JPH05503012A - ガラクトースオキシダーゼの単離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ガラクトースオキシダーゼの単離方法 発明の分野 真菌培地からガラクトースオキシダーゼを単離及び精製する方法が開示されてい る。醗酵ブロスからの上澄液は限外濾過に付され、しかる後高圧液体クロマトグ ラフィーを用いてカルボキシスルホン陽イオン交換カラムで分離される。銅イオ ンは酵素活性を保証する上で存在しなければならない。

発明の背景 ガラクトースオキシダーゼ（Ｅ、　Ｃ，１，１，３，９、Ｇ○アーゼ）は多くの アルコール類及びガラクトースの一級ヒドロキシル基を酸化する銅含有細胞外酵 素である。その酵素はいくつかの真菌種で産生されるが、ダクチリウムーデンド ロイデス（Ｄａｃｔｙｌｉｏｍ　Ｄｅｎｄｒｏｉｄｅ＋）の醗酵が現在量も実用 的な供給源である。この真菌の増殖及び増殖培地から排出された酵素の精製に関 する簡単な方法はＴｒｅｓｓｅｌ　ａｎｄ　Ｋｏ＋ｍａｎ、Ａｎａｌｙｔｉｃａ ｌ　ＢｉｏｃｈｅｌＩｌｉ＋＋＋ｙ、１０５．１５０−１５３（１９３０）で記 載されている。

このプロセスにおいて、その酵素は暗所中２０℃で数日間にわたり好気的に真菌 培養物中で増殖される。次いでこの真菌はグルコースペース液体培地に移され、 ２０℃で約２日間にわたり好気的に増殖される。完全人工培地が用いられる；そ れはソルボース、グルコース、微量栄養素として痕跡量の金属イオン及び必須ビ タミンとしてチアミンの混合物である。培養物の増殖には通常５〜７日間かかる 。ガラクトースオキシダーゼの単離には微結晶セルロースの存在下で沈降から始 めるいくつかのステップを含む。精製はホスホセルロースカラムにおけるクロマ トグラフィーで完了される。

その酵素はタンパク質１モル当たり１原子の銅を含み、第二銅（Ｃｕ２″）イオ ンの存在は酵素活性に必要である。

ガラクトースオキシダーゼが銅欠乏条件下で増殖された場合に、ダクチリウム・ プントロイデスは触媒不活性タンパク質、α−ガラクトースオキシダーゼを合成 して排出する。このタンパク質の触媒活性は第二銅イオンが銅枯渇溶液に加えら れた場合に出現する（Ｓｈａｔｘｍａｎ　ａｎｄ　Ｋｏｓｍａｎ、　Ｂｉｏｃｈ ｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　ＡｃＮｘ、　１９７８．５４４．１６３−１６９； Ｍａｒｋｕｓ　ｅｔ　ａｔ、、Ｇ、Ａｖｉｇａｄ、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌ、、１３（５）、６８５−６９３（１９６５）参照〕。この結果は、銅がガラ クトースオキシダーゼの触媒活性に必要であるが、第二銅イオンはダクチリウム ・プントロイデスによるタンパク質の合成を誘導しないばかりかその完全組立て 及び分泌にも不要であることを示す。他方、日本の研究者ら（Ａｉｓｉｋｘ　ａ ｎｄ　Ｔｅｒａｄａ。

Ａｇ＋ｉｃ、　Ｂｉｏ、　Ｃｈｅｍｓ、　、　４５．２３１１−２３１６（１９ ８１）　）はギベレラ・フジクロイ（Ｇｉｂｂｅ＋ｅｌｌａ　Ｆｕｊｉｋａ＋ｏ ｉ）によるガラクトースオキシダーゼタンパク質の合成が銅で調節される現象で あると結論した。

銅イオンは、また、インヒビターとガラクトースオキシダーゼとの複合化を妨げ ることで、非精製醗酵培地において酵素活性を保存する（Ａｖｉｇａｄ　ａｎｄ 　Ｍａｒｋｕｓ、ｌ＋＋ａｅｌＪ、　Ｃｈｃｍ、　、　３．１９３　（１９６６ ）　〕、ダクチリウム・プントロイデスはへブタペプチドとして確認された少な くとも１種のガラクトースオキシダーゼインヒビターを産生ずることが知られて いる。このタンパク質は銅の非存在下でガラクトースオキシダーゼと安定な不活 性複合体を形成する。

１〜１０ｍＭ第二銅イオンの存在はこの阻害を妨げるだけでなく、阻害された酵 素を徐々に活性化させる。阻害成分は通常クロマトグラフィーによりガラクトー スオキシダーゼ調製物から除去される。

本プロセスでは３日間の単離期間にわたり約４５％収率（回収活性として測定） で酵素を産生ずる。この単離及び精製は限外濾過及び高圧液体クロマトグラフィ ー精製技術の使用により多量の酵素調製混合物に関して単純化かつ実施できるこ とがここにわかった。ダラム量のガラクトースオキシダーゼが１日で産生できる 。

したがって、本発明の目的は効率的な方法により７０％以上の収率（回収全活性 として測定）で多量のガラクトースオキシダーゼを産生ずることである。

すべてのパーセンテージは他に指摘のないかぎり重量による。

発明の要旨 純粋なガラクトースオキシダーゼを産生及び単離するためのプロセスが開示され ている。そのプロセスは＝（１）窒素源、炭素源、微量金属及びチアミンを含む 培地中において２０〜約２５℃の温度でダクチリウム・プントロイデスを好気的 に醗酵させる；（２）０．１５〜０．２５μｍフィルターを用いて醗酵ブロスか ら上澄液を濾過する： （３）１０，０００分子量膜による限外濾過で酵素を濃縮する； （４）（３）からの貯留液を銅イオン及びヒスチジン含有緩衝液で平衡化する： （５）場合により、汚染タンパク質を除去するため貯留液をＤＥＡＥセルロース で処理する；（６）高圧液体クロマトグラフィー法を用いてカルボキシ−スルホ ンカラムで酵素を精製する；ステップからなる。

発明の詳細な説明 Ａ、醗酵 ダクチリウム・プントロイデス又は他の真菌源のガラクトースオキシダーゼの出 発ブロスが調製される。ＫＯ５ＩＩＩａｎ、前掲の操作ではダクチリウム・プン トロイデスで接種された静置デキストロース寒天斜面を調製する。接種された斜 面は約２０℃で約２日間にわたり暗所下で好気的に増殖させて、真菌の均一な白 い綿毛状のコーティングを形成させる。日光又は過度に温かいインキュベート温 度への長期接触は、変色されかつ微細マット化された“異常“培養物をもたらす 。

少量のこの出発真菌は、ガラクトースオキシダーゼを増殖させるため液体培地と ミックスされる。この完全人工培地は炭素源としてソルボース又はグルコース、 微量栄養素として痕跡量の金属イオン及び必須ビタミンとしてチアミンを含有す る。培養物の増殖には５〜７日間かかる。増殖培地のｐＨは中性である。

硫酸銅（１０〜約６０μＭ）は、硫酸銅濃度が１１μＭである場合に標準的方法 で醗酵されたバッチと比較して、醗酵培地において酵素活性を増加させかつ醗酵 ランの再現性を改善する。他方、（Ｃａ”）第二銅濃度が１ｍＭに増加された場 合に、菌糸体の増殖は明らかに遅延化され、わずかに痕跡量のガラクトースオキ シダーゼ活性が検出されただけであった。

ダクチリウム・プントロイデスを増殖させる上で通常のバッチサイズは２０（Ｌ ）リットル容器である。このプロセスはキロリットル容器中で真菌を増殖させる ために容易にスケールアップできる。表１は２５０Ｌ醗酵檀での酵素ブロス産生 用フローチャートを提供する。

表１ ダクチリウム・プントロイデス使用 ダクチリウム・プントロイデス　ＮＲＲ［、２９０３を２５℃、暗所下で３−５ 日間にわたり 寒天斜面上で増殖させ、 アルミホイルでラップして４℃で貯蔵する↓ ５００ｍ１出発培地含有の１リットル出発フラスコを旋回シェーカーにおいて室 温で３日間 インキュベートする（３００　ｔｐｍ、旋回半径１′）↓ １．２マ／マ接種原 ↓ ２１℃の２００リツトル培地含有 ２５０リットル醗酵槽； Ｄｏ＞５０％飽和を維持するように 調節される初期通気速度＝１ママｆｆｉ：攪拌速度＝　１００　ｒｐＩＩｌ 醗酵ブロスで使用可能な微量金属としてはマグネシウム、マンガン、亜鉛、カル シウム及び鉄がある。これらの金属は水溶性塩として加えられる。硫酸、塩化物 、硝酸及び炭酸イオンのような陰イオンも使用できる。銅のレベルは非常に重要 であり、約１０〜約６０μＭの範囲内であるべきである。好ましくは、銅の量は 約４５〜約５８μＭである。微１に金属のレベルは通常第二銅レベルと同等か又 はそれ以下である。

微量金属に加えて、窒素源が必要である。硝酸アンモニウムが好ましい窒素源で あるが、但し他の無機塩、例えば硝酸ナトリウム又はカリウム、硫酸アンモニウ ム、リン酸水素アンモニウム、リン酸アンモニウム等も使用できる。いかなるア ルカリ金属又はアルカリ土類金属硝酸塩であっても使用可能である。尿素も窒素 源として使用できる。

炭素源はグルコース又はソルボースであることが好ましいが、但し他の低分子量 炭化水素類も使用できる。これらにはフルクトース、スクロース及びマンノース がある。炭化水素のレベルは醗酵ブロス中で約０゜２〜約１０％である。

チアミンは約１〜約１０μＭで加えられる。

培地のｐＨは約６．０〜約７．８に保たれる。ｐＨはリン酸緩衝液の使用でコン トロールされることが好ましいが、但し他の緩衝液も使用可能である。

醗酵の温度は環境温度、好ましくは２０〜２５℃に維持される。必要であれば、 水のレベルは蒸発で失われた水を補充することで維持される。

醗酵反応中に溶液は攪拌され、気流で通気される。あらゆる油又は他の汚染物を 除去するために濾過された圧縮空気が用いられる。例えば、空気はほとんどの汚 染物を除去するためにオイルフィルター及びガラスウールプラグに通過させるこ とができる。気流はブロス中で望ましい酸素飽和度を維持する速度に調整される 。好ましくは、５０％飽和以上の大気酸素が望ましい。最も好ましくは、ブロス は酸素で約７５％飽和される。

醗酵が行われる時間の通常の長さは約１００〜約２００時間、好ましくは約１２ ０〜約１４５時間である。

醗酵ブロスの調製に用いられる金属イオン溶液、糖溶液及び窒素溶液のすべてと 醗酵中に加えられる水は滅菌されるべきである。これは干渉酵素及び他の真菌、 細菌又はウィルスの形成を最小にする。

表２ 全ブロスからのガラクトースオキシダーゼの単離（〜２００リットル） ０．１５〜０．２５μｍフィルターによる濾過〔ミリポア・ペリコン（Ｍｉｌｌ ｉｐｏｒｅ　Ｐｅ１ｌｉｃｏｎ）使用〕↓ 濾液へのＣｕ５Ｏｔ　＆ヒスチジンの添加↓ １０．０００　ＭＷＣＯ膜で濾過（ミリポア・ペリコン使用）↓ 貯留液（〜３．５リットル） ２１Ｍ　Ｃ０５Ｏ／　５　ｍＭヒスチジン／　５１ｎＷ　ＮａＯ［１緩衝液に対 する透析 （ミリポア・ヘリ：＝ｒ　：／　／　１０．　Ｇｏｏ　ＭＷＣＯ腹側用）↓ 貯留液（〜３．５リットル） ↓ ＤＥＡＥセルロース〜４５０ｇの添加；３０分間ミキシング ↓ 濾過（ミリポア・ペリコン微孔質膜使用）↓ 濃縮（ミリポア・ペリコンＩＱ、０００　ＭＷＣＯ膜使用）貯留液（〜１００ｍ １） ↓ ＨＰＬＣ精製用にアミコンセル （Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｅ１ｌ）／ＩＱ、０００　ＭＩＦＣＯ膜を用いた２ｍＭ　Ｃ ０３Ｏ／　４　ｍＭｔ：　スｆ　’）　：／／　２０ｍＭ　ＭＥＳ緩衝緩衝 液封する透析 Ｂ、ガラクトースオキシダーゼの単離 表２は単離プロセスについて示す。

醗酵バッチの内容物は約３〜約１０’Ｃに冷却され、０゜１５〜０．２５μｍフ ィルターで濾過される。ミリポア又は他のフィルターのような慣用的フィルター が許容される。ミリポアフィルタ−の使用は、それが次のステップで限外濾過装 置の膜を汚すゲル様ポリマーも除去することから好ましい濾過技術である。しか しながら、ナイロンメツシュシートＣＭＮ−２１０（スモールーポインツ（Ｓｌ １１！１１　Ｐｏ１ｎｔｓｌ、フロリダ〕のような他の濾過手段も使用可能であ る。

硫酸鋼及びヒスチジンは銅イオン（＊二銅）の８〜約１２ｍＭ及びヒスチジンの 約１５〜約２５ｍＭ溶液を得るために必要な量で濾液に加えられる。

濾液は１０．０００分子量カットオフ膜で限外濾過により約１０〜約２５％に濃 縮される；ミリポアペリコンカセリトンステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｐｅ１ｌ ｉｃｏｎ　Ｃａ５ｓｅｔｔｅ　５ＨｊｅＩ１１）が他の限外濾過システムと同様 に使用できる。

貯留液は硫酸銅（３〜８ｍＭ）、ヒスチジン（３〜８　ｍＭ）及び水酸化ナトリ ウム（３〜８　ｍＭ）を含有した新鮮な調製緩衝液（ｐＨ約７．０）で場合によ り平衡化される。

再びその溶液は以前とほぼ等しい容量に濃縮される。

貯留液は硫酸銅及びヒスチジンを含有したりリン酸緩衝液（ｐＨ約７．０）で平 衡化されたＤＥＡＥセルロースで場合により処理される。セルロースは貯留液、 即ちガラクトースオキシダーゼ含有溶液から約５０％の汚染タンパク質を吸着す る。これらタンパク質の除去は酵素の最終精製を容易化する。セルロースは濾過 され、濁っていればいかなる物質も除去するため遠心される。５〜約３０分間の セルロース処理がこれらのタンパク質を除去する上で通常充分である。

この溶液は出発溶液の約１０〜約２５％まで更に濃縮するため再び限外濾過に付 される。酵素は１０．０００分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）透析バッグを用いて ｐＨ約５．６の硫酸鋼（２〜約２０ｍＭ）、ヒスチジン（４〜４０　ｍＭ）及び ＭＥＳ　Ｃ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸〕　（１０〜３０ｍＭ）の 溶液でこの濃縮中に平衡化される。

溶液中に残ったいかなる濁り又は微細粒子も濾過又は遠心により除去できる。

Ｃ，クロマトグラフィー 酵素溶液は最後に高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製され る。Ｊ、Ｔ、ベーカ−（１，Ｔ、　Ｂａｋｅｒｊ製のカルボキシ−スルホン４０ ミクロンカラムが用いられる〔ベーカーボンド・カルボキシ−スルホン　（Ｂａ ｋｅ＋ｂａｎｄ　Ｃａ＋ｂｏＢ−ｓｕｌｆｏｎ”）　）　ａカルボキシ−スルホ ンカラムはサイズが５〜５０ミクロンの範囲である粒子を含むことができる。カ ルボキシ−スルホン基賀は参考のためここに組み込まれる米国特許第４，７２１ ，５７３号明細書で記載されている。

粗製酵素溶液の注入とＭＥＳ、ヒスチジン及び硫酸第二銅からなる緩衝液による 空隙容量の溶出との後に、酢酸ナトリウム、ヒスチジン及び硫酸蔦二銅を含有し た緩衝液の直線勾配が適用される。通常この溶出は約０．５〜約２ｍｌ／ｌｌ１ ｉｎの流速で約１〜２時間にわたり行われる。

約１０〜約１５％のステップ勾配が通常用いられる。

正確な濃度勾配及び時間は溶液、カラム長さ及びカラム担持方法に依存している 。当業者であれば最少の実験で正確な方法を決定することができる。酵素位置は ２８０ｎｍの紫外線を用いて決定される。

Ｄ、アッセイ方法 アッセイ溶液はリン酸緩衝液（０，１Ｍ、ｐＨ７，０）を煮沸し、しかる後それ を室温に冷却することで調製される。この緩衝液にメタノール０．５１に溶解さ れたＤ−ガラクトース〔“実質上無グルコース”物質としてジグ７　（Ｓｉｇｍ ａ）から入手：１５００ｍｇ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（シグマから入手、 基本アイソザイムのタイプＩＩ＋混合物）５ｍｇ及び０−ジアニシジン（３，３ −−ジメトキシベンジジン）５ｍｇが加えられた。これらの溶液はリン酸緩衝液 に加えられ、その緩衝液はメスフラスコ中で１００１１１１に希釈される。０− ジアニシジン（３，３′−ジメトキシベンジジン）は迅速に加えられるべきであ り、そうでなければ濁った懸濁液が生じてしまう。アッセイ溶液は光から遮断し て貯蔵及び冷蔵されねばならない。その溶液は４６０＋＋ｍの吸光度が緩衝液溶 液単独よりも０．１以上多くなったとき廃棄されるべきである。

ガラクトースオキシダーゼの活性を調べるため、アッセイ溶、液１１が紫外線ス ペクトロメーター用のマイクロキュベツトに室温で加えられる。酵素のサンプル （５〜５０μＬ）はアッセイ溶液に注入され、約１秒間攪拌される。直線的な吸 光度増加が１分間追跡され、吸光度／１Ｉｌｉｎが計算される。添加される酵素 の量はこの値が０．２〜０．６となるまで調整されるべきである。

固体酵素サンプルを用いる場合は、固体サンプルはアッセイ混合物中で約０．４ 単位に等しい酵素の量にするため０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解さ れる。

タンパク質アッセイ パイオーラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）　タンパク質アッセイ色素濃縮物、カラログ Ｎｏ、　５００−００６がアッセイ標準に用いられる。

このタンパク質アッセイ色素は蒸留水で約１倍容量の濃度〜４倍容量の濃度に希 釈されるべきである。０．１５Ｍ塩化ナトリウム中の牛血清アルブミン溶液が調 製される（　１　ｍｇ／ｍｌ）。タンパク質１０〜１００μｇ含宵の１０サンプ ルが試験管（１０μＬ１２０μＬ等）に加えられる。容量は各試験管で０．１ｍ ｌに調整される。アッセイ溶液５ｍｌが各試験管に入れて測定され、３０秒間ミ ックスされる。２分間後、アッセイ溶液５ｍｌ中０．１５Ｍ塩化ナトリウム０． １ｍｌから調製されたブランク溶液に対する５　９５　ｎｍの吸光度が測定され る。タンパク質の重量が吸光度に対してプロットされる。

江ユ ２０Ｌボトル中におけるガラクトースオキシダーゼの醗！ ダクチリウム・プントロイデス株ＮＲＲＬ２９０３はノーザン・リージョナルー リサーチ・ラボラトリ−（Ｎｏｒ＋ｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ　Ｌａｂｏｒａ＋ｏｒ７）　（ビオリア、■Ｌ）のＵＳＤＡのＪ、Ｊ、　ガ ラス博士（Ｄｒ、　１．　Ｊ、　Ｅｌｌｉｓ）から入手し、寒天斜面上で維持し た。２０リツトルオートクレーブ処理用プラスチツクボトルに４つの金属エアレ ータ−及びミキシング用の三段階タービンプロペラで装備させた。圧縮空気を油 除去フィルター［カリフォルニア州、グレインビュー・プロダクツ（Ｇ＋ａｉｎ ｖｉｅｖ　Ｐｒｏｄｕｃ＋りのＤＰＳ−１９］Ｌかる後無菌ガラスウールフィル ターで濾過した。フィルターに通した後、空気をボトル内の４つのエアレータ− で分配する。醗酵中、各ボトル（醗酵フラスコ）中の全気流は空気の出口で測定 したときに１９リットル／ｗｉｎで維持する。

寒天斜面： 出発培地＋　１．５％寒天 出発培地： 溶ＨＡ　５．　ｇａｇ　＋　溶液Ｂ　ｌ　ｆｌ＆＋溶ａｃ　Ｌ部十溶液ＤＯ，０ Ｇ０６部 培地： 溶ｉＡ８部十溶液Ｃ１部十溶液Ｄ　Ｏ，０００８部溶液Ａ：　（塩、窒素） １０．７４　ｇ／ｌ　Ｎａ２ＨＰＯ４ １０，４１ｇ／ｌ　ＫＩＩ２ＰＯ４ １，２７ｇ／ｌ　（Ｎｌ１４）　２Ｎｏ３２．５０　ｇ／ｌ　（ＮＨ４）　２Ｓ ｏ４０．９３　ｇ／ｌ　Ｎａ０ｆ１ １．０７ｇ／１ＫＯＨ 溶液Ｂ：　（微量金属） ２、０５　ｇ／　ｌ　Ｍｇｓ［１４ １９，４８ｍｇ／ｌ　ＭｎＳＯ４，［Ｉ２０３０．００　ｍｇ／ｌ　２ｎＳＯ４ ，７Ｈ２Ｏ１７，７５ｍｇ／ｌ　ＣａＣｌ２．２　Ｈ２Ｏ２８，４４ｍｇ／ｌ　 ＦｅＳＯ４，７Ｈ２Ｏ１３５ｍｇ／ｌ　ＣｕＳ１４．５　Ｈ７０溶液Ｃ：　（炭 素源） 寒天斜面及び８発フラスコの場合ニ ア９．４ｇ／ｌ　グルコース 培養フラスコ／醗酵槽の場合： ｔｏｏ　ｇ／ｌソルボース 溶液Ｄ＝　（チアミン） ３３．７ｇ／ｌチアミン、濾過滅菌 醗酵フラスコを水浴中２１℃で維持する。温度コントロールはサーモスタットに よる冷却又は加熱媒体のチュービング中で水を循環させることにより行う。

溶液Ａを醗酵フラスコに入れる。次いでスターラー及びエアレータ−をフラスコ に挿入し、ゆっくりと気流を導入する。攪拌速度は４９０　ＲＰＭ（静かに攪拌 ）で維持する。溶液Ｂ及びＣを各フラスコに加え、しかる後チアミンストック溶 液（８００μＬ）を加える。次いで醗酵槽に出発フラスコから菌糸体懸濁液１２ ０ｍ１で接種する。

気流を１９リットル／ｍｉｎから調整し、醗酵を１３６〜１４０時間続ける。

４８時間の醗酵後、２リツトルの無菌水をフラスコに加えて蒸発した水を補充す る。

醗酵によるブロスを２１０μｍナイロンメツシュシートで濾過し、菌糸体を圧搾 乾燥させる。濾液の容量を測定し、硫酸鋼及びヒスタミンを硫酸銅の１０ｍＭ溶 液及びヒスタミンの２０ｍＭ溶液を得るような量で濾液に加える。

溶液をＧＦ／Ｄワットマン（Ｗｈａｊｍｚｎ）ガラス繊維フィルター及び０．２ ２μｍミリポアフィルタ−（ミリディスク疎水性カートリッジ）で濾過する。溶 液を加圧容器からカートリッジに供給する。微細濾過がゲル様ポリマーを除去す る上で必要である。２つのカートリッジ、即ち各々１５リツトルの溶液につき１ つを用いる。濾過された溶液は１０．ＯＯＯＭＷＣＯ膜カセット装備のミリポア ベリコンカセリトンステムを用いて限外濾過により約５００１まで濃縮する。こ の濃縮には３０リツトル溶液につき１〜２時間要する。貯留液を同ミリポアペリ コンカセリトンステムにおいてｐＨ約５．６の硫酸鋼（５ｍＭ）、ヒスチジン（ ５ｍＷ）及び水酸化ナトリウム（５ｍＭ）含有新鮮調製緩衝液で平衡化する。

貯留液を限外濾過システムで用いられた場合と同様の緩衝液で平衡化されたＤＥ ＡＥセルロース（６０ｇ）で処理し、１５分間攪拌する。セルロースを吸引濾過 で除去する。濾液を９０００ｇで３０分間遠心していかなる濁り又は沈降も除去 する。

透明な酵素溶液を１０．ＯＯＯＭＷＣＯ膜装備のアミコン攪拌限外濾過セル（Ｐ Ｍ−１０径７６　ｍｍ）を用いて４０ｐｓｉ（約２．　８　ｋｇ／ｃｍ２）で約 １５ｍＮ：濃縮する。この限外濾過には３〜６時間要する。濃縮された酵素溶液 は１０．ＯＯＯＭＷＣＯ膜サイズ装備のす析ノくラグを用いてｐＥ（！５．　６ の硫酸銅（２ｍＭ）、ヒスチジン（４ｍＭ）及びＭＥＳ（２０ｍＭ）の溶液で平 衡化する。貯留液を９０００ｇで３０分間遠心していかなる濁りも除去する。

濃縮液をＧ／Ｆワットマンガラス繊維フィルターのプラグで濾過して、この溶液 から微細粒子を除去する。

高圧液体クロマトグラフィーカラム（４０ミクロン）をカルボキシスルホン（Ｊ 、Ｔ、ベーカー、ベーカーボンド・カルボキシ−スルホン）で充填する（４０． ６Ｘ２５０ｍｍ）。濃縮された酵素溶液（１，７５ｍ１）を２ｍｌループを用い てカラムにのせる。空隙容量ピークを溶出させて集める。濃粗製酵素を４〜５回 にわけてカラムに注入し、空隙容量を溶出させる。最後の空隙容量が溶出した後 、１００％八〜１へ０％Ｂの直線勾配を１時間にわたり適用する。流速は１　ｍ ｌ／ｗｉｎである。緩衝液Ａは水酸化ナトリウムで調整されたｐＨ５，６の２０ ＋＊Ｍ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥ　Ｓ）　、２ｍＭ硫酸銅 、４ｍＭヒスチジンの混合液である。緩衝液Ｂは酢酸又は水酸化ナトリウムで調 整されたｐＨ５，８の２ｍＭ硫酸鋼、４ＩｉＭヒスチジンの酢酸ナトリウム１Ｍ 溶液である。ガラクトースオキシダーゼ酵素は約１６分間で溶出する。２８０　 ｎｍにセットされた紫外線検出器が酵素を検出するために使用できる。

空隙容量を標準活性分析によりガラクトースオキシダーゼの存在に関して分析す る。酵素が存在する場合、空隙溶液は鋼イオン及びヒスチジン存在下で限外濾過 濃縮後に再クロマトグラフィーに付すことができる。

７０％ガラクトースオキシダーゼの収率が得られる。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成　４　年　６　月　１９日 特許□長□　７ケ　亘　ウ　圏 ２、発明の名称 ガラクトースオキシダーゼの単離方法 ３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナチ、ワン、ブロクター、エンド、 ギャンブル、プラザ（番地ない名　称　ザ、ブロクター、エンド、ギャンブル、 カンパニー４、代理人 （郵便番号１００） 東京都千代田区丸の白玉丁目２番３号 ５゜　補正書の提出年月日 １９９１年　１０月　２３日 ６、　添付書類の目録 （１）　補正書の翻訳文　１　通 請求の範囲 １、　（１）窒素源、炭素源、微量金属、チアミン及び１０〜約６０μＭの銅イ オンを含む培地中において２０〜約２５℃の温度でガラクトースオキシダーゼの 真菌源を好気的に醗酵させる； （２）０．１５〜０．２５μｍフィルターを用いて醗酵ブロスから上澄液を濾過 する； （３）１０，０００分子量膜心腹る限外濾過で酵素を濃縮する； （４）（３）からの貯留液を銅イオン、ヒスチジン及　゛び水酸化物イオン含有 緩衝液で平衡化する；ステップからなるガラクトースオキシダーゼ酵素溶液の産 生方法であって、 改善が高圧液体クロマトグラフィー法を用いたカルボキシ−スルホンカラムでヒ スチジン、酢酸ナトリウム及び第二銅イオンを含む緩衝液により溶出させてその 酵素を精製することを特徴とする方法。

２、　ステップ（３）からの貯留液が汚染タンパク質を除去するためＤＥＡＥセ ルロースで処理される、請求項１に記載の方法。

３、　炭素源がグルコース又はソルボースである、請求項２に記載の方法。

４、　真菌源がダクチリウム・プントロイデスであり、ステップ（２）における フィルターが０．２２μｍミリポアフィルタ−である、請求項３に記載の方法。

５、　窒素源がアルカリ及びアルカリ土類金属の硝酸塩並びにアンモニウム塩か らなる群より選択される、請求項４に記載の方法。

６、　窒素源が硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム及びそれらの混合物の群か ら選択される、請求項５に記載の方法。

７、　微量金属が銅、カルシウム、マグネシウム、鉄、′７ンガン及び亜鉛の混 合物からなる、請求項５に記載の方法。

８、　醗酵反応のｐＨが約６．０〜約７．８である、請求項５に記載の方法。

９、　ステップ（４）における緩衝液が約５．６のｐＨを有する、請求項８に記 載の方法。

１０、　カルボキシ−スルホンの粒子がサイズ５〜５０ミクロンである、請求項 １に記載の方法。

１１、　溶出が０　、　５〜２　ｍｌ／ｍｉｎの流速である、請求項１０に記載 の方法。

１２、　溶出に用いられる緩衝液が５．８のｐＨを有する、請求項１１に記載の 方法。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（１）窒素源、炭素源、微量金属、チアミン及び１０〜約６０μＭの銅を含 む培地中において２０〜約２５℃の温度でガラクトースオキシダーゼの真菌源を 好気的に醗酵させる； （２）０．１５〜０．２５μｍフィルターを用いて醗酵ブロスから上澄液を濾過 する； （３）１０，０００分子量膜による限外濾過で酵素を濃縮する； （４）（３）からの貯留液を銅イオン、ヒスチジン及び水酸化物イオン含有緩衝 液で平衝化する；及び（５）高圧液体クロマトグラフィー法を用いてカルボキシ −スルホンカラムで酵素を精製する；ステップからなるガラクトースオキシダー ゼ酵素溶液の産生方法。 ２．ステップ（４）からの貯留液が汚染タンパク質を除去するためＤＥＡＥセル ロースで処理される、請求項１に記載の方法。 ３．炭素源がグルコース又はソルボースである、請求項２に記載の方法。 ４．真菌源がダウチリウム・デンドロイデスであり、ステップ（２）におけるフ ィルターが０．２２μｍミリポアフィルターである、請求項３に記載の方法。 ５．窒素源がアルカリ及びアルカリ土類金属の硝酸塩並びにアンモニウム塩から なる群より選択される、請求項４に記載の方法。 ６．窒素源が硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム及びそれらの混合物の群から 選択される、請求項５に記載の方法。 ７．微量金属が銅、カルシウム、マグネシウム、鉄、マンガン及び亜鉛の混合物 からなる、請求項５に記載の方法。 ８．醗酵反応のｐＨが約６．０〜約７．８である、請求項５に記載の方法。 ９．ステップ（４）における緩衝液が約５．６のｐＨを有する、請求項８に記載 の方法。