JPH05503521A - 指状突起―融合リポソームおよびゲル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 一融ムリボソームおよびル 五五立互 本発明は指状突起融合（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉ　ｔａｔｉｏｎ−ｆｕｓｉｏｎ）　 （ＩＦ）リポソームおよびゲルに関するものである。このリポソームおよびゲル は高い溶質−脂質率を獲得する。溶質という用語は生物活性物質を含む複数の生 物活性物質を包含する。本発明はまた、ＩＦゲルとリポソームを生成するための 脂質の指状突起相合の発見および、本発明によるリポソームを形成するそのよう な指状突起相合が大きさに依存することの発見に関するものである。

本発明は、ＩＰリポソームおよびゲル生成の方法に関するものである。本発明の 方法では、リポソームは、音波処理、押出しまたはその他、適当な大きさへのホ モジナイザー処理など、サイズを小さくする処理により、適当な誘発物質の下で 融合される。この処理により、本発明の組成物がゲルの形で生成される。ゲルそ のものは、例えば、生物活性物質の搬送に使用することもできるし、ＩＦリポソ ーム形成にも使用でき、また、ＩＦリポソームは内部体積が非常に大きいため、 大量の溶質を中に包み込むことができる。

ゲルからＩＦリポソームを生成するには、ゲルは、必ずしも必要ではないが、普 通は使用する脂質の遷移温度（丁ｍ）以上でインキュベートしてリポソームを形 成する。本発明の方法に必要な温度は、与えられた脂質、溶質、誘発物質の混合 物の物質特性に変化を起こすような温度であり、これにより本発明のＩＦリポソ ームが生成される。ＩＰゲルから形成されたリポソームがＩＦリポソームである 。必ずしも必要ではないが、誘発物質はインキュベーションの段階で除去される ことが望ましい。この結果、高い溶質−脂質率を有するリポソームからなる組成 物を得ることができる。

亙羞五王 薬物をリポソーム内に封入した形で投与することにより、多くの薬物の治療特性 を劇的に改善することができる［例えば、Ｐ、Ｎ、　５ｈｅｋとＲ，Ｆ、Ｂａｒ ｂｅｒ、　Ｍｏｄ、　Ｍｅｄ、　Ｃａｎａｄａ、　４１．３１４−３８２．　（ ＋９８６）参照コ。例えば、アンホテリシンＢやドキソルビシンの投薬の場合［ Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎら、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｄｉｓ、、１５１．７０４−７１０．　（１９８５）。Ｒａｈｍａｎら、　Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４０．　１５３２　（１９８０）］、毒性は低下し、効 果はそのままか、またはむしろ効果を改善することもできる。リポソーム内に封 入された薬剤から得られる利点は偶発的なものかもしれず、封入された薬物の薬 物動態や伎体内分布が変化したためと考えられるかもしれない（Ｏｓｔｒｏら、 Ａｍｅｒ、Ｊ、　Ｐｈａｒｍ、、　Ｖｏｌ、　４６　Ａｕｇ　１９８９）。

現在、リポソームに生物活性物質を「装入する」方法は多数存在する。

例えば、リポソーム薬物搬送システムでは、薬物などの生物活性物質をリポソー ム内に捕捉したまま、治療を受ける患者に投与される。例えば、Ｒａｈｍａｎら 、米国特許Ｎｏ、３，９９３，７５４；　５ｅａｒｓ、米国特許Ｎｏ、４，１４ ５，４１０；　Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許Ｎｏ、４，２３５ ，８７１ＨＬｅｎｋら、米国特許Ｎｏ、４，５２２．８０３；　Ｆｏｕｎｔａｉ ｎら、米国特許Ｎｏ、４，５８８，５７８を参照のこと。生物活性物質を封入す るこの基本的な方法のほかに、生物活性物質が脂肪親和性であれば、脂質二重層 と結合させることもできる。しかし、従来の方法を用いて作られた製剤は、薬物 −脂質率が低いこと、スケールアップの問題、毒性溶剤の使用という問題を抱え ている。

上記の方法の他にも、「遠隔装填」として知られる賦荷されたプロトンまたはイ オン勾配に反応して、多くの生物活性物質がリポソーム内に蓄積することが知ら れている。〔例えば、Ｍａｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａ ｃｔａ。

８５７、１２３．　（１９８６）；　Ｍａｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、　２７．２０５３．　（１９８８）；　Ｍ。

Ｂ、Ｂａ１ｌｙら、　Ｃｈｇｅｍ、　Ｐｈｙｓ、　Ｌｉｐｉｄｓ、　４７．９７ ．　（１９８ｇ）参照］この装填技術により、リポソームのどのパラメータでも 独立して変化させることができるようになった。従来の技術に比べ、薬物−脂質 率をかなり高くすることができる［Ｍａｙｅｒら、Ｃｈｅｗ、　Ｐｈｙｓ、　Ｌ ｉｐｉｄｓ、　４０．３３３．　（１９８６）］　、遠隔装填のための方法と材 料は、１９８８年１２月１２日提出のＢａ１ｌｙら、出願番号第２８４゜７５１ 号、および１９９１年１月３日提出のＭａｙｅｒら（ＴＬＣ−１３３Ｂ）に開示 されている（後者は、すでに放棄された１９８８年３月７日提出の出願番号第１ ６４，５５７号の出願の継続出願である）。遠隔装填に関するこれらの特許出願 の関連部分は、参考のために本明細書に導入されている。

リポソームは封入された水性物質を含む完全密封された脂質二重層膜である。リ ポソームは単層ラメラ（二重層膜が一重）の場合も、多層ラメラ（タマネギ状の 構造をした多数の二重層膜で、個々の層は水様の層で仕切られている）の場合も ある。この二重層は疎水性の「尾」部と親水性の「頭」部をもつ２つの脂質単層 からできている。膜二重層内では、脂質単層の疎水性（非極性）ｒ尾」部は二重 層の中心に向かって並んでいるが。

親水性（極性）の「頭」部は水相に向かって並んでいる。リポソームの基本構造 は、この分野の様々な技術により作ることができる。

本発明の実施時に使用できるリポソームの一つのクラスは、ラメラ−溶質分布が 実質的に等しいという性質を持つものである。このクラスのリポソームは、Ｌｅ ｎｋらの米国特許第４．５２２．８０３号では安定多層ラメラ小胞（ＳＰＬＶ） と呼ばれ、Ｆｏｕｎｔａｉｎらの米国特許第４．５８８．５７８号では単相小胞 と呼ばれ、その小胞が少なくとも一つの凍結・融解サイクルを経る場合は凍結・ 融解多層ラメラ小胞（ＦＡＴ　ＭＬＶ）と呼ばれる。この方法は、１９９０年の １２月４日に公表されたＢａ１ｌｙらの米国特許第４．９７５．２８２号（名称 ：　捕捉効率の高い多層ラメラリポソーム）で述べられており、参考として本明 細書に導入されている。

リポソーム性カプセル化は、幅広い薬物学的物質にとって潜在的に太きな利点が あり、薬物−脂質率が高いことは、リポソーム内に封入された物質の効果を実現 するのに重要である。薬物を投与するためのリポソームの使用は、薬物のカプセ ル封入および治療中における薬物放出という二つの間圧を提起する。たとえば、 患者に与える脂質負荷を最小限に押さえるため、薬物−脂質率を上げることが引 き続き必要である。

脂質の指状突起相合という現象は、景近になってＪａ履ｅｓ　Ｌ、　５ｌａｔｅ ｒとＣｈｉｎｇ−Ｈｓｉｅｎ　Ｈｕａｎによりかなり詳しく研究された（Ｐｒｏ ｇｒｅｓｓ　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ、。

２７、３２５−３５９．１９８８）。一般的に、この技術では、様々な誘発物質 および／またはアシル鎖長非対称象の存在に由来する様々な脂質の指状突起相合 が述べられている（図ＩＡ、　ＩＢ参照）。しかし、文献には、本発明のＩＦゲ ルとリポソームを生成するための指状突Ｅ鉗合中にリポソームを融合させる際の サイズへの依存性については報告がない。

月二Ω旦釡 本発明の目的は、治療法への応用など、様々な応用分野において溶質搬送に使用 できる指状突起融合ゲルとリポソームを提供することである。

本発明の目的はまた、飽和脂質を含み、さらに追加的に不飽和脂質を含むことが でき、有効濃度の生物活性物質を含む、ヒトを含む補乳類に局所または経口投与 する組成物内に組み込むための、指状突起融合ゲルを提供することである。

本発明のいま一つの目的はまた、高い濃度の生物活性物質を蓄積する指状突起融 合リポソームおよびゲルを生成する方法を提供することである。

本発明はまた、溶質−脂質率が高い指状突起融合リポソームおよびゲルを用いて 動物、特にヒトを含む哺乳類の治療のための治療法を提供することを目的とする ものである。

本発明はまた、本発明の指状突起融合ゲルとリポソームに基づく薬物組成物を提 供することを目的とする。

本発明はまた、指状突起相合ゲルと本発明の指状突起融合リポソームを生成する 方法を提供することを目的とする。

本発明は、また、生物活性物質を捕捉するための新しい方法を提供することを目 的とする。

本発明のこれらの目的およびその他の目的は、以下に述べる本発明の詳細な説明 によりさらに明らかとなる。

凡皿凶！旦 本発明は、溶質を含むことができる指状突起−融合（ＩＦ）リポソームおよびゲ ルに関するものである。これらのリポソームおよびゲルは生物活性物質を含有す る高い溶質〜脂質率を獲得することができる。これらのＩＦゲルおよびリポソー ムは、化粧品、製薬、農業など、多くの分野に応用できる。

生物活性物質と組み合わせることにより、これらのリポソームおよびゲルは植物 や動物、特にヒトを含む哺乳類に局所的または全身的に投与することもできる。

上記の応用のほか、本発明のＩＦゲルとリポソームは樹脂技術、特に塗料技術と 組み合わせると有用である。

本発明の組成は、一定の大きさ、望ましくは直径約０．４ミクロン以下、さらに 望ましくは直径約０．０５ミクロン以下、最も望ましくは直径約０．０２５ミク ロンのリポソームと、例えば生物活性物質などの溶質と、ＩＦゲルを生成するた めのリポソームを融合するのに効果的な指状突起相合誘発物質から構成される。

最初のリポソームはＦＡＴ　ＭＬＶでも代替できる。ＩＦリポソームは本発明の ＩＰデシルら生成できる。本発明のＩＦリポソームおよびゲルにおいて、例えば 、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、シミリストイルホスファ チジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジー０−ヘキサデシルホスファチジルコリン、ジス テアロイルホスファチジルコリンなどの飽和脂質や、トランスジェライトイルホ スファチジルコリン、ジパルミテライドイルーボスファチジルコリンなど、トラ ンス配置内に脂質内のアシル側鎖内に不飽和の炭素−炭素二重結合がある脂質、 またバルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、またはｌ−ス テアロイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＳＯＰＣ）のような混合脂 肪酸脂質、その他の不飽和脂質も使用することができる。

一部の実施態様では、不飽和脂質は本発明の飽和脂質と組み合わせて用いること もできる。一般に、不飽和脂質としてＤＯＰＣを用いた場合、不飽和脂質の５０ モルパーセント以下の罰金で飽和脂質ＤＰＰＣを用いるのが望まし生物活性物質 含有の有無にかかわらず、望ましくは誘発物質の下で一定の大きさのリポソーム が融合される時に生成される指状突起融合ゲルは、それ以上加工せずに使用でき る。または、例えば、このゲルは、必ずしも脂質遷移温度（Ｔｍ）以上の温度に 温めることは必要でないが、この混合物の物質特性の変化を引き起こす温度で混 合物をインキュベートし、それにより本発明のＩＦデシルらＩＦリポソームを形 成させ、そこに含まれる指状突起相合誘発物質を望ましくは除去し、さらに加工 してＩＦリポソームを生成することができる。

本発明のＩＦリポソームは生物活性物質を含有する高い溶質−脂質率を獲得する ために使用することができる。これらのＩＦリポソームはこれ以上の加工をせず に使用できるが、大きさが様々なおよび／または均質なリポソームを生成するた めに、この分野で利用可能な技術と方法を用いてさらに大きさを整えることもで き、それについては以下に述べる。

本発明のＩＦリポソームを生成するため、本発明の指状突起相合誘発物質として 望ましいものは、本発明のＩＦデシルら除去しやすいように、１〜４個の炭素原 子を持つ短鎖アルコール、望ましくはエタノールである。しかし、本発明の実施 態様では、一定の大きさにしたリポソームから融合ＩＦデシル生成するものであ れば、どのような誘発物質を用いてもよい６本発明に使用できる典型的な誘発物 質としては、グリセロール、エチレングリコールなどのポリオール、メタノール 、エタノール、プロパツール、イソプロパツール、ｎ−ブタノールなどの短鎖ア ルコール、グロルプロマジン、テトラカイン、フェニルエタノール、ベンジルア ルコール、フェニルブタノールなどの麻酔薬、その他ポリミキシン、ミニリン塩 基性たんばく質、コリン、アセチルコリン、トリス緩衝液や千オシアン酸塩など のカオトロピック塩（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ　５ａｌｔｓ）が挙げられる。しが し、除去しやすいこと、薬学的適合性の点から、エタノールが望ましい。本発明 に使用される誘発物質の量は、一定の大きさのリポソームから効果的にｒＦデシ ル生成できる量である。本発明のある種の実施態様では、本発明のＪＰデシルリ ポソームを生成するのに用いられる飽和脂質が自己誘発物質である場合、つまり 誘発物質を加えなくても飽和脂質が本発明のＩＦデシルリポソームを生成する場 合があるということに注目すべきである。本発明のこの点に関して例を挙げると 、特に、ジー０−ヘキサデシル−ホスファチジルコリン（ＤＨＰＣ）の使用がこ れにあたる。また、生物活性物質となりつる溶質も、それ自身が誘発物質になる こともある。

本発明のＩＦリポソームおよびゲルは、ビタミン、ホルモン物質、代謝拮抗物質 、抗菌物質、抗真菌性物質、局部麻酔薬、気管拡張薬、ベーターアドレナリン遮 断薬、抗高血圧薬、抗うつ薬、鎮痛薬、抗ヒスタミン薬、抗マラリア薬、鎮痛薬 、抗生物質、免疫原性物質（イムノゲン）、免疫モジュレータ、抗原、栄養素、 たんばく質、ペプチド、ヌクレオシド、オリゴおよびポリヌクレオチド、リボ核 酸（ＲＮＡ）　、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）　。

ＲＮＡとＤＮＡの誘導体、抗腫瘍薬、抗ヒスタミン薬、鎮静薬や催眠薬などの神 経薬理学的物質、ステロイド系や非ステロイド系の抗炎症薬、利尿薬、抗不整脈 薬、血管拡張薬、放射線造影剤、核磁気共鳴（ＮＭＲ）造影剤、抗ウィルス薬な ど、はとんどすべての溶質を含むことができる。本発明に使用する生物活性物質 としてはさらに、たんばく質、脂肪酸、炭水化物なとの栄養素が挙げられる９本 発明の望ましい実施例では、放射線造影剤、（ＮＭＲ）造影剤、ペプチド、セフ ァロスポリンなとある種の抗生物質が本発明に用いられる。本発明で用いられる 典型的な放射線造影剤としては、例えば、イオヘキソル、イオパミドル、インキ ュベート、イオトロラン、イオベルソル、イオタラム酸塩、イオジミド、イオジ パミド、イオペントール、イオジキサノール、メトリザミド、これらの混合物お よび薬物学的に許容し得るこれらの塩類が挙げられる。生物活性物質は天然でも 合成でも、半合成抗菌物質でもよい。典型的な抗菌物質としては、ゲンタマイシ ン、アミカシン、トブラマイシンなどのアミノグリコシドが挙げられる。本発明 の望ましい組成物では、ＩＦデシルよび／またはリポソームは、高い濃度の生物 活性物質を含んでいる。一般的に、本発明のＩＦデシルリポソームの生物活性物 質ｌ脂質の重量比は、約１：１０から約１５＝１とかなり高いものである。もち ろん、この重量比は典型的な比にすぎず、場合によっては薬物／脂質重量比をこ れ以上または以下にしなくてはならないこともある。

本発明の一部の実施態様では、溶質や生物活性物質が誘発物質として機能する場 合がある。このような場合は、本発明の他の実施態様のように、誘発物質／生物 活性物質を除去する必要はない。

本発明の使用に適した生物活性物質は、局所的または全身的に投与された場合に 本発明のリポソームやゲル内で生物活性を示すものである。本発明のＩＦデシル は、局所的または経口搬送が望ましい多数の生物活性物質を封入することができ る。この同じ物質は、局所的投与の場合、本発明のＩＦリポソームに封入するこ とができる。

本発明はまた、様々な濃度の生物活性物質を含むＩＦリポソームおよびゲルを生 成する方法に関するものである。本発明の方法では、音波処理、押出し、ホモジ ナイザー処理またはその他の方法で形成された、一定の大きさ、望ましくは直径 約０．４ミクロン未満、さらに望ましくは直径約０．０５ミクロン未満、最も望 ましくは直径約０．０２５ミクロンの、リポソームまたはＦＡＴ　ＭＬＶを、エ タノールなど適当な誘発物質の存在の下で融合する。

本発明のゲルとリポソーム内で使用された生物活性物質と脂質の相互作用に応じ て、この物質は、誘発物質を加える前や加えた後に加える。誘発物質を加えると 、本発明のＩＦデシルなる。生物活性物質を含むゲルは患者に投与することもで きるし、本発明のＩＦリポソームに転換することもできる。

本発明のＩＦリポソームを生成するには、必ずしも必要ではないが通常は、使用 される脂質の遷移温度より高い温度にＩＦデシル保ち、誘発物質を除去する。本 発明の方法に必要な温度は、本発明のＩＦデシルＩＦリポソームの混合物を形成 する脂質、溶質、誘発物質の混合物の物質特性を変化させる温度である。この結 果、生物活性物質を高い濃度で含むＩＦリポソームからなる組成物が生成される 。

この方法で生成されるＩＦリポソームの大きさは、一般的に約１００ミクロンか ら約０．０２５ミクロンの間で、望ましくは約２０ｕｍから約０．０２５　ｕ　 ｍで、生物活性物質を高い濃度で含むことができる。これらのＩＦリポソームは 、この分野の利用可能な技術を用いてさらに小さなサイズにすることもできる。

図面の簡単な説明 図ＩＡ、は二重層で可能なアシル鎖の異なる並び方を図式的に表したものである 。Ａは、対称性飽和リン脂質Ｃ（＋６）　：Ｃ（１６）ホスファチジルコリンを 含むリン脂質からなり、指状突起相合していない二重層を示す。Ｂは非対称性飽 和リン脂質Ｃ（１６）　：Ｃ（１０）ホスファチジルコリンからなる、一部が指 状突起相合した二重層を示す。ＣはＣ（＋６）　：Ｃ（１０）ホスファチジルコ リンからなる、混合指状突起相合二重層を示す。Ｄは有効量の誘発物質と結合し たＣ（＋６）　：Ｃ（１６）ホスファチジルコリンからなる完全に指状突起相合 した二重層を示す。

図ＩＢは、飽和リン脂質の指状突起相合に対する温度と誘発物質（エタノール） の効果を図式的に表したものである。

図２は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）リポソームの指状突 起相合を、リポソームの大きさとエタノールの濃度の関数として表したものであ る。指状突起相合はジフェニルヘキサトリエン（ＤＰＨ）の蛍光強度により決定 した。ＤＰＨは、脂質二重層に組み入れられた時蛍光が最大になる。指状突起相 合の結果、ＤＰＨの方向が変化し、同時に蛍光も減少する。

Ｆｏはエタノールが存在しない場合のＤＰＨ蛍光。Ｆはエタノールが存在する場 合のＤＰＨ蛍光。励起は３５１　ｎｍ　、発光は３８０−５８０止で検出され、 重量測定により定量した。

図３は、リポソームのマーカー母集団内に一緒に組入れられたＮＢＤ−ＰＥとロ ーダミン−ＰＥとの間の共鳴エネルギー伝達（ＲＥＴ）により判定された、大き さとエタノール濃度の関数としてＤＰＰＣリポソームの脂質混合を表したもので ある。

図４Ａは、゛４Ｃスクロースのカプセル封入パーセンテージをエタノール濃度の 関数として表したものである。図４Ｂは、ＤＰＰＣＩＦリポソームの内部容積を エタノール濃度増加の関数として表したものである。黒丸は“°Ｃスクロースの カプセル封入パーセンテージにより決定された内部容積、白丸はＣＡＴ　Ｉ　Ｅ ＰＲ測定値を示す。図４０は、１．０　Ｍの濃度におけるＩＦリポソーム形成失 敗の結果（うまく遠心分離されなかったＳ聞が残ったため）として回収されたＤ ＰＰＣのパーセンテージを表している。

図５は様々な脂質から形成されたＩＦリポソームの内部容積を゛Ｃスクロース（ 無地棒グラフ）、Ｔ四ＰＯＮＥ　ＥＰＲ（斜線部）　、　ＣＡＴ　Ｉ　ＥＰＲ法 　（網かけ部）を用いて示したものである。

図６は、ＤＰＰＣＩＦリポソームの内部容積を、エタノールを加える前のリポソ ームの初期サイズの関数として表したものである。これらのリポソームの内部容 積は、“Ｃスクロースのカプセル封入（無地棒グラフ）　、ＣＡＴ　ＩＥＰＲ法 （斜線部）　、　ＴＥＭＰＯＮＥ　ＥＰＲ法（網かけ部）により計算した。

図７はＤＰＰＧのＤＰＰＧ−ＤＰＰＣＩＦリポソームへの組込みを表したもので ある。

ＩＦリポソームの内部容積は、図７ＡでＤＰＰＧの分画モルの関数として表され ている（白丸は″゛ＣＣスクロースプセル封入により測定した容積、黒丸は拡張 作用物質Ｔ）：ＭＰＯＮＥ　ＥＰＲ技術により測定した容積）。図７Ｂは、Ｐｉ の回収パーセント（黒丸）と°４Ｃ標識のスクロース（白丸）をＤＰＰＧの関数 として表したものである。

図８は、内部容積とカプセル封入をＤＰＰＣの初期濃度の関数として表したもの で、図８ＡではＤＰＰＣの初期脂質濃度とともにスクロースのカプセル封入パー センテージも上昇することを示している。図８Ｂは、″４Ｃスクロース法（黒丸 ）およびＥＰＲ法（白丸）で測定したＤＰＰＣＩＦリポソームの内部容積を表す 。

図９は、脂質が（Ａ）　１０　ｍｇ／ｍｌの場合と（Ｂ）　２０　ｍｇ／ｍｌの 場合におけるＩＦリポソームのＭａｌｖｅｒｎ粒子サイズの分布を表したもので ある。

図１０は、ＤＰＰＣＩＦリポソームの形成に与えるコレステロールの影響を表し たものである。ＥＩＩＯＡは、ＩＦリポソームの「最終的な」コレステロール濃 度（丸）とカプセル封入された″“Ｃスクロースの最終的なパーセンテージ（四 角）を、エタノールを加える前のリポソームのコレステロール初期パーセントの 関数として表したものである。図１０Ｂは、ＤＰＰＣ−コレステロールＩＰリポ ソームの内部容積の減少を、コレステロール濃度の関数とじて表したものである （白丸は”Ｃスクロースカプセル封入法、白三角はＣＡＴＩ　ＥＰＲ法、黒丸は ＴＥＭＰＯＮＥＮ　ＥＰＲ法）。

図１１は、ＩＦリポソームの形成に与えるジオレオイルホスファチジルコリン（ ＤＯＰＣ）、（不飽和脂質）の影響をグラフで表したものである。図１１Ａは、 様々な量のＤＯＰＣを含むＩＦリポソームの内部容積を、′４Ｃスクロースカプ セル封入法（白四角）とＴＥＭＰＯＮＥ　ＥＰＲ法（黒四角）により測定したも のである。図１１Ｂは、様々な量のＤＯＰＣを含むＩＦリポソーム形成後の脂質 回収率を示したものである。

図１２は、ＤＰＰＣのＴｍ以上および以下の温度における脂質インキュベーショ ン時間（５，３０，６０，１２０分）と、インキュベーションの方法〔室温（Ｒ Ｔ）または５０℃］が、その結果形成されるＩＦリポソームの内部容積に与える 影響をヒストグラムで表したものである。この場合、特に断らないかぎり、室温 （ＲＭ　ｔｅｍｐ）は２５℃を指す。

災更公昆胆皇五貫 本発明の説明を理解しやすいように、以下に用語の定義を述べる。

この明ｍ書で用いられるｒ指状突起相合ノおよび「指状突起相合した」という用 語は、二重層内の一つの脂質のアシル鎖部分が、脂質二重層内の別の層に互いに 貫通しあっている脂質二重層を表す。指状突起相合という用語は、完全指状突起 相合、混合指状突起相合、部分指状突起相合を含む。

図ＩＡの（Ｄ）に示したように、完全指状突起相合リポソームには、脂質のアシ ル鎖が、脂質二重層の幅の全部または一部を貫通している指状突起相合リポソー ムが含まれる。混合指状突起相合リポソームには、ＥｍｌＡの（Ｃ）で示したよ うに、非対称性リン脂質のアシル鎖、一般には長い方のアシル鎖が、二重層の長 さいっばいに伸びているのに対し、短い方の鎖は、図ＩＡの（Ｃ）に示すように 二重層の中央面で末端どうしが向き合っているような指状突起相合リポソームが 含まれる。混合指状突起相合リポソームのもう一つの例は、リポソームの部分が 完全または一部指状突起鉗合しており、かつ指状突起相合していない部分も共存 しているリポソームである。部分指状突起相合リポソームには、図ＩＡの（Ｂ） に示したように、非対称性リン脂質のアシル鎖が対になっていて、一つの二重層 の長い方のアシル鎖がもう一つの二重層の短い方のアシル鎖と対になるような、 指状突起相合リポソームが含まれる。

この明ｍ書で用いられる［誘発物質Ｊとは、リポソームの脂質二重層水相の境界 部分に位置する限られた大きさの両親媒性の分子で、本発明の指状突起融合ゲル （場合によっては液体である）を生成する分子を表す。この語はまた、「自己誘 発物質」として作用する生物活性物質などの脂質および／または溶質も指す。静 水圧もまた「誘発要因」である。

この明細書で用いられる「指状突起融合ゲルＪ（ＩＦデシ）とは、一定の大きさ にしたリポソームを融合するのに充分な量の誘発物質と化合した時にできる生成 物を表す、このようにしてできた脂質シートは本発明の目的とする融合ゲルであ り、この生成物の粘性は様々で、液体、ゲル、または固体に近い非常に高い粘性 を持つ場合もある。

この明細書で用いられる［指状突起融合リポソームＪ（ＩＦリポソーム）とは、 必ずしもではないが通常はリポソーム遷移温度（Ｔ＋＊）以上の温度で、またＩ Ｆリポソームを生成する温度でインキュベートしたＩＰデシからできたリポソー ムを表す。誘発物質は、必ずしもではないが付随的に、ＩＦデシから除去する。

リポソームに自己続発性脂質が含まれる場合、または溶質が誘発物質であるよう な一部の実施態様では、誘発物質は除去されない。ＩＰリポソームには、生物活 性物質　脂質比が約１：１０から１５＋１であるような生物活性物質などの溶質 が高い濃度で含まれている。

この明細書で用いられる「溶質」とは、本発明のＩＦデシやリポソームに捕捉さ れた緩衝剤や溶媒を含めた化学物質を示す。溶質には、緩衝剤、塩類、毒物、微 生物や細菌、農薬、殺虫剤、除草剤、殺菌剤、乳化剤、化粧品、単細胞生物や、 とくに生物活性物質などの多数の化学物質が含まれる。

この明細書で用いられる「生物活性物質」とは、植物や、特にヒトを含む、哺乳 類などの動物など、生体に投与したときに生物学的活性を示す化学物質などの物 質を表す。生物活性物質には、薬物、栄養素、および上記と下記に示された物質 が含まれる。

この明細書で用いられる「飽和脂質」という語は、本発明の指状突起融合ゲルと リポソームを生成するために使われる脂質を表す。飽和脂質には、飽和した、つ まり二重結合を含まない、対称性および／または非対称性のアシル側鎖、トラン ス配置内に不飽和の炭素−炭素二重結合がある不飽和側鎖を有する脂質、および シス配置内に不飽和の炭素−炭素二重結合や、例えば５ｏｐｃやＰＯＰＣなどの 混合脂肪酸脂質がある不飽和側鎖を持つある種の脂質が含まれるが、これに限定 されるものではない。

この明細書で用いられるｒ指状突起融合脂質を含む組成物」という語は、本発明 のＩＰデシとリポソームを表す。

本発明は、一定の大きさ、望ましくは直径約０．４ミクロン未満、さらに望まし くは直径約０．０５ミクロン未満、最も望ましくは直径約０．０２５ミクロンの リポソームと、溶質と組合せてリポソームを融合するのに有効な量の誘発物質か ら構成される脂質に関するものである。最初のリポソームはＦＡＴ　ＭＬＶでも よい。一部の実施態様には、溶質が生物活性物質である場合もある。本発明の組 成物は、例えば、生物活性物質：脂質の比率が約１．１０から１５＝１と、高い 濃度の生物活性物質を含むことができる。

本発明では、本発明のＩＦデシとリポソームを生成する、一定の大きさにしたリ ポソームは、両性イオン性、陽イオン性、陰イオン性の脂質、１２〜３５の炭素 原子を有する脂肪アシル鎖からなるリン脂質で、そこに飽和（ｄｉｓａｔｕｒａ ｔｅｄおよび部分飽和した）および不飽和で、極性または非極性の脂質とリン脂 質を含むものから形成されるのが望ましい。

例えば、本発明の飽和脂質には、シミリストイルホスファチジルコリン、ジステ アロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、シミリ ストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステ アロイルホスファチジルセリン、シミリストイルホスファチジルエタノールアミ ン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファ チジルエタノールアミン、シミリストイルリン酸、ジステアコイルホスファチジ ン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、シミリストイルホスファチジルイノシ トール、ジステアロイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファ チジルイノシトール、水素化大豆ホスファチジルコリン、水素化大豆レシチン、 ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジー０−ヘキサデシルホスファチ ジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホス ファチジルグリセロール、シミリストイルホスファチジルグリセロールが特に挙 げられるが、これに限定されるものではない。

その他の飽和脂質には、飽和した、つまり二重結合を含まない、対称性および／ または非対称性のアシル側鎖、脂質トランス配置内に不飽和の炭素−炭素二重結 合がある不飽和側鎖を持つ脂質、およびシス配置内に不飽和の炭素−炭素二重結 合や、例えば５ｏｐｃやｐｏｐｃなどの混合脂肪酸脂質がある不飽和側鎖を持つ ある種の脂質が挙げられるがこれらに限定されるものではない。

飽和対称性脂質に含まれるその他の脂質には、例えば特に、単独でまたは化合し た、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ） 、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホス ファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、スフィンゴミエ リン（ＳＰＭ）　、カルシオリビンなど混合銀組成物を含む合成または天然のリ ン脂質など、例えば、脂質を形成するその他のリポソームが挙げられる。

上記の脂質のほかに、例えば、ｎ−オクタデシル−２−メチルホスファチジルコ リン、Ω−オクタデシルホスファチジルコリン、】−ラウリルプロパンジオール −３−ホスホコリン、エリスローＮ−リグノセロイルスフィンゴホスファチジル コリン、コレステロール、およびその水溶性誘導体、例えばヘミコハク酸コレス テロールとアルファトコフェロール、およびその水溶性誘導体、例えばヘミコハ ク酸トコフェロール、ガングリオシド、グリコリピド、グリコスフィンゴリピド など、様々なリゾ脂質を含む脂質も本発明の組成物に含まれる。当業者には、本 発明による組成物を生成するための本出願の開示の範囲内で、本発明の組成物に 含まれる脂質には様々な量と種類があることが理解できると考えられる。

本発明の組成物では、少なくとも一つの飽和脂質をかなりの量含んでいる一定の 大きさのリポソームは、誘発物質を加えることにより指状突起融合する。一般に 一つの飽和リン脂質を含む本発明の一定の大きさのリポソームは、有効量の指状 突起相合誘発物質と化合させることにより、完全、一部または混合指状突起相合 する。理論的に限定されることはないが、誘発物質には、ヘッドグループ会合性 水分子の一部の置換を起こし、一般に、ヘッドグループの表面積を増加させる機 能があると考えられている。選ばれた脂質が誘発物質の存在の下で完全な指状突 起相合をするのが望ましいが、本発明の範囲には、完全指状突起相合でない、つ まり混合または部分指状突起相合の脂質も含まれている。本発明に用いられる典 型的な指状突起相合誘発物質としては、たとえば、メタノール、エタノール、プ ロパツール、イソプロパツール、ｎ−ブタノールなどの短鎖アルコール、グリセ ロールやエチレングリコールなどのポリオール、クロルプロマジン、テトラカイ ン、フェニルエタノール、ペンシルアルコール、フェニルブタノールなどの麻酔 薬、萌述の物質のほか、とくに、トリスのような緩衝液や、チオシアン酸塩５Ｃ Ｎ−などのカオトロピック塩類も挙げられる。

場合によっては、本発明のＩＦデシやリポソーム形成に使用される飽和脂質が自 己誘発物質の場合もある。つまり、これらの脂質は、溶質の存在の下で様々な温 度で脂質を混合することにより、化学的な誘発物質（例えばＤＨＰＣ）を加える 必要なしに、指状突起相合させてＩＦデシとリポソームを形成する。また、非常 な高圧を加えて、誘発物質を含む必要なしに指状突起相合を起こせる場合もある 。

一般に、本発明の組成物には、一定の大きさにしたリポソームの融合に効果的な 量の誘発物質が含まれている。リポソーム融合を起こすために用いられる誘発物 質の量と種類は、使用するリポソームの種類の関数として変化する。しかし、一 般に、使用される誘発物質の量は、一定の大きさにしたリポソーム、誘発物質、 および溶質の組合せを含有する溶液の総重量の約１．０−５０＄である。通常の 当業者は、本発明の指状突起相合ゲルとリポソームを生成するには、技術および 本出願の開示の範囲内で誘発物質には様々な濃度が考えられることが理解できる と思われる。

理論的に限定されることはないが、一定の大きさにしたリポソームは、小さな曲 率半径により二重層に加えられた歪を解くため、ある濃度の誘発物質で脂質シー ト（ゲル）に融合すると考えられている（例えば、図３参照）。その結果、生成 された指状突起融合ゲルは高濃度の溶質を捕捉することができる。これには、他 の方法ではリポソームに高い溶質−脂質率で捕捉することができない物質のカプ セル封入も含まれる。本発明の方法では、ＩＦデシが、必ずしもではないが通常 はそのＬベータＩ−Ｌアルファ遷移温度（Ｔ＋ａ）より高い温度で、または、Ｉ Ｆリポソームが形成されるような混合物の物質特性を変化させるような温度で、 望ましくは（しかし必須ではない）誘発物質を除去して、捕捉体積の大きいリポ ソームを生成する。

このリポソームの大きさは、溶質、リポソーム、誘発物質の関数として変化する が、一般には、約１００　ｕｎから、さらに望ましくは２０ミクロンから約０． ０２５ミクロンの範囲にある。

理論的に限定されることはないが、指状突起融合は、脂質二重層をリポソーム形 成中の摂動の影響から守る働きがあり、通常なら膜と相互作用して捕捉が難しい 物質を捕捉するのに使用できると考えられている。例えば、本発明の指状突起融 合リポソームは、膜と相互作用する傾向があるため高い濃度で捕捉するのが非常 に難しいアミノグリコシドを高い濃度で捕捉するのに使用されてきた。ＩＦリポ ソームは、ゲンタマイシンを薬物／脂質率約１・２　（ｗｏｗ）で捕捉できるが 、典型的な処理をした小さな多層ラメラリポソーム（ＳＰＬＶ）は、薬物／脂質 率約１：１０　（ｗ：ｗ）でゲンタマイシンを捕捉する。

本発明の指状突起融合ゲルとリポソームの生成には、一定の大きさ、直径約０． ４ミクロン以下、さらに望ましくは直径約０．０５ミクロン以下、最も望ましく は直径０．０２５ミクロン未満のリポソームをまずつくることが含まれる。ＦＡ Ｔ　ＭＬＶを使用することもあり、場合によってはこれより大きいリポソームを 使用することもある。すでに利用可能な技術、および以下に詳細に記す方法を用 いて、一定の大きさのリポソームを生成することができる。典型的には、リポソ ームはまず、例えばクロロホルムなどの有機溶媒内で脂質溶液を真空乾燥により 、丸底の、またはその他の適当なフラスコや容器内で薄い膜状にし、この脂質膜 を例えば水性緩衝液や食塩水などの水性溶剤で水和して行う。または、リポソー ムは、乾燥脂質粉と、望ましくは例えば食塩水や水性緩衝剤などの水性溶剤の混 和物から形成することもできる６ 次に、音波処理、押出し、ホモジナイザー処理などの既に知られた技術、および 以下に説明する方法によりリポソームを一定の大きさにする。リポソームが一定 の大きさになったら、溶質、望ましくはカプセル封入される生物活性物質をこの 水性溶剤に混合するのが普通である。溶質がリポソームと相互作用をするか否か により、溶質を捕捉するには一般的に２つのアプローチ法がある。溶質がリポソ ームと相互作用をしない場合は、指状突起相合させる一定の大きさのリポソーム を形成した後に水様溶剤または水性／緩衝溶剤と溶質を混合する。リポソームと 相互作用する溶質の場合は、指状突起融合ゲルが形成されてから溶質を水性溶剤 に混合するのが一般的である。

もちろん、当業者には、本発明のＩＦデシとリポソームの個々の組成物が加えら れる順番には様々な変化が考えられ、捕捉する溶質の種類や使用する飽和脂質の 種類により異なることが理解されると思われる。

本発明の溶質をカプセル封入するために使用される脂質の最終的な濃度は、希望 の溶質の種類や使用する脂質の種類の濃度の関数として変化するが、一般的には 、水性溶剤内の薬物と脂質の重量比の範囲は約５０＋１−１．：１０（ｌであり 、最終的な脂質の濃度の範囲は約５−１００　ｍＭである。本発明の指状突起融 合ゲルとリポソーム内の薬物と脂質の最終的な重量比の範囲は、約１：１０−１ ５：ｌである。

一定の大きさのリポソームが形成されたら、水性溶剤に誘発物質を加える。加え られる誘発物質の量は、一般に（脂質、溶質、誘発物質を合わせた重量の）約１ ．０重量２から約５０重量％の範囲で変化する。誘発物質としてエタノールを使 用する場合、含まれるエタノールの量は、一般に約５重量％　（１，０Ｍ）から 約２０重量％（４，０Ｍ）であり、グリセロールの場合は、使用される誘発物質 の量は約９０−１００重量％にもなる。その他の誘発物質が含まれる量は異なる 。エタノールの場合、最終的なエタノール濃度は、約０．５０−１０．０　Ｍｏ １ａｒの範囲に低下し、約１．７５−４．０　Ｍｏ１ａｒの範囲が望ましい。

効果的な量の誘発物質の存在により、一定の大きさにしたリポソームは融合し、 その結果脂質の融合シートができる。この方法で生成されたＴＦデシは、例えば 、柔らかいゼラチン内にカプセル封入した製剤やその他の経口投与剤として、局 所的にまたは経口投与することができる。また、このゲルをさらに加工して本発 明のＩＦリポソームを生成することもできる。

本発明のＩＦリポソームを生成するため、この混合物はゲル形成に充分な時間、 ある温度でインキュベートする。典型的には、この時間は約１分から約１時間の 範囲内にある。その後、必ずしもではないが通常は、温度を脂質のＴｍ以上まで 上げ、約１分から約１時間そのままにする。必要なインキュベーション温度は、 混合物のＴｒｒｒであるが、与えられた脂質、溶質または誘発物質の混合物の温 度は、混合物の物質特性を変化させ、それにより本発明のＩＰリポソームが生成 されるような温度である。このインキュベーション温度を保ちながら、蒸発（特 に誘発物質がアルコールの場合）や、正圧窒素（例えば混合物内に、一般的には Ｎ、を気泡導入する）や、希釈により誘発物質を除去する。これにより、大きさ の範囲が一般的に約０．０２５−１００　ｕｍ、望ましくは０．０２５−２０ミ クロンの範囲にあるＩＦリポソームが生成される。必要であればカプセル封入さ れなかった薬物を溶剤から除去することもできる。上記の方法で生成されたＩＦ リポソームは、大きさの様々な、または大きさが均質なリポソームを生成するた めにさらに小さくすることができる。

押出し法の他にも、音波処理やホモジナイザー処理により、ＩＦデシやリポソー ム法用の初期リポソーム（誘発物質を加える前）や結果としてできるＩＦリポソ ームのサイズを小さくすることができる。音波処理では、音波エネルギーを用い て大きなリポソームを粉砕または切断し、自然に小さなリポソームに再形成させ る。例えば、Ｃｈａｐｍａｎら、ＢＢＡ、　１６３．２５５　（１９６８）を参 照。音波処理は、リポソーム懸濁液を含むガラス管を槽型音波処理器でつくられ た音波中心点に浸して行う。または、リポソーム懸濁液を直接接続したチタンプ ローブの振動により音波エネルギーを発生するプローブ型音波処理器を用いるこ ともできる。

ホモジナイザー処理では、大きなリポソームを破壊して小さなリポソームにする 切断力は、例えば、Ｐｏ１ｙｔｒｏｎ　（Ｂｒｉｎｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅ ｎｔｓ　Ｃｏ、、　Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＵＳＡ）などの 回転ステータ型装置や、マイクロフリュイダイザ−（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓ　Ｃｏｒｐ、、　Ｎｅｗｔｏｎ、　ＭＡ、　ＵＳＡ）などのステーターステー タ型装置や、その他細胞を破壊するために一般に使用されている装置により得る ことができる。上記の方法はすべてＩＦリポソームの破壊を包含するため、ＩＦ リポソームをこのような方法で処理すると捕捉された溶質は失われる。しかし、 リポソームのサイズ縮小作業前にリポソーム懸濁液から捕捉されていない溶質を 取り除かないでおけば、この損失を最小にすることができる。

指状突起融合させるリポソームのサイズを小さくしたり、処理完了後に一定の大 きさのリポソームを生成するには他にも多くの方法がある。その方法としては、 逆相蒸発、融合処理、ホモジナイザー処理、音波処理、マイクロフリュイダイゼ ーション、溶剤希釈、およびこれらの方法の組合せがあげられる。リポソーム生 成のためのこれらの方法のうちのいくつかやその他の方法については、Ｌｉｐｏ ｓｏｍｅｓ、　Ｍａｒｃ　Ｊ−０ｓｔｒｏ、　ｅｄｌ、　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋ ｋｅｒ、　Ｔｎｃｌ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　＋９８３の第−章に見ることがで き、その関係部分はここでも参考のために記載されている。一定の大きさのリポ ソームはまた、押出し処理によっても生成できる。

押出し処理では、一定の大きさのリポソームを生成するために、リポソームは、 一般的には約３０　ｎｕから約１　μ麿の大きさの孔を持つフィルターを通過さ せ、直径約３０　ｎｍから約１μｍのリポソームを生成する。リポソームが押出 されるフィルターの孔の大きさは、約１０ｏ　ｒ＋ｍ−約１ミクロンであるのが 望ましい。一般的にフィルターはポリカーボネート製であるが、フィルターは、 リポソームと相互作用せず、充分な圧力の下で押出しをするのに充分に強力な耐 久性のある物質であれば何でもよい。一般的に、本発明の望ましい押出し処理に おける高圧に耐えられるよう、フィルターは「直通」フィルターが望ましい。ま た、　「湾曲道」フィルターも使用できる。本発明の望ましい実施態様において は、指状突起融合的のリポソームを５０−１００　ｎｍのポリカーボネートフィ ルターを通して押出し、直径５０−１００　ｒｕｎのリポソームを生成する。

指状突起融合させるリポソームの大きさを一定にするため、利用可能な押出し処 理技術を使用することができる。押出し処理は、高圧の下で継続してまたは一回 行われる。本発明で使用するのに特に望ましい押出し処理は、１９８６年１月１ ６日に公開されたＣｕ１ｌｉｓらのＰＣＴ出願ｐｃｒ７ｕｓｓｓ１０＋ｒ６＋、 公開番号Ｗ０８６１００２３８、名称「リポソーム生成のための押出し技術」に 説明されており、ここでも参考のために導入されている。

本発明のリポソームを、融合前または後に一定の大きさにするその他の方法とし ては、１９９０年ｌＯ月５日受理の共通に譲渡された共係属米国特許出願、名称 「リポソーム押出し処理」、米国出願第５９３．２００号で開示された、枝分か れした孔の型の酸化アルミニウム多孔フィルターを通してリポソームを押出す方 法による、例えば、Ａｎｏｔｅｃ　（登録商標）フィルターなど非対称フィルタ ーを用いたろ適法があげられ、関連部分はここでも参考のために記載した。

または、リポソームは、ホモジナイザー処理法や、例えばＧｉｆｆｏｒｄ　Ｗｏ ｏｄコロイドミルなどのコロイドミルを用いて一定の大きさにすることもできる 。リポソームは、適当な大きさと均質性が得られるまで一回またはそれ以上ミル にかけ、隅ｃｏｍｐ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ整粒器やＭａｌｖｅｒｎ　Ｐａｒｔｉｃ ｌｅ整粒器を用いてサイズ分布の分析を行う。または、上で述べたように、リポ ソームを同様にホモジネートするミクロフリュイダイザー装置にかけてもよい。

必要であれば、できあがったリポソームは、接線流フィルター処理など、既知の 分割技術を用いて、いくつかの母集団に分割することもできる。このように、大 きさによってリポソームを分類する処理については、１９８８年１月２８日受理 の、共通に譲渡された共係属米国特許出願、名称「サイズによる粒子の分類法」 、出願番号第２２５．３２７号に開示されており、関連部分はここでも参考のた めに記載した。

この処理では、大きさの異なるリポソームの母集団を一つまたはそれ以上の接線 流フィルターを通すことにより、サイズの上限および／または下限を持つサイズ 分布ができる。例えば、サイズの異なる２つのフィルターを用いた場合１例えば 、孔のサイズが５ｕ＋＊の第一フィルターを通過した５゜Ｏｕｍ未満のリポソー ムはる液の中に入り、次に、孔のサイズがさらに小さい第二フィルター、例えば 孔のサイズが２．Ｏｕｍのフィルターを通過する。

一様なリポソームを含んでいる。フィルターの孔の大きさを変えると、サイズ上 限および下限が異なる母集団が得られる。

誘発物質の存在の下で指状突起融合されるリポソームの大きさは、望ましくは直 径約０．４　ミクロン以下、さらに望ましくは直径約０．０５ミクロン以下、最 も望ましくは直径０．０２５ミクロン以下である。または、本発明の一定の大き さにした初期リポソームはＦＡＴ　ＭＬＶでもよい。本発明の一般的な方法によ り生成されたＩＦリポソームの大きさは、一般的に約＋００　ｕｎから、さらに 望ましくは約２０ミクロンから約０．０２５ミクロンの範囲にあり、一般的には 約２−２０　ミクロンの範囲にある。このようにしてできたＩＦリポソームは、 上記音波処理、ホモジナイザー処理、押出し技術により様々な大きさのリポソー ムを生成するためにさらにサイズを縮小させることができる。しかし、この本発 明のＩＦリポソームのサイズを縮小することができるが、サイズ縮／Ｊ％を行う と、しばしばリポソームから生物活性物質が失われることを注意しなくてはなら ない。したがって、例えば、前述の押出し処理やその他音波処理やホモジナイザ ー処理など、生成するリポソームのサイズを変える処理によりさらにサイズ縮小 を行うＩＦリポソームがカプセル封入する生物活性物質の濃度は低い可能性があ る。

本発明で使用される生物活性物質としては、特に、ビタミン、ホルモン物質、代 謝拮抗物質、抗菌物質、抗真菌性物質、抗生物質、たんばく質、ペプチド、リボ 核酸、デオキシリボ核酸、ヌクレオチド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、 抗ヒスタミン薬、鎮静薬や催眠薬などの神経薬理学的物質、ステロイドや非ステ ロイド系の抗炎症薬、利尿剤、抗高血圧薬、抗不整脈薬、イムノゲン、免疫モジ ュレータ、避妊薬、放射線造影剤、核磁気共鳴（ＮＭＲ）造影剤、抗ウィルス薬 、血管拡張薬があげられる。本発明の望ましい実施態様においては、放射線造影 剤、ＮＭＲ造影剤、ペプチド、自然の、合成または半合成のセファロスポリン、 アミノグリコシドなどある種の抗菌物質が本発明に用いられる。本発明で用いら れる典型的な放射線造影剤としては、例えば、イオヘクソル、イオパミドール、 イオクソグレート、イオトロラン、イオベルソル、イオタラム酸塩、ヨウ化物、 イオジバミド、イオブロミド、イオベントール、イオパミド−ル、メトリザミド 、これらの混合物および薬物学的に受容可能なこれらの塩類が挙げられる。典型 的な抗菌物質としては、ゲンタマイシン、アミカシン、トブラマイシンなどのア ミノグリコシドが挙げられる。

本発明に用いる生物活性物質は１局所的または全身的に投与された場合好ましい 生物活性を示す物質で、本発明の組成物に対して安定しているものであれば適当 である。皮膚に作用するために局所的に投与される物質には、サリチル酸、レゾ ルシノール、フェノール、レチン酸、およびその類似体がある。本発明で用いら れるその他の物質には、例えば、抗原やワクチンなどのある種の除感作物質、ビ タミン、アミノ酸、必須脂肪やミネラルなどの栄養素、樹脂類似物質、ある種の アルキル化物質などの抗新生物剤、抗腫瘍剤が特にあげられる。

本発明で用いられる生物活性物質には、ヘンゾジアゼビン、解熱剤、抗痙管渠、 かゆみ止め、交感神経作用薬、うっ血除去薬、トランキライザ、抗痙管渠、心臓 作用薬、その他の心臓薬、抗嘔吐薬、鎮静薬と催眠薬、ステロイド薬、プロゲス テロン薬、局部麻酔薬、抗生物質が含まれる。特に抗真菌物質などその他の抗菌 物質も本発明で用いることができる。

上述の生物活性物質、特にその薬学的に許容し得る塩類は、本発明で使用できる 。上述の物質と本発明の組成物に用いられた量の混和性の決定は、通常の製剤技 術の範囲内で行うことができる。個々の薬学的物質の安定性と応用性は、当業者 が充分対応できる。

個々のケースで使用される生物活性物質の実際の望ましい量は、薬理学的強さま たは疾病状態の程度および個々の患者について期待される生物活性物質の薬理動 態により、変えることが必要である。与えられた宿主に対する投与量は、従来の 方法、つまり、従来の適切な薬理学的プロトコールにより、対象の生物活性物質 の活性の違いを従来法に比較することにより、決定できる。

本発明のＩＦデシとリポソームは、ヒトなどの哺乳類を含むどの動物にも投与で きる。苦痛の治療のためにヒトに投与する場合、そのヒトの患者に対する適当な 投与量は処方箋を書く医師が最終的に決定するが、これは、その患者の年齢、体 重、反応性や、患者の症状の性質や程度により異なる。

本発明により、様々なリポソームの薬物濃度を可能にする方法が利用可能になる 。

本発明の組成物の投与形態により、この組成物が搬送される生体内の部位が決定 される。例えば、感染の特別な部位への送達は、局所投与（感染が外側、つまり 目、皮膚、耳、または傷や火傷の部位の場合）や、上皮や粘膜皮膚（例、鼻、口 、膣、直腸、胃腸、粘膜など）からの吸収により最も容易に行うことができる。

このような局所投与は、クリームや軟膏の形で行える。本発明の指状突起融合ゲ ルは局所的に使用するのが望ましい。

しかし、本発明のＩＰデシは、口内または胃腸管内の液に接触すると脂質がその 場でリポソームを形成するようなものであれば経口投与することもできる。

生物活性物質を含むＩＦリポソームは単独で投与されることもあるが、一般的に は、意図する投与経路や標準薬学慣例を考量して薬学的担体と混合して投与し、 それにより薬学的組成物を形成する。本発明のＩＦリポソームは、例えば、静脈 内、筋肉内、皮下注射など、非経口的に投与することもできる。非経口投与する 場合、これらのリポソームは無菌水性溶剤の形で使用するが、溶剤を等張にする ため、例えば、充分な塩類、グルコース、ブドウ糖などその他の溶質を加えるの が最も良い。

本発明のリポソームは経口投与する場合は、錠剤、カプセル、ロゼンジ、トロー チ、粉薬、シロップ、エリキシル剤、水性溶剤、懸濁液などの形で使用される。

錠剤の場合、使用できる担体には、乳糖、クエン酸ナトリウム、リン酸塩が含ま れている。澱粉などの様々な分解物、また例えば澱粉などの潤滑剤を使用するこ ともできる。カプセルの形で経口投与する場合に有効な希釈剤は、乳糖および高 分子量のポリエチレングリコールである。

水性懸濁液で経口投与が必要な場合は、ある種の甘味料および／または香料を加 えることもできる。

本発明で使用する生物活性物質には、上述したものが含まれるがこれに限定され る訳ではなく、その薬学的に許容し得る塩類も含まれる。本発明の組成物に用い られる上述の物質との混和可能性やその量は、製剤分野における当業者が充分決 定できる。個々の薬物の安定性と応用性は、当業者が充分決定できる範囲である 。個々のケースで使用される生物活性物質の実際の望ましい量は、薬理学的強さ または疾病状態の程度および個々の患者について期待される生物活性物質の薬理 動態により、変えることが必要である。与えられた宿主に対する投与量は、従来 の方法、つまり、従来の適切な薬理学的プロトコールにより、対象の生物活性物 質の活性の違いを従来からの方法により比較することにより、決定できる。

１Ｆリポソームは、例えば生物活性物質を組入れるために遠隔装填することもで きる。必要であれば、ＩＦリポソームは、Ｊａｎｏｆｆら、米国特許第４，８８ ０、６３５号または５ｃｈｎｅｉｄｅｒら、米国特許Ｎｏ、　（ＴＬＣ−１６３ ）の処理により脱水することができる。

以下の例は、本発明を説明するために挙げるもので、いかなる点においても本発 明の応用の範囲を制限するものと解釈してはならない。

去五輿上 ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ、Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏ１ａｒ　 Ｌｉｐｉｄｓ。

Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、　Ａｌａｂａｍａ、　ＵＳＡから入手）を含有するリポ ソームが、ＤＰＰＣの濃度が２０ｍＭであり、更に０．０４　ｍＭのジフェニル ヘキサトリエン（ＤＰＨ，Ｍｏ１ｅｃｕ１．ａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、　Ｅｕｇｅｎ ｅ、　Ｏｒｅｇｏｎ、　ＵＳＡから購入）を含む濃度に１ｌＩｌの水性緩衝液中 で形成された。リポソームが形成された後、水性溶液に対するその最終的な濃度 が０．３　Ｍ　−２，５Ｍになるように、エタノールを加えた。

ＤＰＩが発する蛍光は、リポソームの二重層に組入れられた時に最大になる。指 状突起相合の結果、二重層膜からＤＰＨの再配向が起こり、同時に蛍光が減少す る。図２に示したように、すべてのリポソームについて、エタノールの濃度が高 い方が指状突起相合の効果が高い。エタノールの濃度が同じ場合は、リポソーム の直径が大きい方が指状突起相合の程度が大きい。

図２において、Ｆｏ　＝エタノールが存在しない場合のＤＰＨ蛍光。Ｆ＝エタノ ールが存在する場合のＤＰＨエタノール。励起＝３５１ｎＩ１１０発光は３８〇 −５８０ｎｍで検出され、重量測定により定量化した。

実施例２ リポソームの脂質混合 一定の大きさにしたＤＰＰＣリポソームの脂質混合は、リポソームの大きさと誘 発物質の濃度の関数として決定された。ＤＰＰＣを含有するリポソームを、２０ ｍＭのＤＰＰＣを含有する水性緩衝液中で作製した。１ｍｌの水性緩衝液中に９ ９重量％のＤＰＰＣｌｏ、３５重量％のＮ−ペンジルジホスファチジルエタノー ルアミン（ＮＢＤ−ＰＥ）、０．６５重量％のローダミン−ホスファチジルエタ ノールアミンを含むリポソームのマーカーグループを形成した。これらのプロー ブは供与部−受容部の対を形成する。ＮＢＤ基は４６５　ｎｍで励起し、共鳴エ ネルギー転移（ＲＥＴ）は、自身が距離依存現象により励起されるロダミン受容 部により消光した。これらのリポソームを、に１０の割合でブランクのリポソー ムと混合した。発光スペクトルは４８０−６８０　ｎｍで記録された。エタノー ル濃度の関数としての様々な大きさのＤＰＰＣリポソーム内の脂質混合は、ＮＢ Ｄ基からローダミン基へのＲＥＴの損失により決定できる。０．３５モル％のＮ ＢＤ−ＰＥと０．６５モル％のロダミンーＰＨのリポソームを調製することによ り、それぞれを０．０３５と０．０６５までそのモル％を連続して減少させなが ら、標準曲線を描いた。二の１／１０混合実験とこの標準曲線を直接比較するこ とにより、脂質混合の程度が示され、これは即ち膜融合度を示すものである。

実施例３ 多数のリポソーム製剤を用意した。捕捉された水相の量を決定し、調製した個々 のリポソームの「タイプ」について比較した。その結果は、以下の表１に示した 。

ＩＦリポソームを調製するため、以下に述べるように、水性緩衝ｆｉ１ｍｌあた りの最終的なりＰＰＣ４度が２０　ｕｍｏｌになるよう、ＭＬＶを準備した。次 にＭＬＶを５０’Ｃの種型音波処理器で半透明になるまで音波処理した（ＳＵＶ ）。

ＳＵＶが室温まで冷えた後、最終的な水性懸濁液における最終的な濃度が２゜０ Ｍになるようにエタノールを加えた。表１のＡ１とＡ２では、エタノールは希釈 および洗浄により除去した。Ｂ１と８２では、エタノールは、窒素を用いた正圧 置換により除去し、その後サンプルを希釈、洗浄した。サンプルＣの初期脂質濃 度はＡとＢの半分で、エタノールの除去はＡの場合と同様に行った。

ＭＬＶを調製するため、１００　ｍｇのＤＰＰＣを５ｍｌのクロロホルムに混合 し丸底フラスコ内に入れて０．０４　ｍＭのジフェニルヘキサトリエンを含む１ 厘１の水性緩衝液を加え１回転させながら蒸発させ、乾燥した薄膜を作った。そ の後、この脂質混合物を激しく撹拌し、壁からすべての脂質を取り除いた。

ＦＡＴ　ＭＬＶは、１９９０年１２月４日に発行されたＢａｄｌｙらの米国特許 第４，９７５゜２８２号で説明された方法で、上述した洗浄していないＭＬＶを ５回の凍結−融解サイクルにかけて形成した。

５ＰＬＶは、上記ＭＬＶの所で述べたようにＤＰＰＣの乾燥薄膜を作り、その脂 質膜を５ｍｌのエチルエーテルに溶かし、それに０．５社の水性緩衝液を加えて 準備した。次にＬｅｎｋらの米国特許第４，５２２，８０３号で説明されたよう に、この混合物を種型音波処理器で乳化し、窒素流を用いてこの乳化物を撹拌し 同時にエーテルを除去した。エーテルの除去は、臭いが検出されなくなるまで続 けた（約５分間）。脂質混合物はＩａｌの水性緩衝液内で再懸濁した。

ＭＰＶは、米国特許第４．５８８．５７８号に説明されているように、単相のＤ ＰＰＣｌｏｏ　ｍｇと５ｍｌのクロロホルム、５ｍｌのエタノール、０．５　ｍ ｌの水性緩衝液を回転蒸発で乾燥させ、懸濁した膜をＩａｌの水性緩衝液内で激 しく撹拌して再懸濁して形成した。

捕捉した水性液の体積を決定するため、リポソーム懸ｆｉｇ！ｉ、０．９８　ｍ ｌに１０ｍＭの４−トリメチルアンモニウムＴＥＭＰＯ（４−ＴＭＡＴ）溶ｇ１ ２０ｕｌ　を加えた。次にサンプルを激しく攪拌し、遠心分離により外側の水相 をリポソームから分離した。４−ＴＭＡＴはこの実験に用いたリポソームと結合 も、浸透もしないため、外側の水相に集中した。ＰｅｒｋｉｎｓらのＢＢＡ、　 ９４３，１０３　（１９８８年）に詳しく説明されている通り、４−ＴＭＡＴ濃 度の測定により、内部水相または捕捉された体積が計算できる。この分析結果は 下の表１に示した。これがらも分かるように、ＩＦリポソームはかなりの量を封 鎖しており、その他のタイプのリポソームの１０倍もの能力を示していることも ある。

表１ 捕捉された溶質の比較 Ｃ８，９ ＭＬＶ　Ｉ　Ｏ，５６ ２０，７８ ＭＰＶ　Ｉ　０．７１ ２１．９ ＦＡＴＭＬＶ　Ｉ　２．７ 京　捕捉された容積は、サンプル形成後に調べるＥＰＲ法（Ｐｅｒｋｉｎｓら、 １９８８年、　Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　９４３．１０３ ）を用いて測定した。

実施例４ ＩＰリポソーム形成の方法 シミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、 ジステアロイルホスファチジルコリンなどの飽和脂質を含有するリポソーム（Ｌ ＵＶ、　ＭＬＶ、　５ＰＬＶなど上記で調製されたもの）を調製し、押出し、音 波処理、ホモジナイザ処理により大きさを０．４ミクロン以下（０，０２５ミク ロンが望ましい）にする。これらの脂質と相互作用しない生物活性物質を、リポ ソームを形成するのに使われる水性溶液と共に混合する（最終的な脂質濃度は約 ５−１００　ｍＭ、望ましくは約１０−３５　ｍＭ）。リポソームの温度は、脂 質の主相遷移温度以下にする。次に、最終的な濃度が約１．７５−約２．５Ｍに なるようエタノールを水性溶液に加える。生物活性物質が脂質と相互作用する場 合、一般的に生物活性物質はエタノールを加えてＩＦデシが形成されてから溶剤 に加える。この段階で処理を停止して、できたゲルを局所的または経口製剤に使 用することもできる。また、このゲルは本発明の圧リポソーム形成にも使用する ことができる。

１Ｆリポソームを形成するため、このゲルを脂質の丁ｍ以下の温度で約１分から 約１時間インキュベートし、次に脂質の丁ｍ以上の温度で約１分から約１時間イ ンキュベートする。それから、蒸発、窒素正圧、または希釈により誘発物質を除 去する。エタノールの場合、エタノール濃度０．２　Ｍ以下まで希釈する。誘発 物質が除去されると、一般的に約０．２５ミクロンから約２０ミクロンの大きさ のリポソームが形成される。

実施例５ ジアドリゾエート−ＤＰＰＣＩＦリポソームの能方向上回転蒸発法により、６０ ０　ｍｇのＤＰＰＣをクロロホルムから乾燥させて膜状にし、さらに真空中で１ ６時間乾燥させた。５１℃の水槽内で０．９％の食塩水６耐中で約１５分間イン キュベートにより再懸濁した。できた多層リポソーム（ＭＬＶ）は３０璽ＩのＣ ０ｒｔｅｘ管に移し、溶剤が半透明になるまで約２時間、５１’Ｃで槽内で音波 処理した。この時点で得られたリポソーム懸濁液は４．Ｉａｌのみだった。４． １　ｍｌの脂質（まだ５１’Ｃのもの）を加えた５０　ｍｌの遠心分離機ボトル にジアドリゾエート［Ｒｅｎｏｇｒａｆｉｎ−７６（登録商標）　、　Ｂｒｉｓ ｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ　５ｑｕｉｂｂより入手可能）　１２　ｍｌ、重水（”ｄＨ ２Ｑ″）１２　ｍｌ　、エタノール２＋ｎｌを混合し、短時間撹拌した。１０分 間で、この混合物はゆるく注げるゲルになり、室温で２時間室いた。次に、この 懸濁液を５１℃の水槽で１時間インキュベートした。エタノール蒸発を容易にす るため、この時点でサンプルを２つに分けた。水槽内に浸けたまま、各一定量の 試料に窒素を１２分間吹き込んだ。サンプルを室温になるまで放置し、ｌ一定量 試料（ａｌｉｑｕｏｔ）につき０．９％の食塩水２０　ｍｌ　を加えて希釈した ６２０℃、１０，０００　ｘ　ｇ、１０分間の遠心分離サイクルを３回繰り返し てこの調剤を洗浄した。実施例６のために上述のようにサンプルを定量した。そ の結果は、以下の表２に示す。

表２ 実施例６ ジアドリゾエートーＨ５ＰＣＩＦリポソーム４００　ｍｇのＨ３ＰＣ（Ｎａｔｔ ｅｒｍａｎ　リン脂質）を１０　ｍｌのｄＨ２０内で７０℃で約１時間水和し、 半透明になるまで（３０分間）プローブ音波処理した。

約１　ｕｃｉ／ｍｌの“”Ｉ−ジアドリゾエートを含む１４　ｍｌのジアドリゾ エート（Ｓｑｕｉｂｂ）と、２．ＩａｌのｄＨ２０と４．９　ｍｌのエタノール を、５０ｍ１のねじぶた付のＣｏｒｔｅｘ　（登録商標）管内で混合した。混合 中に、Ｈ５ＰＣ小単層ラメラリポソーム（ＳＵＶ）７　ｍｌを加えた。これは、 ＳＵＶの温度がまだＴｍより高い時に行った。直ちに固体のゲルが形成され、室 温になるまで約１時間ふたをしておいた。この調剤を７０℃の水槽内で２時間、 ふたをはずしてインキュベートし、その後、液体になった調剤に２３分間泡状の Ｎ、を通した。Ｎ、の流量は、ＭａｎｏｓｔａｔＬｍ　（登録商標）の流量計で ＩＯであった。４ｍｌの一定量試料をＣｏｒｔｅｘｔｍ管内に注ぎ、室温になる まで冷やした。　９００　ｍｏｓ＋ｍのメグルミン緩衝液（メグルミン、ＮａＣ ］、クエン酸塩、ＥＤＴＡかも調合）１０　ｍｌを加え、短時間撹拌した。１８ ℃、１０，０００ｘｇ、１５分間の遠心分離サイクルを３回繰り返すことにより 、捕捉されなかったジアドリゾエートを除去した。ＣｈｅｎらがＡｎａｌｙｔｉ ｃａｌ　Ｃｈｅｗ、。

２８、　ＩＩ、　＋７５６　（＋９５６）で記述した標準方法により定量したと ころ、最終的なリポソーム濃度は＋２．Ｉ　ｍｇ／ｍｌであった。最終的なＩＬ Ｌ比は８゜８　（Ｗ：Ｗ）であった。できたリポソーム懸濁液は大気条件の下で 保存した。

実施例フ イオトロラン−Ｈ５ＰＣＩＦリポソーム＋ｇのＨ３ＰＣ（Ｎａｔｔｅｒｍａｎ　 リン脂質）を１０ｍ１のｄｉ４２０内で７０℃で約１時間水和し、半透明になる まで（３０分間）プローブ音波処理した。生成されたＳ聞を５０　ｍｌのねじぶ た付のＣｏｒｔｅｘ　（登録商標）管に移し、存在するチタンをペレット化する ため、５０００　Ｘ　ｇで約５分間回転させた。ＳＵＶをチタンペレットから傾 瀉し、７０℃の水槽で約５分間インキュベートしてから、４４　ｍｌの″１１Ｉ −標識イオドロランと、１５．６　ｍｌのエタノールと、６．４　ｍｌのｄＨ２ ０を混ぜた溶剤に加えた。この溶剤は、１６゜５＋ａｌの一定量試料４つに分け 、それぞれ、５０　ｍｌのねじぶた付のＣｏｒｔｅｘ　（登録商標）管に移した 。混合しながら５．５　ＩｌｌのＳ聞をそれぞれの管に加え、ゆるいゲルを形成 した。ゲルは、ふたをして室温で１時間置き、個々の管を７０℃の水槽に移して ふたをとって１時間置き、それから、気体流量計で４０の流量で１３分間、個々 の管にＮ、ガスを通した。

それぞれの管の内容物を２５０　ｍｌのエルレンマイヤーフラスコにあけ、室温 になるまで冷やす。フラスコを撹拌しながら、約１５０　ｍｌの無菌ＰＢＳ　（ ＣａやＭｇを含まないリン酸塩緩衝した食塩水）を加えた。１８℃、１０゜００ ０　ｘ　ｇ、　１０分間の遠心分離サイクルを３回繰り返すことにより、捕捉さ れなかったイオトロランを除去した。最終的なヨウ素濃度は、３００　ｍｇ／ｍ ｌのヨウ素におけるイオトロラン溶液の初期比放射能に基づいて測定したところ 、１５２．７　ｍｇ／ｍｌであった。ＣｈｅｎらがＡｎａｌｙＬｉｃａｌ　Ｃｈ ｅｍ、、　２８．１１．１７５６　（１９５６）で記述した標準方法により最終 的なリン脂質濃度を測定したところ、３２．７　ｍｇ／ｍｌであり、緩衝液内に 存在するリン酸塩について修正を行なった。最終的な■・Ｌ比は４．７　（Ｗ： Ｗ）であった。できたリポソーム懸濁液は大気条件の下で保存した。

実施例８ 放射線造影剤の貯蔵安定性 大気条件の下で保存したＩＦリポソーム５０　ｕｌのジアドリゾエートまたはイ オトロランＨ５ＰＣＶＩＰリポソーム調剤（放射標識済）を、その初期懸濁液緩 衝液１ｍｌで希釈し、マイクロ遠心分離機で室温で１６，０００　ｘ　ｇで１０ 分間遠心分離した。上澄液を除去し、ペレットおよび上澄液の１２５１計数を行 った。２５℃で６２日間保存した場合、ジアドリゾエートリポソームの上澄液に 存在した放射標識は４％、イオトロランリポソームの上澄液に存在した放射標識 は５４日間保存した場合３ｚであった。この結果に基づくと、この調剤は、大気 条件下で保存した場合、少なくとも１年は貯蔵できることを示している。

実施例９ ＤＰＰＣＩＦリポソームにおけるジアドリゾエート捕捉に与える初期脂質濃度の 影響 下の表３は、初期脂質濃度を種々に変えて、前述実施例５の説明のようにして作 られたＩＦリポソーム調剤を示す。１５　ｍｌのＣｏｒｔｅｘ　（登録商標）管 で、最終的な容積が以下に示した容積になるよう、ジアドリゾエート１ｍｌを、 濃度５０　ｍｇ／＋ｎｌのｄＨ２０と一定の大きさにした単層ラメラリポソーム （ＳＵＶ）　ＤＰＰＣと混合した。脂質を加える前に、ジアドリゾエート溶液に はＩｌｌあたり８７．５　ｕｌのエタノールを加えたく最終的な容積は２Ｍ）。

この調剤は室温でふたをして１時間放置し、次にふたをとって５１℃の水槽でイ ンキュベートした。１時間後、窒素をここのサンプルに２分間通気した。室温ま で冷やした後、個々のサンプルに０゜９％の食塩水１０　Ｉｌｌ　を加えて希釈 し、１０，０００　ｇ、　２０℃で１５分間の遠心分離サイクルを３回繰り返し て洗浄した。サンプルは前述の方法（実施例３）で定量した。その結果を下の表 ３に示す。

表３ ５０ｍｇ／　１．７　３８　５７，６　２．４７２ｍ１　１．８　３５　５８− ９　２−１８２５ｍｇ／　３，５　３７　６８，７　２．０１２諷１　３，１　 ２８　６２．１　１．６６２５隙ｇ／　５，０　４９　７３．５　２．４７３１ ｍ１　５．６　５６　８０．３　２．５６実施例１０ ＩＰリポソームによるゲンタマイシンの捕捉硫酸ゲンタマイシン溶液（Ｓｉｇｍ ａ　Ｃｈｅｎｉｃａｌｓ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ。

ＵＳＡ）を０６９％の食塩水中で調製し、最終的な濃度が５００　ｍｇ／ｍｌに なるようにした。これとは別に、１００　ｍｇのＤＰＰＣ（Ａｖａｎｔｉ極性脂 質）を蒸発させて乾燥させ、最終的な濃度が４０　ｍｇ／ｍｌになるよう、２． ５　ｍｌの食塩水内で水和した。ＤＰＰＣ混合物は、透明になるまで槽型音波処 理器で音波処理した。

次に以下の混合物を作った。溶液が硫酸ゲンタマイシンを含む前にエタノール誘 発物質を加えたことに注意されたい。

Ａ　−０，５ｍｌのＤＰＰＣ溶液、とエタノール（”ＥシＯｌ（”）　（最終濃 度２Ｍまで）と０．５　ｍｌのゲンタマイシン溶液。

Ｂ　−０，２５ｍｌのＤＰＰＣ溶液とＮａＣ１０，９％の食塩水０．２５　ｍｌ 　、　ＥｊＯｔ（（最終濃度２Ｍまで）と０．５　ｍｌのゲンタマイシン溶液。

Ｃ−０，２５ｍｌのＤＰＰＣ溶液と０．７５　ｍｌの食塩水、ＥｔＯＨ（最終濃 度２Ｍまで）と１．０　ｍｌのゲンタマイシン溶液。

上記の調剤はそれぞれ、脂質：ゲンタマイシン濃度を決定するため、寒天ウェル 拡散バイオアッセイによりゲンタマイシン活性を定量した。

上述の調剤のリポソームはそれぞれ、０．２ｚのＴｒｉｔｏｎ−Ｘ　１００（Ｂ ｉｏｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｔ＋ｍｏｎｄ　ＣＡ）で破壊 し、指示有機体としてＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　（ＡＴＣＣ＃６６ ３３）を用いて寒天ウェル拡散パイオア・ソセイによりゲンタマイシン活性を定 量した。脂質濃度は、ＡｗｅｓらによりＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃ ａｌ　Ｃｈｅｗ、　２３５．２３６．７６９　（１９６０）に示された標準方法 で測定した。

バイオアッセイの結果は、下の表４に示した。この結果は、脂質／ゲンタマイシ ン重量比が非常に低いものが得られたことを示してし）る。

ＩＦリポソームに　された゛ンタマイシンサンプル　ゲンタマイシン゛　脂質　 脂質／ゲンタマイシン実施例１】 ＤＰＳＣ−イオトロランＩＦリポソームの能方向上８　ｇ　（７）ＤＳＰＣを注 射用蒸留水（”ＷＦＩ”）２００　！＋１中に７０℃テ３０分間混合した。でき た懸濁液をマイクロフリュイダイザホモジナイザで、ＩＩ、０００ｐＳｉで２５ 回処理し、ＳＵＶを形成させた。できた５ＬＩＶは、孔のサイズが０．２２　ｕ ｎのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ湾曲道重合体フィルタでろ過した。

イオトロラン（９２ｍｌ　、　３００　ｍｇ／ｍｌ）、１３．４　ｍｌのＷＦＩ 　、　３２．６　ｍｌのエタノールを、容ｚ２ｏｏｏ　ｍｌの丸底フラスコで混 合した。ＳＵＶ　（４４ｍｌ）を室温（約２５℃）でフラスコ内で混合し、バナ ナ型パドルミキサーを用いて１０秒間撹拌した。この混合により形成されたゲル は、１．２５時間静かに放置した。

丸底フラスコを７０℃の水浴中に入れ、バナナ型パドルミキサーを用いて６６　 ｒｐｍで１時間撹拌した。次に、流量・ｉ、７　Ｌ　Ｎ２／分で１時間がけて水 性液の表面に窒素を散布し、エタノールを回収しながら、撹拌速度を＋３５　ｒ ｐｍまで増加させてエタノールを除去した。、最終的な容積は、炭酸化した緩衝 ｇ！（０，４ｍｇ／ｍｌのＮａＨＣＯ３，０，１ｍｇ／ｍｌの二価ナトリウムＥ ＤＴＡを０．９％の食塩水に混合したもの）を加えて４００　ｍｌに調整した。

得られたＩＦリポソームを洗浄し、その際、０．２ｕｍのミクロボン（Ｍｉｃｒ ｏｇｏｎ）ろ過装置によるｄｌａｆｉｌＬｒ、ａｔｉａｎにより、リポソームと 捕捉されなかったイオトロランを分離した。濃縮処理として、ｌｏｏｍｌで７回 洗浄し、最後に３００　ｍｌを除去した。この洗浄工程は２５分間続けた。

得られたイオトロラン／ＤＳＰＣリポソームの分析は下記の表５に示される結果 を生じた。

表５ 脂質濃度　２３．Ｏｄ、　１８．２　ｍｇ／ｍ１ＩＪ　’／　Ｐ　Ｃ１１度０． ９％ 捕捉されたイオトロラン　２６４．８　ｍｇ／ｍｌ遊離イオ遊離チオトロラン　 １．４ｚ イオトロラン／ＤＳＰＣ１４，５ 捕捉容積　１３．７　ｕｌ／ｕｍｏｌ サイズ分布　３．６ｕｍ未満が９０％ ２．８　ｕｓ未満が５（Ｊ％ １．２　ｕｎ未満が１０％ 実施例Ｉ２ エタノール濃度を関数としてのＤＰＰＣ−ＩＦ小胞のカプセル封入効果 ＤＰＰＣ（粉末）を微量の１Ｃスクロースを含む１０ｍ１のＴｒｉｓ　ＨＣＩ％ １５０ｍ１のＮａＣ１と混合し、ｐＨ７，４、総ｆｆ１２．０ｍｌに対してＤＰ ＰＣの濃度が２０ｍｇ／ｍｌなるようにした。この混合は、ＤＰＰＣの相遷移温 度以上の温度、５０−５３℃で行い、ＭＬＶを得た。ＭＶＬを５０−５３℃で１ 時間、音波処理して室温に冷却し、直径約３０−５０　ｒ＋＋＋＋の５ＵＶｓを 得たａ２．０　ｍｌのＳＵＶに充分なエタノール（１００％）を加え、３．０Ｍ エタノール濃度とした（０．４３ｍ１エタノール：総重量で２０％のエタノール ）、この混合物を均質になるまで撹拌した。この懸濁液はふたをして室温で１時 間静かに放置し、ついでＤＰＰＣの遷移温度以上の温度、即ち５０−５５℃でふ たをゆるめて１時間インキュベートした。脂質のＴｒｎより高い温度でインキュ ベートしながら、混合物中に窒素流を３分間静かに通人した。“４Ｃスクロース のカプセル封入調査のためにサンプル（１００ｕＬ）を取り出し、また、チェノ （Ｃｈｅｎ）らのパルトレッド（Ｂａｒｔｌｅｔｔ）リン定量法によりＰｊを測 定するため、４　ｕＬと８ｕＬの一定量の試料も取り出した。得られたＩＦリポ ソームに１０　ｗ＋ｌのＴｒｉｓ／Ｎａｃｌ緩衝液を加え、この混合物を９゜０ ００　ｘ　ｇで１５分間遠心分離し、その上澄液を傾瀉により取り出し、ベレッ トをＴｒｉｓ／ＮａＣ１緩衝液中に再懸濁し、さらに２回遠心分離し、合わせて ３回洗浄した。ベレットは最後に２−０　！ＩＩの緩衝液中で再懸濁した。Ｐ１ 定量のために４ｕＬと８ｕＬの一定量の試料を取り出したのと同様、カプセル封 入調査のためにさらに２００　ｕＬのサンプルを取り出した。

エタノール濃度１．０．２．０．２．５．３．５．４．０　Ｍの溶液を用いて上 記の方法を繰り返した。

ＴＦリポソームの内部容積はリンＰｉ　ｌ　ｕＭあたりのｕＬで表し、”°Ｃス クロースカプセル封入法およびＣＡＴ　Ｉ　ＥＰＲ法で測定した。

″゛Ｃスクロースカプセル封入法の手順は以下の通りである。窒素吹き込み工程 に続いて゛°Ｃスクロースカプセル封入調査のために取り出した試料１００　ｕ Ｌを、Ｂｅｃｋ鳳ａｎモデルＬｓ　６８００シンチレーシヨンカウンターで計数 した。同様に、遠心分離工程に続いて、取り出した試料２゜ＯｕＬを卓上遠心分 離機を用いて３，０００　Ｘ　ｇで遠心分離し、ベレットと上澄液の両者をシン チレーションカウンターで計数した。また、Ｐｌは前述のように測定した。″° Ｃスクロースカプセル封入はこのようにして測定し、その結果を図４Ａのグラフ に示した。

ＣＡＴ　Ｉ　ＥＰＲの研究は、以下の実施例１３のようにして行なわれた。

図４Ｂに示したように、ＤＰＰＣＩＦリポソームの内部容積は、エタノール濃度 の上昇の関数として上昇し、エタノール濃度が高いとリポソームのカプセル封入 効果も高いことと一致している。３回の遠心分離洗浄の後に回収されたＤＰＰＣ のパーセンテージを図４ｃに示した。

実施例１３ スクロース法およびＥＰＲ法で測定したＤＰＳＣ，ＤＨＰＣ。

ＤＯＰＣ，ＥＰＣＩＦリポソームのカプセル封入効果脂質ＤＳＰＣ，ＤＨＰＣ， ＤＯＰＣ，ＥＰＣを用い、最終的な濃度が３．０Ｍのエタノールを用いて実施例 １２の方法を繰り返した。　ＤＯＰＣとＥＰＣについては、エタノールを加えた 後にＤＯＰおよびＥＰＣについて５０’Ｃで低温インキュベーションを行った。

すべてのサンプルについて７０’Ｃで高温でインキュベーションを行った。

ＤＳＰＣ（７）インキュベーションは７０℃で、ＤＨＰＣハ５０”Ｃテ、ＤＯＰ Ｃ，！：ＥＰＣ＋１５℃で行った。

ＤＯＰＣとＥＰＣのサンプルの洗浄は遠心分離では行わず、Ａ＋＊１ｃｏｎ　３ ０にの微量濃度装置（Ｇｒａｃｅ　Ｃｏ、）フィルターでろ過した。カプセル封 入効果を分析するため、ろ液、および、ろ過前後のサンプルがらｔｏｏ　ｕＬの 一定量の試料を取り出した。

カプセル封入効果を、スクロースカプセル封入法、ＣＡＴ　Ｉ　ＥＰＲ法および 丁Ｅ’１ＰＯＮＥ　ＥＰＲ法を用いて計算し、これらの方法については以下に説 明した。

図５に示したように、指状突起相合することが知られている３つのホスファチジ ルコリン（ＤＰＰＣ，ＤＳＰＣ，ＤＨＰＣ）はすべて、内部容積の大きいＩＦリ ポソームを生成した。ＥＰＣとＤＯＰＣの内部容積は比較的小さく、大きさも比 較的小さかったため、机上型遠心分離機（９，０００ｘ　ｇ）ではペレット状に することはできなかった。したがって、ＣＡＴ　Ｉ　ＥＰＲ法ではこれらのリポ ソームの内部容積は測定できなかった。

カプセル封入を測定するためのＣＡＴ　Ｉ　ＥＰＲ法この方法は、外部溶媒容積 法としても知られており、１９８８年のＰｅｒｋｉｎｓらのＢｉｏｃｈｉｍ、　 Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　９４３：］Ｑ３−１０７に説明されている。

リポソームの内部容積は、リポソーム懸濁液の総容積から膜の不透過スピンプロ ーブ濃度を測定することにより計算した外部溶媒容積を差し引いて測定された。

外部溶媒容積は、既知量のスピンプローブである４−トリメチルアンモニウム〜 ２．２．６．６−テトラメチルビペリジン−１−オキシルヨウ化物（”ＣＡＴ　 ｌ“）をリポソーム懸濁液に加えることにより計算した。リポソームをペレット 状にするため、リポソーム懸濁液を遠心分離した。溶剤中のＣＡＴ　ｌの濃度は 、上澄液からのＣＡＴ　Ｉ　ＥＰＲ信号強度に対するＥＰＲ信号と、ＣＡＴ　ｌ 濃度較正曲線を比較して決定した。

プローブはリポソームの内部容積から除外されるためスピンプローブが利用でき る体積が少なくなるので、上澄液中のＣＡＴ　１濃度は、加えたＣＡＴ　Ｉの量 から予芯される濃度より高かった。脂質自身の理由により、サンプル体積につい ても修正を行った。

肚１００．２００．３００．４００　ｕＭ　（ｒ）ＣＡＴ　Ｉ　を含む較正緩衝 溶液として１０ｍＭのＣＡＴ１　、１０　ｍＭの丁ｒｊｓ　ＨＣＩ　（ｐＨ７， ４）　、　１５０　ｍＭのＮａＣ１を含む貯蔵溶液を用いた。Ｂｒｕｃｋｅｒ　 ＥＲ１００Ｄスペクトロメーターにより各貯蔵溶液のＥＰＲスペクトルを記録し た。それぞれの濃度で測定された各スペクトルのピークＭ、　＝　＋１共鳴線の ピーク対ピーク高さくｐｅａｋ　ｔｏ　ｐｅａｋ　ｈｅｉｇｈｔ）およびＣＡＴ 　ｌ濃度曲線に対するピーク高さが作図された。

ＣＡＴ　ｌ貯蔵（０，２０ｕＭ）をリポソーム懸濁液１．００　ｍｌ　（ｖｔ　 ）に加え、撹拌して混合した。このリポソームを机上遠心分離機で９，０００　 Ｘ　ｇで遠心分離してペレット状にし、その上澄液の少量をＥＰＲ毛細管にとり 、封をした。Ｍｌ・＋１共鳴線のピーク対ピーク高さを測定した。ＣＡＴ　１の 溶媒濃度は、サンプルＥＰＲ信号強度と較正曲線から決定した。

外部溶媒容積ｖＯは、較正曲線から得た。外部溶媒容積Ｖ○は、加えたＣＡＴ　 ｌのモル数を阿とし、上澄液中のＣＡＴ　ｌ濃度をＣとするとＭｌＣに等しかっ た。Ｖｌは脂質が占める容積で、Ｖｌを脂質の体積とすると、Ｖｉ　＝１．ＯＯ −Ｖｔ　−Ｖｌと表される。サンプルのリン酸塩濃度で割った内部容積Ｖｉは、 Ｐｉ　Ｉ　ｕＭあたりの内部容積を示し、これがリポソームの内部体積を表す標 準的な方法である。

カプセル封　を　するためのＴＥＭＰＯＮＥ　ＥＰＲこの方法は、拡張刑法とし ても知られ、Ａｎｚａｉ　ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ 　１９８８．９３７：７３−８０に説明されている。リポソームの内部容積は、 膜透過性ＥＰＲスピンプローブ拡張拡張量を測定して決定される。

通常は、高速で回転する水性液ＥＰＲスピンプローブのスペクトル線形は比較的 狭いが、常磁性のイオンを加えることによりスピン−スピン緩和時間（Ｔ２）が 減少する。この拡張剤の濃度が充分高ければ、スペクトル線形が非常に拡張し、 ＥＰＲ信号のピーク高さに対するピークが劇的に減少する。実際、ＥＰＲ拡張剤 がスピンプローブに到達すれば、″プローブ信号は消滅する。

測定は、膜透過性ＥＰＲスピンプローブ４−オクソー２．２．６．６−テトラメ チルビペリジン−１−オキシル（”ＴＥＭＰＯＮＥ”）をリポソーム懸濁液に加 えて行う。リポソーム懸濁液から２００　ｕＬの一定量試料を２本取り出した。

そのうちの一つを２００　ｕｌの緩衝液で希釈し、もう一方は２００　ｕｌの緩 衝液に膜不透過性拡張剤カリウム　トリス（シュウ酸）クロム酸塩（ＩＩＩ）を 加えたもので希釈した。緩衝液で希釈した一定量の試料からのＥＰＲ信号は、サ ンプル総容積と比例するが、カリウム　トリス（シュウ酸）クロム酸塩（ＩＩＩ ）を加えて希釈した一定量の試料のＥＰＲ信号は、リポソーム内部のサンプル容 積と比例している。

ｔｌｌＬ　ＴＥＭＰＯＮＥの貯蔵溶液５０關、ｌ０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ ｐＨ７，４）、１５０　ｍＭのＮａＣｌ貯蔵溶液を調製した。ＴＥＭＰＯＮＥ貯 蔵（１０ｕｌ）を、０．５　ｍｌのリポソーム懸濁液に加え、撹拌して混合した 。それぞれのサンプルから２００　ｕｌの一定量の試料を取り出し、２００　ｕ ｌの緩衝液で希釈した。

別の２００　ｕｌの一定量の試料を取り出し、１００　ｍＭのカリウム　トリス （シュウ酸）クロム酸塩（ＨＩ）と５０　ｍＭのＮａＣＩ溶剤で希釈した。緩衝 液とクロム酸塩溶剤の浸透力を前もって蒸気圧浸透圧計でチェックされ、それら が］−２％の範囲で均等であることを確認した。これらのサンプルは撹拌して混 合した。

Ｂｒｕｋｅｒ　ＥＲ１００ＤスペクトロメーターによりＥＰＲスペクトルを記録 した。サンプルをＥＰＲ毛細管に入れ封をした。緩衝液サンプルのＥＰＲスペク トルを先に記録し、次にクロム酸塩溶剤サンプルを調製し、それから直ちにこの サンプルのＥＰＲスペクトルを記録した。−■＝＋１共鳴線のピーク対ビーク漬 を用いて両方のサンプル内で影響を受けていないスピンプローブの相対濃度を測 定した。サンプルの総容積は、緩衝液で希釈した一定量の試料のＥＰＲ信号の大 きさをスペクトロメーターの獲得設定（ＳＴ）で割ったものに比例したが、リポ ソームの内部容積は、クロム酸塩で希釈した一定量試料のＥＰＲ信号の大きさを 獲得設定（Ｓｒ）で割ったものに比例した。内部サンプル容Ｍ（Ｖｉ＞は、Ｓｌ ／ＳＴにサンプル容積Ｖをかけたものである。サンプルの内部体積Ｖｉ　をサン プルのリン酸塩濃度で割ると、Ｐｉ　Ｉ　ｕＭあたりの内部体積が得られ、これ がリポソームの内部容積を表す標準的な方法である。

実施例１４ リポソームの初期サイズの関数としてのＤＰＰＣＬＵＶＥＴ−ＩＰ（指状突起融 合）小胞のカプセル封入効果実施例１２の方法にしたがって、ＤＰＰＣ（４２２ ｍｇの粉末）を、検出可能な”ｃスクロースを含む２１　ｍｌのＴｒｉｓ／Ｎａ Ｃ１で水和し、ＤＰＰＣの総濃度を２０重ｇ／ｍｌとした。サンプルを５０−５ ５℃で撹拌して混合し、ＤＰＰＣＭＬＶを得た。１９９０年１２月４日に発行さ れたＣｕ１ｌｉｓらの米国特許第４，９７５゜２８２号の方法により、凍結融解 サイクルを合わせて】ｏ＠繰り返してＦＡ丁ＭＬＶを調製した。得うｔ’したＤ ＰＰＣＦＡＴ　ＭＬＶハ、　１９８６年１月１６日ニ公開された、　［リポソー ム生成のための押出し技術］というＣｕ１ｌｉｓらのＰｃＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ８ ５１０１１６１、公開番号Ｗ０８６１００２３８の方法にしたがッテ、ＬＩＪＶ ＥＴ装置を用いて６０−６５℃で、シングル１．Ｏｕｍ　Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅポ リカーボネートフィルターを使って１ｏ回押出した。ＬＵＶＥＴで処理したリポ ソームの２ｍｌを取り出した。

直径０．１．０．２．０，４．１．０　ｕｍのＬＵＶＥＴサンプルが２．Ｏｍｌ 得られるまで、０，４．０，２．０．１　ｕｍのポリカーボネートフィルターを 用いて上記の方法を繰り返した。

この実施例のためにＦＡＴ　ＭＬＶを使用した時は、現在のように押出しせずに 用いた。実施例】２の方法にしたがって、０．Ｉｕｍでろ過されたＬＵＶＥＴの 残りを音波処理してＳ聞を準備した。

これらのリポソームの内部容積は、上記で説明したように、゛°Ｃスクロースカ プセル封入法、ＣＡＴ　Ｉ　ＥＰＲ法やＴＥ’１ＰＯＮＥ　ＥＰＲ法により計算 してめられた。

図６に示したように、ＦＡＴＭＬＶを除いては、ＩＦリポソームの内部容積は、 　「最初の」リポソーム、つまりエタノールを加える前のリポソームの大きさが 小さいほど増加した。この結果は、最初のリポソームの直径は、ＩＦリポソーム の最終的な容積を決定するうえで重要なパラメータになっていることを示してい る。

実施例１５ ＤＰＰＣＩＦリポソームへのＤＰＰＧの組み込み１Ｆリポソームを、実施例１２ の方法に以下の修正をして、ＤＰＰＣ／ジパルミトイルホスファチジルグリセロ ール（ＤＰＰＧ）　Ｓ聞から調製した。全体で３０鯖のリン脂質（ＤＰＰＣとＤ ＰＰＧ）を用い、ＤＰＰにモル分画は０．１７だった（１７モルパーセント）。

それぞれクロロホルムに入れたＤＰＰＣとＤＰＰＧを丸底フラスコ（容量５０　 ｍｌ）に入れ、よく混ぜ合わせた。負圧（回転蒸発）により、脂質はフラスコ内 で乾燥させて薄膜を作り、できた薄膜を２．ＯｍｌのＴｒｉｓ／ＮａＣｌ緩衝液 により水和し、５０−５５℃の温度まで熱した。全体の濃度が３．０Ｍのエタノ ールを用いた。微量の”４Ｃスクロースをサンプルに加え、その懸濁液が透明に なるまで音波処理した。エタノールを除去して混合液を５０〜５５℃でインキュ ベートすると、ＩＦリポソームが形成された。

リポソームの内部容積は、実施例１３の方法にしたがって、“Ｃスクロースカプ セル封入法およびＴＥＭＰＯＮＥ　ＥＰＲ法により計算した。

ＤＰＰＧのモル分画が１．０．０．８３．０．６６、０．５０および０．００（ それぞれ、１００、８３．６６、５０および０モルパーセント）の場合について 、上記の方法を繰り返した。その結果は、図７ＡおよびＢのグラフに表した。

ＤＰＰＧの分画が高くなると、洗浄工程中にリポソームがうまくベレット状にな らないため、回収されるＩＦリポソームは低率になったが、これは陰電荷リポソ ームの典型的な問題になっている。ペレット内で回収されたＩＦリポソームの内 部容積は、図７Ａに示した。白丸は、゛４Ｃスクロースカプセル封入で測定した 容積で、黒丸は拡張剤（ＴＥＭＰＯＮＥ）　ＥＰＲ法で測定した容積である。図 ７Ｂは、ＤＰＰＧの関数としてのＰｉの回収パーセント（黒丸）と、”°Ｃ標識 スクロースの回収パーセント（白丸）である。

実施例１６ ＤＰＰＣ初期濃度の関数としての捕捉容積とカプセル封入実施例１２の材料と操 作を用いて、２０　ｍｇ／ｍｌでＤＰＰＣＩＦリポソームを２゜００　ｍｌ形成 した。

２．０．　＋０．０．２０．０．８０．０および１６０．０　ｍｇのＤＰＰＣを 用いて上記の方法を繰り返し、ＤＰＰＣ濃度が２．５．５．０．　＋０．０．４ ０．０および８０．０　ｍｇ／ｍｌとなるＤＰＰＣＩＦリポソーム２．００　ｍ ｌのサンプルを５つ準備した。

各サンプルの”４Ｃスクロースカプセル封入および内部容積は、実施例】３の方 法により計算した。

この結果は、図８ＡおよびＢにグラフで示した。図８Ａは、スクロースのカプセ ル封入は、初期ＤＰＰＣ脂質濃度とともに増加することを示している。図８Ｂは 、”″Ｃスクロース法（白画角）またはＥＰＲ法（黒菱形）の両者により測定さ れたＤＰＰＣＩＦリポソームの内部容積を示している。

ＩＦリポソームの内部容積は、ＤＰＰＣの初期濃度が１−２０　ｍｇ／ｍｌの場 合は、約１５−２０　ｕｌ／ｕＭ　Ｐｉであった。Ｍａｌｖｅｒｎ粒子整粒器に よる測定では、これらのリポソーム（１０ｍｇ／ｍｌまたは２０　ｍｇ／ｍｌの 脂質を含む）の平均直径は、およそ７．０−７．５　ｕｍであった（図９Ａ、　 Ｂ参照）。このことは、指状突起融合法により形成されたＤＰＰＣリポソームの 内部容積は、従来のＭＬＶよりかなり大きかったということを示している。

実施例１７ ＤＰＰＣＩＦリポソーム形成におけるコレステロールの影響実施例１２の材料と 操作にしたがって、ＤＰＰＣとコレステロールを用いて、全体の脂質３０ＩＩＭ 内で、全体濃度３．０Ｍのエタノールを使ってＩＦリポソームを形成した。Ｓ度 ２０　ｍｇ／ｍｌの貯蔵クロロホルム溶液内で調剤したコレステロールとＤＰＰ Ｃを、容量５０ｍ１の丸底フラスコ内で、ＤＰＰＣ９５％、コレステロール５ｚ の割合で混ぜ合わせた。フラスコの表面に脂質が薄膜を作るよう乾燥させ、前述 の通りＴｒｉｓ／ＮａＣ１で水和した。

インキュベーション温度は５０−５５℃であった。

ＩＦ工程の前後のコレステロールを測定するため、一定量の試料を取り出し、リ ポソームに含まれるコレステロールの確認、および°°Ｃスクロースカプセル封 入の定量を行なった。

上記の方法を、モル分画が０．００．０，０２．０．１０．０．１５．３０．０ のコレステロールを用いて繰り返した（モルパーセントは、０．２．０．１０． １５゜３０）。

リポソームの内部容積は、”°Ｃスクロースカプセル封入、ＣＡＴ　Ｉ　ＥＰＲ 法、ＴＥＭＰＯＮＥ　ＥＰＲ法により測定された。ＩＦリポソームのコレステロ ール含有量は、Ｒｕｄｅｌ　とＭｏｒｒｉｓ、　１９７３．　Ｊ、　Ｌｉｐｉｄ 　Ｒｅｓ、、　１４：１４の方法にしたがって、０−フタルアルデヒドを用いて 測定した。

この結果は、［１ｌｌＯＡおよびＢにグラフで示した。ＩＪＩＯＡは、ＩＦリポ ソームの「最終的な」コレステロール濃度（白丸）および捕捉された゛°Ｃスク ロースの最終的なパーセンテージ（白画角）を示している。

コレステロール含有量が上昇すると、カプセル封入されたスクロースの量は減少 した。

ｅｌＱＢは、ＤＰＰＣ−コレステロールリポソームの内部容積の減少をコレステ ロール含有量の関数として表したものである。ＣＡＴ　Ｉ　ＥＰＲ法や丁１１１ ”４ＰＯＮＥ　ＥＰＲ法（それぞれ白玉角と黒丸）のデータは非常に類似してい るのに対し、′Ｃスクロース定量によるデータでは内部容積はがなり高い。理論 にしばられることはないが、“Ｃスクロースはリポソームに「くっついてｊいる ため、内部容積の読取り値が高くなっていると思われる。

これらの研究および図１０は、ＩＦリポソームの大きさは、コレステロール濃度 が上昇すると急激に減少することを示しており、コレステロール濃度が０％のＩ Ｆリポソームの平均直径は７．６６　ｕｒｎであるのに対し、コレステロール濃 度が３０％の場合は、３．９９　ｕｍであったというＭａｌｖｅｒｎ粒子整粒の 結果からも支持される結論となっている。

実施例１８ ＤＰＰＣＩＦリポソーム形成に対する ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）の影響実施例Ｉ２の材料および操 作にしたがって、ＤＰＰＣと不飽和脂質ジオレイルホスファチジルコリン（”Ｄ ＯＰＣ”）を用い、全体で３０ｍＭの脂質内で、全体濃度３．０Ｍのエタノール を用いてＩＦリポソームを形成した。初期リポソームは、ＤＯＰＣのモル分画が ０．２０　（２０モルパーセント）となるよう丸底フラスコ内で混合し、濃度２ ０　ｍｇ／ｆｆ１ｌの貯蔵クロロホルム溶液内に供給されたＤＰＰＣとＤＯＰＣ から形成した。脂質は、回転蒸発によりフラスコ表面に薄膜状に乾燥させ、前述 のようにＴｒｉｓ／ＮａＣ１で水和した。

インキュベーション温度は５０−５５℃であった。

ＤＯＰＣが０．００．０．ＩＩ、　０．５５．０．７２．１．００モル分画（モ ルパーセントは０、　ＩＩ、　５５．７２．１００）を用いて、上記の方法を繰 り返した。

１Ｆリポソームの内部容積は、゛Ｃスクロースカプセル封入法およびＴＥＭＰＯ ＮＥ　ＥＰＲ法で測定し、その結果は図１１Ａのグラフに表した。

グラフからもわかるように、ＤＯＰＣの量が増加すると、ＩＦリポソームのサイ ズが減少する。１０％というわずかなりＯＰＣでも、リポソーム容積を５０％以 上減少させる。ＤＯＰＣのモル分画が０．４モル（４０モルパーセント）以上に なると、エタノール−脂質ゲルは形成されず、Ｓ［ＪＶＳは融合しないようであ った。ＤＯＰＣのモル分画が０．６と０．８の場合のリポソームの内部容積は、 それぞれ０．２と０．２４　ｕｌ／ｕＭ　Ｐｉで、ＳＵＶの範囲内であった。ま た、ＤＯＰＣのモル分画が０．４モル以上の場合、遠心分離で回収できる脂質の パーセンテージも減少した（図１１Ｂ参照）。

実施例１９ ＤＳＰＣＩＦリポソーム内への放射造影剤イオヘルソル（Ｉｏｖｅｒｓｏｌ）捕 捉ＤＳＰＣ（凍結乾燥粉末２００　ｍｇ）　を５．０　ｍｌの蒸留水内で懸濁し 、半透明のＳＵＶ懸濁液が得られるまで音波処理した（音波処理の時間は約２０ 分）。このＳＵＶ懸濁液を１０，０００　Ｘ　ｇで１０分間遠心分離してチタン 残留物をペレット状にした。イオベルソル（Ｏｐｔｉｒａｙ　３２０Ｒ、Ｍａｌ ｌｉｎＣｋｒｏｄｔ）（１１，５ｍｇ）　、エタノール４．］ｍｌ、蒸留水１． ７　ｍｌを混合し、この混合液から３．３　ｍｌの一定量の試料をピペットで容 量１５　ｍｌのコルテックス（Ｃｏｒｔｅｘ）　（登録商標）管に移した。ＳＵ Ｖ　Ｗ！濁液の一定量の試料（１゜１　ｍｌ）をそれぞれの管に加えた。管にふ たをし、激しく撹拌すると半透明のゲルができた。

この管を室温で１時間放置した後、ふたを取って７０℃の浸漬浴で途中で撹拌し ながら１時間インキュベートした。インキュベーションの後、管内の混合液に窒 素を８分間ゆるく吹き込んだ。内容物が室温まで冷えたら、それぞれの管に緩衝 液（３０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０　ｍＭのＮａＣ１，０゜６　ｍＭのＮａ２ＥＤ ＴＡ　、　ｐＨ６，７）を加え、倒置して混合した。捕捉されなかったイオベル ソルは、遠心分離洗浄（５，０００Ｘ　ｇで３分間）を３回繰り返して除去した 。

この結果ＩＦリポソームに捕捉されたイオベルソルを、２４５　ｎｍの吸収によ る分光光度計およびエタノール内のイオベルソルの標準曲線に対する回帰により 定量した。脂質濃度はＣｈｅｎらの方法により測定した。

捕捉結果は下の表６に示した。

表６ サンプル　ヨウ素ｍｇ／ｍｌ　ＤＳＰＣｍｇ／ｍｌ　最終的なヨウ素：脂質１　 ９２．１　＋／−７，１１４，３＋／−０，２６，４（範囲５−９−７．０）２ 　９３．２　＋／−８，１１３，７＋／−０，７６，８（範囲５．９−７．８） ３　９３．２　＋／−９，２１３，７＋／−０，１６，８（範囲６．１−７．５ ）ＩＦリポソームの直径をＭａｌｖｅｒｎ粒子サイズ分析ですべたところ、平均 ４．０−５．Ｏｕｍであった。

実施例１９の材料と操作にしたがって、ＩＦリポソーム内に放射造影剤インキュ ベート（ＨｅｘａｂｒｉｘＲ、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）を捕捉した。実施例 １９の方法にしたがって捕捉状態を定量し、下の表７にその結果を示した。

表７ 造影剤　ヨウ素ｍｇ／ｍ１．　ＤＳＰＣｍｇ／ｍｌ　ヨウ素：脂質実施例２１ ＤＳＰＣＩＦリポソーム内への放射造影剤イオパミドールの捕捉実施例１９の材 料と操作にしたがって、ＩＦリポソーム内に放射造影剤イオパミドール（Ｉｓｏ ｖｕｅＲ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ　５ｑｕｉｂｂ）を捕捉した。実施例１ ９の方法にしたがって捕捉状態を定量し、下の表８にその結果を示した。

表８ 造影剤　ヨウ素ｍｇ／ＩＩ＋ｌ　ＤＳＰＣｍｇ／ｍｌ　ヨウ素：脂質実施例２２ ＩＦリポソームの内部容積に対する インキュベーション時間の影響 実施例１２の材料と操作にしたがい、ＤＰＰＣを２０　ｍｇ／ｍｌ、エタノール 濃度を３．０　Ｍにし、Ｔｍ上下の温度におけるゲルのインキュベーション時間 を変化させた。インキュベーション時間を５分に設定し、得られたＩＦリポソー ムの内部容積を°゛Ｃスクロースカプセル封入法（黒ベタの棒）、　ＣＡＴ　Ｉ 　ＥＰＲ法（影をつけた棒）およびＴＥＭＰＯＮＥ　ＥＰＲ法（斜線の棒）で測 定した。この測定の結果は、図１２のヒストグラムに示した。

インキュベーション時間を３０分、１時間、２時間に変えて上記の方法を繰り返 した。内部容積を同様に測定し、比較した。

図１２に示したように、インキュベーション時間の関数としてのＩＦリポソーム の内部容積には、インキュベーション時間が５分でも２時間でも、有意な差は見 られなかった。

実施例２３ インキュベーション操作を変えた場合のＩＦリポソームの内部容積が受ける影響 例えば、ＤＰＰＣＴｍ　（例５０−５５℃）以上の温度でのインキュベーション を行わず、ＤＰＰＣ５ＵＶｓを室温のみでインキュベートするなど、インキュベ ーションの条件を変えて、実施例１２の材料と操作を繰り返した。得られたＩＦ リポソームの内部容積は、′°Ｃスクロースカプセル封入法（グラフの無地の棒 ）　、　ＣＡＴ　Ｉ　ＥＰＲ法（陰をつけた棒）、　ＴＥＭＰＯＮＥ　ＥＰＲ法 （斜線の棒）で測定し、その結果を図１２のヒストグラムの″ＲＴ″に示した。

室温でのインキュベーションではなく、エタノールを加えてＤＰＰＣのＴ＋ｓ以 上の温度（５０−５５℃）でインキュベーションを行って上記の操作を繰り返し た。このインキュベーション法により得られたリポソームはペレット状にならず 遠心分離では洗浄できないため、このリポソームの洗浄は、ＤＰＰＣサンプルを ＩＱ　ｍｌのＴｒｉｓ／ＮａＣ１緩衝液で６回希釈し、このサンプルから４．０ 　ｍＪを取り出し、Ａｍ１ｃｏｎ　３０　Ｋマイクロ濃縮器（Ｇｒａｃｅ　Ｃｏ 、）で濃縮し、これをＢｅｃｋｍａｎ　Ｊ−２遠心分離機で３０，０００　ｘ　 ｇで１時間遠心分離した。保持された容積のサンプルを再び同じ操作で濃縮した 。この結果できたサンプルには”５０℃”というラベルをつけた。

図１２を参照すると、大きなＩＦリポソームを形成するためには両方のインキュ ベーション過程が必要であることが明らかである。

実施例２４ １Ｆリポソームの内部容積とＭＬＶｓの比較実施例１２の方法にしたがって、Ｄ ＰＰＣ（８０ｍｇの粉末）　（Ａｖａｎｔｉ極性脂質）を２．００　ｍｌのＴｒ ｉｓ／ＮａＣ］緩衝液に加えた。実施例１２の方法にしたがって、このＤＰＰＣ 懸濁液が透明になるまで音波処理した。最終的な濃度が３．０Ｍのエタノール（ ０，４３ｍｌのエタノールに加えて）を用いてＩＦリポソームを形成した。実施 例１２の通りに、このサンプルをインキュベートして遠心分離で洗浄し、実施例 １３に説明したＣＡＴ　Ｉ　ＥＰＲ法で内部容積を２回測定し、その結果を下の 表９に示した。

８０　ｍｇのＤＰＰＣを２．００　ｍｌのＴｒｉｓ／ＮａＣ１緩衝液に混合し、 ５０−５５℃で撹拌してＭＬＶを生成し、上記■の方法を繰り返した。しかし、 このＭＬＶｓは音波処理を行わず、エタノールも加えなかった。

４０　ｍｇのＤＰＰＣを用いて同じ方法を繰り返した、このサンプルのインキュ ベートと遠心分離洗浄は実施例１２の通りに行い、実施例１３に説明したＣＡＴ 　Ｉ　ＥＰＲ法で内部容積を２回測定し、その結果を下の表９に示した。

月１ 最終的な溶液における最終的な濃度が３．０Ｍになるよう０．４３１１１１のエ タノールを加えて上記Ｉ＋の方法を繰り返した。このサンプルのインキュベート と遠心分離洗浄は実施例１２の通りに行い、実施例１３に説明したＣＡＴ　Ｉ　 ＥＰＲ法で内部容積を２回測定し、その結果を下の表９に示した。

下の表９は、従来のＭＬＶｓ　、比較的高濃度のエタノールにさらされたＭＬＶ ｓと、内部容積が比較的大きいＩＦリポソームとの比較である。

表９ ＤＰＰＣ５ＵＶｓ　２０　あり　１５．７８ＤＰＰＣ５ＵＶｓ　４０　あり　１ ３．３８ＤＰＰＣＭＬＶｓ　２０　あり　２．０２ＤＰＰＣＭＬＶｓ　４０　あ ＬＪ　１．７０ＤＰＰＣＭＬＶｓ　２０　なし　１．３７実施例２５ イオトロラン−ＤＳＰＣＩＦリポソーム実施例７の材料と操作にしたがって、イ オトロランを含むＩＦリポソームの母集団を生成した。

実施例２６ 放射造影剤イオプロミドのＤＳＰＣＩＦリポソーム内への捕捉実施例７の材料と 操作にしたがって、イオトプロミドを含むＩＦリポソームの母集団を生成した。

本発明は、ここで詳述した特別な実施例において説明したが、これは説明の手段 で、本発明はこれに限定されることはない。修正やバリエーションはこの明細書 から明らかで、本発明の趣旨からはずれることなく、当業者には理解されると思 われる。したがって、そのような修正やバリエーションは本発明のおよび以下の 特許請求の範囲内にあるものと考えられる。

図ＩＡ　二重層で可能な種々の異なるアシル鎖の並び方を図式的に表したもの （Ａ）指状突起露台していないＣ（１６）：Ｃ（ＩＳ）　ｐｃ二重層（Ｂ）一部 が指状突起相合したＣ（１６）：Ｃ（ｔｏ）　ｐｃの二重層（Ｃ）混合指状突起 相合したＣ（１６）：Ｃ（１０）　ｐｃの二重層（Ｄ）完全に指状突起相合した Ｃ（１６）　：Ｃ（＋６）　Ｐ　Ｃの二重層（誘発物質が必要） 図ＩＢ　飽和したリン脂質の指状突起相合に対する温度と誘発物質（エタノール ）の関係 ＬＢ・ ＢＩ 図２ エタノール（Ｍ） 図４Ｃ回収されたＤＰＰＣ％とエタノールの関係図５　ホスファチジルコリンの 内部体積ホスファチジルコリン 図６　内部体積と初期リポソームサイズの関係ＬｔＪＶＥＴ直径（ミクロン） 図７Ａ　内部体積とＤＰＰＧモル分画 図７Ｂ　回収されたＰｌとスクロース ＤＰＰＧモル分画 図８Ａ　スクロースカプセル封入とＤＰＰＣ濃度図８Ｂ　内部体積とＤＰＰＣ濃 度 ＤＰＰＣ，ｍｇ／ｍ１ 図９ａ 粒子サイズ（μｍ） 図９ｂ 粒子サイズ（μｍ） 図１２　インキュベーションの時間と方法インキュベーションの時間（分） 要約 本発明は、指状突起−融合（ＩＦ）リポソームおよびゲルに関するものである。

このリポソームおよびゲルは、生物活性物質などを、高い溶質−脂質率で捕捉す る。本発明はまた、ＩＰリポソームおよびゲルの生成（産生）方法に間するもの である。本発明の方法では、音波処理。

押出し、またはその他の方法で一定の大きさにしたリポソームを、エタノールな ど適当な誘発物質の存在の下で融合する。この処理により、本発明の組成物がゲ ルの形で形成される。リポソームを生成するためには、このゲルを、必ずしも必 要ではないが通常は、使用する脂質の遷移温度（Ｔｍ）以上に保つ。本発明の方 法に必要な温度は、混合物の物質特性に変化を起こすような温度である。誘発物 質は除去してもよい。その結果、溶質−脂質率の高いリポソームからなる組成物 が生成される。本発明のＩＦリポソームおよびゲルは、特に生物活性物質など、 多数の溶質と組み合わせて用いることができる。

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