JPH05503577A - ルミネセンスの測定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ルミネセンスの測定 この発明はルミネセンス（例えば、燐光の螢洸ｊ５日の測定に関し、更に詳細に はルミネセンスの崩壊時間の測定に関する。

以下の記載においては螢光発光の崩壊時間について言及されているが、またこの 記載は他の形態のルミネセンスに必要な変更を加えて適用可能である。

螢光顕微鏡法が、多くの他の領域と同様に、現代性１瞥ζ法科学および材料分析 において非常に広く使用されている。螢光発光は２つの点で敏感である。非常カ ルシウムのような重要なイオンの濃度、（２）を監視するのに螢光発光プローブ の使用を可能にする。しかしながら、この感度はまた、螢光体の濃度、励起強度 及び前記物体の量子収量に依存する螢光強度であるから、潜在的なあいまいさを 有する。従って、たとえ励起強度が一定であっても、量子収量がまたサンプル内 で一定であることが知られていないならば、螢光体の濃度を測定された強度に対 し直接関係付けることは不可能である。多くの螢光サンプル、特に螢光イメージ ング（例えば、顕微鏡法）により研究されるこれら螢光サンプルに対して、サン プル内での量子収量の変動は共通である。理想的には、螢光発光強度だけでなく 、量子収量も測定する手段を備えたいであろう。一般に、これは非常に難しい問 題である。しかしながら、多くの状況により、螢光発光の崩壊時間の測定から螢 光の量子収量を推論することができる。これ力９狛功でないところでは、それは 発光寿命（全ての外来の不活性化プロセスの存在しないときの崩壊時間であり、 これは螢光発光効率に関連した螢光発光体の本質的な特性である。）での変化を 意味する。発光崩壊時間を変化させる動揺もまた励起及び／又は放射の分光特性 に影響を与えるので、その様な変化は、通常、検出可能である。

蛍光発光の崩壊時間は、通常２つの技術の１つを使用して測定される。最も普通 には、時間相関のシングルフォトン計数方法であり、そこでは蛍光発光は反復性 の短い光パルス源を用いて励起される（１）。もう一つの方法は、振幅変調され た励起源に応答して放出される蛍光発光の位相シフト測定／復調測定を使用する （２）。後者の技術は、蛍光発光の崩壊が単一の指数関数でない場合、変調周波 数の関数として測定する必要がある。

蛍光発光の崩壊測定に対する、時間領域アプローチと周波数領域アプローチとの 選択は、装置の利用可能性のような実際的な問題により主として左右されている 。しかしながら、一方または他方の方法が優先される明白な環境セットがある。

蛍光発光が（緑色ヘリウムネオンまたはアルゴンイオンレーザのような）低価格 なレーザの出力により餠りに励起されることができるならば、その場合にはレー ザ出力は簡単にポッケルスセルで変調されるので（３）、位相シフト／復調アプ ローチが特に便利であり、あるレーザは振幅変調に対して自動供給を有している 。

レーザ励起が都合のよくないところでは、位相方法はもっと難しくなる。アーク 光源からの光はポッケルスセルを用いて変調することができるが、厳しい平行光 線の要求のために非常に低いスループットの費用負担がかかるだけである。広い 波長範囲を所望する場合、必要なグランティラー偏光子はビームを更に減衰する 。

アーク光源がポッケルスセルを通して放出される場合、中央屯から一緒に到来し て十字形を形成する一対のカスプから構成される特徴的なパターンが見られる。

ポッケルスセルに電圧を印加することによりこれらのカスプは離ね、従って空間 フィルタとして小さな中央開口部を用いることにより、開口部を通過する光の強 度は、このデバイスに変動電圧を印加すると変調される。この放出パターンの様 子は軸から外れた変調器アセンブリを通過する光の結果であり、同種の変調はレ ーザのような極めて良好な平行光線に対してのみ可能である。アーク光源の使用 は連続出力および波長同調性の点で特に便利であり、このためこのような光源の 変調効率での難点は非常に残念である。ポッケルス変調器が使用される場合には 、高変調の深さと通過光の間のこのトレードオフは避けられない、そしてこれは 広い変調バンド幅のために、光の選択上では一般に好都合とされる。

光学素子を用いる変調の代わりとして、ある場合には、光源の出力を直接変調す ることができる。

アーク光源と共にポッケルスセルを用いる場合の比較的低い励起強度の不利な点 を最小にするためには、螢光発光の検出感度を可能な限り高くしなければならな い。十分な励起光強度が利用できる場合でさえも、通常は、例えばサンプルへの 光損傷を最小にするよう検出感度を最適にすることが望ましい。このために、シ ングルフォトン数検出を使用することが特に便利である。先の論文（４）におい て、位相／変調螢光測定法と共にシングルフォトン数検出を用いる一つの手段を 述べた。ヒストグラムデータの高速フーリエ変換（ＦＦＴ）分析を用いたこのア プローチは、時間−パルス振幅変換器からの出力の多チヤンネル解析結果を設定 した。

ディジタル相関関係に基づく、フォトン数を用いた位相シフト測定への代替アプ ローチが述べられている（５）。この技術では、変調周波数における方形波の「 ゲート」が２つの高周波カウンタ間に信号を向けるために用いられた。この方形 波形の位相は調整でき、２つのカウンタ間の計数比を最大にするので、この放出 の位相を簡単に測定することができる。このアプローチは、（４）に概説された ものよりもより簡単かつ安価であり、しかもより高速で計数する能力がある。

しかしながら、その原型においては、励起源が純粋なシヌソイドではないため誤 差が発生するという不都合がある。

本発明によれば、サンプルに照射するよう配置された励起光源と、予め設定され たサイクリックな方法で光源の強度を変調またはパルス化するための手段と、 照射結果としてそのサンプルにより放出されたフォトンを検出するための検出器 手段と、 フォトンの検出とサイクリックに変化する変調との間の位相差の関数として重み 付けされているデータであって、検出されたフォトンを表すデータを記憶するた めの手段と、かつ この記憶データから重み付けされた崩壊時間の情報を生成するための手段と、か ら構成されるルミネセンスのサンプルの重み付けされた崩壊時間の情報を生成す るための装置が提供される。

この発明は重み付けされた崩壊時間のイメージ生成に特に適用可能であるが、例 えば、時間分割の螢光発光無偏光測定、微分偏光位相シフト測定、および従来の 螢光発光崩壊時間の測定と同様に螢光発光の崩壊パラメータにおける時間依存変 化の測定、などの他のタイプの重み付けされた崩壊時間情報を提供するのに使用 し得る。この発明の幾つかの実施例（例えば、図５および図１０に関連して後で 説明されるイメージング配置）は励起と放出のパラメータに関連した崩壊時間を 表す励起放出マトリクスの測定のようなスペクトルで分散されたアレイの検出に 適応される。

好適には、重み付けされた記憶データは、予め設定されたサイクリックな方法で 各々変化すると共に、お互いに関して既知の位相シフトを有する２つの比較信号 を使用することにより得られる。この信号と光源の変調との間の位相関係もまた 既知であるべきであり、好適には比較波形の１つは前記変調（これは無線周波数 範囲であってもよい）と位相が同じである。好適には、比較波形はお互いに関し て９０度位相である。

好適には、比較波形と励起源の変調とはシヌソイドである。

好適には、検出器はシングルフォトンを検出する能力がある。例えば、検出器は 光電子増倍管、或いはより好適にはイメージングフォトン検出器でよい（この例 は後でより詳細に説明されるであろう）。好適には、この様な検出器の出力信号 に関連したフォトンは比較波形の各々と比較さね、信号に関連したこの７オトン は波形の最大に比例した出力の時間位置に依存する確率との比較から出力を生成 するような方法である。この場合、この様な出力信号は、後でもっと十分に説明 されるように、イメージの表示を作り上げるために使用され得る。

代わりの実施例では、検出器は電子カメラと結合するイメージ増倍装置から構成 できる。イメージはフォトカソード（増倍装置の）とマイクロ−チャネルプレー トの前面との間の電圧を変調することにより得ることができ、或いは、代わりに 検出器の利得はマイクロ−チャネルプレート、または増倍装置内の適当に配置さ れたグリッドまたは電極上を横切る電圧の変化のような他の手段により変化させ られることができる。増倍装置の二極電子管のようなマイクロ−チャネルを含ま ないイメージ増倍装置もまた使用でき、そして電子管内の加速電圧を変化させる ことにより変調できる。代わりに、増倍装置を含む或いは含まない検出器システ ムを使用でき、光素子の前に置かれたその光伝送は変調できる。一つのイメージ は励起源の変調と位相が同じに変調されたこの電圧を用いて得られ、別のイメー ジは（９）起源の変調（！：）９０度位相変調されたこの電圧を用いて得られる 。実際には、崩壊時間の対比のために要求されるその後のイメージ操作は好適に はイメージからの直流成分の控除後に処理されるので、検出器の変調および励起 変調が反対位相であるところのイメージを生成するのがまた便利であり、そして このイメージの成分は「位相」イメージと「反対位相」イメージを平均すること によりとても簡単に生成される。

好適には、光源は低い高調波含有量を持つ放出にシヌソイドに変動を与えて直接 変調される。

最も好適には、光源は無線周波数の変調に適合された重水素ランプであり、この 光源は良好な波長同調性、低い高調波含有量および非常に高い時間安定性を与え る。

さらにこの発明は添付図面を参照して例としてのみ説明さね、ここに・図１は、 シングルフォトン計数光電子増倍管の使用に基づくこの発明に係る装置の第１の 実施例のブロック図であり：図２は、図１の装置に接続して使用するための相関 回路であり。

図３は、試験回路配置であり。

図４は、較正曲線を示し。

図５は、イメージングフォトン検出器の使用に基づくこの発明の第２の実施例で あり。

図６は、図５の装置に使用されたイメージングフォトン検出器に用いた検出配置 の説明図であり； 図７は、図５の装置を使用して得られた結果を説明する図であり：図８および図 ９は、図５の装置を使用して得られたコンピュータ生成のイメージの写真であり ； 図１０は、強化ＣＣＤカメラの使用に基づ〈発明の第３の実施例を説明する図で あり：そして 図１１　（ａ）、１１　（ｂ）、１２　（ａ）および１２（ｂ）は、図１０の装 置を使用して得られたコンピュータ生成イメージの写真である。

図１および図５の実施例は、−個一個のフォトンを計数する検出器を組み込んで いる。このような（個々の）オトンを計数する）検出器に対し、フォトン相関モ ジュールは検出器に基づく周波数領域の崩壊時間測定の主要な特徴である。従っ て、図１の実施例を説明する前に。このような相関器の動作原理を以下で説明す る。

基本的に、問題は検出器に到達する信号が非常に弱いため、個々のフォトンだけ が離散した間隔で見られる場合に、光源（例えば、蛍光を発する化合物）の位相 シフトと復調を如何に測定するかということである。この原理を説明するために 、信号が連続した場合（すなわち、統計的な動揺を無視できる光電流）の位相と 復調をどうやって測定するかを考慮することは価値がある。一つのアプローチは 、基本周波数にてフーリエサインおよびコサイン変換を測定することである。

その時、（一定の基準に相対的な）位相シフトがサイン対コサイン変換の比のア ークタンジェントを測定することにより与えられる一方、復調はこの変換のＲＭ Ｓ値から計算されるので、要求された情報を測定することができる。サイン曲線 変換を実行するために、信号は適当なシヌソイドにより掛は算さね、所定時間に 亘って積分さべそしていかなる平均成分（ｒＤｃＪ）も控除される。従って、光 電流の位相測定のために、例えば乗算用高速ＲＦミキサーを使用し、フィルタ内 の時間にわたって積分ｔ、このような掛算を用いずに測定された成分（ｒＤＣＪ 成分のように）を控除する。

確率的な信号の表示に対し同じことを達成するために、フォトン計数器からの出 力におけるのと、原理は同じである。コンピュータのメモリ１積化されている） 内に蓄積された所定のフォトン誘導パルスの！率は、シヌソイドに変動するに違 いない。

位相および復調測定のために、サインおよびコサイン変換が必要である。これを 可能にするために、相関器モジュールは２つのチャネルを有し、到来するパルス は弁別さべそして全く同しパルスが同時に各チャネルに与えられる。

このンス；ムは図１においてブロック図の形で示される。

サンプル１０の蛍光発光は、示されるようにグランティラー偏光子１３と結合さ れたポッケルスセル変調器１２を介して通過された水銀アークランプ光源からの 光により励起される。ポッケルスセル１２を通過する光の変調は、示されるよう にＲＦ（無線局ｍスプリッタ１５とＲＦパワー増幅器を通してセル１２へＲＦ倍 信号供給する無線周波数源手段１４により成し遂げられる。従って、サンプル１ ０上に突き当たる光は無線周波数で変調さね、その結果サンプル１０は蛍光発光 する。

図１は光「ビーム」の変調を説明するが、それ自身が変調され得る光源（例えば 、重水素ランプ）を使用することも可能である。従って、変調された光源を用い る場合には、ポッケルスセル１２を用いる必要がなく、変調は直接光源に印加さ れる。

蛍光発光は、ンングルフオトン計数装置である光電子増倍管１７により検出され る。

光電子増倍管１７により検出された各フォトンは、一定分数弁別器１８（○ＲＴ ＥＣ４７３Ａ）を用いて処理される出力パルスを生成する。この一定分数弁別器 は、光電子増倍管１７からのパルスが特定のピーク高さをこえた場合のみ出力を 生成する（従って、より小さい振幅のパルスを生成する光電子増倍管からの雑音 を弁別する）。さらに、一定分数弁別器の出力は光電子増倍管からの入力パルス のピーク高さの一定の部分でのみトリガさね、これにより「ジッタ」を最小にす る。一定分数弁別器の出力は、ＮＩＭにュークリア・インストルメンション・モ ジュール）タイミングパルスである。

このＣＦＤ　（一定分数弁別器）の出力は分割さべ周波数カウンタ１９を通され る最初のパルスを用いて平均フォトン計数速度ＮＯを記録する。

二番目に、一致した弁別器出力は、ＲＦ変調電圧から誘導された同期信号も受信 する相関モジュール２１のフォトン入力への可変遅延腺２０を介して供給される 。

相関モジュール２１内で、ＮＩＭパルスは二つの信号と比較さね、その一つはＲ Ｆ変調洸源１４により供給される）と同位相であり、そのもう一つはそれに対し て９０度位相である。各チャネルにおける比較の目的は、チャネルに印加された ＲＦ倍信号最大に比例したそれらの時間位置に依存する確率をもってフォトン− 関連パルスを「通過」させること断定のチャネルからの出力パルスをトリガする こと）を可能にすることである。ＲＦがピークにある時に到達したフォトンパル スは、受は取りの最大確率を有し、一方ＲＦが最小の時に到達したそれは最低確 率を有する。中間の時間に到達するフォトンは、到達した瞬間にてＲＦ倍信号線 形に比例する「通過」の確率を有する。相関器の別の説明は、以下の通りである 。検出器は、サンプルから放出されたフォトンを検出するだけの能力があり、短 い崩壊時間と長い崩壊時間の核種により放出されたフォトン間の弁別能力はない 。この弁別を与えるのは、同位相と９０度位相との相関である。励起光の変調は 、蛍光発光の崩壊時間が増加するにつれて減少する範囲まで蛍光発光の放出内に 保たれる。同様に放出の最大輝度は、崩壊時間が増加するにつれて増加する範囲 による励起に比例した時間に合わせて（すなわち、同位相で）置き換えられる。

相関関係か同位相のチャネルは効果的にデータを重み付けするので、励起強度の ピークに近い時間に発生した事象は、おそらくほとんど記録される。同様に、９ ０度位相のチャネルは最大励起に比例して遅延する時間に検出がバイアスされる ので、励起のピークに比例して遅延した事象はおそらくほとんど記録され合には 、これらの平均５０には通り抜ける。しかしながら、ＲＦ入力周波数にて変調さ れた光源の光が信号を生成する場合、その時にはチャネルを通り抜けるパルスの 実際の数は、チャネルへのＲＦ大入力比例した変調の深さと位相に依存する。こ の相関関係は唯−真に維持されるので、変調周波数とチャネルへの入力とが同じ であるならば、変調信号内のいかなる高調波も除去される。９０度位相で駆動さ れる２つのチャネルが用意されるので、変調の位相角は各々を通過した時間平均 された数の比較により容易に決定されへこれらの数は「同位相」チャネルに対す るＮｏと９０度位相にあるチャネルに対するＮｏとして図１に示されてる。

しなければならないことは、各計数値から無変調光を用いて得られた計数値（す なわち、ｒＤＣｌ成分、Ｄ）を引いて、残りの計数値の比率を計算することであ る。光変調器を駆動する信号と同位相で駆動されるチャネルからのこの残留計数 値は、実際上は信号のフーリエ成分の「実」部（Ｒｅ）である。同様に、「９０ 度位相」チャネルからの残留計数値は、フーリエ成分の「虚」部（１ｍ）である 。

周知のように、信号の位相角（φ）は、Ｔａｎ　（φ）＝Ｉｍ／Ｒｅにより簡単 に与えられる。変調の深さくＭ）はまた容易に、Ｍ＝（（Ｒｅ）＋（Ｉｍ）２） １／２／Ｄとして決定される。

光の変動のために生じる誤差は、比率モードで周波数カウンタを用いることによ り除去され得る。位相の比または総フォトン数に対する９０度相関の数の比が、 全部の計算において使用される。

相関回路２１の一例が図２に示される。

相関器の動作は、チャネルを介して伝播されるパルスの確率の変調を必要とする 。これを達成するために、フォトン計数弁別器から生じる一定の振幅パルスがト ランジスタＴＲ３，ＴＲ３からなる高速電流ゲートに印加される。光変調器を駆 動する無線周波数源と一定の関係に無い低周波三角波発生器（ＩＣＩ、ＩＣ２゜ ＴＲ１）からゲートに電流が印加される。このゲートの出力は三角形の包絡線内 の振幅範囲を有する一連の負のパルスである；すなわち、この範囲内の全ての振 幅は、十分に長時間のサンプルにおいて等しく表される。これらの振幅変調され たフォトンパルスは、他のどの入力もない各チャネルをパルスの５０％でトリガ させるようバイアスされた一対の高速比較器（ＩＣ５）に印加される。

光変調と同期した無線周波数信号は約６００ｍＶ　ｐＫ−ｐＫに増幅さね、通常 ９０度位相の２つの出力を生成する９０度パワー分割器（メリマック　ＱＨＴ３ −３０）に印加される。これらのＲＦ倍信号各々は、比較器に相補入力を提供し 、そしてそのしきい値を線形に変調する。従って、チャネルを通り抜けるフォト ン生成パルスの確率は、パルスの到達の瞬間におけるＲＦ倍信号振幅に直接比例 する。

この９０度分割器の出力は、トリムボッ）ＲＶＩを用いてこの装置の帯域幅（２ ５，５から３４．５ＭＨｚ）に亘って振幅を平衡させることができる。ネットワ ークから反射されるパワーは、ボート４終端で都合よく吸収される。２つの比較 器間の差のオフセットは、トリムポットＲＶ２を用いてゼロにできる。パルス伸 張器（Ｄｉ、Ｄ２．　也、ＥＣＬ／ＴＴＬ変換器、モノステーブルおよびゲート 制御されたインバータ出力からなる全く同じ論理チェーンを駆動する。高速パル スとＲＦ倍信号扱う回路部分は、接地面と３０オームのストリップ線技術を使用 して配７１１される。２つのチャネル間の対称性を確実にするよう、かつ、メイ ン回路ブロック間のクロスカップリングを最小にするよう注意が払われている。

この回路の本質的な特徴は、決定論的な事象（すなわち、フォトン生成パルスの 有無）は、確率的処理に変換され；最初パルスが２つのレベル間の振幅の一様な 広がりが指定されていない場合、最終の弁別器がＲＦレベルに依存して、２進数 式にパルスを受け入れるか拒否するかだけである。キーポイントは、結果として 要求される振幅の広がりを有するパルスの三角波形はＲＦ倍信号関係せず、従っ てパルス振幅の指定は光変調に全く相関かないということである。

実際には、ＲＦ増幅器、ポッケルスセル変調器および検出電子回路におけるシフ トのために、相関器に印加される変調基準信号と記録されたフォトン速度におけ る実際の変調との間に不定の位相差が存在する。変調された放出の完全なプロフ ァイルは、変更可能な遅延を段階的にすることにより得ることができる。図３は 試験回路を示し、これによってＲＦ倍信号同期するが１２ＫＨｚのパルス周波数 に減じられた速度でシミュレートされた「フォトンパルス」が生成される。この 構成で使用されるパルス締め出しゲートは、我々のフーリエ変換マイクロ蛍光計 からの収集データの精度を上げるために開発された（４）。このゲートはランダ ムな事象（「フォトン」）により開かね、ＲＦ同期パルスを通すことを可能にす る。検出された最初の「同期」パルスが再びゲートを閉じる；このように１個の ＲＦパルスだけが各受信されたランダムパルスに対して得られる。

これらの試験パルスの位相および９０度位相の相関比率は、遅延設定の関数とし て記録されへそして図４は典型的な較正を示す。最適な相関器の特性を与えるた めに４つの因子が制御されなければならないことが理解できるニーａ）　相関の 無い事象の５０％受は入れを与えるよう調整されたバイアス、ｂ）　相関の線形 範囲を十分に利用するために選択された振幅Ｃ）　平衡された位相と９０度位相 の相対的な振幅ｄ）　ゼロまで減少された位相−９０度位相差のオフセットこれ らの調整はシステムが計数する間中実行することができ、較正はどの所望の周波 数においても得られる。使用される位相スプリッタは非常に広い帯域幅に亘って は９０度位相信号を生成することができないので、記載した相関器はかなり小さ い周波数範囲で動作するよう設計される。我々の目的に関しては、このことは限 界ではない。フェイズロックドループに基づく位相／９０度位相信号源の使用は 、本相関器よりも広い帯域幅に亘って動作することを可能にするであろう、我々 はこの代替を調査している。実際には２〜３度の不平衡が導く誤差は無視できる ので、この相関器に使用されるＲＦ信号間では正確に９０度位相を達成する必要 はない。励起源変調器に対する駆動と相関器を駆動する「同位相ＪＲＦ信号との 近接した位相整合を確実にするために一般的に遅延線が配置使用される。しかし ながら、既知の基準蛍光発光サンプルの位相と９０度位相成分の測定は固定され た器具の位相シフトに対して較正するための簡単な道筋を提供するので、これは 決定的なものではない。

記載した相関の原理は、相関器が基本周波数を効果的に取り除くので、変調され た励起か純粋なンヌソイドでない位相シフトと復調比の正確な測定を可能にする 。普通は、高調波のない変調は望ましい目標であり、それは高変調深さにおいて 達成することは困難である。代替案は、非シヌソイド波形を有する励起源をゆっ くりと駆動し、そしてその波形結果を高調波解析をすることである。この相関器 は並行してフォトン生成パルスを処理するために基本ＲＦの高調波と相関される 検出チャネルの追加の組を付加するとによって、そのような測定に容易に適合さ れる。

光電子増倍管１７は１点ずつ点上だけの崩壊時間測定能力があるが、レーザ光源 を使用してイメージを生成する洪焦顕微鏡と同じような）光学的走査システムと 共に使用することができる。代替の配置において（図示されない）、レーザビー ム（適当に変調される）が励起源として使用でき、その完全なイメージを得るよ うにサンプルの全領域に亘って走査できる。

さらに、別の実施例において、光電子増倍管は空間的分解検出器、例えば図５に 示すようなイメージフォトン検出器により置き換えることができる。

図５の構成は、図１の構成と多くの点で類似しており、そして同様の部分には同 一の参照符号により同一のものとして示す。図５の構成は、洸電子増倍管１７の 位置において）、例えばアイティーニル社により製造されたイメージフォトン検 出器（ＩＰＤ）を配置する。ＩＰＤは、検出器ヘッド１００とこのヘッドからの 信号を処理する遠隔電子モジュールとから構成されている。ＩＰＤの原理は、単 純であり、図６に示される。光電陰極１０２に衝突するフォトンは、陰極に対し て焦点を合せて近接するマイクロチャネルプレート電子増倍器１０３のスタック に引き込まれる電子を発生する。チャネルプレートスタックの後方に放出される 電子バースト１０４は、特有の形状を有する抵抗型陽極１０５に加速されて衝突 する。この抵抗型陽極１０５は、それぞれの角部で電荷に感応する前置増幅器１ ０６を備えている。適正なアナログ処理により、電子バースト１０４の陽極への 到達位置を測定することは可能である。それは、陽極に対して接続されたそれぞ れの前置増幅器によって感応して相対的に電荷を決定するからである。適正な処 理をする電子部品は、ディジタルアドレスへのこの位置情報を符号化し、雑音パ ルスと宇宙線の影響を除去するために全パルス振幅をチェックすることを必要と する。明らかに、その様に発生したディジタルアドレスは、光電陰極での初期入 射フォトンの到達点に位置する。ＩＰＤイメージヤにおいて、ディジタルアドレ スは、フレームスドアに位置付けらね、対応するメモリロケーションは増大する 。この様にして、イメージは、フレームスドアにおいて構築された計数として時 間経過して構築される。標準型ＩＰＤは、検出器ヘッドの内部的レイアウトにお ける組み込みの変更のためと、最終マイクロチャネルプレートの後部表面に対し 接続する処理の速い前置増幅器１０７を含むように、出願人によって設計変更さ れた。この設計変更は、それぞれのフォトンの到達時間を記録するための迅速な タイミング回路構成を許容する。ＩＰＤの抵抗型陽極から迅速なタイミングを十 分に実行することは可能ではない。それは、その高抵抗が、この方伝によって使 用された空間的分解陽極粉袋と分解など）が他の型式であっても、長い時定数を 与えるからである。

チャネルプレートスタックの後方から取出される迅速なタイミングパルスは、オ ーチック４５４タイミングフイルタ増幅器を使用してさらに増幅さね、そして定 数弁別器（オーチック４６３）をトリガする。この弁別器からの出力は、一般的 に構築される電子モジュール内に導入されへ　（図２に示されかつそれを引用し て説明されるように）その目的は、適正な無線周波数信号でタイミングパルスを 相関させることである。相関器は２つの出力を有する。「フラグ」としてのこれ らの動作は、ホストコンピュータによって個別的に感知することができる。フラ ッグが設定されていれば、オフセットがＩＰＤヘッドにより発生したディジタル アドレスに対し加えらｊウモしてこのロケーションでのメモリは増大する。この 様にして、超過時間の３つの個別イメージは、コンピュータに蓄積する。それら の１つは、ＩＰＤヘッドにより見られる普通の明るさのイメージである。他の２ つのイメージは、同じであるか、相関器モジュールにより処理される。

相関器の操作の原理は、前述した通りである。相関器の他の設計は可能であり、 そして実施例として示される概略図に対して変更および拡張することは、科学的 および技術的分野の当業者において明白であろう。

このような相関器に対する入力が、光を変調して検出するシングルフナトン計数 管から供給されたならば、「９００位相位相よび「同位相」チャネルからの集積 総計パルス計数は、平均値として重ね合わせられる出力信号に対して、個別にサ インおよびコサインの変換に相当するであろう。蒼然的な相関器は、増大するア ナログ信号のシングルフォトン長さにおいて、シヌソイドおよび集積結果により 、等価である条件を満たしている。信号の平均値が、相関器の各チャネルからの 集積された出力より減じ、そして残りが分割されるならば、その結果は、検出信 号と基準のコサインとの間の位相角のタンジェントとして与えられる。減算に対 する平均値は、相関器へのＲＦ基準信号を切換えることにより、簡単に決定され る。相関器に代えて、励磁変調で反対位相において相関する追加チャネルを設け ることができ、そして「位相」および「反対位相ｄチャネルの平均は、減算に対 する「ＤＣ」構成要素として使用することができる。

検出器がＩＰＤであるとすならば、各処理フォトンパルスは、コンピュータメモ リのアドレスと結びつけられる。イメージにおける位相シフトの測定に対する前 記相関器の概略図の拡張は、きわめて簡単である。各メモリロケーションは、カ ウンタとして動作し、そしてイメージの１ピクセルからデータを集積する。ＩＰ Ｄを備えた電子プロセッサは、データが有効であることを表示するストローブパ ルスを与える。この装置において、このストローブパルスは、エイコーン　アー キメデスＲＩＳＣコンピュータと接続されたインタフェースアダプタにフラグを セットする。

位相シフトにより重みを付けられたイメージを演算するため、「９０°位相」お よび「位相Ｊチャネルからのイメージは、それぞれｒＤＣｌイメージ（前述した 「位相」−「反対位相」を平均することにより得られるか、または予備演算およ び相関しない「輝度」イメージのスケーリングにより得られる）の減算によって 処理される。結果としてのイメージは、単純に分離される。復調により重みを付 けられたイメージを得るために、イメージのＲＭＳの和か演算される。

図７は、図５の装置を操作する手段についての簡略図を示す。すなわち、短期崩 壊時間に関連する螢光サンプルＣ図７に（ａ）で示す）は、励起放射線と殆ど同 位相である放射信号を与える。この様に、「同位相」イメージは、「９０°位相 」イメージよりも強いものと考えられる。反対に、長期崩壊時間に関連する螢光 サンプル（図７の（ｂ）参乳は、励起放射線との相以舛に関連し、それに関して は弱められる放射信号を与える。この様に、「同位相」イメージは、「９０°位 相」イメージを僅かに強めるのみである。短期崩壊時間に関連するサンプルにつ いての装置から得られる最終イメージは、長期崩壊時間に関連するサンプルに対 するものから区別し得るであろう。

装置の使用によって得られる実際的な結果は、図８および９に示される。

図８は、きわめて短い崩壊時間のＰＯＰＯＰ　［１，４ジー［２−（５−フエニ ロキサゾイル）］ベンゼン〕の長針様のクリスタルと並へてアントラセン鳴壊時 間、概算９ｎｓｅｃ、）のクリスタルを示す。概算崩壊時間は、別々に、崩壊時 間微小螢光計を使用して測定した。相関器は、崩壊時間イメージに対し３１２５ ＭＨｚの周波数で操作した。上部左側のイメージは、相関器の「９０°位相」チ ャネルにより蓄積さね、また上部右側は「同位相」イメージである。両方の場合 、アントラセノ放射はイメージを目立たせている。崩壊時間の重みを付けたイメ ージは下部に示す。この場合、螢光輝度のコントラストは失われており、短い崩 壊時間の核が最も明るく表われている。従って、アントラセンおよびＰＯＰＯＰ のクリスタルは、非常に明瞭に区別される。

きわめて類似したイメージが図９に示されている。ここには、クリスタルは、Ｐ ＯＰＯＰおよびきわめて長い崩壊時間を有するユーロピウムの螢光錯体である。

変調周波数の使用で（再度、３１．２５ＭＨｚ）、この放射は全体的に復調され る。上部の一対のイメージでの輝度のコントラストは、ユーロピウム錯体がＰＯ ＰＯＰと区別されることを直ちに認めることはできないが、しかしサンプルの組 成は、下部の崩壊時間の重みを付けたイメージから示唆される。

崩壊時間の重みを付けたイメージについて、原理的に、位相／′復調技術を使用 して、完成させることかできる幾つかの他の方法が存在する。１つのアプローチ は、カメラの前に置く光学変調器を使用することであり、変調器が励起光源と同 位相および９００位相に操作されるイメージを得ること、すなわち変調イメージ より減算される平均輝度の測定を行うように無変調となるイメージを蓄積するこ とである。不幸にして、このアプーチは、標準光学変調器がイメージシステムに 良好に作用しないので、原理的に困難である。代案として、探求したものは、電 子カメラの前に置くイメージ増倍器で利得変調またはスイッチングを使用するこ とである。潜在的な問題は、良好な変調度と変調の直線性とを同時に達成するこ とが困難なことである。励起光である限り、この点については、調波的に純粋な ンヌソイドで良好に変調される。これは、不十分な平行光源、すなわちキセノン あるいは水銀アーク灯で作用するポッケルス電極では特に困難である。この様な 状況下において、結果としてのイメージは、イメージシステムの利得がシヌソイ ド的に変化するとしても、螢光崩壊の実際の表示のみであり、それにより調波は 平均して時間超過となる。しかしながら、光源が利得切換えモードまたはシヌソ イト的な変調で、所望的に使用することができる増倍器の低調波の内容（レーザ ーおよび直接変調重水素源で達成することができるような）で、シヌソイド的に 変調される。

図１０の構成配置において、螢光サンプル２００は、ＲＦ源２０２による無線周 波数で変調された光源２０１（例えば、重水素ラン力で発光している。サンプル ２００のイメージは、ＣＣＤカメラ２０３を使用して得られ、そのカメラの前に 正しく置くイメージ増倍器２０４と接続配置されている。ＲＦ源２０２からの信 号は、信号を０°、９０°および１８０°に選択的にシフトできる位相シフタ２ ０５を介して増倍器の利得制御のために供給される。この結果の信号は、増倍器 の利得を変調するために使用される。

図１０の構成配置についての操作は、増倍器２０４は、予定された時間の周期に 対し、光源２０１（例えば、位相シフタ２０５での０°シフト）で、同位相に変 調さ姐そしてイメージはカメラ２０３を使用して得られる。このイメージは、コ ンピュータにストアされる。同様にして、イメージは、光源の変調と共に９０° 位相および反対位相に変調する増倍器で得ることができ、それぞれのイメージは コンピュータ２０６にストアされる。両者が短期崩壊時間の核を得る３つのイメ ージ（同位相、９０°位相、反対位相）の実施例は、図１０に（ａ）として概略 的に示めさね、そして比較としての長期崩壊時間の螢光核に対する対応するイメ ージは、（ｂ）として示めされる。短期崩壊時間の核に関し、最も強いイメージ は、利得が光源と同位相に変調される場合に得られ−より少ない輝度のイメージ は、変調が９０°位相の場合に得られ、そして最も弱いイメージは、利得が反対 位相の場合に得られる。長期崩壊時間の核が関係する限りにおいては、前と同じ 方向であり、相違することは、非常に少ない特徴付けがなされることである。崩 壊時間が完全な復調放射に対し相当長いことから、理論的に３つの同じイメージ が結果として生じる。

イメージは、次のように演算される。増倍器の光電陰極（表面抵抗および容量と なるような不均一性を生じさせることができる）に交差するＲＦ位相シフトまた は変調度の変化に対し補正する目的で、最良の作業として、補正イメージが基準 サンプルすなわち散乱するサンプルまたは公知の崩壊時間のサンプルを使用して 演算処理される。このイメージは、励起と共に増倍器の同位相（Ｐ）、９０゜位 相（Ｑ）および反対位相（Ａ）で変調するイメージの測定により算出さね、そし て演算結果は次の通りである（但し、サブスクリプト（ｘ　ｙ）は、各イメージ においてピクセルとして与えられものと対応する）。

［Ｑ　−（Ｐ＋Ａ）　／２］　／　ＣＰ　−（Ｐ＋Ａ）　／２１　＝　Ｉ　（ｘ ｙ）同様の計算は、Ｉ′　で与えられるサンプルに対しても実行し得る。補（ｘ 　ｙ） 正されたイメージの結果は、次の通り算出される。

この様な手順は、選択した周波数で「位相シフトによる明白な崩壊時間」に基づ くイメージを与える。他の計算は、復調によって、または位相、復調、輝度など の混合によって、重み付けられたイメージを発生するために使用することができ る。

輝度増倍ＣＣＤシステムを使用する実施例は、図１１ａとｌｌｂおよび図１２ａ と１２ｂに示される。図１１ａにおいて、輝度イメージは、キナクリン塩化水素 で染色したオニオン表皮層が示される。崩壊時間を重み付けたイメージ（図１１ ｂ）は、コントラストのない、サンプルを交差するほぼ一定の崩壊時間の表示を する。他方において、図１２ａは、オニオンが臭化エチジウムで染色された同様 の写真（高倍率）を示す。この場合において、崩壊時間を重み付けたイメージ（ 図１２ｂ）は染色した原子核□□□壊時開時間い）とセルの残りとの間のコント ラストを明瞭に示している。

イメージ増倍器に基づくイメージ検出器は、真のマルチチャネル装置であり、よ って高電子増倍管の技術に基づくいずれのシングルチャネル装置を越える大きく 多様な利点を提供する。出願人は、速度時間応答に対し導電陰極を有する一般的 構築のマイクロチャネルプレート型イメージ増倍器を使用して時間分解イメージ を達成し、そして現在までの結果、３０メガヘルツ以上の変調周波数で蓄積され るイメージを認めた。それは、設計が高周波数までに至るように最適化できたこ とであると確信する。

ＩＰＤおよびＩＣＣＤイメージヤの比較変調増倍器を使用してイメージを比較す ると、ＩＰＤシステムは、それは本質的にシングルチャネル装置（しかし、勿論 出力は異なる周波数または基準位相で同時に処理するための分解をすることがで きる）であるが、イメージを蓄積することが遅くなることは避けられない。しか しながら、この不利益は、相関操作が励起光での調波歪みを拒否するために有効 なフィルタであるので、高度の線形的応答を達成すべく固有の能力によって除去 される。加えて、ＩＰＤの心臓部は、本質的にマイクロチャネルプレート型増倍 器であるが、この装置の時間応答は優れており、出力パルスに感応する増幅器／ 弁別器の混合器の特性によって制限される。それは、ＲＦミキサの技術を使用し てきわめて広い周波数レンジで相関を簡単に達成することができ、そしてこれは 論理的発展である。さらに加えて、それは、並列マルチ周波数操作に対し、相関 器を拡張することにより、励起光における避けられない調波歪みについて使用す るのに適している。再び、相関器の設計は、同位相、９０°位相、反対位相おび 反９００位相で相関するようにチャネルを使用することにより、単一の周波数に 対する拡張をすることができる。このようなアプローチは、ここに述べた２重チ ャネルシステムにおいて、パルスの５０％についてのみは、各相関チャネルに対 して処理されるので、蓄積時間を与えるための信号対ノイズの比を最適化する。

ＩＰＤイメージヤは、崩壊時間のイメージは、すなわち励起／放射マトリクス型 の多次元分光学として、その応用につき示唆さべそして位相による明白な崩壊時 間の別の次元は、追加することができる。他の製作者は、従来のパルス励起シス テムにおける類ナノ秒でタイミングをとるために、ＩＰＤシステムを使用してお り、そしてその装置は、シングルフォトン計数（７）を使用する従来の崩壊時間 の螢光分析において明瞭に可能性を有している。この発明における位相／復調の 測定の利点は、コンピュータ記憶部の使用が非常に有効であるフォーマットで都 合よく情報を圧縮する能力があり、従って励起のための従来のアーク源の使用が 認められることになる。単一変調周波数で作動し、しかし励起および／または放 射の波長で決定される単純なシステムに対しての位相による明白な崩壊時間を測 定する能力は、固定した励起／放射のの波長でマルチ周波数で測定するために、 可変的に変更できることが判明した。差動的に偏光させる位相螢光分析に対する この技術の応用は、分光感度において、および生物学的サンプルでのイメージに ついての両方で示唆される。

ｒＰＤ崩壊時間イメージヤの心臓部は、相関器モジュールである。ここに述べた ように、共焦のイメージヤのようなスキャニングシステムにおけるシングルフォ トン計数光電子増倍管と共に同等に使用することができる。共焦のレーザーイメ ージヤは、優れた深さの弁別を表示するものとして、今日生物学上きわめて一般 的である。しかしながら、シングルチャネルシステムが感度においてマルチチャ ネルシステムと等価となるように、広く光の輝度と比較するということは、両装 置において照明サンプルとして使用すべきことである。共焦のスキャナにおいて 、サンプルの大部分が発光していないいかなる場合においても、発光部分はきわ めて高い輝度を示す。これは、三重項−三重項消滅のような処理の可能性が、こ のような条件で消去し得ると考えることができないので、蛍光測定の基本的な光 物理学上の歪みとして現れる結果である。従って、量的な共焦のイメージヤにお ける直線性について、それは光の輝度を低減しそしてイメージを通常よりゆっく りと蓄積することについての必要な試験を行うことが好ましい。フォトン計数検 出は、検出器の利得変調よりもむしろ、これらの雰囲気下において必要であろう 。そこで、相関器は好適な試験をすべきである。この様な特質をもって、出願人 は、共焦のスキャニングシステムにおける崩壊時間の測定が、高価でありそして 容易に実行できるものであることを考慮した。

ＩＰＤのみならず増倍器技術においてもまた使用する共焦のイメージヤは、この 瞬間の点源の輝度が、好ましい感度を保持している間レーザースキャナに対して よりもより低くできるので、スリットまたはディスクスキャニング顕微鏡を使用 して構築することができる。

イメージにおける蛍光崩壊時間の測定をすることの能力は、潜在的に蛍光顕微鏡 イメージの計量を改良することができる。蛍光が力学的に消滅するならば、その 崩壊時間は低減され、そして測定される蛍光輝度もまた低減される。この様に、 消滅の力学がサンプルの点から点へ変化するので、輝度のそれ自体の変化により イメージにおける蛍光の集中的プロファイルを測定するは困難である。崩壊時間 を重み付けたイメージの同時測定は、どの様な場合でも補正することがでるが、 蛍光の全部の静的消滅については勿論できない。

引用文献 １．　Ｗａｒｅ、Ｗ、Ｒ，１９８３，Ｔｉｍｅ　Ｒｅ５ｏｌｖｅｄＦｌｕｏｒｅ ｓｃｅｎｃ：　５ｏｅｃｔｒｏｓｃｏｏｖ　ｉｎ肋ｘｈｅｍｉｓｔ　ａｎｄ　Ｂ ｉｏｌｃｅｖ、　＼、”＋ＴＯＡＳＴ　５ｅｒｉｅｓ　Ａ、　Ｌｉｆｅ　５ｃｉ ｅｎｃｅｓ　Ｅｄ、　Ｒ。

Ｂ、　Ｃｕｎｄａｌｌ、　ａｎｄ　Ｒ，Ｅ、　Ｄａｌｅ　（Ｎａｗ　Ｙｏｒｋ： 　Ｐｌｅｎｕｍ）　６９Ａ、　２３゜２、　Ｔａａｌｅ、Ｆ、Ｊ、Ｗ、１３　Ｔ ｉｍｅ　Ｒｅ５ｏｌすｅｄ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　５ｏｅｃｔｒｏｓｃｏ 　ｖ　＋ｎＢｉｏｃｈａｍｉｓｔ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｉｖ、ＮＡＴＯＡＳＴ　 ５ｅｒｉｅｓ　Ａ、Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄ、ＲＢ、　Ｃｕｎｃｌａｌ ｌ　ａｎｄ　Ｒ，Ｅ、　Ｄａｌｅ　（Ｎａｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｐｉｅｎｕｍ）　６ ９Ａ、　５９゜３、　Ｓｃｈｌａｇ、　Ｅ、Ｗ、、　５ｅｌｚｌｅ　Ｈ−Ｌ、、 　５ｃｈｎｅｉｄｅｒ、　Ｓ　ａｎｄ　Ｌａｒｓｅｎ、　Ｊ、Ｃ，、１９７S， Ｓｉｎｇｌｅ ｐｈｏｔｏｎ　ｐｈａｓｅ　ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒ７　ｗｉｔｈ　ｎａｎｏｓｅ ｃｏｎｄ　ｔｉｍｅ　ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎＲｅｖ、　Ｓｃｉ、　Ｉｎｓｔｒｕ ｍ、、　４５．３６４４、　Ｍｕｒｒａｙ、　Ｊ、Ｇ、、　Ｃｕｎｄａｌｌ、　 Ｆ！、Ｂ、、　ｂｌｏ＝ｇａｎ、　ＣＧ、、　Ｅｖａｎｓ、Ｇ、Ｂ、　ａｎｄ　 Ｌ■翌奄刀A　Ｃ。

１９８６、Ａ　ｓｉｎｇｉｅ−ｐｈｏ℃ｏｎ−ｃｃＩ−，１ｔａｒ：ｇ　：ｏｕ ｒ＋ｅｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍ　ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒｏｍ■狽■■ Ｊ、　Ｐｈｖｓ、　Ｅ、　Ｓｃｉ、　ＩｎｓｚｒＩＪｍ、、　１９．３４９５、 ５ｐｅｎｃｅｒ、　Ｒ，Ｄ、　ａｎｄ　Ｗｅｂｅｒ　Ｇ、　１９６９　間ｅａｓ ｕｒｅｍｅｎｔｓ　ｃｆ　５ｕｂ−ｎａｎｏｓｅｃｏｎ■ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｌｉｆｅｔｉｍｅｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ｃｒｏｓｓ− ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｐｈａｓｅ　ｆｌｕｏｒｏｍｅｔ■■ Ａｎｎ、Ｎ　Ｙ　Ａｃａｃｌ、Ｓｃｉ、、１５８，３６１６、　Ｄ、　Ｒｅｅｓ 、１．　ＭｃＷｈｉｒｔｅｒ、Ｐ、Ａ、　Ｒｏｕｎｃｅ　ａｎｄ　Ｆ、Ｅ、　Ｂ ａｒｌｏ−°；　Ｊ、　Ｐｈｙｓ、　iＥ）　１４ ２２９　（１９８１）。

？、Ｗ、Ｇ、ＭｃＭｕｌｌａｎ、Ｓ、ＣｈａｒｂｏｎｎｅａｕａｎｄＭ、Ｌ、Ｗ 、Ｔｈｅｗａｌｔ；Ｒｅｖ、ＳｃｉＩｎｓｔｒｕｍ、　５８（９）　１６２６　 （１９８７）要約書 サンプルを発光するために配置した励起光源と、予定した周期的方法で励起光の 輝度を変調またはパルス化する手段と、ルミネセンスの結果としてサンプルによ り放射されるフォトンを検出する検出器手段と、検出されたフォトンを表示する データをストアし、このストアされたデータをフォトンの検出と周期的可変変調 との間の位相差の関数として重み付けする手段と、および崩壊時間を重み付けし たストアされたデータからの情報を発生する手段とから構成することを特徴とす る崩壊時間を重み付けしたルミネセンスのサンプルの情報（例えば、崩壊時間を 重み付けしたイメージ）を発生する装置。

補正書の写しく翻沢り提出書 （特許法第１８４条の８） 特許庁長官　蘇生　渡　殿　平成４年７ＪＨ３Ｅ１１、特許出願の表示　囚 ＰＣＴ／ＧＢ９１１０００４６ ２、発明の名称 ルミネセンスの測定 ３、特許出願人 住　所　イギリス国、エム５４ダブリユーテイー、ツルフォード（番地なし）名 称　ユニバーシティ　オブ　ツルフォード（国　籍）　（イギリス国） １９９１年１２月１６日（平成　３年１２月１６日）６　添付畜類の目録 （１）補正書の写しく翻沢対　１通 するための装置が提供される。

ない。十分な励起光強度が利用できる場合でさえも、通常は、例えばサンプルへ の光損傷を最小にするよう検出感度を最適にすることが望ましい。このために、 シングルフォトン数検出を使用することが特に便利である。先の論文（４）にお いて、位相／変調螢光測定法と共にシングルフォトン数検出を用いる一つの手段 を述べた。ヒストグラムデータの高速フーリエ変換（ＦＦＴ）分析を用いたこの アプローチは、時間−パルス振幅変換器からの出力の多チヤンネル解析結果を設 定した。

ディジタル相関関係に基つく、フすトン数を用いた位相シフト測定への代替アプ ローチが述べられている（５）。この技術では、変調周波数における方形波の「 ゲート」が２つの高周波カウンタ間に信号を向けるために用いられた。この方形 波形の位相は調整でき、２つのカウンタ間の計数比を最大にするので、この放出 の位相を簡単に測定することができる。このアプローチは、（４）に概説された ものよりもより簡単かつ安価であり、しかもより高速で計数する能力がある。

しかしながら、その原型においては、励起源が純粋なシヌソイドで無い場合、誤 差が発生するという不都合がある。

本発明によれば、サンプルに照射するよう配置された励起光源と、予め設定され たサイクリックな方法で光源の強度を変調またはパルス化するための手段と、 照射結果としてそのサンプルにより放出されたフォトンを検出するための検出器 手段と、 フォトンの検出とサイクリックに変化する変調との間の位相差の関数として重み 付けされているデータであって、検出されたフォトンを表すデータを記憶するた めの手段と、かつ 各々予め設定されたサイクリックな方法で変化すると共に、お互いに関して既知 の位相シフトを有する２つの基準信号を用いて得られる重み付けされた記憶デー タであって、この記憶データから重み付けされた崩壊時間の情報を生成するため の手段と、 から構成されるルミネセンスのサンプルの重み付けされた崩壊時間の情報を生成 この発明は重み付けされた崩壊時間のイメージ生成に特に適用可能であるが、例 えば、時間分割の螢光発光無偏光測定、微分偏光位相シフト測定、および従来の 螢光発光崩壊時間の測定と同様に螢光発光の崩壊パラメータにおける時間依存変 化の測定、などの他のタイプの重み付けされた崩壊時間情報を提供するのに使用 し得る。この発明の幾つかの実施例（例えば、図５および図１０に関連して後で 説明されるイメージング配置）は励起と放出のパラメータに関連した崩壊時間を 表す励起放出マトリクスの測定のようなスペクトルで分散されたアレイの検出に 適応される。

この信号と光源の変調との間の位相関係もまた既知であるべきであり、好適には 比較波形の１つは前記変調（これは無線周波数範囲であってもよい）と位相が同 じである。好適には、基準波形はお互いに関して９０度位相である。

好適には、基準波形と励起源の変調とはシヌソイドである。

好適には、検出器はシングルフォトンを検出する能力がある。例えば、検出器は 光電子増倍管、或いはより好適にはイメージングフォトン検出器でよい（この例 は後でより詳細に説明されるであろう）。好適には、この様な検出器の出力信号 に関連したフォトンは基準波形の各々と比較さね、信号に関連したこのフォトン は波形の最大に比例した出力の時間位置に依存する確率との比較から出力を生成 するような方法である。この場合、この様な出力信号は、後でもっと十分に説明 されるように、イメージの表示を作り上げるために使用され得る。

代わりの実施例では、検出器は電子カメラと結合するイメージ増倍装置から構成 できる。イメージはフォトカソード（増倍装置の）とマイクロ−チャネルプレー トの前面との間の電圧を変調することにより得ることができ、或いは、代わりに 検出器の利得はマイクロ−チャネルプレート、または増倍装置内の適当に配置さ れたグリッドまたは電極上を横切る電圧の変化のような他の手段により変化させ られることができる。増倍装置の二極電子管のようなマイクロ−チャネルを含ま ないイメージ増倍装置もまた使用でき、そして電子管内の加速電圧を変化させる ことにより変調できる。代わりに、増倍装置を含む或いは含まない検出器システ ムを使用でき、光素子の前に置かれたその光伝送は変調できる。一つのイメー１ 、サンプルを発光するために配置した励起光源と、予定した周期的方法で励起光 の輝度を変調またはパルス化する手段と、ルミネセンスの結果としてサンプルに より放射されるフォトンを検出する検出器手段と、 検出されたフォトンを表示するデータをストアし、このストアされたデータをフ ォトンの検出と周期的可変変調との間の位相差の関数として重み付けする手段と 、および 重み付けしたストアされたデータを、予定した周期的方法でそれぞれ変化する２ つの基準信号を使用し、カリ相互に関係を有する公知の位相シフトを保持するこ とにより得て、この崩壊時間を重み付けしたストアされたデータからの情報を発 生する手段とから構成することを特徴とする崩壊時間を重み付けしたルミネセン スのサンプルの情報を発生する装置。

２、基準信号の一方は、光源の変調またはパルス化と同位相である請求の範囲１ 記載の装置。

３、基準信号は、相互の関係が９０°位相である請求の範囲１または２記載の装 置 ４、検出器手段は、空間的に決定する検出器である請求の範囲上ないし３のいず れかに記載の装置。

５、崩壊時間を重み付けした情報を発生する手段は、崩壊時間を重み付けしたイ メージを発生する能力を有してなる請求の範囲上ないし４のいずれかに記載の装 置。

６、励起光の輝度を変調またはパルス化する手段は、光源から放射される光で作 動してなる請求の範囲１ないし５のいずれかに記載の装置。

７、ポッケルス電極は、光源からの光を変調するために設けてなる請求の範囲６ 記載の装置。

８、光源は、変調しまたはパルス化して励起光を放射するように、変調またはノ ＜ルス化すべく適合してなる請求の範囲１ないし５のいずれかに記載の装置。

９、光源は、重水素ランプである請求の範囲８記載の装置１０、検出器は、シン グルフォトンを検出し、かつそれに対する応答出力を生じる能力を有してなる請 求の範囲１記載の装Ｌ１１、相互に位相が外れており、そして励起光を変調また はパルス化する関係で予定の位相関係にある少なくとも第１および第２の相関器 信号を発生する手段と、前記第１および第２の信号のそれぞれと検出されたフォ トンの検出表示の出力を相関し、かつ個々の相関する時間での位相サイクルにお いてその位置に従属している可能性のある関数が満足し得るかどうかを、前記各 相関器からの出力信号として独立して発生する手段と、前記相関器からの出力信 号はデータ保持手段に供給するよう構成することを特徴とする請求の範囲１０記 載の装置１２、検出器は放射された検出フォトンからのサンプル上の位置に対す るように位置的情報を提供する能力を有し、データ保持手段はサンプルの第１お よび第２のイメージ表示をストアする能力を有し、前記表示は放出される検出フ ォトンのサンプル上の位置の位置アドレス表示と関連し、出力信号は第１のイメ ージ表示において増大する検出フォトンのサンプルの位置と対応する位置的アド レスを生じる第１の基準信号を有する相関器から起因し、さらに出力信号は第２ のイメージ表示において増大する検出フォトンのサンプルの位置と対応する位置 的アドレスを生じる第２の基準信号を有する相関器から起因してなる請求の範囲 １１記載の装置。

１３、検出器はイメージフォトン検出器である請求の範囲１２記載の装置。

１４、第１の基準信号は励起光の変調またはパルス化と同位相であり、第２の基 準信号は励起光の変調またはパルス化と９０°位相である請求の範囲１０ないし １２のいずれかに記載の装置。

１５、フォトンを検出する手段は、イメージ増倍器が配置される電子カメラと、 相互に位相が外法かつ励起光の変調またはパルス化と関連して予定された位相関 係を有する２つの異なる条件で、増倍器の利得を周期的に変調する手段とから構 成してなる請求の範囲１記載の装置。

１６、増倍器の利得を変調する第１の条件は、励起光の変調またはパルス化と同 位相であり、他の条件はそれらの関係が９０°位相である請求の範囲１５記載の 装置。

１７、増倍器の利得を周期的に変調する手段は、さらに励起光の変調またはパル ス化と反対位相関係で利得を変調する能力を有してなる請求の範囲１６記載の装 置。

１８、崩壊時間を重み付けした情報を発生する手段は、光検出器の特性の空間的 不均一性に対し補正するために、公知の特性の基準イメージを使用する手段を含 んでなる請求の範囲１５ないし１７のいずれかに記載の装置。

＋９．励起光は無線周波数でパルス化または変調してなる請求の範囲上ないし１ ８のいずれかに記載の装置。

国際調査報告 ｌｍｓ”雪ｉｍ＊ｊｌＡｓｓｌｃ＊＋ＩＩＩＩＩＩｓｐｃつコ／ＧＢ９１１００ ０４６

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．サンプルを発光するために配置した励起光源と、予定した周期的方法で励起 光の輝度を変調またはパルス化する手段と、ルミネセンスの結果としてサンプル により放射されるフォトンを検出する検出器手段と、 検出されたフォトンを表示するデータをストアし、このストアされたデータをフ ォトンの検出と周期的可変変調との間の位相差の関数として重み付けする手段と 、および 崩壊時間を重み付けしたストアされたデータからの情報を発生する手段とから構 成することを特徴とする崩壊時間を重み付けしたルミネセンスのサンプルの情報 を発生する装置。
2. ２．重み付けしたストアされたデータは、予定した周期的方法でそれぞれ変化す る２つの基準信号を使用し、かつ相互に関係を有する公知の位相シフトを保持す ることにより得ることからなる請求の範囲１記載の装置。
3. ３．基準信号の一方は、光源の変調またはパルス化と同位相である請求の範囲２ 記載の装置。
4. ４．基準信号は、相互の関係が９０°位相である請求の範囲２または３記載の装 置。
5. ５．検出器手段は、空間的に決定する検出器である請求の範囲１ないし４のいず れかに記載の装置。
6. ６．崩壊時間を重み付けした情報を発生する手段は、崩壊時間を重み付けしたイ メージを発生する能力を有してなる請求の範囲１ないし５のいずれかに記載の装 置。
7. ７．励起光の輝度を変調またはパルス化する手段は、光源から放射される光で作 動してなる請求の範囲１ないし６のいずれかに記載の装置。
8. ８．ポッケルス電極は、光源からの光を変調するために設けてなる請求の範囲７ 記載の装置。
9. ９．光源は、変調しまたはパルス化して励起光を放射するように、変調またはパ ルス化すべく適合してなる請求の範囲１ないし６のいずれかに記載の装置。
10. １０．光源は、重水素ランプである請求の範囲９記載の装置。
11. １１．検出器は、シングルフォトンを検出し、かつそれに対する応答出力を生じ る能力を有してなる請求の範囲１記載の装置。
12. １２．相互に位相が外れており、そして励起光を変調またはパルス化する関係で 予定の位相関係にある少なくとも第１および第２の相関器信号を発生する手段と 、前記第１および第２の信号のそれぞれと検出されたフォトンの検出表示の出力 を相関し、かつ個々の相関する時間での位相サイクルにおいてその位置に従属し ている可能性のある関数が満足し得るかどうかを、前記各相関器からの出力信号 として独立して発生する手段と、前記相関器からの出力信号はデータ保持手段に 供給するよう構成することを特徴とする請求の範囲１１記載の装置。
13. １３．検出器は放射された検出フォトンからのサンプル上の位置に対するように 位置的情報を提供する能力を有し、データ保持手段はサンプルの第１および第２ のイメージ表示をストアする能力を有し、前記表示は放出される検出フォトンの サンプル上の位置の位置アドレス表示と関連し、出力信号は第１のイメージ表示 において増大する検出フォトンのサンプルの位置と対応する位置的アドレスを生 じる第１の基準信号を有する相関器から起因し、さらに出力信号は第２のイメー ジ表示において増大する検出フォトンのサンプルの位置と対応する位置的アドレ スを生じる第２の基準信号を有する相関器から起因してなる請求の範囲１２記載 の装置。
14. １４．検出器はイメージフォトン検出器である請求の範囲１３記載の装置。
15. １５．第１の基準信号は励起光の変調またはパルス化と同位相であり、第２の基 準信号は励起光の変調またはパルス化と９０°位相である請求の範囲１１ないし １３のいずれかに記載の装置。
16. １６．フォトンを検出する手段は、イメージ増倍器が配置される電子カメラと、 相互に位相が外れへかつ励起光の変調またはパルス化と関連して予定された位相 関係を有する２つの異なる条件で、増倍器の利得を周期的に変調する手段とから 構成してなる請求の範囲１記載の装置。
17. １７．増倍器の利得を変調する第１の条件は、励起光の変調またはパルス化と同 位相であり、他の条件はそれらの関係が９０°位相である請求の範囲１６記載の 装置。
18. １８．増倍器の利得を周期的に変調する手段は、さらに励起光の変調またはパル ス化と反対位相関係で利得を変調する能力を有してなる請求の範囲１７記載の装 置。
19. １９．崩壊時間を重み付けした情報を発生する手段は、光検出器の特性の空間的 不均一性に対し補正するために、公知の特性の基準イメージを使用する手段を含 んでなる請求の範囲１６ないし１８のいずれかに記載の装置。
20. ２０．励起光は無線周波数でパルス化または変調してなる請求の範囲１ないし１ ９のいずれかに記載の装置。