死 因子、リンホトキシン、表皮成長因子、面小板由来の成長因子、ＴＧＦ−α、マ クロファージ移動阻害因子、マクロファー／活性化因子、線維芽細胞成長因子、 マクロファージ活性化因子、インターフェロン、およびコロニー刺激因子を包含 する。これらの調節物質は、天然供給源から導くか、白血球によって生成させる か、適切ならば化学的方法によって合成するか、または組換え法によって調製す ることができる。これらのうちでＩ　Ｌ−１、ＩＬ−２、［Ｌ−５およびＩＦＮ −γが好ましい。

Ｂ９本発明実施の様式 ％式％ ＬＡＰの誘導体およびアミノ酸配列変異体は、本明細書中の他の箇所に記載して いるように、それらの生物学的活性が治療用途に関係しているので有用である。

（ａ）共有結合修飾 ＬＡＰ分子の共有結合性の修飾は本発明の範囲内に包含される。

約１００残基までの残基を有する変異ＬＡＰ断片はインビトロ合成によって容易 に調製することができる。精製あるいは粗タンパク質の標的アミノ酸残基を、選 択した側鎖もしくは末端残基と反応しうる有機誘導体化試薬と反応させることに よって、このような修飾を分子中に導入することができる。得られる共有結合誘 導体は、生物活性にとって重要な残基を同定することを目指す計画において有効 である。

ンステイニル残基は最も普通には、α−ハロアセテート（および対応するアミン ）（例えば、クロロ酢酸あるいはクロロアセトアミド）と反応してカルボキシメ チルもしくはカルホキ／アミドメチル誘導体を与える。また、／ステイニル残基 は、プロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドジイル）プロ ピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド類、３−ニト ロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル　２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロ ロメルクリベンゾエート、２−クロロノルクリ−ニトロトロフェノール、あるい はクロロ−７−ニドロベンゾー２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっ ても誘導体化される。

ジエチルピロカーボネートは比較的ヒスチジル側鎖に特異的であるので、ヒスチ ジル残基はｐＨ５，５〜７０でのこの試薬との反応によって誘導体化される。パ ラブロモフェナシルプロミドも有用テある（この反応はｐＨ６，０の０．１Ｍ　 カコジル酸ナトリウム中で行うのが好ましい）。

リジニル残基およびアミノ末端残基は、無水コハク酸もしくは他のカルボン酸無 水物と反応させる。これらの試薬による誘導体化は、リジニル残基の電荷を反転 させる効果を持つ。α−アミノを含む残基の誘導体化に適する他の試薬には、イ ミドエステル類（例えば、メチルピコリンイミデート）、ピリドキサルリン酸、 ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メ チルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、およびトランスアミナーゼによって触 媒されるグリオキシレートとの反応が含まれる。

アルギニル残基は、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１．２− シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンなどの通常の試薬の１もしくは幾つ かとの反応によって修飾される。グアニジン官能基のＩ）Ｋａが高いので、アル ギニン残基の誘導体化はアリカリらびにアルギニンのε−アミ７基とも反応する ことかできる。

チロノル残基の特異的修飾自体は、特に芳香族ジアゾニウム化合物あるいはテト ラニトロメタンとの反応によってチロシル残基中に分光学的標識を導入する目的 で、詳しく研究されている。最も普通には、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテ トラニトロメタンか、それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体 を形成させるために用いられる。放射免疫検定に用いる標識タンパク質を調製す るためには、目５１あるいは１３１■を用いてチロシル残基をヨウ素化する。上 述のクロラミンＴ法が適当である。

カルボキシル側鎖（アスパルチルあるいはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ “−Ｎ　−Ｃ−Ｎ−Ｒ”）［例えば、■−シクロへキンルー３−（２−モルホリ ニル−（４−エチル）カルボジイミドあるいは１−エチル−３−（４−アゾニア −４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドコとの反応によって選択的に修飾 される。また、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの 反応によってアスパラギニルおよびグルタミル残基に変換される。

グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、対応するグルタミルおよびアスパル チル残基に脱アミド化することが多い。また、これらの残基は、穏やかな酸性条 件下で脱アミド化される。これらの残基のどちらの形態も本発明の範囲内に包含 される。

他の修飾には、プロリンおよびリジン残基のヒドロキフル化、セリンあるいはト レオニン残基の水酸基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖の α−アミ７基のメチル化［Ｔ、　Ｅ、　Ｃｒｅｉｇｈｔ。

ｎ、　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　：　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、　Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ＆　Ｃｏ６．　Ｓａｎ　 Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　７９４６頁（１９８３）］、Ｎ末端アミンノアセチル化 、およびある場合にはＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。

（ｂ）　Ｄ　Ｎ　Ａ中の突然変異 ＬＡＰのアミノ酸配列変異体はＤＮＡ中の突然変異によって調製することもでき る。このような変異体には、例えば図８に示すアミノ酸配列中の残基の削除、挿 入あるいは置換が含まれる。また、最終構築物が所望の活性を保持するなら、削 除、挿入および置換の任意の１組合せを行なって最終構築物に達することも可能 である。この変異体をコードするＤ　Ｎ　Ａ中に行われる突然変異は、その配列 を読み枠の外に置くものであってはならず、また、二次ｍＲＮＡ構造を形成する 可能性のある相補領域を生み出さないものであるのが好ましいのは明白である（ ＥＰ　７５，４４４Ａを参照）。

遺伝子レベルでは、通常、これらの変異体は、ＬＡＰをコードするＤＮＡ中のヌ クレオチドの部位指向性の突然変異誘発によって該変異体をコードするＤＮＡを 得、次いでこのＤＮＡを組換え細胞培養で発現させることによって調製される。

通常、これらの変異体は天然の類似体と同じ性質の生物学的活性を示す。

アミノ酸配列の変異を導入する部位は予め定められるが、その突然変異自体は予 め定める必要はない。例えば、ある部位の突然変異の成果を最適化するためには 、襟的コドンあるいは領域においてランダム突然変異誘発を実施し、発現させた ＬＡＰ変異体について目的の活性の最適組合せをスクリーニングすることができ る。既知の配列を有するＤＮＡ中の予め決めた部位に置換突然変異を作るための 技術は周知である（例えば、部位特異的突然変異誘発）。

本発明に係るＬＡＰ変異体のＭｕは、先に調製したこのタンパク質の変異体もし くは非変異体をコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発によって行なうのが 好ましい。部位特異的な突然変異誘発は、欠失接合部を横切る両側に安定な二本 鎖を形成するに充分な大きさと配列の複雑性を有するプライマー配列を得るため に、目的の突然変異のＤＮＡ配列ならびに十分な数の隣接ヌクレオチドをコード する特別なオリゴヌクレオチド配列を使用することにより、ＬＡＰ変異体の生産 を可能にする。通常は、長さが約２０ないし２５ヌクレオチドの、変更される配 列の接合部の両側に約５ないし１０残基を伴うプライマーが好ましい。Ａｄｅｌ ｍａｎら［ＤＮＡ　２：　１８３　（１９８３）］などの発表によって例示され るように、一般に部位特異的な突然変異誘発の技術は当分野で周知である。

理解されるであろうが、部位特異的突然変異誘発の技術は、通常、一本鎖および 二本鎖の両形態で存在するファージベクターを使用する。部位指向性突然変異誘 発に有用な代表的ベクターには、例えばＭｅｓｓｉｎｇら［Ｔｈ１ｒｄ　Ｃ１ｅ ｖｅｌａｎｄ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ａ ｎｄ　ＲｅされているようなＭ１３ファージなどのベクターが含まれる。これら のファージは市販品から容易に入手することができ、その使用法は当業者に広く 知られている。また、一本鎖ファージの複製起点を含有するプラスミドベクター ［Ｖｅｉｒａら、　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５３：　３　（１９８７）］ を使用して一本鎖のＤＮＡを得ることもできる。

一般に、本明細書に従う部位指向性突然変異誘発は、関係のタンパク質をコード するＤＮＡ配列をその配列中に含有する一本鎖ベクターを最初に得ることによっ て行なわれる。突然変異した目的の配列を有するオリゴヌクレオチドブライマー を、普通には合成によって、例えばＣｒｅａら［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａ ｄ、ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　７５：　５７６５　（１９７８）］の方法によって調 製する。次いで、このプライマーを、一本鎖のタンパク質配列を含有するベクタ ーにアニールさせ、大腸菌ポリメラーゼ■クレ／ウフラグメントのようなり　Ｎ 　Ａ重合酵素に適用して突然変異を有する鎖の合成を完結させる。即ち、一方の 鎖が元の非突然変異配列をコードし、第二の鎖か目的の突然変異を保有している ヘテロ二本鎖が形成される。次いて、このヘテロ二本鎖ベクターを使用して適当 な細胞（例えば、Ｊ　Ｍ　１０１細胞）を形質転換し、突然変異した配列配置を 保有する組換えベクターを含有するクローンを選択する。

このようなりローンを選択した後、突然変異したタンパク質領域を取り出し、タ ンパク質生産に適したベクター（１ｖ通には、適切な宿主の形質転換に使用でき る型の発現ベクター）中に設置することができる。

（ｃ）突然変異の型 一般に、アミノ酸配列の削除は約１ないし３０残基の範囲であるが、より好まし くは１ないし１０残基であり、通常は連続的に削除する。

アミノ酸配列の挿入には、１残基から本質的に無制限の長さのポリペプチドのア ミノ末端および／またはカルボキシル末端融合、ならびに１あるいは複数アミノ 酸残基の配列内挿入が含まれる。配列内挿入（即ち、成熟ＬＡＰ配列内への挿入 ）は、一般に、約１ないしｌＯ残基の範囲で可能であるが、より好ましくは１な いし５残基である。

変異体の第三の群は、ＬＡＰ分子中の少なくとも１個のアミノ酸残基（１残基の みであるのが好ましい）が除去され、その位置に異なる残基が挿入されている変 異体である。ＬＡＰ分子の性質を精密に調節することが所望である場合には、次 の表１に従ってこのような置換を行なうのが好ましい。

表　１ 元の残基　置換例 Ａ　１ａ（Ａ　）　ｇｌｙ　；　５ｅｔＡ　ｒｇ（Ｒ）　１ｙｓ Ａ　５ｎ（Ｎ　）　ｇｉｎ　；　ｈｉｓＧ　１ｙ（Ｇ　）　ａｌａ　；　ｐｒ。

Ｈ１ｓ（Ｈ）　ａｓｎ　；　ｇｉｎ ｌ　１ｅ（１）　ｌｅｕ；　ｖａｌ Ｌ　ｅｕ（Ｌ　）　ｉｌｅ　；　ｖａｌＬ　ｙｓ（Ｋ　）　ａｒｇ　；　ｇｉｎ 　：　ｇｌｕＭｅｔ（Ｍ）　ｌｅｕ　；　ｔｙｒ　；　１ｌｅＰ　ｈｅ（Ｆ　） 　ｍｅｔ　；　ｌｅｕ　；　ｔｙｒ表１の置換より保存性が少ない置換を選択す ることによって、即ち、（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、例え ばノートまたは螺旋の立体配座、（ｂＨｍ的部位における分子の電荷または疎水 性、または（ｃ）側鎖の大きさ、を維持するその作用かもっと有意に異なってい る残基を選択することによって、機能または免疫学的な独自性の実質的な変換が 行なわれる。通常、ＬＡＰの性質に最大の変化をもたらすと予想される置換は、 （ａ）グリシンおよび／またはプロリン（Ｐ）を別のアミノ酸で置換したか、ま たは削除もしくは挿入したちの：（ｂ）親水性の残基（例えば、セリルまたはト レオニル）を、疎水性の残基（例えば、ロイシル、イソロイフル、フェニルアラ ニル、バリルまたはアラニル）に代えて（または、によって）置換したもの、（ Ｃ）システィン残基を他のいずれかの残基に代えて（または、によって）置換し たちの；（ｄ）電気陽性の側鎖を有する残基（例えば、リジル、アルキニルまた はヒスチジル）を、電気陰性の残基（例えば、グルタミルまたはアスパルチル） に代えて（または、によって）置換したちの；または（ｅ）大きな側鎖を有する 残基（例えば、フェニルアラニン）を、そのような側鎖を有さない残基（例えば 、グリシン）に代えて（または、によって）置換したものであろう。

はとんどの削除および挿入、ならびに、特に置換は、ＬＡＰ分子の特徴に根本的 な変化を与えないと考えられる。しかし、置換、削除あるいは挿入の正確な効果 をそれを行なう前に予測することが困難である場合には、一般に行われているス クリーニング検定法によってその効果を評価することは当業者の理解するところ であろう。例えば、通常は変異体を、天然のＬＡＰをコードする核酸の部位特異 的突然変異誘発、この変異核酸の組換え細胞培養中での発現、および所望による 細胞培養物からの精製（例えば、ウサギポリクローナル抗ＬＡＰカラムへの免疫 親和性吸着により、変異体を少なくとも１つの残存免疫エピトープのところでカ ラムに結合させることによって吸着させる）によって作成する。

ＬＡＰは二量体に集合するので、一方または両方のサブユニットが変異体である ヘテロニ量体およびホモ二量体を提供することも本発明の範囲内に含まれる。両 サブユニットが変異体である場合、アミノ酸配列中の変化は各サブユニット鎖で 同一または異なっていてよい。両サブユニ、トをコードするＤＮＡで宿主細胞を 同時形質転換し、必要であれば目的のへテロニ量体を精製するか、あるいは、個 別にサブユニ、トを合成し、このサブユニットを解離させ［例えば、カオトロピ ック試薬（尿素、グアニジン塩酸塩など）による処理によって］、解離したサブ ユニットを混合し、次いでカオトロビ。

り試薬を透析除去してサブユニ・ノドを再会合させることによって、ヘテロニ量 体を容易に製造することができる。

次いで、細胞溶解液または精製したＬＡＰ変異体の活性を、目的の性質に適した スクリーニング検定法でスクリーニングする。例えば、候補の突然変異体による ＴＧＦ−β活性量の変化は適当な検定法で測定する。酸化還元もしくは熱的安定 性、疎水性、タンパク質加水分解に対する感受性、あるいは担体と集合もしくは 多量体に集合する傾向などのタンパク質の性質の変化は、当業者に周知の方法に よって検定する。

３、組換え発現 目的のＬＡＰ分子は組換え法を含むいずれかの技術によって調製することができ る。また、本明細書において単離ＤＮＡとは、５゜境界領域を伴うかまたは伴わ ない化学合成り　Ｎ　Ａ　、　ｃＤ　Ｎ　Ａ、染色体もしくは染色体外ＤＮＡを 意味する。本発明の目的のＬＡＰは組換え細胞培養で合成するのが好ましい。

このような合成のためには、初めにＬＡＰをフードする核酸を確保することか必 要である。ＬＡＰ分子をフードするＤＮＡは、ヒトＴＧＦ−βの細胞の供給源か ら、（ａ）これら細胞由来のｃＤＮＡライブラリーを調製し、（ｂ）ＴＧＦ−β あるいはその断片をコードする椋識されたＤ　Ｎ　Ａ　（１００塩基対まで、も しくはそれ以上の長さ）を用いるハイブリ、ド形成分析を行なって、相同な配列 を含有するライブラリーにおいてクローンを検出し、そして（ｃ）制限酵素分析 および核酸配列決定によってこれらクローンを分析することにより完全長（フル レングス）のクローンを同定することによって得ることができる。ストリンジエ ンシー（厳密度）の低い条件下でＴＧＦ−βをコードするＤＮＡとハイブリッド 形成することができるＤＮＡは、ＴＧＦ−βをコートするＤＮＡを同定するのに 有効である。高および低ストリンジェンンーの両条件については後に定義する。

完全長のクローンかｃＤＮＡライブラリー中に存在しない場合には、本明細書に 開示した核酸配列情報を用いて種々のクローンから適当な断片を回収し、これら クローンに共通する制限部位で連結してＴＧＦ−βをフードする完全長のクロー ンを組立てることができる。別の方法では、ゲノムライブラリーが目的のＤＮＡ を提供するであろう。

このＴＧＦ−βの成熟部分を切断した残りの前駆体（ＬＡＰ）部分が本発明で使 用する部分である。最終的に決定したヒトＬＡＰをフードするＤ　Ｎ　Ａ配列を 図８に示す。このＤＮＡを同定し、ライブラリーから単離したら、さらにクロー ニングまたは発現させるために、これを複製可能なベクター中に連結する。

組換え発現系の１つの例では、ＬＡＰをコードするＤ　Ｎ　Ａを含有する発現ベ クターを用いる形質転換によって、哺乳動物細胞中でＬＡＰをコードする遺伝子 を発現させる。培養培地もしくは宿主細胞の細胞周辺腔中にＬＡＰが得られるよ うに（即ち、分泌型分子が得られるように）、プロセシングを行ないうる宿主細 胞を形質転換するのが好ましい。

（ａ）有用な宿主細胞およびベクタ一 本明細書に開示したベクターおよび方法は、広範囲の原核および真核生物にわた る宿主細胞で使用するのに適している。

一般に、目的のベクターの最初のクローニング、増幅、または保存には原核生物 が好ましい。ベクターＤＮＡはある種の原核生物から容易に得ることができる。

大腸１ｍ（Ｅ、鮒旦）　ＫＬ２　ＭＭ２９４株（ＡＴＣＣＮｏ。

３１、４４６）がこの目的に特に有用である。使用できる他の微生物株には、Ｅ 、ｃｏ且ＢおよびＥ、　ｃｏ旦Ｘ１７７６（ＡＴＣＣＮｏ、　３１．５３７）の ような大腸菌株が含まれる。勿論、これらの例は例示を意図するものであって、 限定のためのものではない。

原核生物を発現に使用することもできる。前記の株、ならびにＬｃｏｌｉ　Ｗ３ １１０株（Ｆ＼プラムー、原栄養株：＾ＴＣＣＮｏ、　２７．３２５）、Ｋ５７ ７２（ＡＴＣＣＮｏ、　５３．６３５）、および５ＲＩＯＩ、バチルス（例えば 、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、および他の腸内細菌（例えば、Ｓａ ｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉａ＋ｕｒｉｕａあるいは５ｅｒｒａｔｉａ　ｍａ ｒｃｅｓａｎｓ）、および種々のシュードモナス種を使用することができる。

一般に、宿主細胞に適合する種から導かれるレプリコンおよび制御配列を含有す るプラスミドベクターを、これらの原核性宿主と組合せて使用する。通常、この ベクターは、複製部位、ならびに形質転換された細胞における表現型選択を伺与 することができるマーキング配列を保持する。例えば、大腸菌は大腸菌種由来の プラスミドｐＢＲ３２２１例えば、Ｂｏｌｉｖａｒら、　Ｇｅｎｅ　罎９５　（ １９７７）を参照コを用いて形質転換するのが普通である。ｐＢ　Ｒ３２２はア ンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有しているので、形 質転換細胞を同定するだめの容易な手段を与える。また、このｐＢＲ３２２プラ スミドあるいは他の微生物プラスミドもしくはファージは、選択マーカー遺伝子 の発現のために、その微生物によって使用されうるプロモーターを含有するか、 または含有するように修飾されなければならない。

組換えＤＮＡ構築に最も普通に用いられるプロモーターには、β−ラクタマーゼ （ベニ／リナーゼ）およびラクトースプロモーター系７ＬＣ（１９７７）　；　 Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ　２８１　：　５４４　（１９７９）Ｉ、なら びにトリゾ：　４０５７　（１９８０）：　Ｅ　Ｐ○出願公開Ｎ　ｏ、　００３ ６．７７６コが含まれる。これらが最も普通に用いられるが、その他の微生物プ ロモーターも発見され、そして利用されている。これらのヌクレオチド配列の詳 細は公表されており、当業者はこれらをプラスミドベクターに機能的に連結する ことができる［例えば、５ｉｅｂｅｎｌ　ｉｓｔら、　Ｃｅ１ｌ　２０　：　２ ６９　（１９８０）を参照］。

原核生物に加えて酵母培養物などの真核微生物を用いることもできる。Ｓ　ａｃ ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは通常のパン酵母が最も普通 に用いられる真核微生物であるが、他の多数の菌株も普通に用いることができる 。Ｓ　ａｃｃｈａｒｏＬｌｌｙｃｅｓ中で発現させるためには、例えばか普通に 用いられる。このプラスミドは、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の 突然変異株、例えばＡ　Ｔ　ＣＣＮ　ｏ、　４４．０７６またはＰＥＰ４川口ｏ 用ｅｓ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　８５：　１２　（１９７７）１のための選択マー カーを与えるｔｒｐｌ遺伝子を既に含有している。次いて、酵母宿主細胞ゲノム の性質としてｔｒｐｌ欠損か存在すると、トリプトファンの非存在下での増殖に よって形質転換を検出するための有効な環境か得られる。

酵母ベクターにおける適切な促進配列には、３−ホスホグリモレ／ラーゼ、グリ セルアルデヒド−３−ホスフェート　デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピル ベート　デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルツース−６−ホス フェート　イソメラーゼ、３−ホスホグリセレート　ムターセ、ピルベート　キ ナーゼ、トリオセホスフエート　イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ 、およびグルフキナーゼなとのプロモーター［Ｈｅ５ｓら、　Ｊ、Ａｄｖ、Ｅｎ ｚｙｍｅ　Ｒｅｇｌ：　１４９　（１９６ｇ）およびＨｏ１ｌａｎｄ、　Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１７　：　４９００　（１９７８）］が含まれる。適切な 発現プラスミドを構築する際には、ｍＲＮＡのポリアデニル化と終止を得るため に、これらの遺伝子に伴われる終止配列をも、その発現ベクター中の発現させよ うとする配列の３゛に連結する。生育条件によって転写が制御されるという別の 利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロケナーゼ２、イソチトク ロムＣ１酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関与する分解酵素、および上記のグリ セルアルデヒド−３−ホスフェート　デヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよ びガラクトースの資化の原因となる酵素のプロモーター領域である。酵母に適合 するプロモーター、複製起点および終止配列を含有するあらゆるプラスミドベク ターが適切である。

微生物に加えて、多細胞生物由来の細胞の培養物も宿主として用いることができ る。原理的には、を椎動物の培養物または無を椎動物の培養物の由来を問わず、 このような細胞培養物の全てが利用可能である。しかし、を椎動物細胞が最も重 要であり、を椎動物細胞このような有用な宿主セルラインの例には、５Ｖ４Ｑ配 列で形質転換されたサル腎ＣＶＩライン（、ＣＯＳ　−７：　ＡＴＣＣＣＲＬ　 １６５１）　：ヒト肝腎ライン［２９３ＨＧｒａｈａｍら、　Ｊ、ＧｅｎＪｉｏ ｌ、　３６：　５９　（１９７７）］　；幼ハムスター腎細胞（ＢＨＫ；ＡＴＣ ＣＣＣＬ　１０）　；チャイニーズハムスタカミトリサル腎細胞（Ｖ　Ｅ　ＲＯ −７６；　ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）　；　ヒト頚癌細胞（ＨＥ　Ｌ　Ａ　： 　ＡＴＣＣＣＣＬ　２）　；イヌ腎細胞（Ｍ　Ｄ　ＣＫ　；　ＡＴＣＣＣＣＬ　 ３４）；バッフアロラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ＋＾ＴＣＣＣＣＬ　１４４２）　 ；ヒト肺細胞（Ｗ　１３８　；　ＡＴＣＣＣＣＬ　７５）　；ヒト肝細胞（Ｈｅ ｐ　Ｇ　２　；　ＨＢ　８０６５）；マウス乳腫瘍細胞（ＭＭＴ　０６０５６２ 　；　ＡＴＣＣＣＣＬ　５１）　ニラノド肝癌細（１９８２）］が含まれる。安 定な発現のために本発明で最も好ましい真核宿主はチャイニーズハムスター卵巣 セルラインである。

哺乳動物細胞中で使用するためには、発現ベクター上の制御機能がウィルス成分 によって提供されることが多い。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、 ポリオーマ、アデノウィルス２、レトロウィルス、サイトメガロウィルス、そし て最も多くはサルウィルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから導かれる。他のプロモ ーターは、例えばβ−アクチンプロモーターなどのヘテロローガスな供給源由来 のプロモーターである。ＳＶ４０ウィルスの初期および後期プロモーターは、５ Ｖ４Ｑのウィルス性複製起点をも含有する断片として複製起点中に位置する）に 向かって延びる約２５０ｂｐの配列が含まれているなら、比較的小さいかまたは 比較的大きいＳＶ４０断片を用いることもできる。ヒトサイトメガロウィルスの 即時型プロモーターはＨｉｎｄｌｌｌ制限断片として好都合に得られる［Ｇｒｅ ｅｎａｖａｙら、如ｎｅ　１８　：　３５５−３６０　（１９８２）ｌ。また、 目的の遺伝子配列に通常結合しているプロモーターまたは制御配列を用いること も、この制御配列が宿主細胞系に適合する場合には可能であるし、また、望まし いことが多い。

高等真核生物によるＬＡＰをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハン サ−配列を挿入することによって増大する。エンハンサ−は、通常は約１０〜３ ００ｂｐのシス作用性のＤ　Ｎ　Ａ要素であり、プロモーターの転写開始活性を 増強するように作用する。エンハンサ−は、その配向および位置には比較的非依 存性であり、転写単位の５　’　［Ｌａ１ｍ１ｎｓら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　７８：　９９３　（１９８１）コおよ内［０ｓｂｏｒｎｅ ら、　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ、　５：　１２９３　（１９８４）！に見い出 されている。しかし、本発明のためにはこのエンハンサ−要素をプロモーター配 列の上流に設置するのが好ましい。現在では多数のエンハンサ−配列が哺乳動物 遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロティンおよびイ ンスリン）から既知となっている。しかし、真核細胞ウィルス由来のエンハンサ −を用いるのが普通である。その例には、ＳＶ４０の複製起点の後期側のエンハ ンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウィルスの初期プロモーターエン ハンサ−、ポリオーマの複製起点の後期側のエンハンサ−５およびアラ／ウィル スのエンハンサ−が含まれる。本発明で最も好ましいのは、５Ｖ４Ｑのエンハン サ−領域である。

哺乳動物宿主細胞で用いる発現ベクターはポリアデニル化部位をも含有している であろう。ポリアデニル化領域の例は、例えば５ｖ４０（初期および後期）また はＨＢＶなどのウィルスから導かれる領域である。

複製起点は、外性の起点口例えば、５Ｖ４Ｑまたは他のウィルス（ポリオーマ、 アデノ、■Ｓ■、ＢＰＶなど）供給源から導かれるコを含むようにベクターを構 築することによって得るか、または宿主細胞から得ることができる。ベクターが 宿主細胞の染色体中に組込まれるときには、後者が充分であることが多い。

発現ベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含んでいるのが適切で あろう。選択遺伝子は、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または増殖に 必要なタンパク貫をコードしている。

哺乳動物細胞に適した選択マーカーの例には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）またはネオマイシンが含まれる。このような選択 マーカーが哺乳動物宿主細胞中に成功裏に移転されると、この形質転換されだ哺 乳動物宿主細胞は選択圧のもとに置かれたときに生存することができる。

広く用いられている２種類の別カテゴリーの選択法が存在する。

第１のカテゴリーは、追加された培地とは無関係に増殖する能力を欠く突然変異 セルラインの使用と細胞の代謝に基づいている。例を２つ挙げると、ＣＨＯＤＨ ＦＲ−細胞およびマウスＬＴＫ−細胞である。これらの細胞は、チミジンまたは ヒボキサンチンなどの栄養素の追加なしでは増殖する能力を欠いている。これら の細胞は完全なヌクレオチド合成経路に必要なある種の遺伝子を欠いているので 、この欠失したヌクレオチドか追加培地に供給されなければ生存することができ ない。培地に追加を行うことの代替は、無傷のＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子をそれ ぞれの遺伝子を欠（細胞中に導入してそれらの増殖要件を変えることである。Ｄ ＨＰＲまたはＴＫ遺伝子で形質転換されなかったそれぞれの細胞は、未追加の培 地では生存することができないであろう。従って、これら細胞の直接選択には、 追加栄養素の非存在下での細胞増殖が必要である。

第２のカテゴリーは優性選択であり、これは突然変異セルラインの使用を必要と しない選択法である。通常、この方法は宿主細胞の増殖を抑制する薬物を用いる 。新規な遺伝子を保持するこれら細胞は薬物耐性を与えるタンパク貫を発現し、 選択に耐えるであろう。

優性選択に用いる薬物の例には、ネオマイシン［５ｏｕｔｈｅｒｎおよびＢｅｒ ｇ、Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、１：　３２７　（１９８２）］、 ミミツフェノール［Ｍｕｌｌここに挙げた３つの例は、真核性の制御下に細菌性 遺伝子を用いて、適当な薬物、即ちネオマイシン（０４１８またはジェネチシン ）、ｘｇｐｔ（ミツフェノール酸）、またはハイグロマイシンのそれぞれに対す る耐性を与えるものである。

十分な電のタンパク貫か細胞培養によって生産されるか、二次暗号配列を用いる 改良によって生産レベルかさらに増大するのを助ける。ある二次暗号配列は、メ トトレキセート（ＭＴＸ）などの外因的に制御されるパラメーターの影響を受け るジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）からなり、従ってメトトレキセート濃度を 制御することによって発現を制御することができる。

ＬＡＰおよびＤＨＦＲタンパク質の両者をコードするＤ　Ｎ　Ａ配列を含有する 本発明のベクターによるトランスフェクションにとって好ましい宿主細胞を選択 する際には、使用するＤＨＦＲタンパク質バク質を使用する場合には、ＤＨＦＲ が欠失している宿主細胞を選択するのか好ましく、これにより、ヒボキサンチン 、グリシンおよびチミジンを欠く選択培地中での成功裏のトランスフェクション のための樟識としてＤＨＦＲ暗号配列を使用することが可能になる。

この場合の適切な宿主細胞は、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ［Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　ＡｃａＤＨＦＲ活性を欠失しているチャイニーズハムスター卵巣（ ＣＨＯ）セルラインである。

一方、ＭＴＸに対して低い結合親和性を有するＤＨＦＲタンパク質を制御配列と して使用する場合には、ＤＨＦＲ欠失細欠失細円する必要はない。突然変異ＤＨ ＦＲはメトトレキセートに対して耐性であるので、宿主細胞自体がメトトレキセ ート感受性である場合には、Ｍ　Ｔ　Ｘを含む培地を選択の手段として使用する ことができる。

ＭＴＸを吸収することができる真核細胞のほとんどは、メ２−レキセード感受性 であると考えられる。このような有用なセルラインの１つはＣ８０株、ＣＨＯ− Ｋ　１　（ＡＴＣＣＮｏ、　ＣＣＬ６１）である。本発明の方法を用いる細胞培 養によって極めて良い収量のポリペプチドが得られる（二次暗号配列をコードす る独立したベクターによる同時トランスフェクションを用いる改良）。二次暗号 配列の１つは、メトトレキセート（ＭＴＸ）などの外因的に制御されるパラメー ターの影響を受けるジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）からなり、従ってメトト レキセート濃度を制御することによる発現の制御が可能である。

（ｂ）使用することができる代表的な方法目的の暗号配列および制御配列を含有 する適切なベクターの構築には、標準的な組換え法を用いる。単離したプラスミ ドもしくはＤＮＡ断片を切断し、加工し、再連結して、所望のプラスミドを調製 する。

平滑末端が必要な場合には、切断したＤＮＡ調製物を、ＤＮＡポリメラーゼロク レノウ断片）もしくはＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより３７°Ｃで３ｃ１間処理し 、フェノール−クロロポルム抽出Ｌ、エタノール沈殿させることができる。３° 突出末端はどちらかの酵素の３′から５゛へのエキソヌクレアーゼ活性によって 除去され、そして、５′突出末端は、その断片の末端に達するまて相補ヌクレオ チドを取り込む、５°から３°へのポリメラーゼ活性によって平滑化される。

切断した断片のサイズ分離は、Ｇｏｅｄｄｅｌら［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、　８：　４０５７　（１９８０）３に記述されている６％ポリアクリ ルアミドゲルを用いて行うことができる。

構築したプラスミド中の正しい配列を確認するための分析には、通常、連結混合 物を用いてＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　２９４株（ＡＴＣＣ３１，４４６）あるいは 他の適当な大腸菌株を形質転換し、適当な時点で成功裏の形質転換体をアンビン リンもしくはテトラサイクリン耐性によって選択する。Ｍｅｓｓ　ｉｎｇら［Ｎ ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９：　３０９　（１９８１）］の方法、 もしくはＭａｘａｍら［Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ、　６５：　４９９　（１９８０ ）］の方法により、形質転換体からプラスミドを調製し、制限マツピングおよび ／またはＤＮＡ配列決定によって分析する。

ＤＮＡを哺乳動物細胞宿主に導入し、安定な形質転換体用の培地中で選択した後 、ＤＨＦＲ活性の競争的阻害物質であるメトトレキセート約２００〜５００　ｎ Ｍの存在下で宿主細胞培養物を生育させることによって、ＤＨＦＲタンパク賃を コードする配列の増幅を行なう。濃度の有効範囲は勿論そのＤＨＰＲ遺伝子の性 質および宿主の特徴に大きく依存する。明確かつ一般的に定義した上限および下 限を確定することはできない。他の葉酸類似体もしくはＤＨＦＲを阻害する他の 化合物も適切な濃度で使用することかできる。しかし、ＭＴＸ自体か便利であり 、容易に人手でき、また効果的である。

他の使用可能な技術は実施例の直前の項で説明する。

（以下、余白） ４、用途および製剤 本発明のＬＡＰ分子は、ＴＧＦ−β活性の拮抗または中和に関係した多数の治療 学的用途を有する。このような用途には、長期間にわたって二次感染にかかり、 そしてそれを持続する能力によって調へたときに免疫抑制されている患者および 線維症疾患の治療が含まれる。特に、再発または慢性のウィルス、細菌、菌類ま たは寄生生物感染に罹患している患者が重要である。成熟ＴＧＦ−βに可逆的に 結合するＬＡＰの能力に基づいて改善されつる他の生理学的症状もこれに含まれ る。

さらに、ＬＡＰを、他の免疫調節物質（例えば、組換えサイトカイン類）を医薬 物質として用いたときの副作用を防止する手段として用いることができるし、ま た、特定の臨床計画に依存してそのような調節物質と組合せて用いることができ る。

上述した徴候のために、治療しようとする特定の疾患、それぞれのを者の症状、 ＬＡＰを放出する部位、投与法、および医学者に既知の他の因子を考慮に入れて 、信頼できる医学的実施態様に一致する方法でＬＡＰ分子が処方され、投与され るであろう。即ち、本発明の目的のためには、ＬＡＰの”治療学的有効量”とは 、治療する症状の悪化を予防もしくは軽減するか、またはその症状を緩和もしく は治癒させるのに有効な量のことであり、特にインビボでＴＧＦ−βの活性に拮 抗するに充分な量を指す。

望ましい純度のＬＡＰと生理学的に許容しうる担体、賦形剤、あるいは安定化剤 を混合することによって、ＬＡＰを保存あるいは投与用に調剤する。そのような 成分は、使用される投与量および濃度では被投与者に対して非毒性である。ＬＡ Ｐが水溶性である場合は、リン酸塩あるいは他の有機酸塩のような１１衝液（約 ７〜８のｐＨが好マシい）中に調剤する。ＬＡＰ変異体が部分的にしか水に溶け ない場合には、その溶解度を増大させるために、これを非イオン性の界面活性化 剤［例えば、ツイーン、プルロニックあるいはＰＥＧ、例えば、０．０４〜０． ０５％（ｗ／ｖ）のツイーン８０］と配合することによってマイクロエマルショ ンとして調剤する。

所望により池の成分も添加することができる：例えば、抗酸化剤（アスコルビン 酸など）、低分子量（約ｌＯ残基より小さい）のポリペプチド（ポリアルギニン あるいはトリペプチドなど）、タンパク’！（血清アルブミン、ゼラチン、ある いは免疫グロブリンなど）、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、ア ミノ酸（グリシン、グルタミン酸、アスパラキン酸、あるいはアルギニンなど） 、単糖類、三糖類、および他の炭水化物（セルロースあるいはその誘導体、グル ツース、マンノース、あるいはデキストリンを含む）、キレート化剤（ＥＤＴＡ など）、および糖アルコール（マンニトールアルいはソルビトールなど）である 。

治療投与に使用するＬＡＰは滅菌状態でなければならない。滅菌は、滅菌濾過Ｎ Ａ（例えば、０２ミクロン膜）で濾過することによって容易に達成される。通常 、ＬＡＰは凍結乾燥品として、または、熱的および酸化変性に対して安定性が高 い場合には水溶液として保存されるであろう。ＬＡＰａｌｌ製物のｐＨは通常は 約６〜８であろうか、ある場合にはより高いかもしくはより低いｐＨ値も適切で あろう。ある種の上記賦形剤、担体あるいは安定化剤を使用することによって、 Ｌ　ＡＰの塩か生成することは理解されるであろう。

ＬＡＰを非経口的に使用しようとする場合には、ＬＡＰを含有する治療学的組成 物を、通常は滅菌出入口の付いた容器（例えば、皮下注射針で突き刺せる栓の付 いた静脈内液剤バッグもしくはバイアル）に入れる。

一般に、その疾患が許す場合には、部位特異的に放出するようにＬＡＰを調剤し 、投与するへきである。これは線維症および膿瘍の場合に好都合である。

徐放性製剤を調製することもてき、これにはマイクロカプセル粒子および移植可 能な物品の調製が含まれる。徐放性のＬＡＰ組成物を調製するためには、ＬＡＰ を生物分解性のマトリ、クスもしくはマイクロカプセル中に導入するのが好まし い。この目的に適した素材はポリラクチドであるが、その他のポリ−（α−ヒド ロキシカルボン酸）ポリマー、例えばポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ ＥＰ　１３３，９８８＾）を用いることもできる。他の生物分解性ポリマーには 、ポリ（ラクトン）、ポリ（アセタール）、ポリ（オルトエステル）、あるいは ポリ（オルトカーホネート）が含まれる。ここで最初に考慮しなければならない ことは、担体自体あるいはその分解産物が標的組織において非毒性であること、 およびその症状をさらに悪化させないということである。これは、標的疾患の動 物モデルにおいて、もしくはそのようなモテルが利用できない場合には正常な動 物において、通常のスクリーニングによって決定することができる。

徐放性組成物の例としては、米国特許Ｎ　ｏ、　３．７７３．９１９、ＥＰ５８ ，４８１Ａ１米国特許Ｎ　ｏ、　３．８８７．６９９、Ｅ　Ｐ　１５８，２７７ Ａ、カナダ特許Ｎ　ｏ、　１．１局所的に適用する場合には、ＬＡＰを担体およ び／または補助剤なとの他の成分と配合するのが適切である。そのような他の成 分の性質には制限がないが、ただし、それらは薬学的に許容しうるちのであり、 意図している投与に有効でなければならず、また、組成物中の活性成分の活性を 減じるものであってはならない。適切な賦形剤の例には、軟膏、クリーム、ゲル 、または懸濁液が含まれ、これらは精製コラーゲンを伴っていてもよいし、伴っ ていなくても良い。

また、この組成物を、好ましくは液状あるいは半液状で、経皮用のバッチ、硬膏 、および包帯にしみ込ませることもてきる。

ゲル製剤を得るためには、液体組成物中に調剤したＬＡＰを有効量の水溶性多糖 類、もしくはポリエチレングリコールなどの合成ポリマーと混合して局所適用に 適した粘度のゲルを得ることができる。

使用しつる多糖類には、例えば、セルロース誘導体［例えば、アルキルセルロー ス、ヒドロキシアルキルセルロースおよびアルキルヒドロキシアルキルセルロー ス（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチ ルセルロース、ヒドロキシプロビルメチルセルロース、およびヒドロキシプロピ ルセルロース）を含むエーテル化セルロース誘導体］、デンプンおよび分別した デンプン、寒天、アルギン酸およびアルギン酸塩、アラビアコム、プルラン、ア ガロース、カラゲナン、デキストラン、デキストリン、フルクタン、イヌリン、 マンナン、キンラン、アラビナン、キトサン、グリコーゲン、グルカン、および 合成生物ポリマー、ならびにゴム（例えば、キサンタンコム、グアーゴム、ロー カストビーンゴム、アラビアゴム、トラガカントゴム、およびカラヤゴム、およ びこれらの誘導体および混合物）か含まれる。本発明において好ましいゲル化剤 は、生物系に対して不活性であり、非毒性であり、調製が容易であり、流動性ま たは粘性が高すきず、そしてその中に保持されるＬＡＰを不安定化しないもので ある。

多糖類はエーテル化セルロース誘導体であるのが好ましく、さらに、十分に定義 され、精製され、モしてＵＳＰに挙げられているもの１例えば、メチルセルロー スおよびヒドロキシアルキルセルロース誘導体（ヒドロキノプロピルセルロース 、ヒドロキシエチルセルロース、およびヒドロキシプロビルメチルセルロースな ど）］が好マしい。本発明ではメチルセルロースが最も好ましい。

ゲル化に有用なポリエチレングリフールは、通常、適当な粘性を得るために、低 および高分子量のポリエチレングリコールの混合物である。例えば、分子！４０ ０〜６００のポリエチレングリコールと分子１１５００のポリエチレングリコー ルをペーストが得られるように適切な比でａ＝した混合物かこの目的に有効であ る。

多糖類およびポリエチレングリコールに適用する場合の”水溶性”なる用語は、 コロイド液および分散液を含むことを意味する。一般にセルロース誘導体の溶解 度はエーテル基の置換の程度によって決まり、本発明において有用な安定化誘導 体は、この誘導体を水溶性にするために、そのセルロース鎖中の無水グルコース 単位あたりにそのようなエーテル基を十分な量で含有しているべきである。通常 は、無水グルコース単位あたり少なくとも０．３５エーテル基のエーテル置換置 が十分である。また、このセルロース誘導体はアルカリ金属塩（例えば、Ｌｌ、 Ｎａ％に１あるいはＣｓ塩）の形態にあってもよい。

メチルセルロースをゲルに使用する場合には、ゲルは約２〜５％、より好ましく は約３％で含有され、ＬＡＰはゲルｌａｌあたり約３００〜１０００μｇの量で 含まれるのが好ましい。

使用されるＬＡＰの投与量は上述の因子、特に治療される疾患の種類に依存する 。一般的な提案として、例えば１またはそれ以上の単回投与、連続注入またはホ ーラス注射のいずれによるかにかかわらず、約０．０１５〜１５ｍｇ／ｋｇのＬ ＡＰ投与量を患者に投与することかできる。例えば、ＬＡＰの最初の用量は注射 または注入によって牛１者に投与する。症状に応じて数日間またはそれ以上の長 期にわたる繰返し投与のためには、この処置を疾患の症状の所望の抑制が起こる まで繰り返す。しかし、他の投与処方も有用であろう。

本発明の別の態様によれば、ＬＡＰを他の薬物と連続して、または組合せて投与 することによってＬＡＰの効力を改善することができる。この目的に有効な池の 薬物は、例えば、■またはそれ以上の抗ＴＧＦ−β抗体、免疫機能の調節物質（ 上で定義）、あるいは１またはそれ以上の通常の治療薬物（例えば、アルキル化 薬、葉酸拮抗薬、核酸代謝の抗代謝物質、紡錘前、抗生物質、ピリミジン類似体 、５’−ＦＵ１プリンヌクレオシド、アミン、アミノ酸、トリアゾールヌクレオ シド、フルチフステロイド、カルシウム、レチノイド、リポキンゲナーゼおよび シクロオキシゲナーゼ阻害物質、フマル酸およびその塩、鎮痛薬、向精神薬、局 所麻酔薬、鎮痛薬、およびβ−遮断薬など）である。例えば、Ｆｏｌｅｙ［ＮＥ ｎｇ、Ｌ（〔３１３：　８４−９５　（１９（１９８２）］を参照。このような 他の薬物は投与される組成物中に存在していてもよいし、独立して投与してもよ い。

な放射活性物質の照射または導入〕と連続して、または組合せて投与するのも適 当である。

さらに別の態様においては、ＬＡＰと異種であるかまたは同種であるかを問わず 、成熟ＴＧＦ−βと組合せてＬＡＰを用いる。例えば、ＴＧＦ−βｌ由来のＬＡ Ｐを成熟ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３と共に用いることかで きる。成熟ＴＧＦ−βのＬＡＰに対する相対量は、通常はほぼ等モルである。

同一の製剤中であるかまたは独立した投与であるかを問わず、成熟ＴＧＦ−βを ＬＡＰと同時に同一の場所（静脈なと）に投与する。

ＴＧＦ−βとＬＡＰを投与前にａ＝するのが好ましい。この混合物か不安定であ るときには、これら成分を投与の直前にほぼ等モル量で混合する。この混合物が 安定であるときには、ＴＧＦ−βとＬＡＰを混合し、不活性な複合体を反応混合 物から精製除去し、精製された物質を投与する。投与は全身的であるのが好まし いが、これは、ある用量で全身的に投与されるＴＧＦ−βに伴われる副作用を減 少させるところに利点があるためである。

成熟ＴＧＦ−βとＬＡＰの組合せを、潜在性ＴＧＦ−βのプールによって高めら れるあらゆる過程（傷治癒および骨形成などの軟および硬組織生成、ならびに免 疫抑制を含む）に用いることができる。

この療法は手術時ならびに非手術の場合に適用される。例えば、この組合せ物を 手術前の日にも者に投与して傷部位の組織強度を高めるか、または単純骨折を有 する患者に投与して骨の治癒速度を高めることができる。

最後に、血清中の成熟ＴＧＦ−βを検出することによって診断しうる状態（疾患 を含む）を有する患者の血清中の活性なＴＧＦ−βを捕捉する診断検定において ＬＡＰを適切に用いる。この方法は、血清中のごくわずかな量の成熟ＴＧＦ−β を高感度で検出するのに特に適している。具体的には、この方法は、任意の適当 な検出可能な部分（３′Ｐまたはアルカリホスファターゼなど）で標識されたＬ ＡＰをインビトロであるとインビボであるとを問わず血清に加え、血清中の成熟 ＴＧＦ−βとＬＡＰの標識された複合体の存在を検定することからなる。

実施例および請求の範囲を簡素にするために、頻繁に使用する方法のいくつかを 簡略化した用語で表現する。

”トランスフェクション”は、いずれかの暗号配列が実際に発現されるか否かに かかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取込みを意味する。数多くのトラン スフェクション法が当業者に知られている（例えば、Ｃａ　Ｐ　Ｏｈおよび電気 穿孔法）。一般に、成功裏のトランスフェクションは、このベクターの作用の何 らかの徴候がその宿主細胞内に生じたときに認識される。

”形質転換”は、Ｄ　Ｎ　Ａが染色体外要素として、または染色体構成要素とし て攬製されるように、生物内にＤＮＡを導入することを意味する。使用する宿主 細胞に応じて、その細胞に適した標準的技術を用いて形質転換を行う。Ｃｏｈｅ ｎ、　Ｓ、　Ｎ、　［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　（ ＩＪｓＡ）６９：　２１１０　（１９７２）］、Ｍａｎｄｅｌら’ＩＪ、Ｍｏ１ ．Ｂｉｏ１．５３：　１５４　（１９７０）］、およびさらに最近になってＬｉ ｌｊｅｓｔｒｏｍらＥＧｅｎｅ　４０：　２４１−２４６　（１９８５）］が記 述しているような塩化カルシウムを用いるカルシウム処理法は、堅固な細胞壁障 壁を有する原核細胞および他の細胞に一般的に用いられている。そのような細胞 壁を持たない哺乳動物細胞には、Ｇｒａｈａｍ、　Ｆ、およびｖａｎ　ｄｅｒ　 Ｅｂ、　Ａ、　［亘胚且ｔ５２：　４５６−４５７　（１９７８）コのリン酸カ ルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物細胞宿主系の形質転換の全般的態様はＡｘ ｅｌ［米国特許Ｎ　ｏ、　４．３９９．２１６（１９８３年８月１６日発行）］ が記述している。酵母の形質転換は、通常、Ｖａｎ　Ｓｏｌｉｎｇｅｎ、　Ｐ、 ら［」ａｔ、１３０：　９４６　（１９７７）］およびＩｓ　ｉａｏ、　Ｃ，Ｌ 、ら［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　（ＵＳＡ）　７６ ：　３８２９　（１９７９）ｌの方法に従って行う。しかし、核注入あるいはプ ロトプラスト融合を用いるなど、細胞中にＤ　Ｎ　Ａを導入するための他の方法 も用いることができる。

”機能的に結合する”という表現は、構成成分の正常な機能を発揮することがで きる並置を意味する。従って、制御配列に”機能的に結合した”暗号配列とは、 暗号配列がこれら制御配列の制御のもとて発現することができ、結合されたＤＮ Ａ配列か連続している配置、また、分泌リーダーの場合には連続的かつ読み枠内 にある配置を意味する。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのためのＤＮＡ は、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるなら 、ポリペプチドのＤＮＡに機能的に結合している。また、プロモーターあるいは エンハンサ−は、それが配列の転写に影響を与えるなら、暗号配列に機能的に結 合している。さらに、リポソーム結合部位は、それか針状を促進するように設置 されているなら、暗号配列に機能的に結合している。結合は都合の良い制限部位 での連結（ライケーンヨン）によって行なう。そのような部位か存在しない場合 には、合成オリコヌクレオチドアダプターもしくはリンカ−を常法に従って用い る。

゛°制御配列”は、機能的に結合した暗号配列が特定の宿主生物中て特表平５− ５０３００３　（２２） 発現するのに必要なりＮＡ配列を意味する。原核生物に適した制御配列には、例 えば、プロモーター、場合によってオペレーター配列、リポソーム結合部位、ま た、場合によっては未だよく理解されていない池の配列が含まれる。真核細胞が プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサ−を利用することは知 られている。

”発現系”は、機能的に結合した所望の暗号配列と制御配列を含有するＤＮＡ配 列であって、これらの配列で形質転換された宿主がそのコードされているタンパ ク質を産生ずることができるようなりＮＡ配列を意味する。形質転換を行なうた めに、この発現系をヘクターに含有させることができる。しかし、関係している ＤＮＡが後に宿主染色体に組込まれることもある。

本明細書で用いる”細胞”、”セルライン”および”細胞培養物”は相互に交換 することができ、これらの表現はその子孫をも包含する。

従って、”形質転換体”あるいは”形質転換細胞”には、最初の形質転換体およ びこれから導いた培養物（その継代数は問わない）が含まれる。童画した突然変 異あるいは偶然の突然変異の故に、全ての子孫か正確に同一のＤＮＡを含んでい ないこともある。最明の形質転換細胞において選別した機能と同じ機能を有する 突然変異子孫は包含される。別の意味か童画されているところは、その文脈から 明白であろう。

”プラスミドは、小文字ｐ、これに先行および／またはこれに続く大文字および ／または数字によって表示される。本発明の出発プラスミドは市販されているか 、制限されていない供給源から誰でも入手可能であるか、または公表された方法 に従ってそのような入手可能なプラスミドから構築することができる。さらに、 他の等価なプラスミドが当分野で知られており、当業者には明白であろう。

本発明において用いる”ＰＣＲ”の技術は、一般に、ごく微量の特定のＤＮＡ片 を米国特許Ｎ　Ｏ，４，６８３，１９５（１９８７年７月２８日発行）に記述さ れているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅することができるという 技術を意味する。通常は、目的の配列の両末端またはそれを越えた部分の配列情 報が利用可能であることを必要とし、これによってオリコヌクレオチドプライマ ーを設計することかできる。

これらのプライマーは互いに向き合い、増幅しようとする鋳型の反対側の鎖と同 一であるか、もしくは類似しているであろう。この２つのプライマーの５′末端 ヌクレオチドは、増幅される原料物質の両末端と一致しているであろう。ＰＣＲ を用いて、全ゲノムＤＮＡ、全細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バタテリオ ファージあるいはプラスミド配列などから特定のＤ　Ｎ　Ａ配列を増幅すること ができる［一般的には、Ｈ，Ｅｒｌｉｃｈ編のＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓ ｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ。

１９８９）を参照］。

本発明において用いる”ＰＣＲ突然変異誘発”の技術は、次のような技術を意味 する［Ｅｒ１ｉｃｈ（上記）のＲ，Ｈｉｇｕｃｈｉの章（６１−７０頁）を参照 ］。

少量の鋳型ＤＮＡをＰＣＲの出発物質として使用するときに、鋳型Ｄ　Ｎ　Ａ中 の対応する領域と配列かわずかに異なっているプライマーを用いて、プライマー が鋳型と異なっている位置においてのみ鋳型配列と異なっている比較的大量の特 別のＤＮＡ断片を生成させることができる。プラスミドＤＮＡ中に突然変異を導 入するためには、一方のプライマーは突然変異の位置に重なるように、そして突 然変異を含むように設計する。他方のプライマーの配列はプラスミドの反対側の 鎖の配列の部分と同一でなければならないが、この配列はプラスミドＤＮＡに沿 うどんな場所に位置していてもよい。しかし、第２のプライマーの配列は、最後 にプライマーによって囲まれたＤＮＡの全増幅領域が容易に配列決定されうるよ うに、第１の配列から２００ヌクレオチド以内に位置しているのが好ましい。こ こに記したプライマー対と同様のプライマー対を用いるＰＣＲ増幅により、プラ イマーによって指定した突然変異の位置において異なり、そして恐らくは他の位 置において異なるＤＮＡ断片の集団が得られることになる（鋳型のコピーは若干 間違う傾向にあるので）。

以下に説明する方法においては、製造物質に対する鋳型の比率は極めて低く、そ の結果、製造されたＤ　Ｎ　Ａ断片の大部分は所望の突然変異を含んでいる。こ の製造物質を、通常のＤＮＡ技術を用いてＰＣＲ鋳型となったプラスミド中の対 応領域を置換するのに用いる。

突然変異の第２プライマーを用いることによって、または異なる突然変異プライ マーによる第２のＰＣＲを行ない、得られた２つのＰＣＲ断片を３（またはそれ 以上）部分連結で同時にベクター断片に連結することによって、別位置の突然変 異を同時に導入することができる。

後記の実施例で用いたＰＣＲ突然変異誘発の操作は次のようである。増幅しよう とする領域の外側のブラスミ）”ＤＮＡ中に唯一の認識部位を有する制限エンド ヌクレアーゼで消化することによって、鋳型プラスミドＤＮＡ（１μｇ）を直線 化した。この物質のうち１〜５ｎｇを、０．５ｍｌの反応バイアル中、最終容量 ５０μｌで１６．６ｍＭ（Ｎ　Ｈ、）、Ｓ　Ｏ，，６７１１１Ｍ）リス−ＨＣＩ （ｐＨ８，８）、６　、７　ｍＭ　ＭｇＣＸ！、６．７μＭ　ＥＤＴＡ、ｌｏｍ Ｍ　２−メルカプトエタノール、それぞれ１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ ＰおよびＴＴＰ、１７０μｇ／ｍｌウン血清アルブミン、それぞれ２５ｐモルの オリゴヌクレオチドブライマー、およびｌμｌのＴｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉ ｃｕｓ　（Ｔａｑ）　ＤＮＡポリメラーゼ（５単位／　ｕ　ｌ　：　Ｐｅｒｋｉ ｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ、　Ｎｏｒｖａｌｋ、　ＣＴａｎｄ　Ｅｍｅｒｙｖ ｉｌｌｅ、　ＣＡから購入）を含むＰＣＲ混合物に加えた。この反応混合物に３ ５μｌの鉱油を重層し、Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋ ｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓから購入）中に入れた。このＤ　Ｎ　Ａ　Ｔｈｅ ｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒは次のようにプログラムした・ 時間−遅延・ファイル　１２分間　９４°Ｃ熱−サイクル・ファイル　１分間　 ５０°Ｃ２〜３分間　６８〜７２°Ｃ １分間　９４℃ ２０サイクル 時間−遅延・ファイル　４分間　５０°Ｃ時間−遅延・ファイル　１２分間　６ ８°Ｃ浸透・ファイル　４℃ 上に示したそれぞれのファイルは次の行のファイルにつながっている。プログラ ムの終了時に、反応バイアルをＴｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒから取り出し、水 相を新しいバイアルに移し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール （５０：　５０　：　Ｌ容１比）で抽出シ、エタノール沈澱させ、常法によって ＤＮＡを回収した。次いで、この物質を、ベクター中に挿入するための適切な処 理に付した。

ＤＮＡの”消化”は、ＤＮＡ中の特定のヌクレオチド配列にだけ作用する酵素に よるＤＮＡの触媒的切断を意味する。このような酵素は制限酵素と呼ばれ、また 、それぞれが特異的に作用する配列は制限部位と呼ばれる。本発明で使用する種 々の制限酵素は市販されており、酵素供給元によって確立された反応条件、補助 因子、および他の必要条件を用いる。制限酵素は一般に、それぞれの制限酵素を 最初に得た微生物を表す大文字とそれに続く他の文字、次いで特定の酵素を指定 する数字で構成される略号で表示される。通常、約１μｇのプラスミドあるいは ＤＮＡ断片を、約２０μｌの緩衝液中、約１〜２単位の酵素と共に使用する。特 定の制限酵素に適した緩衝液および基質量は製造元によって指定されている。通 常は３７℃で約１時間のインキユベーシヨンが用いられるが、供給元の指示に従 って変更することもある。インキユベーシヨンの後、フェノールおよびクロロホ ルム抽出によってタンパク質を除去し、エタノール沈澱によって水性分画から消 化した核酸を回収する。それが適切であれば、制限酵素による消化の後に、末端 ５°リン酸基の細菌アルカリホスファターゼ媒介の加水分解を行なって、１つの ＤＮＡ断片中の２つの末端が”環化する”、もしくは閉じた環を形成する（これ はその制限部位に他のＤＮＡ断片を挿入することを阻害するであろう）のを阻害 する。特に述べない限り、プラスミドの消化の後に５°末端脱リン酸化は行わな い。脱リン酸化の方法および試薬は通常のものを用いる［Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉ ｓら：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 　Ｍａｎｕａｌ　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９ｇ２）　１３３−１３４頁（１９８２）］。

制限消化によって得たあるＤ　Ｎ　Ａ断片の”回収”あるいは”単離”とは、消 化物をポリアクリルアミドもしくはアガロースゲル電気’ｔ６動によって分離し 、その移動度を既知分子量の標識Ｄ　Ｎ　Ａ断片の移動度と比較することによっ て目的の断片を同定し、目的の断片を含有するゲル部分を切り出し、ゲルとＤＮ Ａを分離することを意味する。

この操作は広く知られている。例えば、Ｒ，Ｌａ宥ｎらｊＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ １ｄｓ　Ｒｅｓ、　９：　６１０３−６１１４　（１９８１）コ、およびり、　 Ｇｏｅｄｄｅｌ［Ｎｕｃｌｅｉｃへｃｉｄｓ　Ｒｅｓ多　４０５７　（１９８０ ）］を膠照のこと。

”連結（ライゲーション）”は、２つの二本鎖核酸断片間のホスホジエステル結 合を形成させる過程を意味する［Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓら、１４６頁（１９８ ２）　；上記］。特に述へない限り、連結は、既知の緩衝液および条件を用い、 はぼ等モル量の連結しようとするＤＮＡ断片０５μｇあたり１０単位のＴ４ＤＮ Ａリガーセ（”リガーセ”）を用いて行なうこ物培養物から単離することを意味 する。特に述べない限り、Ｍａｎ　１ａｔＩＳら［９０頁（１９ｇ２）　、上記 コのアルカリ／ＳＤＳ法を使用することができる。

”オリゴヌクレオチド”は、既知の方法、例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒら［川１、 ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１４：　５３９９−５４０７　（１９８６）］に記述さ れているデオキシヌクレオシドＨ−ホスホネート中間体経由で、もしくはＥＰ特 許公開Ｎ　ｏ、　２６６、０３２（１９８８年５月４日公開）に記述されている ような固相法を用いるホスホトリエステル、ホスファイトもしくはホスホルアミ ダイトの化学で化学的に合成された、短い一本鎖もしくは二本鎖のポリデオキシ ヌクレオチドである。次いて、これらをポリアクリルアミドゲルで精製する。

以下に挙げる実施例は、本発明を実施する際の現在わかって（する最良の態様を 例示するものであるか、本発明はこれらに限定されると見なされるべきではない 。

（以下、余白） 実施例Ｉ　ＬＡＰをコードしているＤＮＡのクローニングおよび発現 １、ｔ−ＰＡ発現ベクターの構築 スプライス・ドナー−イントロン−スプライス・アクセプタ一単位の特徴の多く を変えることによって、親ヘクターｐｓＶＩ−ｔＰＡから種々のｔ、Ｐ　Ａベク ターを導いた。

ａ、ｐｓｖＩ−ｔＰＡ 既に開示されている２種類の哺乳動物発現ベクターｐＲＫ−ｔＰＡおよびｐＥ３ ４８ＤＨＦＲＵＣの部分を結合させｒｐｓ　Ｖ　Ｉ　−ｔＰ　Ａを創製した。

哺乳動物発現ベクターｐＲＫ−ｔＰＡは、ｐＲＫ　５　［ＥＰ　３０７．２４７ （上記）に開示されている。ここで、出発プラスミドｐＣＩ　Ｓ　２．８ｃ２８ ＤはＥＰ　２７ｇ、７７６（１９８８年８月１７日公開）に開示されている］と ｔ−ＰＡ　ｃＤＮ　Ａ　［Ｐｅｎｎ１ｃａら、Ｎａｔｕｒｅ　３０１：　２１４ 　（１９８３）コから調製した。ｐＲＫ５に挿入するためのｃＤＮＡを、制限エ ンドヌクレアーゼＨ１ｎｄｌｌｌ（ＡＴＧ開始コドンの５′側の４９塩基対を切 断する）および制限エンドヌクレオチドＢａ１ｌ（ＴＧＡ停止コドンの下流の２ ７６塩基対を切断する）による切断によって調製した。このｃＤＮＡを、予めＨ ｉｎｄｌｌｌおよびＳｍａｌで切断しておいたｐＲＫ　５に通常の連結法（Ｍａ ｎｉａｔｉｓら、１９８２：上記）を用いて連結した。この構築物をｐＲＫ−ｔ ＰＡと命名し、図２に示す。

ｐＲＫ−１ＰＡｉｉ、ヒト２９３線維芽細胞への一時的なトランスフェク／ヨノ によりｔ−ＰＡを効率的に合成させる。このベクターは、サイトメカロウイルス の即時型遺伝子のエンハンサ−およびプロモーター、ＣＭＶ−Ｉ　Ｅスプライス ・ドナ一部位および結合イントロンの一部、バクテリオファージＳＰ６プロモー ター、＋ｇＶ、イントロンの一部および結合スプライス・アクセプター、ｔ−Ｐ 　ＡをコートしているｃＤＮＡ、ＳＶ４０の初期ポリアデニル化（”ポリＡ”） 領域、ナラヒにＳＶ４　Ｑの複製起点（”ｏｒｉ−をプラスミドｐＵｃ１１８中 に］は、Ｈｉｎｄｌｌｌ部（ｆｉ（コノウィルスノ５１７１位）の上流のｓ■４ ゜のエンハンサ−および初期プロモーター領域、次いで不ズミノヒドロ葉酸還元 酵素（ＤＨＦＲ）をコードしているｃＤＮＡ、続いて５８４ｂｐのＢ型肝炎ウィ ルス（ＨＢＶ）のポリへシグナルを、プラスミドｐＭＬｌ中のＨＢＶのＢａｍＨ ｌからＢｇｌ１１部位に含有している。このプラスミドは、５Ｖ４Ｑ配列のすぐ 上流にポリリンカーを含有している。

へ’ｙ　９−ｐＲＫ−ｔＰ　ＡオヨヒｐＥ　３４８　ＤＨＦ　ＲＵＣノ一部ヲ次 のようにして単離した（図２）。

（１）ベクターｐＲＫ−ｔＰＡを制限酵素５ａｃｌｌて消化し、次いで大腸菌Ｄ ＮＡポリメラーゼ■（”ｐｏｌｌ”）の太きい（”フレノウ”）断片（フラグメ ント）で処理して、５ａｃｌｌ切断によって生成した３′突出末端を除去した。

これに続いて制限酵素Ｓ　ｐｅ　Ｉによる消化を行なった。ＣＭＶ転写配列の一 部、スプライス・ドナー−イントロン−スプライス・アクセプタ一単位（図２中 の”イノトロン”）、ｔ−Ｐ　Ａ　（１）ｃＤ　Ｎ　Ａ　。

５Ｖ４ＱのポリＡおよびｏｒｉ領域、ならびにｐＵｃ１１８を含有する大きい方 の断片（ＣＭ　Ｖの５°末端に由来する少数のヌクレオナトを含有する）を、断 片の電気泳動分離の後にポリアクリルアミドケルから単離した（°°ケル単離“ ）。

（２）ベクターｐＥ３４８Ｄ）ＩＦＲＵＣを酵素Ｃ１ａｌて消化し、得られた５ ”突出末端を４挿すへてのテオキ／す士ヌクレオチド（ｄＮＴＰ　：ｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ＴＴＰ）の存在下にフレノウｐａｌＩを用いて充填した。

次いで、Ｘｂａｌで消化した後、小さい方のＸｂａｌ−Ｃ１ａｌ断片（３６０ｎ Ｌ）に存在する５Ｖ４Ｑの転写調節配列（ＳＶ４０初期転写開始部位を含むエン ハンサ−および初期プロモーター）をゲル単離した。

単離したｐＲＫ−ｔＰＡおよびｐＥ３４８ＤＨＦＲＵＣの断片を連結してベクタ ーｐｓＶＩ−ｔＰＡを創製した。−す、ｐｓｖ　＋　２−ｔＰＡ ベクターｐｓＶＩ２−ｔＰＡを図３に示すようにして調製した。ここで、ベクタ ーｐｓＶＩ−ｔＰＡのスプライス・トナ一部位は、以下の記載のようにして調製 した３つの断片の連結によって突然変異させだ。ｐＳ　Ｖ　Ｉ　−ｔＰ　Ａの５ °エクソン／イントロンの境界に対してヌクレオチド−３（Ｇ）および−１（Ｃ ）をそれぞれＣおよびＧに変えて、このスプライス・トナー配列かコンセンサス （共ｉ）配列：　ＣＡＧ／Ｇ　Ｕ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ｕと同一になるようにした。こ れを次のようにして行なった。

（１）ベクターｐｓＶＩ−ｔＰＡをＨｉｎｄｌｌｌおよびＢｇｌｌ＋で切断して 、主として３８１位と６１８位の２つのＨｉｎｄｌ１１部位の間のスプライス・ ドナー−イントロン−スプライス・アクセプタ一単位を含有する小さい断片、６ １８位と７７０位のＨｉｎｄｌｌｌおよびＢｇｌ１１部位の間に位置するｔ−Ｐ Ａ　ｃＤＮＡの５”部分を含有する別の小さな断片、ならびにｐｓＶＩ−ｔＰＡ 　ＤＮＡの残りの部分を含有する大きい断片を得た。細菌アルカリホスファター ゼ（”ＢＡＰ”）処理の後に、これら３つの断片をゲル電気泳動によって分離し 、最も大きい断片を回収した。

（２）ベクターｐｓＶＩ−ｔＰＡをＲｓａｌおよびＢｇｌｌ＋で別々に消化し、 ４４３位のＲｓａ１部位から７７０位のＢｇｌ１１部位まで延びる３２７ｎｔの 断片をゲル単離した。この断片は、イントロンの３′部分、スプライス・アクセ プター、およびｔ−Ｐ　Ａ　ｃＤ　Ｎ　Ａの５′部分を含有している。

（３）２種類のオリゴヌクレオチド（図３〜図７中の”プライマー″）を合成し た。第１のもの（ＳＶ１３７９）はｐｓＶｌ−ｔＰＡ＋７）３ｔ７レオチド３７ ９〜４００（上側の鎖）に対応するものであるが、制限エンドヌクレアーゼＥ　 ａｇ　Ｉによって認識される配列（ＣＣ，ＧＣＣＧ）＋６＜得られるように３９ ０位にＧからＣへの変化が導入されており、そしてＨｉｎｄｌ１１部位に重なる 。これは、次の配列を有していた（変化の位置には下線を引いた）： ５−ＡＡＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＧＧＣＣＧＧＧＡＡＣ−３′　。

第２のオリゴヌクレオチド（ＳＶＩ４４８）は４４８位と４２７位の間のｐｓＶ ｌ−ｔＰＡの下側の鎖に配列が一致するものであるが、１１番目のｎｔにＧから Ｃへの変化およびｎｔ−１３にＣからＧへの変化を有する。この配列は、２カ所 の単一ヌクレオチド変化のすぐ５゛側にＲｓａ１部位を含んでいる。このオリゴ ヌクレオチド配列は次のよってあった（対応するｐｓＶＩ−ｔＰＡ配列との相違 点には下線を引これら２種類のオリゴヌクレオチドを用い、ＰＣＲによって３７ ９位と４４８位の間のｐｓＶＩ−ｔＰＡの領域（スプライス、トナーを含む）を 増幅した。このＰＣＲ生成物をＨｉｎｄｌｌｌおよびＲｓａｌで消化し、６２ｎ ｔの断片をゲル単離した。

３種類の単離した断片を連結し、大腸菌ＭＭ２９４に導入した。

プラスミドＤＮＡをいくつかのアンピシリン耐性コロニーから単離し、所望の順 序で連結した３つの断片を有する１つの単離体（ｐＳ　ｖ＋２−ｔＰＡ）のヌク レオチド配列を決定して、２種類のプライマーで指定したヌクレオチド変化の存 在および増幅した断片から得た領域の完全性を確認した。

ｃ、ｐＳＶ　＋　３−ｔＰＡ ベクターｐＳＶＩ３−ｔＰＡを図４に示すようにして調製した。ｐｓＶＩ２−ｔ ＰＡの２つの隣接領域を、ｐｓＶＩ２−ｔＰＡ配列と同一のオリゴヌクレオチド および所望の変化を指定する突然変異オリゴヌクレオチドをそれぞれの場合に用 いてＰＣＲにより増幅した。これらの断片を用いてｐｓＶＩ２−ｔＰＡ中の対応 領域を置換した。単離したこれら断片は次のようであった。

（１）ベクターｐｓＶ１２−ＬＰ、ＡをＨｉｎｄｌｌｌて消化し、消化物をＢＡ Ｐて処理し、２つのＨｉｎｄｌｌｌ断片をケル電気泳動によって分離した。

大きい方の断片をゲルから回収した。これは、スプライス・ドナー−イントロン −スプライス・アクセプタ一単位を含む２３７　ｎｔのＨｉｎｄｌｌｌ断片を除 いて全ｐｓＶＩ２−ｔＰＡ配列を含有していた。

（２）新しいオリゴヌクレオチド（ＳＶＩ５２５Ｂａｍ）を、ｐｓＶＩ２−ｔＰ Ａイントロン内のＡＴＧ）リヌクレオチドのＰＣＲ突然変異誘発のために合成し た。これはｎｔ５２５からｎｔ４９７までのｐｓＶＩ２−ｔＰＡの下側の鎖と配 列が一致するものであるが、５１６位にＴからＡへの変化、５１９位にＡからＣ への変化、および５２３位にＴからＧへの変化を有する。この第１の変化はＡＴ Ｇ　トリヌクレオチドをＴＴＧに変えるために設計した。第２および第３の変化 は酵素ＢａｍＨＩの認識配列（ＧＧＡＴＣＣ）を創製するためのものである。

ＳＶＩ５２５８ａｍのヌクレオチド配列は次のようであった（ｐｓｖｒ２−ｔＰ Ａ配列との相違点には下線を引いた）：５’　−ＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＧＧ ＴＴＡＴＧＴＡＴＴＡＡＴＴＧＴ−３’　。

オリゴヌクレオチドｓｖ＋３７９（上記）およびＳＶＩ５２５Ｂａｍを用いて、 ＳＶＩ５２５８ａｍによって指定される変化を導入しながらｐｓＶＩ２−ｔＰＡ の３７９位と５２５位の間の領域をＰＣＲ突然変異誘発により増幅した。この反 応生成物をＨｉｎｄｌｌｌおよびＢａｍＨＩで消化し、得られた１３７ｎｔの断 片をゲル単離した。

（３）オリゴヌクレオチドＳＶＩ５３９Ｂａｍを、ｐｓＶＩ２−ｔＰＡの分枝点 領域のＰＣＲ突然変異誘発のために合成した。これは５３９位から５７３位まで のｐｓＶＩ２−ｔＰＡ配列（上側の鎖）と一致するものであるが、次の変化を有 していた：即ち、５４１位のＴの代わりにＧ；５４４位のＣの代わりにＴ：５４ ５位のＡの代わりにＣ：５５３位のＡの代わりにＣ１そして、５５５位のＡの代 わりにＧ０最初の３つの変化はＢａａ＋ＨＩ認識部位を創製するためのものであ るが、最後の２つはＢＰＳコンセンサスに類似するシグナルを創製することを意 図するものであった。このＳＶ１５３９８ａｍのｎ　ｔ　配列は次のようであっ た（ｐＳ　Ｖ　Ｉ　２−ｔＰＡ配列からの変化には下線を引いた）： ５’　−ＧＧＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＧＡ（−ＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＣ ＴＴＴＣ−３’　。

オリゴヌクレオチド５ＶＩ６２５を合成した。これは６２５位から６０３位まで のｐｓＶ１２−ｔＰＡ配列の下側の鎖と一致するものであるが、６１７位にＡか らＣへの変化を有し、ＢｓｔＢＩ認識部位（ＴＴＣＧＡＡ）が創製されるように 設計したものである。この５ＶＩ６２５の配列は次のよってあった（変化には下 線を引いた）５−ＣＣＡＡＧＣＴＴＣＧＡＡＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧ−３’　。

オリゴヌクレオチドＳＶ１．５３９Ｂａｍおよび５ＶＩ６２５を用いて、ヌクレ オチド５３９と６２５の間のｐＳＶｔ２−ｔＰＡの領域をＰＣＲによって増幅し 、同時に所望の変化を導入した。このＰＣＲ生成物をＨｉｎｄｌｌｌおよびＢａ ｍＨＩで消化し、７７ｎｔの断片をケル精製した。

３つの断片（図４）を連結し、これを大腸菌ＭＭ２９４に導入した。

プラスミドＤＮＡを多数のアンピシリン耐性コロニーから単離し、１つのフビー それぞれに３つの断片すべてか存在していることを適当な制限酵素による消化お よびゲル電気泳動によって分析した。これら断片の相対的な配向もこの分析によ って決定した。ｐＳＶＩ２−ｔＰＡと同じ順序で３つの構成断片が並んでいる１ つの組換えプラスミド（ｐＳ　Ｖ　Ｉ　３−ｔＰ　Ａ）のヌクレオチド配列を、 ３つの組換え部位（２つのＨｉｎｄｌ１１部位およびＢａｍＨ１部位）をまたぐ 領域において決定した（これら部位の間の全配列を含む）。

ｄ、　ｐＳ　Ｖ　Ｉ　５−ｔＰ　Ａ ベタ５’−ｐｓＶＩ５−ｔＰＡｉｔ、ｐｓＶＴ３−ｔＰＡから、イントロンの一 部とスプライス・アクセプターをＰＣＲ生成させた突然変異断片で置換すること によって構築した（図５に示すように）。ｐｓＶ１３−ｔＰＡの３′スプライス 点に対してヌクレオチド−１６（Ｇ）をヌクレオチドＴに変えて、遮断されてい ない１６ｎｔ長のポリピリミジン域をスプライス・アクセプターの一部として創 製した。また、このベクターを修飾して、このベクター中のスプライス・ドナー 配列（Ｇ／ＧＴＡＡＧＴ）に相補性である配列ＧＡＣＴＴＡＴＴ内に埋設された ３°スプライス点に対して−２３の位置に潜在的な分枝アクセプターｎＬを含ま せた。このＢＰＳと重なるのは、”広い”ＢＰＳコンセンサスに一致し、Ｕ２ｓ ｎＲＮＡ配列に相補性である別のＢＰＳ（ＴＡＣＴＧＡＣ）である。このＢＰＳ 中の分枝アクセプターｎ（は３′スプライス点に対して−２７の位置に存在して いる。最後に、このベクターを、ｐＳ　Ｖ　＋　３−ｔＰＡ中の２つのＢＰＳの すく上流に第３のＢＰＳを挿入することによって修飾する。この第３のＢＰＳＢ ＰＳ中の分枝アクセプターは３′スプライス点に対して−３４の位置に存在して いる。

り５ＶＩ５−ｔＰＡを創製するための断片は次のようにして調製した。

（１）ベクターｐｓＶＩ３−ｔＰＡをＢａｍＨＩで消化し、得られた５゜突出末 端を４挿すへてのｄＮＴＰの存在下にＴ４ＤＮＡポリメラーゼで充填した。次い て、この物質をＢｓｔＢｌで消化し、ＢＡＰて処理し、ｐｓＶＩ３−ｔＰＡのス プライス・アクセプター配列およびイントロンの一部を除くすべてを含有する大 きい方の断片をゲル単離した。

（２）中間生成物を単離することなく連続的なＰＣＲ増幅において使用するため に２つの新しいオリゴヌクレオチドを合成した。多種の突然変異を導入するこの 方法を採用して、樟的に対して多数の誤対合を有する単一の長いオリゴヌクレオ チドの使用を避けたく比較的長い合成オリゴヌクレオチドは正しくない配列の分 子を比較的大きな比率で含有していることが多い）。さらに、将来においてこの 第１のオリゴヌクレオチドを単独で用いて、分枝点およびスプライス・アクセプ ター領域がｐｓＶＩ３−ｔＰＡと異なるベクターを創製することができるであろ う。

第１のオリゴヌクレオチド５ｖＩ４は、ｐＳ　Ｖ　Ｉ　３−ｔＰＡ（５４５〜５ ５７位）と共通する３°末端の１３ヌクレオチドを有していた。

これらヌクレオチドの前に、５２３〜５４４位のｐｓＶＩ３−ｔＰＡ配列に類似 するが同一ではない２２ヌクレオチドの配列が存在していた。この相違は次のよ うであった（下では下線を引いた）即ち、５２８位にＧからＴへの変化；５３５ 位にＡからＴへの変化：５３７位にＣからＡへの変化、５３８位にＣからＴへの 変化；５３９位にＡからＴへの変化、そして、５４４位にＧからＴへの変化を有 する。この最後の変化はスプライス・アクセプターのポリピリミジン域の延長を 引き起こすであろうし、また、最初の変化はｐＳＶＩ３−ｔＰＡ配列ＧＡＣＴＧ ＡＣをＢＰＳコンセンサス配列（Ｕ２に対合する）に一致するように変えるであ ろう。残りの４つの単一ヌクレオチド変化は、スプライス・トナーに相補性であ る配列を創製するように設計した。５Ｖ１４の配列は次のようである５’　−Ｃ ＴＡＴ何ＡＣＴＧＡＣＴＴＡＴＴＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣ−３° 　。

第２のオリゴヌクレオチド（ＳＶＩ５）は５Ｖ１４の中心部分と重なる。これは ５ＶＩ４の５個の５°末端ｎｔが異なっており、５゛方向に延長して酵母のＢＰ Ｓ（ＴＡＣＴＡＡＣ）を導入したものである。

この配列は次のようである（下線は対応するｐｓＶＩ３−ｔＰＡ配列との相違点 を示す）・ ５−ＣＴＡＣＴＡＡＣＴＡＣＴＧＡＣＴＴＡＴＴＣＴＴＴ−３”。

このｐｓＶ！３−ｔＰＡのＢＰＳ／スプライス・アクセプター領域を、オリゴヌ クレオチド対５ＶＩ４／５ＶＩ６２５を用いるＰＣＲ突然変異誘発によって増幅 し、突然変異させた。このＰＣＲ生成物を希釈し、オリゴヌクレオチド対５ＶＩ ５／５ＶＩ６２５で再１１幅した。この生成物をＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよび Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理し、制限酵素ＢｓｔＢＩで切断し、７１ｎ ｔの断片をゲル単離した。

この２種類の単離した断片（図５）を連結し、形質転換された（アンヒフリン耐 性）細菌コロニーからプラスミドＤＮＡを得、ｐｓＶＩ３−ｔＰＡについて上記 したようにして分析した。所望のイントロン変化のすへてを保持する単離体の１ つをｐｓＶＩ５−ｔＰＡと命名した。

配列決定によって、スプライス・ドナー−イントロン−スプライス・アクセプタ 一単位の外側に予期しない別の変化が同定された。

２個の付加的なヌクレオチド（ＧＣ）がｐｓＶ１５−ｔＰＡ中のｐｓＶＩ３−ｔ ＰＡのＢｓｔＢ１部位内に存在しくＴ　Ｔ　ＣＧ　Ａ　ＡかＴＴＣＧＣＧＡＡに 変化）、従ってこの部位がｐｓＶ１５−ｔＰＡに存在しなくなった。しかし、こ の２つの付加的なヌクレオチドは酵素ＮｒｕＩの認識部位を創製したくこの部位 はこのベクター中で１つしかない）。この付加的なヌクレオチドは、連結に用い た２つの構成断片のＢｓｔＢＩ突出末端の予期しない充填の結果である可能性が 最も高い。

ｅ、ｐＳＶ　ｌ　６Ｂ−ｔＰＡ ｐｓＶ１５Ｂ−ｔＰＡはｐｓＶＩ’５−ｔＰＡについて上記した方法と同様の方 法によって創製した。即ち、部分的に重なる突然変異オリゴヌクレオチドによる ２回の連続増幅を用いて、ｐＳＶＩ３−ｔＰＡのインドロン−スプライス・アク セプター領域中の所望の変化を創製した（図６に示す）。

第１のオリゴヌクレオチド（ＳＶＩ６Ａ）は次の配列を有しくｐ、５Ｖ１３−ｔ ＰＡ、５２３〜５５０位との相違点には下線を引いた）：５°−ＣＣＴＧＡＣＡ ＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴ工ＣＣＴＴＴＣ−３°　。

また、第２のオリゴヌクレオチド（ＳＶＩ６Ｂ）は次の配列を有していた（ｐｓ 　Ｖ　Ｉ　３−ｔＰ　Ａの５２３〜５４５位と比較して）：ｓ′　−Ｃ：ＴＡＣ ＴＧＡＣＡＣＴＧＡｃ］八ＴＣＣＡＣＴＴＴＴＣ−３へ　。

ＳＶ　ｌ　６Ａにおけるヌクレオチド置換は、５２４位のＴからＣ１５２６位の ＴからＧ、５２８位のＧから０１および５４４位のＧからＴであった。５ＶＩ６ Ｂによって指定される変化は、ｐＳＶＩ３−ｔＰＡのヌクレオチド５２５と５２ ６の間のＣの挿入、ヌクレオチド５２６と・５２７の間のＧの挿入、Ｃによる５ ２８位のＧの置換、および５４４位のＧからＴへの変化であった。これらの変化 は、ｐＳＶＩ３−ｔＰＡのＢＰＳを最適化し、それと正に境界を接する第２のＢ ＰＳを５“側に導入するために設計した。これら２つの分枝点配列は中心のＣの ところで重なり、これらを５ＶＩ５Ｂ配列において［］内に示す。

ｐＳＶＩ５−ｔＰＡについて記載したようにして、５ＶＩ６２５の存在下でオリ ゴヌクレオチド５ＶＩ６Ａおよび５ＶＩ６Ｂによる連続増幅を行なって、ｐｓＶ Ｔ３−ＬＰＡのインドロン−スプライス・アクセプタ一単位を修飾した。また、 ＰＣＲ生成物の酵素処理、ゲル単離、およびＰＳＶＩ３−ｔＰＡの大きいＢａｍ ）（Ｉ　−ＢｓｔＢ　Ｉ断片への連結もｐＳＶＩ５−ｔＰＡについて記載したよ うにして行なった。

アンピシリン耐性の細菌コロニーの１つからのプラスミドＤ　Ｎ　Ａ　（このプ ラスミド単離体をｐｓＶ１６Ｂ−ｔＰＡと命名した）のヌクレオチド配列分析に より、５ＶＩ６Ｂオリゴヌクレオチドによって指定される修飾に加えていくつか の予期しない変化が示された。即ち、５４５位カｐＳ　Ｖ　＋　３−ｔＰ　Ａ（ ＤＣテハナ＜　Ｔ　テあり、５５０位もｃではなくＴであり、そしてｐＳＶＩ５ −ｔＰＡ中にＮ　ｒｕ　［制限部位を創製する付加的なジヌクレオチドがｐＳＶ Ｉ６Ｂ−ｔＰＡ配列中に存在していた。この初めの２つの変化はｔ−ＰＡの発現 に悪影響を及ぼすものとは予想されず、補正しなかった。

２、広目的の親ベクターｐｓＶ１５８５およびｐｓＶ１６８７の構築法（利用で きる別種ポリペプチドの発現のための親ベクターを、図７に示す、にうにＬＴｐ ＳＶ　ｌ　６Ｂ−ｔＰＡから導イタ。ｐｓＶ＋５Ｂ５と呼ぶこのベクター（大腸 菌株＾ＴＣＣＮｏ、　６８．１５１を形質転換）は、ｐＳＶＩ６８−ｔＰＡ中の ｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡの代わりにポリリンカー領域を担持している。別の有用な親 ベクターであるｐＳＶＩ６Ｂ７（ｐＲＫ７由来）のポ’Ｊ　’）　ンカ−ｉ；Ｌ ｐＳＶ　［６Ｂ５［ｐＲＫ５由来、ＥＰ公開Ｎ　ｏ、　３０７．２４７（１９８ ９年３月１５日公開）３のポリリンカーと同一であるが、Ｃ１ａｌとＨｉｎｄｌ ｌｌの間のポリリンカー領域中のエンドヌクレアーゼ制限部位の順序が逆になっ ている。これらのポリリンカー領域は好都合かつ唯一の制限エンドヌクレアーゼ 認識部位を与え、これら部位を用いて所望のポリペプチドをフードしている任意 の配列を導入することができ、この配列の発現はｐｓＶＩ６８−ｔＰＡスプライ ス単位中に存在する修飾によって影響を受けるであろう。

ベクターｐｓＶ１６８５は、図７に示し以下に説明するように４工程で創製した 。初めの３工程は、ｐｓＶ１６Ｂ−ｔＰＡからＢａｍＨｌ　、　Ｈ１ｎｄｌｌＬ および５ａｉｌ制限部位をそれぞれ除去することからなる。その結果、最後の工 程でｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡをポリリンカーで置換することにより、ポリリンカーの これら酵素の部位が、得られた親発現プラスミド中で唯一のものとなった。

ａ　第１の中間体プラスミドｐｓ　Ｖ　１６８−ｔＰ　Ａｄ（ｂ）の構築ベクタ ーｐｓＶ１６Ｂ−ｔＰＡをＢａｍＨＩ（イントロン内だけを切断する）で消化し 、得られた５′突出末端をｄＮＴＰの存在下にＴ４ＤＮＡポリメラーゼで充填し 、直線化されたベクターをゲル単離し、そしてＴ４ＤＮＡリガーゼて処理して再 環化した。これによりＢａｍＨｒ認識配列が失われ、代わりに、酵素Ｃ１ａｌの 認識配列が創製された。しかし、プラスミドＤＮＡをｄａｍ”大腸菌から得ると きには、メチル化によりＣ１ａｌはこの配列を切断することができない。

ｂ　第２の中間体ブラｘ　ミＦｐＳ　Ｖ　Ｉ　５　Ｂ−ｔＰ　Ａｄ（ｂｈ）（７ ）構築プラスミドｐＳ　Ｖ　Ｉ　６　Ｂ−ｔＰ　Ａｄ（ｂ）をＨｉｎｄｌｌｌ（ スプライス単位の両側を切断する）で消化し、５′突出末端を４種すべてのｄＮ ＴＰの存在下にＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼで充填し、反応混合物の一部を ＢＡＰで処理した。この処理および未処理の両温合物中に存在する２種類の断片 をゲル電気泳動によって分離し、大きい方の断片は処理した混合物から、そして 小さい方の断片は未処理の混合物から単離した。これら２つの断片を連結してプ ラスミドｐｓ　Ｖ　１５８−ｔＰＡｄ（ｂｈ）を創製した。画構成断片のＨｉｎ ｄｌｌｌ末端の充填によって、得られるプラスミド中に２つのＨｉｎｄｌ１１部 位が存在しなくなり、同時に酵素Ｎｈｅｌの２つの新しい認識部位か創製された 。

Ｃ４第３の中間体プラスミドｐＳ　Ｖ　１６８−ｔＰ　Ａｄ（ｂｈｓ）の構築単 一の５ａｌｌ認識部位を、この酵素による消化、ｄＮＴＰの存在下でのＴ　４　 Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ処理、直線プラスミドＤＮＡのゲル単離、およびＴ４Ｄ ＮＡリガーゼを用いる再環化によってプラスミドｐＳ　Ｖ　Ｉ　６Ｂ−ｔＰ　Ａ ｄ（ｂｈ）から除去した。これにより、新たにＰｖｕＩ認識部位が創製される結 果になった。

ｄ、プラスミドｐＳＶ■６Ｂ５およびＰＳＶＩ６Ｂ７（７）構築最後の多目的の 親プラスミドを創製するために、次のようにして２種類の断片を調製した。

（１）ブーｙｘミＦｐＳ　Ｖ　ｒ　６　Ｂ−ｔＰ　Ａｄ（ｂｈｓ）をＰｓｔＩお よびＣ１ａｌで消化した。このプラスミド中にはＣ１ａｌの認識部位が３カ所存 在する。１つはｔ−Ｐ　Ａ配列の前のイントロン中に、１つはｔ−Ｐ　Ａ　ｃＤ 　ＮＡとＳＶ４０初期ポリＡ領域の境界に、そして１つはポリＡ１Ｔｌ域の末端 近くに存在する。これら部位の１つだけ（第２の部位）がメチル化に対して非感 受性である。従って、ｄａｍ″ＭＭ２９４から調製したプラスミドＤＮＡはＣ１ ａＩによってこの部位でのみ切断された。

Ｐｓｔｌ認識部位はスプライス単位とｔ−Ｐ　Ａ　ｃＤ　Ｎ　Ａの連結点に位置 しており、さらにいくつかがこの位置とメチル化−非感受性のＣｌａｌ部位の間 のｔ−Ｐ　Ａ配列中に存在している。従って、ＰｓｔｌとＣ１ａＩによる切断に よって、ｔ−ＰＡの配列を含有する数個の比較的小さい断片とｔ−ＰＡのｃＤＮ Ａを除＜　ｐｓ　Ｖ　１６８−ｔＰ　Ａｄ（ｂｈｓ）配列のすべてを含有する大 きい断片が得られた。この大きい方の断片をゲル単離した。

（２）２つのオリゴヌクレオチドを合成した。これらは、第１のオリゴヌクレオ チド（５Ａと呼ぶ）の全長（４７ｎｔ）にわたって相補性であった。第２のオリ ゴヌクレオチド（５Ｂ）は、その５′末端のところが２ヌクレオチド延ひ、その ３′末端のところか４ヌクレオチド延びていた（以下の５Ｂ配列において下線を 引いた）。従って、これら相補性のオリゴヌクレオチドをアニーリングすると、 １つの５゜および１つの３′突出末端（”オーバーハング）を有するＤＮＡ断片 が得られた。４ｎｔの３゛突出末端の配列はＴＧＣＡ−３’であり、これはＰｓ ｔｌ認識部位のＰｓｔｌ切断によって創製される３′オーバーハングと相補性で ある。２ｎｔの５°突出末端はジヌクレオチド５°−ＣＧからなり、これはＣ１ ａｌ制限部位のＣ１ａｌ切断によって創製される５′オーバーハングと相補性で ある。さらに、これら２つのオリゴヌクレオチド配列を、多数の制限エンドヌク レアーゼ認識部位を与えるように設計した（これらの一部を、以下に示す各オリ ゴヌクレオチド配列の下に示す）。オリゴヌクレオチド５Ａの配列は次のようで ある： ５’　−ＴＣＧＡＴＴＧＡＡＴＴＣＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣ ＧＡＣＣＴＧＣＡＧ＾＾ＧＣＴＴ−３’ＥｃｏＲＩＳａ＋ａｌＢａｆｆＩＨＩＸ ｂａｌＳａｌｌＰｓｔｌＨｉｎｄｌ［Ｉオリゴヌクレオチド５Ｂの配列は次のよ うである：オリゴヌクレオチド５Ａおよび５Ｂをアニーリングし、単離したｐＳ 　Ｖ　ｌ　６　Ｂ−ｔＰ　Ａｄ（ｂｈｓ）断片に連結してプラスミｌ’ｐＳＶＩ ６Ｂ５を創製した。Ｐｓｔｌオーバーハングをアニーリングしたオリゴヌクレオ チドのＴＧＣＡ−３’オーバーハングに連結してもＰｓ目部位は再生されず、Ｃ ｌａｌ部位が創製された。このリンカ−の他の末端におけるＣ１ａｌオーバーハ ングの５°−ＣＧオーバーハングへの連結はＣｌａｌ部位を再生しなかった。

プラスミドｐＳＶＩ６８７は、以下の２つのオリゴヌクレオチドを用いて同様の 方法で創製した（７Ａおよび７Ｂ、これらオリゴヌクレオチド中の制限部位の順 序は、オリゴヌクレオチド５Ａおよび５Ｂと比較して、突出末端に対して逆にな っていることに注意）。

７Ａ　。

５′−八ＡＧＣＴＴＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧ ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＡＴ−３’Ｈｉｎｄｌｌｌ均１１シリＩ　聯Ｉ均猥旧膿Ｉ　 均四Ｒ１７Ｂ・ の構築ならびに潜在性関与ペプチドをフードする遺伝子の発現ａ　プラスミドの 調製 本実施例で調製するポリペプチドは、成熟ＴＧＦ−βをその前駆体の残りの部分 から切断したときに残る潜在性関与ペプチド（ＬＡＰ）である。このペプチドを 用いて過剰のＴＧＦ−βを浄化するが、またはＴＧＦ−βが活性化のための部位 に到達するまでそれを潜在性のまま維持することができる。

図８は、ＬＡＰの完全なヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列を示すもので ある。ペプチドの予想アミノ酸はＤＮＡ配列の下に示し、ペプチド配列のＮ−末 端の最初の残基がら数を付している。

成熟ＴＧＦ−βの配列は含まれていない。負の数はシグナル配列を示し、正の数 は分泌されるペプチドの配列を示す。

ブ５７．ミ）’ｐＳＶＩ６Ｂ−ＬＡＰ−３ＥＲ（ｔ、通常ｆｔＴＧＦ−β１前駆 体中の塩基性切断部位の前にある、セリン残基＃２７５で終わるＴＧＦ−βｌの プレプロ領域の配列を含んでいる。プラスミドｐＳＶ　Ｉ　５Ｂ−ＬＡＰ−ＡＲ Ｇは、停止コドンのすぐ５゛側のコドンによってコードされているアルギニン残 基＃２７９で終わることを除いて同一のものである。ｐｓｖ　１６Ｂ−ＬＡＰ− ３ＥＲおよびｐｓＶ１６Ｂ−ＬＡＰ−ＡＲＧの構築を図９に示す。プラスミドｐ ＳＶ１６Ｂ−ＬＡＰ−ＡＲＧを大腸菌株に導入し、得られた宿主を１９８９年１ ０月２５日（こＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ ｉｏｎ［Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　；八ＴＣＣＮ。

ａｓ、　１ｓｏｉに寄託した。

詳しく説明すると、これらのベクターは次のようにして調製した。

ＥｃｏＲｌおよびＢｇｌｌｌ末瑞にしたプレプロＴＧＦ−βをコードしている読 み取り枠Ｄ　Ｎ　Ａ　［Ｅ　Ｐ公開Ｎｏ、　２００．３４１（１９８６年１２月 １０日公開）］を単離した。ベクターｐＲＫ５をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで 切断し、大きいベクター断片を単離した。小さいＥｃｏＲＩ　−Ｂｇｌｌｌ断片 と大きいｐＲＫ５ベクター断片を連結して、１）ＲＫ５のポリリンカー配列の２ １ｂｐ欠失を何するプラスミドｐｓＢβＩＭＦを得た。９３８２１Ｍ　Ｆ　ハ、 ＣＭＶプロモーター／エンハンサ−によって駆動する前駆体ＴＧＦ−βフード化 ＤＮＡと、それに続いてスプライス・ドナー−イントロン−スプライス・アクセ プター領域をこのＴＧＦ−βコード化Ｄ　Ｎ　Ａの５′側に有している。このＴ ＧＦ−βフード化ＤＮＡの３°末端には、ＳＶ４０の初期ポリＡおよび５Ｖ４Ｑ の復製起点が存在する。

このベクターｐＳＢβＩＭＦをＡｐａｌおよびＨｉｎｄｌｌｌで消化し、大きい ベクター断片を単離した。この断片を以下に示す２種類のオリコヌクレオチドの どちらかと連結した。

ＬＡＰ−ＡＲＧ： Ａｐａｌ　５’−ＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＡＡＡＧＣＴＣＣＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣ ＧＡＴＡ（Ａ）　ＨｉｎｄｌｌｌＣＧＧＧＴＣＧＴＡＧＡＣＧＴＴＴＣＧＡＧＧ ＧＣＣＧＴＧＧＣＧＧＣＴＡＴ　Ｔ　ＴＣＧＡＧｌｎＨｉｓＬｅｕＧ１ｎＳｅｒ ＳｅｒＡｒｇＨｉｓＡｒｇＡｒｇ停止Ａｐａｌ　、５°−ＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣ ＡＡＡＧＣＴＣＣＴＡ（Ａ）　ＨｉｎｄｌｌｌＣＧＧＧＴＣＧＴＡＧＡＣＧＴＴ ＴＣＧＡＧＧＡＴ　Ｔ　ＴＣＧＡＧｉｎ）ＩｉｓＬｅｕＧｌｎＳｅｒＳｅｒ停止 得られたプラスミドｐＴＧＦ−βＬＡＰ１＋２およびｐＴＧＦ−βＬＡＰ３＋４ をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌで切断し、小さい断片を単離した。次いで、 これらの断片を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌて切断したｐｓＶ１５Ｂ５由 来の単離ベクター断片に連結して、ＬＡＰ断片をこのベクターのポリリンカー領 域に挿入した。得られたプラスミドをｐＳＶ　１６Ｂ−ＬＡＰ−５ＥＲおよびｐ ＳＶ　ｌ　６Ｂ−ＬＡＰ−ＡＲ６０闘皿に全面の約３０％で蒔いたヒト２９３Ｓ 細胞［ＧｒａｈａＩｌｌおよびｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５ ２：　４５６−４６７　（１９７３）コを、ｐＳＶＩ６Ｂ−ＬＡＰ−５ＥＲまた はｐＳＶＩ６８−ＬＡＰ−ＡＲＧ（２，５μｇ）とプラスミドＲ３Ｖ　Ｔ−抗原 （２μｇ）を用いてその翌日にトランスフェクションした［Ｇｏｒｍａｎら、　 ５ｃｉｅｎｃｅ　２２１：　５５１−５５３　（１９８３）］。その翌日に、３ ＳＳ−システィンおよび３ＳＳ−メチオニンをそれぞれ２５０μＣｉ／ｍｌで含 有する血清不含のＤＭＥＭ（１，０ｍ１）中で１〜２時間、細胞を標識した。標 識化培地を除去し、血清不含培地（１ｍｌ）中で４〜５時間、分泌タンパク質を 集めた。この上清を遠心して透明にし、すすいだ細胞を溶ｍ緩衝液［リン酸緩衝 食塩水中、１％Ｎｏｎ１ｄｅｔＰ４０；０．５％デオキシフレート、０，１％　 ＳＤＳ　；　５ｍＭ　ＥＤＴＡ］（０，５ｍ１）中で溶解し、１０分間回転させ 、溶菌液を使用時まで凍結させた。

分泌されたタンパク質（１００μｌ）を、組換えヒトＴＧＦ−β１に対して生成 させた不ズミ抗体で免疫沈澱させた。ＴＧＦ−β抗体で沈澱させようとする上清 は、抗体の添加前に０．１％ＢＳＡの存在下に７５°Ｃで５分間加熱し、そして 氷上で冷却した。分泌されたタンパク質の免疫複合体をＰ　ａｎｓｏｒｂｉｎ（ Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で沈澱させ、細胞溶解液はプロティンＡ　−３ｅｐｈａ ｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で沈澱させた。変性した免疫沈澱物または全分 泌タンパク質（１５μＩ）を１３％５ＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動に付し、ゲルを Ｅ　ｎｈａｎｃｅ（Ｄ　ｕ　Ｐ　ｏｎｔ）により透過し、−７０°Ｃで３日間暴 露した。

トランスフェクションした細胞からの″′Ｓ−標識した全分泌タンパク質の５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥのオートラジオグラフィーにより、ｐＳＶｌ　６　Ｂ−ＬＡ　Ｐ− ３Ｅ　ＲがＬＡＰであることを示す約７５Ｋｄのタンパク質を生成することがわ かった。ＴＧＦ−β１免疫沈澱物の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析のオートラジオグラフ ィーにより、ＬＡＰは成熟ＴＧＦ−β１に指間性の抗体と免疫沈澱しないことが わかった。

Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ（上記）の一般的方法を用いて、ＣＨ ○−ｄｈｆｒ−細胞［例えば、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ（上記）が記載 しティる細胞］を、ｐＳＶｒ６Ｂ−ＬＡＰ−５ＥＲ＊たはｐＳＶ１６Ｂ−ＬＡＰ −ＡＲＧのどちらかと、ｄｈｒｒ選択ベクターｐＦ　Ｄ　ｌ　１　［Ｓｉｍｏｎ ｓｅｎおよびＬｅｖｉｎｓｏｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　ｌ＾ｃａｄ、ｓｃｉ、 ＵｓＡ　８０：　２４９５−２４９９　（１９８３）］で同同時トランスフエフ シタした。後者プラスミドはＤＨＦＲをコードしており、従ってトランスフェク ションされた細胞にメトトレキセート耐性を付与し、ＬＡＰを発現する形質転換 体の選択を可能にする。形質転換したｄｈｆｒ−細胞を、グリシン、ヒボキサン チンおよびチミジンを欠く培地で増殖させることによって選択した。この選択培 地で生成したコロニーを綿棒を用いて単離し、同一の培地中で数世代まで増殖さ せた。細胞増殖の後、常法により漸増量のメトトレキセートを用いて細胞を増幅 し、選択した。

次に、一時的な発現に対して上に記したようにして細胞を襟識し、分析した。両 形質転換体は、ＬＡＰ−３ＥＲまたはＬＡＰ−ＡＲＧセグメントであることを示 す約７５Ｋｄのタンパク質を生成した。

実施例２　２９３ＳおよびＣＨＯ細胞から分泌されたＬＡＰの生物活性 １、一時的な５２９３細胞トランスフエクシヨンの生物活性ｐｓＶＩ５Ｂ−ＬＡ Ｐ−５ＥＲまたはｐＲＫＴＧＦ−β［完全長のＴＧＦ−β（前駆体ＴＧＦ−β） を挿入体として含有するｐＲＫ５であるコのどちらかでトランスフェクションし た２９３Ｓ細胞から、血清不含の培養液を集めた。この培養液を用いて、ＴＧＦ −βの標準的な生物検定法として使用されるミンク肺線維芽細胞検定においてＴ ＧＦ−βに対するＬＡＰの効果を試験した。ＴＧＦ−βの上清を７５°Ｃて５分 間処理することによって熱活性化し、１：１００．１：２００゜１：４００．１ ：８００、およびｌ　：　１６００の一連の希釈液を調製した。これら希釈液の それぞれに１・２００希釈のＬＡＰ上清（未処理または熱処理）を加えた後に検 定を行なった。

図１０に示すように（図中、円は熱活性化ＴＧＦ−β、破線を伴う四角は熱不活 性化ＬＡＰ、そして実線を伴う四角は未処理のＬＡＰである）、熱処理したＬＡ Ｐの添加はＴＧＦ−βの生物学的活性に影響を及ぼさず、熱が不可逆的にＬＡＰ を不活性化することを示した。

対照的に、未処理のＬＡＰタンパク賃を存在させることによって、ＴＧＦ−β活 性の量を減少させるか（１：１００から１・４００希釈まで）、または過剰に存 在しているときにはＴＧＦ−β活性を完全にＣ肖失させることができｔこ（１： ８００から１　：　１６００まて）。

ミンク肺線維芽細胞セルラインへの未処理ＬＡＰ上清の添加によって、ＴＧＦ− βｌの基本（ベースライン）産生が３ｎｇからＯｎｇに減少した。この結果は、 ＬＡＰがＴＧＦ−βの阻害活性を逆転させたことを示すものである。

２　安定なＣＨＯ細抱トランスフェクションの生物活性実施例ＩＣに記載したよ うにメトトレキセートを用いて選択した細胞から血清不含の培養液（２，５ｍ１ ）を集めた。この培養液の生物活性を、トランスフェクションした５２９３細胞 に対して上に記したようにして測定した。この結果を以下の表に示す。

培養液のｆｆｔ　ＴＧＦ−βの生物検体による活性（ｎｇ／ｍ＋）ｐｓＶＩ６８ −ＬＡＰ−ＡＲＧ　ｐｓＶＩ６Ｂ−ＬＡＰ−３ＥＲｏ　２７２６　２７６２ ＩＯラムタ　＋７９５　９０７ ５０　ラムダ　６２７　ＬＴＳ ２５０　ラムダ　１７１　ＬＴＳ ２５０　ラムダ、加熱　２６９８　２８ｇ２２つのプラスミドによって得られる ＬＡＰの間の活性（成熟ＴＧＦ−βを不活性化する能力）の差異は、細胞からタ ンパク質を取り出すのに必要な各セルラインの量に関係しており、生成したＬＡ Ｐ形態の特異的な活性にはよらない。この結果から、未処理ＬＡＰ上清の濃度が 増加するにつれてＴＧＦ−βの活性が直線的に減少するこＬ−９２９検定系が好 都合なインビトロ検定法であり、所望により免疫機能の適当な調節物質との関係 で、本発明に係るＬＡＰの活ｉ、ＵａＡ　７２：　３６６６　（１９７５）’！ のインビボの腫瘍壊死検定との関速度は現在のところ未知であるが、この検定法 が具体的にネズミの腫瘍細胞を利用しているのでその関速度は高いものと予想さ れる。タンパク貫である膿瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）とリンホトキンン（ＴＮＦ −β）はこの検定において活性を与える。この検定は米国特許Ｎ　ｏ、　４．４ ５７．９１６に記載されている検定（ネズミＬ−Ｍ細胞とメチレン・ブルー染色 を用いる）とその概念が類似している。しかし、このＬ−９２９検定は、ヒト腫 瘍セルライン細胞毒性と関係することが示されている（Ｈし一６０細胞から導か れたＴ　Ｎ　Ｆ−αに対して）。

ここでのＬ−９２９検定系においては、Ｌ−９２９細胞を微量滴定プレート中の 単層として一晩調製する。最良の試料をプレートを横切って２倍に希釈し、ＵＶ 照射し、次いて調製細胞単層に添加した。

次に、ウェル中の培養培地をｌμｇ／ｍｌアクチノマイ／ンＤにする。

このプレートを３７°Ｃで１８時間インキュベートし、顕微鏡のもとて視覚によ り採点した。各ウェルに、ウェル中の細胞死の程度を示す２５．５０．７５、ま たは１００％の評点を与える。１単位のＴＮＦ活性を、５０％死滅が起こる希釈 の逆数と定義する。

２、インビボの検定 さらに、この薬物の腫瘍を死滅させるかもしくは腫瘍増殖を抑制する能力、およ び腫瘍を有する動物を死から保護する能力を用いて、調製物の活性を試験するこ とができる。Ｂａ１ｂ／ｃマウスに種々の型の腫瘍細胞を皮下注射して局所的な 腫瘍を生成させる。腫瘍セルラインには、腹水液から細胞懸Ｅａとして得られる ＭｅｔｈＡマウス線維肉腫、および１　ｍｍ’塊の細胞として投与されるヒト乳 癌ＭＣＦ−７が含まれる。

検定のために、ＭＣＦ−７塊または０．１ｍＬ培地中に５ｘｌＱ５の線維肉腫細 胞を含有する懸濁液のどちらかを２６ゲージ注射針で雌性Ｂａ１ｂ／ｃマウス（ １９〜２２ｇ）に皮下注射する（線維肉腫懸濁液は８日齢の腹水液から細胞計数 と血清不含培地による希釈によって調製する）。９〜１０日後に腫瘍が明瞭にな ったときに、マウスあたり１ＬｇのＴＮＦ−αを静脈内注射し、必要なら後日に ＴＮＦ−αの投与を繰り返す。結果は、腫瘍の容積を測定することによって、お よび生存率によって評価する。マウスあたりｌμｇのＴＮＦ−αおよびマウスあ たり１０　ｍｇｌ　ｋｇのＬＡＰ（実施例１の記載のようにして調製し、常法に よって精製した）の独立した連続注射を用いてこの試験を繰り返す。

Ｌ　Ａ　Ｐは、上記のインビボおよびインビトロの両試験においてＴＮＦ−αの 腫瘍減少活性を増強することがわかる。

実施例４　Ｍ−Ｃ８Ｆの検定 肉腫細胞死滅を測定するための検定においては、１２００　Ｕ／ｍｌのＭ−Ｃ３ Ｆを含有するネズミし細胞培養液としてのネズミｒＭ−Ｃ５Ｆ（米国特許Ｎ　ｏ 、　４．８４１．２０１のように調製）と共に、およびそれを含まずに、ならび に上記のネズミＭ−ＣＳ　Ｆ培養液と１ｍｇ／ｍｌのＬＡＰ（実施例３で用いた ）を含有する製剤と共に、通常の２時間付着Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス腹腔マクロフ ァージをインビトロで１日間インキュベートする。次いで、このインキュベート 物を、２０：１の比で、３Ｈ−チミジン標識したマウス肉［１ＴＵ５細胞ならび に１０％（ｖ／　ｖ）ｃｏｎＡ　Ｘ導（１０μｇ／ｍｌ）した膵臓リンホカイン （ＬＫ）（これはγ−インターフェロンを含有する）と混合する。次の４８時間 にわたる標識チミジンの放出を＠瘍細胞死滅の尺度として用いる。

ＬＡＰは、ネズミマクロファージによる腫瘍細胞の死滅化を刺激するＭ−Ｃ３Ｆ の能力を増強することがわかる。

実施例５１Ｌ−２の検定 実施例３で用いたＬＡＰは、誘導したＪ　ｕｒｋａｔセルラインから単離した天 然の精製ＩＬ−２に追加すると、ＨＴ−２細胞増殖検定［ｗａｔｓｏｎ、　Ｊ、 ＥｘＰ、Ｍｅｄ、１５遼：　１５１０−１５１９　（１９７９）およびＧ１１ｌ ｉｓら、　Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．１２３０：　２０２７−２０３２　（１９７９ ）］におけるその特異的な生物活性によって測定したときに、ＩＬ−２の効力を 高めることがわかる。

実施例６ 足に深い傷を持ち、軟組織感染を導（抑制免疫系を有する体重９０ｋｇの６０才 の男性患者に、ヒト血清アルブミン（５ｍｇ）、塩化ナトリウム（８ｍｇ）、リ ン酸水素カリウム（０，２ｎ＋ｇ）およびリン酸水素二ナトリウム（１、４ｍｇ ）を用いて製剤化した実施例３で用いたＬＡ　Ｐ（１０ｍｇｌ　ｋｇ）を、１ポ ーラスで注射する。治療の２週間後に、患者の感染が解消する。

実施例７ Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ感染を有する体重７０ｋｇの５５才の男性患者は 免疫抑制されており、従って二次感染にかかつている。この患者に、実施例３で 用いたＬＡＰを０　、１　ｍｇ／　ｋｇの用量で含有する組成物を５週間にわた って連続注入する。この治療の結果、二次感染が解消する。

実施例８ 手術の結果として腕に深い切創を有し、免疫抑制された状態に起因する軟組織感 染を有する体重８５ｋｇの５０才の男性層者に、組換えヒトＩＦＮ−７（米国特 許ＮＯ，４，７６２，７９１）（２５μｇ／ｍ”）、実施例３で用いたＬＡＰ（ １ｍｇ／ｋｇ）、ヒト血清アルブミン（５ｍｇ）、塩化ナトリウム（８ｍｇ）、 リン酸水素カリウム（０，２ｍｇ）およびリン酸水素二す）　ＩＪウム（１，４ ｍｇ）を含有する製剤を静脈内注射する。この治療を４週間にわたり週５回行な う。４週間後に感染が解消する。

体重７５ｋｇの３５才の男性患者は身体の５０％に３度の火傷と軟組織感染に導 く抑制された免疫系を有する。この患者に、実施例６の組成物を５週間にわたり 週３〜５回静脈内注射する。３週間の治療の後に、患者の表面感染は解消する。

虱Ｕの寄託 以下の菌株をＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔ　ｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔ ｉｏｎ（Ａ　Ｔ　ＣＣ：　１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏ ｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ、　ｔｌｓＡ）に寄託している：菌　株　ＡＴＣＣ受託 番号　寄託口 ２９４／ｐｓＶ１６Ｂ−ＬＡＰ−ＡＲＧ　６ｇ、　１５０　１９８９年１０月２ ５日２９４／　ｐｓＶＩ６Ｂ５　６８．１５１　１９８９年１０月２５日これら の寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規 定（ブダペスト条約）のちとに為されている。

これによると、寄託の日から３０年間にわたり生存培養物の維持が保証される。

これら微生物は、ブダペスト条約の条項のもとで、およびジエネンテク、インコ ーポレイテッドとＡＴＣＣの間の契約の条件もとてＡＴＣＣから入手可能となる であろう。即ち、関連の米国特許か発行されたとき、または米国もしくは外国特 許出願のいずれかが公開されたときのとちらか早いときに公衆への培養物子孫の 永久的かつ非制限の入手可能性か保証されており、また、３５ＬｉＳＣ＠１２２ およびそれに則る長官の規則（８８６０Ｇ　６３８への具体的な言及を有する３ ７　ＣＦＲ６１，１４を含む）に従って米国特許商襟局長官によって決定された 者への該子孫の入手可能性が保証されている。

本出願の譲受人は、寄託微生物が適当な条件下で培養したときに死ぬか、失われ るか、または破壊されたときには、通知後速やかに同培養物の生存試料と交換す ることに同意している。寄託された微生物の入手可能性は、特許法に従っていず れかの政府機関の権限のもとに認可された権利に反して本発明を実施するライセ ンスであると解すべきではない。

上に記述した明細書は、当業者が本発明を実施することを可能ならしめるに十分 であると考えられる。本発明は寄託された培養物によってその範囲が限定される ものではない。これは、寄託された具体例が本発明のある種の態様の個々の例示 を意図するものであるためてあり、また、機能的に等価なあらゆる培養物が本発 明の範囲内にあるためである。本発明における原料の寄託は、本明細書に含まれ る記述が本発明のあらゆる態様（最良を態様を含む）の実施を可能ならしめるに 不十分であるということを認めるものではなく、また、それによって示される特 定の例に特許請求の範囲を限定するものでもない。実際には、本明細書に示し、 かつ記述したものに加えて本発明の各種の修飾が上の記述から当業者には明らか となり、そしてそれらは添付した請求の範囲内に含まれるであろう。

泊、屓掃 へ手ケバ’ｆｃｌｖ五Ｔ６Ｆ−βオ漠イト、千’；”　Ｔ＋ ＴＧＦ−ＢＥＴＡの布ぺ −〜−−へ？’ｌ　％Ｆ　ｆｆ　（’Ｊ　Ｐ／′ｌぐい国際調査報告 国際調査報告

Claims (51)

【特許請求の範囲】
1. １．非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したときに約７５，０００の分子量を有し、 成熟ＴＧＦ−βの生物学的活性に拮抗することができる潜在性関与ペプチドをコ ードしている配列を含有する単離された核酸配列（ただし、該配列は成熟ＴＧＦ −βを同時にコードすることはない）。
2. ２．成長因子がヒトである請求項１に記載の配列。
3. ３．ＤＮＡ配列である請求項１に記載の配列。
4. ４．核酸配列に機能的に結合したプロモーターをさらに含有する請求項３に記載 の核酸配列。
5. ５．ベクターで形質転換された宿主によって認識される制御配列に機能的に結合 した請求項３に記載の核酸配列を含有する発現ベクター。
6. ６．請求項５に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
7. ７．細胞が真核性である請求項６に記載の宿主細胞。
8. ８．細胞が原核性である請求項６に記載の宿主細胞。
9. ９．前駆体ＴＧＦ−βに関連した性質を保持してＴＧＦ−βの生物学的活性に拮 抗するように、潜在性関与ペプチドのアミノ酸配列を十分に複製するアミ／酸配 列を有する潜在性関与ペプチドをコードしているＤＮＡ配列を含有する単離され たＤＮＡ配列（ただし、該配列は成熟ＴＧＦ−βを同時にコードすることはない ）。
10. １０．ｃＤＮＡ配列である請求項９に記載の配列。
11. １１．潜在性関与ペプチドをコードする配列のＮ−末端にシグナル配列をコード する領域をさらに含有する請求項９に記載の配列。
12. １２．シグナル配列が哺乳動物細胞によって認識される請求項１１に記載の配列 。
13. １３．ゲノム配列である請求項９に記載の配列。
14. １４．検出可能な部分に共有結合している請求項９に記載の配列。
15. １５．ベクターで形質転換された宿主によって認識される制御配列に機能的に結 合した請求項１０に記載の配列を含有する発現ベクター。
16. １６．プラスミドである請求項１５に記載のベクター。
17. １７．ｐＳＶＩ６Ｂ−ＬＡＰ−ＳＥＲである請求項１６に記載のベクター。
18. １８．ｐＳＶＩ６Ｂ−ＬＡＰ−ＡＲＧである請求項１６に記載のベクター。
19. １９．請求項１５に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
20. ２０．真核性である請求項１９に記載の宿主細胞。
21. ２１．原核性である請求項１９に記載の宿主細胞。
22. ２２．ＡＴＣＣ　Ｎｏ．６８，１５０で特徴付けられるｐＳＶＩ６Ｂ−ＬＡＰ− ＡＲＧである請求項２１に記載の宿主細胞。
23. ２３．ｐＳＶＩ６Ｂ−ＬＡＰ−ＳＥＲである請求項２１に記載の宿主細胞。
24. ２４．請求項１９に記載の細胞を培養して宿主細胞培養物中にペプチドをコード している核酸を発現させることからなる潜在性関与ペプチドの製造方法。
25. ２５．宿主細胞培養物からペプチドを回収する工程をさらに含む請求項２４に記 載の方法。
26. ２６．ペプチドを宿主細胞の培養培地から回収する請求項２５に記載の方法。
27. ２７．供給源のタンパク質を全く含まない潜在性関与ペプチド。
28. ２８．ヒト起源のものである請求項２７に記載のペプチド。
29. ２９．治療学的有効量の請求項２７に記載のペプチドを薬学的に許容しうる担体 中に含有するＴＧＦ−β活性に拮抗するのに有用な医薬組成物。
30. ３０．哺乳動物の免疫機能の調節物質をさらに含有する請求項２９に記載の組成 物。
31. ３１．調節物質がγ−インターフェロン、ＩＬ−１、ＩＬ−２またはＩＬ−６で ある請求項３０に記載の組成物。
32. ３２．等張性である請求項２９に記載の組成物。
33. ３３．滅菌濾過されている請求項２９に記載の組成物。
34. ３４．有効量の請求項２９に記載の組成物を哺乳動物に投与することからなるＴ ＧＦ−βの活性に拮抗させるための方法。
35. ３５．投与が全身的である請求項３４に記載の方法。
36. ３６．拮抗させようとするＴＧＦ−βの活性が免疫抑制またはストローマ形成活 性である請求項３４に記載の方法。
37. ３７．拮抗させようとする活性に哺乳動物の免疫機能の調節物質の活性が含まれ る請求項３６に記載の方法。
38. ３８．有効量の哺乳動物の免疫機能の調節物質を哺乳動物に追加的に投与するこ とをさらに含む請求項３４に記載の方法。
39. ３９．調節物質がγ−インターフェロン、ＩＬ−１、ｌＬ−２またはＩＬ−６で ある請求項３８に記載の方法。
40. ４０．哺乳動物がヒトである請求項３４に記載の方法。
41. ４１．拮抗させようとするＴＧＦ−βがＴＧＦ−β１である請求項３４に記載の 方法。
42. ４２．治療学的有効量の請求項２７に記載のペプチドと治療学的有効量の成熟Ｔ ＧＦ−βを薬学的に許容しうる担体中に含有する、ＴＧＦ−β活性を有するもの として有用な医薬組成物。
43. ４３．成熟ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３である 請求項４２に記載の組成物。
44. ４４．成熟ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β１であり、ＴＧＦ−β活性が軟もしくは硬組 織生成または免疫抑制の促進である請求項４３に記載の組成物。
45. ４５．治療学的有効量の請求項２７に記載のペプチドと治療学的有効量の成熟Ｔ ＧＦ−βを哺乳動物に投与することからなる、ＴＧＦ−β治療を必要としている 哺乳動物の治療方法。
46. ４６．投与が全身的である請求項４５に記載の方法。
47. ４７．ＬＡＰと成熟ＴＧＦ−βを同一器官または静脈に別々に投与する請求項４ ５に記載の方法。
48. ４８．ＬＡＰと成熟ＴＧＦ−βを１つの組成物として一緒に投与する請求項４５ に記載の方法。
49. ４９．成熟ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３である 請求項４５に記載の方法。
50. ５０．成熟ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β１であり、ＴＧＦ−β活性が軟もしくは硬組 織生成または免疫抑制の促進である請求項４９に記載の方法。
51. ５１．標識された形態の請求項２７に記載のペプチドを血清に加え、この血清中 の該ペプチドと成熟ＴＧＦ−βの標識された複合体の存在を検定することからな る、患者の血清中の成熟ＴＧＦ−βの存在によって検出しうる状態の存在を診断 するための方法。