JPH09510015A - スラブゲル電気泳動用ノッチ付きスペーサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、電気泳動ゲルとサイドスペーサーとの間の溝の形成を防ぐスラブゲル電気泳動に使用するための改良されたサイドスペーサー、およびサイドスペーサーを使用する方法にある。この改良は、ゲルと接触するサイドスペーサーの縁にカットした１個またはそれ以上のノッチをもつサイドスペーサーを形成し、ゲルが硬化するとき、サイドスペーサーがゲル中に固定され、これによってサイドスペーサーとゲルとの間に溝が形成しないようにすることからなる。

Description

【発明の詳細な説明】 スラブゲル電気泳動用ノッチ付きスペーサー 発明の技術分野 本発明は、電気泳動システムに関し、さらに特に、スラブゲル電気泳動に使用 するための改良されたサイドスペーサー、およびこのサイドスペーサーを使用す る方法に関するものである。 発明の背景 電気泳動は過去も現在も生物科学において優れた分析的な分離技術である。こ れは電気泳動が、特に、一般に高分子量であり、水溶性であり、不安定で荷電し ている生物ポリマー、例えばＤＮＡ、蛋白質、炭水化物等に良く適しているから である。現代のゲル電気泳動の応用は、蛋白質の分子量決定、例えばハメスら編 、Gel Electrophoresis of Proteins, IRL Press, Washington, D.C. (1984)か ら、ＤＮＡ配列分析、例えばトレイナーのAnal．Chem.，62: 418:426(1990)、遺 伝子の病気の診断、例えばワトキンスのBiotechniques，6: 310:319(1988)、炭 水化物混合物の分析、例えばジャクソンらのElectrophoresis，12: 94:96(1991) までの範囲がある。 一般的に、分析的な電気泳動は“スラブ”フォーマットで行われる。スラブゲ ル電気泳動の技術は生化学および分子生物学の技術分野では良く知られている、 例えばリックウッドら編、Gel Electrophoresis of Nucleic Acids: A Practica l Approach，IRL Press，New York，(1990)。スラブゲル電気泳動では、電気泳 動分離媒体、一般的には架橋ゲルは、２枚の矩形非伝導プレート、例えばプレー トの側縁領域に位置する２個のサイドスペーサーによって分けられたガラスプレ ート間に置かれ、これによって“ゲルサンドイッチ”を形成する。このサイドス ペーサーはガラスプレート間の距離をゲルを横切って均一に確保され、これによ って均一なゲル厚を確保する。ゲルサンドイッチの頂縁と底縁は頂部と底部の緩 衝液貯蔵器中に含まれる緩衝液に浸す。頂部と底部電極は頂部と底部の緩衝液貯 蔵器内に取りつける。緩衝液の目的は頂部と底部の電極とゲルサンドイッチの頂 縁と底縁との間で電気的接触を与えることである。ゲルの頂部に試料を装填し、 電 位をゲルを横切って印加し、荷電試料がゲルを通って移動するようにする。自動 化スラブゲル電気泳動システムは追加として実時間走査型螢光検出器を含み、例 えばフンカピラーらの米国特許4,811,218、ゲルを通過するとき多数の螢光標識 試料を検出する。電気泳動中に多数のレーンからのデーターを収集するために、 光学検出システムはゲルの幅を横切って螢光標識試料の移動方向に垂直な方向で 走査する。 スラブゲル電気泳動工程の適当な機能化に対して、サイドスペーサーが分析の 間に電気泳動ゲルと接触したままである、即ちサイドスペーサーとゲルとの間に 空隙または溝が見えないことは重要である。このような空隙は、電気短絡、不均 一電界、ゲル破壊、および、極端な場合には、火災を含む種々の問題を導くこと がある。本発明は、サイドスペーサーと電気泳動ゲルとの間の密な接触を確保し 、これによって空隙の形成の見込みとそれによる複雑化を減らす装置と方法に向 けられている。 発明の概要 簡単には、本発明は電気泳動ゲルとサイドスペーサーとの間の溝の形成を妨げ るスラブゲル電気泳動において使用するための改良されたサイドスペーサー、お よび改良されたサイドスペーサーを使用する方法に向けられている。この改良は ゲルと接触するサイドスペーサーの縁にカットしたノッチをもつサイドスペーサ ーを形成し、ゲルが固化するとき、サイドスペーサーはゲル中にしっかり固定さ れ、これによってサイドスペーサーとゲルとの間のチャネルの形成を妨げるよう にする。 さらに特に、本発明のサイドスペーサーはゲル層と接触する内側縁からなり、 この内側縁は、その中にゲル層の領域を印す少なくとも１個のノッチを有し、こ れによってサイドスペーサーをゲル層にしっかり固定し、ゲル層とサイドスペー サーとの間のミクロのミゾの形成を妨げる。 追加として、本発明は電気泳動ゲルサンドイッチを含み、その間にゲル層をも つ一対の並列した平らなプレート、互いに離れて平行なプレートの間隔を置くた めの一対のサイドスペーサーからなり、少なくとも１個のノッチを有し、このノ ッチはゲル層の領域を印し、これによってサイドスペーサーをゲル層にしっかり 固定する。 最後に、本発明は（i）一対の第１のプレートを下に置き、（ii）第１のプレ ートの頂部に一対のノッチ付きサイドスペーサーを置き、ノッチ付きサイドスペ ーサーの外側縁を第１のプレートの縁で面一にして、各ノッチ付きサイドスペー サーのノッチを互いに向き合っているようにし、（iii）前記一対の第２のプレ ートを第２のプレートの縁をもつノッチ付きサイドスペーサーの頂部に置き、第 １のプレートの縁とスペーサーの外側縁とを面一にして、これによって２枚のプ レート間に溝穴を形成し、（iv）上記構成を維持するように締めつけ装置を取り つけ、そして（ｖ）ゲル媒体を２枚のプレート間に形成された溝穴に注入し、ゲ ル媒体が硬化したとき、ゲル層を２枚のプレート間に形成する各工程からなる電 気泳動ゲルサンドイッチを組み立てる方法を含む。 図面の簡単な説明 図１は、サイドスペーサーとゲル層との間のミクロの溝を示す図である。 図２は、本発明のサイドスペーサーの好適例を示す図である。 図３は、本発明のサイドスペーサーの複数の変更例を示す図である。 図４は、本発明のサイドスペーサーを組み込むスラブゲル電気泳動装置の正面 と側面の図である。 発明の詳細な説明 本発明の重要な局面は、サイドスペーサー（１２）が、ゲルサンドイッチの取 扱によっては電気泳動前に偶発的に取り除かれ、ゲル層（２４）とサイドスペー サー（１２）との間にミクロの溝（８０）を形成するということを見出したもの である。図１参照。ミクロの溝はスラブゲル電気泳動の利用を制限することがで きる幾つかの重大な問題の原因となることが見出された。第１に、ミクロの溝は 頂部緩衝液貯蔵器からの緩衝液の漏れの原因となり、頂部緩衝液貯蔵器申の液体 水準を下げることになる。頂部貯蔵器の液体水準が落ちるので、頂部電極とゲル 層との間の電圧の低下が大きくなり、これによってゲルを横切る電圧の低下が減 り、試料分子の電気泳動速度が変化しやすくなる。極端な場合には、頂部貯蔵器 の液体水準がゲ層の頂縁より下に落ち、ゲル層と頂部電極との間の電気接続が切 断され、頂部電極とゲル層との間の短絡の原因となる。短絡は頂部電極と暴露ゲ ル層との間にアークを形成することになり、ある場合には火災となる。 第２に、ミクロの溝（８０）はゲル層（２４）とサイドスペーサー（１２）と の間に低い電気抵抗路を生成することができる。この低い抵抗路はゲル層内の電 界ラインを不通にすることができ、これによって試料分子の移動方向および速度 に影響を与え、平行でない水平でない配列の電気泳動レーンを導く。これらの変 形したレーンは、特に自動化実時間データー収集システム、例えば螢光に基づく ＤＮＡ配列分析システムの場合に、データー解釈の仕事を面倒にする。 第３に、低い抵抗のミクロの溝内の電流が高いので、“ホットゾーン”がジュ ール熱によりミクロの溝内に生成することができる。これらのホットゾーン内の 温度の上昇は電気泳動緩衝液の脱ガスを導き、最後には気泡が形成することにな る。アーク化は気泡を横切って起こり、ゲル層の破壊を導き極端な場合には火災 となる。 本発明の別の重要な局面は、ゲル層にそれ自身をしっかり固定することによっ て移動に抵抗し、これによってサイドスペーサーとゲル層との間のミクロの溝形 成に関連した問題の見込みを減らすサイドスペーサーを改良設計する。この固定 化はスペーサー中に“ロックノッチ”を形成して達成され、ロックノッチはここ では、ゲル層に向かい合うサイドスペーサーの縁に形成された切断部、窪みまた は中空として定義される。以下、ロックノッチを組み込むサイドスペーサーはロ ックノッチスペーサーと呼ばれる。ロックノッチスペーサーは複数のロックノッ チを組み込むことができる。本発明のロックノッチを特徴付ける手軽な方法は、 “支持範囲”を参照し、支持範囲はロックノッチによって印されるゲル層の範囲 として定義される。好ましい支持範囲はゲル物質の性質、例えばポリマーおよび 架橋剤のパーセントに依存する。好ましくは本発明のロックノッチは約１＊10^-6 ｍ²および1.2＊10^-3ｍ²の間の支持範囲をもたなければならない。さらに好まし くは、本発明の少なくとも１個のロックノッチはサイドスペーサーの頂縁と底縁 の20cm内に位置する必要がある。 本発明のロックノッチの好ましい構成は、図２に示されるように、“三角形” のロックノッチであり、三角形のロックノッチ（１００）は長さｒをもつノッチ 縁（１０４）、および大きさθをもつノッチ角（１０８）を参照して記述するこ とができる。三角形のロックノッチ（１００）の場合、ノッチエッジ（１０４） は５mmと50mmの間の長さをもつ必要がある。好ましくはノッチエッジ（１０４） は10mmと30mmの間の長さをもつ必要がある。ノッチ角（１０８）は鋭角でなけれ ばならない。好ましくは、ノッチ角（１０８）は５°と85°の間である。さらに 好ましくは、ノッチ角（１０８）は10°と75°の間である。以下に示されるよう に、最も好ましいノッチ角（１０８）は45°である。三角形のロックノッチ（１ ００）の場合、支持範囲は(r^z/2)＊sin(θ)cos(θ)に等しい。45°のノッチ角は 三角形のロックノッチの支持範囲を最大にする、当業者は支持範囲の概念が三角 形の他の形状に応用できることを認めるであろう。図３は複数の可能な代わりの ロックノッチ形状を示す。 本発明のサイドスペーサーの材料は、通常のゲル材料および緩衝水溶液に関し て均一なゲル層、非導電性、非圧縮性、および化学的に不活性を確保するように 画定された均一な厚さを有する薄いシートに形成することができる必要がある。 このような材料の例はポリカーボネート、ポリビニルクロリド、ポリテトラフル オロエチレン（Teflon、登録商標）、ポリ（メチルメタクリレート（Plexiglass 、登録商標）、ポリエチレンテレフタレート（Mylar、登録商標）、ガラス、ポ リ（ブチレンテレフタレート）（Valox、登録商標）等を含む。好ましくは、火 災の可能性のため、本発明のロックノッチスペーサー用の材料は、ポリカーボネ ート、ポリテトラフルオロエチレン（Teflon、登録商標）、ポリエチレンテレフ タレート（Mylar、登録商標）、ガラス、ポリ（メチルメタクリレート（Plexigl ass、登録商標）、ポリ（ブチレンテレフタレート）（Valox、登録商標）のよう な不燃性材料でなければならない。さらに好ましくは、本発明のロックノッチス ペーサーはポリ（ブチレンテレフタレート）（Valox、登録商標）から作られる 。 図４は、本発明を使用する電気泳動分離に使用されるスラブゲルサンドイッチ を示す。正面およびバックプレート（４）および（８）は共に、互いに向き合い 、ロックノッチスペーサー（１２）によって分離される。プレート（４）および （８）は平たく、ゲル材料または試料分子と不利に影響しあわない穴のない電気 絶縁物から作られる必要がある。一般に、プレート（４）と（８）はガラスから 形成される。 ロックノッチスペーサー（１２）は正面およびバックプレート（４）および（ ８）の間に置かれ、ゲルが形成されるプレート間に均一な隙間を与える。一般的 には、ロックノッチスペーサー（１２）は100μmと5000μmの間の厚さをもつ。 好適例では、２枚のロックノッチスペーサー（１２）を、ゲル層（２４）の各側 に備える。 ゲル層（２４）を形成するために、正面およびバックプレート（４）および（ ８）は共に締めつけて、ゲル材料が両側から逃げないようにする。サイドクラン プ（２８）を使用して、ロックノッチスペーサー（１２）と接触させてプレート （４）と（８）を支持し、漏れ止めシールを形成する。ある場合には、サイドク ランプを粘着テープによって置き換えることができる。好ましくは、サンドイッ チの底から媒体が漏れないように確保するため注入工程の間に、テープはゲルサ ンドイッチの底縁（３０）に当てる。適当な分離媒体、例えばポリアクリルアミ ドまたはアガロース等を使用して、正面およびバックプレート（４）および（８ ）の間のスペースを埋める。これらの材料はプレート間にあるときは流動性液体 であり、その後に材料は硬化して硬質ゲルを形成する。一般的に、プレートが垂 直方向にある間に分離媒体はプレート間に置き、これによって材料中に存在する 気泡を容易に除去する。 頂部緩衝液（３６）と頂部電極（３８）を含む頂部貯蔵器（３２）はゲルサン ドイッチの頂部に位置し、ゲル層（２４）の頂縁（２３）と頂部電極（３８）と の間の電気的接続を与える。一般的に、貯蔵器は正面プレート（４）の上部伸長 部（４０）と頂部貯蔵器（３２）との間に形成される。 ゲル層が硬化すると、底縁（３０）をカバーしているテープを除き、底縁（３ ０）を底部貯蔵器（４８）に浸す。底部緩衝液（５２）および底部電極（４９） を含む底部貯蔵器（４８）はゲルサンドイッチの底部に配置し、ゲル層（２４） の底縁（３０）と底部電極（４９）との間に電気的接続を与える。 電源（５６）は頂部電極（３８）と底部電極（４９）に接続する。電源（５６ ）は約100と5000Ｖとの間のＤＣ電圧および約500Ｗまでの全電力出力を与えるこ とができなければならない。 通常は、複数の試料を同時に多数の平行なレーン中のゲルに走行させる。各レ ーンは試料を電気泳動前に装填するゲル層（２４）の上部にて形成される試料ウ ェル（６０）によって規定される。試料ウェル（６０）はコーム；一片の薄いプ ラスチック、厚さが等しいロックノッチスペーサー（１２）によって形成するこ とができ、図４のウェル形状を形成するようにカットされる。代替のウェル形状 は核酸配列分析に一般に使用される“サメの歯”形状のようなものを使用するこ とができる。コームは、液体分離媒体を注入した後でゲルの硬化前に、プレート （４）および（８）の間に挿入する。ゲル硬化した後、コームを除去して、試料 を電気泳動前に置くことができるウェルを残す。 以前に使用されたサイドスペーサーを超える利点を有する新規のサイドスペー サーをスラブゲル電気泳動装置に使用することを記載してきた。本発明は、前述 の記載によって説明されるが、そこで採用されている素材に限定されると解釈さ れるものではなく、むしろ本発明は、上に明らかにされたところの包括的な範囲 に向けられている。その様々な改良および具体化はそれらの意図あるいは範囲か ら逸脱することなく行うことができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ゲル層と接触する内側縁からなり、この内側縁は、指示範囲を印す少なくと も１個のノッチをその中に有し、サイドスペーサーをゲル層にしっかり固定する ようにするスラブゲル電気泳動に使用するためのサイドスペーサー。 ２．前記ノッチの前記支持範囲が１＊10^-6ｍ²および1.2＊10^-3ｍ²の間である請 求項１記載のサイドスペーサー。 ３．少なくとも１個のノッチがゲル層の頂縁の20cm以内に位置する請求項１記載 のサイドスペーサー。 ４．少なくとも１個のノッチがゲル層の底縁の20cm以内に位置する請求項１記載 のサイドスペーサー。 ５．前記ノッチがノッチ縁およびノッチ角を有する三角形のノッチであり、ノッ チ縁が５mmと50mmの間の長さを有し、ノッチ角が鋭角である請求項１記載のサイ ドスペーサー。 ６．前記ノッチ角が５°と45°の間である請求項５記載のサイドスペーサー。 ７．ノッチ角が45°である請求項５記載のサイドスペーサー。 ８．電気的に不伝導性の、非圧縮性の、化学的に不活性の材料からなる請求項１ 記載のサイドスペーサー。 ９．前記材料が、ポリカーボネート、ポリビニルクロリド、ポリテトラフルオロ エチレン（Teflon、登録商標）、ポリ（メチルメタクリレート（Plexiglass、登 録商標）、ポリエチレンテレフタレート（Mylar、登録商標）、ガラス、および ポリ（ブチレンテレフタレート）（Valox、登録商標）からなる群から選ばれる 請求項８記載のサイドスペーサー。 １０．前記材料が、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン（Teflon、 登録商標）、ポリ（メチルメタクリレート（Plexiglass、登録商標）、ポリエチ レンテレフタレート（Mylar、登録商標）、ガラス、ポリ（ブチレンテレフタレ ート）（Valox、登録商標）からなる群から選ばれる請求項８記載のサイドスペ ーサー。 １１．前記材料が、ポリ（ブチレンテレフタレート）（Valox、登録商標）であ る請求項８記載のサイドスペーサー。 １２．（ａ）その間にゲル層をもつ一対の並置した平らなプレート； （ｂ）プレートを互いに離して平行に置くための少なくとも１個のノッチ を有する一対のサイドスペーサーからなり、ノッチは支持範囲の印しをつけ、こ れによってゲル層にサイドスペーサーをしっかり固定する、電気泳動ゲルサンド イッチ。