JPH05503146A - 炭水化物の処理 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 炭水化物の処理 発明の分野 本発明は、分析及び他の目的用の炭水化物の処理に関する。

発明の背景 国際出願Ｎｏ、　ＷＯ３８／　１０４２２は、電気泳動ゲルに炭水化物材料を加 え、ゲルを泳動させ、異なる物質の異なる移動をおこさせることを含む、炭水化 物構造を分析する、又は炭水化物材料を識別もしくは分離する方法を開示してい る。この炭水化物材料は、例えば蛍光標識剤により標識が付けられ、材料に電荷 が与えられ、それにより電気泳動分離が可能になり、そしてゲルを泳動させた後 、物質の観察か可能になる。観察は肉眼で行われるが、電荷結合素子（ＣＯＤ） による観察によって高い感度が得られる。

本発明は、電気泳動で分離された炭水化物ユニットに適用可能な、さらに進んだ 工程のそのような方法の開発に関する。

発明の概要 本発明の一態様により、電気泳動ゲルで泳動された荷電された炭水化物材料を、 吸い取り法により多孔質膜上に移すことを含む、炭水化物材料を処理する方法が 提供される。

この方法は、さらなる処理もしくは貯蔵に適した形状でゲルからの荷電された炭 水化物材料の回収を可能にし、ゲル内の電気泳動分離の永久的記録を与える。例 えば、吸い取られた炭水化物材料は、標識が付けらたプローブ、例えばレシチン 、糖特異的モノクローナル抗体、ウィルス受容体もしくは他の蛋白プローブによ り膜上のプロットを検出することにより分析される。好適なプローブ法は当業者 に公知である。

移動工程は、例えばＪａｃｓｏｎ及びＴｈｏｍｐｓｏｎのＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏ ｒｅｓｉｓ。

１９８４、５．３５−４２に記載されているような電気泳動ゲルから蛋白質を吸 い取るための公知であるような吸い取り法を用いて行われる。例えば、ゲルを好 適な膜と接触させ、電場を加え、ゲル内の物質を膜に移すことを含む半乾燥プロ ット移動装置を用いる電気移動もしくは電気プロット法を用いることが好ましい 。

そのような方法に適した広範囲な多孔質膜は市販入手可能であり、活性紙、ニト ロセルロース、ナイロン、及びポリビニルジフルロン（ＰＶＤＦ）より製造され ている。特定のシステムに適した膜は実験により選択される。

本発明の他の態様において、荷電された炭水化物材料を電気泳動ゲルに加え、こ のゲルを泳動させ、異なる材料の異なる移動をおこさせ、そしてこの材料をゲル から多孔質膜に吸い取り法により移動することを含む、炭水化物材料を処理する 方法か提供される。

このゲルは好ましくは比較的密なポリアクリルアミドゲルを含み、１５〜６０％ 、好ましくは２０〜４０％の濃度を有するが、ある場合には低濃度のゲルを用い ることも可能でありもしくは好ましい。

このゲルは均一な濃度を有するか又はグラジェントゲルの形状であってもよい。

このゲルは好ましくは、例えばＮ、　Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ビス ）により架橋されている。

好ましいゲルは、２０％（上）から４０％（底）の連続勾配で変化するポリアク リルアミド濃度（Ｗ／Ｖ）を有する直線ポリアクリルアミドグラジェントゲルを 含む。このゲルは、ポリアクリルアミドの最も低い濃度において０．５３％、ポ リアクリルアミドの最も高い濃度において１．０６％の濃度でビスにより架橋さ れている。又は、Ｎｅｖｉｌｌｅ、　Ｊｒ、のＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　 １９７１゜２４６、６３２８−６３３４に記載された電気泳動システムが良好な 結果を与えることがわかった。

感度を良好にするため、ゲルは好ましくは、例えば”Ｇｅ１ｅｌｅｃｔｒｏｐｈ ｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ：　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒ ｏａｃｈ″、Ｂ。

Ｄ、Ｈａｍｅｓ　ａｎｄ　Ｄ、　Ｒｉｃｋｗｏｏｄ編、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ出版 に記載されているような蛋白質及びＤＮＡフラグメントについて行う公知の方法 を用い、スタッキングバッファーシステム（移動界面電気泳動、多相ゾーン電気 泳動及び他の名称としても公知である）を用いて泳動される。

炭水化物材料は好ましくは電気泳動分離の前に荷電された蛍光標識剤により標識 付けられ、それにより電気泳動分離できるように、そしてゲルを泳動後及び膜に 移した後材料の観察を促進するようこの材料に電荷が与えられる。

好ましい蛍光標識は１．２もしくは３個の置換スルホン酸基を有するアミノナフ タレンスルホン酸、特に８−アミノナフタレン−１，３，６−）リスルフイオン 酸（ＡＮＴＳとして公知）である。ＵＫ特許出願Ｎｏ、　８９２１８１７．６及 び９０１４１５８．１並びに同時継続ＰＣＴ出願Ｃｌ３９．１／Ｇに記載されて いるように、そのような標識物質の使用はとても良好な感度で異なる炭水化物材 料のとても良好な電気泳動分離を可能にする。

標識剤は、必要により結合した生物分子から離れた後炭水化物材料のサイトに結 合する。又は、生物分子は標識剤の混入を可能にするため公知の方法で改良され る。

炭水化物材料をＡＮＴＳ及び還元剤、例えばナトリウムシアノボロヒドリドにイ ンキュベートすることによりＡＮＴＳのような標識剤により炭水化物材料は標識 付けられる。

標識付けを良好にするため、例えば１５体積部の酢酸及び８５体積部の水を含む 酢酸と水の混合物中の溶液中のＡＮＴＳを加えることが有効であることがわかっ た。ＡＮＴＳは、例えばＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、　Ｅｕｇｅｎｅ、 　Ｏｒｅｇｏｎより市販入手可能であり、二ナトリウム塩の形状で供給されてい る。

ゲルを泳動後、標識付けられた炭水化物材料は、好適な波長の紫外線で照射され ると、ある場合には肉眼で観察できるが、ＣＣＤでイメージングすることにより 良好な分離及び感度が得られる。ＣＣＤの使用はまたとても早く容易に定量され る結果を与える利点を有する。ＣＣＤは好ましくは少なくとも一２５°Ｃに冷却 され、さらに−１６０°Ｃに冷却することにより感度は十分高められる。典型的 な操作温度は−４０〜−１２０°Ｃである。

本発明は、糖蛋白質、プロテオグリカン、糖脂質、スフィンゴ糖脂質、多糖、グ リコサミノグリカン、より誘導されるものを含む炭水化物材料、及び成分として これらを含む複雑な生物分子を含む他の生物分子に適用可能である。

標識剤としてＡＮＴＳを用いる場合、ポリビニルジフルロン（ＰＶＤＦ）の陰荷 電誘導体である、ＭｉＩｌｉｐｏｒｅより得られるＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｎ膜を 用いて良好な結果が得られる。この物質は陰荷電ＡＮＴＳとよく作用し、膜上の ＡＮＴＳ標識付けられた炭水化物材料の実質的に１０％の保持を与える。

本発明を、以下の実施例及び添付図面を参照し、さらに説明する。

図１はＡＮＴＳ　（イオン化状態で示す）と還元糖との反応を説明する式である 。

図２はＡＮＴＳで標識付けられた種々の糖を示す電気泳動ゲルの写真である。

図３及び４は例１で用いられる２つの複雑な分技糖を示す。

図５は図２のゲルからＡＮＴＳを標識付けた糖の電気移動後のＩｍｍｏｂｉｌｏ ｎ−Ｎのシートの写真である。

図６は吸い取った後のゲルの、図２と同様の写真である。

図７はＩｍｍｏｂ　ｉ　］　ｏｎ−Ｎの第二のシートの図５と同様の写真で以下 の例１において、ＡＮＴＳで標識付けられた還元糖はポリアクリルアミドゲル電 気泳動により分離され、次いて垂直電気泳動により薄い多孔質膜上のゲルに移さ れ接着される。

この方法は以下の工程を含む。

図１は、ＡＮＴＳと還元糖との反応を説明している。

１、ミクロ遠心チューブ内で還元糖を凍結乾燥する。

２、酢酸／水（１５：８５、ｖ／ｖ）中の溶液中の０．２Ｍ　ＡＮＴＳにナトリ ウム塩の形状、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、　Ｅｕｇｅｎｅ、　Ｏｒｅ ｇｏｎより得られた）を５μｌ加える。

３、ジメチルスルホキシド中の溶液中の１．０Ｍナトリウムシアノボロヒドリド を５μＩ加える。

４、良く混合し、３７°Ｃて１５時間インキュベートする。

５、サンプルを真空凍結乾燥する。

６、サンプルを好適な体積のサンプルバッファー、すなわち６Ｍ尿素、０．０６ ２Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６，８に溶解する。

ア。サンプルを一７０℃で凍結保存するか又はすぐに電気泳動により分析する。

ＡＮＴＳで標識付けられた糖をポリアクリルアミドゲル内で電気泳動を行う。分 離は各機の分子量及び構造によって異なる。

移動界面（スタッキング）バッファーシステムを用い明確なバンド及び高い分離 度を与える。このシステムはＬａｅｍｍｌｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ、　１９７０ ．２２７．６８０−６８５）に基づくか、５ＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を 排除する。

方法 １、垂直スラブ電気泳動ゲル装置をセットする。０．５ｍｍのゲル厚を用いる。

２．２０％Ｗ／Ｖ（上）〜４０％Ｗ／Ｖの直線ポリアクリルアミドグラジェント からなる分離ゲルを製造する。低濃度アクリルアミド溶液２０％ｗ／ｖ及び０． ５３％Ｗ／ＶのＮ、　Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ビス）並びに高濃度 溶液４０％Ｗ／Ｖ及び１．０６％Ｗ／Ｖのビスを製造する。この溶液は両方とも ０．３８Ｍ　ｌ−リス−ＨＣｌバッフｙ　ｐＨ８，５５，０，０１６７％ｗ／ｖ の過硫酸アンモニウム及び０．０８％ｖ／ｖのＮ、　Ｎ、　Ｎ’　、　Ｎ−テト ラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を含む。ゲル高さは１２ｃｍである。

３、分離ゲル溶液の上に水を乗せ、ゲルを重合させる。

４、分離ゲルの上に高さ２ｃｍのスタッキングゲルを製造する。このスタッキン グゲル溶液は３．０％Ｗ／Ｖアクリルアミド、０．０８％ｗ／ｖビス、（Ｌ１２ Ｍ　トリス−ＨＣｌバッフｙ　Ｉ）Ｈ６，８，０，１％Ｗ／Ｖ過硫酸アンモニウ ム、０．１％ｖ／ｖ　ＴＥＭＥＤからなる。くし形を用いスタッキングゲルにサ ンプルウェルを形成する。

５、スタッキングゲルが重合したら、くし形を取り出し、サンプルウェルを貯蔵 バッファー（１９２ｍＭグリシン、２５ｍＭ　トリス、ｐＨ８，３）で洗浄する 。

６、サンプルをウェルに乗せる。

７、電気泳動装置をセットする。

８、この装置をＤＣ電源にセットし、電気泳動を行う。

９、電流を切る。

１０６型からゲルを外し、紫外線照射を用い、例えばライトボックスを用い写真 をとる。照射光の好ましい波長は約３７００ｍであるか、３０２ｎｍの最大波長 を有する広いスペクトルにより良好な結果が得られる。

この方法は、グルコース及びそのα−４結合したオリゴマーラスべてマルトース からマルトヘプタオースへの良好な分離を可能にする。さらに、同じ分子量を有 するが異なる構造を有するある単糖、例えばＧｌｃをＧａｌからの及び６−デオ キシＧＩＣを２−デオキシＧｌｃからの分離を可能にする。この方法をセロビオ ースからマルトースを及びセロトリオースからマルトトリオースを分離するが、 本発明の方法を用い、Ｇｌｃｂｅｔａｉ３ＧｌｃからＧｌｃａｌｐｈａｌ−３− Ｇｌｃを分離することが可能である。

２７バンドまで、単一のゲルで酵素スターチ消化（αアミラーゼ）か見られる。

ＡＮＴＳで標識付けられた還元糖の吸い取りゲル電気泳動からＩｍｍｏｂ　ｉ　 ｔｏｎ−Ｎの多孔質膜へのＡＮＴＳで標識付けられた還元糖の電気移動は、以下 の方法で半乾燥プロット移動装置を用いておこなわれる。

■、プロットバッファー（２５ｍＭ　トリスペース、１９２ｍＭグリシン）で湿 らせたＷｈａｔｍａｎｎ　３ＭＭ濾紙のシートを半乾燥プロット装置の下の電極 に乗せる。

２、濾紙の上にＩｍｍｏｂｉ　１ｏｎ−ＮもしくはＬｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ　（ Ｍｊｌｌｊｐａｒｅ）用の吸い取り膜を１枚もしくはそれ以上乗せる。

３、膜の上にゲルを乗せる。

４、ゲルの上に５枚の湿らせた濾紙を乗せ、ローラーでプレスし、空気泡を除去 する。

５、このサンドインチの上に半乾燥プロット装置の上の電極を乗せる。

６、ＤＣ電源を接続し、５■で１０分間電気泳動を行う。

このサンドイッチの層の間に空気泡か存在してはならない。

例１ 種々の糖を、上記のようにしてＡＮＴＳで標識付けし、ポリアクリルアミド電気 泳動ゲルで泳動する。得られるゲルを３０２ｎｍの最大波長を有する広いスペク トルを有するライトボックス上のＵＶ照射下で写真をとり、結果を図２に示す。

図２において、トラックを以下のものである。

１、標準混合物（以下を参照） ２、トラック１の標準混合物 ３．６−ジオキシ−Ｄ−Ｇｌｃ、　Ｄ−Ｇｌｃ　、　Ｄ−Ｇａｌ　、６−ジオキ シ−Ｌ−Ｇａｔ（Ｌ−フコース）、マルトース、マルトリオース、マルＩ・へｅ ｒより入手）により消化されたスターチ１５、β−ガラクトシダーゼにインキュ ベートした複雑な糖１　（その構造を図３に示す） １６、β−ガラクトシダーゼ １７、β−ガラクトシダーゼにインキュベートした複雑な糖２（その構造を図４ に示す） １８、β−ガラクトシダーゼ １９、　Ｇａ１ｂｅｔａｌ−４Ｇａｌ　、　Ｇａ１ｂｅｔａｌ−６Ｇａｌ　、セ ロトリオース２０、　Ｇａ１ｂｅｔａｌ−４Ｇａｌ　、　Ｇａ１ｂｅｔａｌ−６ Ｇａｌ　、セロトリオース、６−デオキシＧｌｃ　、マルトヘプタオースプロッ ティング２１、トラック３と同じ ２２、トラック１の標準混合物 ２３、トラック１の標準混合物 標準混合物は、等モル量の、マルトヘプタオース、マルトヘキサオース、マルト ペンタオース、マルトテトラオース、マルトトリオース、セロトリオース、Ｇａ １ｂｅｔａｌ−６Ｇａｌ　、マルトース、Ｇａ１ｂｅｔａｌ−４Ｇ１ｃ（ラクト ース）　、Ｇａ１ａｌｐｈａｌ−４Ｇａｌ、Ｇａ１Ｎａｃ、　Ｇａｌ　、　Ｇｌ ｃ　、　６−デオキシＧｌｃからなる。

図２のゲルはＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｎのシート上に吸い取られた。吸い取った後 の膜を前記のようにしてＵＶ照射下写真をとり、結果を図５に示す。

図６は、吸い取った後のゲルの、図２と同様の写真であり、少量残っている蛍光 ＡＮＴＳ標識を示している。

図７は、図５に示したシートの下に入れた（ゲルから離し。

て）　Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｎ膜の第二のシートの図５と同様の写真である。こ の第二のシートはＡＮＴＳによる蛍光を占めさず、このことは標識付けられた糖 分子かすべてＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｎの第一のシートに閉じ込められたことを示 している。

本明細書において述べたすべての糖は、特に示さない限りＤ異性体である。

Ｍａ１１α１ 国際調査報告 １つｌｅ＋ｖｎ＋ｍｅ＋ｌ　ｋＤ＊ｈｒａｈい、、　ＰＣＴ／叩９０１０１４４ ９国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．電気泳動ゲルで泳動された荷電された炭水化物材料を、吸い取り法により多 孔質膜上に移すことを含む、炭水化物材料を処理する方法。 ２．荷電された炭水化物材料を電気泳動ゲルにのせ、ゲルを泳動させ、異なる材 料の異なる移動をおこさせ、そしてこの材料を吸い取り法によりゲルから多孔質 膜上に移すことを含む、炭水化物材料を処理する方法。 ３．電気泳動ゲルが１５〜６０％の濃度のポリアクリルアミドゲルを含む、請求 項２記載の方法。 ４．ゲルが２０〜４０％の濃度を有する、請求項３記載の方法。 ５．ゲルがＮ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドにより架橋されている、請求 項３又は４記載の方法。 ６．電気泳動がスタッキングバッファーシステムを用いて行われる、請求項２〜 ５のいずれか記載の方法。 ７．吸い取りが電気移動法を用いて行われる、前記請求項のいずれか記載の方法 。 ８．吸い取りが半固体ブロット移動装置を用いて行われる、請求項７記載の方法 。 ９，多孔質膜が、活性紙、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニルジフルロン 及びこれらの荷電された誘導体から選ばれる、前記請求項のいずれか記載の方法 。 １０．多孔質膜を標識付けられたプローブと接触させる工程をさらに含む、前記 請求項のいずれか記載の方法。 １１．プローブが蛋白プローブである、請求項１０記載の方法。 １２．炭水化物材料がアミノナフタレンスルホン酸により標識付けられている、 前記請求項のいずれか記載の方法。 １３．炭水化物材料が８−アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸によ り標識付けられている、請求項１２記載の方法。 １４．多孔質膜がポリビニルジフルロンの陰荷電した誘導体を含む、請求項１３ 記載の方法。 １５．炭水化物材料が糖蛋白質、プロテオグリカン、糖脂質、スフィンゴ糖脂質 、多糖、グリコサミノグリカン又は他の生物分子より得られる、前記請求項のい ずれか記載の方法。 １６．吸い取られた荷電された炭水化物材料を表面に有する多孔質膜。