JPH05503285A - グルカン配達系及び補薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 グルカン配達系及び補薬 発明の背景 生物工学及び免疫学の進歩により、ワクチンなどの安全で有効な薬剤を得る新し い挑戦が生まれた。例えば新しいジェネレーションサブユニット及び抗イデイオ タイプ抗原により非常に安全なワクチンが得られる：しかしこれらのワクチンは 一般に免疫刺激及び予防効果が少ない。従って新規薬剤又はワクチン配合物の重 要な特徴は、配達機構を与え、ワクチンの場合は抗原に対する免疫応答を増強す ることによりその安全性と有効性を強化する成分である。補薬は一般に、免疫応 答を増強する成分として、及び抗原の供与を増し、長期間にわたり薬剤及び抗原 を持続的に放出し、又は薬剤あるいは抗原に特定の免疫細峰を標的とさせる配達 系として分類することができる。

今日の補薬及び配達系の多くに重大な欠点がある。はとんどが細菌又は植物を起 源とする未加工の配合物、又は油性の乳液であり、その活性成分及び作用の機構 は未知である。さらに通常これらの配合物は毒性であり、特に人間に適用する場 合安全に使用することができない。酵母の細胞壁成分であるβ−グルカンの配合 物には、ウィルスワクチン又は感染死細胞と共に与えるといくつかの伝染病に対 する抵抗性を増すものがあることが示された。Ｒｅｙｎｏｌｄｓ等、１９８０． Ｉｎｆｅｃｔ。

ｈ等、１９８２．Ｉｎｆｅｃｔ、ＩｍｍｕｎｉｔＬ　３６：９４７−９５１゜他 のβ−グルカン配合物の投与の悪影響のいくつかがＵ、Ｓ、特許４，７６１．４ ０２中でＷｉ　１１　ｉ　ａｍｓ等により記載されテイル。

これらの影響には、アナフィラキシ−１肉芽種の発生、低血圧の発生、及び高度 の急性毒性が含まれる。

発明の要約 本発明は、薬剤配達媒質であり、非特異的に免疫応答を増強する新規製薬配合物 に関する。配合物は、完全グルカン粒子、及び薬剤や抗原などの薬理学的活性物 質を含む。薬剤又は抗原は完全グルカン粒子内に、それと共に均一に分散して、 又は化学的に結合して含むことができる。

（１）薬剤の長期放出；　（２）タンパク質分解、加水分解及び他のクリアラン ス機構から保護することによる薬剤の半減期の延長：　（３）マクロファージを 標的とする薬剤の配達：及び（４）免疫応答の刺激を組み合わせて与える製薬配 合物における完全グルカン粒子の使用法も本発明の主題である。

本配合物を患者に投与すると、捕獲されていた薬剤がグルカンマトリックスを通 って生理学的環境中に放出される。薬剤が抗原の場合、β−グルカン成分は、患 者の免疫応答を増すことにより同時に抗原に対する補薬として作用する。

完全グルカン粒子はβ−グルカン分子の非常に純粋な調剤であり、純度の低い調 剤に伴う望ましくない副作用の多くを避けることができる。

完全グルカン粒子は、それを誘導した酵母の細胞壁のインビボの三次元的形態を 保持している。従って粒子は中空であり、薬剤又は抗原をくぼみに挿入すること ができる。完全グルカン粒子は、細胞壁を崩壊する他の方法で調製したβ−グル カンより含水容量が高い。含水容量は、例えば分校の量を変えるなど、β−グル カン構造を改良することにより制御することができる。

本発明はさらに、完全グルカン粒子内に含まれた（例えば内包される、又は捕獲 されている）、又は均一に分散された、あるいはそれと化学的に結合した薬剤を 患者に投与することにより、患者に薬剤又は抗原を与え、同時に薬剤又は抗原に 対する免疫応答を増強するための補薬を与える方法を提供する。例えばワクチン を完全グルカン粒子に挿入し、粒子を患者に投与し、患者を伝染病に対して保護 すると同時にワクチンに対する患者の免疫応答を増強することができる。

本発明は薬剤又は抗原を無傷の完全グルカン粒子に挿入し、薬剤配合物の投与及 び有効性を実質的に改良する方法も述べる。

本発明は免疫応答も増強し、インビボの薬剤供与性を増し、薬剤に特定の免疫細 胞を標的とさせるインビボの薬剤配達のための、安全な非毒性媒質を提供する。

図の簡単な説明 図１は、分子量の異なる数種のタンパク質の、完全グルカン粒子からの放出速度 を示すグラフである。

図２は、透過性の異なる完全グルカン粒子からの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の 放出速度を示すグラフである。

図３は、薬剤、ントクロムーＣの、完全グルカン粒子を用いた放出速度に対する 架橋量の変化の影響を示す棒グラフである。

図４は、ＢＳＡと混合し、マウスに投与した完全グルカン粒子の免疫学的効率（ 抗体力価）を示すグラフである。

図５は、ＢＳＡと混合し、ブースターとしてマウスに投与した完全グルカン粒子 の免疫学的効率（抗体力価）を示すグラフである。

図６は、ＢＳＡを粒子に化学的に架橋した完全グルカン粒子、及びＢＳＡを粒子 と物理的に混合した完全グルカン粒子の免疫学的効率（抗体力価）を比較したグ ラフである。

図７は、Ｐ５５を粒子に化学的に架橋した完全グルカン粒子、及びＰ５５を粒子 と物理的に混合した完全グルカン粒子の免疫学的効率（抗体力価）を比較したグ ラフである。

発明の詳細な説明 本発明は、制御された及び／又は連続した薬剤又は抗原の放出、及びβ−グルカ ンにより誘起される免疫系の強化を組み合わせた独特の製薬配合物に関する。従 って本配合物は、薬剤の補薬として作用する薬剤配達及び放出制御系を提供する 。本文で使用する“補薬“という言葉は、薬剤製品又は配合物に加えられ、薬剤 又は活性成分の作用を延長及び強化する物質を意味する。例えばワクチン配合物 において完全グルカン粒子は、その半減期を延長することによりワクチンの抗原 性を増し、それにマクロファージ又は抗原−提供細胞を標的とさせ、同時にこれ らの細胞を活性化する媒質となる。

β−グルカンは、宿主の免疫防御系を非特異的に活性化することにより伝染病に 対する抵抗性を強化する。活性化は、単球上の特異的β−グルカン受容体との相 互作用により、インターロイキン−１（ＩＬ−１）及び他のサイトカインならび に細胞内メゾイエイタ−の放出が誘起されて起こる。Ｃｚｏｐ、（１９８６）Ｐ ａｔｈｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ、５：２８６−２９６；Ｗｉ　］　ｌ　ｉ　ａｍｓ等、１９８８．Ｉｎｔｅｒ ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊ。

１−已±」■−セビ戊立η１１：■工且Ｌ」ユ、旦＝２６完全グルカン粒子、及 び薬剤又は他の薬理学的活性物質を含み、人間及び動物において安全で有効な本 発明の配合物は、薬剤配達媒質及び薬剤又はワクチンの投与における補薬を組み 合わせて与えるために使用することができる。配合物は、完全グルカン粒子及び 薬剤又は抗原がら成る二相系である。本配合物は製薬配合物の投与及び効率を実 質的に改良する。これらの改良には： （１）組成及び構造の明確な非毒性生分解性キャリヤーを与える：（２）薬剤又 は抗原成分を持続的に放出することができる配達媒質を与える。

（３）薬剤又は抗原成分にマクロファージを標的とさせる；及び（４）周知の作 用形態で、非特異的免疫刺激を与えることが含まれる。

これらの性質の組み合わせは相乗的効果を有し、従って本発明は薬剤又はワクチ ンにマクロファージを標的とさせ、マクロファージを活性化し、薬剤を分解（タ ンパク質分解又は加水分解）及び急速なりリアランスから保護することによりそ のインビボ半減期を延長し、その結果薬剤、抗原又は完全グルカン粒子の個別の 配合物と比較して効力及び有効性が向上した完全グルカン粒子配達系を提供する 。

ここで使用する“完全グルカン”、“完全グルカン粒子”、“完全β−グルカン ”又は“完全β−グルカン粒子″という言葉は、完全β−グルカン粒子のことを を言う。完全β−グルカン粒子は基本的に、堅固な半透過性グルカンマトリック スから成る、ミクロンの大きさの中空の球である。完全β〜グルカン粒子は水溶 液中で膨潤する能力がある。

３　完全グルカン粒子は酵母細胞壁からのアルカリ不溶性グルカン留分の抽出及 び精製により、酵母細胞から調製する。酵母細胞！を破壊せずにゴ　酵母細胞を 水酸化物水溶液で処理すると、細胞のタンパク質及び細胞内部分が消化され、あ まりタンパク質で汚染されず実質的に不変化の細胞壁構造を有するβ（１−６） 及びβ（１−３）結合グルカンの壁成分が残る。完全グルカン粒子及びその調製 法に関するより詳細な記述は、Ｕ。

Ｓ、　特許４，８１０．．６４６及び同時係属特許出願ＵＳＳＮ１６６．９２９ 、ＵＳＳＮ２９７，７５２及びＵＳＳＮ２９７，９８２１：あり、その記載をこ こに参照として挿入する。

完全グルカン粒子は、他のβ−グルカンで特徴づけられたと同様の機構により人 の単球マクロファージを活性化することが示された。Ｃｚ。

子の独特の性質は、酵母細胞壁のインビボの三次元形態を保持していることであ る。本方法で調製した完全グルカン粒子は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏ ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ、２４ニア７３−７７９においてＤｉｌｕｚｉ ｏ等により、及びＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪｏｕｒｎａ　１．１３５　：１９ −３０　（１９７３）でＭａｎｎｅｒｓ等により記載されているような他のβ− グルカン配合物に優るいくつかの利点を有する：これは純度が高く（例えばタン パク質は１％（Ｗ／Ｗ）以下でありキチン及びグリコーゲンは３％（Ｗ／Ｗ）以 下である）、無傷であり、中空の球形であり、そのため薬剤を粒子中に挿入して 化学的に修飾しく例えば架橋し）、内包した薬剤の放出速度、及びβ−グルカン マトリックスの分解速度を調節することができる。さらにグルカン全粒子はマク ロファージ細胞を活性化することができ、従って薬剤や抗原を患者に投与するた めのキャリヤー又は輸送媒質として使用することができ、同時に患者の免疫応答 を増強し、それにより薬剤の作用を強化することができる。完全グルカンキャリ ヤーが作用して薬剤又は抗原は直接マクロファージに配達され、そこでゆっくり 放出され、高い持続性免疫応答を引き起こす。このように本配合物により薬剤又 は抗原はマクロファージ細胞に方向づけられる、又はマクロファージ細胞を標的 とすることができる。

完全グルカン粒子は生分解性であり、すなわち生理学的環境内で長時間を経て生 物腐食を受ける。ここで使用する“生分解性”又は“生物腐食性”という言葉は 、生物学的環境に反応してひとつ又はそれ以上の物理的又は化学的分解過程、例 えば酵素の作用、加水分解、溶解Ｉこより、長時間を経て単位構造又は単位物に 無害で崩壊又は分解する多孔質材料の本体の性質又は特性として定義される。腐 食速度はβ−グルカンマトリックス中のβ（１−６）：β（１−３）結合の比率 を変えることにより、又は架橋により７ＡＷＪすることができる。

本配合物中で使用するのに適した薬剤は、生物学的活性物質である。

これらの物質には、生物活性ポリペプチド、抗原及びワクチンが含まれる。体の 治療に使用されるどのような薬剤も本配合物に挿入することができる。ここで“ 薬剤“という言葉は、広義で薬理学的反応を起こすことができるどのような配合 物又は物質も含むものとして使用する。本発明の配合物と共に使用するのに適し た薬剤にはニインスリンなどのタンパク質薬剤、抗原などの脱感作剤：ａｈ、黄 熱病、ジステンパー、コレラ、鶏痘、抗へび毒、狸紅熱、ジフテリアトキソイド 、破傷風トキソイド、百日咳、インフルエンザ、狂犬病、おたふくかぜ、麻疹、 及び灰白髄炎などのワクチン；ペニシリン、テトラサイクリン、ネオマイシン及 びエリスロマイシンなどの抗生物質；抗アレルギー剤；ステロイド；抗うっ二剤 ；抗コリンエステラーゼ：鎮静薬、トランキライザー；エストロゲン：液性薬剤 ；神経安定薬；鎮痙剤；抗マラリア薬；抗ヒスタミン剤；心臓活性剤：ビタミン 、アミノ酸及び脂肪などの栄養剤が含まれるがこれらに限られない。上記と同− 又は異なる生理活性を有する他の薬剤も本発明の範囲内で薬剤配達系中に使用す ることができる。単一の薬剤の代わりに、薬剤の適した混合物も配合物に挿入す ることができる。

薬剤は、非帯電分子、分子間複合体の成分又は製薬上許容できる塩、例えば塩酸 塩、臭素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、はう酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩及 びサリチルサン塩などの種々の形態であることができる。酸性の薬剤の場合、金 属塩、アミン又は有機カチオン（例えば第４アンモニウム）を使用することがで きる。望ましい保持及び放出特性を有するが体のｐＨ又１ま酵素により容易に加 水分解される、薬剤の簡単な誘導体（例えばエーテル、エステル、アミド）を使 用することができる。

薬剤配達系に挿入する薬剤の量は、特定の薬剤、望まれる治療効果及びグルカン マトリックスが膨潤、腐食又は溶解するのに要する時間に依存して広く変化する 。広範囲の治療及び予防処理のために完全な投薬管理を行う種々のβ−グルカン 粒子を得ることができ、従って系に挿入する薬剤の量に厳しい上限はない。下限 は薬剤の活性、及び系からのその放出の期間に依存するであろう。

本配合物は、選んだ薬剤の溶液の存在下で完全グルカン粒子を膨潤させることに より製造する。従って種々の薬剤を自然の拡散により粒子中に挿入することがで きる。−炭粒子中に吸着すると、これらの薬剤は溶媒の除去又は（例えばｐＨ１ イオン性環境又は溶媒の変化による）沈澱により捕獲することができる。例えば 粒子中のタンパク質は、薬剤と完全グルカン粒子の溶液に硫酸アンモニウム、エ タノール又はアセトンを加えることにより沈澱させることができる。従って捕獲 された粒子の外側への拡散及び放出の速度は、使用環境への溶解速度及び半透過 性グルカンマトリックスを通る拡散速度の関数である。

グルカン粒子の膨潤にいくつかの方法を使用することができる。一般に充填する べき薬剤の水溶液を調製し、適した量の完全β−グルカン粒子に加え、混合物の 粒子を十分な時間（一般に最高６時間）膨潤させる。

その後膨潤した粒子を溶液から除去し、乾燥し、又は他の化合物と接触させて捕 獲した薬剤を沈澱させる。

完全グルカン粒子のくぼみから生理学的環境に薬剤を放出する機構は、自然拡散 及び／又はグルカンのポリマーネットワークの分解による。薬剤の放出速度は、 グルカン中のβ（１−６）：β（１−３）結合の比率の変化により調節すること ができる。β（１−６）：β（１−３）結合の比率を修正し、操作して変え、そ れによってβ−グルカンマトリックスの性質を変える方法は、Ｕ、Ｓ、４．８１ ０，６４６；及び同時係属特許出願ＵＳＳＮＯ７／１６６．９２９．ＵＳＳＮＯ ７／２９７，７５２及びＵＳＳＮＯ７／２９７．９８２にＪａｍａｓ等により詳 細に記載されており、その記載をここに参照として挿入する。例えばβ（１−６ ）：β（１−３）結合の比率の化学的、酵素的又は遺伝的修正により、完全グル カン粒子の含水容量及び透過性を変えることができ、それによりそこに挿入され た薬剤の放出速度を調節することができる。牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の放出 速度への、β−グルカンマトリックスの透過性の減少の影響を図２に示す。さら に、薬剤分子の大きさく例えば分子量）が重要である。図１で示す通り、タンパ ク質のように大きな分子はインビボにおける放出速度は遅いであろう。このよう に、グルカンキャリヤーの性質を、問題の薬剤に特異的に合うように仕立てるこ とができる。

完全グルカン粒子からの分子の放出速度は、それをグルカンマトリックスに架橋 することにより修正することができる。この方法は、通常グルカンマトリックス を通る拡散の速い低分子量薬剤の場合に特に有用である。これは、例えばβ−グ ルカン粒子と薬剤の混合物に架橋剤を加えることにより行うことができる。架橋 の影響を図３に示す。

本配合物は、薬剤からの所望の結果又は効果に適合するいずれの方法によっても 投与することができる。そのような投与法には、経口、筋肉内、皮下、皮肉、静 脈内又は消化管を経た投与が含まれる。配合物は液体溶液、錠剤、ロゼンジ、座 薬、インサートなどに調製することができる。本配合物の利点のひとつは、β− グルカン媒質がインビボで無毒性の天然化合物に分解することである。

患者に投与する配合物の量は、使用する薬剤、治療の性質、治療する症状の型と 重度、患者の大きさと身体的状態、及びめる結果に依存して変化するであろう。

完全グルカン粒子は、水酸化アルミニウム及び他の方法で調製したグルカン（例 えばＤｉ　Ｌｕｚｉｏ等、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、２４ニア７３−７７９　 （１９７９）；Ｍａｎｎｅｒｓ等、１９７３．Ｂｉ。

疫刺激剤としていくつかの利点を有する。完全グルカン粒子はこれらのグルカン より純粋であり、インビボで酵母細胞の三次元的形態を保持しており、薬剤を挿 入することができる無傷の中空構造を与えることができる。他の方法で調製した グルカンは、使用する方法に酵母細胞壁を粉砕し、完全グルカン粒子の独特の機 能的特徴を破壊する処理が含まれているので無傷ではない。

以下の実施例により本発明をさらに説明する。

実施例１ 膨潤及び物理的捕獲による完全グルカン粒子へのタンパク質の挿入性以下の方法 を用いて分子量の異なる３種類のタンパク質を完全グルカン粒子に挿入した。シ トクロム−Ｃ（ｃｙｔ、Ｃ；Ｍｗ＝１４．０００ダルトン）、牛血清アルブミン （Ｂ　ＳＡ　：　Ｍｗ＝６７．　ＯＯＯダルトン）、及びアルコールデヒドロゲ ナーゼ（酵母）（ＡＤＨ；Ｍｗ＝１５０゜０００ダルトン）を約１２ｍｇ／ｍｌ の濃度で脱イオン水に溶解した。

各タンパク質溶液１ミリリットルを試験管中で１５０ｍｇの完全グルカン粒子（ パン用酵母Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｆｏｏｄｓ、ＷＩ及びす・ツカにより記載され ている方法に従って製造）に加え、室温にて２時間膨潤させた。その後管を４５ ℃の炉に移し、１２時間乾燥した。得られた乾燥完全グルカン粒子は、粒子１グ ラム当たり約８０ｍｇのタンパク質を完全グルカン粒子からのタンパク質の持続 性放出完全グルカン粒子からの、大きさの異なる分子の放出速度を示すために３ 種類のタンパク質を選んだ。シトクロム−Ｃ（Ｍｗ＝１４，０００ダルトン）　 、ＢＳＡ　（Ｍｗ＝６７．０００ダルトン）、及びＡＤＨ（Ｍｗ＝１５０．００ ０ダルトン）を、実施例１に記載の方法で完全グルカン粒子に充填した。乾燥し た充填粒子を１０ｍ１の脱イオン水に再懸濁し、３７℃にて撹拌した。試料を一 定の時間間隔で取り出し、放出タンパク質に関して分光光度分析を行った。図１ は単独の薬剤と比較した、完全グルカン粒子からのｃｙｔ−Ｃ，ＢＳＡ及びＡＤ Ｈの拡散の速度論を示す。３種類の薬剤の５０％の放出に要する時間を表１に示 す。

表１．完全グルカン粒子（パン用酵母から誘導）からの、タンパク質の５０％の 放出に要する時間（Ｔ０ｎ） タンパク質　分子量（ダルトン）Ｔ５゜（分）シトクロム−〇　１４．０００　 ３１ 牛血清アルブミン　６７．０００　８０アルコールデヒドロゲナーゼ　１５０． ０００　２００これらの結果は、完全グルカン粒子からのタンパク質の放出速度 がタンパク質の分子量と関連していることを示す。

実施例３ グルカン膜の透過性の修正による完全グルカン粒子からの放出速度の謂子を使用 する以外は、実施例２に記載の方法に従い、以下の実験を行った。これらの変更 完全グルカン粒子は、酵母の変異株、サツ力ロミセスセレビンアエ（Ｓａｃｃｈ ａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｒ４（Ｕ、Ｓ、特許４，８１０．６ ４６に記載のＮＲＲＬ　Ｙ　１５９０３）から誘導した。商業的パン用酵母、及 び変異株Ｒ４からＵＳ。

特許４．８１０．６４６に従って製造した完全グルカン粒子からの、ＢＳＡの放 出速度を決定し、比較した。図２に示す結果は、変異Ｒ４から誘導した粒子にお けるグルカンの低い透過性により、パン用酵母から誘導した粒子を用いた場合（ Ｔｓｏ＝８２分）と比較して捕獲されたＢＳＡの保持時間が長くなる（Ｔｓｏ＝ ２０４分）ことを示している。

墾へＡ 化学的架橋による、完全グルカン粒子からの小さい分子の放出速度の調壓 最初に２５℃、暗所にて１ｍｌの１０ｒｎＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７中で ５ｍｇのントクロムーＣと２．５ｍｇの複素二官能基性架橋剤スルホスクシンイ ミジル　６−　（４’　−アジド−２′　−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエ ート（スルホ−３ＡＮＰＡＨ）を反応させることにより、架橋シトクロム−Ｃを 含む完全グルカン粒子を製造した。１５０ｍｇの完全グルカン粒子と混合するこ とにより、１ｍｌのスルホ５ＡＮＰＡＨ−シトクロム−Ｃ複合体を完全グルカン 粒子のくぼみに膨潤させ、２５℃、暗所にて２時間インキュベートした。明光に 暴露することにより、スルホ−８ＡＮＰＡＨ−ントクロムーＣ複合体は完全グル カン粒子に架橋した。水中で完全グルカン粒子を洗うことにより、未反応のスル ホ−３ＡＮＰＡＨ，ントクロムー〇及びスルホ−５Ａ　Ｎ　Ｐ　ＡＨ−ントクロ ムーＣを除去した。架橋完全グルカン粒子：シトクロム−Ｃ複合体を乾燥し、４ ℃で保存した。

粒子からのタンパク賀の放出速度を実施例２に記載の方法に従って決定した。図 ３は、シトクロム−Ｃを含む完全グルカン粒子に加えた架橋剤の量の増加により ントクロムー〇の放出速度が減少し、２４時間の間、９０％以上を保持すること ができることを示す。

実施例５ ＢＳＡを用いたマウスの免疫における完全グルカン粒子の補薬効果マウスにおけ る完全グルカン粒子のインビボ補薬効果が、抗原ＢＳＡに応答する抗体の製造の 増加により示された。実施例１に記載の要領でＢＳＡを完全グルカン粒子に挿入 した。リン酸塩緩衝食塩水中でＢＳＡと混合した、ある範囲の投薬量の完全グル カン粒子を用いてＣＤ−１マウスを皮肉免疫した。ｌマウス当たり１０μｇのＢ ＳＡを含む完全グルカン粒子の投薬量は、０μｇ、２μｇ、１０μｇ、２５０μ ｇ及び１２５０μｇであった。ＢＳＡ（１０μｇ）のみも参照標準として使用し た。

免疫の２週間後にＥＬＩＳＡアッセイにより抗−ＢＳＡ抗体力価を決定した。図 ４は、免疫後２週間の抗体力価を示す。免疫後３週間のマウスを、同投薬量の２ 回目の注射によりブーストし、ブースト後２週間で抗体力価を測定した。図５は ブースト後２週間の抗体力価を示す。

結果は、完全グルカン粒子が一次及び二次免疫応答の両方において抗−ＢＳＡの 製造に刺激効果を有することを示している（図４及び５）。

動物１匹当たり２μｇの少ない完全グルカン粒子（体重１ｋｇ当たり約１００μ ｇ）の投薬量の場合も刺激が観察された。

マウスにおける完全グルカン粒子の補薬性及び配達性の組み合わせ実施例５の結 果に基づき、タンパク質抗原（Ｂ　Ｓ　Ａ）及び５５−アミノ酸ペプチド（Ｐ５ ５）を用いて完全グルカン粒子の補薬／配達性の組み合わせを研究した。ＢＳＡ 及びＰ５５を完全グルカン粒子の中空の（ぼみに充填し、実施例４に記載の要領 で架橋した。各投薬量（０，２ｍ１）に１００μｇの完全グルカン粒子及び１０ μｇのＢＳＡ又は５０μｇのＰ５５のどちらかが含まれるように架橋配合物を調 製した。完全グルカン粒子とＢＳＡ又はＰ５５を単に混合することにより、等し い比率の完全グルカン粒子と抗原を含む配合物もＷＩ製した。試験の第１日に各 配合物を５匹から成るマウスの別々の群に注射しく皮下投与）、第１４日に実施 例５と同様に同一の配合物で動物をブーストした。第２６日に動物を犠牲にし、 血清を集め、直接ＥＬＩ　ＳＡにより抗−Ｂ　Ｓ　Ａ又は抗−Ｐ５５抗体に関し て分析した。図６及び７に結果をまとめる。

図６及び７でわかる通り、完全グルカン粒子を補薬と配達媒質の組み合わせとし て使用することにより、抗原とグルカンの単純な混合物より非常に高い抗体力価 を得ることができる。

同！男 同業者は単に日常的実験を用いて、本文に特に記載されている本発明の特別な具 体化の多くの同等例を認める、又は確かめることができるであろう。そのような 同等例も以下の特許請求の範囲内に含むものとする。

時間（分） ｍｇ／ｍｌ　サンバ（Ｓａｎｐａｈ） 血清希釈 補装置の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成３年１２月１３ 日 特許９ヤ　、ア　ヨ　い　いハ ３、特許出願人 名　称　アルファ・ベータ拳テクノロジー４、代理人　〒１０７ 電話　３５８５−２２５６ ５、補装置の提出年月日 １９９１年７月１日 ６、添付書類の目録 （１）補装置の写しく翻訳文）　１通 本発明は免疫応答も増強し、インビボの薬剤供与性を増し、薬剤に特定の免疫細 胞を標的とさせるインビボの薬剤配達のための、安全な非毒性媒質を提供する。

図の簡単な説明 図１は、分子量の異なる数種のタンパク質の、完全グルカン粒子からの放出速度 を示すグラフである。

図２は、透過性の異なる完全グルカン粒子からの牛血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ ）の放出速度を示すグラフである。

図３は、薬剤、シトクロム−Ｃの、完全グルカン粒子を用いた放出速度に対する 架橋量の変化の影響を示す棒グラフである。

図４は、ＢＳＡと混合し、マウスに投与した完全グルカン粒子の免疫学的効率（ 抗体力価）を示すグラフである。

図５は、ＢＳＡと混合し、ブースターとしてマウスに投与した完全グルカン粒子 の免疫学的効率（抗体力価）を示すグラフである。

図６は、ＢＳＡを粒子に化学的に架橋した完全グルカン粒子、及びＢＳＡを粒子 と物理的に混合した完全グルカン粒子の免疫学的効率（抗体力価）を比較したグ ラフである。

図７は、Ｐ５５を粒子に化学的に架橋した完全グルカン粒子、及びＰ５５を粒子 と物理的に混合した完全グルカン粒子の免疫学的効率（抗体力価）を比較したグ ラフである。

本配合物は製薬配合物の投与及び効率を実質的に改良する。これらの改良には： （１）組成及び構造の明確な非毒性生分解性キャリヤーを与える：（２）薬剤又 は抗原成分を持続的に放出することができる配達媒質を与える； （３）薬剤又は抗原成分にマクロファージを標的とさせる：及び（４）周知の作 用形態で、非特異的免疫刺激を与えることが含まれる。

これらの性質の組み合わせは相乗的効果を有し、従って本発明は薬剤又はワクチ ンにマクロファージを標的とさせ、マクロファージを活性化し、薬剤を分解（タ ンパク質分解又は加水分解）及び急速なりリアランスから保護することによりそ のインビボ半減期を延長し、その結果薬剤、抗原又は完全グルカン粒子の個別の 配合物と比較して効力及び有効性が向上した完全グルカン粒子配達系を提供する 。

ここで使用する“完全グルカン”、“完全グルカン粒子”、“完全β−グルカン ”又は“完全β−グルカン粒子“という言葉は、完全β−グルカン粒子のことを を言う。完全β−グルカン粒子は基本的に、堅固な半透過性グルカンマトリック スから成る、ミクロンの大きさの中空の球である。完全β−グルカン粒子は水溶 液中で膨潤する能力がある。

完全グルカン粒子は酵母細胞壁からのアルカリ不溶性グルカン留分の抽出及び精 製により、酵母細胞から調製する。

ｉｇ、黄熱病、ジステンパー、コレラ、ＢＭ、抗へび毒、狸紅熱、ジフテリアト キソイド、破傷風トキソイド、百日咳、インフルエンザ、狂犬病、おたふくかぜ 、麻疹、及び灰白髄炎などのワクチン：ペニシリン、テトラサイクリン、ネオマ イシン及びエリスロマイシンなどの抗生物質：抗アレルギー剤ニステロイド：抗 うっ血剤：抗コリンエステラーゼ；鎖静薬、トランキライザー；エストロゲン： 液性薬剤：神経安定薬；鎮痙剤、抗マラリア薬：抗ヒスタミン剤：心臓活性剤： ビタミン、アミノ酸及び脂肪などの栄養剤が含まれるがこれらに限られない。上 記と同−又は異なる生理活性を有する他の薬剤も本発明の範囲内で薬剤配達系中 に使用することができる。単一の薬剤の代わりに、薬剤の適した混合物も配合物 に挿入することができる。

薬剤は、非帯電分子、分子間複合体の成分又は製薬上許容できる塩、例えば塩酸 塩、臭素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、はう酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩及 びサリチルサン塩などの種々の形態であることができる。酸性の薬剤の場合、金 属塩、アミン又は有機カチオン（例えば第４アンモニウム）を使用することがで きる。望ましい保持及び放出特性を有するが体のｐＨ又は酵素により容易に加水 分解される、薬剤の簡単な誘導体（例えばエーテル、エステル、アミド）を使用 することができる。

薬剤配達系に挿入する薬剤の量は、特定の薬剤、望まれる治療効果及びグルカン マトリックスが膨潤、腐食又は溶解するのに要する時間に依存して広く変化する 。

特許請求の範囲 １、哺乳類に投与するための生物腐食性製薬配合物において：ａ、半透過性グル カンマトリックスを含む中空の球である完全β−グルカン粒子：及び す、薬剤： から成り、該薬剤が該完全β−グルカン粒子中に含まれるか又は化学的にそこに 結合し、その配合物は生理学的環境中に置くと時間をかけて生理学的環境中に薬 剤を放出し、該完全β−グルカン粒子は生理学的環境中で生物腐食を起こし、完 全β−グルカン粒子が哺乳類において免疫応答を刺激し、それによって補薬効果 を与えることを特徴とする配合物。

２、第１項に記載の製薬配合物において、薬剤が抗原又は抗原決定基であること を特徴とする配合物。

３、第２項に記載の製薬配合物において、薬剤がワクチンを含むことを特徴とす る配合物。

４、治療用配合物において ａ、半分透過性グルカンマトリックスから成る中空の球である、β（１−６）及 びβ（１−３）結合β−グルカンを含む生物腐食性完全粒子；及び す、完全β−グルカン粒子内に含まれる、又はそこに化学結合をしている抗原又 は抗原決定基；を含み、その配合物を生理学的環境下に置（と抗原又は抗原決定 基を時間をかけて生理学的環境に放出し、該完全β−グルカン粒子が生理学的環 境下で生物腐食を起こし、完全β−グルカン粒子が哺乳類の免疫応答を刺激し、 それによって補薬効果をあたたえることを特徴とする配合物。

５、ワクチンとして使用するための配合物において、完全β−グルカン粒子から 連続的にワクチンを放出するために完全β〜グルカン粒子がその中にワクチンを 含んでおり、該粒子が哺乳類における免疫応答を刺激してワクチンの作用を強化 することができることを特徴とする配合物。

６、哺乳類における免疫応答を刺激するために使用する二相薬剤配合物において ： ａ　半透過性グルカンマトリックスから成る中空の球である生物腐食性完全β粒 子を含む第１相；及び す、薬剤を含む第２相：から成り、薬剤が該完全β−グルカン粒子中に含まれる か又は化学的にそこに結合し、その配合物は生理学的環境中に置くと時間をかけ て生理学的環境中に薬剤を放出することができ、該完全β−グルカン粒子は生理 学的環境に反応して生物腐食を起こし、完全β−グルカン粒子が哺乳類において 免疫応答を刺激し、それによって補薬効果を与えることを特徴とする配合物。

７、哺乳類に投与するための生物腐食性製薬配合物において；ａ、半分透過性グ ルカンマトリックスから成る中空の球である、β（１−６）及びβ（１−３）結 合β−グルカンを含む完全グルカン粒子；及び す、完全β−グルカン粒子内に含まれる、又はそこに化学結合をしている抗原又 は抗原決定基；を含み、 完全グルカン粒子がマクロファージに特異的でありニゲルカン粒子がマクロファ ージ内で生物腐食性であり、それによってマクロファージを活性化し：配合物は マクロファージ内又はその近辺で抗原あるいは抗原決定基を放出し、それによっ て抗原又は抗原決定基に対する免疫応答を強化する結果となることを特徴とする 配合物。

血清希釈 ＦＩＧＵＲＥ　６ 国際調査報告　ｐｃＴ／υＳ　９０１０３４４０−箱−，１１，１Ａｒｍ＋□、 １いお、　ＰＣ〒／ＵＳ　９０１０１４４０国際調査報告

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳類に投与するための生物腐食性製薬配合物において：ａ．完全グルカン 粒子；及び ｂ．薬剤； から成り、該薬剤が該完全グルカン粒子中に含まれ、その配合物は生理学的環境 中に置くと時間をかけて生理学的環境中に薬剤を放出し、該完全グルカン粒子は 生理学的環境中で生物腐食を起こし、該配合物が哺乳類において免疫応答を刺激 する補薬を含むことを特徴とする配合物。
2. ２．第１項に記載の製薬配合物において、薬剤が抗原又は抗原決定基であること を特徴とする配合物。
3. ３．第２項に記載の製薬配合物において、薬剤がワクチンを含むことを持律とす る配合物。
4. ４．二相治療用配合物において： ａ．生物腐食性完全グルカン粒子から成る第１相；及びｂ．薬剤から成る第２相 ；を含み、該薬剤が完全グルカン粒子内に含まれ、薬剤がグルカンから時間をか けて放出され、グルカン粒子が生理学的環境下で生物腐食を起こし、配合物が補 薬であることを特徴とする配合物。
5. ５．第４項に記載の治療用配合物において、薬剤が抗原又は抗原決定基であるこ とを特徴とする配合物。
6. ６．第５項に記載の治療用配合物において、薬剤がワクチンであることを特徴と する配合物。
7. ７．哺乳類への予防接種の方法において：完全グルカン粒子中に含まれるワクチ ンから成る配合物を哺乳類に投与し、それによりワクチンを完全グルカン粒子か ら連続的に放出することから成り、完全グルカン粒子が哺乳類の免疫応答を刺激 し、それによってワクチンの作用を強化することを特徴とする方法。
8. ８．哺乳類への薬剤の投与法において、ａ．生物腐食性完全グルカン粒子から成 る第１相；及びｂ．薬剤から成る第２相；を含む２相配合物を哺乳類に投与する ことから成り、薬剤が該完全グルカン粒子内に含まれ、又は分散されており、そ の配合物は生理学的環境下に置くと時間をかけて生理学的環境中に薬剤を放出し 、完全グルカン粒子は生理学的環境に反応して生物腐食を起こし、配合物が哺乳 類の免疫応答を刺激する補薬を含むことを特徴とする方法。