JPH05507420A

JPH05507420A - 組換えヒト第８因子誘導体

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Publication number: JPH05507420A
Application number: JP92505642A
Authority: JP
Inventors: アルムステツト，アンネリエ・ベー; ヘルストレム，エーバ・マリア; リンド，ペーテル; ユング，カテリーネ; サンドベルイ，ヘレーナ・インガ; スピラ，ヤツク; シドウ―ベツクマン，モーナ; ビマン，ヘレーナ
Original assignee: カビ・フアーマシア・アー・ベー
Priority date: 1991-03-15
Filing date: 1992-03-11
Publication date: 1993-10-28
Anticipated expiration: 2012-09-24
Also published as: WO1992016557A1; DE69230206D1; IE920814A1; AU1351392A; PT100245B; GR3032468T3; NO924395D0; FI925131A0; EP0533862B1; NO924395L; JP2655752B2; DK0533862T3; ZA921882B; CA2081659A1; SE9100799D0; SE468050B; AU650730B2; DE69230206T2; ES2137182T3; SE9100799L

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】組換えヒト第■因子誘導体本発明は、生物学的に活性の組換えヒト第■因子誘導体をコードするＤＮＡ配列、かかるＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクター、かかる組換え発現ベクターによって形質転換された宿主細胞、及び、組換えヒト第■因子誘導体の製造方法に関する０本発明はまた、金属イオン架橋によって結合された２つのポリペプチドを含むヒト第■因子を包含する。

発明の背景古典的血友病または血友病Ａは先天性出血性疾患である。

この疾患は、Ｘ染色体に結合した血液凝固第■因子の欠如を原因とし、１００００人あたり１人または２人の発生率でほぼ例外なく男性にだけ発病する。Ｘ染色体の欠損は、自身は血友病患者でない女性キャリアによって伝播される。

血友病Ａは臨床的には異常出血の傾向として表れ、第■因子濃縮薬による治療が開発される以前には、重症の血友病患者の平均寿命は２０歳に達していなかった。血漿から得られた第■因子濃縮薬の使用は、血友病患者のおかれた状況を顕著に改善した。患者の平均寿命は飛躍的な延びを示し、はとんどの患者は多少とも普通の生活を送れるようになった。しかしながら、血漿由来の濃縮物及びその使用に関してはいくつかの問題があり、最も深刻な問題はウィルスの伝播である。

これまでにも、ＡＩＤＳ、Ｂ型肝炎、非Ａ非Ｂ肝炎などの原因となるウィルスの集団感染という深刻な事態もあった。最近にも、種々のウィルス不活化方法、及び高度に精製された新規な第■因子濃縮薬が開発されたが、ウィルス汚染を完全に防止できるという保証はない。

また、ヒト血漿原料の供給量が限られているので第■因子濃縮薬はかなり高価である。

血友病Ａを治療するために組換え材料から得られる第■因子製品は、血漿から得られる第■因子濃縮物の使用に伴う問題をかなりの程度まで解決できると予想され、現在では多数の研究グループがかかる製品の開発に携わっている。

しかしながら、組換え第■因子の開発はいくつかの難点に遭遇しており、例えば、十分に高い収率の産生レベルの達成に関する問題、特に完全長分子に関する問題がある。

生の血漿中でプロテアーゼインヒビターの存在下に調製される第■因子は分子量２８０ｋＤａを有し、２００ｋＤａ及び８０ｋＤａを夫々有する２つのポリペプチド鎖から構成されていることが判明したく＾ｎｄｅｒｓｓｏｎ、　Ｌ−０，ら、（１９８６）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、　ＵＳ八へ３．２９７９〜２９８３）　、これらの鎖は金属イオン架橋によって互いに保持されている。

市販の濃縮物から精製した第■因子材料中には、第■因子の分子の多少ともタンパク質分解して減成した形態が活性フラグメントとして検出される（＾ｎｄｅｒｓｓｏｎ、Ｌ−０，ら、前出；＾ｎｄｅｒｓｓｏｎ−Ｌ−０，ら、（１９８５）　Ｅ　ＰＯ１９７９０１）　、分子量２６０ｋＤａから１７０ｋＤａを有する第 ■因子のフラグメント形態は、１８０ｋＤａから９０ｋＤａの範囲の分子量を有する１つのＨＭと、８０　ｋ、　Ｄ　ａの分子量を有する１つのＬＭとの組み合わせから成り、Ｈ鎖のすべての変種が等しいアミノ末端を有している。Ｈ鎖のアミノ末端領域は、第■因子ｃＤＮＡのヌクレオチド配列データから推定され得る一本鎖の第■因子ポリペプチドのアミノ末端領域に等しい（Ｗｏｏｄ、　Ｌｌ、ら、（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３１２．３３０〜３３６　；　Ｖｅｈａｒ、Ｇ、＾、ら、（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３１２．３３７〜３４２）。

１つの９０ｋＤａ＠と１つの８０ｋＤａ鎖とから成り分子量１７０ｋＤａを有する第■因子の最も小さい活性形態は、トロンビンによってより大きい分子量形態と同程度まで活性化され、従って、不活性化形Ｒ（ｕｎａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｆｏｒｍ）を示している。これはまた、血友病のイヌで試験すると、ｉｎ　ｖｉｖｏで完全な生物学的活性を有することが判明した（　Ｂｒ１ｎｋｈｏｕｓ、に１Ｍ、ら、（１９８５）　Ｐｒｏａ、Ｎａｔｌ、＾ｅａｄ、ｓｃｉ。

ＵＳＡ８２．８７５２〜８７５６）　、従って、第■因子の場合、１７０ｋＤａ形態の止血効果は高分子量形態の止血効果とほぼ同じである。

アミノ酸Ａｒｇ−７４０とＧｌｕ−１６４９との間に存在する第■因子ポリペプチド鎖の高度にグリコジル化された中央領域は十分な生物学的活性に必要であると考えられないことに基づいて、何人かの研究者達は、この領域の欠如した組換え第■因子の誘導体を産生ずる試みを進めた。

このような誘導体は、第■因子の高度にグリコジルされた中央領域をコードするｃＤＮＡの一部分を完全にまたは部分的に欠失させることによって得られた。

例えば、Ｊ　、　Ｊ　、　Ｔｏｏ　ｌ　ｅらは、アミノ酸９８２〜１５６２、及び７６０〜１６３９が夫々欠失した第■因子の構築及び発現を報告した（　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ　（１９８６）　８３．５９３９〜５９４２）　、　Ｄ、Ｌ、Ｅａｔｏｎらは、アミノ酸７９７〜１５６２が欠失した第■因子の構築及び発現を報告した（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９８６）　２５．８３４３〜８３４７）　、、Ｒ，Ｊ、Ｋａｕｆｍａｎは、アミノ酸７４１〜１６４６の欠失した第■因子の発現を記載したく国際特許出願ＷＯ３７７０４１８７）　、　Ｎ、５ａｒｖｅｒらは、アミノ酸７４７〜１５６０の欠失した第■因子の構築及び発現を報告した（ＤＮＡ　（１９８７）　６．５５３−５６４）　０Ｍ、Ｐａ５ｅｋは、アミノ酸７４５〜１５６２及びアミノｗｉ７４１〜１６４８が夫々欠失した第■因子の構築及び発現を報告した（ＰＣＴ出願Ｎｏ、８８７００８３１）　、　Ｋ−Ｄ　Ｌａｇｎｅｒは、アミノ酸８１６〜１５９８及びアミノ酸７４１〜１６８９が夫々欠失した第■因子の構築及び発現を報告した（Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｉｎ５ｔ、Ｍｉｔｔ、　（１９８８）　Ｎｏ、８２．１６〜２５、Ｅ　Ｐ２９５５９７）　、　Ｐ、Ｍｅｕｌｉｅｎらは、アミノ酸８６８〜１５６２及びアミノ酸７７１〜１６６６が夫々欠失した第■因子の構築及び発現を報告した（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　（１９８８）　２　（４）　、３０１〜３０６、Ｅ　Ｐ　０３０３５４０Ａｌ）。これらの欠失形態の第■因子ｃＤＮＡを哺乳類細胞中で発現させると、典型的な産生レベルは全長男■因子の産生レベルの１０倍になる。

更に、異なる２つのｃＤＮＡ誘導体がら得られた９０ｋＤａ鎖及び８０ｋＤａ鎖を同じ細胞中で別々に発現させることも試験された（　Ｂｕｒｋｅ、　Ｒ，Ｌ、ら、（１９８６）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２６１．１２５７４〜１２５７８、Ｐａｖｉｒａｎｉ、＾、ら、（１９８７）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、ｃｏｍＬ、１４５．２３４〜２４０）　、　Ｌかしながらこの系では、回収された第■：Ｃ因子活性のｉｎ　ｖｉｖｏ復元の効率がよくないと考えられる。

本発明は、分子量及びその他の生化学的特性に関して、市販の濃縮薬中にかなりの量で存在するこれまでに得られた血漿第■因子形！’！１ｅｔ（＾ｎｄｅｒｓｏｎ、Ｌ−０ら、（１９８６）　、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ　８３．２９７９〜２９８３　）に対応する組換え第■因子誘導体をコードする欠失第■因子ｃＤＮＡの分子を記載している。これらの新規な欠失第■因子ｃＤＮＡの誘導体は、組換え第■因子製剤の工業的製造方法で使用できるように、組換え第■因子タンパク質を十分に高収率で与えると考えられる。

使用用語の定義以下の各項において、「第■因子欠失誘導体」なる用語は、アミノ酸７４１〜１６４８から成るセグメントを欠失させ、該セグメントを例えばりシン及びアルギニンから選択された少なくとも３つの塩基性アミノ酸から成るリンカ−セグメントで置換することによって、全長２３３２個のアミノ酸の第■因子ポリペプチドから誘導されたＺ、第■：Ｃ因子活性を有する１つ以上のポリペプチド鎖を意味する。「第■：ＲＥ因子」なる用語は、全長男■因子からアミノｗ１７４１〜１６４８が欠失したポリペプチド鎖を意味する。「第■：ＱＤ因子」なる用語は、全長男■因子からアミノ酸７４５〜１５６２が欠失したポリペプチド鎖を意味する。「第■：Ｒ３囚子」は、アミノ酸７４１〜１６４８が欠失し、該セグメントが２つのアルギニン残基によって置換されたポリペプチドを意味する。「第■：Ｒ４因子」は、アミノ酸７４１〜１６４８が欠失し、該セグメントが３つのアルギニン残基で置換されたポリペプチドを意味する。「第■二Ｒ５因子」は、アミノ酸７４１〜１６４８が欠失し、該セグメントが４つのアルギニン残基で置換されたたポリペプチドを意味する。

発明の説明本発明は、第■：Ｃ因子活性を有するタンパク質の産生方法に関する。より詳細には本発明は、動物細胞中で発現したときに、分子量９０ｋＤａ及び８０ｋＤａｔ夫々有する２つのポリペプチド鎖から本質的に構成された第■：Ｃ因子活性を有するタンパク質を高レベルで産生ずる、全長男■因子ｃＤＮＡに由来の修飾された第■因子ｃＤＮＡ配列を提供する。

従って本発明は、ヒト第■因子の９０ｋＤａｇをコードする第１ＤＮＡセグメントとヒト第■因子の８０ｋＤａ鎖をコードする第２ＤＮＡセグメントとを含み、リシン及びアルギニンから選択された少なくとも２つのアミノ酸残基から成るリンカ−ペプチドをコードするリンカ−ＤＮＡセグメントによって前記セグメントが相互接続された生物学的に活性の組換えヒト第■因子誘導体をコードするＤＮＡ配列を提供する。

前記リンカ−ＤＮＡセグメントによってコードされるリンカ−ペプチドの長さは厳密に制約されないが、約１０個よりも多いアミノ酸残基を含まないのが好ましい。

好ましくは、リンカ−ペプチドが２．３または４個のアミノ酸残基、特に好ましくは３または４個のアミノ酸残基から構成される。また、Ｇｌｕ−１６４９の直前のアミノ酸残基がアルギニンから成るのが特に好ましい。

本発明によれば、リンカ−ペプチドを形成する全部のアミノ酸残基がアルギニン残基から成るのが好ましい。

リンカ−ペプチドが、塩基性アミノ酸、即ち、リシン及び／またはアルギニン残基から構成されることに注目されたい、これらの２つのアミノ酸残基のうちではアルギニン残基のほうが好ましい。

本発明はまた、上記のごときＤＡＮ配列から成る転写ユニットを含み、更にプロモーター及びポリアデニル化シグナル配列を含む組換え発現ベクターに関する。

本発明はまた、上記に定義の組換え発現ベクターによって形質転換された動物起原の宿主細胞を包含する。

更に本発明は、上記に記載の生物学的に活性の組換えヒト第■因子誘導体の製造方法を提供する。該方法は、上記に定義の組換え発現ベクターによって形質転換させた動物細胞系を普通培地中で培養し、９０ｋＤａドメインと金属イオン結合によって該ドメインに結合された８０ｋＤａドメインとから成るヒト第■因子誘導体を発現及び分泌させ、該発現された誘導体を培地から回収する段階を含む。

最後に本発明は、ヒト第■因子の９０ｋＤａ鎖と、リンカ−ペプチドまたはその一部を任意に介して、金属イオン結合によって前記９０ｋＤａ鎖に結合した、ヒト第■因子の８ＱｋＤａ鎖とから成るヒト第■因子誘導体を提供する。

上記ポリペプチド鎖から成る第■：Ｃ因子活性を有するタンパク質を得るためには、ｉｎ　ｖｉｖｏ翻訳中に作成された一重鎖ポリペプチドを、産生細胞中の生合成プロセス中の翻訳後プロセッシングまたはｉｎ　ｖｉｔｒｏのタンパク質分解プロセッシングまたはその双方Ｇこよって開裂する必要がある。分子量２００ｋＤａ及び８０ｋＤａを夫々有する２つのポリペプチド鎖から成る第■：Ｃ因子活性を有するタンパク質はヒト血漿から単離できるので、−重鎖の全長第■因子 −次翻訳産物上に酵素ブロモ・ンシング用の適当な開裂部位が存在すると推測される。重要な１ｎｖｉｖｏプロセッシング部位はＡｒｇ−１６４８の力！レボキシ末端側に位置する可能性が極めて高νＡ。タンノくり質分解による成熟過程で、Ａｒｇ−１６４８の開裂（こよって、上記の分子量２００ｋＤａ及び８０ｋＤａの上記の鎖力）ら成る第■因子タンパク質が生じる。Ａｒｇ−１６４８４！第 ■因子の分子の構造的ドメイン間の境界（こ位置し、１種または複数のプロセッシング酵素によって立体的Ｇこアクセスされ得るターゲットを構成すると考えられる。別のブロモ・ノシング部位は、２００ｋＤａ鎖を９０ｋＤａ鎖４：１ｎｖｉｔｒｏ変換するＡｒｇ−７４０に存在し、これ力（、ヒト血漿から得られた市販の第■因子濃縮物中に存在する第■因子の９０ｋＤａ及び８０ｋＤａの形態を生成させると考えられる６本発明によれば、ｉｎ　ｖｉｖｏまた番、ｔｉｎｖｉｔｒｏのプロセッシングによって分子量９０ｋＤａ及び８０ｋＤａの２つのポリペプチド鎖から成るタンパク質を与える第■因子欠失誘導体を産生するために、全長第■因子タンパク質のＡｒｇ−７４０とＧｌｕ−１６４９とを相互接続している９０８個のアミノ酸から成るポリペプチド鎖を、リシン残基またはアルギニン残基またはその双方から成る少なくとも３つの塩基性アミノ酸残基によって置換できることが知見された。好ましくは、Ｇｌｕ−１６４９のアミノ末端側のアミノ酸はアルギニン残基であろう。

上記のような２つのポリペプチド鎖から成る第■因子タンパク質を適当な宿主細胞中で高レベルで産生ずるためには、有効な転写ユニットに組み込んだ第■因子欠失誘導体ｃＤＮＡを、当業者に公知の方法に従って大腸菌中で増殖し得るクローニングベクター中の適当な調節要素と共に含むことが必要である。転写用の有効な調節要素は、動物細胞を天然宿主とするウィルスまたは動物細胞の染色体ＤＮＡから得られた。好ましくは、ＳＶ４０ウイルス、アデノウィルス、ＢＫポリオーマウィルス、ヒトサイトメガロウィルスに由来のプロモーター−エンハンサ −コンビネーションまたはラウス肉腫ウィルスのＬＴＲに由来のブロモータ−一エンハンサーコンビネーションまたはβ−アクチンもしくはＧＲＰ７８のような動物細胞中の強力に構成的に転写された遺伝子を含むプロモーター−エンハンサ −コンビネーションを使用し得る。第■因子ｃＤＮＡから安定な高レベルのｍＲＮＡ転写を達成するためには、転写ユニットがその３′近位部に転写終結−ポリアデニル化配列をコードするＤＮＡ領域を含んでいなければならない。好ましくは、この配列は、ＳＶ４０ウィルスの初期転写領域、ウサギβ−グロビン遺伝子またはヒト組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子から得られる。

このように有効な転写ユニットに組込まれた第■因子ＣＤＮＡを次に、種々の第 ■因子タンパク質を発現させるための適当な宿主生物に導入する。好ましくはこの生物は、正確な折畳み、ジスルフィド結合形成、アスパラギン結合グリコジル化及びその他の翻訳後修飾並びに培地への分泌を確保するためにを椎動物起原の動物細胞系でなければならない。その他の翻訳後修飾の例は、９０ｋＤａ及び８０ｋＤａの２つの鎖から成る第■因子の分子の形成に必須な新生ポリペプチド鎖のタンパク質分解プロセッシング及びチロシン０−スルフェート化である。使用できる細胞系の例は、サルＣＯ８細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、ハムスターＢＨＫ−２１細胞、ヒト胚腎臓２９３細胞であり、好ましい細胞はＣＨ ○細胞である。

第■因子ｃＤＮＡをコードする転写ユニットは異なる種々の方法で動物細胞系に導入できる１例えば、種々の動物ウィルスに基づくベクターの組換え体を上記転写ユニットによって作成し得る。これらの例として、バキュロウィルス、ワクシニアウィルス、アデノウィルス及び好ましくはウシパピローマく乳頭ＩＩＩ）ウィルスに基づくベクターがある。

第■因子ｃＤＮＡをコードする転写ユニットはまた、組換えＤＮＡをそのゲノムに取込んだ特異的細胞クローンの単離を容易にするために、動物細胞中の優性選択マーカーとして機能し得る別の組換え遺伝子と共にこれらの細胞に導入されてもよい。この種の優性選択マーカー遺伝子の例は、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ　（Ｇ４１８）耐性を与えるＴｎ５アミングリコシドホスホトランスフェラーゼ、ヒグロマイシン耐性を与えるヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ及びビューロマイシンに耐性を与えるビューロマイシンアセチルトランスフェラーゼである。この種の選択マーカーをコードする転写ユニットは、第■因子ｃＤＮＡをコードするベクターと同じベクターに担持されてもよくまたは宿主細胞のゲノムに同時に導入されて組込まれ、しばしば種々の転写ユニット間の緊密な物理的結合を与える別のベクターにコードされてもよい。

第■因子ｃＤＮＡと共に使用できる別種の選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）をコードする種々の転写ユニットに基づく、内因性ｄ　ｈ、　ｆ　ｒ活性が欠如した細胞、好ましくはＣＨＯ細胞（ＤＵＫＸ−Ｂ　１１−　ＤＧ−４４）にこの種の遺伝子を導入した後、ヌクレオシド欠失培地中で増殖させ得る。このような培地の一例は、ヒボキサンチン、チミジン、グリシンを含まないハムのＦｌ、２（Ｈａｍ’ｓ　Ｆｌ２＞培地である。これらのｄｈ　ｆ　ｒ遺伝子を第■因子ｃＤＮＡ転写ユニットと共に同じベクターまたは異なるベクターにのせて上記のごときＣＨＯ細胞に導入すると、組換え第■因子タンパク質を産生ずるｄｈｆｒ陽性の細胞系が産生される。

ｄｈｆｒ阻害剤である細胞障害性メトトレキセートの存在下に上記細胞系を増殖させると、メトトレキセート耐性の新しい細胞系が生成されるであろう、これらの細胞系は、増幅数のｄｈｆｒと第■因子転写ユニットとの結合を有するので、組換え第■因子タンパク質の産生率が増加する。

メトトレキセートの濃度を漸増（１〜１１００００ｎ＞させながらこれらの細胞系を増殖させると、第■因子タンパク質を極めて高率で産生ずる新しい細胞系が得られる。

第■因子タンパク質を産生ずる上記細胞系は、浮遊培養または種々の固体担体によって大規模に増殖させ得る。これらの担体の例は、デキストランもしくはコラーゲンマトリックスに基づく微粒子担体または中空ファイバーも４シ＜は種々のセラミック材料の形態の固体担体である。浮遊培養または微粒子担体培養で増殖させるとき、上記細胞系をバッチ培養、またはならし培地を長期間連続的に与える潅流培養によって培養する。従って、本発明によれば、上記細胞系は、ヒト血漿から単離できる２つのポリペプチド鎖標品（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）（９０ｋＤａ及び８０ｋＤａ＞から成る第■因子に対応する組換え第■因子の工業的製造方法の開発に特に適している。

上記のごときＣＨＯ細胞の培地に蓄積される組換え第■因子タンパク質は、組換え第■因子タンパク質と細胞培地中の別の物質との、サイズ、電荷、疎水性、溶解度、特異的親和性などの違いを利用する方法を含む種々の生化学的方法によって濃縮及び精製できる。

このような精製の一例は、固体支持体に固定させたモノクローナル抗体に組換え第■因子を吸着させる方法である。

脱着後に上記特性に基づく種々のクロマトグラフィー法で第■因子タンパク質を更に精製し得る。

本発明に記載された第■因子活性を有する組換えタンパク質は、治療用医薬製剤に使用され得る。精製した第■因子タンパク質を生理学的に相溶性の慣用の水性バッファ溶液に溶解させるとよい、医薬製剤用のアジュバントを該バッファ溶液に任意に添加し得る。

本発明を非限定実施例によって更に詳細に以下に説明する。本発明の特定実施例に関するこの記載は添付図面を参照して行なう。

図１は、全長茎■因子と第■：Ｒ３因子、第■：Ｒ４因子及び第■：Ｒ５因子の夫々との関係を示す概略図である。

９０ｋＤａｌ　（Ａｒｇ−７４０）のＣ末端と８０ｋＤａＭ（Ｇｌｕ−１６４９）のＮ末端との間の領域の一次構造が示されている。

図２は、ヒトサイトメガロウィルスプロモーターの転写コントロール下の第■：Ｒ３因子ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＧＥ４９１の説明図である。

図３は、ヒトＧＲＰ７８グロモーターの転写コントロール下に第■：Ｒ４因子ｃＤＮＡを含み、マウス乳癌ウィルスＬＴＲの転写コントロール下にマウスジしドロ葉酸レダクターゼｃＤＮＡをコードする追加の転写ユニットを含むプラスミドｐ　ＫＧＥ　６７４を示す。

図４は、ヒトＧＲＰ７８プロモーターの転写コントロール下の第■因子；Ｒ５囚子ｃＤＮＡと、図３に示すベクターと同様のマウスジヒドロ葉酸レダクターゼとを含むプラスミドｐＫＧＥ６７２を示す。

図５は、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼｃＤＮＡ転写ユニットだけを含むプラスミドｐＫＧＥ３２７を示す（図３と比較するとよい）。

図６は、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下のポリアクリルアミドゲル電気泳動後の第ＶＩ：Ｒ３因子、第■：Ｒ４因子、第■：Ｒ５因子及び血漿由来の第■因子のイムノブロッティングを示す。レーンＡ：血漿第■因子、レーンＢ：第■：Ｒ３因子、レーンＣ：第■：Ｒ４因子、レーンＤ：第■、Ｒ５因子、レーンＳ　ｔ　：　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉａｂｏｒａｔ。

ｒｉｅｓから入手したハイレンジのＢＲＬプレスティント分子量標準。

図７は、ヒトα−トロンビンと共にインキュベーションした後の組換え第■：Ｒ５因子の第■囚子活性を示すグラフである。

図８は、ヒトα−トロンビンと共にインキュベーション（０，０ＩＮｒＨ単位のトロンビン／ＩＩＵの第■二Ｃ因子）した後の組換え第■：Ｒ５因子の５ＤＳ− ＰＡＧＥ及びイムノブロッティングのパターンの変化を示す６実施例ＩＢドメインを完全に喪失しているが、Ｈ鎖のカルボキシ末端ｅＬＭのアミン末端に結合する種々の数の塩基性アミノ酸を含むポリペプチド鎖をコードする第■囚子ｃＤＮＡの一連の欠失誘導体を構築した。これらの第■因子の欠失誘導体を、 −次翻訳産物のｉｎ　ｖｉｖｏタンパク質分解プロセッシング処理して２つのポリペプチド鎖とする。以下の実施例でアミノ酸名は、シグナル配列を含まない全長第■因子分子中の位置に対応する。

：Ｒ３’−”　ｆ−めの　の全長茎■因子のＡｒｇ　７４０とＧ］、ｕ　１６４９との間の直接融合を介して結合したアミノ酸Ｌｅｕ　５８７からＡｌａ　１７０２をコードする第■因子欠失誘導体のＣＤＮＡ（第■：ＲＥ因子、Ｍ、Ｐａ５ｅｋ、　ｒＢ際出願Ｎｏ、ｌ ’１０８８１００８３１、＾ＴＣＣ５３５１７）から得られた６２７塩基対のＫｐｎＬ−Ｐｓｔｌ制限フラグメントを、標準法に従ってバクテリオファージベクターＭ　１３　ｍ　ｐ　１９　（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ，ら（１９８５）　Ｇｅｎｅ　３３．１０３〜１１９）に導入した。上記組換えバクテリオファージから調製した一本ＭＤＮＡ鋳型に対して特定オリゴヌクレオチドの突然変異誘発（Ｎａｋａｍａｙｅ　、　Ｋ　。

＆　Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、　Ｆ、　（１９８６）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、１４．９６７９〜９６９８）を行なった。１０μｇの精製した環状−重鎖ファージＤＮＡを、配列：５′−ＡＡＣＡＡＴＧＣＣＡＴＴＧＡＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＴＡＡＣＴＣＧＴＡＣＴＡＣＴＣＴＴＣＡＧ−３’ を有する８ｐｍｏ　ｌ　ｅの５′−リン酸化オリゴヌクレオチドにアニーリングした。

４つのデオキシヌクレオチド全部と、ｄＣＴＰαＳと、１２単位のＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントと、１２単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼとを添加することによって、得られた鋳型に環状ＤＮＡの第二の鎖を合成した。１６ ℃で一部インキユベーションした後に、５００ｍ、　ＭのＮａＣｌの存在下にニトロセルロースでｒ遇することによって、反応混合物中の二重ｇＤＮＡを濃縮した。精製した二重鎖ＤＮＡの１１５を、５単位の制限酵素Ｎｃｉ■と共にインキュベーションすることによってニックし、５０単位ノエキソヌクレアーゼ（Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）　ＩＩＩによって、ファージＤＮＡの鋳型殖が部分的に除去される程度まで処理した。得られた部分的二重鎖（ｐａｒｔｉａｌ　ｄｕｐｌｅｘ）を、４つのデオキシヌクレオチド三リン酸全部の存在下に３単位のＤＮＡポリメラーゼＩと２単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼによって１６℃で３時間処理することによって二重鎖にした。得られた混合物の１／４を使用して、３００μｍのコンピテント大腸閉ＴＧＩを形質転換させた。得られた突然変異ファージクローンのうちから、１０個を選んでジデオキシＤＮＡ配列決定した（ＳａｎＦｉｅｒ、　Ｆ、ら、（１，９７７）　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ　７４．５４６３〜５４６７）　、配列決定されたファージクローンの１つは、上記突然変異誘発プライマーによって指令された予想ヌクレオチド配列によるインサートを含んでいた。従って、ファージインサートは、２つのエキストラＡｒｇ残基を介してＡｒｇ　７４０とＧｌｕ１６４９との融合をコードする第■囚子ｃＤＮＡの６３０塩基対のＫｐｎｒ− Ｐｓｔｌフラグメントから構成されている（第■：Ｒ３囚子）。

■：Ｒ３コード　る　ベクターの上記のごとく融合した第■：Ｒ３因子をコードする６３０塩基対のＫｐｎｌ−Ｐｓｔｌフラグメントを、Ｍ１３ｍｐ１９ファージＤＮＡの二重銅複製型から切出し、ベクターｐＫＧＥ４３１に導入する。このベクターは、ＰＯＣｌ２中の第■ ：ＲＥ因子タンパク質のアミノ酸Ｌｅｕ　５８７〜Ｍｅｔ　２１７６をコードする第■：ＲＥ因子ｃＤＮＡ　（Ｍ、Ｐａ５ｅｋ、国際出［ＩＮｏ、ＷＯ３８１００８３１、ΔＴＣＣ５３５１７）に由来の２０４６塩基対のＫｐｎ　ｌ−８ｐｈ　Ｉフラグメントから成る。上記のごとく融合した第■：Ｒ３因子をコードする６３０塩基対のフラグメントを、Ｋｐｎｌによって完全開裂し且つＰｓｔｌによって部分開裂しておいたＴ）　ＫＧＥ４３１に導入した。得られたベクターｐＫＧＥ４９０は、第■：Ｒ３因子のアミノＭＬｅｕ　５８７〜Ｍｅｔ　２１７６をコードする２０５２塩基対のＫｐｎｌ−３ｐｈＩインサートを含む、ｐＫＧＥ４９０をＫｐｎＩ及びＡｐａｉで消化し、第■、Ｒ３因子タンパク質のＬｅｕ　５８７〜Ａｌａ　２０４７をコードする１６６５塩基対の対応するフラグメントを、Ｋｐｎｌ及びＡｐａｌで消化しておいたベクターｐＫＧＥ３４７の大フラグメントに結合した。大腸菌クローニングベクターｐＢＲ３２７に基づくベクターｐＫＧＥ３２７は、第■；ＱＤ因子ｃＤＮＡの上流の７４１塩基対のＤＮＡセグメント（ヌクレオチド位置−６７１〜＋７１、Ｂｏｓｈａｒｔ、Ｎ、ら、（１９８５）　Ｃｅ１ｌ　４１．５２１〜５３０）にコードされたヒトサイトメガロウィルスエンハンサ−／プロモーターと、ＳＶ４０　を−抗原イントロンと、３′近位部のポリアデニル化配列とから成る。得られた図２のベクター（ｐＫＧＥ４９１＞は、完全第■：Ｒ３因子ｃＤＮＡを含み、第■因子の別の欠失誘導体がコードされることを除けばｐＫＧＥ３４７に等しい。

■・Ｒ４か　を　しさせるための　■　ｃ　ＤＮＡΔλ然又１１涜上記の第■：Ｒ３因子ｃＤＮＡの一部をコードする６３０塩基対のＫｐｎｌ−Ｐｓｔｌフラグメントを、同じ酵素で開裂しておいたベクターｐＵｃ１９に導入した。得られたベクターをｐＫＧＥ６５７と命名し、ポリメラーゼ鎖反応を用いたオーバーラツプエキステンション（重複延長）によって特定部位の突然変異誘発を行なった（Ｈｏ、　Ｓ、Ｎ、ら、（１９８９）　Ｇｅｎｅ　７７．５１〜５９　；　５ａｉｋｉ、　Ｒ，に、ら、（１９８８）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３９．４８７〜４９１）　、突然変異誘発反応の第一部では２つの平行実験を行なった。

第１の実験では、１１００ｎのプラスミドｐＫＧＥ６５７を１μＭの２つのプライマー５′−ＡＴＴＧＡＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＴＡＡＣＴＣＧＴＡＣＴ−３′、５′−ＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡ−３’の各々と混合した。

これに、最終反応容４１１００μｍで、５０ｍＭ（７）ＫＣｌ、１１０１ＴＬのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，３，１，５ｍＭのＭｇｃｌ、、０，０１％のゼラチン、各２００μＭの４つのデオキシヌクレオチド及び２．５単位のＴａｑポリメラーゼを添加した。ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒを製遺業者（Ｐｅｒｋｉｎ　ＥＩ＋＊ｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）の指示通りに使用し１、サンプルに対して、９４℃で１分間の変性と５０℃で２分間のアニーリングと７２℃で３分間のエキステンシゴンとから成る処理を２５サイクル繰返した０反応産物を標準法によってアガロースゲル電気泳動及びエチジウムプロミド染色で分析すると、長さ２４０塩基対の増幅された一本ｇＤＮＡ産物の形成を検出した。第２の実験では、以下の２つのプライマー：５’　−ＡＧＴＡＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＴＣＡＡＴ−３′ ５’　−ＧＴＡＡＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣ−３′を使用して同様のポリメラーゼ頒反応を行なった。

反応産物のアガロースゲル電気泳動分析は、長さ５５０塩基対の一本の増幅されたＤＮＡ産物の形成を示した。突然変異誘発反応の第二部では、上記の２つの平行実験で得られた各１０μｍの産物の混合物を総量１００μｌの第三ポリメラーゼ鎖反応で組み合わせた。以下の２つのプライ５′−ＧＴＡＡＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣ−３′５’−ＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡ−３′を使用する以外は、上記と同じ条件を使用した。

反応混合物のアガロースゲル電気泳動分析は、長さ７５０塩基対の一本の増幅ＤＮＡ産物の形成を示した。このＤＮＡフラグメントをＫｐｎｌ及びＰｓｔ　ｌによって消化し、同じ酵素で開裂したベクターｐＵｃ１９に導入した。得られたプラスミドのいくつかのＤＮＡ配列決定を、デオキシチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、ら、前出）で行なった。予想された６３３塩基対のＫｐｎｌ−Ｐｓｔフラグメントを正しい配列で含むプラスミドをｐＫＧＥ６５８と命名した。従ってこのプラスミドインサートは、３つのエキストラＡｒｇ残基を介してＡｒｇ　７４０とＧｌｕ１６４９との間の融合をコードする第■：Ｒ４因子ｃＤＮＡフラグメントから成る。

■：Ｒ４コード　る　べ　−の第■：Ｒ４因子ｃＤＮＡの一部をコードする６３３塩基対のＫｐｎｌ−ＰｓｔｌフラグメントをベクターｐＫＧＥ６５８から切出し、Ｋｐｎｉによって完全開裂し且つＰｓｔｌによって部分開裂しておいたベクターｐＫＧＥ４９０に導入した。得られたベクターｐＫＥ０６７３は、第■：Ｒ４因子のアミノ酸Ｌｅｕ　５８７からＭｅｔ　２１７６丈でをコードする２０５５塩基対のＫｐｎｌ−Ｓｐｈｌインサートを含む、第■：Ｒ４因子のＬｅｕ　５８７からＡＩａ　２０４７までをコードする１６６８塩基対のＫｐｎｌ−ＡｐａｌルミｌフラグメントＧＥ６７３から切出し、同じ酵素で開裂しておいたベクターｐＫＧＥ６０１の大フラグメントに移入した。大腸菌クローニングベクターｐＭＬ２に基づくベクターｐＫＧＥ６０１は、第■：Ｒ５因子ｃＤＮＡの上流の４４３塩基対のＤＮＡセグメント（ヌクレオチド位置２〜４４５、Ｔｉｎｇ、　Ｊ　＆　Ｌｅｅ、Δ、Ｓ、　（１９８８）　Ｄ　ＮＡ　７（４）、２７５〜２８６）にコードされたヒトＧＲＰ７８のエンハンサ−／プロモーターと、ＳＶ４０　を−抗ＨＡントロンと３′近位領域のポリアデニル化配列とから成る。

この領域の下流に、マウス乳癌ウィルスＬＴＲのコントロール下にマウスジヒドロ葉酸レダクターゼｃＤＮＡをコードし、上記と同じＳＶ４０　３′コントロール要素を利用する転写ユニットが配置される。得られたベクターｐＫＧＥ６７４を区３に示す。

■：Ｒ５””さ　るための　■　ｃＤＮＡαλ然又１月１第１１月１因子に関する上記実施例と同様にして、ポリメラーゼ鎖反応を用いたオーバーラツプエキステンションによってベクターｐＫＧＥ６５７の特定部位の突然変異誘発を行なった。２つの平行反応の第１の反応ではプライマーとして以下の配列：５′−ＡＴＴＧＡＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＴＡＡＣＴＣＧＴＡＣＴ−３”５′−ＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡ−３’を使用した。

上記実施例と同様に、反応産物のアガロースゲル電気泳動分析は、２４０塩基対の反応産物の形成を示した。２つの平行反応の第２の反応ではプライマーとして以下の配列５’　−ＡＧＴＡＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＴＣＡＡＴ−３’５′−ＧＴＡＡＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣ −３′を使用した。

反応産物のアガロースゲル電気泳動分析は、５５０塩基対の反応産物の形成を示した。上記実施例と同様の突然変異誘発実験の第２部では、７６０塩基対の増幅ＤＮＡ産物が生じた。このＤＮＡをに、　ｐ　ｎ　ｌ及びＰｓｔｉで消化した後に、Ｋｐｎ［で完全開裂し且つＰｓｔＩで部分開裂しておいたｐＫＧＥ４９０に導入した。

ジデオキシチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、ら。

前出）によって定量したときに、正しい配列の６３６塩基対のＫｐｎＩ−Ｐｓｔ ■フラグメントを予想通りに有するプラスミドをＰＫＧＥ６５９と命名した。このプラスミドは、４つのエキストラＡｒｇ残基を介してＡｒｇ−７４０とＧｌｕ −１６４９との間の融合をコードする第■：Ｒ５囚子ｃＤＮＡのフラグメントから成る合計２０５８塩基対のインサートを含む。

：Ｒ５をコード　ベク　−の第■：Ｒ４因子発現ベクターｐＫＧＥ６７４に関する上記の方法と同様にして、第■：Ｒ５因子のＬｅｕ　５８７からＡｌａ　２０４７をコードする１６６８塩基対のＫＰｎｌ−Ａ、ｐａｌフラグメントをｐＫＧＥ６５９から切出し、同じ酵素で開裂しておいたベクターｐＫＧＥ６０１の大フラグメントに移入した。このようにして得られた第■：Ｒ５因子をコードするベクター（ｐＫＧＥ６７２）を図４に示す。

大１自Ｉ２：Ｒ３イニーズハムス　− １段ＲＪ１０ｃｍ径の細胞培養皿に、１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベツコの改質イーグル培地／ハムのＦ１２培地（１：１）に５０万個（０，５ｍｉ　Ｉ　Ｉ　ｏｎ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠失チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ −Ｄ　Ｇ　４４　、Ｄｒ　Ｌ　Ａ　Ｃｈａｓｉｎ、Ｃｏ１ｕ＋＊ｂｉａ　ｔｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋから入手）を播種し、５％炭酸ガスのインキュベータ内で３７℃で一部インキユベートした。翌日、細胞を新しい培地で洗浄し、次いで、第■：Ｒ３因千発現ベクターＰＫＧＥ４９１とジヒドロ葉酸レダクターゼベクターＰＫＧＥ３２７との１：１混合物１０μｇを、当業界で公知のごとくリン酸カルシウム法でトランスフェクトした。ベクターｐＫＧＥ３２７は、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼｃＤＮＡの上流のマウス乳癌ウィルスＬＴＲがら成る転写ユニットを、ベクターｐＭＬ２に時計回り方向にクローニングされたＳＶ４０　を−抗原及び３′近位部のポリアデニル化配列と共に含むく図５）。３日目に、培地を除去し、細胞を洗浄し、新しい細胞培養皿に分割した。４日目に、培地を、ヒボキサンチン、グリシン及びチミジンが欠如し１０％の完全透析ウシ胎仔血清を補充した上記細胞培養培地で置換することによってジヒドロ葉酸レダクターゼ陽性細胞の選択を開始した。培地を週２回交換し、約２週間後にジヒドロ葉酸レダクターゼ陽性細胞のコロニーを収穫した。これらのコロニーをプールし、更に２５ｃｍ２の細胞培養瓶で増殖させ、サブコンフルエンシーに到達した後に、培地を、３％のウシ胎仔血清を含む新しい培地で置換した。

２４時間後に、培養培地中の第■：Ｃ因子の活性を合成基質法（Ｃｏａｔｅｓｔ　第■：Ｃ因子、ＫＡＢｒ−Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ　）で試験すると、発現レベル８０ｍＵ／ｍｌが得られた。ジヒドロ葉酸レダクターゼ陽性細胞のプールを、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤であるメトトレキセートを含む培地中で数週間培養することによって遺伝子増幅させた。メトトレキセートの濃度を５００ｎＭまで段階的に増加させながら選択した後で、回転瓶培養で第■：Ｃ因子を１．ＯＵ／ｍｌのレベルで産生する耐性細胞のプールを得た。

：Ｒ４ヤイニーズハムスター【旦■Ｊ上記の第■：Ｒ３因子をコードする発現ベクターのトランスフェクションと同様にして、第■°Ｒ４因子をコードする発現ベクターｐＫＧＥ６７４をチャイニーズハムスター卵巣細胞にトランスフェクトした。この場合、ｐ　ＫＧＥ３２７とのコトランスフェクションを削除した。その理由は、このベクターは、選択及び増幅マーカーであるジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする転写ユニットを含んでいるからである。ヒボキサンチン、グリシン及びチミジンが欠如し１０％の完全透析ウシ胎仔血清を補充した培地中で上記と同様に選択した後で、Ｃｏａｔｅｓｔ法で測定すると４００ｍＵ／ｍｌの第■：Ｃ因子活性を産生する細胞クローンのプールが得られた。２０ｎＭのメトトレキセート中で数週間培養することによって遺伝子増幅を選択すると、５００ｍＵ／ｍｌの第■：Ｃ因子を産生ずる細胞のプールが得られた。２００ｎＭのメトトレキセートを含有する培地中で培養することによって更に選択すると、９８０　ｍ　Ｕ　／　ｍｌの第■：Ｃ因子を産生ずる細胞のプールが得られた。これらの細胞は、回転瓶培養で、８００ｍＵ／ｍｌの第■：Ｃ因子を産生じた。

：Ｒ５ニーズハムス　− 胆ＩＩ創導上記と同様に、第■：Ｒ５因子をコードする発現ベクターｐＫＧＥ６７２をチャイニーズハムスター卵巣細胞にトランスフェクトした。このベクターは、第■：Ｒ５因子とジヒドロ葉酸レダクターゼ転写ユニットとを同じプラスミド上にコードしている。ヒボキサンチン、グリシン及びチミジンが欠如し１０％の完全透析ウシ胎仔血清を補充した培地中で選択すると、Ｃｏａｔｅｓｔ法で測定して１１０ｍＵ／ｍｌの第■；Ｃ因子活性を産生ずる細胞クローンのプールが得られた。

２０ｍＭのメトトレキセート中で数週間培養することによって遺伝子増幅を選択すると、回転瓶培養で１．５．Ｕ／ｍｌの第■、Ｃ因子を産生ずる耐性細胞クローンのプールが得られた。

実施例３：　Ｒ３：　Ｒ４：　Ｒ５の但ヱヱ遣ヤー　１ゼーシ　ン実施例２に記載したように夫々の増幅されたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞系プールによって産生された第■：Ｒ３因子、第■：Ｒ４因子及び第■：Ｒ５因子の生化学的特徴を試験した。培養培地から得られた材料を精製するために、第■因子に対するモノクローナル抗体を用いたイムノアフィニティクロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーとのステップを順次に用いた。得られた精製材料の比活性は、３０００〜４０００ＩＵ／Ａ２８゜の範囲であり、第■因子活性／第■因子抗原の比は１に近い値であった（活性はＣｏａｔｅｓｔ法（ＫＡＢＩ−Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ　）で測定し、抗原は８０ｋＤａの鎖に対するモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイで定量した）。

精製した第■＋Ｒ３因子、第■：Ｒ４因子及び第■：Ｒ５因子を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びウェスタンプロット分析で処理した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌ　ｉ　（１９７０；Ｎａｔｕｒｅ２２７．６８０〜６８５）に従って行なった。本質的にＴ　ｏ　ｗ　ｂ　ｉｎ、Ｈ，ら（１９７９、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　Ｉ　、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ、７６．４３５０〜４３５４　）に記載の方法で行なったウェスタンプロット分析には、前記に記載したウサギポリクローナル抗ヒト第■因子抗体（＾ｎｄｅｒｓｓｏｎ、　Ｌ −０，ら、（１９８６）　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ　。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３．２９７９〜２９８３　）を使用した。結果を図６に示す。レーンＡ　：　８０ｋＤａのＬ鎖と２００ｋＤａ〜９０ｋＤａの範囲のＨｇとを含む血漿第■因子。レーンＢ：第■：Ｒ３因子。レーンＣ：第■；Ｒ４因子。

レーンＤ：第■：Ｒ５因子、第■二Ｒ３因子は、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１３０ｋＤａ及び１７０ｋＤａにバンドを示す、８０ｋＤａ及び９０ｋＤａのバンドは、血漿第■因子の生化学的に活性の最も小さい複合体を表す８０ｋＤａ及び９０ｋＤａのペプチドとしてゲル上の同じ位置に検出された。１７０ｋＤａのバンドは恐らく、プロセッシングされない一次翻訳産物を示し、１３０ｋＤａのバンドは第■：Ｒ３因子の不正にプロセッシングされた形態を示すものであろう。

従って、８０ｋＤａ及び９０ｋＤａの鎖に加えて、真正（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）でないポリペプチド鎖が得られた。第■：Ｒ４因子及び第■：Ｒ５因子は８０ｋＤａ及び９０ｋＤａにバンドを示す、これらの材料中には有意な量のプロセッシングされない一次翻訳産物（１７０ｋＤａの鎖）は存在していなかった。これは、これらの場合にはｉｎ　ｖｉｖｏタンパク質分解プロセッシングが有効に作用して、−次翻訳産物を２つのポリペプチド鎖にしたことを意味する。従って、双方の場合に、血漿第■因子中に存在する最も小さい活性形態に対応する分子量のペプチド鎖を有する２つの鎖分子が得られた。更に、第■：Ｒ５因子の全自動エドマン分解によるＮ末端配列の決定は、９０ｋＤａ及び８０ｋＤａの鎖のアミノ末端が血漿由来の９０ｋＤａ及び８０ｋＤａから成る第■因子のアミノ末端と同じであることを示した。

図７及び図８は、第■：Ｒ５因子をトロンビンと共にインキュベーション（第■ 因子ＩＵあたりトロンビン０．０１Ｕを添加した）した後に得られた活性化曲線及び５ＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンプロットパターンを示す０反応混合物から採取したサンプルを直接アッセイするために１段階クロッティング法（阿１ｋａｅｌｓｓｏｎ、　Ｍら（１９８３）　、　Ｂｌｏｏｄ　６２．１００６〜１０１５　）を使用した。２分以内に１７倍の活性化が得られ、次いで失活した。５ＡＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンプロットによる分析用のサンプル中の反応を停止させるなめに０．０２ｇ／ｍｌのドデシル硫酸ナトリウムを添加した０図６に関して記載したように、反応中に適当な時間間隔で採取したサンプルを電気泳動及びウェスタンプロットで分析した。得られた結果によれば、トロンビンとのインキュベーション中に第■因子のペプチドは血漿第■因子のペプチドと同様の分子量変化を示した。従って、９０ｋＤａのペプチドはトロンビンによって開裂され、５０ｋＤａ及び４０ｋＤａのペプチドの混在物が形成された。８０ｋＤａのペプチドは開裂され、７０ｋＤａのペプチドが形成された。トロンビンによる試験は、第■：Ｒ５因子がこの酵素との相互作用において血漿第■因子と同様の挙動を有することを示した。この特徴はｉｎ　ｖｉｖｏの生物学的活性に必須であると考えられる。

５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−６Ｂのサイズ排除り０７トグラフイーを使用して、第■：Ｒ５因子とヒトフォン・ビルプラント因子との相互作用を試験した。１０ＩＵの第Ｗ：Ｒ５因子を３０Ｕの精製ヒトフォン・ビルプラント因子と共に３７ ℃で２０分間インキュベートした。次に、インキュベーション混合物を、５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−６Ｂを充填したカラムに流した。第■因子活性を有する全部の材料がフォノ・ビルプラント因子と共にボイドボリュームに溶出した。フォノ・ビルプラント因子を添加しない第■：Ｒ５因子をカラムに流したとき、第■ 因子活性を有する材料は、血漿第■因子の９０ｋＤａ〜８０ｋＤａの形態も溶出する場所で内部分画中にのみ溶出した。この結果は、第■：Ｒ５因子がフォノ・ビルプラント因子に結合する能力を有することを示し、これは、優れたｉｎ　ｖｉｖｏ生存を得るための必要な特性である（　Ｂｒ１ｎｋｈｏｕｓ、に、Ｍ、ら（１９８５）　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｅｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ　８２．８７５２〜８７５６）。

本発明の第■誘導体は１９９１年３月１３日にＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｔｓｍｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎに寄託された。

従って、第■：Ｒ３因子には受託番号ＤＳＭ６４１５、第■：Ｒ４因子には受託番号ＤＳＭ６４１７、第■：Ｒ５因子には受託番号ＤＳＭ６４１６が夫々与えられている。

ＦＩＧ、６ＦＩＧ、８ｋＤａ　Ｏ’丁３’　５’　１０’　３σ６０’　１５σ〕にコ ■ ヒト第■因子の９０ｋＤａ鎖をコードする第１ＤＮＡセグメントとヒト第■因子の８０ｋＤａｇをコードする第２ＤＮＡセグメントとを含み、前記セグメントがリシン及びアルギニンから選択された２〜１０個のアミノ酸から成るリンカ−ペプチドとコードするリンカ−ＤＮＡセグメントによって相互接続されている生物学的に活性の組換えヒト第■因子誘導体をコードするＤＮＡ配列；かかるＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクター；かかる組換え発現ベクターによって形質転換された動物起源の宿主細胞；組換えヒト第■因子誘導体の製造方法：及び金属イオン結合によって結合されたＨｇとＬ鎖とを含むヒト第■因子誘導体。

国際調査報告１ｆｆｉ＋４＋＋＋おａｌｉｌ＋＋ｍｉ。１晶−ｋＰＣＴ／ＳＥ９２１０ＯＩＳＯ

Claims

【特許請求の範囲】

１．ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸１〜７４０をコードする第１ＤＮＡセグメントと、ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸１６４９〜２３３２をコードする第２ＤＮＡセグメントとを含み、前記セグメントが、リシン及びアルギニンから選択された少なくとも２つのアミノ酸残基から成るリンカーペプチドをコードするリンカーＤＮＡセグメントによって相互接続されていることを特徴とする生物学的に活性の組換えヒト第ＶＩＩＩ因子誘導体をコードするＤＮＡ配列。
２．前記リンカーＤＮＡセグメントが、約１０個までのアミノ酸残基をコードしていることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ配列。
３．前記リンカーＤＮＡセグメントが、２、３または４個のアミノ酸残基をコードしていることを特徴とする請求項１または２に記載のＤＮＡ配列。
４．前記リンカーＤＮＡセグメントが、３または４個のアミノ酸残基をコードしており、Ｇｌｕ−１６４９の前のアミノ酸残基がアルギニンであることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列。
５．前記リンカーの全部のアミノ酸残基がアルギニンであることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列。
６．前記リンカーＤＮＡセグメントが、アルギニンから構成された３または４個のアミノ酸残基をコードしていることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列。
７．請求項１から６のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列から成る転写ユニットと、転写プロモーターとポリアデニル化配列とを含むことを特徴とする組換え発現ベクター。
８．請求項７に記載の組換え発現ベクターによって形質転換された動物起原の宿主細胞。
９．請求項１から６のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列によって発現された生物学的に活性の組換えヒト第ＶＩＩＩ因子誘導体の製造方法であって、請求項７に記載の組換え発現ベクターによって形質転換させた動物細胞系を栄養培地中で培養し、金属イオン架橋によって互いに結合された分子量９０ｋＤａ及び８０ｋＤａを夫々有する２つのポリペプチドから成るヒト第ＶＶＩＩ因子誘導体を発現及び分泌させ、前記誘導体を培地から回収することを特徴とする方法。
１０．請求項９の方法によって調整されたヒト第ＶＩＩＩ因子誘導体。
１１．ヒト第ＶＩＩＩ因子の９０ｋＤａのドメインと、任意にリンカーペプチドまたはその一部を介して、金属イオン結合によって前記９０ｋＤａのドメインに結合されたヒト第ＶＩＩＩ因子の８０ｋＤａのドメインとを含むことを特徴とする請求項１０に記載のヒト第ＶＩＩＩ因子誘導体。