JPH05503362A - 液中ゲル電気泳動のための装置および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 液中ゲル電気泳動のための装置および方法ブランコ・コズリック（Ｂｒａｎｋｏ 　Ｋｏｚｕｌｉｃ）およびウルスーハイムガルツナー（Ｕｒｓ　Ｈｅｉｍｇａｒ ｔｎｅｒ） 発明の背景 電気泳動は荷電種を分離する方法である。電気泳動は電界においてはさまざまな 種がことなる移動度で泳動するという事実に基づいている。金属イオン等の小さ な種およびウィルス等の大きな種が、これまで電気泳動技術により分離されてき た。しかしながら、この技術は現在のところ多くの場合、蛋白質、核酸およびそ れらの誘導体を含む生物学的高分子の分離のために利用されている。この方法は 、通常強制的に分子を水性ゲルを通って泳動させることにより実行される。移動 度は、ゲルの構造、電界、および実効表面電荷と大きさと、形状とを含むイオン 自体の特性に依電気泳動に使用されるゲルは大きく分けて２つのカテゴリーにわ かれる。それらは、天然高分子かまたは合成ポリマーのいずれかから構成され得 る。アガロースは最も広範囲に使用される天然素材であり、かつポリアクリルア ミドのゲルは最も一般的な合成マトリックスを代表するものである。ゲルは本質 的に２つの形式の電気泳動装置において使用される、すなわち垂直のものと水平 のものである。垂直フォーマットにゲルをランする（＋ｕｎ　）ことにはいくつ かの利点がある。ゲルは２つのプレートの間に投入されるので均一であり、かつ 大変薄くなることが可能で、かつしたがって流されている間に発生する熱が簡単 に発散し、結果として高度に再生可能な帯のパターンが生じることになる。一方 、垂直のゲルを準備することは大変困難であり、かつそれらゲルはカセットから ゲルを取り出す際に裂けてしまいがちである。垂直の装置とは対照的に、水平電 気泳動装置におけるゲルの取扱いは簡単である。流されている間、ゲルは台の上 で平らなままである。電極とゲルとの間の接触は直接または心（ｗｉｃｋ）等に よって成立し得る。

代替的には、液中ゲル電気泳動においては、電極とゲルとの間で導電媒体として の役割を果たす緩衝液内にゲルを液浸する。このフォーマットが最も単純であり 、かつ核酸の分析に関して広く利用されている。アガロースのゲルはほとんど排 他的に核酸の液中ゲル電気泳動に使用されている。

液中ゲル電気泳動のための装置は通常ベースと１対の対向するタンクとを含む。

各タンクは緩衝液含有ゾーンと電極とを有する。ゲルは両タンクの間の前記ベー ス上に置かれかつ緩衝液含有ゾーンと連通ずる。緩衝液の層は通常ゲル上２−４ ｍｒｎの高さでありかつタンクにおいてはＩＯＣｍまでの高さである。電極は典 型的にはゲルに平行なタンクの底付近に配置される。

トゥーレ他（Ｔｕｒｒｅ　ｅｔ　ａｌ）（米国特許第４゜４１５．４１８号）に より記載されるもの等、上記装置を修正したものも知られている。類似するがバ イディメンショナルな（ｂｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　）電気泳動に適する装置 も開示されている（サーワー（Ｓｅｒｗ６ｒ）米国特許第４，６９３．８０４号 ）。これらの装置においては、電界密度は緩衝液のタンクにおけるよりもゲルの コンパートメントでのほうがより高い。

広く知られているとおり、上記液中ゲル電気泳動装置を使用したアガロースゲル における核酸の分解能は十分なものである。電気泳動の流れがより長い時間にわ たって行なわれることが必要な場合には、緩衝液を再循環させかつ冷却すること が有利である。本質的に上に述べたような構造のいくつかの液中ゲル電気泳動装 置は各タンク内にポートを有する。管状物がそのポートに結合されかつポンプが 緩衝液を循環させるために使用される。管状物内の緩衝液は電気的に荷電される のでこの態様での緩衝液の循環は潜在的に安全面での危険を意味する。加えて、 ゲル表面にわたって緩衝液の流れを均一にすることはこれらの装置においては対 処されていない。

緩衝液が違うやり方で循環する装置がバーファーモデルＨＥ１００Ｂ　（サンフ ランシスコ市、バーファー・サイエンティフィック・インストロタンク（Ｈｏｅ ｆｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））である。

電気的に荷電されてはいるが、緩衝液は中心に磁気撹拌バーを有するスパイラル （＋ｐｉ＋ａｌ）により撹拌する。渦巻は２つの緩衝液タンクの間に位置する。

電気泳動装置がその上にある磁気撹拌器により撹拌バーを回転させることで一方 のタンクから他方のタンクへ緩衝液が導かれる。しかしながら、この装置におけ る電界密度も緩衝液のタンクにおけるよりもゲルのコンパートメントにおけるほ うが高い。

アガロースゲルにおける大型ＤＮＡ分子の分離はパルスによる電界電気泳動（（ カンタ−およびシュワルツ（Ｃａｎｔｏｒ　ａｎｄ　Ｓｃｈｗａｒｔｚ）、米国 特許第４゜４７３．４５２号）により、多大に改善され得る。またパルスによる 電界電気泳動のための他の装置についても記載がある（たとえば、チュ他（Ｃｈ ｕ　ｅｔ　ａｌ（１９８６））サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３２．１５８ ２）。

これらの装置のうちいくつかの場合、側壁および端部壁が上記の装置の場合のよ うに電界を規定しない。電界はその代わり特定の電極構成により閉じられる。

既に述べたとおり、ポリアクリルアミドとアガロースのゲルが生物分子の電気泳 動分析に関して多く使用されるマトリックスである。蛋白質および核酸の分析に 関しては新しい合成マトリックスがコズリック他（米国特許出願第３２８．１２ ３号、分析生化学（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ　ｓ　ｔ　ｒｙ） １６３　（１９８７）５０６−５１２、および分析生化学１７０　（１９８８） ４７８−４８４）により導入されている。これはアクリルモノマー系のもので、 Ｎ−アクリロイル−トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＮＡＴ）　（Ｎ −ａｃＢｌＯＹｌ−Ｈｉｓ　（ｂ７ｄｒｏｘ７ｍｅ＋ｈｙｌ　）　ａｍｉｎｏｍ ｅ＋ｈａｎｅ）である。ポリ（ＳＡＴ）のゲルはポリアクリルアミドのゲルより 多孔性ではあるがアガロースゲルに比べて多孔性が低いことが分かった。したが って、これらゲルは大型蛋白質および大きさがアガロースおよびポリアクリルア ミドゲルの最適分離範囲を逸脱する核酸の分離に有利である。引用の文献におい ては、垂直フォーマットにおいてゲルを流した後に、ＤＮＡの分析に関してポリ （Ｎ　Ａ　Ｔ）ゲルが優れた特性を有していることが提示されている。しかしな がら、驚いたことに、標準的液中電気泳動装置においては、ポリ（Ｎ　Ａ　Ｔ） ゲルにおけるＤＮＡの分解能は垂直システムにおけるものほどよくないことが分 かった。大きな違いはゲルの下半分に見られ、すなわち帯かより拡散していたの である。そのうえ、真中のレーンにおけるＤＮＡフラグメントは外側のレーンに おける対応イリング効果にｉｉｌｉｎｇ　ａｆｆｅｃ＋）として知られている。

ざらに、かなり頻繁にＤＮＡの帯は真中のみにおいては真直ぐではあるが、端縁 が上向きに曲がっていた。

上に述べたような現象は同じ条件下でアガロースのゲルを流す場合にはこれほど 顕著ではなかった。ＤＮＡ分析に使用されるアガロースゲルは、通常０．５から ２％のポリマー乾燥重量を含む。これに対して、我々が使用したポリ（ＮＡＴ） ゲルは６から１２％のポリマー乾燥重量を含んでいた。したがって、予想される ことは、ポリ（ＮＡＴ）ゲルがゲルを通る緩衝液のイオンの泳動に対しより高い 抵抗を示すということである。したがって、ジュール熱として知られる電気泳動 の際に生じる熱がアガロースゲルにおける場合よりもポリ（ＮＡＴ）ゲルにいて 高いと考えられる。ジュール熱を制御することが最適電気泳動分離を達成するた めに重要である点を提示する多くの例が先行技術にも見うけられる。また電界は できる得る限り均一なものである必要がある。

標準的な液中ゲル電気泳動装置においては、図１ａに模式的に示すように、ジュ ール熱に関して制御はされずかつ電界も均一でない。電界密度は、緩衝液のタン ク１０１におけるよりもゲル領域１０２においてより高い。加えて、電界線１０ ５はゲル領域においては湾曲する。この湾曲は電極１０６．１０６′とゲル領域 との距離、電極の位置およびゲル１０３に対する緩衝液１０４のレベルにおおむ ね依存する。この湾曲は、図１ｂに示されるように、ゲルに対して同一平面上に 電極１０７．１０７′を置くことにより低減されることが可能であり、かつ電界 の均一性もこれにより改善される。しかしながら、電界線は依然として湾曲し、 緩衝液のレベルがゲルよりも高い場合にはとくにそうである。ゲルに対して電極 の対を他の位置に置くことも可能であるが、電界の均一性は実質的に改善され得 ない。

本件発明の構成要件として、一方が他方の上に配置された電極１０８，１０８“ の２つの対が図ＩＣに示されるとおり、両電極間の領域に実質的により均一な電 界を発生させるということが分かった。電界の均一性は非常に重要であり、かつ それは付加的な要件が達成された装置を使用してのみ電気泳動分解能に期待され る改善をもたらすことになる。これらの付加的要件のうち大変重要なものはジュ ール熱の制御と、ゲル領域における緩衝液イオンの枯渇、すなわちカソード付近 へのカチオンの蓄積およびアノード付近へのアニオンの蓄積をさけることである 。これらの要件は本件発明の装置において達成され、これについては以下の説明 から明らかになるであろう。

本件発明の目的 水性ゲル、特にポリ（ＮＡＴ）ゲルにおいて荷電種の液中ゲル電気泳動を行なう ための改善された装置を提供することが本件発明の基本的目的である。

ポリ（ＮＡＴ）ゲルにおけるＤＮＡの液中ゲル電気泳動のための改善された方法 を提供することが本件発明のもう１つの目的である。

発明の概要 本件発明の原則を実施することで、標準的なやり方における場合よりも良好にＤ ＮＡフラグメントを分解することが可能である。改善された分解能は、ＤＮＡ制 限フラグメント長の多形性を検出する上でかつＤＮＡ増幅生産物の分析において 特に有益である。

第１の好ましい実施例においては、本件発明の装置はゲルコンパートメントとし ての上部緩衝液コンパートメントと、貯蔵槽コンパートメントとしての下部緩衝 液コンパートメントと、ゲルコンパートメントの底部として２つのコンパートメ ントの間にある水平プレートとを含む。本件発明の特徴によれば、緩衝液のバル クは下部コンパートメントにあるが、電極は上部コンパートメントにある。これ により、過度に高い電流を生じることなくゲルコンパートメントにより、均一な 電界が形成され得る。先はど述べた水平プレートは外部の加熱器／冷却器に接続 された熱交換器、　にもなり得る。緩衝液は水平プレートにある開口を通って２ つのコンパートメントの間で循環する。２つの分離された開口は上部コンパート メントにおける側壁と長い垂直バリアとの間の水平プレートの各側部上に位置決 めされる。

バリアは緩衝液の流れを方向づけかつ電界を上部コンパ−特徴としては、ポンプ の入口と出口の間の緩衝液は実質的に荷電されないという点である。ゲルコンパ ートメントにおける緩衝液の流れは長いバリアｉこ垂直で、水平プレートの各端 部に接近した１対のダムにより導かれる。本件発明のもう１つの特徴によれば、 図ＩＣに示すような２対の電極が使用され、標準的な装置における場合よりも実 質的により均一な電界を生じさせる。電極は長いバリアに対して平行に位置決め され、かつ緩衝液の流れは電界線に対して実質的に直角を成す。

本件発明の第２の好ましい実施例においては、電極は長いバリアに対して直角に 位置決めされる。電極は上部コンパートメントにおける緩衝液の流れを調整する ダムの内側に接近している。緩衝液の流れは電界線に対し本質的に平行である。

本件発明の第３の好ましい実施例においては、端部壁に近い各端部側の中央に１ つずつ、合計２つの開口が水平プレートにある。各開口の前には垂直バリアがあ る。垂直バリアは各壁よりも短い。上部コンパートメントにおける緩衝液の流れ は垂直バリアに対して平行に位置決めされた２つのダムにより調整される。電極 は側壁に対し平行でありかつ緩ｉ液の流れは電界線に対して本質的に直角をなす 。

本件発明の第４の好ましい実施例においては、上部コンパートメントは２つの別 個のチャンバに区切られている。

水平プレートは、各チャンバに対して２つずつ、合計４対の開口を有する。２つ のチャンバにおける電極は独立しておりかつ２つの電界は分離されている。緩衝 液は１つの緩衝液貯蔵槽から２つのゲルコンパートメントへと循環する。

図面の説明 本件発明の上記および他の目的、特徴および利点が、添付の図面を参照しての以 下の説明により、より容易に明らかになるであろう。図面において、 図１は標準的液中電気泳動装置における電界のアウトラインである。

図１ｂはゲルに対して同一平面上に位置決めされた２つの電極により生じる電界 のアウトラインである。

図ＩＣは２対の電極により生じる電界のアウトラインである。

図２は本件発明に従う電気泳動装置のベースの斜視図である。

図３は長い電極を有する電極アセンブリとフレームとの斜視図である。

図４は図３の電極アセンブリが適所に設けられる、図２に示された電気泳動装置 の平面図である。

図５はＡ−Ａ−の線に沿って破断した図４の電気泳動装置の断面図である。

図６はＢ−Ｂ−の線に沿って破断した図４の電気泳動装置の断面図である。

図７は水平プレートの断面図である。

図８は短い電極を有する電極アセンブリの斜視図である。

図９は水平プレートの端部上に緩衝液再循環開口を有する電気泳動装置の平面図 である。

図１０は上部コンパートメントに２つの別個の電気泳動チャンバを有する電気泳 動装置の平面図である。

図１１は隣合せに設けられたゲルコンパートメントと貯蔵層コンパートメントを 有する電気泳動装置の模式的平面図である。

図１２は本件発明に従う装置における液中ゲル電気泳動の後の６％ポリ（Ｎ　Ａ 　Ｔ）ゲルにおけるＤＮＡの帯のパターンである。

図１３は図２ないし７の実施例のための修正されたダムの図である。

好ましい実施例の詳細な説明 以下の記載は例としてさまざまな限定された寸法決めを含む。これらは製作され かつ試験が行なわれたある種の実験室モデルに関連している。これら寸法決めは 明らかに例示目的のみのものでありかついかなる意味においても限定的な態様で 解釈されない。

本件発明のすべての装置は、非導電性材料によって製作される。図２．３．４． ５、および６を参照して、好ましい実施例の装置は、側部プレート１．１′と、 端部プレート２．２′と、貯蔵層コンパートメントの底部プレート３と、ゲルコ ンパートメントの底部としての水平プレート４と、電極アセンブリ（図３）とか ら基本的に構成される。

水平プレート４は上部および下部緩衝液コンパートメントを規定する。上部コン パートメントにおいては、水平プレートの各側に小さな垂直バリア７および７′ により分離される２つの開口５．６および５′、６′がある。これら開口は上部 および下部コンパートメントの緩衝液を接続する。

長い垂直バリア８および８′は小さいバリア７および７゛に接近して、水平プレ ートの各鋼上の開口の前に装着される。長いバリアは水平プレートの側部よりも いくぶん短い。

下部緩衝液コンパートメントにおいては、下部コンパートメントを２つの部屋に 分けるダム９が設けられる。ダムは隅と中央とに開口を含みかつ水平プレートの 各鋼上の２つの開口の間に位置決めされる。ポンプ１０は下部コンパートメント の底に装着される。ポンプの入口１１はダム９の一方側にありかつ出口は他方側 にある。ポンプは開口５および５−から緩衝液を引出しかつこれを開口６および ６′を介して押出す。矢印に示されるように、上部コンパートメントにおいては 、両側の長いバリアと側壁との間を緩衝液が流れる。２つの流れは端部壁２に至 ったときまがりかっ組合わされる。この流れがダム１３および１４により方向付 される。好ましい実施例においては、ダム１３は長い半楕円状の開口を有しかつ ダム１４は長いスロットを有する。その機械的安定性を増すために、ダム１４に おけるスロットは中央にバーを有してもよい。スロットは水平プレートよりいく 分上にある。ダム１４におけるスロットは平行な上部および下部側部を有する代 わりに、緩衝液の流れのプロファイルをよりよく制御するために、Ｃ１３に示さ れるように中心に向かってテーパされるよう修正が加えられてもよい。ダム１３ における半楕円状の開口は修正されたダム１４におけるスロットよりも中心点に おいて１−５ｍｍ高い。緩衝液のレベルは半楕円状の開口上１−５ｍｍに保たれ る。ダム１３および１４を通過した後、緩衝液は水平プレートの中央部分を流れ かつ類似するダム１３−および１４′を通って進む。端部壁２−に至ったとき、 流れは別れて長いバリアと側壁との間を開口５．５′を介して下部コンパートメ ント内へ戻って行く。緩衝液はまたダム９における開口を介して下部コンパート メントにおける２つの部屋の間でも循環する。このダムにおける開口の大きさと 水平プレートにおける開口５．５゛および６．６′の大きさが上部コンパートメ ントにおける流量をおおむね決定する。ダム９における開口が小さい場合には、 上部コンパートメントにおける流量は増大し、かつ開口が大きい場合には減少す る。

電界はたとえばプラチニウム配線等の導電性材料から製作される電極１５および １５′により生じる。水平方向には１ｃｍかつ垂直方向には７ｍｍ離された、２ 対の電極がプラグキューブ上に装着されたプラグ１６および１６′に接続される 。ワイヤはダム１３および１３′を通りそれらの端部が端部壁２および２′から １ｃｍを越えて離れていないことが好ましい。電極がダム１４と１４′との間の 距離のみを結ぶ場合には、電界が乱れることが観察されている。これは、ダム１ ４または１４′に最も近いレーンにあるＤＮＡの帯の歪みによっても明らかであ る。電極はバリア８および８−の表面に交互に装着され得るが、その場合には泡 形状のガス電気分解生成物がより大きくなりかつ電極上に長く留まる傾向にある 。これら泡は電界を乱すので、バリア８と８′から少なくとも１ｍｍ離してダム の間に電極を延ばすほうがよい。下部電極も水平プレート上部なくとも１ｍｍ上 のところにあれば、形成される泡は小さくかつそれらはワイヤから簡単に離れる 。電界の乱れはしたがって最小限にされる。ダム上に電極を装着することには付 加的な利点がある。ダムを２つの長いバー１７と１７′とで結ぶことにより、取 外し可能な電極アセンブリが形成される。アセンブリはバリア８．８゛と端部壁 ２．２°との間にぴったり適合する。電極アセンブリの上向き方向への動きは４ つのブロッキングピース１９により防止される（図においては２つしか示してい ない）。これらを端部壁にある穴に挿入した後、ブロッキングピース１９からの ロッドがプラグキューブとキューブ１８．１８−のちょうど上に来る。

バリア８および８′には２つの目的がある。これらはまず緩衝液の流れが上部コ ンパートメントに入ってくる際に、この流れの方向付を行なう。第２に、バリア が電界を実質的に上部コンパートメント内に境界決めする。緩衝液は図５に示さ れるように、下部コンパートメントをポンプにより出入りするので、ポンプにお ける緩衝液は電界によっては引き込まれない。本件発明の装置はしたがって強く 荷電された電気泳動緩衝液に対しポンプ動作を行なうことが回避されるという重 要な利点を有している。

ゲルを流すために、それは水平プレートの中心部分において電極の間に置かれる 。緩衝液の流れがあるので、ゲルがその流れとともに浮遊することを防止するた めに固定されなければならない。ゲルを固定するために便利な方法は、電気的に 非導電性材料から製作されるフレーム２０によるものである。フレームはハンド ル２０′とダム１４のスロットに類似した大きさの２つの長いスロットを有する 。ゲル自体よりもいくらか大きい支持膜上にゲルを流すことが有利である。フレ ーム２０はゲル支持の２つの端縁上に置かれる。フレーム２０のもう１つの役割 は上部コンパートメントにおける緩衝液の流れの平坦さを改善することである。

フレーム２０はその幅がゲルの大きさに依存して変化し得ることが明らかである 。また、１または２つ以上のフレーム２０がゲルコンパートメント内に配置され 得ることも明らかである。

先はども述べたとおり、電気泳動の際に熱が発生する。

この実施例における水平プレート４は熱を制御する役割を果たす。装置の組立て の際にプレート４を水平に整列させることを用意にするため、ストリップ２１． ２１′が側部プレート１．１−上に固定され、かつストリップ２２．２２′が端 部プレート２．２′に対し固定される。水平プレートの断面が図７に示される。

冷却剤は小さな矢印で示すように、プレート内部の曲がりくねった流路を介して 循環しかつその出入りについては大きい矢印で示すとおりである。プレート４の 入口および出口の穴は側壁１′における同じ大きさの穴および管接続部分２３． ２３′のより大きな穴と整合している。熱は水平プレートの上部を介しかつ底部 を介して交換される。上部上では、通常表面の大部分がゲルで覆われており、こ れにより緩衝液と水平プレートとの間の熱交換はもっばら下部コンパートメント におけるプレートの底部を介して生じる。熱の均衡は下部コンパートメントの一 方の部屋から他方の部屋へ緩衝液をダム９を介してポンプ動作することから生じ る緩衝液の混合により容易になる。これに対し、ゲルからの熱はゲル下の水平プ レート内へ部分的に発散しかつゲルの上を流れる緩衝液内に部分的に発散する。

所望の緩衝液の温度が１５℃から３０℃の範囲にある場合には、水平プレートの 上部および底部は１−２ｍｍの厚さの一般的なプラスチック材料から製作されて よい。しかしながら、所望の緩衝液の温度が１５℃を下回るかまたは３０℃を越 える場合には、熱伝導体としてより優れた他の電気的に非導電性材料を使用する ことが望ましい。

ゲルを流し始める前に装置の上にカバー２４が適所に置かれる必要がある、とい うのもこれが実験者による突発的な電気接触を防ぐ遮蔽物を形成するからである 。カバーはプラグ１６および１６′へのジャックの接続を可能にするのに十分な 大きさの２つの穴を有している。

好ましい実施例において、２本のワイヤが電極に使われるのには、主に２つの理 由がある。第１には、２本のワイヤにより生じる電界のほうが１本のワイヤによ り生じる電界よりもより均一だからである。第２には、２対の電極により結果と して生じる電流が高すぎないからである。１本ではなく２本のワイヤを使用した 場合、アンペア数はおよそ２のファクタで増大することが観察された。したがっ て、７０Ｖで、緩衝液が３０ｍＭ）リスアセテート、０．７５ｍＭＭａ２ＥＤＴ Ａの場合、アンペア数は１本の電極の場合では約７０ｍＡであり、かつ２本の電 極では約１４０ｍＡであった。したがって、所与の電圧での電流はワイヤの数に 依存することは明らかである。３本または４本以上のワイヤを使用することによ り、電界の均一性は改善されるが、アンペア数も増大する。高いアンペア数では 、熱がより多く発生しかつ電気泳動緩衝液の成分が主に電気分解によってより早 く変化するので有害である。したがって、本件発明においてはアノードのために ２本のワイヤとカソードのために２本のワイヤが最適であると考える。しかしな がら、より均一な電界を必要とするかまたは大変低い電圧を必要とする応用にお いては、２本を超える数のワイヤか導電性のストリップをアノードおよびカソー ドとして使用することが有利かもしれない。

ゲルコンパートメントにおける緩衝液の量は、ちょうど上部ワイヤを覆う程度の 量にされる。そこで、所与の電圧での電流はこの２本のワイヤの垂直方向の間隔 に依存して増大する。したがって、電流を低く保つためには、この距離をあまり 大きくなり過ぎないようにする必要がある。また、電界の均一性は、ワイヤの垂 直方向の距離が小さすぎる場合には改善されない。本件発明の特徴として、３か ら１０ｍｍの垂直方向の距離が望ましいと考えられる。アノードとカソードとが 記載の実施例に比べて実質的により接近しているかまたは実質的により離れてい る場合には、最適距離はこの範囲を外れるかもしれない。電流はワイヤの厚さに も依存する。厚さを選択する上で、考慮されるべき重要な点は機械的な安定性と コストである。プラチナから製作された０、１から０．５ｍｍの厚さのワイヤが 適当である。

全体長さにわたって２つの電極を垂直に等間隔に保つためには、好ましい実施例 では、単一の０．２ｍｍの厚さのプラチナワイヤをダム１３．１４．１３′、お よび１４′における穴に通す。加えて、シリコン管状物２５および２５′の２つ の断片がワイヤとダム１３および１３−との間に挿入され、それによりワイヤが 管状物をダムに対向して押圧する。ワイヤをび−んと張ったままにするこの手段 はその単純さゆえ好ましい。

第１の好ましい実施例において、電極間の水平方向の距離は１１ｃｍである。電 極がこれより長いまたは短い間隔で位置決めされ得ることは明らかである。１１ ｃｍの空隙が選択されるのは、約９ｃｍのゲルの長さが多くの適用に関して十分 であるからである。本件おいては、９２ｍｍの長さのポリ（ＮＡＴ）ゲルが使用 される。これらゲルは２つの電極間の領域の中心に置かれる。したがって、ゲル の端部が電極から約９ｍｍの距離にある。この距離は標準的な液中ゲル電気泳動 装置におけるゲルと電極との間の距離より実質的に短い。したがって、本件発明 の装置はよりコンパクトでかつしたがって利用可能なゲルの領域が標準的な装置 における場合よりも比例してより大きくなる七いう付加的な利点も有している。

電気泳動の際に、ゲルはフレーム２０で適所に維持される。ゲルは突出ゲル支持 膜上にあるフレーム内に位置決めされる。フレーム２０は幅広いというよりは長 いゲルを収容する。長さと広さが等しい、または長いというよりは広いゲルを有 することも可能である。対応するフレームはしたがってその大きさが変化するこ とになる。ゲルはフレーム２０と合う大きさのものであり、第１の好ましい実施 例の一電気泳動装置において３つのゲルが同時に置かれかつラン（「ｕｎ　）さ れることが可能である。２つのフレーム２０は、支持膜がフレーム２０の垂直側 部の半分の厚さだけ突出す場合には、３つのゲルを固定するのに十分である。

第１の好ましい実施例のゲルコンパートメントにおける緩衝液の量は、最大ゲル 量より約２倍から５倍大きく、この場合ゲルの厚さは３から６ｍｍである。この 緩衝液の量が十分かもしれずかつしたがって短時間で低電圧でアガロースゲルを ランするためにもう１つの緩衝液のコンパートメントは必要ではないが、合成ゲ ルをランする場合にはおおむね３つの理由により緩衝液の量はより多いほうがよ い。

第１には、合成ゲルは通常電気泳動の際にゲルから移動してくるミリモルの濃度 の重合触媒を含んでいる。緩衝液の成分はしたがって徐々に変化をとげ、かつ緩 衝液の量が多ければ多いほど成分における相対的な変化は小さくなる。

第２には、合成ゲルは通常少量の非重合モノマーを含んでおり、これがランの際 のゲルから発散する。多くのビニールモノマーは濃度に依存する態様で、生体分 子内に存在するいくつかの官能基と反応する。したがって非重合モノマーがより 希釈されるであろうから、緩衝液の量は多いほうがよい。第３には、電気泳動の 際に、ジュール熱が発生する。この場合も緩衝液の量は多いほうがよい、という のも熱容量がより高くかつしたがってゲルをランしている間の温度の変動がより 小さいからである。好ましい実施例においては、適当な緩衝液の量はゲルの量全 体よりも８から４０倍大きいが、これよりもさらに多い緩衝液の量がいくつかの 適用においては望ましいかもしれない。本件発明の装置はしたがって多い量の緩 衝液の使用が可能であるという重要な利点も有している。

第２の好ましい実施例においては、図８に示される電極アセンブリが図２に示さ れる基本装置の上部コンパートメント内に挿入される。電極２６および２６″は ダム１４および１４′に直角に固定された断片２７．２７′および２８．２８′ に装着されかつ第１の実施例において記載されたのと同様の態様で延ばされたま まにされる。電極２６および２６−は電極１５および１５′よりも短いが、それ らの間隔はより長い。したがって、これら２本の電極の間の領域にはより長いゲ ルをランすることが可能である。本件発明の新規な装置は実質的に長さの違うゲ ルをランすることが可能であるというさらなる利点を有している。この能力は電 極アセンブリを交換することが可能であるという点から生じる。しかしながら、 本件発明の装置内に電極を永久に固定することも可能である。これは電極アセン ブリを交換する際の損傷というリスクを排除すると考えられるが、同時にランさ れ得るゲルの大きさを限定すると考えられる。

第２の実施例においては、緩衝液の流れは電界線に対して本質的に平行であるが 、第１の実施例においては流れは電界線に対して本質的に直角である。９０゛と １８０°の角度が選ばれたのは、これら角度が最も便利だからである。

緩衝液が電界線に対してさらに違う角度で流れ得ることは明らかである。

図９に上から示された第３の好ましい実施例においては、水平プレート内に２つ の開口２９および２９′がある。前面と、側部と開口の後方には垂直バリア３０ ．３１、および３０−１３１′がある。緩衝液は開口２９を通ってバリア３０お よび３１と端部壁３２との間を流れる。その後、流れは曲がり、かつ第１の好ま しい実施例のダム１３および１４の開口と同じ形状の開口を含む、ダム３３およ び３４の下を通過する。中央領域を通過した後、流れはダム３４−および３３′ を通過して端部壁３２′とバリア３〇−および３１′との間を移動することによ り開口２９−に入る。水平プレートおよび下部コンパートメントの他の特徴は第 １の実施例のものに実質的に同じである。

電極３５および３５′は側壁３６および３６′に平行であり、かつ緩衝液の流れ は電界線に対し本質的に直角をなす。電極が電極断片３７．３７′および３８． ３８′の間の間隔にまたがる場合には、適当な電界が達成される。緩衝液のレベ ルはこの断片より上にくる。電極がより短い場合には、ＤＮＡの帯はバリア３４ および３４′に最も近いレーンで歪む。

図１０に上から示された第４の好ましい実施例では、上部コンパートメントは２ つの別のチャンバに分離される。

水平プレートが各チャンバに２対ずつ合計４対の開口を有している。この２つの チャンバにおける電極は独立しており、かつ一方のチャンバにおける電極は他方 のチャンバにおける電極から分離されている。緩衝液は１つの各コンパートメン トから２つの上部チャンバへ循環する。この装置の上部コンパートメントが第１ の実施例の１上部コンパートメントと第２の実施例の一上部コンパートメントか ら本質的になることは明らかである。その重要の違いは２つのチャンバを分離す る長い垂直バリア３９である。単一水平プレートがチャンバ双方により共有され る。

第４の実施例の装置は、主に１チヤンバにおいてゲルが異なった条件下、たとえ ば第２のチャンバにおけるゲルとは違う電圧で同時に流され得るという理由で有 利である。

本件発明の範囲内で第４の好ましい実施例の装置に対して多くの修正がなされ得 ることは明らかである。このような修正のうち２つについて以下に述べる。第１ のものは、上部のチャンバが図９に示された緩衝液再循環開口とバリアとを含み 得るというものである。第２のものによれば、上部のコンパートメントが２つを 越える数のたとえば４つのチャンバを含んで、４つのゲルを同時にそれぞれ異な る条件下でランすることが可能になり得る。

好ましい実施例の上の説明においては、言及された可能な修正の数はわずかであ る。本件発明の範囲内で他の実施に繋がる多くの付加的変更がなされ得ることは 、当業者にとり明らかであろう。これらの可能性のいくつかについて以下に簡単 に述べるがこれは限定を目的とするものではなく、そうではないと明細書中に特 定的に示されている場合を除いては例示目的のものである。したがって、図１１ に示したもう１つの実施例では、ゲルコンパートメント４０と貯蔵層コンパート メント４１を並べておくことが可能である。ポンプ４２が緩衝液を循環させるた めに使用される。

ポンプが同じ直径の管状物を使用する場合には、貯蔵層コンパートメントにおけ る緩衝液のレベルはゲルコンパートメントにおける緩衝液のレベルとは違ったも のになり得る。

代替的には、緩衝液はゲルコンパートメントの一方開口内へのみポンプ動作され ることが可能で、かつその後貯蔵層コンパートメント内の管状物を介して流れ得 る。緩衝液のレベルはコンパートメントにおいては本質的に同じである。

この実施例では、緩衝液の再循環開口も水平プレート内に位置決めされる。さら にもう１つの実施例では、緩衝液循環開口は水平プレートの側部もしくは端部壁 または他の位置におかれてもよい。さらにもう１つの実施例においては、水平プ レートおよび／または緩衝液は循環冷却剤ではなくペルチェ（Ｐｅｌｊｉｅ＋　 ）素子によって冷却されてもよい。さらに他の例では、電極コンパートメントに おけるダムはダム１３および１４のものとは異なる形状の開口を含んでもよい。

また他の場合には、電極は、２本ではなく、１本、３本もしくはそれ以上のワイ ヤまたは導電性材料を含むストリップを含んでもよい。

例 本件発明の方法により、異なる大きさのＤＮＡフラグメントが第１の実施例の装 置において６％ポリ（ＮＡＴ−（Ｂｉｓ）ゲル内で電気泳動される。電気泳動緩 衝液は０゜７５ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡを含む、３０ｍＭトリス−アセテートｐＨ ８，０である。約１７００　ｍ　ｌの緩衝液が装置内に注ぎ込まれる。ゲルは長 さ９２ｍｍ、幅６２ｍｍ、かつ厚さ３ｍｍである。プラスチックの支持膜がゲル の各鋼上に２ｍｍ突出す。ゲルは水平プレートの上に置かれかつ支持膜と水平プ レートとの間に気泡がひっかかったままになることはない。ゲルはフレーム２０ により適所に維持される。追加の緩衝液が、緩衝液のレベルが上部プラチナワイ ヤの上部２ｍｍのところに来るまで加えられる。ＤＮＡサンプルは４０％スクロ ースと０．００５％のブロモフェノールブルーを含む電気泳動緩衝液で希釈され る。２つの異なるＤＮＡサンプルが使用される。１つはよいＤＮＡフラグメント （ｌｋｂラダー、ベテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｌｈｅｉｄａ　Ｐ 、ｅ＋ｅａ＋ｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏ「ｉｅ＋）の商業的に入手可能な混合物で あり、かつもう一方はバクテリオファージラムダＤＮＡのＭｖａＩ制限消化物で ある。各サンプルのの５μｔ４つ分がゲルに与えられる。サンプルのウェルは長 さ５．５ｍｍ、幅１．５ｍｍ、かつ深さ２．５ｍｍである。サンプルをローディ ングした後、カバーが閉じられかつ電圧は７７Ｖに設定される。この電圧では対 応する電流は約１７０ｍＡである。電界強度は２つの電極の間の領域では７Ｖ／ ｃｍである。ブロモフェノールブルー追跡用色素の移動から判断して、ＤＮＡフ ラグメントは約４分でゲル内に侵入する。このとき、緩衝液の循環がポンプにス イッチを入れることにより開始される。電気泳動の際、ＬＫＢモデル２２１９マ ルチテンプＩＩサーモスクテックサーキュレータ（Ｍｕｌｔｉ　Ｔｅｍｐ　Ｉｆ 　Ｔｈｅｒｍｏ＋１ａｌｉｃ　Ｃｉ「ｃｕｌａｔ。

ｒ）から来る循環冷却剤が２４．５℃の温度であれば、緩衝液の温度は２５℃で ある。約２時間と２０分の後、追跡用色素はゲルの底に達する。そこで電力は断 ち切られ、かつゲルは、１００μｇの臭化エチジウムを含む１００ｍ１の蒸留水 に１時間インキュベートされる。臭化エチジウムの余分なものを希釈するために 、ゲルは暗所で蒸留水ＩＬに１晩浸けられる。引続き、ゲルはＵＶ光の下で写真 撮影される。図１２に示されるＤＮＡのパターンから、スマイリング効果が生じ ていないことは明らかである。加えて、帯は帯幅全体にわたって真直ぐである。

最後に、２０〇−２０００の塩基対の範囲での分解能はすぐれておりかつ特に顕 著なのは、５６０と５１６塩基対フラグメントの分解能である。

本件発明はかなりの細部にわたって記載されてきたか、そのいくつかが上にも述 べられたが修正および変更が以下のクレームに記載される本件発明の概念および 範囲から逸脱することなくその経過およびその装置自体においてなされ得ること が当業者にとり明らかになるであろう。

Ｆｉｇｕｒｅ　１ｂ 開示の纒要幻 名称：液中ゲル電気泳動のための装置および方法液中ゲルにおいて電気泳動を行 なうための電気泳動装置であって、少なくとも１つのゲルコンパートメントおよ び少なくとも１つの貯蔵層コンパートメントを含む複数のコンパートメントと、 ゲルコンパートメントの底部としてのプレートと、ゲルコンパートメント内のみ にある電極とを含み、該電極は動作の際に生じた電界が矩形の箱内に本質的に閉 込められるような態様で配列されており、前記矩形の箱は側部においては側壁ま たはバリアにより、上部においては空気により、かつ底部においてはプレートに より規定されており、緩衝液を循環する手段と、緩衝液循環開口の前のプレート 上に装着されたゲルコンパートメントにおけるバリアとを含む。

国際調査報告 □→ 国際調査報告 ）コー″、：尤：ｌＲ”＠１１’１′：＋、、＝−ロ＝ｚ＝〒；“−１°−−１ ゛け帽２Ｗ“−“°−１゜１コ一＃Ｉｗｉロ嗜Ｉ−ｍ内１’ｔｌ＠ｍｒａｎｔｓ Ｉｔｂｎｏｗｙ１１１１１１１１１ｗ雷−呻ｓｎｌｅｗ＋・ｑ＠１−−ｔｅ＊＊ ｆ曽−■■■窒戟|ｉｒｇｗｍＴｈｅ％−＊ａイー−１ｓｒ＋＋７４ａｍ

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．液中ゲルにおいて電気泳動を行なうための電気泳動装置であって、 少なくとも１つのゲルコンパートメントと少なくとも１つの貯蔵層コンパートメ ントとを含む複数のコンパートメントと、 ゲルコンパートメントの底としてのプレートと、ゲルコンパートメントのみにお ける電極とを含み、電極が、動作の際に生じる電界が矩形の箱内に本質的に閉込 められるような態様で配列され、前記矩形の箱が側面は側壁またはバリアで、端 部は端部壁またはバリアで、上部は空気でかつ底部はプレートで規定され、緩衝 液を循環するための手段と、 緩衝液循環開口の前のプレート上に装着されるゲルコンパートメントにおけるバ リアとを含む、装置。
2. ２．電界が好ましくは各々垂直方向に２から２０ｍｍ離された２本の平行なワイ ヤを含むアノードとカソードにより発生される、請求項１に記載の電気泳動装置 。
3. ３．電極が除去可能である、請求項２に記載の電気泳動装置。
4. ４．ゲルのコンパートメントの底部としてのプレートが、その温度が電気泳動の 際に変化するようなものである、請求項２または３に記載の電気泳動装置。
5. ５．ゲルのコンパートメントの底部としてのプレートが電気泳動の際の温度を安 定化させるための手段を含む、請求項２または３に記載の電気泳動装置。
6. ６．１つのゲルコンパートメントと１つまたは２つ以上の貯蔵層コンパートメン トとを含む、請求項４または５に記載の電気泳動装置。
7. ７．２つまたは３つ以上のゲルコンパートメントと、１つまたは２つ以上の貯蔵 層コンパートメントとを含む、請求項４または５に記載の電気泳動装置。
8. ８．緩衝液のレベルをゲルコンパートメントにおいて実質的に一定に保つための 手段を含む、請求項６または７に記載の電気泳動装置。
9. ９．ゲルのコンパートメントが貯蔵層コンパートメントの上に位置する、請求項 ６または７に記載の電気泳動装置。
10. １０．緩衝液がポンプにより循環する、請求項８または９に記載の電気泳動装置 。
11. １１．緩衝液が装置の壁内の開口を通ってゲルコンパートメントと貯蔵層コンパ ートメントとの間を循環する、請求項１０に記載の電気泳動装置。
12. １２．緩衝液が、ゲルコンパートメントの底部としてのプレート内の開口を通っ てゲルコンパートメントと貯蔵層コンパートメントとの間を循環する、請求項１ ０に記載の電気泳動装置。
13. １３．底部プレートの各側に２つの分離された緩衝液循環開口を含む、請求項１ ２に記載の電気泳動装置。
14. １４．底部プレートの各端部上に１つの緩衝液循環開口を含む、請求項１２に記 載の電気泳動装置。
15. １５．緩衝液の循環開口がバリアと壁との間に留まるような態様で装着された各 緩衝液循環開口の前の底部プレート上に２つの垂直なバリアを含む、請求項１３ または１４に記載の電気泳動装置。
16. １６．いくつかの開口を含むダムを含みかつそのダムが貯蔵層コンパートメント においてポンプの入口と出口との間に位置する、請求項１５に記載の電気泳動装 置。
17. １７．ゲルコンパートメントにおける緩衝液の流れが緩衝液の流れに対して直角 をなして位置決めされた２つの形式のダムにより方向決めされ、前記ダムの１つ の形式が半楕円状の開口を含みかつ他方の形式が長いスロットを含む、請求項１ ６に記載の電気泳動装置。
18. １８．半楕円形の開口を有する少なくとも２つのダムと、長いスロットを有する 少なくとも２つのダムとを含む、請求項１７に記載の電気泳動装置。
19. １９．半楕円状の開口を有する１つのダムと、長いスロットを有する１つのダム とを含む互いから１ないし４ｃｍ離された１対のダムが、半楕円状の開口を有す るダムが端部壁の近くに来るような態様で各端部壁から１ないし３ｃｍ離されて 位置決めされる、請求項１８に記載の電気泳動装置。
20. ２０．電極が側壁に対して平行に位置決めされる、請求項１９に記載の電気泳動 装置。
21. ２１．電極が端部壁に対して平行に位置決めされる、請求項１９に記載の電気泳 動装置。
22. ２２．液中ゲル電気泳動のための矩形の箱の形の実質的に均一な電界を生成する 方法であって、各電極に２本のワイヤを使用することと、前記電界を側部におい ては側壁またはバリアにより、端部においては端部壁またはバリアにより、上部 においては空気により、かつ底部においては底部プレートにより閉込めるステッ プを含む、方法。
23. ２３．電極が、垂直バリアと壁との間にぴったり適合するフレームに装着される 、請求項３に記載の電気泳動装置。
24. ２４．電極が側壁に沿って延びる、請求項２３に記載の電気泳動装置。
25. ２５．電極が端部壁に沿って延びる、請求項２４に記載の電気泳動装置。
26. ２６．スペア部品としての請求項２４または２５に記載の電極アセンブリ。