JPH05503632A - モノクローナル抗体ｍ１９５の超可変領域の治療的使用およびその構築 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本出願は、１９８９年１２月１４日に出願された米国出願第４０５，９１８号の 一部継続出願であり、その内容は？考として本出願に取り込まれている。 本出願を通して、種々の刊行物が括弧内のアラビア数字で参照されている。これ ら全ての刊行物は、請求の範囲の直前の明細書末尾に列挙しである。これらの刊 行物の開示は、その全体が、本発明に関係する従来技術の状態をより完全に記載 するために、参考として本出願に取り込まれる。 〔発明の背景〕 モノクローナル抗体Ｍ１９５ マウスのモノクローナル抗体Ｍ１９５は、急性骨髄性白血病（Ａ　Ｍ　Ｌ　）患 者から採取した白血病細胞サンプルの６０〜７０％と反応するＩ　ｇＧ２ａであ る。また、Ｍ１９５は初期骨髄系細胞ｊｅｘ＋１７　ｍｙｅｌｏｉｄ　ｃａｌｌ ）および幾つかの単球細胞と反応するか、初期骨髄系前駆細胞とは反応しない。 他の何れの造血性もしくは非造血性組織にも、標的抗原は発現されない。 同じタンパク（ＣＤ３３）上の関連抗原に対する抗体であるＭ　ｙ　９及びＬ４ Ｆ３は、現在、自己輸血前にＡＮＬＬの骨髄を浄化するために使用されている（ ３．４）。Ｍ１９５は、結合後に迅速に細胞内に内在化され、二の効果は放射性 金属、放射性ヨウ素または複合毒素の細胞内への放出を増大し１辱る（５）。Ｍ 　１９５は、兎もしくはモルモットの補体を共に用いることによって白血病細胞 を殺すことかできる。しかし、ヒト補体もしくはヒト抗体依存性の細胞媒介細胞 障害性をインビトロで共に使用することによっては、白血病細胞を殺すことはで きない。インビトロにおけるこれらメゾイエイタの活性化は、インビボでのこれ らの効果に関連している（６）。 しかし、インビロトで効果がないことに基づいて、インビボでの効果がないこと が予測され得るかどうかについては分かっていない。Ｍ１９５は初期骨り系紹胞 とも反応するから、正常な骨髄前駆細胞もまた影響され得る。 骨髄性白血病 現在の最良の化学療法で得られる急性白血病患者の長期生存率は、一般に２０％ 未満である。再発患者または最初の誘導化学療法の試みに失敗した患者の生存率 は遥かに低い。自己もしくは同種骨髄移植は生存率を改善し得るが、その恩恵に あずかるのはごく一部の患者に過ぎない（８）。を髄形成異常症候群または慢性 単球性白血病の効果的な療法はなく、これら疾患の長期生存率は極めて僅かであ る。慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の患者では、同種骨髄移植のみが生存率に対し て顕著な影響を与えている（９）。より有効な治療への一つのアプローチは、モ ノクローナル抗体の使用である。 骨髄系抗原に対するモノクローナル抗体骨髄系細胞およびその前駆細胞上に存在 する分化抗原と反応するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、造血性分化の研究、 急性非リンパ性白血病（ＡＮＬＬ）の同定、造血性成長因子の影響の研究、白血 病細胞の骨髄の浄化およびインビボでの治療に使用されている（１０〜２４）。 急性非リンパ性白血病（ＡＮＬＬ）細胞および造血性前駆細胞の表面に存在する 抗原の配置については、その地図が、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使って多 くの研究室で作製されている（２５）。これらの研究は、リンパ性白血病を非リ ンパ性白血病から区別すること（２６〜２８）、急性骨髄性白血病のサブタイピ ングおよび結果の予測（２９〜３４）、並びにインビボ（３５）またはエクスビ ボ（３６）での骨髄浄化による治療に向けられている。ＡＮＬＬ細胞を定義する 抗原はまた、発生の初期段階にある正常な造血性細胞をも決定する。従って、該 抗原は白血病特異性抗原としてよりも、分化抗原として分類されるべきである。 造血性発生の所期段階に限定された抗原は、ＮＬＬがこれらの細胞から誘導され ると考えられているため（３７〜４０）、特に興味深いものである。これら初期 細胞を同定するモノクローナル抗体は、その精製、または成長の調節および分化 の制御の研究の補助となり得る（４１）。かかる初期１１１駆細胞は骨髄救済に おける自己前注射（３ｕｔｏｌｏｇｏｖｔ　＋ｅｉｎ［ｕｉｉｏｈ）のために有 用であり得る（４２）。Ａ　Ｎ　Ｌ　Ｌ　患者から得た骨髄の研究によって、多 分、クローン原性の細胞は循環系中の大部分の細胞よりも表現型的にはより未熟 な細胞サブセットから誘導されることか示された（３８．３９＞。これは、白血 病細胞の発生の解析か、市療的試みと同様、単に骨髄および抹消血液中において 表現型的に優勢な細胞に向けられるのではなく、これら初期細胞に向けられるべ きであることを示唆している。 造血性前駆細胞に限定された幾つかのｍＡｂｓが報告されている　ＭＹＩｏ、３ Ｃ５及び１２，８は、殆どのＡＮＬＬ患者および殆どの急性リンパ性白血病患者 から採取された、正常なコロニー形成細胞、骨髄芽細胞および白血病芽細胞上に 見られる１１５−ｋＤｘの糖タンパク（ｇｐＨ５［ＣＤ３４コ）を認；する（４ ２〜４４）。モノクローナル抗体であるＮ　ＨＬ−３０５は、同様の細胞分布に 見られる１８０−ｋＤａのタンパクを同定する（４５〜４６）。ＭＹ９及びＬ４ Ｆ３抗体は、若干成熟した前駆細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭのサブセット及びある種 のもっと老いた細胞）上に表現される６７−ｋＤａの糖タンパク（ＣＤ３３）（ ４８〜５０）を同定し、また骨髄系統および単球系統の白血病に限定される。長 期間の培養研究は、ＣＤ３３抗原を有する細胞を除去することにより、おそらく はより成熟した抗原陰性前駆細胞の存在のために、全ての系統の正常な骨髄細胞 が再成長されることを示唆する（４８）。サバス（ｉ＋ｂｂａｌｈ）等（３９） は、他のもっと成熟したマーカーが通常は殆ど発現されないにもかかわらず、Ｃ Ｄ３３抗原が白血病性コロニー形成細胞上に発現することを示している。最後に 、ＡＮＬＬ骨髄に関する研究は、補体を固定化したＣＤ３３に対する抗体を用い ることによって、最終的な正常前駆細胞の破壊を伴うことなく、多くのＡＮＬＬ 、患者の骨髄から白血病細胞を追い出すことが可能であろうことを示唆している 。また、分布限定の少ない他の幾つかの抗体も記載されている（３８゜にｏｈｌ ｅ＋及び１Ｊｉｌｉｌ！ｉｎによるハイブリドーマ技術の発見（５３）以来、モ ノクローナル抗体を、癌の診断および治療のための放射活性物質の担体として利 用することに著しい興味がもたれてきた（５４．５５）。放射能ラベルされた抗 体を癌の検出に利用することに関するＧｏｌｄｓｎｂｅ＋ｇ等の最初の報告（５ ６）がなされた後、放射能ラベルされたモノクローナル抗体を用いた幾つかの臨 床試験が、リンパ腫および白血病（両者とも放射免疫局在化および放射免疫治療 について）において行われてきた（５７〜６３）。これら試験の殆どは、放射性 ヨウ素を用いている（５７〜６２）　、　Ｃｘ＋ｒｚ＋ｑｉｌｌｏとｉｌｌ　＋ − 彼の仲間は、Ｔ細胞リンパ腫の診断において、　Ｉｎ（ラベルされたモノクロー ナル抗体Ｔｌ０Ｉ　（５７，６１）の使用を研究した。放射能ラベルされた抗体 の明白な一つの利点は、標的抗原に対する抗体の特異性（しばしば、腫瘍性細胞 の増加量で表される）が、放射能を腫瘍部位に対して選択的に放出するための潜 在的に有用な方法を提供することである。更に、現在段もよく用いられる放射性 核種によって放出される潜在的致死放射線の範囲は細胞数個分の直径に亘ってお り、標的抗原を欠く隣接した腫瘍細胞に対して細胞障害性を発揮するような放射 線を与えることが理論的に可能である。 組織的には、　■のようなβ−マイナス粒子放出が、放射免疫療法に向けたｍＡ ｂのためには好ましい。電子捕獲によって崩壊する１２５Ｉのような放射性核種 もまた、これか細胞によって内在化されると細胞障害性であるため、放射免疫療 法では興味あるものである（６４）。従って、標的抗原との相互作用に続いて細 胞内に内在化される１２５■でラベルされた抗体は、細胞障害性であり得る（６ ５）。動物およびヒトにおける研究によって、放射性金属Ｉｌｌ　Ｉｎか、放射 性ヨウ素に比較し、て有意に且つ大幅に腫瘍内に濃縮されることが示された（６ ６．６９）。従って、９０Ｙのようなβ−マイテスを放出する放射性金属の使用 もまた、治療にとって興味深いものである。従って、放射能ラベルされた診断お よび治療のためのｍＡｂｓを用いた臨床試験の計画において、モノクローナル抗 体のラベルに使用する放射性核種の選択は重要であり得る。 モノクロナール抗体の内在化 抗原−抗体複合体は、抗体との相互作用に続いて、細胞から脱落するか、或いは 細胞内に内在化される。このプロセス（モジユレーシヨンとして知られている） は、当初はマウスにおいて報告され（７０）、後にヒトにおけるｍＡｂの試験て も起きることが確認された（７１）。このプロセスは、造血細胞（７２）および 新生細胞、並びに固体腫瘍（７３）の多くの抗原−抗体系において見られる一般 的な現象であるように思える。モジュレーシヨンは、ｒｎＡｂの脱落、内在化ま たはその両方のプロセスをもたらし得る。脱落が起きると、標的細胞上における 抗体の滞留時間が、細胞を殺すためには短すぎるようになる。一方、内在化され た抗原−抗体複合体は、もし該抗体に付着された細胞障害性ラベルが細胞内に内 在化されて保有されるならば、理論的に、有為な玉の細胞障害性抗体を細胞内に 放出する。モジュレーション及びレセプタ内在化の細胞生物学は他で研究されて いる（７４．７５）。 白血病のモノクローナル抗体療法 血液、骨髄、牌臓およびリンパ節内の容易に接近し得る新生細胞は、特異的抗体 の迅速且つ効果的なターゲツティングを可能とするから、モノクローナル抗体に 基づく治療は造血性新生細胞に対して理想的に適用可能である。造血性分化の種 々の系統および段階の良く特徴付けられた免疫表現型は、他の２要な造血性の系 統および前駆細胞を節約しながら、新生細胞に対する抗体の選択的結合のための 抗原標的の同定を可能ならしめるに違いない。 白血病の成るモデルにおいては、標的細胞上への抗体の特異的摂取が数分以内に 示され、続いてモジュレーションによる細胞からの抗体の喪失が起こる。ヒＩ・ 急性白血病の先導的研究において、同様のモジュレーションが観察されている（ ８０．８１）。この生物学および薬物速度論に基づき、近距離（＋ｈｏ＋ｉ＋ａ ｎｇｅｄ）での高線形エネルギー移行（ＬＥＴ）のα粒子（７９）または近距離 でのオージェ電子（８２，８３）を放出する短命な核種に結び付けられた抗体が 、治療に効果的であろうことが提案されている。 ｍ　Ａ　ｂでＡ　ｈｉ　Ｌを治療する試みは、最終的な正常造血性前駆細胞には 見られないが、クローン原性骨髄系白血病芽細胞に見られる抗原標的を選択する 必要がある。Ｇｐ６７（ＣＤ３３）はこのような標的の一つであると巴われる。 この標的に対する細胞障害性の不ズミｍＡｂは、正常な骨髄前駆細胞の再成長の 能力をなくすことなく、初期髄系細胞（ＣＦＵ−ＧＭ。 ＢＦＵ−Ｅ）および白血病細胞を択的に殺すことができる。 この選択性は、ＡＭＬの治療において自己再注射を行う前の骨髄の浄化に適用さ れている（８４〜９１）。Ｍ］９５はｇｐ６７と反応するマウスＩｇＧ２ａであ り、ｇｐ６７は標的細胞との結合に際して迅速に細胞内に内在化できるが、ヒト 補体またはエフェクター細胞の使用によってインビボで細胞を殺すことはできな い（８８，８９）。コミットされた造血性前駆細胞および幾つかの単球を除けば 、！ｖｌ１９５は何れの正常な細胞または組織とも反応するとは思えない（２６ ，２７）。 以前に行われた抗体治療の全ての仕事は、マウスモノクロ−±ル抗体を用いてい た。このアプローチには一定の限界がある。マウス抗体は細胞を殺す生物学的活 性が限定されており、またヒト血清内での半減期が比較的短い。加えて、使用す る抗体がマウス由来であるため、外来物質に対する免疫応答をトリが−し得る。 従って、ヒト化抗体を使用することによって、該分子の治療的挙動の改善を補助 する。これは人血清中における該分子の半減期を改善し、また免疫応答を減少哺 乳動物細胞中に遺伝子を導入するための新しい有力な手段はレトロウィルスベク ターの構築であり、ここでは外来遺伝子がウィルスゲノムの部分を置き換える（ ９５）。しかし、幾つかの束縛によってレトロウィルスベクターの使用は制限さ れ得る。一つは、細胞向性ｆＣｅＩｆ　＋＋ｏｐｉｉｍ）に関する：この制限の 一品は、異なった種の広範な細胞を感染できる両栄養性ウィルスベクターの発展 によって一部回避されている。 反対に、遺伝子療法を含む特定の目的のためには、細胞の選択されたサブポピユ レーションのみを感染させるのか有利である。これは、もし全体の細胞ポピユレ ーションがウィルスに対する膜レセプターを有しているならば、環境栄養性ウィ ルスまたは両栄養性ウィルスの何れかについては可能ではない。混合物内の特定 の細胞の選択的なターゲツティングを可能とする一つの方法は、特異的な抗原標 的を用いることである。組換レトロウィルスベクターを選択された細胞内に導入 することを可能とするであろう技術の発展は、レトロウィルスベクターの可能性 を顕著に拡張する方法である。 〔発明の概要〕 本発明は、モノクローナル抗体Ｍ＋９５　（ＡＴＣＣ番号・ＨＢ　１０３０６） が結合する抗原に対して特異的に結合し得るアミノ酸配列から実質的になるポリ ペプチド、例えば、そのアミノ酸配列がモノクローナル抗体Ｍ１９５の超可変領 域のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一であるポリペプチドを提供する。 本発明は更に、このようなポリペプチド、即ちＭ１９５が結合する抗原に対して 結合するのに必要なアミノ酸から実質的になるアミノ酸配列を具備したキメラ抗 体を提供する。 更に、本発明は、このようなポリペプチド、キメラ抗体、またはＭ１９５抗体そ れ自体の何れかに細胞障害剤、例えば放射性同位元素またはトキシンが結合され たものを含む治療剤を提供する。 本発明は更に、このようなキメラ抗体もしくは治療剤、またはＭ１９５それ自体 を含む薬剤組成物を提供する。 最後に、本発明は付加的に、ヒト患者の白血病を治療または診断する方法；骨髄 移植を行う方法；および造血細胞内に遺伝子情報を導入する方法を提供する。 〔図面の簡単な説明〕 図１　：　Ｍ１９５　Ｉ　ｇＧおよびＦ（Ａｂｌ″２の放射結合検定：飽和度お よびスキャッチャード分析。検定は後述の材料および方法で説明するようにして 行われた。Ａは、１２５１−１　ｇＧの合計（◇）、過剰のラベルされていない ＩｇＧ存在化での＋２５Ｉ　ｒｇｃのＨＬ６１］白血病細胞に対する非特異的結 合（◆）及びＨＬ６０白血病細胞に対するＭ１９５ＩｇＧの特異的結合（■）を 示す。Ｂは、ＭＩ９５１ｇＧ結合のスキャ・ｌチャードプロットである。Ｃは、 Ｍ１９５　Ｆ　（Ａｂｌ’２結合のスキャソチャードプロットである。 図２　造血性起源のセルラインに対するＭ１９５１ｇＧおよびＦ（Ａｂ）’２の 放射免疫検定。　Ｉ−Ｍ１９５結合は、後述の材料および方法で説明するように して飽和度で測定した。非特異的結合は［１，２μｇ／　５００．０００細胞で あった。特異的結合のみが示されている＋ＩｇＧ。 ■、Ｆ（＾ｂ）’２．口。 図３・兎補体を用いた、Ｍ１９５　Ｉ　ｇｔ：、のＨＬ６０に対する補体細胞障 害性。兎補体の濃度は図中に示しである：１／６（■）、１／１８（◇）および １／３０（◆）の最終稀釈。検定は、後述の材料および方法に記載したようにし て行った。 図４：ＨＬ６０をｍＡｂ　Ｍ１９５に曝した後の抗原モジュレーション。この検 定は、後述の材料および方法に記載したようにして行った。Ｍ１９５１ｇＧは図 中に示した濃度で添加し、３７℃でＹ軸に示した時間だけインキュベートさせた 。細胞は次に、３７℃で４５分間、兎補体と共に追加のＭ１９５１ｇＧの添加に より、溶解について試験された。この第二の添加の後の細胞毒性がＹ軸に示しで ある。 図５６新鮮な造血性新生細胞に対するｍ、’ｉｂ　Ｍ］９５１　ｇ　Ｇの直接放 射免疫検定。この検定は、後述の材料および方法に記載したようにして行った。 検体の同定はＹ軸に示した：　５００．０００細胞当たりｌｏｇの結合は、細胞 １個当たり８０００のＩｇＧに等しい。ＡＭＯＬは急性単球性白血病である。Ｃ Ｍ、Ｌ−ＭＢは骨髄芽細胞性Ｃ〜Ｉしてある：Ｍ〜１は多重ミエローマである； ＨＣＬは毛性組胞白血病である。ＣＬＬは慢性リンペ性白血病である。ＤＰＤＬ は拡散性の僅かに分化したリンパ腫である。ＤＨＬは拡散性の組織球性リンパ腫 である。ＮＰＤＬは結節性の僅かに分化したリンパ腫である：これらのリンパ腫 はリンパ節から作製された懸濁液である。バックグラウンドの非特異的結合は、 ０．２μｇ結合であった。特異的結合のみが示しである。 図６：過剰のラベルされないＩｇによるＭ１９５直接放射免疫検定のブロンキン グ。５０−１００倍モル過剰のＹ軸に沿って指定した抗体をＨＬ６Ｑ標的細胞に 添加し、続いて”Ｉ−Ｍ１９５を４℃で６０分間結合させた。 結合された１２５１−Ｍｌ９５の量をＹ軸に示した。競合ＩＧのないＭ＋９５の 結合が、１００％に規格化された。 図７　、　Ｉ−Ｍ］９５の内在化および放出内在化（図７ａ、　７ｂ）　：　５ ００万個のＨＬ６０細胞を５μｇのｍＡｂまたはフラグメントと混合し、４℃ま たは３７℃でインキュベートした。適当な時点で一部を採取し、全体および内在 化された細胞関連放射能を６１１定した。時間の経過に沿った放射能を１分間当 たりのカウントで示す全てのグラフは、次のようにラベルされる。（△−Δ）： ４℃での全ての細胞関連放射能；　（０−０）：　３７℃での全ての細胞関連放 射能：　（ムーム）：４℃での内在化放射能、（・−・）：３７℃での内在化放 射能。 パーセント内在化放射能を示す全てのグラフは、次のようにラベルされる。（ム ーム）、４℃でのパーセント内在化、（０−０）　・３７℃でのパーセント内在 化放射能。 放出（図７ｃ、７ｄ）：　５００万個の細胞を５μｇのｍＡｂまたはフラグメン トと４℃で６０分間混合インキユベートシ、次いて遊離の周囲ｍＡｂを洗浄した 。内在化放射能の測定は、洗浄した細胞を４℃または３７℃に保って上記のよう に行った。 これらのグラフについての記号は、内在化データのためのものと同しである。 図８　：　”１１　ｎ−Ｍ！９５の内在化および放出内在化（図８ａ、８ｂ）： Ｍ１９５がＩｎ−１ｉｔでラベルされた点を除き、図７ａ、７ｂに記載したのと 全く同様にして行った。 放出（図８ｃ、８ｄ）：この実験では、ｋｌ　］、　９５がＩｎ−ｌ１ｌでラベ ルされた点を除き、図７ｃ、７ｄに記載したのと全く同様にして行った。 図９−　１−Ｍ１９５　Ｆ　（ａｂ）’２の内在化および放出内在化（図９ａ、 ９ｂ）：　ｌ−１２５が今回はＭＩ９５のＦ（ａｂｌ’２フラグメントに付着さ れた点を除き、図７ａ、７ｂｌ：記載したのと全く同様にして行った。 放出０図９　ｃ、９　ｄ）　：　Ｍｉ９５　Ｆ　Ｄｂ）’２かＩ　−１２５でラ ベルされた点を除き、図７ｃ、７ｄに記載したのと同様にして行った。 図１０・ヒト組織におけるＭ１９５抗原の分布のｖ１要を示す図である。何れか の非造血性成熟組織に該抗原が存在することは知られていないので、図示されて いない。 造血性細胞中の分布か示されている。 図１１：１８時間前に５　ｍｃｉのヨウ素１３１　ｋｉ１９５を注射された宙者 ＃１の、ガンマ線カメラによる前方全体写真および後方全体写真である。白血病 に関係あるものとして知られた全ての領域（骨髄、婢臓、肝臓、中隔膜緑色腫） が顕著なＭ１９５の摂取を示している。 図１２　、”　Ｉ−Ｍ１９５を注射された患者の、２４時間後における前方写真 および後方写真である。骨髄、肝臓および牌臓が写っている。 図１３　＋　”　Ｉ−Ｍ１９５画像（Ａ）と、低露出（Ｂ）または高露出（Ｃ） での９９ＴＣ−骨髄画像との比較である。 図１４．前処理、１時間後、２４時間後および１０日後に血清フローサイトメト リーで測定された、インビボでのヒト白血球細胞に対するＭ１９５のモジユレー シヨンである。 図１５：ヒト患者にインビボで注射した後の、エクスビボでのＭ１９５の白血病 細胞内への内在化。トップは絶対ｃｐｍ−ボトムは内在化パーセント。３７は３ ７℃、４は４℃、■は全ｃｐｍ、Ｉは「内在化」である。 図１６　：　ＨＬ−６０セルラインに対する４つのプロトコールの細胞障害活性 。Ｍ　ｏ　Ａ　ｂ　＋　Ｃ処理は、ｌ／６　（ｙ＃）　稀釈の補体と共に、４０ μｇ／ｍｌのＭ１９５及びＦ２３を投与する１サイクルを示す。４ＨＣ濃度は、 単独で使用するときは１００μＭである。８０μＭまたは１００μＭの４　ＨＣ は、該薬剤がＶＰ−１６と組み合わされ且つＭｏＡｂｓを伴わないときは同じ結 果を与えた。 図１７：ＣＦＬ−Ｌに対する４つのプロトコールの細胞障害活性。詳細は図１の 説明を参照のこと。 図１８＝患者＃１に１３１１−Ｍｌ９５を２回投与した後の、末梢血液白血病細 胞のカウント。 図１９二壱者＃７における末梢白血球および血小板のカウント。患者＃７は、血 小板減少を伴う再発ＡＭＬのも者である。ＭＩ９５　（９０ｍＣｉ／Ｍ）での治 療に続いて、血液および骨髄における芽細胞の死滅にもかかわらず、血小板は直 ちに増加し始めた。第７日に、骨髄芽細胞は５０％減少し、血小板は５０％増加 した。毒性はなく、患者は解放（ｄｉ＋ｃｈａ＋Ｂ）　された。これは、１３１ −Ｉ−Ｍ１９５による選択的死滅を示している。 図２０・患者＃５における骨髄芽細胞（Ａ）および末梢血球（Ｂ）のカウント。 患者＃５は、急性骨髄性白血病に進んだを蝕形成異常症候群の患者である。可能 な最良の化学療法を２サイクル（夫々について、ダウノマイシン及びＡＲＡ−Ｃ の投与を５日間）行ったにもかかわらず、彼女の骨髄芽細胞のカンウドは上昇し 続けた。１３！−１−ＭＩ９５　ｆ７ｈｃｉ／ｌｊｉの１サイクルは、彼女の白 血病の細胞を減少し、骨髄中の芽細胞のカウントを１３％に低下させた。（上記 参照）。 彼女の正常細胞に対する影響は存在したものの、許容され得るものであった。（ 下記参照）。従って、Ｍ１９５は難治療性で、且つ前処理された患者に存効であ り、細胞の殺滅において相対的に選択的である。 約５００．０００．０００．０００個の細胞が死滅した。 図２１：患者＃６に対する梢ＷＢＣカウント後処理末。全骨髄芽細胞は９９％異 常減少した。死滅した全白血病細胞は、約１０１２と見積もられる。非血液学的 毒性はなかった。 図２２　標的とするレトロウィルスベクターを以下の説明で述べる前駆細胞に特 異的に結合させる方法の概要を示す図。 図２３・　（Ａ）ｍＡｂ標的レトロウィルスベクターの内在化。 （Ｂ）ｍＡｂをレトロウィルスベクターに付着させるための代替え法 図２４．５１クロム放出検定で？ｊＪＩ定されたものとしての、キメラ〜１１９ ５を用いるＡＤＣＣ０ヒトキメラＩｇＧ］及びＩ　ｇ　Ｇ３　Ｍ１９５は、ＨＬ ６１］白血病細胞標的に対して、投与量依存性のＡＤＣＣができる。二つの抗体 の混合は、これらが同一の部位に結合から、可成的ｆａｄｄｉｔｉｙｓ）ではな い。 〔発明の詳細な既述〕 本発明は、モノクローナル抗体ＭＩ９５　（ＡＴＣＣ番号　ＨＢ　１０３０６） か結合する抗原に対して特異的に結合しｉ尋るアミノ酸配列、例えば、前記抗原 に結合するために必要なモノクローナル抗体Ｍ＋９５の超可変領域のアミノ酸配 列と実質的に同一であるアミノ酸配列から実質的になるポリペプチドを提供する 。一つの実施例において、このポリペプチドは実質的に、マウスモノクローナル 抗体Ｍ１９５の超可変領域のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一であるア ミノ酸配列からなる。 Ｍ　！９５として特定されるモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマは、 合衆国メリーランド州ロックウィル２１］８５２のアメリカン会タイプ・カルチ ャーφコレクション（ＡＴＣＣ）に、ＡＴＣＣ受付は番号ＨＢ　１０３０６で寄 託されている。 この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約 （ブダペスト条約）の規定に準じて行われた。 従って、まず寄託されたハイブリドーマからモノクローナル抗体ＭＩ９５を得、 次いで、その超可変領域を得るように該Ｍ１９５抗体を処理（例えばタンパク分 解消化）することによって、上記に記載したタイプのポリペプチドを得ることが できる。 或いは、Ｍ１９５抗体の超可変領域をコードするＤＮＡをクローン化し、標準的 な組換えＤＮＡ技術を用いることにより、このＤＮＡを適切な単細胞ホストまた は他のホスト内で発現させればよい。この方法によれば、本発明の範囲内のポリ ペプチドが得られる。 更に、上記のポリペプチドは、ポリペプチドを合成するための、化学的方法によ る良く知られた技術を用いて合成することができる。 本発明は、Ｍ１９５抗体の超可変領域に対応するアミノ酸配列を含むポリペプチ ドには限定されない。本発明はまた、Ｍ１９５が結合するのと同じ抗原、即ちＣ Ｄ３３抗原に特異的に結合できるアミノ酸配列から実質的になるポリペプチドを も包含する。このようなポリペプチドを得るだめの一つの方法は、ＭＩ９５の超 可変領域に存在するアミノ酸配列を、これが置換されたときポリペプチドの抗原 に対する結合が影響されもしくは影響されないように、選択的に置換することで ある。 このようなポリペプチドを得る別の方法は、まずＭ１９５抗体に特異的に結合で きるポリペプチドをコードするＤＮＡを得、次いで該ＤＮＡを、これが発現した ときにＭ１９５または他のＣＤ３３特異性抗体に存在し且つＣＤ３３抗原に結合 するために不可欠なアミノ酸からなるポリペプチドを産生ずるＤＮＡを得るよう に、部位指定変異によって変化させることである。 一つの抗体は、典型的には二つのポリペプチド鎖の二つの対を有する。夫々の対 は、−以上のジスルヒド結合によって一緒に保持されたライト鎖（約２５　ｋＤ の分子量を存する）およびヘビー鎖（約５０−７０　ｋＤの分子量を有する）で ある。 二つのこのような対は、−以上のジスルヒド結合により結合されて抗体を形成す る。抗体の定常部は夫々の鎖のＣ００Ｂ−末端に位置し、抗体のエフェクター機 能を提供する。抗体の可変部は夫々の鎖のＮｌ２−末端に位置し、該抗体に特定 の抗原に対する特異性を与える。可変部内には超可突部、即ち、アミノ酸配列が 最も変化する可変部の切片か存在する。残りの部分は、単一種では比較的保存性 の高いアミノ酸配列で構成され、フレームワーク領域と呼ばれる（９６．９７） 。この明細書において、「ヒトフレームワーク領域」の用語は、天然に存在する ヒト抗体の対応する配列に類似した（８５％以上の相同性）フレームワーク領域 を意味する。 キメラ抗体とは、抗体の複数の部分が二辺上の異なった生物に由来する抗体をい う。典型的には、このようなキメラ抗体は、該抗体に対してより広い機能を与え 又はより広いホスト許容性を与えるための仕事において調製される。 更なる実施例において、本発明は、上記のようなポリペプチドを具備したキメラ 抗体を提供する。而して、本発明に従うキメラ抗体は、少なくとも一つの鎖（ヘ ビー鎖またはライト鎖）が、モノクローナル抗体ｋｉ１９５が結合する抗原に対 して特異的に結合できるアミノ酸配列を具備する：このようなアミノ酸配列は、 例えば、前記抗原に結合するために必要なモノクローナル抗体Ｍ１９５の超過片 領域のアミノ酸から実質的になるアミノ酸配列、即ち、Ｍ１９５の超可変領域と 同一または実質的に同一であるアミノ酸配列である。 原理的には、一つの鎖しかこのようなアミノ酸配列を有しないのであるが、少な くとも二つの鎖、通常は同しタイプの両方の鎖（即ち、画法のヘビー鎖または両 方のライト鎖）がそうである場合が一般的である。勿論、このような配列を両ヘ ビー鎖および両うイト鎖に取り込むことによって、該抗体は四つのこのようなア ミノ酸配列を有し得る。 このような抗体は、例えば米国特許第４．８１６．３９７号および同第４．８１ ６．５６７　；　Ｐ　ＣＴ特許公開第ＷＯ１０１５３３号および同第ＷＯ３９１ ０Ｉ９７５号；および参考文献９８に２蔵された方法を含む、この技術分野でよ く知られた方法によって、このようなアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、例えば ＣＤ３３に向けられた抗体（例えばＭ１９５　）の超過片領域をコードするＤＮ Ａを用いて調製され得る。 好ましくは、このようなキメラ抗体の定常領域は、該抗体が投与されるヒト対象 における抗原性応答を最小限にするために、ヒト免疫グロブリンの定常領域と同 一もしくは実質的に同一である。 特に好ましいタイプの一つのキメラ抗体は「ヒト化された」抗体、即ち、ヒト及 びマウス抗体配列の最適組み合わせを決定する分子モールド技術によって製造さ れた抗体である。この最適組み合わせとは、マウス抗体の可変領域による結合親 和性を低下または喪失することなく、該抗体のヒト含量を最大とする組み合わせ である。従って、一つの実施例においては、Ｍ１９５のようなマウスモノクロー ナル抗体由来の超過片領域を「ヒト化」し或いは非免疫原性とするために（９９ ゜１、ＯＯ，１０１）、本発明はヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列および ヒト抗体由来の定常領域のアミノ酸配列を具備するキメラ抗体を提供する。 超過片領域は、アミノ酸配列の非隣接可変領域（ＣＤＲｓ）の３塩基連鎖から誘 導される三次構造であることがよく知られている。ＣＤＲ５は、望ましい超可変 配列を達成するために、一つのアミノ酸配列中に遺伝子的に移植され得る（１０ ３．１０４）。従って、本発明には特に、ポリペプチド、即ち、ヒＩ・フレーム ワークおよび定常領域と共に、移植されたＣＤＲ切片を含む上記で議論したタイ プのアミノ酸配列を宵するキメラ抗体が包含される。 本発明はまた、上記のようなポリペプチド、キメラ抗体、またはＭ１９５抗体そ れ自体の何れと、これに結合された細胞障害剤とを含む治療剤を提供する。 特に興味があるのは、細胞障害剤かアルファ粒子放出剤、例えば鉛−２１２、ビ スマス−２１２又はアルタチン−２１１、特にビスマス−２１２のような放射性 アイソトープである治療剤である。 或いは、細胞障害剤は例えばヨウ素−１３１、スカンジウム−４７、レニウム− ＩＳ６、レニウム−１８８又はイ・ｌトリム−９０、特にヨウ＄−Ｄｌまたはイ ソトリム−９０のようなベータ粒子放出剤であってもよい。更に、放射性アイソ トープは例えばヨウ素−１２３、ヨウ素利２５、臭素−７７若しくはインジウム −１１１、特にヨウ素−１２３のようなオージェ電子発生剤；又は、ボロン−１ ０若しくはアクチニドのような融合可能な核種であってもよい。 或いは、細胞障害剤は、リジンのような良（知られた毒素の何れかであってもよ い。そのポリペプチドおよび抗体への結合については先に説明した。 更に加えて、細胞障害剤はアドリアマイシン又は５−フルオロウランルのような 、良く知られた細胞障害薬剤の何れかであってもよい。そのポリペプチドおよび 抗体への結合については先に説明した。 細胞障害剤をポリペプチド又は抗体に結合させる精密な方法は、細胞障害剤の性 質に応じて変わる。しかし、当業者はこのような方法を熟知している。単なる例 示として挙げれば、放射性アイソトープは、二官能性キレートの手段によってポ リペプチド、キメラ抗体またはＭ１９５抗体自体の何れかに結合され得る。 本発明はまた、白血病の治療に有効な量の本発明に従うキメラ抗体と、薬剤的に 許容され得る担体とを含有する薬剤組成物を提供する。 ここで言う白血病には、急性および慢性の骨髄性およびリンパ性白血病、並びに を椎形成異常症候群、前白血病症候群、難治性貧血および骨髄増殖障害が含まれ るが、これらに限定されるものではない。加えて、本発明には白血病の治療に有 効な量の上記治療剤の何れかと、薬剤的に許容され得る担体とを含有する薬剤組 成物が含まれる。更に、本発明には、白血病の治療に有効な量のモノクローナル 抗体Ｍ１９５と、薬剤的に許容され得る担体とを含有する薬剤組成物もまた含ま れる。 本発明の薬剤組成物中に使用するための有効量は、当業者に周知の多くの因子に 応して変化する。これらの因子には、細胞障害剤の種類を含む治療剤の精密な種 類；担体の種類；治療すべき病気、並びに治療される患者の性別、年齢および他 の特徴：採用される投与経路が含まれる。当業者、ルーチンの方法でこのような 査効量を決定することに熟知している。 一般的には、成人宙者における有効量は、約０．　ｌｅｇ〜５０［１ｍｇ、好ま しくは約ＩＢ〜約２００　ｍｇの範囲で変化する。 同様に、薬剤的に許容され得る担体もこの分野では周知であり、水性緩衝溶液の ような固体および適切な賦形剤のような固体の両者が含まれる。保存剤、香料等 のような他の成分も任意に使用され得る。 本発明はまた、白血病患者を治療する方法を提供する。この方法は、白血病細胞 を破壊して患者を治療するために、有効量の本発明に従う治療剤またはキメラ抗 体を投与することを具備する。このような方法において、治療剤またはキメラ抗 体の量は、典型的には約０．０５Ｂ〜約５００Ｂ　、好ましくは約０、ＩＢ　／ 約１００Ｂ　テある。 治療剤またはキメラ抗体は、原理的には、この分野で知られた種々の包囲法の何 れによめても投与され得る。典型的には静脈注射が選択される。 一つの実施例において、治療剤はヨウ素−１３１を含有し、その有効量は約５０ 　ｍｃｉ〜約２００１１ｃｉである。他の実施例において、治療剤はイツトリウ ム−９０を含有し、その有効量は約１０ｍＣ１〜約５０　ｍｃｉである。別の実 施例において、治療剤はビスマス−２１２を含存し、その有効量は約２０　ｍｃ ｉ〜約８０　ｍｃｉである。 更に別の実施例において、治療剤はヨウ素−１２３を合釘し、その有効量は約０ ０１町〜約３００ｍＣ１である。 加えて、本発明はヒト患者の生来の骨髄細胞を破壊する方法を提供する。この方 法は、患者の骨髄細胞を破壊するのに有効な量の本発明のキメラ抗体または治療 剤を患者に投与することを具備する。 このような方法においても、治療剤の量は当業者に周知の範囲内で変化し得る。 典型的には、治療剤またはキメラ抗体の量は約００１町〜約５０ｍｇであり、静 脈内投与される。 加えて、本発明は白血病の治療方法を提供する。この方法は、ヒト白血病患者か ら白血病細胞を含む骨髄細胞を除去することと：こうして除去された骨髄細胞を 、その骨髄細胞に存在する白血病細胞を破壊するために、有効量の本発明のキメ ラ抗体もしくは治療剤、またはモノクローナル抗体Ｍ＋９５と接触させることと ；こうして得られた骨髄細胞を患者に自己系再注入（ａｕ＋ｏｌｏｇｏｕ＋１７ 　ｒｅｉｏｈ＋５ｉＢ）することとを具備する。好ましくは、患者から除去され た白血病細胞を含むこの骨髄細胞の接触は、兎補体、モルモット補体またはヒト 補体の存在下で行われる。 加えて、本発明はヒト患者の白血病を診断する方法を提供する。この方法は、画 像化剤でラベルされた本発明のポリペプチド又はキメラ抗体を、該抗体とを者に 存在する何れかの白血病細胞との間の複合体が形成される条件下でも者に投与す ることと、こうして形成された何れかの複合体を画像化して白血病を診断するこ ととを具備する。本発明にはまた、画像化剤でラベルされたＭ１９５　、或いは Ｍ１９５モノクローナル抗体（ＡＴＣＣ番号　ＨＢ　１０３０８　）か結合する 抗原に向けられる画像化剤でラベルされた抗体を、該抗体と患者に存在する何れ かの白血病細胞との間の複合体が形成される条件下で患者に投与することと、こ うして形成された何れかの複合体を画像化し、白血病を診断することとを具備し た白血病の診断方法か包含される。一般的に、画像化剤は白血病細胞中に内在化 される。 一つ（７）実＆ｆｌｌにおいて、上記の抗体はモノクローナル抗体Ｍ１９５であ り、また画像化剤は陽電子を放出する放射性金属。 ガンマ線を放出する放射性金属；ヨウ素−１３１：ヨウ素−１２３：インジウム −ＩＩ＋またはテクネチウム−９９ｍのような放射性アイソトープである。 最後に、本発明は白血病細胞内に遺伝子情報を導入または担持させる方法を提供 する。この方法は、遺伝情報が結合され或いは組み合わされた本発明のポリペプ チドまたはキメラ抗体に細胞を接触させ、このポリペプチドまたは抗体を細胞に 結合させて複合体を形成した後、細胞内に前記遺伝し情報を導入もしくは担持さ せるように、これを細胞内に内在化させることを具備する。 加えて、本発明は、遺伝情報が結合されたＭ１９５モノクローナル抗体、或いは Ｍ１９５モノクローナル抗体が結合する抗原に向けられる遺伝子情報か結合され た抗体に細胞を接触させ、このポリペプチドまたは抗体を細胞に結合させて複合 体を形成した後、細胞内に前記遺伝し情報を導入もしくは担持させるように、こ れを細胞内に内在化させることによって、遺伝子情報を造血性細胞内に担持させ る方法を提供する。 一つの実施例において、遺伝情報は、上記の抗体に結合されたレトロウィルスベ クターを具備する。 以下の実験は請求の範囲の記載によって限定される本発明の理解を助けるために 記載されるものであり、請求の範囲によって定義される発明の範囲を如何なる意 味でも限定する意図はな（、またそのように解釈されてはならない。 実験　】 この実験および実験２では、マウスモノクロ−±ル抗体であるＭ１９５について 述へる。この抗体は初期骨髄細胞、単球細胞およびＡＮＬＬに限定された抗体を 定義し、ＤＣ３３タンパクに結合される。この抗体は他の何れの成熟組織にも検 出されず、骨髄単球の分化の研究およびＡＮＬＬの診断および治療に有用である 。この実験は、細胞ライン、正常組織および成熟した造血性細胞における該抗体 の分布を記述するものである。個々の細胞に対するこの抗体の生物学的活性、親 和性および定量的分布が提示される。 く材料および方法〉 Ａｂｓ ｍＡｂのＭ１９５は、５Ｐ２１０−ＡＧ１４マウスハイブリドーマ細胞と、Ａ　 Ｍ　Ｌ　、９者の白血病細胞で免疫された５遇齢のＢＡＬＢ／Ｃマウスの牌臓逍 胞（Ｆｉ〜Ｂ−Ｍ２）との融合によって得られたマウスハイブリドーマから産生 される。クローン化されたハイブリドーマ培養の上清液を、５Ｉｘｐｔ＋ｙｌｏ ｅｏ＋ｃｕｔ　ａｕ＋ｅｕ＋タンパクＡ、（ＰＡ）赤血球ロゼツト形成（下記参 照）を用いて、白血病細胞ライン及び原Ａ　Ｎ　Ｌ　Ｌ白血病細胞に対してスク リーニングした。繰返しサブクローン化されたＭ１９５ハイブリドーマを、ブリ スチンで二重にブライミングされた（Ｃ５７ＢＬ／６　ＸＢＡＬＢ／Ｃ）　Ｆ　 １マウスの腹腔内で爆発的に増殖させた。 連続的なｐＨステップ溶出を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって 、〜１１９５をＰＡ−セファロース（ファルマノア）上で精製した。純度は、ラ ーマシープリリヤ／ドブルー（Ｃｏｏｍａ＋＋ｉｃ　ｂ＋１ｌｌｉ＆ｎｌ　ｂｌ ｕｅｌで染色された硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）／ポリアクリルアミドゲ ル上で測定した。 対照抗体は、広範に発現された細胞表面抗原（ＶＬＡ）（１０３）に反応するｍ ＡｂＡＪ２と、ｍＡｂ　Ｍ３１　（ルイスＸ抗体と反応する）を含んでいた。 ハイブリドーマ上清のスクリーニング １０％ウシ胎児血清を含むＲＰＬｉＩｌ’０μｍ中の４０００個の細胞（ＨＬ６ ０または免疫原ＡＮＬＬ細胞）を、文献に記載されているようにして、２０℃で ４５分間、コンカナバリンＡ（ファルマシア）をコーティングした６０穴のテラ サキプレート（ＩＩＵＮｃ）に分注静置して結合させた（１０４，１０５ン。Ｐ Ａコートされたヒト〇−赤血球ロゼットを指示剤として用いることにより、ハイ ブリドーマ上清のこれら細胞に対する活性を測定した（１０４）。 細胞及び細胞ライン 健康なボランティヤ及び忠者から、ヘパリン化した末梢血液サンプル及び・け髄 吸引液を得た。単核細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ファルマシア）上で分離 し、３７℃で２時間の塑性粘着（ｐｌａｓｔｉｃ　ａｄ！ｕ＋ｅｎｃｅ）により 、付着性細胞を非付着性細胞から分離した。ｌＸｇで６０分間のデキストラン沈 降の後、ｐＨ７２のトリス緩衝液中での塩化アンモニウム溶解によって、混入し ている赤血球から多形核白血病細胞を精製した。血小板は、示差遠心分Ａｌ　（ ｄｉ［ｆ＋＋ｅｎｌｉｘｌ　ｃｅｎｆｒｉ［ｉｌｇ［１ａａｌ　によって、Ｆｉ ｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅｉ（ｉ細胞から分離された。ノイラミニダーゼ処理された ヒツジ赤血球細胞（ギブコ）とのインキュベーションに続いて、Ｆ＋ｃｏｌｌ− Ｐａｑｕａ度勾配遠心分離および塩化アンモニウムでの赤血球の溶解の後、単核 細胞のＥ−ロゼソト陽性画分および陰性画分が分離された。 造血性細胞ライン（表１）および非造血性細胞ライン（表３）は、スローアン・ ゲッタリング・インスティチュートにおけるヒト癌免疫研究所のヒトａ瘍銀行か ら得られた。ＩＦＩＯおよびＩＦＩＯ（モノ）、ＨＬ６１）サブクローンおよび その単球性分化型はＹ、ケイヤー博士から寄贈された（１０６）。 血清学的検定 抗体特異性は、５ｔａｐｈ７１ｏｃａｃｃｕｓ　ｘｕｒｅｕ＋　ＰＡまたは文献 記載の方法で調製されたウサギ抗マウス１ｇでコートしたヒトＯ赤血球細胞（１ ０４）を指示剤に用い、６０穴テラサギプレート内に収容された付着性細胞上で 決定された。懸濁標的細胞は、コンカナバリンＡを用いた試験の直前に標的細胞 がテラサキプレートに結合された点を除き、同じ指示細胞を用いて検定された（ １０５）。この検定は、ＨＬ６０に結合する約ｌ　ｏｇ／山１のｍＡｂ！ν１１ ９５の濃度に対して感受性である。腹水稀釈２００未満でロゼツトか形成されず 、また吸収分析も陰性であるときに、細胞は陰性とみなされた。２００〜Ｉｎ、 　ｌ１ｔｌｆｌのｆ１１′沢で５０％より多い細胞がロゼツトを形成したとき、 腹水は細胞ラインｊこ対しでＦ弱陽性」であるとみなされた。「弱陽性」の細胞 は、吸収分析（下記参照）によって反応性であることか確認された。・１イブリ トーマを含んだマウスから採取り、”［水は、＋００．　ｔｌｏｏより大きい稀 釈で細胞のロゼツト形成か起きたときに、細胞ラインに関して陽性であるとみな された。精製抗体が使用されたときは、５ｈｇ／ｍｌ未虜の濃度でのロゼツト形 成について「陽性」とみなし、５０〜５０［］　Ｂｏｗｌの濃度でのロゼツト形 成についてはｒ弱陽性ｊとみなした。反応性は、直接放射免疫検定および補体固 定検定（下記参照）によっても確認された。 吸収分析 ２００万〜１ｏｏｏ万個の細胞をＰＢＳで洗浄し、５　Ｘ　５０Ｉｎｍのガラス 管内で５００Ｘｇの遠心分離によりペレット化し、陽性細胞に５０％ロゼツト形 成を起こさせるのに必要とされる稀釈度の４倍に稀釈された等容量の腹水と反応 させた：陽性細胞はＨＬ６０細胞または免疫原ＡＮＬＬ細胞であり、この稀釈は 典型的には腹水の１００．０００〜２００．０００倍稀釈である。吸収は４℃で ３０分間行われ、５００Ｘｇで混合物を再びペレット化した。この上清を、上記 のロゼツト形成試験において、標的細胞ラインと反応させた。 抗体依存性の細胞媒介細胞障害性（ＡＤＣＣ）Ｍ１９５がＡＤＣＣを媒介できる か否かを決定するための検定は、ｆｅｎ等の記述（１０７）と実質的に同様にし て行われた。標的細胞は５１０ｒ内で９０分間インキュベートされ、次いで遊離 の５１Ｃｒを洗浄した。氷上において、Ｍ１９５抗体が１〜１００μｇ／ｌの濃 度で添加され、またｌＯ〜４０／１のエフェクター／標的比で新鮮な末梢血液単 核細胞が添加された。 細胞は３７℃で６〜１８時間インキュベートされ、スカトロン細胞回収器を用い て回収し、パノカードガンマ線カウンタで放出された５１Ｃｒをカウントした。 洗剤で溶解された細胞を、１００％対照として用い、アイソトープ配合された無 関係の抗体処理細胞を陰性対照として用いた。 放射性ヨウ素化および放射免疫検定 精製抗体を、反応を開始するためのクロラミンＴと反応を停止させるためのナト リウムメタビサルファイトを用いて、Ｎａ、−１２５１にューイングランド・ニ ュークリア）でラベルした。特異的活性はタンパクの２〜１０μＣｉであった。 過剰の生存ＨＬ６０細胞に結合する血清としてρ［定された免疫活性は、４０〜 ６０％であった。放射免疫検定は、１ｏ％ＦＣ３を含むＲＰＭＩ　１１１１０μ ｍ中の生存細胞５Ｘ１０６個に対して行われ、また非特異的結合をブロックする ために、熱不活性化された２％正常ウサギ血清で１５分間罰インキュベートされ た。４℃で９０分間結合が行われ、続いてＲＰＭｒ／ＦＣ９て３回洗浄された。 細胞ベレット内に結合された放射活性が、バノヵードガンマ線カウンタでＭ１定 された。 ＦＭａｂ）’：フラグメントの調製 ｌｌｌ１ｇの精製免疫グロブリンを、ｐＨ４，５のアセテート緩衝液中において ３７℃で６時間、固定化ベプンンビーズ（ピアスケミカルズ）と反応させた。ｐ Ｈを８．８１：調節することによって反応を停止させ、＋５．０ＯＯＸ　ｇで１ 時間遠心してベブノンビーズを沈降させた。消化されなかった免疫グロブリン及 びＦｃフラグメントは、プロティンＡセファロース（ファルマシア）との反応に よって除去される。フラグメントの純度は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドケル分 画とこれに続くクーマシーブルー染色によって測定される。 血清中の抗原をブロックするための拮抗放射免疫検定造血性新生細胞の宙者から の血清を、新鮮な凝固血液から得、−７０℃で使用時まで保存した。５０μｍの 新鮮に解凍した血清及び１２５ＴでラベルされたｏＡｂ　Ｍ１９５１　ｇ　Ｇを ４℃で２０分間インキュベートすることにより、血清中のブロッキングＭ１９５ 抗原の存在を検定した。Ｍ１９５１ｇＧの濃度は、５×１０５個のＨＬ６０標的 細胞に対する５０％最大結合のために充分な濃度であった。次いで細胞を添加し 、４℃で６０分間インキュベーションを続けた後、ＲＰＭＩ培地で２回洗浄した 。 Ｍ１９５１ｇＧ結合の阻害を、ｍＡｂ　ＭＩ９５がＰＢＳ中の２％ウン血清アル ブミン（ＢＳＡ）の存在下かつ拮抗する血清の非存在下でインキュベートされた 場合と比較した、ＨＬ６０に対する結合の減少パーセントとして記録した。 補体−媒介細胞障害性 ２×１０６個／ｍｌの標的細胞２５μｍを、４℃において、２５μｍの補体およ び２５μｍのモノクローナル抗体と混合した。次いで、該混合物を時々振韮しな がら、３７℃で４５分間インキュベートした。トリパンブルー排除を指標として 、生存細胞および死細胞を数えた。 モルモット血清および幼児ウサギ血清は、Ｐｅ１Ｆ＋ｕｚ＊から購入した。ヒト 血清はボランティアから得た。全ての補体は使用するまで一７０℃で保存し、再 使用はしなかった。補体は、標的細胞の非特異的溶解を示さない最大濃度で用い たニ一般には１・６〜８の最終稀釈度である。 間接的な免疫パーオキシダーゼ検定および免疫蛍光検定組織的に正常な成人ヒト 組織を、切除後１〜２時間の外科的病理学検体から得た。幾つかの事例から得た 器官の、幾つかの正常な検体を用いた。イオベンタンｆｉｏｐｅＩｌｌｈａｎｅ ）／液体Ｎ、中で凍結した後、組織をＯＣＴ化合物に埋設した。組織を厚さ４〜 ８μｍに切断し、アセトン中で固定化し、Ｏ１％Ｈ２０２でクエンチし、ヒツジ またはウマ血清でブロックした。ｍＡｂ　ＭＩ９５は上清、腹水または２０μｇ 　／　ｒａ　ｌの精製したＩｇＧとして用いた。陽性および陰性の１ｇ対照は、 全ての研究に含まれている。ヤギ抗マウスＩｇＧパーオキシダーゼ複合体（１５ ０稀釈）（丁ａｇｏ、　Ｂｕ＋ｌｉｎｇａｍｅ、　ＣＡ）またはアビジン−ビオ チン・パーオキシダーゼ慢合体を有するビτチニル化ウマ抗マウスＩｇＧ（ベク ターラボラトリーズ、Ｂｕ＋ｌｉｎｇｚｍｅ、ＣＡ）を二次試薬として用いた。 ジアミノベンジノンかクロモーゲンとして用いられた。蛍光研究のために、ヤギ 抗マウスＩｇ−イソチオシアン酸フルオレセイン複合体（ヘクトンーディッキン ソン）が二次試薬として用いられた。 細胞表面抗原のモジュレーション 抗体結合の後にｍＡｂＭ１９５によって検出される細胞表面抗原のモジュレーシ ョンは、補体媒介細胞障害によってモニターされる（１０８）。ＨＬ６０細胞は 、３７℃で３時間まで、種々の濃度のＭ１９５とインキュベートされた。幾つか の時点で追加の抗体およびウサギ補体が添加され、４５分後に細胞溶解の量が測 定された。 ＨＬ６０のクローン化された変種、ＩＦＩＯ（１０６）及びその分化した単球性 変種（ビタミンＤ３及びホルボールミリステートアセテートと３日間インキュベ ートシ、単球性成熟を促進させた）を使用した（１０６）。細胞ラインは両方と もＹ、ケイヤー博士の好意により提供された。 新鮮な生きたＡ　Ｎ　Ｌ　Ｌ細胞（ＦＡＢクラス、Ｍ２）で免疫されたマウス由 来の牌臓の融合によって発生したハイブリドーマが産生ずる数百の抗体群の中か ら、ｍＡｂ　ＭＩ９５が詳細な研究のために選択された。この抗体は、骨髄細胞 ライン及び単球細胞ライン、即ちＨＬ６０、ＫＧＩ、ＩＦｌ、ＣＩ、Ｕ９３７及 びＩＦＩＯの単球性変種（表１）に対するＰＡ−ロゼツト検定において、特異的 な高い力価の結合を示した。ＩＩＡｂ　Ｍ１９５は、赤面病細胞ラインに５６２ に対して弱反応性であり、また未分化の骨髄細胞ラインであるＫＧｌａとは反応 しない。ｍＡｂ　Ｍ１９５は、種々の分化段階にあるＢ細胞起源の１８ラインと 反応せず、Ｔ細胞誘導の１０ラインとも反応しなかった。一つの無価値のフィン パ球ライン、即ちＮ−ＡＬＬ−１は弱反応性であった。活性化Ｂ細胞および活性 化Ｔ細胞は、抗原を発現しなかった。非反応性細胞ラインは、１．、０００．０ ００個の細胞中に結合する約１ｎｇのＭ１９５を検出できる吸収検定と、約ｌｌ １ｇ／ｍｌの抗体濃度での結合を検出するロゼツト検定によって、陰性であるこ とが確認された。殆どの細胞がＭ１９５抗原陰性であるこれら検定において、ｍ ＡｂＡＪ２か陽性対照として用いられた。細胞ラインのこのパネルは、Ｍ１９５ が、造血性細胞のうち非リンパ性系列に限定されることを示した・即ち、これは コミットされた骨髄細胞ラインおよび単球細胞ラインに最も高度に発現し、赤血 球細胞および初期骨髄細胞には弱く発現される。 表１．ＭＩ９５の造血性細胞ラインとの反応性３細胞　Ｍ１９５　ＡＪ２ （陽性対照） 骨髄性 に５６２　、　ＨＬ６０　０・　・ ＫＧＩ、Ｋ（７１ａ　・Ｏ・・ ＩＦＩＯＯ・ 単球性 Ｕ９３７　、　１．　Ｆ　１Ｏ（ｌｌｌｏｎｏ）　・・　・・Ｔ　ＨＰ　−１０ 前Ｂ細胞 ＮＡＬＬ−１，ＮＡ、ＬＭ−１００Ｏ ＮＡＬＭ−１，ＮＡＬＭ−１６００ Ｂ細胞 Ｓ　Ｋ　Ｌ　ｙ　−１６，−１８、Ｄａｕｄｉ　０００　・＾ＬＡ−１０，ＳＫ 　ＤＥＬ−２，Ｒ，ａｉｉ　０００　・・ＣＣＲＦ−５Ｂ　、　ＬＩＣＲ／Ｍｙ −２００・ＢＡＬＬ−！　○ ミエローマ Ｏｊｘ　、Ｕ２６６　、ＩＩＦＭＩ　８２６６　０ＱＯ０ＲＣ５，ＨＡＳ、ＢＩ ｏｗｎ　０００ ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞　０ （ｎ−１５） Ｔ細胞 Ｔ−４５、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、　Ｍａｉｌ　４　０００　０ＴＡＬＬ−１，ＭＴ −１，ＢＵＴ−１０２０００ＲＰＭＩ　８４０２　、　ＣＣＲＦ−Ｈ５Ｂ２　０ ０１）　１２／　ｃｈｉｋａｖａ　、　ＨＰＢ−ＡＬＬ　００　・ＰＨＡ芽旧胞 細胞　○ （ｎ−５） ・＝陽性；ｅ−弱陽性；〇−陰性 １テキストで説明した直接プロティンＡおよび混合血液付着ロゼツト形成、並び に吸収検定により測定されたものとして 骨髄細胞ラインへの結合の定量分析 ロゼ・ノド形成検定および吸収検定の結果を確認するために、また骨蝕細胞およ び単球細胞の間でのＭ１９５抗原発現の２５一 定置的相違を見るために、　■で７ベルされた精製Ｍ　ｌ　’１５の直接結合を 使用しまた感受性放射免疫検定が用いられた。多くの造血性細胞が、その表面の 標的抗原に加えて又はその代わりＦｃレセプタを有しており、これらＦｃ　レセ プターへの放射能ラベルされたＩｇＧの結合は、放射免疫検定の定量的結果を混 乱させるであろう。従って、Ｍ１９５のＦ（ａｈ’）２フラグメントを調製し、 これを該検定に用いて、抗原部位の数を確認した。 Ｍ１９ＭｇＧのＨＬ６ｔｌへの結合は、飽和および特異性を示した（図１ａ）。 スキャンチャート分析により、ＩｇＧについて、３Ｘ１．０９リツトル／ａ＋ｏ ｌの結合の結合活性が示された（図１ｂ）。この曲線から計算される結合部位の 数は、生きたＨＬ６Ｇ細胞１細胞１ウ当１００．０００であった。ＨＬ　６０の 異なった系統に対するＭ１９５１ｇＧの幾つかのロットのスキャンチャート分析 も、同等の結果を与えた。Ｍ１９５の精製されたＦ（ａｂ）’２の分析（図１． ｃ）によっても、同様の結合活性（１０・　リットル／ｍｏｌ）の細胞及び結合 物の数（１００，０００／ＨＬ６０細胞）が示され、フラグメントのプロテアー ゼ消化によっても結合活性は顕著に変化しないことが示唆される。 完全なＩｇＧおよびＦ（ａｂ）’２フラグメントの両者を、造血性細胞ラインの 放射免疫検定に用いた（図２）。この検定の条件下での非特異的結合（過剰の非 ラベルＭ＋９５の存在下での１２５Ｉ−、月９５の結合ンは、５Ｘ１０５個の細 胞者たり略２０ｆｌ　ｐｇ　（１６００分子）であった。従って、このレベルよ り高い結合のみが有意と考えられる。この検定は飽和濃度のＭ１９５ＩｇＧまた はＦ（ａｂ）’２の下で行われたから、全部の結合は細胞１個当たりの結合部位 の数を計算するのに用いられる。ＨＬ６Ｄ、ＩＦｌｌ）及びＵ９３７は、細胞１ 個当たり６０００〜１２０００の結合部位を有する。ＫＧＩは、細胞１個当たり 約３０００の結合部位を有する。ＫＧｌｉ及びに５６２に対する結合は、非特異 的結合のバックグラウンド（１６００部位）より多くはなく、また　。 非骨髄性細胞ラインは陰性であった。この検定によって、これら骨髄細胞および 単球細胞に対するＭ１９５の特異性が確認され、結合はＦｃ　レセプタに関係し ないことが示された。ロゼ・ノド形成および吸収によって陽性の三つの細胞ライ ンは、同じ量のＭ１９５抗体発現を有していた。 新鮮な正常造血細胞との反応性 ＭＩ９５は、生きた末梢血液成分および主要な造血性器官に由来する細胞との反 応性を調べるために、吸収分析により試験された（表２）。ｌＩＩＡｂＭ３１は 陽性対照として用いられた。 これら細胞型の何れに対しても、Ｍ　１９５の反応性は見られなかった。 造血性細胞に対する結合の定量的分析 反応性および定量的結合を確認するために、新鮮な造血性細胞に対して直接的な 放射免疫検定を行なった（表２）。 赤血球、血小板、ｎｙａ細胞、骨髄細胞および末梢血液単核細胞は陰性であった 。多形核白血病細胞は、完全なＩｇＧ１．ｌｌしてバックグラウンドよりも高い 細胞１個当たり約８００部位の結合を示したが、Ｆ（Ａｂ）’２フラグメントに 対しては顕著な結合を示さなかった。これは、この最小の結合がＦＣレセプタを 介したものであることを示唆している。末梢血付着性細胞（マクロファージ）陽 性であり、Ｆ　Ｆ　（Ａｈ）’　２に対する結合は細胞１個当たり約５０００の 抗原部位を示した。末梢血液Ｅ−ロゼツト陰性細胞に対する結合は、多分このボ ビュレーンヨンに含まれるマクロファージの存在パーセントが少ないことに起因 して、バックグラウンド限界よりも高い。マクロファージを除いて、ここに示し た直接放射免疫検定により、吸収による特異性分析が確認された。吸収検定にお けるマクロファージとの反応性の欠如は、Ｍ１９５を吸収するのに２要な充分な 抗原を含んだ大量の生きた細胞を得ることができないことに起因する（細胞１側 当たり５０００の抗原部位を存するマクロファージ１．０００．０００個は、約 ＩＢのｍＡｂ　Ｌか吸収しない）。 これら放射免疫検定における結合の欠如は、例えば骨髄のような大きく不均一な ポピユレーション内の幾つかのＭ　ｌ　９５陽性細胞の存在を排除する。 表２１Ｍ１９５の新鮮な造血性細胞との反応性１Ｂ富化ＰＢＬ　−−− 付着性単球　−−− 顆粒球　や 血小板　ＮＤ’ 赤血球　ＮＤ 非付着性ＰＢＭＣＮＤ　−− 牌臓性Ｔ富化　ＮＤ　−− 稗臓性Ｂ富化　ＮＤ　−−’ 牌臓性単核　ＮＤ　−ｄ 骨髄性単核　−−− リンパ節単核　−ＮＤ　ＮＤ 胎児胸腺細胞　ＮＤ　ＮＤ ３テキスト中に記載したようにして行った。 ｂＰＢＬ−末梢血液リンパ球、ＰＢＭＣ−末梢血液単核細胞ｃＮＤ−行わず ６非付着性細胞 補体媒介細胞障害性検定 補体媒介細胞障害性検定し、特異性を確認するために用いられた。検定では、ま ず補体源としてのウサギ、モルモット及びヒトの血清の存在下で、ｍＡｂ　Ｍ！ ９５が細胞を死滅させることかできるか否かを測定した。固相酵素免疫検定（Ｅ ＬｉｓＡ）によって、ｍＡｂ　Ｍ１９５は、一般に補体を固定できるＩｇＧ２ａ クラスの免疫グロブリンであることか示された。ＨＬ６０を標的に用いた場合、 Ｍ１９５は、モルモット補体およびウサギ補体の存在下で細胞を死滅させること ができたが、ヒト補体の存在下では死滅させられなかった。ヒト補体の存在下で は細胞の死滅は殆ど起こらず、最高でもバックグラウンドから１０〜１５％高い たけであった。 細胞障害性は抗体濃度依存性であり、また補体濃度依存性である（図３）。しか し、ＩＯμｇ／ｍ１以上のＭ１９５ａ度では、３０倍に稀釈されたウサギ血清を 用いた場合でも、略全での細胞が死滅された。 この補体検定は、吸収検定および放射免疫検定で得られた特異性分析（表２）を 確認するために用いられた。補体検定はＦＣレセプター結合によって混乱されず 、抗原陽性の大きなポピユレーション内の細胞のパーセンテージを決定する二と が可能である。検定は、　１１８の最終濃度に稀釈されたウサギ血清を用いて、 ＩＯμｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌのＭ１９５で行われた。ＨＬ６０および 新鮮な単球性白血病細胞を陽性対照として用い、Ｂ細胞系統のＲＡＪＩ細胞およ び慢性リンパ性白血病細胞を陰性対照として用いた。補体および抗体のみの対照 も含まれた。バックグラウンド死滅は、抗体または補体の存在しない対照では１ 〜５％であり、牌臓Ｅ−ロゼント陰性細胞では５〜１０％であった。数％のこの ハックグラウンドのために、陽性細胞がこのレベル以下でサンプル中に存在する か否かを測定することは不可能である。 成熟した正常な造血細胞の一つのポピユレーションのみが、Ｍ１９５およびウサ ギ補体を用いて、バックグラウンドより高い死滅を示した。付着性細胞のこれら サンプルのうちで、これら細胞のサブポビュレーンヨンが〜１１９５抗原を発現 したことを示す細胞の３５〜５０％が死滅した。この検定によって、放射免疫検 定のデータが確認された。 慢性１髄性白血病（ＣＭＬ）単核細胞のなかで、低いパーセントの細胞（５〜６ ％）がバックグラウンド（示されていない）よりも高い死滅を示した。ＣＭＬ単 核細胞ポビュレーンヨンを含む細胞には、優勢なより成熟した骨Ｈ細胞を伴うバ ンド形成によって、芽細胞が含まれる。抗体および補体処理の前後でのこれら細 胞の形態学的分析によっては、そのような事実があるにしても、何れの細胞が選 択的に死滅されたかは示されたなった。ｃＭｔ患者からの末梢血液細胞は成熟し た骨髄細胞の完全なスペクトルを示すから、この存意な細胞障害性の欠如によっ て、Ｍ１９５は大部分の成熟骨髄性細胞との反応性が欠如していることが確認さ れる。 Ｍ１９５及び分化したＨＬ６０細胞の反応性ＩＦＩＯ細胞および分化した単球性 ＩＦＩＯ細胞は、イーボン・ケイヤー博士によって提供された。１．００％のＩ ＦＩＯ細胞が形態学的に変化し、付着性になった。分化の前および後に、ロゼツ ト形成および放射免疫検定によって、Ｍ１９５の反応性が試験された。放射免疫 検定によると、分化した単球性１Ｆ１０細胞では、ＩＦ４０％の抗原発現の喪失 があった。ロゼツト形成試験は陽性のままであったが、結合の力価は１０倍低下 した。分化したＩＦｌｏに対する定員的結合は、新鮮で正常な付着性単球と同様 であり、インビトロでのこのモデルラインによって、新鮮な造血性細胞のなかで も単球の分化に伴う抗体の喪失は類似していることが示唆された。 ＡＤＣＣ検定 Ｍ１９５は、材料および方法の項で説明した条件下では、ＨＬ６０細胞およびＵ ９３７に対してＡＤＣＣを媒介する能力を示さなかった。これらの細胞は、試験 されたものの中で、当該抗原の発現か最も高いものである。 Ｍ１９５の非造血性細胞ラインとの反応性Ｍ１９５は、広範なスペクトルのガン から誘導された７０の細胞ラインとの反応性について試験された。反応性は全く 見られなかった。陽性抗体としてモノクローナル抗体ＡＪ２か含められ、これは 試験された何れのケースでも陽性であった。 従って、Ｍ］９５抗原は造血性細胞に限定されるように思われ表３．　Ｍ１９５ の非造血性細胞ライン　との反応性Ｍ１９５　Ａ　Ｊ　２ （陽性対照） 星状細胞腫　ＳＫ−ＭＧ−１，−２、−３０００・−４，−６，−７，−９，・ −１２，−１５，−１７、−２３００００・　・膀胱癌　丁−２４，２５３１， ５６３７０００乳癌　５Ｋ−ＢＲ−３，−５，−７０００ＢＴ−２０，ＭＣＦ− ７００・ 頚癌ＣＣ−Ａ、　ＣＣ−Ｂ、ＩＩＴ−３００００６＠Ｃ４１０・ 棧毛癌　ＧＣＣ−ＳＶ　（ｃ）　、　Ｌｌｌ−７５（ｃ）　００結腸癌　５Ｗ− ４０３，−４８０，−６２００００・・・−１１６，−１４１７００・・ ！ＩＴ−２９，５Ｋ−Ｃｏ−１０００・・ＣａＣｏ−２，ＨＣＴ−１５００・・ 肺癌　５Ｋ−ＬＣ−１，−４，−６０００ｅ　ｅ−８，−９，−１０，−＋７　 ００００　・　・Ｃｘ１ｕ−１，−６，５に−Ｌｕ−＋　０００　・・・ＳＸ　 ＭＥＳ−１０Ｐ　Ｏ＠ メラノーマ　ＳＫ　ＭＥＬ−１３，−２３，−２８０００・・・−２９，−３７ ，−９３０００・・・ −１７３，Ｍｅｍｏ　００　・ 神経芽腫　ＳＫ−Ｎ−ＭＣ，ＰＮＤＷ　００　・・卵巣癌５Ｋ−ＯＶ−３，０Ｖ −２７７４００・膵臓癌　ＡＳＰＣ−１，−２００・・ 腎癌　５Ｋ−ＲＣ，−１，−２，−７０００・−８，−９，−２０，−２８００ ００・・−２９，−４５，−４８，０００・・・子宮癌　ＭＥ　１８０．　ＳＫ 　ＩＩＴ−１００ｅ・３表１に記載したようにして行った。 Ｍ１９５の組織分布 Ｍ１９５のヒト組織との反応性は、新鮮な凍結組織に対しする、間接的免疫蛍光 検定および間接的免疫パーオキシダーゼ検定で測定された（表４）。２５の異な ったタイプの組織に、反応性はみられなかった。新鮮な組織に対するこれらのデ ータは、上記細胞ラインでの検定で得られた特異性のデータと一致する。 表４．．　Ｍ１９５の組織分布１ 副腎　ＯＯ 膀胱　Ｏ○ 乳腺　○　０ 毛細血管　０　０ 頚部　０　０ 結腸　ＯＯ 心Ｗａ　ｏ　○ 腎臓　０　０ 肝臓　０　０ 胎盤　○　Ｏ 前立腺　０　０ 精巣　０　０ 甲状腺　０　０ ０＝陰性、　Ｐ−陽性染色 １材料および方法の項で説明したようにして行った。 Ｍ１９５の新鮮な白血病との反応性 ロゼツト形成試験において、Ｍ＋９５は殆どの骨髄性白血病と反応し、リンパ性 白血病とは殆ど反応しなかった。ロザゼノト形成試験の性質のために、どの細胞 が反応性であり、芽細胞の何パーセントが陽性であったかを決定することはでき なかった。これら組織、並びに標準的な細胞表面マーカーと比較したＭＩ９５の 特異性および活性の詳細な分析は、後述の実験２および参考文献１０９に詳細に 記載されている。 血清中におけるＭ１９５ブロッキング抗原Ｍ＋９５抗原が造血性細胞から血清中 に脱離したか否かを測定するために、種々の白血病もしくはリンパ腫の人からの 血清または健康な人からの血清が、放射能ラベルされたｍＡｂ〜１１９５のＨＬ ６０細胞への結合をブロックできる可溶性抗原について試験された。３９のヒト 血清のうちの三つが、有意に結合をブロックした。このブロッキングは完全では なかった。 一つの血清はＣＭＬ患者からのものであった。急性リンパ性白血病の６人の患者 の二つの血清は、部分的に結合をブロックする。これら両患者からの白血病細胞 はＭ１９５抗体と反応せず、ブロンキング抗原はこれら細胞から脱落しないこと 、またはブロッキング活性か特異的でないことが示唆された。 これらのデータは、血清中のＭ１９５抗原がｍＡｂ　Ｍ１９５が標的細胞に到着 するのを妨害できないであろうことを示唆する。 この検定の感覚は約２００　ｎｇ／ｍｌのＭ　ｌ　９５であるから、Ｍ　＋９５ は、これよりも低いレベルで血清中に発現することは可能である。加えて、Ｍ１ ９５１ｇＧに対する低い結合活性をもった１価の抗原が存在するかも知れないか 、結合をブロックすることはできない。 表５．白血病患者の血清中における Ｍ１９５ブロッキング因子 ＣＭＬ　６　１（５２％）ｂ ＡＬＬ　６　２（５６〜、６７〜） ＡＨＬ／ＣＬＬ　８　０ ウサギ、マウス、ウマ　５０ １血清は、放射性ヨウ素化された２００　ｎｇ／ｍｌのＭ１９５のＨＬ６０標的 旧胞に対する直接的結合を５０％以上減少できる。 ゝ夫々の陽性血清によるパーセント減少抗原のモジュレーション ＨＬ６０細胞の表面から抗原のモノニレ−ジョンを誘導するＭ１９５の能力は、 補体媒介細胞毒性を用いて研究された。 ＨＬ６０細胞は種々の濃度でＭ１９５と反応し、ウザギ補体を添加した場合のＭ １９５の細胞殺傷能力を時間に対して測定した（図５）。最高抗体濃度において は３時間以内に補体のモンユレーンヨンが生じた。つまり、ｍＡｂ　Ｍ１９５と 共に３時間インキ二ヘートされた細胞に補体を添加すると、細胞は死滅しなかっ た。モジュレーションは、低いｍＡｂＩｇＧａ度に晒された細胞では不完全であ った。他の研究は（下記実験３）、モジュレーションは抗体が結合した後の抗原 の内在化を介して生じることが実証された。 Ｍ１９５抗原の生化学的性質 ラジオイムノアッセイ及びロゼツトアッセイにおいてＨＬ６０細胞を１分間１０ ０℃で処理することにより、全結合活性を排除した。これは、抗原のエピトープ は蛋白によって運ばれることを示唆している。しかし、トリプシン、プロテアー ゼ、及びノイラミニダーゼを用いて処理しても、ＨＬ６０細胞に対するｍＡｂ　 〜工１９５の結合には何の影響もなかった。従ってこれらの実験によっては、抗 原の生化学的性質を確認することはできなかった。３５Ｓ−メチオニンで標識さ れた細胞、或いはヨード−１２５を用いて表面を標識された細胞に対する抗原に ついて、ラクトペルオキシダーゼを用いて免疫沈降を繰り返し行ったが成功しな かった。ＨＬ６０抽出物についてウェスタンブロッティングを行ったが陰性であ った。我々は標的を同定することはできなかったが、参考文献１０９の実験２に 示された他のデータは、この抗原はＣＤ３３蛋白によって運ばれることを示して いる。 議論 この実験は、骨髄性白血病細胞、初期の骨髄細胞及びいくつかの単球と反応する 新しいマウスｍＡｂである、Ｍ１９５の特異性を詳細している。ｍＡｂの結合に ついての定性及び定員分析、その生物学的活性、及びその免疫学的機能を記載す る。 Ｍ１９５の２つの利用可能性は、診断及びＡＮＬＬのインビボにおける治療なの で、全組織及び身体の細胞との反応性の包括的な定義かなされた。新鮮な細胞及 び細胞株におけるＭ１９５の特異性の分析に、いくつかのアッセイが用いられた 。最初に、ｍ１当たりのｍＡｂ　Ｍ１９５　１ｎｇを検出するのに十分、感受的 なロゼツトアッセイが、特異性を分析するために用いられた。次に、ヨード−１ ２５１ｇＧ及びＦ々の陽性細胞上に発現した抗原部位の数を定量するために用に 定義する利点を有する。最後に、補体結合アッセイが、反応性を分析するために 用いられた。このアッセイには、適切な方法で抗原に結合した後の生物学的活性 が要求されるため、非特異的結合の影響は低減する。非直接的な免疫蛍光法及び それに続く非直接的なイムノベルオキシダーゼアソセイによる確認は、正常組織 の広スペクトルのＭ　１９５抗原の発現を定義するために用いられた。これらの 結果は、細胞株におけるロゼツト及び吸収分析から得られたデータを示唆するも のであった。組織は凍結切断され、固定されているので、膜抗原と同様に細胞質 抗原への結合もこれらのアッセイで検出することができた。 Ｍ１９５は骨髄細胞株及び単球細胞にのみ特異的に結合することか発見された。 末梢血Ｔ及びＢ細胞を包含するリンパ球細胞、リンパ節、腓臓及び骨髄細胞、ブ レＢ、初期Ｂ、Ｂ、及び後期Ｂ細胞期及びｒｍｍ外性白血病細胞代表するＴ及び Ｂ細胞株、及び活性化された新鮮なり及びＴ細胞は、Ｍ　１．９５抗原を発現し なかった。赤血球及び血小板もまた陰性であった。９５の非造血細胞株及び非造 血組織の中で、非成人組織はＭ１９５と反応した。絨毛上皮癌細胞では細胞質の 骨髄抗原の存在が報告されているか、正常栄養芽細胞では報告されておらず（１ １０）、その重要性も知られていない。 骨髄単球系てのＮ１１９５抗原の分布は更に制限される。多形核白血球は反応性 もなく、正常骨髄単核細胞におけるＴｌｉ要な結合も実証できなかった。慢性骨 髄性白血病患者からの末梢二車核細胞の少数パーセントの細胞は陽性であった。 これらのサンプルはバンド期に至るまでの顆粒球前駆細胞を多く含んでいる。多 形核白血球との反応性の欠如、及びＣ〜ＩＬとのこのわずかな反応性は、多量の 成熟及び骨髄前駆細胞はＭ１９５抗原を発現していないことを示唆している。反 対に、骨髄性白血病細胞株及び新鮮な骨髄性白血病細胞は強陽性であった。最も ′ｆｒＪ期の骨髄細胞或いは赤血球細胞を代表する細胞株は陰性、或いは後期白 血病細胞を代表する骨髄細胞株より弱い陽性を示した。これらのデータは、骨髄 分化の初期或いは中期における細胞に対するＭ　１９５抗原の発現を示唆してい る。この抗原は最初は存在せず、また細胞の顆粒球への成熟に伴って消失する。 単球細胞の中で、Ｍ　１９５は、単球白血病細胞株及び成熟末梢血粘着細胞のフ ラクノヨノと反応した。これはＨＬ６０変異株であるＩＦＩＯに存在し１、ビタ ミンＤ３及びフｔルボールエステルＣｐｈｏｒｂａｌ　ｅｓｔｅｒｓ）を用いた ＩＦ　］、　Ｏの単球への分化の後に、量が減少する。更に、Ａ　ＭＯＬ芽細胞 は、マクロファージが５０００部位を有するのに対して、約１０，０００部位（ 実験２）を存する。従って、顆粒球前駆細胞における発現のように、単球細胞に おけるＭ１９５抗原の発現も成熟依存性であるように思われる。 ＨＬ　６０細胞に対する定置的な結合の分析は、３Ｘ１０９リゾトル１モルのＭ １９５　１ｇＧの結合能を与えた。結合は飽和できるものであり、細胞数に依存 的であった。これらのデータは、陽性細胞株は細胞当たり約１０，０００の抗原 部位を発現していることを示している。従ってＭ１９５は他の多くの細胞表面抗 原に比べて比較的弱く発現している。我々は、ｍＡｂ　Ｍ１９５の標的抗原を同 定することはできなかったが、そのいくつかの特徴はポリペプチドであることを 示唆している。この抗原は熱に不安定である。表面に発現しているのは少数であ る。この抗原は、抗体が結合した後直ぐにモジュレートされ、またＩｇＧ２ａに よって検出された（これはこの研究室ではめったに同定されない炭水化物であっ た）。 試験された細胞型の中でこの抗原の発現がかなり制限されていたこと、急速なモ ジュレーション及び内在化を包含する上記の生化学的特徴、及び細胞当たりの部 位が少数であることはすべて、Ｍ１９５の標的た骨髄前駆細胞の増殖及び分化に 重要な受容体であることを示唆している。しかし、骨髄細胞株、末梢血単核細胞 （データは示されでいない）、及びコロニー形成ユニット（１０９）の増殖にお ける〜１１つ５単独の効果の研究は、ｍ　Ａ　ｂのいかなる刺激及び抑制効果ら 示さなかった。 限定された骨髄抗原と反応するｍＡｂは少なくとも４つの領域において有用であ る。 Ａ）骨髄細胞及び単球細胞の増殖及び分化の研究骨髄単球の分化において記載さ れた多くの抗原及び抗体システムの中で、骨髄細胞の成熟の異なる状態を定義し た２つのシステムが最も広く研究されている。リンパ系及び骨髄細胞系の両方の 最も初期の造血前駆細胞に見られるｇ　ｐ　１．１５を認工し、分化において直 ちに消滅するＣＤ３４システム（ｍＡｂｓ　＆１Ｙ１０．１２．８．３Ｃ５）（ ４２−４４）はまた、内皮を含むいくつかの非造血組織にも見られる。この抗原 に対するｍＡｂｓは骨髄の再構成に対する前駆細胞を精製するために用いられる （４２）。ＣＤ３３抗原システム（ｍＡｂｓ　ＭＹ９．Ｌ４Ｆ３．ＬＩＢ２）（ ４７−５０）は、初期の骨髄細胞及び単球細胞に限定されたｇｐ６７（４１）を ４工する。これは、最も初期の造血前駆細胞及び他の正常組織には欠けているも ので、最終前駆細胞を倹約しながら、骨髄から白血病細胞を排除するために用い られる。ＣＤ１５抗原システム（多重量Ａｂｓ）は、期７日目の顆粒球コロニー に見られるＬｅｗｉｓ　Ｘ　抗原を認＝し、細胞か多形核細胞へ成熟するにつれ て発現を増加させる。この抗原はまた、正常組織にも広く分布している（１１１ ）。 この文献で詳細されたＭ１９５抗原の分布は、Ｍ１９５抗原が骨髄単球に特殊な 第二のカテゴリーに分かれることを示している。競合的結合の研究、及びＣＤ３ ３形質転換細胞への結合（実験２及び参考文献１０９で議論された）は、Ｍ１９ ５はＣＤ３３蛋白で運ばれることが実証された。しかし、新鮮な白血病細胞のコ タイピングは、ｍＡｂ　Ｍ１９５によって検出された抗原は他のＣＤ３３抗原と 一致しないことを示した（１．０９）。 Ｂ）造血新生細胞の診断 診断学的応用に有用なｍＡｂｓは、系特異的でなければな　。 らないが、期待異的である必要はない。従って、リンパ球細胞にも存在するＣＤ ３４抗原は、骨髄単球抗原システムＣＤ１３及びＣＤ１５、或いは単球特異抗原 ＣＤ１４よりも有用性が低い（５０，１１２，１１３）。Ｍ１９５は骨髄単球細 胞に限定されており、ＡＮＬＬの診断に有用である。 Ｃ）ｆ髄からのＡＮＬＬの浄化 骨髄の浄化に有用であるために、骨髄単球に特異的であることに加えて、ｍＡｂ は最終前駆細胞を節約するものでなければならない。骨髄の外の他の組織との反 応性は重要ではない。補体を結合させるための能力は重要であるが、毒で細胞を 殺すため（１１４）　、或いは磁気性ビーズを用いて細胞を除去するため（１１ ５）の新しい方法を用いると、この要求は低減される。ＣＤｌ５抗体は、この応 用において最も有用であることが証明されており、現在は臨床学的試験に最も有 用である（３６）。ＣＤ３３抗体は骨髄前駆細胞の十分な回収か保証され得ると きでさえかなり有用である。ウザギ補体と共に、直ぐにかつ効果的に白血病細胞 を殺すＭ１９５は、この問題に好ましく適応することができる（実験５参照）。 この抗原は、クローン原性新生細胞にも見られるため、ｍ、Ａｂもまたリンパ性 新性細胞の治療に用いることができる。 Ｄ）インビボにおけるｍＡｂを用いた治療この応用は、上記の規範に加えて、最 適に正常組織との限定された反応性を要求するために、最も困難なものである。 骨髄単球細胞に対して記載された多くの抗原システムの中でも、ＣＤ３Ｂはイン ビボにおけるこの応用に最も適しているように思われる。〜１１９５も応用して 用いるとかできる。しかし、インビトロにおいて、ヒト補体或いはＰ　Ｂ　Ｍ　 Ｃの存在下ではＭ１９５は細胞毒性を持たないので、ｍＡｂは好ましくは丑も効 果的な細胞毒性アイソトープまたは毒を運ぶへきである。抗原及び抗体は直ぐに 内在化されるので、この治療様式は実行可能である。 実験　２　（讐照ａ） 実験１において、我々は、初期骨髄細胞、単球およびＡＮＬＬ細胞について見出 され、他の造血細胞もしくは非造血細胞系の細胞（１８）については見出されな い抗原を検出する、マウスモノクローナル抗体、Ｍ　ｌ　９５を開示した。記載 された抗原は、初期骨髄細胞およびＡＮＬＬ細胞には見出され、ＡＮＬＬ細胞（ ＋１９）を選択的に殺すことができる根源的な始原細胞（１１９）には見出され ない骨髄性単球細胞抗原ＣＤ３３（１３、＋４）と共通の幾つかの特徴を有して いる。この研究においては、２２７種の異なる新鮮な造血性新生物の中でＡＮＬ Ｌに対して特異的なＭ１９５の反応性を開示する。この反応性は、ＭＹ９　（Ｃ Ｄ３３）に類似ではあるが、同一ではない。これら２種の抗体の標的細胞との結 合の交叉阻害が見出された。 ＭＹ９と組み合わせることにより、Ｍ１９５は、臨床検体のフローサイトメトリ ーによるＡＮＬＬの診断において特異性を示した。Ｍ１９５は、コロニー形成検 定による測定では、はとんどのＣＦＵ−ＧＭと結合した。ＭＩ９５の反応性のこ のパターンは、その成人組織との反応性の欠如（１１８）と共に、ヒトの治療上 の試みにおいてｍＡｂ　Ｍ］９５を有用なものとしている。 材料および方法 モノクローナル抗体 Ｍ１９５．７ウスＩｇＧ２ａは、実験１（上記）に記載した通りに、当研究所に おいて調製した。以下のｍＡｂは、コールタ−崇イムノロノー（Ｃｏｕｌｌｅ＋ 　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　：　！１ｉ＝ｌ＋ａｈ　５Ｆｌ）から入手した。〜ｉ Ｙ９、ＩｇＧ２ｂ、（ＣＤ３３）　＋８４　、ＩｇＧ　Ｉ（ＣＤ１９）；Ｂｌ　 、ＩｇＧ　２Ａ　（ＣＤ２０）；ｌ、もしくは１３、ＩｇＧ　２Ａｓ（抗ＨＬＡ −ＤＲ）：ＭＹ４　、Ｉ　ｇＧ　２ｂ　（ＣＤ１４）　：およびＭＹ７、ＩｇＧ ２ｂＣＣＤ１３）。これらは、フルオレセインイソチオンアネート結合体もしく は精製免疫グロブリンのいずれかとして得られた。以下のｍＡｂは、ベクトンー ディキンソン（Ｂｅｃ＋ｏｎ−Ｄｉ＋ｋｉＨｔｏｎ　：　Ｍｏｕｂｌａｉｎ　Ｖ ｉｅｗ　、ＣＡ）から入手した。ＭＹＩＯｌＩ　ｇＧ　ｌ　（ＣＤ３４）および Ｆ　（ａｂ）−２のヤギー抗マウスＩｇフルオレセインイソチオンアネート結合 体。ＩｇＭ（ＣＤ３３）腹水は、Ｄｒ、アービン・ベルンユタイ＞　（ｌｒｖｉ ｙ　Ｂ＋＋＋＋ｅｉｎ）から贈られたものである。オルソ・バイオチック（０＋ ｔｈｏ　Ｂｉｌ＋ｃｈ　：　Ｒ２＋１ｌａｎ　、ＮＪ）から提供されたハイブリ ドーマ由来のＭ　３１、Ｉ　ｇＭ　（ＣＤ＋５）および０ＫＢ７、ＩｇＧ　２Ｂ 　（ＣＤ２１）は当研究所で調製した。 フローサイトメトリー 骨髄由来の、　５００万個の新鮮な生単核細胞または記念病院での血液型−リン パ腫す−ビ７．　（Ｈｓｍａ＋ｏｌｏｇ７−Ｌ７ｍｐｈｏｍａ　５ｅｔｖｉｃｅ 　）の患者由来の血液を、フルオレセイン結合モノクローナル抗体と共に、最終 体ＭＯ，１ｍｌとして、４℃で３０分間インキュベートした。その後、２回洗浄 し、分析の前に０１％パラホルムアルデヒドで固定した。間接免疫蛍光法のため に、第１抗体を４℃で３０分間インキュベートした後、ヤギー抗マウスフルオレ セイン結合体５０μｌを３０分間添加し、洗浄および固定を行なった。試料の幾 つかでは、Ｑ予備法（Ｑ　ｐｔｅｐｍｅｔｈｏｄ　・コールタ−）を用いる直接 免疫蛍光法によって、全血を分析した。ＥＰＩＣ５ＣまたはＥＰＩＣＳプロフィ ール（コールタ−）フローサイトメトリーのいずれかにより、１万個の細胞を分 析した。分析のために、芽細胞をすり潰した（Ｅｌａｕｅ＋＋　ｗｕｓ　ｇａｔ ｅｄ　）　ｏ　２５％を越える陽性細胞を含有する試料を（イソタイプ適合制御 ■ｇを陰性蛍光強度の上限の選定に用いて）陽性として評価した。 ラジτイムノアッセイ ヨウ素−１２５で放射性ラベルしたＭ１９５　ＩｇＧ　２ａをプロティンＡアフ ィニティクロマトグラフィで精製し、前述（１１８）の生白血病細胞および骨髄 細胞に対する直接ラジオイムノアッセイに用いた。Ｍ１９５は２−１０　μＣｉ ／μｇタンパクとなるようラベルした。特異結合は、過剰の非ラベルＭ１９５１ ｇＧ　２１１の存在下における結合〜１１９５　ＩｇＧ　２ａの量を減じること により決定した。非特異結合は、細胞１００万個当り約４００ｐｇ（細胞当り　 １６００サイト）であった。したがって、このレベルもしくはそれ未満の結合は 重要ではないと考えられた。 白血病の影響学的命名 記念病院の白血病サービスの患者における急性白血病を、フランスルアメリカ− イギリス（ＦＡ、Ｂ）基準（１２０）に従って分類した。組織化学的染色で陰性 であり、す／べ様ではなく、かつ他の診断でＦＡＢ基準を満たさない未分化細胞 はＭＯ（２つのケースのみ）に分類した。骨髄吸引物および末梢血スミアを、形 態学のために、マクニール・テトラクローム（Ｍｃ）ｂｉビｓ　Ｉ！！ｒａｃｈ ＋ｏｍｅ　：　Ｐｏ１７ｉ＋１ｅｎｃｅ　、　Ｗａ＋＋ｉｎｇｔｏｏ、２人）で 染色した。組織化学分析には、スーダンブラックＢおよび／またはベルオーＦ／ ダーゼ並びに過ヨウ素酸ンソフ、アルファナフチルブチレートおよびＡＳＤクロ ロアセテートエステラーゼ、酸ホスファターゼ、末端デτキンヌクレオチジルト ランスフエラーゼ（Ｔｄｔ）を用いる染色を含めた。潜在的Ｂ細胞新生物を、マ ウス赤血球のロゼツト形成および免疫グロブリン生成物のための間接イムノベル τキンダーゼにより分析した。Ｔｍｍ上上ヒツジ赤血球細胞受容体の存在は、３ ７℃および４°Ｃでのロゼツト形成（およびフローサイトメトリーによるモノク ローナル抗体）により決定した。 骨髄コロニー形成単位の決定 （２２）に記載されているように、ＣＦＵ−ＧＭＳＣＦＵ−ＧＥＭ、およびＢＦ Ｕ−Ｅ由来のコロニーについて、骨髄性単核細胞を分析した。培養は、２４％ウ シ胎児血清、０８％税イオンウノ血清アルブミン（シグマ・ケミカル社、ＳＬｌ 、ｏｕｉｓ、ＭＯ）　、１０”４＆ｉ　２−メルカプトエタノール（シグマ・ケ ミカル）、＋Ｕ部分精製ヒト尿性エリスロボエチン（４９Ｕ／ｍｇ）ｃ　ト−ヨ ー　ホー、ｌｉＹ、　ＮＹ）　、ｌＯ％ＭＯＴｍ胞系、ｇ整培地、および１４３ ％メチルセルロースからなる。培養物は、４通り作製し、７日もしくは１４日目 に評価した。幾−〕かの検定においては、３７℃で９０分間の可塑性接着（ｐｌ ａＮｉｃ　５ｄｈｔｔｔｕｃｅ　）により、最初に接着回外が除去された。コロ ニー形成単位の抗体介在相補細胞毒性を、まず、最終希釈ｊ、８の、過剰のモノ クローナル抗体（１０−１００μｇ／ｍ　１）および低毒性子ウサギ補体（ｔｅ ｌ　Ｉｒｅｅｒｔ）中において、骨髄性単核細胞を３７℃で３０分間インキュベ ートし、次いで培地で２回洗浄することにより決定した。これとは別に、ヒト血 清を補体源として用いた。 精製正常始原芽細胞の調製 （２２）に開示されるように、密度分離およびモノクローナル抗体のパネルを用 い、次いで免疫ロゼツト形成またはパニングを用いる逆選択（＋＋ｅｇａｆｉｙ ｅ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ）により、正常骨髄細胞から成熟副細胞を除去して始原 細胞の数を増加させた。 １２例の抗体が、成熟Ｔ、Ｂ、骨髄、および単球細胞上に存在する細胞表面抗原 と反応した。次いで、細胞を液体窒素中で凍結して一旦もどし、使用前に、フィ コール−バーク（Ｆｉｓ。 Ｉｆ−Ｐａｑｕｅ　：ファルマシア、Ｐｉ＋ｃｘ＋ｘｖａｙ、　Ｎｌ）上で再分 離した。 結果 造血性新生物上のＭ２Ｏ３の分布 フローサイＩ・メトリーにより測定した、２２７人の去者由来の単核細胞に対す るｍＡｂ　Ｍ］９５の結合を表１に示す。Ｍ２Ｏ３は、肯髄芽細胞性白血病の大 多数に見出された。陽性ＡＮＬＬの場合の３０％のほうかＭ２Ｏ３に陽性の細胞 の５０％よりも大きかった。陽性の場合の４０％のほうかＭ２Ｏ３に陽性の細胞 の７５％よりも大きかった。リンパ性白血病、リンパ球分裂疾害、および他の非 骨髄性試料は、実際には常に陰性であった（ケースの４％が陽性）。 数例の陽性造血性新生物における結合サイトの総数の定量分析は、ラジオイムノ アッセイによって行なった。従来の研究（１１８）は、骨髄性単球白血病細胞系 が、細胞１個当り約１．０．０００の抗原サイトを発現することを示していた。 同じ量か、数人の患者由来の新鮮なＡＮＬＬ細胞について見られた（図６）。リ ンパ性白血病およびリンパ腫、および慢性期にある慢性骨髄性白血病（ＣＬＭ） 細胞は、それらの表面上に抗原を発現しない。 表　１ す佃・メＩ・リ−８による遺皿性新生物におけるＭ２Ｏ３の分布急性非リンパ性 芽細胞白血病　５４　３４　（６コ）Ｔｄｔ〜陽性の場きのみ　１０　コ　（コ ０）４髄性、芽細胞の場合の総数　６１　４１　（６７）慢性骨髄性ｌｌＬ球白 血＠　３　）　（１ｏｏ）　’骨髄形成異常症候群　２５　１２　（４０）Ｇ性 すンパ性芽細胞白血病； Ｃａ１ｌａ　＋　コニｌ　４　（１２）Ｃａｌｌａ　−８０ リンパ性芽ＷＩＩ１２１期　５゜ リンパ性、芽細胞の場合の総数　５１　４　（８）正常、非Ｊシ断、その他　５ １０ ８「材料および方法４に記載の通りに実施Ｍ　１９５の発現をＡＮＬＬのＦＡＢ 分類（表２）と比較した。 Ｍ１９５は、？ｖ１０およびＭ６を除いて、ＡＮＬＬの全てのサブクラスにおい て発現した。これら２つのクラスの白血病は非常に僅かであるので、この重要性 は明らかではない。しかしながら、ＭＯおよびＭｌクラスの両者がプールされて いる場合には、Ｍ２　、Ｍ３　もしくはＭ４白血病の４４例のうちの３０例（６ ８％）か陽性であるのと比較して１４例のうちの３例（２３％）か陽性であるだ けであった。 表２ Ａ　Ｍ　ｌ−のＦ　Ａ　Ｂ形態７的サブグル　プ内にＩ〕ける〜１１Ｌ′１５抗 原の分布 Ｆ　、Ｂ　、：ｆｔｐ−ア　試験数　Ｍ１９５陽性の数　（豹ＭＯ２０（０１ Ｍ１１２コ（２５） Ｋ２　２４　１５　（６コ） Ｍ３　５　５　（１００） Ｍ４　１５　１０　（６７１ Ｍ５ａ　５　：ｌ　（６０） Ｍ５ｂ　１Ｂ　Ｂ　（４４） Ｍ６　２　０　（○） Ｍ’７　１　１　（１００） Ｔｄｔ陽性ＡＮＬＬ　（＞３２０　ｎｇ／１０８細胞）は、また、Ｔｄｔ陰性骨 髄性白血病（７４％）と比較してＭ１９５陰性（３０％）である傾向にあった。 これらのデータは、Ｍ　１９５抗原はより未分化である初期骨髄細胞よりも初期 抗原感作顆粒球前駆則胞により高度に発現する（１１．８）とする我々の初期の 冊子からの示唆を支持するものである。 Ｍ１９５は、慢性期のＣＭ　Ｌ試料の３番目、骨髄芽明もしくは促進期の全ての ＣＭＬ細胞について見出されている（表３Ａ）。急性リンパ球性（全）白血病４ ６例のうちの４例がＭ１９５陽性であった（表３Ｂ）。これら全ての試料は、Ｃ ＡＬ　Ｌ　Ａ陽性プレＢ白血病であった。これらの試料におけるＭ１９５に陽性 の細胞の総数は比較的低い。すなわち、２６％、３２％、３９％および４２％で あった。他のマーカーは比較のために示す。ＭＹ９は、５例のブレＢ白血病に、 ２７％、２８％、３５％、３５％および６２％のＭ　Ｙ　９陽性細胞が存在した 。これらのうちの４例は、ＭＩ９５陽性であるものとは異なっていた。 −例では、２８％のＭ　Ｙ　９陽性および４２％のＭ１９５陽性であった。ＭＹ ９は、リンパ芽球性ＣＭＬ５例のうちの１例にも見出された（表３Ａ）。 人３Ａ 記よ病院　における慢性（十髄性自ｌ！ｌＩ病のイムノフェノタイプ試験（，５ Ｍ１９５　Ｍｙ９　ＭｙｌＯＭｙ７　Ｍｙ４　／Ｂ４　工δロ仏　ｉ７　４１　 ４１１９　１８６　６　２４慢性間 ＣＫｒ、　７　１００　７０　Ｚｏｏ　８６　２８　ＮＤ　８６促進および芽細 胞 ＣＫＬ　５　０　２０　１００　５０　０　８０　８０リンパ性芽細胞 表３Ｂ 記念病院８における急作りシバ性芽細胞白血病のイムノフェノタイプへ＋−１、 ｙイｙ試験Ｅｔ、　工ａ　ＭｙｌＯＢ４　Ｂｌ　Ｍ１９５　Ｍｙ９Ｃ入ＬＬ入　 今　ココ　！１２　５８　９１　５２　１２　１５０人ＬＬＡ　−８ｓａ　ｓａ 　１ｏｏ　ｏ　ｏ　。 Ｔ−人ＬＬ　ｓ　ｏｏｏｏｏ。 総　数　４１　８コ　６４　９５　４１　１０　１２非ＴＡＬＩ− 総Ａ１．−１−　４６　７４　５７　Ｂ５３７　９　１１８「材［＋および方法 １に記載の通りに実施Ｍ１９５とＣＤ３３抗原との比較 Ｍ＋９５の分布は、ＣＤ３３反応性抗体ＭＹ９およびＬ４　Ｆ３について記述さ れたものと同じに見える。このため、Ｍ１９５のタンパク標的は検出にほとんど かからない（１，１！ｌ）。同じ白血病に対する、〜１１９５の反応性と他のよ く特徴付けられた骨髄性マーカーとの比較を表４に示す（この表には、表２に含 まれる他のマーカーによって特徴付けられていない３０例の白血病は含まれてい ない）。ＭＹｌ、０、Ｍ　Ｙ　７およびＭＹ４は、Ｍ１９５とは異なるパターン で全てのサブタイプにわたって分布していた。ＭＹ９は、その分布パターンが著 しくＰｖｉ１９５に類似していた。フローサイトメトリー研究における、新鮮な 、急性−１＃髄性白血病（リンパ性もしくは非リンパ性）Ｉこ対するＭ１９５と Ｍ　Ｙ　９との一致の解析を表５に示す。ＡＮＬＬまたは急性リンパ性白血病の ９３例において、両マーカーが陽性であるか、もしくは両方か陰性であるかのい ずれかであっｌ：。 １９例は異なる結合であり、その結果、全体で３３％の一致率となった。この高 いが完全ではない一致は、Ｍ　ｌ　９５抗原がＣＤ３３に関連があるか、もしく は共に発現するものである可能性を示唆した。 表　・１ 記念病院におけるＡ　Ｍ　Ｌ　、７）　ｆ仁〜Ｂサブグル−アのイムノブｌツタ イアグループ　試＠ｔ　ＭＹ工ＯＭｙ７　Ｍｙ９　Ｍ１９５　Ｍｙ４ＭＯ２１ｏ ｏ　１ｏｏ　ＯＱ　Ｑ Ｋユ　５　８０　５０　６０　４０　０に２　１５　６７　コ３　７３　７コ　 ７Ｘコ　４　１ｏｏ　５０　ユ○０　１００　７５Ｍ４　１０　７０　４０　８ ０　７０　４４ト（５ａ　コ　１００　コ１　１００　６７　０Ｍ！ｉｂ　１２ 　５８　４５　７５　５８　１７Ｍ６　２　５０　１００　５０　０　０Ｍ７　 １　１００　０１００　ＬＯＯ０表５ １１２ｆ１１の芽細胞性白皿病ｌ：対するＭＩ９５およびＭＹ９の一致データ反 応性・ぐターン　例数 ＭＹＱ　＋および’Ｍ１９５　＋　３８ｈ、ｉ　Ｙ　９−および〜１１９５−　 ５５ＭＹＱ＋およびＭ１９５−１または　１９Ｍ￥９−およびＭ１９５　＋ 全体での一致　８３％ 過剰濃度の種々の免疫グロブリンの存在下における、ＨＬ６１１１：結合してい るヨウ素−１２５標３〜１１９５１ｇＧもしくはＦ　（Ａｂ）−２を用いた交叉 阻害実験を図２に示す。本来のＭｉ９５ＩｇＧの池に、Ｍ　Ｙ　９およびＬ４　 Ｆ３　ＣＣＤ３３反応性）の両者は、　Ｉ−Ｍ１９５の結合を阻止（７た。〜Ｉ Ｙ７　（ＣＤ＋３）　、Ｍ３］　（ＣＤ１５）および０ＫＢ７　（ＣＤ２＋）は 結合を阻害しなかった。これらのデータは、ＭＩ９５抗原とＣＤ３３抗原との関 係をさらに確実なものとした。（示されていない）他の実験においては、フロー サイトメトリーにより測定した際に、過剰の非標！Ｍ１９５が約５０％のＦＩＴ Ｃ−標識ＭＹ９の　。 ＨＬ６０細胞への結合を阻止することができた。 ｍＡｂ　Ｍ１９５　もまた、ｆＮ旧細胞来のＤＮＡが形質導入され、ＣＤ３３抗 原を発現するＮｌ−３７３細胞（１２＋）との反応性がＤｒ、Ｔ、ルック（Ｄｒ 、Ｔ、Ｌｏｏｋ　：　Ｓｔ、Ｊｕｄｅ、　Ｍｅｍｐｈｉｓ、ＴＮ）によって試験 された。Ｌ４　Ｆ３　（ＣＤ３３）およびＭＹ９（ＣＤ３３）の両者ともこれら の細胞に対して反応性である。 Ｍ１９５　も同様に反応性であった。この結果は、上に示した異なる一致データ と関連付けたときに、Ｍ１９５抗原はｐ６７（ＣＤ３３）に担持されているが、 Ｌ４　Ｆ３およびＭＹ９により認ユされる、従来開示されでいるＣＤ３３抗原エ ピトープとは異なるものであることを示唆している。 ＭＩ９５の診断上の有用性 ＭＹ９は、４へＮ　Ｌ　Ｌ　＋：対する標準マーカーであると広く見なきれてい る（Ｉ２２、Ｉ２３）。我々は、骨髄もしくはリンパのいずれかに由来する８１ 例の芽細胞性白血病に対するＭＹ９の診断上のａ用件を、Ｍ１９５のそれと、単 独もしくは共存のいずれかで比較した（表６）。ＡＮＬＬの８４％が〜１１９５ もしくはＭＹ９のいずれかを発現したが、各々の抗体単独では症例の１／４を越 える例を同定することができなかった。リンパ性の症例の中ではＭ　Ｙ　９もし くはＭ１９５のいずれかが時折発現したか、両者の抗体は１０だけ一緒に発現し たのみてあった。この場合、反応性は弱い・２８％ＭＹ９＋および４２％Ｍ１９ ５　＋である。このため、白血病試料に対してＭ１９５およびＩｖｌ　Ｙ　９の 両者が陽性であることは、その白血病のＡＮＬＬとしての定義付けにおいて９８ ％の特異性を有していた。 表６ 芽細胞性白血病におけるＭ１９５およびＭＹ９の診断上の有用性 指示マーカー（複数ンに対して陽性の例Ｍ１９５　ＭＹ９　Ｍ１９５と　Ｍ１９ ５と単独　単独　ＭＹ９　ＭＹ９ 骨髄性６１例に　６７％　７４％　６７％　８４％おける感受性１ リンパ性５１例に　８％　１２％　２％　２０％おける特異性０ １抗体（複数）は全ての例において陽性であるべきであるｂフローサイトメトリ ーによる陽性の例の割合０抗体（複数）は全ての例において陰性であるべきであ る造血性コロニー形成細胞上でのＭ１９５の発現白血病細胞上（ただし、成熟非 接着末梢血細胞でも、いかなる検出可能な非接着性骨髄細胞でもない（＋１８） 　）でのＭ１９５の発現は、Ｍ１９５が造血性始原細胞の小群で発現するかもし れないことを示唆した。骨髄単核細胞をＭ１９５およびウサギ補体で処理した後 の骨髄コロニーの回復を解析することにより、造血性始原細胞でのＭ１９５の発 現を調へた（表７）。 補体単独、抗体単独、および抗体もしくは補体処理なしのものを陰性対照として 用いた。ヒトＩ　Ａ抗原に対する抗体（Ｄｒ、Ｊ、　Ｄ、　グリフイン（ＤＴ、 　Ｊ、　Ｄ、　Ｇ＋１ｌｌｉｎ）の贈呈品）を陽性対照として用いた。回復した Ｃ　Ｆ　Ｕ　−Ｇ　Ｅ　Ｎ１ｈ１の数は、統Ｊｆ的に有意のデータを得るには不 十分であった。４例の実験のうちの３例において、Ｍ１９５および補体は、１４ 日ＣＦＵ−Ｇ　Ｍのほとんど全てを排除した。回復の平均は幾らか高く表７ 抗体および補体を用いた処理の後のコロニーの回復処理　下記コロニーの回復％ ７日間ＣＦＵ−ＧＭ　１４日間ＣＦＵ−ＧＭ　ＢＦυ−Ｅｂ Ｎｉｌ　１２４　１２６　（１３９，１０４，１０３（１４３，８３゜（Ｉｌｌ 、　１３６）　ＩＩｌ、　１１Ｏ）　１１５．７１　）〜１１９５単独　１０８ 　１２４　（１２６，１８１，１０７（１４１，１１４゜（９７，１２０）　Ｉ ｌｌ、　１１０）　９８．７４　）Ｍｕ独＋００ｅ１００　１００ Ｍ）９５および　６　（１０，ｌ）　１７　（ｆｌ、　６０．３．６）　３３　 （８，７７，６，４０）補体 抗−ＩＡ　（１（０，！ｔＤｄ）　ｌ（０，２，０，ＮＤ）　６（５，Ｉｌ、１ ．１ｌＤ）および補体 ０　「補体単独」処理を回復率１００％とし、表の他のデータを標準化した。 型面効率は０１０ないし０１５てあった。 初期造血性始原細胞上でのＭ１９５の発現の程度を決定するために、高度に精製 した芽細胞に対してラジオイムノアッセイを行なった。用いた細胞は、１２のモ ノクローナル抗体のツマネルおよびイムノロセ’７テイング（ｉａｍｕｎｏ＋ｏ ｕＮｉＢ　）もしくはパニングを用いる逆選択と、これに続いて凍結し、一旦も どすこと（２２）とにより単離した。これらの細胞は影響学的に芽細胞であり、 骨髄単核細胞よりも５０−１００倍純度の高い始原細胞の数を表わしている。こ れらの細胞の５ないし１２％は、典型的には骨髄性もしくは赤血球性コロニーを 形成する。 これらの正常な初期芽細胞の異なる試料３例の試験において、バックグランドを 越える１２５１−　Ｍ　１９５の結合は見出されなかった。少数の陽性細胞がこ の検定を用いる方法から逃れ得た。 これらのデータが、ＣＦＵ−０Ｍコロニーに反応し得る少数の骨髄細胞上にＭＩ ９５が発現することを示唆していたため、我々は、パニング、免疫磁性ビーズ分 離、親和性セファロースビーズ分離、および蛍光活性化細胞挿入を用いる陽性選 択によりこれらの細胞の同定を試みた。これらの方法はいずれも、Ｍ１９５−陽 性サブポビュレーノヨンを選び出さなかった。 これは、弱い抗原の発現、抗体親和性、または他の未知の問題によるものであろ う。 ヒト補体の存在下にお（＋る骨髄性始原細胞に対するＭ１９５の我々は、イン・ ビボにおけるＡＮＬＬの治療にＭ１９５が用いられることを期待していたので、 補体源としてのヒト血清の存在下における、正常な骨髄に由来するＣＦＵ−ＧＭ および５Ｆ　Ｕ　−Ｅに対するＭ１９５の効果を調べた（表８Ａ）。１４日１で は、ＣＦＵ−ＧＭもしくはＢＦＵ−Ｅの死は見られなかった。また、ブレーティ ングの１および５日後に、補体を添加することなく抗体をメチルセルロースに添 加することにより、骨髄培養物中にＭ１９５が連続的に存在することによる影響 も調べた。これらの実験は、抗体か、髄内の始原細胞に対する成長促進もしくは 抑制効果を存するかどうかを決定するために行なわれた。効果は見られなかった 。末梢血単球細胞およびＨＬ６０白血病細胞に対する同様な成長研究も陰性であ った。 表８Ａ ヒト補体の存在下における造血性幹細胞に対するＭｌ９５の効果ＣＦＵ−ＧＭ　 ＢＦＵ−Ｅ なし　＋＋６　（１００％）　＋５４　（１００％）補体（Ｃ′）単独　１ｏ２ ｃ　ｔｏｏ％）　＋２１　（１１１０％）Ｍ１９５　１３２　（１，１３％）　 ＋５４　（１０２％）Ｍ１９５　＋Ｃ−１４１（１３８％）　１２７　（１，０ ５％）表８Ｂ コロニー形成細胞に対するＭ１９５の連続圧力の効果ＣＦＵ−ＧＭ　ＢＦＵ−Ｅ Ｍ１９５　１３２　（１１３％）　＋５４（１吋％）３　：材料および方法」に おいてウサギ補体について記載のように、ヒト血清を最終希釈１／６て添加した 。 ｂクラドリプリケート（Ｑｕｉｄ＋１ｐｉｏ＋ｅ　）　・コントロール・プレー トの結果は１００°もに標準化Ｉ′己。 ：　７材料および方法」に記載のように、Ｍ１９５１ｇＧは増殖培地に直接添加 した。 論説 この実験は、新鮮な白血病細胞および初期造血性始原細胞に祠するｍＡｂ　Ｍ１ ９５の結合の分布を開示している。我々は、Ｍｉ９５抗原か骨髄単球白血病細胞 、および単球の分画には存在するが、骨髄もしくは末梢血に存在するより成熟し た骨髄細胞でも、非造血性細胞および組織でも検出不能であることを示した（　 ＋１８）。この実験においては、Ｍ１９５抗原の記述を拡大し、それを他の特徴 付けられた骨髄性および単球性抗原と直接比較した。２２７例の新鮮な造血性試 料の研究の　。 中でも、Ｍｌ、　９５抗原の発現は、分化ｌ、たＡＮＬＬに大きく限定された。 未分化で、Ｔｄｔ−陽性のＡＮＬＬは、抗原を示すことがより少ないようであっ た。しかしながら、ＦＡＢ分類は、ｋｉ１９５の発現とは特別な相互関係はなか った。 ラジオイムノアッセイによる定量分析では、ＡＮＬＬの細胞表面上で約１０．０ ００サイトが発現したことが示された。我々の研究（＋１．’）では、抗体結合 後にこれらのサイトが急速に変質することが示されている。 現在、数種の抗体が、フローサイトメトリーによるＡＮＬＬの診断に用いられて いる。これらのうち、ＣＤ３３抗体、ＭＹ９　（１４）　、およびＬ４　Ｆ３も しくはＬＩＢ２　（１３）か最も広く、かつ最も特異的にＡ、　Ｎ　Ｌ　Ｌに分 布しているように思われる。Ｍ１９５は、例の８３％において、ｈ、ｉ　Ｙ　９ と調和的に発現した。さらに、抗原が１００％のＡＮＬＬに発現することはない か、Ｍ１９５およびＭ　Ｙ　９の両名が白血病試料で発現するのであれば、Ｍ１ ９５およびＭＹ９の組み合わせは９８％の特異性をもってＡＮＬＬの診断に用い ることができる。現在、我々は、記念病院で、この組み合わせを急性白血病の診 断の補助に用いている。 Ｍ１９５およびＭＹ９の密接具発現（ｃｌｏｓｅ　ｅｏｕｐｎ＋＋１ｏｎ）は、 Ｍ１９５がＣＤ３３タンパク標的［ｐ６７］　（１２１）と結合する可能性があ ることを示唆した。Ｍ　１９５の標的を同定する努力は徒労に終わっている（　 １１！り。ここに示す阻止実験は、Ｍ１９５の標的とＣＤ３３タンパクとが恐ら く同一であろうことを示している。さらに、Ｍ１９５とＣＤ３３ＤＮＡ形質導入 体との結合が示された。これらのデータにもかかわらず、フローサイトメトリー のデータはＭＹ９との非同−的な調和を示しているので、Ｍ１９５はＭ　Ｙ　９ 　もしくはＬ４　Ｆ３と同じＣＤ３３エピトープには結合していないようである 。 ＦＡＢ分類Ｍ２、Ｍ　３、およびＭ４のＡＮＬＬ試料の方が他のタイプよりも高 い割合でＭ１９５抗原が見出されるのではあるが、Ｍ１９５の結合の存在を形態 学上の予想に用いることはできず、その逆も同様であった。免疫フェノタイプと 形態学的フェノタイプとを比較する他の研究も同様の結果になっている。これは 、各タイプのＡＮＬＬにマーカーの相当量のオーバーラツプが存在するためであ る（　１２３−１２５）。しかしながら、骨髄性ＡＮＬＬ由来の単球の区別が示 されている（１２３、］２６）。 ＣＤ３３抗原は初期骨髄性単球始原細胞に発現するが（１３，１４参考ａ、）、 最も根源的な始原細胞には発現しない（＋１９）。二の制限は、選択された状況 において、正常細胞の再増殖を認めつつ、骨髄由来のＡＮＬＬ細胞の選択的パー ジを可能にする（１２７、実験５をづ照）。予期されるように、Ｍ１９５はＣＦ Ｕ−ＧＭで、およびより少ない程度ではあるがＢＦＵ−Ｅで発現する。ＭＹ９お よびＬ４　Ｆ３と同様に、Ｍ１９５はウサギ補体と一緒に容易に細胞を殺すので 、ＡＮＬＬにおいてパージング剤として有用である。 Ｍ１９５を用いる、高度に精製した初期芽細胞に対するラジオイムノアッセイは 、重要な抗原発現は検出しない。ラジオイムノアッセイが、その細胞群内にある 小さいサブボピュレーンヨンでのＭ１９５の発現を見落とす可能性があるので、 この発見をさらに明確かつ確実にするために、長期間の髄培養を行なった（実験 ５を参照）。ここでのデータおよび実験１のデータに基づくと、造血性分化にお けるＭ］９５抗原の分布は他のＣＤ３３抗原に対して開示されたもの（１３，１ ４）に類似しているように思われる。これには、初期抗原感作骨髄性始原細胞は 含まれるが、最も初めのコロニー形成細胞は含まれない（実験５を参照）（１７ ，１８参考ａ、）。 Ｍ１９５抗原は、成人ヒト組織では発現しない。したがって、ＡＮＬＬの診断用 マーカーおよびパージング剤としての用途に加えて、Ｍ１９５はイン・ビボにお ける治療剤として潜在的に使用し得る。この抗体は、単独でもしくは補体源とし てのヒト血清の存在下において、イン・ビトロ細胞毒性効果を有していないので 、ＡＮＬＬ細胞の溶解を起こすことはないように思われる。しかしながら、ｍＡ ｂ　〜１１９５か結合する際に、この抗体は急速に内在化される（実験３）。そ のため、イン・ビボにおけるＡＮＬＬ細胞への毒もしくは放射性同位体の担体と してのｍＡｂ　ＭＩ９５の利用が可能である。 実験３ この実験では、放射性核種の癌細胞への配薬に際し、モジュレーション、並びに ｍＡｂ内在化および放出の影響に注目する。２種の原型放射性核種、即ち放射性 ヨウ素およびう放射性インジウムが、一般にフェーズＩ医学的トライアルのメモ リアルースローンケタリング癌センターでの評価においてｍＡｂに付着するとき の挙動を調査した。ヨウ素−１２５は、１２５　１２３　ＤＩ　１．２１１Ａ０ 、および１２４□。ようＢｒ、　Ｉ、 な全での！・ロゲン化物に対する原型として有用である。　１１１１は、・Ｂ１ 、２１２Ｐｂ、９０Ｙ、　１８６Ｒｈ、およびｌ８８Ｒ２１り ｈのような全ての放射性金属に対する原型として有用である。 前記ｍＡｂは、抗原との相互作用に続いてモジュレ−１・する。 Ｍａｂ　Ｍ１９５は、殆どの骨髄性白血病細胞（１２８，１２９）に見られる６ ７ＫＤ細胞−表面グリコプロティンと反応性があり、また、エブシニテインバー ビールス（ＥＢＶ）、即ち殆どのＢ　−細胞および慢性のリンパ性白血病（１３ ０゜１３１）に示される１４０ＫＤグリコプロティン表面レセプターと反応性が ある。更に、抗体の蛋白の分解性消化フラグメントの挙動についても調べた。 く材料および方法〉 細胞 ＨＬ６０、骨髄性白血病細胞株を、５％二酸化炭素内、３７℃で１０％ＦＣ５お よび１０％１−グルタミンを用いて補充されたＲＰＭ１１６４０中の対数増殖内 で培養させた。 生存能（トリパンブルー排除によって評価）が９５％以上である細胞のみを使用 した。 抗体 Ｍ１９５は、殆どの骨髄性白血病細胞（１２８，１２９゜参考文献Ｃ）に見られ る６７ＫＤ細胞−表面グリコプロティンと反応する、ＩｇＧ２ａモノクローナル 抗体である。この抗体を、プロティンＡアソフィニティクロマトグラフィを用い て、ネズミの腹水から精製した。Ｍ１９５　Ｆ（ａｂ−）、を、無傷の免疫グロ ブリンのベブンン消化によって調製した。０ＫＢ７　Ｆａｂをパパイン消化によ って調製した。 放射性ヨウ化処理 無傷の抗体およびそのフラグメントを、クロラミン−Ｔ法（１３２）によりヨウ 素−１２５を用いてラベル３付与した。　Ｉ　２ｍＣｉおよび新たに調製された 濃度２　ｍ　ｇ　／　ｍＩのクロラミン−■の溶液２０μｍを用い、０．２Ｍリ ン酸塩中において、ｐＨ７，４，１分間、室温の条件で、抗体１００μｇをイン キュベートした。この反応系を、新たに調製された濃度２０ｍｇ／ｍｌのメタ重 亜硫酸ナトリウム−Ｔの溶液２０μｌを用いてクエンチし、５分間インキュベー トした。この放射性ラベルが付与された抗体を、エクスクル−ジョンクロマトグ ラフィ　（サファデノクス　Ｇ２５．ファーマシア社製、ビスキャタワエイ、Ｎ Ｊ）を用いて精製した。更に、ｐＨ７，４のリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に おいて、４″で放射性ラベルか付与されたｍＡｂを透析することにより、遊離放 射性核種からｍＡｂを精製した。 ラベル付与された抗体の免疫反応性（抗原と結合し得る処方中の抗体分子の比率 ）を、上述した方法（１，３２，１３３）の変更によって、以下の通り測定した ：４℃における生存能が少なくとも９５％である１０７細胞を、放射性ラベル付 与された抗体５ｎｇを用いて６０分間インキュベートした。結合した成分の比率 で評価した・遠心沈殿後に得られた上澄み液を同様の細胞の組に転換し、結合ま で繰り返されるプロセスを、比較細胞株を用いた場合より少ない回数で行った。 Ｍ１９５の場合、免疫反応性は６５％未満であった。 参考文献１３４に記載された方法で、無傷の免疫グロブリンをジエチレントリア ミン五酢酸（ＤＴＰＡ）に接合させた。接合後、室温、６０分間のｐＨ３，０に おけるＩｌｌ　Ｉｎを用いたインキュベーションを行うことによって、各抗体を １１１１ｎでラベリングした。この反応系を、０．２Ｍメタルフリーのリン酸塩 緩衝液（ｐＨ７，４）を用いてｐＨを６゜５まで増大させることにより、クエン チした。この放射性ラベルが付与されたｍＡｂを、チェレックス（（ｈｓｌｅｘ ）金属結合カラムを用い、続いてサイズエクスクルージミンクロマグラフィによ り精製した。更に、ｐＨ７，４のメタルフリーＰＢＳ中において、４ａで放射性 ラベルが付与されたｍＡｂを透析することにより、ｍＡｂから遊ｇｌＩｌｌ、、 を除去した。 ラベル付与された抗体の免疫反応性を、夫々の放射性ヨウ素処理された抗体の免 疫反応性と比較した。 放射性核種の内在化 媒質５ｍｌ中において、５百万個の生存可能な細胞を、放射性ラベルか付与され た抗体５μｇを用いて４℃または３７″でインキュベートした。放射性ラベルか 付与されたｍＡｂ（またはフラグメント）を添加した直後、数回に亘って、細胞 の各ハツチよりアリクラｆ　ント２００μｌを取出し、３回洗浄した。グリシン ／塩化ナトリウム１．５ｍｌ　（５０ｍＭグリン：／／ＨＣＩ、１５０ｍＭ塩化 ナトリウム、ｐ　Ｈ２，８）を各ベレットに添加した。“全体的な”細胞に結合 した放射能を、混合後ガンマカウンターにより測定した。次に、これら細胞を遠 心分離し、上澄み液を吸引して、細胞ベレットを再計算し“内在化した″放射能 を決定した。”細胞表面の“放射能を、全体的な放射能および内在化した放射能 の差として算出した。この一般的な方法は、他の細胞表面レセプタの内在化を研 究するために用いられてきたものである（７２−７４）。我々は、この直接的な 方法は、間接的な方法（放射免疫測定および補体結合）と同じく、抗体の表面か ら現れるロスを正確に測定することを確認した。上澄み液中でプロティンに結合 した放射性ヨウ素の比率を、この上澄み液のＴＣＡ沈殿反応によって評価したと ころ、９５％を下回ることはなかった。同様にして、プロティンが結合した放射 性ヨウ素を、選択された上澄み液のアリクワオツド中で、希薄層クロマトグラフ ィにより評価したところ、常に９０％を超えた。 放射性核種の放出 媒１５ｍ１中において、５百万個の生存可能な細胞を、放射性ラベルが付与され た抗体５μｇを用いて４℃で６０分間インキュベートした。次に、このインキュ ベートされた細胞を媒質中で２回洗浄し、同し容積中に再分散させた。基準とな る全体的なおよび内在化した放射能を、上述したように決定した。洗浄直後、洗 浄された細胞を２部に分け、４″または３７″のいずれかに保った。次いで、全 体的な細胞に結合した放射能および内在化した放射能を、上述したように期間中 に亘って決定した。 く結果〉 全ての実験を２ないし６度行い、全てのポイントを重複して行った。２回の測定 の平均を記録した。〜１１９５の結合の極大値は、細胞当り約１００００箇所で あった。 内在化の実験は、周囲に抗体が過剰に存在する場合において、即ち抗体が患者に 対し注入される間に生ずる条件下において、結合および細胞に結合した放射能の 動態の変化の研究を意図するものである。放出の実験は、結合期間の後、ｍＡｂ 注入の終了に従うインビボの条件を模倣する周囲抗体の存在下において、同様の 現象を研究することを意図する。 ４°では、　１２５■の最小限の内在化と共に細胞に関連した放射能の総量が増 加した（図１ａ）。結合した１２５Ｉは、約４倍増加して、２時間プラトーシ、 この期間内で結合の競合および部位の飽和を示した。３７°では、４°における 場合と同様に、細胞に結合した放射能の全てが増加した。反対に、期間中の内在 化した放射能の量は、最初の２時間で示されたほとんどの増加につれて、かなり 増大した。２時間後、内在化した放射能は、開始時に比べて１２倍に増加した。 Ｍ１９５１ｇＧ（図９ｃ、ｄ）に対する放出の実験では、４°における期間中の 細胞に関連した放射能の際たった変化は示されなかった。細胞表面および内部の 放射能の童は、期間中変わらなかった。３７″では、細胞に結合した放射能の約 ４０％が最初に急速に請出した。請出した放射能は、細胞表面からの網目の損失 により説明できるものである。これが、直接的になされるものか、内在化の工程 を経るものがは、これらのデータから決定された。経時により内在化した放射能 は増加した。細胞表面からの放射能の請出は、最初の１時間で起こり、その後、 細胞に結合した放射能の総量か、内在化した放射能の量は増加し、実験の終了時 に至るにつれて増加か停滞した。 細胞に結合された放射能の内在化されたパーセントは、４℃における細胞では一 定であった（図８ｂ、ｄ）。３７℃において、内在化された放射能のパーセント は、過剰の抗体の存在下では細胞に結合した全放射能の３５％に近付き、周囲抗 体の非存在下では６０％にまで近付いた。 周囲抗体の存在下においては、内在化された放射能パーセントの増大に寄与する 細胞内での増加量を伴った、細胞に結合した放射能の正味のロスは見られなかっ た。対照的に、周囲抗体の非存在下においては（図８ｃ、ｄ）、細胞に結合した 全放射能の正味のロスがあり、これは細胞表面から周囲媒質および細胞内部への 放射能の移行を示す。これは、内在化に引き続く表面に結合した放射能の媒質中 への放出、または独立した直接的な放出のために起こったものであろう。内在化 されたパーセント放射能の増大に翻訳されたこの正味のロスは、内在化された放 射能カントの増大のみから明らかなそれよりも大きい。この正味の結果は２時間 後のそれであり、ＨＬ６１］に結合した放射能の半分以上が細胞内である。 ユ旦１ｎ−Ｍ１９５の内在化および放出（図９ａ−ｄ）１１１１　ｎ　−ＭＩ９ ５を用い、上記のようにして追加の実験が行われた。４℃（図２ａ）に比較して 、３７℃においては、内在化放射能に大きな経時的減少か起きた。パーセンテー ジでの　Ｉｎの内在化は一貫して＋２５１よりも高く、４時間を越えても高原値 を示さずに時間と共に増大し、幾つかの実験では略７０％に達した。これは、お そらく部分的には、キレート化されたＩＩＩ、ｎが表面に結合されたＩｇＧがら 脱落することにより、３７℃での全ｌｌｌＩｎに大きなロス（６０％）を生じた ことに起因するものかもしれない。ここにおいて、１１１１ｎ−○ＫＢ７実験と 同様、おそらくは細胞部分に対するＩｌｌ　Ｉｎのトランスキレーンヨンに起因 して、内在化のバックグラウンドパーセントは１２５Ｉｎでラベルされた抗体の 場合よりも著しく大きかった。 まとめると、細胞が代謝的に活動していないと思われる４℃においては、細胞上 または細胞内の何れであろうと、周囲の抗体か存在しようと存在しまいと、細胞 に結合した放射能に大きな経時変化はなかった。対照的に、細胞が代謝的に活性 である７℃においては、細胞に結合した放射能は、経時的に激しく変化した。 １２５１−　ＭＩ９５　Ｆ　ｔａｂ’１２の内在化および完全なＩｇで観察され た知見とは対照的に、Ｆ　ｔａｂ″）２では、細胞に結合した全放射能の初期増 大は、時間と共に温和に減少した。しかし、内在化された放射能は３７°Ｃにお いて時間と共に徐々に増大する一方、４℃では比較的一定であった。バックグラ ウンド（時間０）の放射能は、Ｆ　（ａｂ′）２について一貫して高かった。該 フラグメントについての内在化された放射能の増大は、完全なＩｇについてのよ うには経時的に大きくなかった（Ｉｇについて６％〜３２％に比較して、該フラ グメントについては２６％〜３７％）。 周囲抗体の非存在下では、３７℃において、細胞に結合した全放射能に迅速な経 時的増大が生じた；これには、例え僅かではあっても、細胞内の全放射能におけ る有意な減少が伴われた。従って、３７℃において、内在化パーセントは完全な Ｉｇはどには経時的に増大しなかった。 ラベルされたＩｇ及びフラグメントの特異的活性におけるの相違、並びに異なっ た組の実験での二つの放射性各種の計量効率における相違（個々の実験において 全て経時的に変化する）は、時間０での条件に関係しており、我々が実験を比較 することを可能にする（表Ｉ）。時間（ｎ）での放射能力ウノトは、時間０での 放射能カウントに対するパーセント（Ｃｐｍ、、、　／　Ｃｐｍｌ−１）　Ｘ　 １０口）として表現された。幾つかの結論は明白である。 Ｍ１９５１ｇ、即ち、周囲の過剰の抗体の存在下で迅速に内在化（内在化実験） する抗体については、内在化された放射性インジウム量における変化の間で、内 在化された放射性ヨウ素の量における変化と比較して顕著な相違はなかった（１ １３０％ＶＩ　１３００％）。対照的に、周囲抗体の非存在下において、細胞か らの放射性ヨウ素のパーセント・ロス（放出実験）は、１１１Ｉｎのロス量より も顕著に少なかった。内在化されたパーセントにおける相対的な増加は、主に、 細胞に結合した放射能のロスが大きかった結果である。当該フラグメントに付Ｉ Ｉ 着された放射性ヨウ素は、　Ｉｎの場合よりも速くクリアされた。 く考察〉 画像化診断または放射免疫治療のだめの、放射能を結合したモノクローナル抗体 を用いた臨床試験の数が増加するに伴って、抗体結合および核種内在化の速度論 を理解することの必要性が益々重要になってきている。放射性ヨウ素でラベルさ れた抗体の場合と比較した１ｌｌｌｎでラベルされた抗体の結合における顕著な 差が、インビトロ及びインビボで示されている（６６〜６９）。ここでの実験は 、細胞レベルでのこれらの相違の幾つかを記述しようと試みたものである。我々 は、放射性核種の標的腫瘍細胞内への内在化が、完全な免疫グロブリン又はフラ グメントの何れの場合にも、放射性核種の選択、関係する抗原−抗体系、及び使 用する抗体の性質に依存することを示した。 最近、プレス等（７２）は、Ｂ細胞腫瘍に反応する放射性ヨウ素化された抗体パ ネルにおける、結合及び分解の特徴を比較した。我々もここで確認したように、 ｍＡｂｓの間には、内在化の速度論における明確な相違が見出だされた。加えて 、我々は、二つの異なったプロトタイプの放射性核種（１２５１及びＩｌｌ、、 ）でラベルされたときの、完全なｍＡｂｓ及びフラグメント化されたｍＡｂｓの 挙動を研究した。我々が研究した初期の時点においては、放射性核種のｍＡｂが らの顕著な脱落は見られなかった。これは、プレス及び彼の仲間が観察した結果 と同様である。２〜４時間のうちに定常状態か達成されたので、我々は、それよ り後の時点での挙動を試験しなかった。 過剰の周囲の抗体の存在において、標的抗原との相互作用に引き続いて、Ｍ１９ ５ｉｇは迅速に細胞に内在化された。二つの核種について、結合速度論に相違は なかった（表Ｉ）。 Ｆｔｇｏ’）２については、全放射能およっぴ内在化された放射能に最小限の変 化があった。周囲のＭ］９５１ｇまたはＦｆａｂ’）２か洗い流された後では、 　１２５■でラベルされたＩｇに比較して、　１１１ｎ−ラベルされたＩｇの大 きなロスがあった。また、Ｆ（ａｂ’）２については、Ｉｇの場合よりも非常に 大きな内在化があった。これらの相違が、結合活性における小さな相違（Ｆ（ｘ ｂ’）：では１０９Ｌ／Ｍに対して、完全なｆでは３×１０′Ｌ／Ｍ）を反映す るものであるか否かは分からない。 迅速に内在化されるｍＡｂにラベルされた放射性核種の内在化および放出の速度 論は、使用された放射性核種の性質に依存しなかった。完全なＭ１９５■ｇに結 合された放射性核種は、該抗体のフラグメントに結合されたときよりも遥かに大 きな内在化を示した。Ｆａｂフラグメントに関する研究によって、モジュレーシ ョン及び内在化の欠如は、過剰の周囲抗体の非存在化においてより明白であるこ とが示唆された。 Ｍ１９５を用いた（診断的または治療的の何れでも）臨床試験において、顕著に 多量の放射能が内在化されるから、完全な〜１１９５１ｇはフラグメントよりも 好ましいであろう。完全な免疫グロブリンのＫ　（３Ｘ１０９Ｌ／Ｍ）に比較し て、Ｆ（ａｂＭ２のに、は１０　Ｌ／Ｍである；解離定数１ニオｌｔル：と小さ な相違、又はＦ（ａｂ’）２創製の結果として生じた抗体結合における幾つかの 他の未知の変化によって、内在化に相違が生じるか否かは分からない。周囲ｍＡ ｂの非存在下において、細胞からの１１１１ｎのクリアランスは大きかったが、 内在化された量も有意に大量であった。使用された放射性核種がＩｌｌ、、であ るとき、周ｉｍＡｂの非存在下では、細胞に結合した放射能の大きなロスがある から、使用されるべき理想的な放射能ラベルは、放射性核種の物理的半減期およ びホスト中での抗体の生物学的半減期に依存して、ヨウ素の適切なアイソトープ または放射性金属の何れかであろう。 結合、内在化および放出の速度論は重要であるが、臨床治療試験のための核種の 選択もまた、ラベリング特性および血清クリアランスによって影響されると同様 、考慮されている放射性核種の物理的半減期、放射特性および細胞障害能力によ って影響されるであろう。ヨウ素ラベルされた抗体の脱ハロゲン化が記述されて いるか（６９）、現在のキレート化の方法もまた、インビボにおける抗体からの 放射性金嘱の脱落をもたらし、また今日までヒト試験は等しく成功していない。 新しいキレート化学における進歩によって、これら問題は解決されるであろう。 更に、もし電子捕獲で崩壊する放射性核種が、細胞中に内在化されたときに、ベ エタ・マイナス崩壊を生じるものよりも細胞障害性であれば、　■及び　Ｙは治 療目的のための放射性核種の候補となろう。ｗｏｏ等によ１２５゜ る最近の報告は、ラベルされない抗体に比較して、　■でラベルされた抗体か顕 著に細胞障害性であることを示し、これは核内１２５Ｉの細胞障害性に起因する ものと仮定している。 我々はまた、増大量のレセプタを発現する細胞内のＤＩ　、でラベルされた又は ラベルされない抗体に比較して、　Ｉでラベルされた抗表皮増殖因子レセプター 抗体の顕著に増大した増殖抑制を観察した。我々はいま、ヨウ素でラベルされた Ｍ１９５のインビトロでの細胞障害性を研究している。 まとめると、放射性核種および抗体の形を選択することは、放射性核種の内在化 の速度論および標的細胞内での保持に対して大きなインパクトを有しており、従 って、放射能ラベルされた抗体を用いる臨床試験の計画においては極めて重要で ある。ここに記載したような細胞結合および内在化の前臨床的研究は、画像化ま たは治療のための最適なアプローチを補助するであろう。 実験４　モノクローナル抗体ＭＩ９５の急性ｆ軸性白血病についてのフェーズＩ 試験。 く材料及び方法〉 Ｍ１９５．　ｍＡｂ　１９５の分離及び特徴付けが報告されている（８８゜８． ９．９＋、　１３６）。臨床級のＭＩ９５の精製は、本質的に上述ｔ１３７＋の ようにして、［Ｒｉｔの認可のもとにソランーケッターリングインスティチュー トｆｓｌｏｘｎ−Ｋｅｔｔｒ＋ｉＢ　ｌ１１ｓｔｉｔｕｔｅ）で行われた。最終 的な生成物を、マウスウィルス、エンドトキシン、パイロジエン、細菌若しくは 真菌汚染、マイコプラズマ及びＤＮＡの存在下で試験した。通常の安全試験を、 マウス及びモルモットについて行った。純度は、鍛着色ポリアクリルアミドケル および陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーにより検定した。 放射線種３．　Ｍ１９５１．５ｍｇを、クロラミン−Ｔ　（１３８＋および無菌 無パイロジエン技術を用いてヨウ素−１３１にュー　イングランド　ナラフラー ）約５ｍＣ１で標識した。純粋な抗体を排除クロマトグラフィーで分離し、臨床 で使用する前におよび０．４５μｍフィルターで濾過した。 品質管理、　１３．　Ｉ−Ｍ１９５を次に掲げる事項について試験した：特異的 活性、トリクロロ酢酸沈殿性！３１　’タンパク質、高性能薄層クロマトグラフ ィーによるヨウ素−１３１なしのタンパク質、高速液体クロマトグラフィーによ る生化学的不純物、およびＨＬ６Ｑ骨髄性白血病細胞についての免疫活性。注射 する量は、９８％フリーの１３１１よりも多く、過剰の抗原中での一段階結合検 定（ｏｎｅ　ｔｔ！ｐ　ｂｉａｄｉＢ　ａｓｓＢ　）において約６０％の免疫活 性を示した。 試験設Ｘｔ　白血病性芽細胞がフローサイトメトリーによりＣＤ３３抗体を発現 するならば、１８歳よりも上でありかつ再発したか若しくは難治性のＡＭＬ　、 促進されたか若しくは芽細胞性の慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）　、または慢性骨 髄性単球細胞性白血病（Ｃｉｉ！ＭＯＬ）を有する全てのも者が望ましい。初期 の白血球若しくは血小板の計数、または静脈内の抗体の併用は制限されない。全 ての化学療法または放射線療法はＭ１９５開始的４週間中止した。水酸化尿素に より、１１１９５開始前３日までに末梢血球計数を調節した。 患者は、ルゴール液およびアロプリノールで前治療した。 全ての４つの異なる１日投与量を４〜６日間にわたって投与した。最小限、三人 の患者を、２０分間の点滴により夫々の投与濃度（１ｍｇ、／ｍ”、５Ｂ／ｍ２ および１０ｍｇ／ｍ−；夫々４回投与）で治療した。夫々の患者におけるＭ１９ ５の１番目の投与を、上述の１３１１で標識・追跡した。毎日、物理的試験、全 血球計数、凝固指数、生化学的な値および電解質の値を測定した。 薬理学的、線量的および放射線局在化データは、以下のように得られた。毒性は 、国際癌癌学会　［）ＩｃＩ）により制定された通常の基準に従って検定した。 本試験は、全ての参加した患者による通知した同意が得られた後にインシニティ チューショナル　レビュー　ボート（ｌｈ＋ｔｉｌｕｌｉｏｎａｌ　Ｒｓｖｉ＋ ｖ　Ｂｏａ＋ａ）の認可の下で行われた。 薬理および線量Ｍｌ定　ヘパリンを添加した血液試料を、１番目ノ！ｊ１９５ヲ 、点７１１ｉ　Ｌ、　７５．　］　０．　Ｉ　５．３０．４５．６０．１２０． ２４０．４８０分後に採取し、さらに５日間毎日２回採取した。全ての血液およ び血漿を、　１３１．及び定量について別々に分析し、二次指数崩壊曲線をＢＬ Ｄソフトウェア（デパートメント　オブ　ナンクラーメディスン（Ｄ＋ｐａｒ＋ ｍｅｏｌ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅａ＋　Ｍｅｄｉｃｉｎｅｌ、ＮＩＢ）を用いて描い た。トリクロロ酢酸沈殿性１３１１およびｌ”　ＬＪ１９５のＨＬ−６０細胞と の免疫活性を、同様の血清の選択がされた試料について測定した。　Ｉの累積尿 排泄も、選択された患者について同様にル一定した。骨髄のバイオブシイーおよ び吸引液は、点滴後１時間および２〜３日で得た。骨髄単核細胞から分離された 骨髄芯部１ｇ及びフィコール−パーク（Ｐｈｕｍｉｃｉａ、　Ｐｉｓｃｉｊｘｗ ａｙ、　Ｍｌ）　ｌＧ　あたりの１３１１を測定した。末梢血液芽細胞を高濃度 で有する患者において、分離された単核細胞に結合した１３１１を同様に測定し た。骨髄または血液単核細胞の標識された細胞とのスピン（ｉｔａｉｎｃｄ　（ ７１０＋ｐｉｏ＋）または塗抹を行って、白血病との関係の割合を評価した。　 全身の前後のガンマ線カメラ画像を、テクニゲア　ジ上ミニ１１　（ジｘｊｆ− ラルエレクトリック（Ｇｅｎｅ＋ａｌ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ！、マノソンｔＭａｄ ｉ＋ｏｎ）　、　ｆｉｌ　を用いて得た。重要な領域ｆｌｌｏｌ＋は、ミラージ ソフト（Ｍｉｒ弓ｅ　Ｓｏ自ｗ！ｎ’＋　（デパートメントオブ　ナラフラー　 メディスン、ＮＩｌりを使用するＣｐｌＯの測定のためにコンピューター画像に 描いた。全ての人体の放射線活性を、同様に３つのメーターで決定した。−次指 数１３１１崩壊曲線を、全身、骨髄、および重要な機関について得られたデータ からＢＬＩ）ソフトウェアを用いて描いた。白血病の芽細胞の”Ｉ−Ｍ１９５の 吸収および放出は、試験官内および生体外において、期間中、以下のように行わ れた０３６）。 標ユされていない１ｌ１９５の血清中濃度は、期間中、サンドイッチ固相酵素免 疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて同様に測定した。 吸光度を、間者の治療前の血清に希釈した精製Ｍ１９５を標準として用いてタン パク質濃度に変換した。 血漿および全身の放射線測定、　血漿フレアランスデータを積分して、ＭＩＲＤ −５囚子（１３９＋を使用して投与したＤＣ１辺りの非血漿浸透性投与量（単位 ラド）を決定するために使用した。全血漿投与量を、全身投与量に非血漿浸透性 投与量を加えることにより決定した。有効な全身クリアランス（前述）を同様に ＭＩＲＤ−５因子と併用して、ｌ及び１２３１で標識し１３ま たＭｆ９５ついての全身投与量を計算した。これらの評価を、ｇ−因子（１４０ １を計算するための身長および体重を用いて個々の測定と比較し、結果は両方と も良好に一致した。肝投与量を、期間中、ミラージュソフトンステムにおいて５ １２Ｘ５１２モードで補足したガンマ線カメラスキャンデータについてに０１を 分析する二とにより測定した。有効なりリアランス時間を、上述のＢＬＤを用い て測定し１、累積投与量をＳ−因子方法（＋３９）を用いて計算した。 注入したｌｌＩＣ１に対する標的細胞核中に沈殿したｋｅＶの値を、カシスらｉ ｌ　４　ｔ）の仮説および手順を使用して測定した。ｌ−１２３およびｌ−１３ １のだめの崩壊計画値（ｄｅｃＢ　＋ｃｈｓ＋ａｓ　ｖａｌｕｅｉ）はブラウン およびファイヤストーンｆ１４２）から引用した。細胞中に取り込まれた放射線 活性は、細胞質の内部に均一に分布していると仮定した。核に沈殿した１崩壊あ たりのｋｅＶを、３ｔ）Ｉ−し、１および１３１．の崩壊を、夫々、〕崩壊あた り０、５３ｋｅＶおよび１崩壊あたり０．５４ｋｅＶに決定した。細胞の表面ま たは外側からの投与量は３ｆ算しなかった。 ＨＡＭＡ、血漿試料を、ＨＡＭＡについて、点滴終了後８〜ＩＯ日に開始して３ 〜４週間、毎週、本質的に前述したＥＬＩＳＡ（１５）を用いて試験した。 フローサイトメトリー、　末梢血液および骨髄細胞を、１時間前およびＭＩ９５ による治療後２４時間で、Ｍ１９５抗体の発現およびその他の骨髄細胞表面の標 識について、エビマウスプロフィール　フローサイトメタ−（ＥＰＩＣ５Ｐｒｏ ｆｉｌｅ　）ｌａｙ　ｃｙＩｏ−ｍｅｔｅｒ）　（８９）を用いて試験した。ヤ ギ抗マウスＩｇ−フルオレセイン　イノチオンアネート結合体を、−次抗体なし で同様に使用して、生体内で細胞に結合したＭ１９５を調べた。ＭＹ４　（ＣＤ １４）、　ＭＹ９　＋ＣＤ３３）および＋２（ＢＬ＾−ＤＲ）モノクローナル抗 体を、コールタ−［Ｅｉａｌｅｇｈ、　Ｆｌ）から獲得した。 参照）を示したＮＯ，４の患者と、Ｎ０１５の患者は、盲腸炎および急性腹症の ために、４回の服用を行わず、追加の患者は、この濃度での安全性を確認するた めの５／ｒａｇ／ｖｌｌ“で追加した。 薬理、　薬物速度は、１番目のＭｌ９５の標識・追跡投与および血漿中のマウス ｍＡｂについてのＥＬＩＳＡ分析に基づいた。 全血漿放射線活性がトリクロロ酢酸沈殿性血漿放射線活性に極めて近いために、 フォーマ−（ＩｃＩｍｃｉだけを使用した。選択した患者の血漿の試料について の”Ｉ−Ｍ１９５の分析は、点滴後２日までは血清中に残っているＭ１９５の免 疫活性が著しくは失われないことを示した。すなわち、半減期の計算は、直９５ の生化学的活性の挙動を反映するであろう。 −回のＭ１９５の投与量は、１．５Ｂ　〜１９ｍｇ　（１〜ｌｈｇ／ｍ２）の範 囲内であり、全投与量は、６〜７６ｍｇである（表２）。二相速度（ｔｗｏ−ｐ ｈａｓ＋　ｋｉｎｅｔｉｃ＋）を二人の患者以外の全員について調へた。　５０ ％血漿Ｔ１／２アルフアの中央値は１３時間であり、血漿Ｔ　Ｉ／２ベータの中 央値は５２時間であり；全身半減期の中央値はは５３時間であった。薬物速度は 、投与量と関連がなかった。一つの例外として、患者のサイズに合わせて調節さ れる分配初期値（Ｖｄ）は、期待した血液値よりも極めて大きく、標準状聾での Ｖｄ／コ“は、５）Ｌ（中間値）であった。生体内における標的細胞への標議さ れたＭ１９５の吸収が、初期Ｖｄが血液値および標準のＶｄよりも３倍大きい（ ２５Ｌ）　１番目の患者で明確に観察された。この患者では、他の患者と同様に 、腫瘍ＩＫｇあたりＭ］９５約１ｍｇを注射し、Ｍ１９５１ｇＧの投与量は、推 定された腫瘍ｆｆｉ量１ｋｇあたりＭ１９５１０ｇを超過した（表２）。 １７１９５１ｇＧの血漿濃度を、治療期間中、−日２回採取した試料を用いて同 様にＭ１定した。３番目または４番目の投与後の到達ｌ−だ最高１．１１９５濃 度（表２）、および、２番目の投与の直前に到達した最低濃度は、投与量と関連 があった。しかしながら、最低投与濃度での血清ｈ！＋９５ｉｆｉ度が、血漿中 への投与量の単純な分配による予想された濃度よりも低く、血漿外および飽和し た細胞へのＭ１９５の連続的な移動か起こる二とが再び提案された。この最初の 投与濃度では、たぶん、最初のＭ１９５２〜３ωｇの注射によって結合部位が飽 和するためのにこの効果は見られなかった。 生作　患者Ｎｏ、　Ｉは、点滴の間、一時的な刺激性の少ないかゆみについて不 平を言った；じんま疹は見られなかった。 他の９人の患者では、点滴の間、投与量が最高で１５倍の場合でさえ、その他の 症状はなかった。患者Ｎｏ、４は、Ｍ１９５の３番目の投与を開始した後に、猛 烈な骨の痛みおよび、胸骨、腎孟、頭蓋、長骨の虚弱を訴え始めた。これらの部 位の全ては、　”ｌ−１１１９５の取り込みがスキャンにより証明された（以下 参照）。この痛みは、最後の点ａ後３日間続き、痛みを抑制するために麻酔薬の 静脈注射が必要であった。患者Ｎｏ、　８は、白血病の耳下腺の骨髄外性史部を 残した。彼女は、猛烈な痛みを訴え、２日後に痛みが増大した（Ｍｌ勅累積投与 ｔ３６ａ＋ｇ）。 この腺へのＭ１９５の取込みの特徴は、スキャンにより同様に認められた。その 他の短期または長期の毒性または効果は、いずれの他の患者でも認められなかっ た。 生化学的効果、　白血病細胞を高濃度で有する二人の患者において、治療開始時 、Ｍ１９５の点滴に帰する末梢血骨芽細胞の一過性（１８時間未満）の下落が観 察された。末梢血骨芽細胞数または迩髄芽細胞数の変化の飽和または差異は観察 されなかった。Ｍ１９５の点滴に関連する、血小板、ヘモグロビン濃度、化学的 性質または電解質の著しい変化はなかった。 フィブリノーゲン、パーシャルトロンボプラスチンタイム（ＰＴ丁）およびプロ トロンビンタイムｆｌ’Ｔ）を全てのを者について追跡した。ＡＦＬによって、 患者ＮＧ、４では、Ｉｄｌあたり９９から１４４ｍｇへのフィブリノーゲンの正 常化が、Ｍ１９５冶療と同時に起こった。その他の患者９人のうち７人は、Ｍ１ ９５冶療１こおいてフィブリノーゲン濃度の増加（３０％から６０％への増加） を同様に示した。 研究された患者における腫瘍反応はなかった。患者Ｎｏ、　ｌおよび４は、ｖ１ ９５の投与を中止した直後に水酸化尿素による再治療が２要であり、患者Ｎｏ、 　８は、芽則胞が急激に段階的に増加したためＭ１９５を２回投与した後に水酸 化尿素による治療を再開しなければならなかった。 放射線局在化、前側または後側全身画像は、全てのを者に置ける骨髄の全域への 標識された１３’１−Ｍ１９５の取込みを証明した（図＋２．１３１）。頭蓋、 胸骨、肋骨、を椎、腎孟および長骨の上下両極端には、点滴後２〜４時間以内で 取り込みか開始し、４８時間までにほとんどの患者で終了したことが明確に認め られた。時間が立つにつれて骨髄からアイソトープが徐々に失われるために、早 い時点でほど画像がより明確であった。投与量が５、特に１０ｍｇ／ｍ２である ときに、血液プール（腸動脈、大静脈および心臓）はさらに極めて明瞭に表わさ れ、造血組織での抗体の飽和が達成されたこと、および、過剰の抗体が血液中を 循環していることを示した（ｆｆｉ　１２．１３）。 対称的に、全注射投与ｊｉ１．５Ｂで、ＷＢＣ濃度が高く、かつ、富核性骨髄を 有する患者Ｎｏｌでは、血液プールは見られなかった（図１２　、ｈ　＞。 肝臓および牌臓は、全てのも者で映し出された。肝臓の取り込み（約１２％）は 、抗体が結合した麦に標識された白血病細胞を蓄積すると共に、白血病細胞、単 細胞またはマクロファージを内在するために標的となった、この器官の大きな血 液プールに帰するであろう。−１９５と結合することが予想されるＦＣ受容体は 試験管内では見らなかったが、網内細胞系（ＲＥ）Ｓ）による非特異的な取込み は、４人の患者について行った９９°Ｔ（コロイドを用いた標準骨髄スキャンと 比べるとさらに減少した。このコロイドを用いたスキャンは、全身のいたるとこ ろでＲＥＳにより取り込まれ、投与量の大部分が肝臓および牌臓に蓄積されたく 〉８０％）（図］、３Ｂ）。すなわち、骨髄を見るためには、画像は露出過度に しなければならない（図１３０）。これに対して、　”Ｉ−Ｍ１９５の大部分は 、骨髄に濃縮された（図１２．１３Ａ）。　”Ｉ−Ｍ１９５および９９ｆｆｌＴ Ｃの両方についての骨髄における解剖学上の分配は、Ｍ１９５が骨髄の全ての知 られている領域に標的を定めることを示した患者では同様であった。 骨髄外性の白血病の患部を有する２人の患者は、その上に、これらの領域への標 識されたｌ１１９５の取り込みも同様に示した。 二の取込みは、左耳下腺（図１２Ｆ　）および肥大縦隔肉芽腫性内挿（図１２　 Ａ　）を含んでいる。ヨウ素−１３１の代謝および排泄が、はとんどの患者にお いで、甲状腺および膀胱中で見られた。 非特異的な器官の取込みは、いずれの患者でも見られなかった。これらの画像は 、すべての患者（高濃度でＷＢＣを有し骨髄をパ・ツクした患者だけでなく、形 成不全の患者やＣＤ３３陽性芽細胞の１５〜３０％程度の割合で骨髄移植した後 の患者）において、ｕ１９５がわかっている白血病のすべての領域に急速に、特 異的かつ本質的に標的を定めることを証明した。注射投与量と画像を比較するこ とにより骨髄部位の飽和した後に血液プール活性が増加するために投与量が多い ほど効果が低くくなる（すなわち、特異性が低くくなる）ことも示唆された。 最高の投与量における”１−Ｍ１９５の取込みの割合の減少を、より９期の濃度 における部位の飽和によって説明することができる。しかしながら、ｌＯＩＩＩ ｇ／′ＩＩ＋２の濃度で全ての結合が失われることは矛盾する。このことは、骨 髄に比べて末梢血液芽細胞の増加または芽細胞でのＭ１９５の発現の減少（例え ば、患者１０）のような患者の臨床的な差異に原因があると考えられる。さらに 、１１１１９５抗原−抗体複合体の調節は、試験管内で投与量に依存しているこ とが示されている（８８）。 量の割合は、１時間で全ての３つの投与濃度に関して同様であり（平均値００１ １ん、　０．０１５％、　０．０１４％）、３日間で全ての３つの濃度に関して 同様であった（平均値０．００５％、　０．００６％、０００３〜）。１３１＋ −１１１９５のバイオプシー１グラム当たりの骨髄芯部内への取込みの割合は、 両方の試料採取時間において投与濃度５ｍｇ／ｍ２で最高であった（表３）。血 漿に対する骨髄の比は、両方の試料採取時間の両方において同様であった。この ことは、け髄における”１−Ｍ１９５の半減期が血漿でのものと同様であること を示唆した。いくつかの種類の証拠が、全血液に対する赤色量（細部成分）の放 射線投与量の実際の割合は、表３に示される血漿に対する骨髄芯部バイオプシー の投与鼠比の少なくとも２倍であることを示唆する。・１．骨髄芯部バイオプシ ーは、広範囲の細胞数の範囲内で約５０％の非造血性組ａ　［１４３）を含有す るため、記録されたバイオプシー中に取込まれた割合は、骨髄の細胞成分中への 取込みの割合を５０％だけ少なく見積もっている。２．７人の患者では、骨髄単 核細胞を分離したフィコール−バークあたりの放射線活性は、５人の患者（ｎｏ 、　ｌ、　３．６．７．１０　）において、骨髄芯部ｌ”１−Ｍ１９５投与量は 、実際の細胞”ｌ−１１１９５投与量を３３〜３００％だけ少なく見積もってい ることを示し、証明した。患者Ｎ。 ５ては、計算された”Ｉ−Ｍ１９５投与量は、両方の方法で等しく、患者Ｎｏ、 ８では、吸引液は５０％低い投与量を示した。しかしながら、データは、末梢血 液細胞による吸引液の汚染および分離ならびに洗浄工程における１３’Ｉ−Ｍ１ ９５の損失の両方によって困惑されている。３．全血液の取込みの割合は、血漿 よりも約３０〜低く　（標的でない細胞による希釈のため）、すなわち、全血液 に対する骨髄バイオプシーの１３１１の比か約３０％高くなった。４２点滴後３ 〜４時間におけるより低い１．１１９５投与濃度での骨髄を、主な血管が見られ ない鮮明に映し出す能力は、この遅い時点で、骨髄中の”　Ｉ−Ｍ１９５ａ度が 、血液中よりも著しく高くなければならないことを同様に示唆する。末梢血液標 的細胞への結合に数時間必要であるために、１時間試料採取投与量は”Ｉ−Ｍ１ ９５ρ度の最高値を骨髄にもたらさない（選択された患者で測定した場合）。 最低投与濃度での３人の患者では、骨髄芯部バイオプシー試料中の取込みの割合 は、同し時点における血漿中で見出だ人の患者では、骨髄中への取込みの割合は 、最初のうちは、血漿中よりも１３〜４倍高かった。これらの４人の患者は、通 常、２回目の試料採取時間まで血漿よりも高い比率を維持した。最高の投与濃度 では、血漿に対する骨髄での１３１１は、いずれの時点でも最低であり、平均は 約１３であった。従って、骨髄への取込みの割合は、投与量に異存し、５ｍｇ、 ／ｍ″で最高であった。節約して使用することにより、血液に比へて、実際の光 量細胞に対する放射線投与量の比が血漿に対する芯部バイオプシーのものの少な くとも２倍であることが推定され、Ｉｍｇ／ｌ１２で治療した患者における血液 に対する骨髄の放射線投与量の比の推定値がｌθ〜！、５．５ａ＋ｇ＃＋・の濃 度では２．５〜８．６　、ｌ０ｍｇ／ｎ“の濃度では０７〜１．７であった。 全骨髄への”Ｉ−Ｍ］９５の取込みの全量を測定するために、健常人（！４３） に骨髄（脂肪および細胞）３０００ｇを仮定した。 先のように、４人の患者に５ｍｇ／＋＋２投与量（平均＋／−５Ｄ：８５％＋／ ’−２５）を与えたときに、取込みの割合が最高値になった。 患者ｎｏ、５−７の骨髄への取込みは、おそらくバイオプシーにおける試料採取 を過ったために、確かに高く見積もられた。 １０ｇ１０“および１０ｍｇ／ｍ”の投与濃度での患者における全骨員への取込 みの割合は、かなり低かったが、それどもなお価値があった（平均＋・′−５Ｄ −１７〜＋／−３および２３％＋／−１ｔｌ）。正常細胞性骨髄（３７）Ｉｇあ たり約１０９の細胞を仮定し、１１１１９５１２ｇあたりのＩｇＧ分子４ＸＩ０ ９を計算することにより、初期に、患者によっては細胞に対して数百から数百の Ｍ１９５　ＩｇＧか標的を定めることを推定することができた。３日間で、Ｉｇ Ｇの数が約５０〜７５％低Ｆした。 最高投与量での１３１１１１１９５の取込みの割合の減少は、より早期の濃度に おける部位の飽和によって説明できる。しかしなから、ｌｏｎｇ／ｍ２の濃度で の全ての結合か失われることは矛盾する。このことは、骨髄に比へて末梢血液芽 細胞の増加または芽細胞でのＭ１９５の発現の減少（例えば、患者１０）のよう な患者の臨床的な差異に原因かあると考えられる。さらに、Ｍ１９５抗原−抗体 複合体の調節は、試験管内で投与量に依存していることが示されている（８８］ 。 次いで、骨髄、血液、全身および肝臓に送達される放射線投与量を、薬物速度デ ータおよび画像上の重要な領域を使用して計算した。肝臓はスキャンにおいて取 込みを示した唯一の非造血組織であったために、放射線投与量の研究のために選 択された唯一の器官であった（その他の膀胱および甲状腺は不適切であると考え られた）。ｍＣ１あたりのラドは、オージェ電子放出器を用いて、いずれも将来 治療に使用し得るため、Ｉｗよび　Ｉの両方について計算した。　１３１．に１ ３１、　１２３ ついては、総全身投与量（浸透および非浸透）は０．３３ｔｚｄ／ａＱｃｉ　〜 １．０Ｔｏｉｄ／′ｍｃｉ　；全血漿投与量は１．１ｒａｄ／ｍｃｉ　〜６．　 ！＋ａｄｚ’ｃＣ１；肝臓投与量は１．８＋ａｄ／ｍＣｉ　〜４．０＋ｘｄ／ｃ ｃｉの範囲であった。 これらの放射線投与量は、１１１９５　ＩｇＧの投与量と関係がなかった。 骨髄放射線投与量は、伝統的に、血液投与量と近似していると仮定されているｔ １４５＋か、二のことは、骨髄が標的組織でない系でのことである。我々は、す でに、骨髄細胞の取込みは、おそらく、芯部バイオプシー自体で予測される少な くとも２倍であることが分かっている（上記および表３）。す濃度で５〜３４１ 　器ｄＩＣｉの光量細胞投与墓、その他の投与濃度で２〜５＋ａｄｚ′ｍＣｉの 光量細胞投与量が患者で達成できることを予測するであろう（表３）。 ＭＩ９５は吸収され、放射能ヨウ素は実質的に細胞内部に保持されるので、崩壊 あたり細胞核内部に送達されるＫｅＶに関して、微視的線ｊｉ測定的計算を同様 に行った。　１３１１については、ＩｇＧ分子あたりヨウ素−！３１］、、’＃ 子と仮定すると、患者における最小細胞核投与量は１ＯＫｅＶ〜９６１］ＫｅＶ の範囲であり、５吐／−の投与１窒で最高である（平均　５２訊範囲　１３０〜 促囲　１０−７０ＫｅＶおよび平均　１１３．範囲　６０〜２２０にｔＶ）。 これらの推定は、血液中または細胞近傍でのＭ１９５から核投与量またはベータ およびガンマ投与量への細胞表面を含有せｔ、すなわち、核への推定される最小 付加投与量を表す（１４０，１４１）。 ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ＋　の反応性、　血清を適切に生存し、治療後に追 跡調査した６人の患者においてＲＡ　Ｍ　Ａの存在について検定した。４人の患 者から採取した血清は陽性であった。ＥＡＭＡは、１４日程度で２人の１１で県 られたか、その他のを者では３週まで延びた。 抗原−抗体のモノニレ−ジョン及び同位体の吸収、末梢血液白血病細胞を、ＣＤ ３３抗原およびその他の特異的細胞表面タンパク質の存在、並びに”Ｉ−Ｍ１９ ５の点滴前及び後の結合した１１１１９５の存在についで分析した。リン・く球 、芽細胞または単核球並びに多核リンパ球を、夫々、３つのビノトマ・ノブを用 いて単色蛍光物質で同時に試験した。Ｍ１９５０点ａ後に先生外で白血病細胞に 結合し得る、直接ラベルされた抗ＣＤ３３抗体＜　Ｍ１９５−ＮＴＣまたはｌｙ ９づＩ丁Ｃ）の量を、点滴前に結合し得る直接結合するＦＩＴＣ−ヤギ抗マウス １ｇを使用して、濾過後にＭ１９５が結合した表面が新生することが証明きれる ことを確認した。無関係な表面標識　Ｌ’ＨＬＡ−ＤｒまたはＭｙ４　（ＣＤ１ ４）　）を用いて、表面から抗原及び抗体を両方ともにモジュレートした（消失 させた）芽細胞を確認した。 高い投与量では、点滴後にＣＤ３３が選択的に飽和した。　１３１１−Ｍ１９５ の飽和は、ＭＹ９結合か消失し、ヤギ抗マウスＩｇ（Ｇ、〜Ｍ）の結合が完了す ることにより示されるように、Ｌｌで１時間で完了した（図１４）。しかしなが ら、後日までに、ＭＴ９およびＧＡＭの結合が消失することにより示されるよう に、抗原および抗体の両方が細胞から失われる。これによって、モジニレ−シラ ンが行われた。このことは、試験管内モデルにおいてＭ１９５について既に説明 されている（ＰＩ３．１３６）。Ｍ１９５抗原および抗体はゆっくりと同時に戻 った。同様の現象か、それほど完全ではないか４人の異なる宙者で起こった。２ 人の患者では、飽和またはモジユレーシヨンのいずれか一方が観察された。 ホジュレーンヨン後の結合した””１−ｋｌ１９５の運命を、５人の患者におい て、精製された芽細胞の連続放射免疫測定により調へた。５人の患者のうち４人 ｉｏ、　！、　４．８．９）において、って白血病細胞に吸収され、長時間細胞 内に保持された。生体内では、今までにないほど大部分の結合したｉｌｉ＋９ｓ ｃ患者１１０、８．９．１０で、夫々、３０％、　７０’ｉ、　７５〜）が耐酸 性成分に入り、結合後に１９５が細胞内に吸収され乙ことを示した。里庄点で吸 収された１３１１−Ｍ１９５は時間をかけてゆっくりと失われるが、大部分が２ ４時間まで細胞内部に保持された（図１５）　。 く考察〉 米国において年間的１５．０００人に影響を及ぼす急性および慢性骨髄性白血病 のだめの有効な治療方法はなかった。非特異的化学療法はこれらの細胞を殺傷で きるが、正常な造血前駆体、全ての系統の成執した造血細胞も殺傷し、かつ、そ の他の組織にもひどい損傷を与え得る。選択的に特異的な細胞群に標的を合わせ るモノクローナル抗体は、抗原標的がその他の成熟組織、最終造血幹細胞、成熟 骨髄細胞また非骨髄系統の上で発現しないことを提供する補助的治療方法を提供 し得る。ａｐ６７　ｔｃＤ３３）は、そのようｔ；抗原である！８４−８９）　 。その他の細胞および組織に損傷を与えずに１９５か結合した全ての細胞を選択 的排除できるならば、受容可能な病的症状を存する白血病細胞の除去が可能にな る。 ここで、ＡＭＬにおける特異的な斤量への取込みおよび映像化を示すモノクロー ナル抗体の試験を開示した。二の研究は、主に２つの質問に答えることを意図し ている。・１．　ＣＤ３３に結合し５た抗体か安全に投与でき、非細胞殺傷性成 熟抗体による結合が、単独で生物学的反応性、毒性または退行を結果として生じ るかどうか。２．　Ｍ１９５を細胞殺傷同位体またはその他の試薬の担体として 使用する試験を計画するのに使用しなければならないｍＡｂ　Ｍ１９５の薬物速 度、局在化特性および線量、測定はどのようであるか。第一の質問に対しては、 １０人のも者に、１週間にわたって、血液および骨髄中の白血病細胞上の全ての ＣＤ３３部位を過飽和にするに適当な濃度までＭ１９５の投与量を上昇させて点 滴することによって答えた。Ｍ１９５の一番目の投与は同様に標識・追跡したた め、種々の組織および細胞上におはるＭ１９５の定量速度論的濃度を測定するた めに、血液および骨髄を連続して採取し、全身を映像化することにより、第二の 質問に答えることができた。 生物学的効果および轡者の反応、１０人の患者中７人において不利な反応は認め られなかったが、１人の患者で一時的なかゆみを、２人目の患者では骨髄の痛み を、３人目では耳下腺の痛みを含んでいた。ルゴール液が耳下腺の痛みの原因と なり弓るために、耳下腺の痛みが１１１９５に帰することを明確にできなかった （１４６１゜しかしながら、冒された左の耳下腺でも、スキャンに標識された” ｌ−１Ｊ１９５の取り込みが見られた。 ｍ療的効果も、血清の化学的性質または血球数１ｂｌｏｏｄｃｏｕｎｔ）の変化 もなかった。ＡＦＬおよびＤＩＣを有する患者を含む患者の８０％が、著しいフ ィブリノーゲン濃度の増加を示し、たが、このことの意味は、臨床的な白血病の 反応がなければ不明確である；この増加は、非特異的な急性位相反応物（ａｃｕ ｔｓ　ｐｈａｓｅ　ｒｅａｃｔａｎｔ）の増加によるものであり得る。失体内で の飽和を示す投与量での生化学的効果の欠損は、ＣＤ３３に対する非細胞殺傷性 マウスｍＡｂが、その他の生化学的活性剤の担体として使用しない限り、有用で ないことを提案する。 ＣＤ３３タンパク質の機能は知られていない。毒性または治療効果が、マウスｍ Ａｂ複合体またはＣＤ３３にヒューマナイズしたｌｕｍａａｉ＋ｅｄ）　ｍＡｂ により達成されるならば、現在、これらの効果は、この解釈の作動因子のメカニ ズムに帰するが、ＣＤ３３部位の阻害に帰さないことを明確にできる。 試験された６人の患者のうち４人がＩＩＡＭＡを発達させて、厳しく免疫抑制さ れ、激しく前処理した群でさえ、マウス抗体を免疫したことを示した。興味深く は、１人の患者では、ＢＡＭＡかドナーの骨髄に由来している。この群では、少 ない試料サイズおよび減少させた追跡のために、Ｍ１９５による治療後の１１Ａ ＭＡの実際の発生率についての推定はできなかった。しかしながら、Ｂ細胞腫瘍 ｆ１４７）によって患者におけるＢＡＭＡの発生率か減少しない限り、骨髄移植 または血球減少を含む激しい前治療にもかかわらず、ＨＡ　Ｍ　Ａは、ＡＭＬを 有する史者において顕著な反応である。　− 薬理　薬理学的研究によって、？ｖｌ　１９５は３３から１１１時間の範囲の半 減期で血液中に広く分布することが示された。 しかし、−人を除くすべての患者で、点滴された投与量は、推定標的位置を飽和 するのに必要な投与量の大過剰である。 ２．５ｍｇのＭ１９５（１０１６分子）は１Ｋｇ（７）ＩＩＩ胞の抗原部位（１ ０１６）の推定数に等しいので、これらの後者の慰者において、投与量の変化に 応じてＶｄまたは”　Ｉ／２に大きな変化か見られなかったことは、驚くへきこ とではない。患者Ｎｏ、１のＭ１９５投与量は、飽和投与量より５倍も少ないか ら、血清からの吸収およびその後に上昇されるＶｄを予想することができる。計 算された過剰の抗原を有するこの患者において、大部分の注射された投与量の標 的細胞への吸収は、注射後ただちに起こり、８．３Ｌ／ｍ２のＶｄと最も鮮明な 骨髄画像を生じる。全患者で骨髄が映し出されたが、血液活性の増加がｍ　Ａ、 　ｂ　Ｍ　ｌ　９５の投与量の増加に伴って増大した。従って、該抗体デリバリ −の最も高い特異性は最低投与レベルで達成された。この結果は、他の系で観察 されるものとはまったく異なるが、迅速でしかも効果的な可飽和ターゲツティン グ（ｉｘｔｕ＋ａｂｌ＋　ｔｕｇｅ＋ｉｎｇ）とは一致する。最低投与レベルで のＭ１９５の濃度は、約１ｎＭである。これはｉｎ　ｖｉ１＋ｏで計算された結 合活性定数と同じである（８８）。従って、二の血液学的な系においてｉｎ　ｖ ｉｖｏでのｍＡｂの振舞いは、ｉｎ　ｖｉｌ＋ａでのその活性と同しである。 Ｍ１９５抗原および抗体のモノュレーンヨンは、結合後に迅速に起こる。この現 象は、　■およびｌ１ｌＮ、の両方の標二を用いたＭ１９５のｉｎ　ｖｉＨｏモ デルで起こることが示されている（１３６）。驚くことに、ｉｎ　ｖ＋ｖｏでの 結合および内在化後の標的芽細胞内部での１３１　■の保持力は、ｅｘ　ｖｉｖ 。 ての同様な結合（１３６、および本研究）と比較して、より大きかった。ｉｎ　 ｙｉｖｏでの結合の後、細胞に結合した１３１１の７０％は細胞内に存在する。 これは、ｉｎ　ｙ＋ｔｒｏでの単独に行なわれる実験で生理的条件かより少ない ためであるか、または、ｉｎ　ｖｉｔ＋ｏての培養時間か短いためであろう（ｉ ｎ　ｖｉｖ。 で１１７２から２時間に対して、ｉｎ　ｙｉｌ＋ｏでは３７℃１時間）。 モシニレーンヨンが、同位体の内在化を起こすのではあるか、抗原陽性細胞のリ ターン前にＨＡ　ＭＡが発生するのて、マウスＭ１９５の繰り返し投与は有用で ないことが示唆される。 ヒト化ｍＡｂを利用することによって、標的抗原を再発現させるために計画され た間隔で、投与を繰り返すことか可能となるであろう。 線量計測　薬理学、生体組織検査、および画像分析に基つく放射線投与量ｐｊは 、複合体として１３１■を用いれば、Ｍ１９５によって、骨髄に対して異常投与 量の放射線を特異的に与えることができることを示した。中間投与量レベルにお いて、注射された１３１■のそれぞれのｍＣ１当たり、５から３４ｒａｄが与え られると見積もられる。全身投与量（０，３から１　、０　ｒａｄ／ｍｃｉ　） および正常器官投与量は、肝臓の投与量（１，８から４．　２＋ａｄ、’ｍｃｉ 　）を除いて最小量であった。注射される”Ｉ−Ｍ１９５を５Ｑ□ｌｌ１ｃｉに 制限することによって、肝臓に対する放射線投与量を耐用可能な範囲に保持でき る。この制限によってもなお、骨髄に対する２５００から１７．０００ｒａｄの 見積られた放射線送達はまた可能である。 これによって、最小の非造血毒性で、　Ｉ−Ｍ１９５を用いた完全な骨髄除去が 達成される・・骨髄移植または自己的な骨髄救出（ａｕ＋ｏｌｏｇｏｕｓ　ｍａ ＋＋Ｏｖ　＋ｅｓｃｕｅｌ　に先立つ、実行可能な医療法である。骨髄細胞に含 まれる全細胞への取り込み、可能なサンプリングエラーの大きさまたは実際の骨 髄の半減期を、非常に多くの吸引術や各々の患者の生体組織検査を用いずに決定 することは不可能であるから、これらの見積は大雑把なままである。 骨髄の救出（ｍｘｔｒｏｗ　ｔｔｓｃｕｅ）を必要としない医療法においては、 より範囲の狭い細胞に特異的な放射を発する核種が好ましい。これらには、　１ ２３　工即ちオージェ放射体が含まれる。 放射線投与量は同様な技術でＭ　１９５に結合し得る１２３工に対して計算され た。　”Ｉ　（１９３時間）に比較して、この同位体（１４時間）のＴ１／２が より短いので、非特異的放射投与量は、比較される１３１工の投与量よりも１０ から２０倍低い。全身投与量は約０．　０５ｒｘｄ／ｍｃｉ　、血漿投与量は０ ゜１５　ｒｉｄ／ｍｃｉ　、肝臓は、約０．　２＋ｘｄ／ｌｌ１ｃｉであった。 全骨髄に対する投与量も１３１１に対して計算されたものより約１０から２０倍 少なく、０．１からｌ　、　４　ｒａｄ／ｍｃｉの範囲にあった。対照的に、高 いオージェ電子の変動のために、標的細胞の核当たりの計算されたＫｅｖは、　 ■を用いたときに非常に高くなり、特に５　ｍ　ｇ　／　ｍ″の投与量レベルで 高かった。 この投与レベルては細胞当たり１．５かう１０．　７＆ｉｅ　’ｖ’ノ核か付与 達される。先のように、これらは、細胞表面またはそれ以外からのオーン二線束 またはベータ線束を含まない最小の評価である。　■から全身および器官への投 与量が非常に低いので、標的および非標的組織に対する放射投与量を比較したと きに、Ｍ１９５に捕捉された１２３Ｉは、　１３１、−Ｍ１９５より１００倍以 上大きな治療指数を与えた。しかし、これらの理論投与量は、達成可能なラベリ ングの特異的活性によって制限される。それぞれ１０個のＩｇＧに対して約１個 のヨウ素が実質的に結合しているので、実行可能な投与量は、１０倍低くなる。 即ち、投与量は骨髄細胞に対して約ＩＭｅＶそして身体に対しては１０　ｔ！ｄ 以下に低くなる。　１２５Ｉがこの方法に用いられるか、　■は細胞毒性の核種 としてまだ用いられていない。 ビスマス−２１２のようなアルファー粒子を放出する核種もそれらの短い範囲お よびＬＥＦか高いので、標的細胞を選択的に治療する（４）。この報告中で説明 されている骨髄への迅速な取り込みや、ビスマスで標識されたＭ１９５の達成で きる特異的な活性によって、これは穏当な代替のアプローチになる（Ｓｃｈｅｉ ｚｂｅ＋ｇ　およびＧａｎ＋ｏｗ　、未発表）。デリバリ−の特異性はまた、治 療形態として、遺伝学的に処理された免疫毒素、または細胞毒性ヒト化ｍＡｂ（ ４０，４１）の使用を可能にする。更に、結合に続くデリバリ−およびｍＡｂの 内在化の有効性もまた、ｉｌ　ｙｉｖｏにおいて、白血病細胞または正常骨髄原 始細胞に直接に他の生物学的に重要な分子を送達させることを可能にする。 結果 マウスＭ１９５ ？＆量標識された〜１１９５　（”Ｉ−Ｍ１９５）および標識していないＭ１９ ５の投与量を段階的に増やしたフェーズ１試験を、骨髄性白血病を持った１０倍 者を含めて行った。この試験では、Ｍ１９５の安全性が確認され、また特異性、 迅速性、若しくは白血病細胞へのｋｉ　１９５の定旦的デリバリ−とそれに続く 血液および骨髄中の細胞への内在化が示され、更に、ヒト抗マウス抗体がほとん どの患者で生成されることが示された。広範な薬学的および＆Ｉ］！計測は、医 療目的に対する第二次試験か１３１■を用いて行なわれるように記述される。 ”Ｉ−Ｍ１９５を段階的に増やした投与量でのフェーズ１試験は、上述のフェー ズ１の観測が以下の二とに加えて確認されたことを示した。莫大な細胞か殺傷さ れることは、２００、０００．０００．０００から１．０００．０Ｇ０．０００ ．０００の殺傷された白血病細胞を持った６から８人の患者によって立証された 。これは、最も有効な化学療法にまったく反応しない患者、および高い循環芽細 胞数を持つ患者に、骨髄移植後を含めて幾度も前治療した患者で起こる。白血病 細胞が細胞減少するにもかかわらず、重要な非血液学的毒性はなかった。腫瘍溶 解症候群（ｔｕｍｏｒ　１１＋ｉｉ　ｓｙｎｄｒｏｍｕ　）や肝機能異常は見ら れなかった。 幾人かの患者では、正常な造血細胞さえも節約された。 表１の注釈 ａＡＭＬは、急性ミニロイド性白血病であり、適用できれば、ＦＡＢの分類に従 う。；０〜１Ｍ０Ｌは慢性骨髄単球性白血病である。 ｂ　略語：ＣＯＰＢＬＡＭはサイトキサン（（Ｈｏｘａｌｌ）、ビンクリスチン （ｖｉｎｃ＋１ｔｆｉｎｓ）、プレドニゾン（ｐｎｄｎｉｉａｎｓ）、プレオマ イシン（ｂｌ！ｏｍ７ｃｉｎ）、アドリアマイシン（ａｄ＋ｉｘｍｙｃＩＤ）、 メソトレキサーテ（＋ｇｅｔｈｏｌｎｘ［ｅ）である。、ＩＤＡはイダルビシン （ｉｄａ＋＋＋ｂｉｔｉｎ）である。、ＨＤＡＣは高投与ｌ　Ａｒ　ａ−Ｃであ る。、　Ｍ　Ｉ　Ｔ　Ｏはマイトキサントロン（ｍｉ＋ｏｘｕ＋ｔｏｏｒ）であ る。、ＨＵはヒドロキシ尿素である。Ａｒａ−Ｃはントンンアラビノシドである 。ＡＺＱ−ＣＴＸ−ＴＢＩ−ＢＭＴはＡＺＱ、高投与量のシトシンおよび全身照 射とそれに続く異質遺伝型の骨髄移植である。ＤＡＴはダウノマイシン（ｄｘｕ ｎｏｍ７ｃｉｏ）　、Ａ　ｒ　ａ　−Ｃ，およびチオグアニンである。ＣＨＯＰ はサイトキサン、アドリアマイシン、ビンクリスチン、プレドニゾンである。Ａ 　Ｍ　Ｓ　Ａはアムサクリン（ａｏｘａｃ＋ｉｎｅ　）である。ＨＭ　Ｂ　Ａは ヘキサメチレンビスアセトアミドである。 ｃＷＢＣは１ｕｌＸ１０−３当たりの白血球細胞である。；血小板はｕｌＸ１０ ’当たりである。、Ｈｇｂはｌｄｌあたりのグラム数で表したヘモグロビンであ る。、ＡＮＣは１ｕｌ当たりの絶対顆粒細胞数である。患者の何人かは血小板ま たは赤血球輸血依存性であった。 ｄ　線量計算を助けるだめの腫瘍重量を見積る目的で、正常同胞性骨髄が１ｋｇ あるいはＩＸｌ［）１２セルあると見積られた。従って、任意の価として１．０ ｋｇを割り当てた。；ハイパーセルラー（ｈｙｐｓ＋ｃｅｌｌｕｌａｒ　）　： 　１．　２ｋｇ　；ハイポセルラー（ｂｙｐｏｃｓｌｌｕｌｘ＋）　：　０．８ ｋｇ　：非常なハイポセルラー（ｖｕｙ　ｈａｙｐｏｃｅｌｌｕｌｕ）　＋　０ ．　３ｋｇ　（文献３７も参照）ｅ　本患者中の前骨髄細胞および芽細胞。 ｆ　本患者中の単核細胞および芽細胞。 ｇ　この患者は多数の抗生物質を受けていた。 表２の注釈 ａ　Ｎｏ　Ｆｉｔは、たった一つの勾配が回帰分析（＋ｅｇ＋ｃ＋＋ｉｏｎ　ａ ｎａｌｙｓ口）で決定されたことを意味する。 ｂ　ＮＤは“決定されない（Ｎｏｔ　Ｄｅｌｕｍｉｎｓｄ）　”″である。 Ｃ患者の罹患率のために患者１および５で尿浄化値によって決定された。 ｄ　ＥＬＩＳＡによって決定された。 ｅＫｇ（ここてＬＫｇは１０１２セルと仮定する。）中の全腫瘍重量が血液に関 連して決定された。：［１ｕｌ当たりのＷＢＣ掛ける、％芽細胞掛ける、０．０ ０３掛ける、体表面積］　、プラス、骨髄患部（！ｈ＋　ｂｏｎｅ　ｔｓａｔｒ ｏｗ　１ｎｖｏｌｙｅ＋ｕｎ＋　）＝　［細胞性因子掛ける、％芽細胞掛ける、 ０．０１．］。細胞性は、指標と同じように（３７）を用いた表１で任意に定義 される。“全”重量は、肝臓、肝臓、および、骨髄性外患部（ｕｔ＋ｘｍ＋ｄｕ ｌｌｕ７　ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）が含まれていないので、多分、過小評価さ れている。しかし、骨髄中の我々が仮定した重量の精度を決定する方法はない。 ｆ　ＭｇのＭ１９５がそれぞれ見積られたＫｇの白血病細胞重量に対して投与量 力たり注射された。 ｇ　Ｎ１２回投与のみが与えられたので適用できなかった。 １致−ユ　急性骨髄性白血病における自己骨髄移植；骨髄特異性単一クローン抗 体および薬の組合せによるインビトロ処理 材料および方法 （ΣＪＩＪｉｔＪ　ＨＬ−６０は１倍加時間２４時間およびコロニー形成率７〜 １２％で成長するヒト急性前骨髄球性白血病細胞系である（１４８）、この細胞 系を、３７℃、５％ＣＯ２空気中において、　１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２−　 Ｈｙｃ　ｌ　ｏｎａ　ロガン（Ｌｏｇａｎ）、ＵＳＡ）１％Ｌ−グルタミンで補 足したＲＰＭＩ−１６４０中で対数増殖に維持した。細胞生存度は、常に９５％ よりも高く、細胞は、マイコプラズマ汚染がなかった。 土亙亙ｌ　通知同意書を得た後の健康なボランティアの後腸骨稜から骨髄細胞を 吸引し、フィコール−ハイベーク勾配（１，０７７ｇ／ｃｍ、）後に８Ｍ単核細 胞を集めた。 白血病試料　８人のＡＭＬ患者の末梢血から細胞を得たく表１）、ＡＭＬの診断 は、形態的基乳　細胞化学的染色およびＭａＡＢＳのパネルを用いた表面マーカ ー分析によって確立した。白面Ｒ試料は、　ＦＡＢ分類システム（１４９）に従 ってサブ分類した。血小板のカウントが充分に高い場合は、パーコール（１，０ ５０ｇ／ＣＭｓ）（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社、ビスカッタウｘ− （Ｐｉｓｃａｔｔａｗａｙ）、ＮＪ）に対し遠心することにより先ず血液から血 小板を除き、ついでパーコール（１，０７５ｇ／ＣＭｓ）に対して遠心すること により低密度細胞を得た。白血病細胞をウシ胎児血清中に懸濁し、記載（１５０ ）のように５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および６％ヒドロキシエチル スターチ（ＨＥＳ）を含有する混合物を用いて凍結保存した。細胞は、　レブコ フリーザー（レブコ・サイアンティフィック、アッシェビル、ＮＣ）中、−１２ ０℃で凍結した。解凍後、細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）、６０ｕ／ｍ ｌのデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅ＞（クーパー・バイオメディカル、 マルバーン、　ＰＡ）で補足したイスコブ変性ダルベツコ培地（■ＭＤＭ）に懸 濁させ、氷上で３０分インキュベートした。生存細胞をフィコール−ハイベーク 勾配により回収した。全ての試料ｉ！、８６％以上の芽細胞および前骨髄球を含 有していた（表１）、残存Ｔ細胞をＭｏＡｂｓ（抗Ｔ、、Ｔ１およびＴ、１）の パネルで免疫蛍光染色により評価し、全ての患者について２％以下であった。 化学療法化合物　ＶＰ−１６（ブリストル・ラブズ、シラキューズ（Ｓｙｒａｃ ｕｓｅ）、ＮＹ）および４８Ｃ（ボルチモア、ＭＤのジョン・ホプキンス大学の ○７Ｍ、コルビン博士の厚誼により提供）を使用直前に、それぞれカルシウムお よびマグネシウムを含まないＲＰＭＴ−１６４０およびＰＢＳにより希スＴｇＧ ２ａ単−クローン抗体である（１５１）、Ｆ２３は、その標的抗原（ＣＤ１３） が初期および成熟骨髄細胞上に表現されているマウスＩｇＧ２ａ単一クローン抗 体である（ＬＪ、オールド博士の厚誼により提供）、ＨＰＣＡ−１，（Ｍｙｌｏ 、ベクトンーディッキンソン　マウンテン　ビュー、ＣＡ）は、推定上のヒト造 血性始原細胞上に表現されたＣＤ３４抗原に直接向かうマウス１ｇＧ１単一クロ ーン抗体である常ＢＭ細胞をそれぞれ２×１０番／ｍｌおよび２０Ｘ１０６／ｍ １の濃度に調節した。ＶＰ−１６を５μｇ　／　ｍ　ｌの濃度で。 ４８Ｃ：　８０μＭまたは１．　ＯＯμＭ、Ｍ１９５およびＦ２３：４０μｇ　 ／　ｍ　ｌ添加し、最適補体（ベイビーラビットコンブリメント、ベルフリーズ 、ブラウンディア、Ｗ　Ｉ　）濃度は１、．６（Ｖ／Ｖ）であることが見いださ れた。　３７℃で１時間のインキュベーションが完結した後、細胞を５分間氷上 に置き、Ｆｅ２で補足されたＲＰＭＩで２回洗浄した。　「半ビボ」８Ｍ瀉下状 態をシミュレートするために、ＨＬ−６０細胞は。 照射（３０００ｃＧｙ）８Ｍ細胞とともにもインキュベートした（比］、：　１ ０）、ｆｆｌ瘍細脳細胞単独でまたは照射正常８Ｍ細胞とともにインキュベート した後、３５ｍｍのプラスチック製ベト９皿（マイルズ・ラブ、ネーパービル、 　ＩＬ）中で４倍に平板培養した。培地（１２Ｑ％ＦＣ３，１％抗生物質および １％Ｌ−グルタミンを含有するｒ　ＭＤ　Ｍ中１％メチルセルロース（メトセル Ａ４Ｍ、ダウ・ケミカル社、ミツドランド　３．（！　＞からな乙ものであった 。　１ｍｌの培地中で平板培養した細胞の数は、１０００未処理および１０’処 理であった。細胞は、空気中５％ＣＯ２の加湿雰囲気中３７℃でインキユベート シ、インキュベーションの７日後倒立顕微鏡を用いてコロニー（〉５０細胞）に ついて測定した。 処理後、正常骨髄細胞を、既に記述されている（１５０）通り、ＣＦ　Ｕ　−Ｇ 　Ｍ、Ｂ　Ｆ　ＩＪ　−ＥおよびＣＦＵ−ＧＥＭ由来のコロニーについて検定し た。簡単に述べると、培地は、　２４％、０．８％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ −シグマ・ケミカル社、セントルイ人　ＭＯ）、　１０−’Ｍの２−メルカプト エタノール（シグマ）、　ＩＵの部分精製ヒト尿エリスロボイエチン（トーヨー ボー、ＮＹ、ＮＹ）、１０％の、　ヒトＭＯＴリンパ球芽細胞系＜１５３）（ｔ ｊｃＬＡ−ロサンジェルス、ＣＡのディピッド・ゴールド博士の厚誼により提供 ）から調製したＭ　ｏ　ＣＭの選定ロフトおよびウシヘミン０．２ｒｎＭ　（シ グマ）で補足された１、　ｍ　ｌのＩＭＤＭ（ギブコ）からなるものであった、 メチルセルロースを最終濃度１．３２％で添加した。４倍培養物を上に述べたよ うにインキユベートシ、コロニーをインキュベーションの１４日後に測定した。 ＣＦＵ−Ｌ（１４９）についてのクローン原性検定＋ｉ　ウシ血清およびエリス トボイエチンを添加しないで、正常８Ｍ始原細胞について用いたものと同じであ った。全部で１０’の照射自己細胞（１＄７（：　ｓ源での３０００ｃＧｙ）を 培養物ｍ１当り添加した。対照試料においてｍ１当り約１００コロニーを有する ように平板培養した細胞の数を調節した。処理試料はより高い細胞濃度でクロー ン化した。コロニー（〉２０細胞）は、インキュベーションの１０日後に測定し た。 ５」λ」−４°、ＣＤ３３−１８胞の富化およびデルタ値　いずれかに報告され ている通り（１５４）、免疫パンニング（ｉｎ＋ｍｕｉｏｐａｎｎｉｎｇ）技術 （ＨＰＣＡ−１との３０分インキュベーション後１６）（ＭＹＩＯｌ　ｌｏμｇ ／ｍｌ、ベクトンーディソキンソン）により精製始原細胞を得た。形態的分析お よび免疫蛍光法により評価したＣＤ３４＋芽細胞のパーセントは、常に９０％よ り高かった。ｒ　−Ｇ　Ｍ　−ＣＳ　Ｆ　（Ｉ　ＯＯＯＵ　／　ｍ　ｌ、アムゲ ン、サウザンド・オークス、　ＣＡ、）、　ＩＬ３　（５０ｎｇ　／　ｍ　ｔ、 ジェネティックス　インスティチュート　ケンブリ・ソジ、ＭＡ）またはＭｏＣ Ｍ（１，０％、Ｖ　／　Ｖ　）を＝ｏ＝−刺激因子として、　５Ｘｌ○４ＣＤ３ ４”、ＣＤ３３〜細胞をＣＦＵ−ＧＭについて半固体培地中で平板培養した。イ ンキュベーションの１４日後、　コロニーを倒立顕ｇｉ鏡でカウントし、日数０ 　（Ｄｏ）ＣＦＵ−ＧＭＩｉ度として記録した。同時に、１×１０う細胞を、Ｉ Ｌ３　（５０ｎｇ／ｍｌ）またはＩ　Ｌ３＋ＩＬＩ　（１００μ／ｍｌ、シンテ ックス、バロ・アルド　ＯＡ）またはＭｏＣＭ（１０％■／〜′）を含有する２ ０％ＦＣ８で補足したｒＭＤＵ１ｍｔ中に懸濁した。　７日目に、細胞をカウン トし、各懸濁液からのＩ　Ｘ　１０４細胞を上に述べたようにＣＦＵ−ＧＭが３ 倍となるように平板培養した。液体培養の開始から７日が経過しているので、　 １４日のコロニーを０７ＣＦｔＪ−ＧＭ頻度として記録した。　デルタ値は、　 Ｄ７ＣＦＵ−ＧＦＭ頻度をＤＯＣＦＵ−Ｇｍ頻度で除す二とによって決定し、　 これは、１４日ＣＦＵ−ＧＭ早期段階の始原細胞の数の指標である。　Ｄ　ＯＣ Ｆ　Ｕ　−Ｇ　Ｍが０であった場合、Ｄ７ＣＦｌ、’−ＧＭ頻度は、　０．３３ で除する。　クローン原性検定は、　３倍で開始し、　１つのコロニーが検出の 下限であったからである。 立二上欠遣　全ての実験は３回以上行い　各実験の平均＋標準偏差（ＳＤ）を計 算した。藁処理後のコロニーカウントは、未処理対照細胞のパーセントとして表 現した。 結果 腫瘍細胞に対する化学および／または免　療法の効果　ＡＭＬ患者の臨床特性は 、表１に報告されている。平均年齢は、４９才（範囲３５〜６９）であり、白血 病芽細胞は６９ないし９８％に渡り、残存Ｔ細胞は、常に２％以下であった。Ｈ Ｌ−６０およびＣＦ　ＩＪ　−Ｌクローン原性検定阻害の結果は、第１６図およ び第１７図に示されている。免疫化学療法処理（すなワチ、Ｍ１９５プラス１０ ００μＭまたは８０μＭのいずれかで用いた４８Ｃ＋ＶＰ−１６およびＭ１９５ およびＦ２３プラスＨＣ＋ｖＰ−１６の組合せ）の後、４０グより大きいＨＬ− ６０厘腫瘍胞除去が観察されたが、単独法は、平均９５　＋　０　、９％ＳＤの コロニー形成阻害（−緒に使用したＭ１９５およびＦ２３による補体−媒介溶解 （ｃｏｍｐ　ｌ　ｅｍｅｎｔ−ｍｅｄｉａＬｅｄ　１ｙｓｉｓ））　を与え、　 ９９．５＋０．８％５Ｄ−４１−ＩＣ（２００μＭ）単独使用；　９９．／９５ ＋０．２％５Ｄ４ＨＣおよびＶＰ−１６混合物であった（第１６図）。 ８人のＡＭＬ患者を４つのプロトコールに従って治療した。 ＭｏＡｂ　Ｍ１９５ブラＸ４ＨＣ（１ｏｏμＭ、）およびＶＰ−１６による組合 せ治療後、ＣＦＵ−Ｌは見いだせなかった（すなわち、３０グを越える腫瘍細胞 除去）が、抗体処理および補体溶解、４　ＨＣ，および４ＨＣ＋ＶＰ−１６処理 後の平均コロニー形成阻害は、それぞれ、　９２．３＋２．５％ＳＤ、９５．５ 　１．４％ＳＤおよび９９＋０．８％ＳＤであった（第１７図）。 単独ＭｏＡｂ（すなわち、Ｍ１９５またはＦ２３）による補体依存溶解は、Ａ　 Ｍ　Ｌ患者からのＩ−ＩＬ−６０細胞および白血病細胞の双方に対して治療した とき、　９０％未満の腫瘍細胞除去をもたらした（データ報告せず）。 正常８Ｍ始原細胞に対する４つの異なる瀉下プロトコールの監１！ユ１進　４Ｈ Ｃ＋ＶＰ−１６を用いまたは用いずにＭｏＡｂで処理した後のコミットされた正 常ＢＭ前駆体の平均回復率を表２に示す、我々の実験で観察されたＣＦＵ−ＯＥ Ｍの低い数は、統計的分析を許容しなかったので、ＣＦし−ＧＭおよびＢＦＵ− Ｅ回復率の結果のみが報告されている。 単独処理は、平均回復度として、　工２％ＣＦＵ−Ｇ〜イおよび２２．９％のＢ Ｆｔｊ−Ｅ　Ｃ免疫療法）、および４．４％ＣＦＵ−ＧＭおよび５．６％ＢＦＵ −Ｅ　（化学療法）を示した。造血性細胞の二ロ二−形成効率は、はとんどの実 験において組合せプロトコールにより完全に消失した。４．８Ｃを８０μＭの濃 度で試験し、Ｖ　Ｐ　−］、　６およびＭ　ｏ　、Ａ　ｂと組み合わせたとき、 ＣＦＵ−ＧＭおよびＢＦｔＪ−Ｅの回復率は、それぞれ。 ２．７％＋３３Ｄおよび１％２．５ＳＤであった（データは、表２に示されてい ない）１次に、免疫薬理学処理後のＣＤ３４”、ＣＤ３４−細胞の富化集団から の始原細胞の回収率を評価するために追加の実験を組み立てた。我々の検定は、 液体培養におけるｒ−ＣＳＦまたはＭ　ｏ　ＣＭによるブレーＣＦじ−ＧＭ（Ｃ Ｄ３４÷、ＣＤ３３−）区画の刺激、その後の富化芽細胞集団由来のＣＦＵ−Ｇ Ｍの回復率を評価するためのクローン原性検定からなるものであった。我々は、 また、初期造血性始原細胞を刺激するための最適のＣ３Ｆの組合せを調べるため に異なる培養条件を比較した。この組の実験において、組合せ処理へのＭｏＡｂ 　Ｆ２３の添加は、Ｍ１９５だけを薬とともに用いた場合と異なる結果を与えな かったので、Ｍ１９５プラス４ＨＣ＋ｖＰ−１６プロトコールのデータのみが表 ３に報告されている。 最初の３つの実験では、　ＩＬ３のみ（＃１、２）またはＩＬ、　ｌとの組合せ （＃１、２，３）およびＭ　ｏ　ＣＭを懸濁培貫における刺激因子として選び、 ＴＧＭ−Ｃ３ＦおよびＩＬ３を半固体検定におけるＣＦＩＪ−ＧＭ成長を誘起す るために用いた。これら３つの実験は免疫バンニングによるＣＤ３４＋細胞の富 化前の免疫薬理学的処理後にＣＦ＋シーＧＭ回復を示さなかった。ＣＤ３４”、 ＣＤ３３−細胞を検定したとき、我々は、２つの実験（８１，３）（Ｄｏ値）に おいてわずかなＣＦＵ−ＧＭを観察したが、実験＃２において顆粒細胞−マクロ ファージ始原細胞は得られなかった。液体培養の１週間後に数えたＣ　Ｆ　Ｕ　 −Ｇ　Ｍの数（Ｄ７値）は、特に、半固体検定においてＧＭ−Ｃ３ＦまたはＩＬ ３のいずれかを用いてＭ。 ＭＣを用いた懸濁＠養中の刺激を行なった後は、Ｄｏ値よりも顕著に高かった（ 実験＃１．２および３においてそれぞれ３６１．３．．２４および２５５のデル タ値）、　ＩＬ３単独による富化芽細胞のインキュベーション後に得られたデル タ値が乏しいと仮定して、我々は、次の実験では、液体培養におリ】Ｉコニ−ｔ 　”　＠　ｑ　？）０％、　ｆＬ９：フコ、ユｏ６！　ｆＬ　ｔ”ｊｈＪニー’ ＣＴＲ−１７Ｌ　＃Ｔｐｉ　）ｉ＜ｇεＬす１いてＩ　Ｌ　１．　＋　Ｉ　Ｌ　 ３及びＭ　ｏ　ＣＭ及びＣ３Ｆのみを用いることを決定した。さらに、短期間検 定においてコロニー刺激因子としてＭｏＣＭをも使用した。我々の実験室で同時 に行なった他の研究は、Ｍ　ｏ　ＣＭが高度富化芽細胞集団に対する最も効果的 なＣＳ　Ａであることを示したからである（１．ｂ５１！。 実験＃４および５は、ＭｏＣＭによる刺激（実験＃４．それぞれ、〉４５および 〉３０）の１週間後の半固体検定にｆＬ３またはＧＭ　Ｃ３Ｆを用いたときの、 最も高いデルタ値（これは、ＣＤ３４”、ＣＤ３３−細胞集団由来のＣＦＵ−Ｇ Ｍの増殖能力を示す）を報告している。 最後に、実験＃６は、初期ＣＤ３４”、ＣＤ３３−幹細胞に対する２つの異なる 免疫化学療法（１００μｍ　−Ａ−シＳ８０１ｔＭ−Ｂ−の効果を比較した。多 能性細胞区画は、４８Ｃのより低い投与を用いることによってより影響されない ように思われ（デルタ値は、　ＩＬＩおよびｒＬ３刺激後に、ＭｏＣｍを使用し たとき、１８０．　およびＭ　ｏ　ＣＭまたはサイトカイン組合せによる刺激の 後にＧＭ−Ｃ３Ｆのとき、〉！、　４４．　）　、他方、コミットされた骨髄始 原細胞の「汚染」は、両方の場合において免疫パンニング後同様であった。興味 のあることに、４つの実験（２，５，６ａおよびｂ）において、８Ｍ始原細胞は 、液体培養において単独でまたは組み合わせて用いたときの同じ成長因子に曝さ れた後ＩＬ３［二対する応答性を消失した。 １肩 動物システムにおいてＢＭを瀉下させる植々の技術の治療的利益は充分に確立さ れ（１５６）、Ａ　Ｍ　Ｌを持つ患者に対する４ＨＣまたは４ＨＣ＋ＶＰ−１６ 瀉下ＢＭを用いた予備研究は、励みとなる結果を報告している（１５７．　１５ ８）。 Ａ　Ｍ　Ｌ患者に対する８Ｍ瀉下の役割を実証するためのランダム化試行からの データが手元にないが、　１９８９年のヨーロッパ骨髄移植グループからのマル チセンター登録データは。 骨髄芽細胞コンディショニング養生後ＣＲ１に移植されたＡＭＬ患者における非 瀉下骨髄に対するマフォスファミド（ｍａｆｏｓｆａｍｉｄｅ）瀉下骨髄の優れ た結果を示した（１５９）。 ＢＭからの腫瘍細胞の選択的除去のためのＭ　ｏ　Ａ、　ｂの使用は、もう一つ のアプローチであり、いくつかのグループが、Ａ　Ｍ　Ｌを持つ患者からの白血 病細胞をも認識し得る骨髄性細胞上に表現された抗原と反応性のＭ　ｏ　Ａ　ｂ の生成を報告していた（１６０〜１６３）。 これらＭ　ｏ　Ａ　ｂのいくつかは、また、Ａ　Ｍ　Ｌの治療における瀉下プロ トコールにも用いられてきており、白血病患者のためのＭ　ｏ　Ａｂおよび補体 処理骨髄が関与する試行が現在も行なわれている（１６４〜１６６）。 しかしながら、これらアプローチ（すなわち、化学療法および免疫療法）の双方 は、単独で使用されたとき、正常８Ｍ始原細胞に比較してクローン白血病細胞の 選択的死滅についての説得力のある証拠を示さなかった。シフロスフッアミド（ ＣＹ）活性誘導体くすなわち、４８Ｃおよびマフォスファミド）または他のアル キル化剤凰独もしくは異なる化学療法剤を用いた瀉下プロトコールは、骨髄性細 胞系と正常ＢＭ前厘体との間で差のある活性を示した（１６７〜１６９）が、白 血病患者からのＣＦＵ−ｉ、を試験したとき同じ結果は確認されておらず、臨床 学的研究がら見て、連続的に成長する細胞系について得られたデータは、予言的 なものでないことを示唆している。同様に、ＡＭＬ細胞細胞細胞表面抗原の表現 の研究は、表現型特徴は、その正常体と類似の方法で獲得されることを証明して いる（３２．　３３）、従って、白血病細胞に対して反応する特異的ＭｏＡｂは 、この手法の大きな障害である。加えて、ＣＦＬＩ−Ｌ上の抗原表現における異 買性は、いくつかの白血病細胞をして溶解を逃れさせ得た（１７４）。 現在の瀉下方法を改善するために、我々は、　２つの異なる瀉下方法を組み合わ せることによって自己骨髄から潜在白血病細胞を除去することを企画した。特に 、条割化学療法プロトコールを骨髄性細胞と広く反応性の２つのＭｏＡｂによる 補体媒介溶解と比較し、これと組み合わせた（抗ＣＤ３３および抗ＣＤ−１３） 。 第１の研究では正常ＢＭ回復率が報告されていないが、同様のアプローチ（すな わち、免疫化学療法）が、既に、Ｔ−ＡＬＬおよびバーキットリンパ腫細胞の瀉 下のために提案されており、単独処理に比較して腫瘍細胞死滅の有意の増加が提 供されている（１７５、１７６）。 ４８Ｃ＋ＶＰ−１６（それぞれ、　１１００ＡＬおよび５μｇ／ｍ１）瀉下プロ トコールは、ＨＬ−６０細胞に対して相乗活性を有し、正常ＢＭ前駆体に対し拮 抗作用を有することが証明されており（１６７）、メモリアル病院でＡＭＬおよ び非ホジキンリンパ腫患者の瀉下処理のために使用されている（１７７、１７８ ）、Ｍ１９５Ｍｏ、Ａ、ｂはＣＤ３３抗原を認識し、それが、研究された骨髄芽 球白血病のほとんどに表現されていることが見いだされた９Ｍ１．９５およびウ サギ補体は、クローン原性検定（すなわち、　１４日のＣＦＩＪ−ＧＭおよびＢ ＦＵ−Ｅ）においてコミットされた８Ｍ始原細胞のほとんど全てを除去し得たが 、負選択によって集められた初期芽細胞上に１２ｓＩ　Ｍ　！、　９５の結合が 見いだされなかった（１６０）、これらの観察は、ＡＭＬ細胞の大部分に陽性で あるが最初期の正常コロニー形成細胞にはそうではないＭ１９５の使用（単独ま たは抗ＣＤ　Ｉ　３ＭｏＡｂ、すなわちＦ２３との組合せ）を含むプロトコール に対し治療的有利性を示唆し得た。またＣＤ３３抗原と反応性である類似のＭＯ Ａｂ、ＭＹ９．　は、残存白血病細胞から、Ａ　Ｍ　Ｌ患者骨髄を瀉下するため に使用されてきた（１６６）。 我々の実験システムにおいて、ＨＬ−６０白血病細胞系クローン原性効率は、Ｍ １９５プラス４ＨＣ＋ＶＰ−１６との１時間のインキュベーション後、骨髄細胞 過剰の存在下で、４０グ以上減少したが、化学療法または免疫療法単独の処理は 、クローン原性腫瘍細胞にはより効果的でなかった。３０グの感受性レベルでの 同じ組合せプロトコールは、ＡＭＬを持つ８人の患者からのＣＦｔＪ−Ｌの完全 な根絶を生じた。Ｆ２３の添加は、ＨＬ−６０およびＣＦＵ−Ｌ細胞双方の除去 をさらに増加させることがなかったが、より低い濃度（才なわち、８０μＭ）の ４８Ｃは、前の研究（１６７）で見いだされた最適４８　Ｃ濃度（１００μＭ） のＨＬ−６０に対し同じ結果を示した。 免疫化学療法プロトコールでの正常骨髄のインキュベーション後、ＣＦＵ−ＧＭ およびＢＦＵ−Ｅは、半固体培地中で直接検定によりほとんどの実験において検 出できなかった。 しかしながら、検出できるＣＦＬＩ−ＧＭを含まない化学精製骨髄の注入は、移 植された患者における血液学的回復を示した（１７９）ので、この検定は、造血 再構成能を適切に予測させるものではない、それ故、初期幹細胞の生存度および より成熟した始原細胞をもたらす能力のより感受性の高い検定が必要である。最 近の実験的証拠は、１己更新性を有する初期造血性始原細胞は、ＣＤ３４抗原を 表現し、それらはより差のある骨髄性細胞から区別できることを示唆している（ １５２．１８０、１８１．）。 さらに、ＣＤ３４“細胞フラクションは、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ３３抗原の共 表現に従って明確は前駆体集団に分割できる（１．８１．）、アントリユースら は、最近、長期骨髄培養（ＬＴＭＣ）システムにおいてＣＤ３４＋、ＣＤ３３− 細胞集団のみがＣＦＵ−Ｃ生産を４週間持続させたが、両方の抗原を表現した細 胞はわずかなＣＦ　Ｕ　−ＣＬか生産しなかったことを実証している（１８２） 、ＣＤ３４＋細胞の重要性は、また、アビジン−ビオチン免疫吸着技術により単 離されたこれら細胞（お　致死的照射ヒトおよびヒトにおいてリンパ造血を復元 し得ることを示す研究によって強調されている（１８３．１８４）。 より最近、ジーナらは、高投与量化学療法およびｒ−Ｈｕ−ＧＭ−Ｃ３Ｆの１ｖ 投与後多くのＣＤ３４＋細胞が誘起されてガン患者の末梢血中を循環すること、 およびＣＤ３４←細胞フラクシヨンの富化は、　ミエロアブレイティブ化学療法 後正常造血を回復するための決定的なポイントであることを実証した（１８５） 、それ故、我々は、単一クローン性抗ＭＹＩＯ抗体でのパンニングによる陽性選 択後に集めた推定の造血性前駆体（ＣＤ３４＋、ＣＤ３３−）を節約するための 免疫化学療法処理の能力を評価することを試みた、マウス（１８６，１８７）お よびヒトモデル（１５４）における多能性ｔａ性前駆体の自己更新に特異的であ ることが示された短期懸濁培養システムを組み立て、ＩＬ３、　ＩＬｌ＋ＩＬ３ およびＭ。 ＣＭによる刺激後に、芽細胞のクローン原性効率の数の増加を評価した。我々の 結果は、免疫化学療法後日数１４０ＦＲ−ＧＭより早期の造血性始原細胞の回復 を実証した。特に、予備生成された供給層の不存在下でのＩＬＬおよびＩＬ３ま たはＭｏＣＭの双方を含有する培養は、多能性前駆体における顕著な増加を示し たが、単独で使用されたｒＬ３はより効果的でなかった。 最後に、多能性幹細胞に対する２つの異なる組合せプロトコール（８０μＭ対１ ００μＭで用いた４８Ｃ１これら双方はＨＬ−６０クローン原性効率阻害に間し て同じ結果を与えた）の効果を比較するために実験を行なった。４ＨＣの低い投 与（＝　造血性始原細胞区画のよりよい回復をもたらし、得られたデルタ値は、 初期弁細胞の最適の回復および刺激を確保するために異なる技術分用いたところ の正常８Ｍ使用について多くの一連の実験で観察された値（１５４，）に匹敵し た。 免疫化学療法および抗ＣＤ３４ＭｏＡｂでのバンニング後の白血病細胞の回復を 調べるためのさらなる実験が現在進行中である。加えて、ブレＣＦＵ−ＧＭ前駆 体を正確に定量化するために長期骨髄培養システムと我々の短期液体培養との比 較を行なっている。 要約すると、我々の結果は、Ｍ　ｏ　Ａ　ｂによる単サイクル補体媒介溶解と薬 理学的プロトコールの組合せは、白血病細胞に対する追加の腫瘍細胞死滅性を生 み出し得るが、同じ実験条件で、造血性前駆体は、実買的に節約されることを示 した。 反対に、我々の実験において　コミットされた造血性始原細胞の欠乏（お　ロー リ−ら（１８８）に従って、その臨床的適用からみて、我々の免疫薬理学的瀉下 方法の効力をほぼ完全に示唆していた。　ＩＬＬおよびＩＬ３の組合せに対する 初期８Ｍ始原細胞の応答性は２　また、　これらサイトカイニンとの自己骨髄の 予備インキュベーションは、　瀉下された骨髄の再注入後の遅延した造血性再構 成を増大させ得ることを示唆している。我々の実験室からの最近のデータは、長 期ＢＭ＠Ｍステム（４４）に於ける幹細胞ボールに悪影響を及ぼすことのない、 ｒＬｌおよびＩＬ３組合せ区画の使用を支持している。かくして、　４８Ｃ＋Ｖ Ｐ−１６およびＭ　ｏ　Ａ　ｂの使用は、自己移植から最小の残存白血病を瀉下 するための妥当なアプローチであるようである。 図面についての凡例。 にＬ４８Ｌ−６０細胞系に対する４つのプロトコールの細胞毒性活Ｌ　ＭｏＡ、 ｂ＋Ｃ処理は、　１サイクルの、　１／６（Ｖ／Ｖ）希釈での補体を伴う４０　 ｉｔ　ｇ　／　ｍ、　ｌのＭ２Ｏ３およびＦ２３を表わす、　４８Ｃ濃度は、単 独使用のときは、　１１００ｕである。８０μＭまたはｌｏ０μＭの４８ｃは、 薬を、Ｍ　ｏ　Ａ　ｂとともにまたはそれなしでＶＰ−１６に組み合わせたとき に同じ結果を与えた。 第１７図：ＣＦＵ−Ｌに対する４つのプロトコールの細胞毒性活化　詳細は、第 １６図の凡例手肌 ６　再注入のための患者の準備 急性骨髄性白血病の治療のために自己骨髄移植を受けている患者（Ｌ　再発によ りなお大きく失敗している。これＣｉ、ホストの不適切な準備または不適切な瀉 下によるものであり得る。我々は、急性骨髄性白血病細胞および初期骨髄性始原 細胞に対して特異的な細胞毒性単一クローン抗体を用いてこの療法の双方の点を 改善することを試みることを提案する。この試行で（Ｌ　我々は、先ず、患者の 状態調節を改善するために１３’ｒ−Ｍ２Ｏ３の安全性および効力を評価する。 ここで行なった。　”’Ｉ　−Ｍ　ｌ　９５によるフェーズＩ毒性および薬理学 的研究は、低い腫瘍負担の患者において　１．）１１−Ｍ２Ｏ３によってｍＣｉ 当り３〜５ｒａｄが骨髄に送られるであろうことを示唆している。すなわち、こ こで提案した試行では、我々は、順次高めた３つの照射レベルの１３ｒＩ−Ｍ　 １９５で付加的に２００．４００および６００　ｒａｄまで特異的に骨髄に送る ことを期待する。他の器官への照射は、有意であるべきでない。 Ｍ２Ｏ３は、骨髄を目指し、準備養生のために、ビスマスのような同位体または 白血病細胞が付着している細胞像でなく付近の正常および腫瘍性細胞をも死滅さ せる実験３　（上記）で述べた白血病細胞を死滅させるために用いられるオージ ェ電子発生器の代わりに、１３１　Ｔやｔｏｙのよ・うな長飛程同位体を担って いる。これ１Ｌ　新しい骨髄の注入を許容する。同時に。 それは、通常の養生の一部として与えられる化学療法または放射線療法を逃れ得 る残存腫瘍性細胞を死滅させる。 この準備養生（Ｌ　全ての同種間移植に、非造血性ガンに対してさえ有用である 。これは２　また自己移植にも有用である。 研　計および目的　これは、難治性または再発骨髄性白血病を持つ患者における 骨髄性白血病細胞に特異的な放射線標識単一クローン抗体の順次高められた投与 でのフェーズｒ研究である。安全性、毒性、薬理学、線量的および生物学的効果 が最小９人の患者で研究されるであろう。 −亘」η　再発した急性非リンパ球様白血病（ＡＮＬＬ）を持つ患者における放 射線標識単一クローン抗体Ｍ１９５の毒性を決定すること、放射線標識Ｍ１９５ の薬理学および線量計測を決定すること、ホスト応答　細胞応答および白血病応 答を含む、Ｍ２Ｏ３に対する生物学的応答を研究すること。 兄１亙孟１１１ Ａ　Ｎ　Ｌ　Ｌ　最良の現在の化学療法養生によるＡ　Ｎ　Ｌ　ｌ−における長 期生存部は、一般に、　２０％以下である（１９０）、再発した患者または誘導 化学療法で初めの試みを失敗した患者の生存率は、はるかに低い、自己または同 種間骨髄移植は。 生存率を向上させ得るが、小さなサブセットの患者においてに過ぎない（１９１ ）、を髄形成異常症候群または慢性単球性白血病にたいする効果的な治療法はな く、これらの病気において長期生存は稀である。慢性の前傾性白血病（ＣＭＬ） を持つ患者の中で、同種間骨髄移植のみが生存にインパクトを与えた（１．９２ ）。 単一クローン　療法　未標識抗体造血性新生物を用いていくつかの試験的試行が 行なわれた（１９３で１／ビユーされている）、毒性は許容できるものであり、 応答も見られたが。 それらほとんどいつも一時的なものであった。独創的な試みは、いずれも、内因 性細胞毒性能を有する抗体を使用しておらず、応答は、おそらく、エフェクター 機能、抗原転形およびヒト抗マウス１ｇ応答の欠落によって消失した。放射性同 位体標識単一クローン抗体を用いたより最近の試みｉＬ　高い主要応答を達成し た。これらの試みは、Ｔ細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、および結節性リ ンパ腫に対する１）Ｉ■標識単一クローン抗体の大量投与を利用していた。主要 な悪性反応ｉＬ　高い放射線投与に関係］、で、血液病学的であった。 Ｔ細胞リンパ腫およびＣＬＬを用いた試みにおいて、穏解期は短かった。結節性 リンパ腫の試みにおける長期間の結果を知るには短かすぎる。ＡＮＬＬを持つ患 者については、単一クローン抗体の研究は完了していないが、３人の患者が最小 応答および毒性をもって抗体のカクテルで処置された（１９６）、これら抗体は 、Ｍ２Ｏ３が認識するものとは異なる抗原標的を認識した。抗体の大量投与（数 百ｍｇまで）にもがかわらず、芽細胞のカウントは、　３人の患者各二おいてほ んのわずか抑制された。３人の患者は全て熱を持ち、　１人は、注入によりじん ま疹を有したが、抗体は高度に精製されなかった。我々ζ戴　ユニで、　０１な いし１００ｍｇにわたる投与で単一クローン抗体○ＫＢ７またはＲ２４で処置し た、Ｂ−ＮＨＬ、ホジキンス病およびＴ−Ｎｌ（Ｌを持つ３０人の患者において 最小の毒性を観察している。 Ｍ２Ｏ３マウス凰−クローン抗体Ｍ１９５は、　スローンーケッタリング・イン スティヂュートで開発されたＩｇＧ２ａであり（１９６，１９７）、ＡＮＬＬを 持つ患者からの芽細胞の試料の６０〜７０％と反応する。Ｍ２Ｏ３は、　また、 初期骨髄性細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）およびいくつかの単球に結合するが、最初期の 骨髄性始原細胞には結合しない、標的抗原は、他のいずれの造血性または非造血 性組織上にも表現されない、同じ蛋白（ＣＤ３３）上の関連抗原に対する抗体Ｍ ｙ９およびＬ４Ｆ３は、自己輸血までにＡ　Ｎ　Ｌ　Ｌの骨髄を瀉下するために 現在用いられつつある（１９９、２００）、Ｍ２Ｏ３は、結合後急速に細胞中に 内在化し、この効果は、放射性金属、放射性ヨウ素もしくは複合化トキシンの細 胞中への輸送を向上させることができる（２０１）、Ｍ２Ｏ３は、ウサギもしく はモルモット補端で白血病細胞を死滅させ得るが、インビトロでのヒト補体また はヒト抗体依存性細胞性細胞毒性の使用によるものでない、インビトロでのこれ ら媒介物の活性化（Ｌ　インビボでのこれら効果と関連付けられている（２ｏ２ ）が、インビトロでの効果の欠落が、インビボでの効果の欠落を予測するかどう かは知られていない、Ｍ２Ｏ３は、初期骨髄性細胞とも反応するので　正常骨髄 始原細胞もまた影響され得る。 ヒトにおけるＭ２Ｏ３の研タ　ヒトにおける放射標識Ｍ１９５の毒性、生体分布 、薬理学および線量計測を決定するために、ＡＮＬＬを持つ患者を含む試験的試 みを、　ＩＲＢの承認（＃８９〜１１３Ａ（１））の下で、　１９８９年にメモ リアル病院で開始した。 骨髄性白血病を持つ患者を、フェーズ１試行において、骨髄性白血病芽細胞およ び初期造血性始原細胞上に見いだせる糖蛋白であり、ＣＤ３３と反応性のマウス 単一クローン抗体Ｍ１９５の順次固められた投与量で処理した。Ｍ１９５！Ｌ一 連の血液および骨髄の採取並びに全身のガンマカメラ映像により詳細な薬動力学 的および線量計測的研究ができるように、ヨウ素１３１で追跡標識した。　１． ５ｍｇから１９ｍｇに渡る個々の投与および６ｍｇないし７６ｍｇの合計投与を 毒性がなく安全に投与した。平均血清半寿命は５２時間であり、全体の半寿命は ５３時間であった０分布の体積は、血液の体積よりもやや大きかった。標的への Ｍ２Ｏ３のインビボ吸収は、生検、薬理学、フロー血球計算および映像により実 証し、利用可能な部位の飽和は、　５　ｍ　ｇ　／　ｍ　２またはそれ以上の投 与で生じた。全骨髄は、注入後の時間内に開始して特定的に、明瞭に映像化した 。骨髄における結合部位の飽和後は過剰の”’Ｉ−Ｍ１９５は血管中で見えたの で、最適の映像化は、最低投与レベルで生じた。骨髄生検は、全患者において、 注入の１時間後という早い時期にＭ２Ｏ３の有意の吸収があることを実証した。 　５　ｒｎ　ｇ　／　ｍ　２の投与レベルで、評価された合計骨髄吸収は、注入 投与の大部分を説明した。　１人の患者で毒性が見いだされたが、二の患者は骨 髄の全領域において激しい骨髄痛を受けていた。急性前骨髄性白血病および散在 した訳管内凝固を持つ１人の患者を含む、　１０人の内の８人においてフィブリ ノーゲンレベルが３０ないし６０％増加したことを除いて、生物学的、血液学的 または生化学的効果は、見られなかった。薬理学、映像化および生検に基づ＜Ｍ ＩＲＤ線量計測１１　”’　Ｉ　−Ｍ　ｌ　９５について、見積の０．３３ない し１．０ｒａｄ／ｍＣｉが全身に送られ、　１，１ないし６　、　’１　ｒａｄ ／ｍＣｉが血漿に送られ、および４ないし３４ｒａｄ／ｍｃｉが赤色骨髄区画に 送られたであろうことを証明した。フロー血球計算および放射性免疫検定分析は 、標的細胞中に内在化されつつある結合ＩｇＧの７０％までにより”ｉ　−Ｍ　 １９５が急速に変調されたことを示した。生検データおよび白血病細胞中への放 射線標識の内在化に基づくミクロ線量計測評価は、全身への照射投与が取るに足 らないもので、　ＩＭｅＶまでの、１２１ｒを持つ標的細胞核への移送が可能で あったことを証明した。　これらデータは、順次高められた同位体投与により、 ”’Ｉ−Ｍ１９５の全骨髄剥踵性（ａｂｌａｔｉｖｅ）投与が安全カッ容易に達 成できたこと、および”３Ｉ−Ｍ２Ｏ３の白血病特異的瀉下投与が可能であるこ とを示している。さらに、骨髄への急速で特異的な定量的移送およびインビボで のＭ２Ｏ３の標的細胞への効率的な内在化故に、アルファ発生器のような他の同 位体、　トキシン、または他の生物学的に重要な分子の、白血病細胞または正常 造血性始原細胞への移送も可能である。 旦１．の微線量計１ｆＪＪ Ｍ１９５ｍＡｂの白血病細胞表面への局在化および後の細胞質への導入はこの状 態を作り出す特性を有する放射線核種の選択の機会を与える。細胞径程度（１０ −２０ミクロン）の範囲のエレクトロン放出は細胞（２０３）内にそのエネルギ ーの大部分をさせる。エレクトロン捕捉（Ｅ　Ｃ）は崩壊モードであり、このよ うな低いエネルギー放出の大部分を生じさせる。ＥＣにより崩壊するヨードのア イソトープとしては１、−１２５　（Ｔ−１／２＝６０ｄ）およびｌ−１２３（ Ｔ−１、／２−１４ｈ）かある。この後者のものは、予想される生物的フレアラ ンス時間に符合する物理的半減期の点で有利である。微線量計測の観点からは、 直径１０〜１２ミクロン程度の細胞において、！　−１３１，より効果的である 。 しかし、適切な比活性、アイソトープ供給、重大な費用などの問題から、現時点 ては１２３Ｉの利用可能性は小さい。 ！３１　、も１崩壊当たり等量の低いエネルギー放出を生じさせ、技術的におよ び経済的に利用可能性が大きい。　Ｉ−Ｍ１９５を用いて、１．ＭｅＶ（役２５ ０ラド）までの標的細胞核への比線量が、１１０ｍＣｉ／ｍｇ　（Ｉ　Ｉ　ｇＧ 当たり１原子）で標よを付したＭ、　１９５の投与により達成し得ると判断した 。 同し投与レベルで、身体全体の放射線量は約７０〜１１０ラドであり、プラズマ 線量は２２０〜６６０ラドである。骨髄線量は見積ることが困難であるが、特に 骨髄が含まれる場合はプラズマ線量の２ないし１０倍であろう。上述のように標 的細胞中での付加的τ−ゲフラノクス（ａｕｇｅ　ｆｌｕｘ）の存在のため、正 常の骨髄細胞に対するよりも白血病細胞への照射を５０％余計に得ることができ る。正常細胞対白血病細胞の比感度については知られていない。 線量に対する制限 線量制限を受ける非造血器官は肝臓であろう。或患者においては４ラド／ｒｎＣ ｉまでの放射線を受けることがあるので、５００ｍＣ１（肝臓に対し合計２００ ０ラド）は予想される終点である。 血液学的線量制限は、これより小さいものと思われる。なぜならば第１段階試験 の状態にある患者において、骨髄中に可なりの量の１３’Ｉ−Ｍ１９５の蓄積見 られた。これは通常、２−６ラド／ｍＣｉの範囲であるのに対し、１０ラド／ｍ Ｃ１以上の線量を受けるものと思われる。すなわち、線量制限血液学的毒性は２ ００ｍＣ１注入線量の範囲に達しているものと思われる。なぜならば、骨髄線量 計Ｍｊは未だ予測できないが、完全な骨髄機能破壊が生じている可能性もある。 も者選択 最小９人の患者を治療する。 適格性 １、急性非リンパ様白血病（ＡＮＬＬ）、髄性白血病芽細胞または加速段階にあ る慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ、ＭＢＬ）、または加速段階にある慢性骨髄単球白 血病（ＣＭＭＯＬ）をもった患者で、従来の治療からぶり返した者または従来の 治療で直らない者で、かつ他の骨髄移植プロトコルに適さない者が適格性を有す る。 ２、白血病芽細胞は、Ｍ１９５抗原表徴に対して陽性でなければならない（フロ ー血球計算による２５％以上の陽性細胞）。 ３、患者は治療前少なくとも４週間、化学療法（ヒドロキシ尿素）および放射線 療法から解放されていなければならない。 ヒドロキシ尿素は、安定なまたは上昇ＷＢＣカウント用い、この試験前少なくと も２日停止していなければならない。 ４、患者は眉療ののち少なくとも６週間生存することが予測されなければならな い。 ５、＠者はカルノフスキー（Ｋａｒｎｏｆｓｋｙ）遂行状態が６０％以上でなけ ればならない。 ６、血清クレアチンが２ｍｇ／１００ｍ１未満、血清ビリルビンが２ｍｇ／１０ ０ｍ１未満、プロトロンビン時間が１゜３×対照未満でなくてはならない。 ７、この研究に？加することについての告知同意書にサインしなければならない 。 除外 １、臨床的に顕著な心臓病（二ニーヨーク・）＼−ト・アソン工−ン３ン、クラ スＩＩＩまたはＩＶ）。 ２、アンホテリンンを必要とする重大な感染、冶ｉ１０口以内の陽性血液培養、 く９０胞和または活発な病状を示すＣＸＲを有する肺病、または他の重大な病気 。 ３．１６才未満の者（なぜならば、若年の患者についての薬理学的データを段階 ■試験８８９−１１３から１’４ていないから）。 ４、抗マウス１ｇ応答か存在する場合の前マウス単一クローン抗体治療。 ５、活発なＣＮＳ白血病、頭蓋神経症。 ６、妊娠または授乳期の婦人。 ７、最近のＣＮＳ出血。 ８、合併症が予想される公知のＨＩ　Ｖ感染。 ハイブリドーマ腹水をプリスティン（ｐｒｉｓｔａｎｅ）処理および照射したマ ウスを用いて製造した。高い力価の腹水バッチのみを精製のために溜めた。無細 胞流体を溜め、精製のために濃縮してもよい。 腹水および上澄液をネズミウイルス（ＭＡＰ、ＭＳ６Ｖ。 Ｅ　ｄ　Ｉ　Ｍ、胸腺ウィルス、ＬＤＨ，、ＭｕＬＶ　（完全）ＬＣＭ）につい て試験した。これらの試験で陰性の腹水のみを精製のために溜めた。 １００．０００ｇで超遠心分離によりリポたんばくを除去し、クロマトグラフィ により分画し、およびたんばくＡに対するアフィニテークロマトグラフィにより 腹水からＭ１９５を精製した。 精製したＭ１９５はＤＮＡの不存在について試験し、電気泳動、ＨＰＬＣ、ラベ リング特性、滴定量について特徴づけ精製したＭ１９５を、ラビットにおける発 熱性評価、内毒素についてのリムルス評価、小動物における滅菌テストおよび一 般的安全テストを含む安全試験に供した。 純度および上記の安全基準を満足したＭ１９５のパンチのみをこの提案された研 究に用いた。 放射性核種でのラベリング ２ｍｇのＭ１９５を無菌無発熱因子法によりヨード−１３１でラベリングした。 純粋な抗体は排除クロマトグラフィにより分離した。ラベリングされていない抗 体はのちに加えられ全抗体量を２　ｍ　ｇ／　ｍ“とした。 治療計画 患者は単一部屋に入れられ、治療前１晩、１５０ｃｃ／時間の割合で与えられ、 治療の少なくとも１２時間前がらアロプリノール３００ｍｇＴＩＤの日経投与が 始められた。アロプリノールの投与は１週間で中止された。抗体治療（もし可能 であれば）の前５日にはルゴール溶液による処置が始まり、抗体治療後７日間続 けられた。４００ｍｇの過塩素酸カリウムポウピッド（ｐＯｂｉｄ）が抗体治療 の前の日に始められ合計４日間続けられた。 〜１１９５の投与 ３人の患者をそれぞれの線量レベルで治療した。すなわち、３つのアイソトープ 線量レベル：　５０ｍＣｉ／ｍ”　、７０ｍＣｉ／ｍ”　、９０ｍＣｉ／ｍ”が それぞれ２５ｍＣ１／ｍ−１３５ｍＣｉ／ｍ”　、４５ｍＣｉ／ｍ２に２つに分 けて与えられた。患者は第１日月および第３日日に治療した。Ｍ　ｉ　９５は５ （１ｍｌの食塩水１５％ヒト血清アルブミンを用い２０分に亘り輸液した。アイ ソトープ線量および比活性は段階的に治療の開始６週間で・け髄芽細胞を５０％ 以上除去された。患者は同じスケジュールで再び治療かなされた。ＨＡＭＡ＋、 患者は再治療に対し適格性を存する。 放射線安全協会により離れても安全と認められるまで、患者は単一の部屋で隔離 、治療を受けた。 １、経歴および身体検査。 ２、完全な血液計数、プロトロンビン時間、部分的トロンボプラスチン時間、血 漿計数、トロンビン時間、フィブリノーゲン、コアギニラグラム。 ３、生化学的スクリーニングプロフィール、電解質。 ４゜血清クレアチン。 ５、顕微鏡検査を含む尿検査。 ６、Ｍｌ、９５抗原を循環するための血清。 ′７．１２−鉛心電図。 ８、胸部Ｘ−線。 ９、形態学のための骨髄吸引液、芽細胞計数および細胞遺伝学（もし、以前にな されていない場合）。 １０、予備処理ヒト抗マウス１ｇ応答の分析のための血清サンプル。 １１、生存徴候（脈搏、血圧、呼吸数、体温）。 １２、骨髄およびＴ、Ｂ、骨髄性マーカーおよびＭ１９５についでの血液単一核 セルのフロー血球数分析。 １３、甲状腺機能テスト。 １４、細胞充実度についての骨髄コア生体組織検査。 治療後の評価 １、治療前、〜１１９５の注入の間３０分ごと、注入後３０分、６０分、その後 ４時間に亘り１時間ごとに、生存徴候（脈搏、血圧、呼吸数、体温）をモニター し、記録した。実験の１週間２００ｍ１の血液を採血した。 ２、以下のその他のテストを行った。 テスト　タイミング 身体検査および、　ｇｄ、治療の間 機能状態 ＣＢＣ，較差、血小板　Ｍ１９５冶療ののち６時間、ついで、ｇｄＸ６日、つい で指示 通り ＰＴ、ＰＴＴ、フィブリ　治療ののち６時間、ついて、ｇノーゲン　ｄＸ６日、 ついで１週間ごと尿検査　毎日×６日 電解質、ＢＵＮＳ　Ｍ１９５冶療ののち６時間、１クレアチン、Ｐｈｏｓ、　２ 時間、ついで、ｇｄＸ６日Ｃａ、尿酸 ヒト抗マウスＩｇ　治療ののち８日間、Ｑ４週間治療後×２、ついでｑ８週間（ Ｅ Ｏ８まで） 細胞充実度についての　９日目 骨髄生体組織検査 末梢血管のフロー血球数　４−６日目 分析 形態学のための骨髄吸引　９日目、ついでＱ１４ｄ液、芽細胞計数、ガンマ　１ −４日月 −カメラ像（核薬剤） 甲状腺機能テスト　３か月、１年。 特別研究 血液放射能活性レベルを上述の時間間隔でサンプルをテストすることにより得、 定量的放射能活性減衰曲線を調べた。 上記時間で血液細胞を得、抗原の徴候、マウスイムノグロブリンの存在、アイソ トープおよび白血病細胞表現型の定量などを測定した。 Ｇｅｍ１ｎｉスキャ六−を用い、全身のイメージングを行い、全身、肝臓、ひ蔵 、その他の主な器官の線量計測を治療の間毎日行った。その他のイメージングも 必要であるがもし試料収集：血液１ｍｌを５．１０．１５．３０．４５．６０． １２０．２４０．３６０．４８０分後にそれぞれ採血し、事前、事後輸液を２日 間行った。 Ｍ１９５血清レベルは、”ダブル−抗体サンドウィッチ”法を用い、　■および ＥＬＩＳＡ評価法により判定した。 各血清サンプルについてこの評価を行った。予備処理血清を陰性対照として用い た。標準曲線は、患者の予備治療血清に稀釈したｍＡ、ｂの既知の濃度を用いて 作成した。この評価法により、２０ｎｇ／ｍｌの程度まで抗体濃度を検出するこ とができる。 採血された血液全量は、入院時は標準採血血液を含め５０ｍ１未満であり、１８ 目は８０ｍ１未満であり、その後は１２０ｍ１未満であった。 輸液後、直接ＲＩＡを用い、選ばれた血清をＭ１９５活性の存否についてテスト した。 ヒト抗マウスｒｇ応答 Ｍ１９５塗布マイクロ滴定プレートに結合するイムノグロブリンの存在について ＥＬＩＳＡ法を用い、患者の血清を評骨髄および末梢血液単一核細胞を、血液数 計側法により、Ｍ１９５結着および他のマーカーについて分析した。２４時間で の血液中の抗原の変調をテストした。これらの試料は氷上に保存する必要がある 。 評価可能であるための基準 毒性について・ ＭＴＤ５を少なくとも１投与与えられた患者は毒性について評価の対象となる。 治療応答： ＭＴＤ５を少なくと６２投与与えられた患者は治療応答について評価の対象とな る。 評価不可であるための基準 以下の理由により特定のも者は評価不可である。 １、毒性または腫瘍進行以外の理由によりプロトコールに合わずに拒絶される。 ２、薬剤または腫瘍に関連しない原因による死。 ３、継続評価または治療に戻ることができない。 毒性 毒性は、ＩＲＢにファイルされているＮＣＩにより開発された毒性基準に沿って 判定された。 抗体注入の間の毒性 もし、グレート１−１１の毒性が生じたときは、同じ投与量およびスケジュール で治療を継続することができる。 もし、グレートＩＩＩの毒性が生じたときは、ＭＴＤ５の注入を当初のらのから ５０％減少させるなどして、治療の継続は試験官の判断に一任される。もし、グ レートＩＩＩの毒性が継続したり、再び生じたときは、再治療を５０％減少投与 量で継続される。もし、グレートＩＩＩの毒性がこの低い投与量で解消されない 場合は、治療を中止し、患者は実験の対象から外される。 他の毒性 最大許容投与ｆｉ　（ＭＴＤ）は、３人の患者の内、２人がその投与量でグレー トＩＩＩ以上の非血液学毒性を示したときとする。もし、これが投与レベル２で 生じたときは、さらに３人の患者が投与レベル１で治療される。もし、これが投 与レベル３で生じたときは、さらに１人の患者が投与レベル２で治療される。も し、これが投与レベル１で生じたときは、さらに３人の患者が投与レベル１の半 分で治療される。 血液学的ＭＴＤ ５週間後において、３人の患者の内、２人がＷＢＣ（正常または白血病）に戻る ことができないときは、ＭＴＤであると考えられる。そして上記同様に患者が付 加的に試験される。 ＭＴＤ５の全ての投与がなされたのちに芽細胞が増加した患者、または病状の新 たな進行が認められた患者は実験の対象から外される。この場合、他の治療がな される。もし、白血病がＭＴＤ５の投与後４週間、安定している場合は、患者は ＠瘍の進行が認められるまで実験が継続される。 実験から除外されるための基準 以下の理由により輸液が中止される。 Ａ、収縮期の血圧が２５ｍｍＨｇ以上低下したとき。 Ｂ、呼吸困難。 Ｃ１脈搏が１３０／分を超えたとき。 Ｄ１体温が３９度を超えたとき。 Ｅ、医師の判断で認められたとき。 Ｆ、患者の要望かあったとき。 芽細胞５％未満の正常骨髄が達成された患者で、ＨＧＢが９ｇｍ％を超え、ＷＢ Ｃが３，０００を超え、血小板が１０ｏ、ｏｏｏを超えたもの。 部分的病状減少 芽細胞５−１０％の正常骨髄が達成された患者で、末梢血管の血液数において、 ＨＧＢが９ｇｍ％を超え、ＷＢＣが３゜０００を超え、血小板が１００，０００ を超えたもの。 僅かな応答および安定した病状 薬剤誘起による骨髄形成不全が記録されたけれど、これは治療効果とは思われな い。完全または部分的病状減少を達成されない患者は治療上の失敗に数えられた 。 統計的考察 これは毒性情報、薬力学的および放射免疫局在化が得られた第１段階の研究であ る。ｍＡｂを用いた他の研究では、ｍＡｂの薬力学性において患者ごとにばらつ きが見られた。この研究の目的は異なる投与量レベルで治療を受けた患者のグル ープ間の統計的違いまたは腫瘍の応答性についての違いを証明することではない 。 同時薬物治療 必要ないかなる非細胞毒性、非化学療法をも患者の管理について許される。白血 病細胞の殺りく変形に効果的なものとして知られているいかなる治療の使用も患 者のこの実験からの終了を生じさせる１つの理由となる。 若年者の同意 この実験は子供に対して少なからずの危険（連邦規則第４６部門、コード４６． ４０４−４５）を伴う。したがって、この実験に入る前に若年者の同意を取る必 要がある。 実験７：造血細胞への遺伝子情報の導入状々は先に、特定の細胞に生理学的に重 要な物質を導入するキャリアとしてのＭ１９５の特異な特徴を示した。実験１お よび２において、ヒト白血病細胞および正常造血先祖細胞への結合特異性を示し た。実験３において、Ｍ１９５の結合につづく抗体の内在化、およびヨード−１ ２５などのアイソトープまたは中にアイソトープを持ったキレート化剤の抗体へ の付着を示した。 さらに我々は、超可変性区域を含むＭ１９５の一部が内在化に有効であることを 示した。実験４において、我々は内在化か生きた患者の中で容易に達成しうろこ とも示した。Ｍ１９５は静脈内注射を行うことができ、骨髄または血液の特定の 細胞に目標を定めることができ、これらの細胞に内在化して結合しうろことも示 した。したかって、他の重要な物質もＭ１９５で目標を定めたのち特定の造血細 胞に内在化し得るかも知れない。これは体外で行うこと（再輸液の前の骨髄培養 のように）、および生体内で行うことができる。 導入のための最も重要な物質の１一つは遺伝子情報または遺伝子である。遺伝子 を包み込む最も効果的な方法はレトロウィルスベクトルの形にすることである。 これは当業者に公知の方法で容易に作成することかできる（２０４−２０６）。 これらの遺伝子包み込み法は５年以上以前から知られている。最も重要な遺伝子 の幾つかは造血細胞または造血細胞を含むたんばくを規制し生成させるものであ る。造血細胞中の不良遺伝子が多数の人々を煩わす病気の原因となっている。 これらの病気の内には、鎌状赤血球血症、地中海貧血、白血病、を髄形成異常症 などがあることが知られている（２０７）。造血細胞遺伝子はそのため、研究の 焦点となっており、遺伝子をマウスやヒト造血細胞に導入する方法が提案されて いる（２０８−２１０）。この最後の研究として、地中海貧血のマウスモデルが 細菌ラインに新しい遺伝子を導入することにより集められた。 遺伝子治療の必要性は明らかであり、のちに衰微しうる遺伝子を包み込む方法は 公知であり、レトロウィルスベクトルを用い遺伝子を細胞中に導入することも公 知である。しかし、造血先祖細胞に造血遺伝子を運び込むレトロウィルスベクト ルを特定の目標に向ける方法が欠けている。Ｍ１９５はこれらの細胞（ＣＦＵ− ＧＭ、ＣＦＵ−ＧＥＭＵＲ，ＢＦＵ−Ｅとしても知られている）に対し特異性を 有することから、この機能に役立つ。このＭ１９５１９５μトロウィルスベクト ルの外側に結合させ、このベクトルを適当な細胞に向かわせ、そこに遺伝子を含 むベクトル等をこの細胞内に内在化させる。 抗体をウィルスに結合させる方法は公知である（２１１）。 同様の方法でＭ　１．９５をウサギ抗−マウスＩｇＧブリッヂを用いてこのベク トルに結合させることができる。このウサギ抗−マウスＩｇＧブリッヂはレトロ ウィルスベクトル表面たんばくに結合するモノクローン抗体に連結される（図１ ９）。 Ｍ１９５を製造、精製する方法は実験１および２に記載されている。レトロウィ ルスベクトル表面たんばくに対するモノクローン抗体の製造方法は１０年以前か ら知られている（２１２）。２つのモノクローン抗体を一緒に連結するのに用い られるマウスモノクローン抗体に対するウサギポリクローン抗体は市販されてい る（丁ＡＧＯ，ＤＡＫＯ１ＳＩＧＭＡ）。 赤血球表面にブリッジ状に３つの抗体を連結させるのと同様の方法（２１３）で ３つの抗体がウィルスに連結される。 この方法において、！ノトロウイルスに対するモノクローン抗体が４℃で１時間 、レトロウィルスとともに過剰の抗体存在下（５０−１００μｇ／ｍｌ抗体）で 培養される。結合されない抗体はウィルスの超遠心分離によりサツクロースクシ ンヨン上に除かれる。過剰のウサギ抗体がついで同様にレトロウィルスで塗布さ れたモノクローン抗体とともに培養され、ついで超遠心分離により結合されない ウサギ抗体が除かれる。 最後にＭ１９５が５０−１００μｇ／ｍｌの割合で加えられ、上記同様に培養さ れ、洗浄される。その結果得られる構造体は図１９に示すようなブリッヂを有す る。Ｍ１９５が造血先祖細胞に対し特異性を有するから、このウィルスを造血先 祖細胞にのみ結合させる。Ｍ１９５の内在化に対する特異な特徴のため、このベ クトルが目標細胞にもたらされる。この方法はＭ１９５−ベクトル構造体を正常 のヒト骨髄と体外で混合し、ついで骨髄を再輸液するか、この構造体を静脈を介 して輸液することにより行われる。同様に遺伝子を白血病細胞のような腫瘍性の 細胞に送り込み、抗−腫瘍遺伝子、抑圧遺伝子、その他の機能を変えるかも知れ ない遺伝子を挿入してもよい。 Ｍ１９５をレトロウィルスに付着させる他の方法、例えばレトロウィルス表面た んばくに遺伝子学的に付着されたり、Ｍ１９５をレトロウィルス表面にあるシャ ツ（ｓｈａｐｈ）ＡたんばくＡに連結したり、Ｍ１９５をウィルスコートに化学 的に付着する方法を採用してもよい（図１８）。 実験８ニヒト抗体 Ｍ１９５１９５μ果は上述の通りである。しかし、これはマウス誘導抗体である ため患者に与えられたとき異物として認められ免疫抗原反応を生じさせるなどの 悪影響をもたらすおそれもある。このため、マウス抗体をヒトのもので置換しヒ ト化（ｈｕｍａｎ　ｉ　ｚ　ｅ）Ｌ、Ｍ１９５１９５μる免疫抗原反応を減少さ せる必要がある。公知の遺伝子技術がこれらの変換に利用される。 このヒト化は種々のレベルでおこなうことができる。例えば抗体のマウス定常区 域をヒト定常区域で置き換えてもよい（２１４−２１６）。これにより抗原に結 合する区域を完全に触れないで残すことができる。すなわち、抗体の結合能力を 存続させることができる。さらに−歩進めて、マウス抗体のＣＤＲシーケンスを 含む抗体をヒト抗体に移植させてもよい（２１７−２１９）。さらに、コンピュ ータモデリング技術を利用してアミノ酸単位レベルで可変結合区域に役割を果た すアミノ酸と、果たさないアミノ酸と識別することも可能である（ＭｉｃｒｏＧ ｅｎｉｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ＡｎａＩｙｓｉｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ、　Ｂｅｃ ｋｍａｎ；　Ｅｎｃａｄ；　Ｍｉｄａｓ）。この方法を用い、所望の結合レベル を保持する最良のヒト化シーケンスを判定することができる。これにより、シー ケンサ−から所望のシーケンスを持つポリペプチドを生成させることができる。 キメラＭ１９５ キメラモノクローン抗体（ｍＡｂ）Ｍ１９５−Ｉ　ｇＧｌおよびＭ１９５−Ｉ　 ｇＧ３　（ＰＤＬにより製造）はＭＳＫＣＣにおける増血ガン免疫化学研究所で テストした。双方のキメラｍＡｂを形成するハイブリドーマが借地で良好に成育 され、ｍＡｂ、１ｍｌ当たり約５μｇ製造された。双方のｍＡｂは５０％中性硫 酸アンモニューム析出により精製され、ついでたんばくＡセファロースを用いた アフィニテークロマトグラフィにより処理された。スキャチャード分析によりテ ストされた双方のｍＡｂの親和性は元のマウスＭ１９５のものと同様であった（ 約１０９Ｌ／Ｍ）。マウスＭ１９５はキメラＭ１９５の結合について競合した。 キメラＩｇ１．Ｍ１９５はヌードマウス、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃ７ウス、ＣＢ ｙＦ１７ウスに成育させることもできる。この場合、腹水が１ｍｌ当たり約１ｍ ｇのｍＡｂを製造し、これがＢと同様に精製される。双方のキメラｍＡｂは高い 特異活性を有すべく１２５ヨードで放射能ラベルが付される。双方のｍＡｂは目 標白血病細胞に内在化される。双方のキメラｍＡｂは目標骨髄性白血病細胞に特 異的に結合する。双方のキメラｍ　Ａ、　ｂはウサギ補体を活性化し１μｇ／ｍ １未満のｍＡｂ濃度で目標骨髄性白血病細胞を破壊する。いずれのキメラｍＡｂ もヒト補体に対する有意な補体活性を示さない。双方のキメラｍＡ、ｂは１〜１ ０μｇ　／　ｍｌの濃度で目標骨髄性白血病細胞の細胞媒介破壊（ＡＤＣＣ）を 媒介し、２５−１００　：　１の目標割合を生じさせるエフエ双方のキメラＭ１ ９５ｍＡｂは当初のマウスＭ１９５のすべての特徴を保持し、これにさらにヒト 定常区域およびヒトＡＤＣＣ機能の特徴が加わる。 参考文献 Ｌ　Ｔａｎ１ｎｏｔｏ　Ｍ、５ｃｈａｉｎｂｅｒｑ　ＤＡ、Ｃｏｒｄｏｎ−Ｃａ ｒｄｏ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ。 Ｘａｔｕｋａｍｉａ　３：ココ９−３１８　（１９８９）。 ２、　Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ　ＤＡ、ｒａｎｉｗｔｏ　ｘ、ＭｃＫａｎｚｉｅ　 Ｓ、　ａｔ　ａｌ。 Ｌａωｃａｍｉａ　３：４４０−４４５　（１９８９）。 コ−Ｂａｒｎｓｔａｉｒ＋　より、Ｓ工ｎｇｔｒ　Ｊｉｍ、入ｎｄｒａｗｓｉ　 ＲＧ、ｅｔ　ａｌ、　：。 Ｃ１工ｎ、工ｎｖａｓｔ、　７９：工１５３−１１５９　（１９８７）。 ４、　Ｇｒｉｆｆｉｎ　ＪＤ、Ｌｉｎｃｈ　Ｄ、５ａｂｂａｔｈ　Ｋ、ｅｔ　ａ ｌ、　ＬｅｕｋｅｍｉａＲｅｓ、Ｉ：５２ｍ−５３４（１９８４）。 ５、　Ｄｉｖｇｉ　ＣＲ，Ｋ１ｎｎ１ｔｉ　ＪＧ、　Ｏｌｄ　ＴＪ、　５ｃｈｅ ｉｎｂｅｒｇ　ＤＡ、Ａｍｅｒ。 Ａ３５ｏｃ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　３０：　Ａｂｓ　１１６０６　（１９ ８９）。 ６、　Ｈｏｕｇｈｔｏｎ　ＡＮ、　Ｍｉｎｔｚａｒ　Ｄ、　Ｃａｒｄｏｎ−Ｃａ ｒｄｏ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ。 １’ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ入　Ａ２：１２４２−１２４６ 　（１９８５）。 ７、　Ｃ１ａｒｋｓｏｎ　ＢＤ、Ｇａｓ　ＴＳ、Ｍｔｒｔｅｌｓ−「ＤＲ，ａｔ 　ａｌ、（ＲＣｃｒ１ｔユｃａｌ　ｒｅＶｌ！＋＋／　ｉｎ　０ｎｃｏｌｏｃｙ ｙ／Ｈａｍａｔロエｏｇｙ　４：２２１−２４８（１９８６）。 ８、　Ｇａ１ｅ　ＲＰ、Ｉ（ｏｒｏｗｉｔｚ　ＭＩＭ、Ｂｉｇｇｓ　ＪＣ，ａｔ 　ａｌ、　Ｌａｎｃｅｔ８６４）：１１１９−１１２１　（１９８９）。 ９、　Ｃ１ａｒ）ｃｓｏｎ　ＢＤ、　Ｊ、Ｃ１１ｒ＋、０ｎｃｏｌ−３：ｌコ５ −１３９　（１９８５）。 １０、　Ｃｊ、ｖｉｎ　Ｃ−工−、Ｍｉｒｒｏ　Ｊ、ｒ　Ｂａｎｑｕａｒｉｇｏ 　に、Ｌ−、Ｂｌｏｏｄ　５７：８４２−８４５　（１９８１）。 １ニー　Ｇｒｉｆｆｅｎ　Ｊ−Ｄ−、Ｒｉｔｚ　Ｊ−、Ｎａｄ工ｅｒ　Ｌ−Ｍ− 、Ｓｃｈｌｏｓｇｍａｎ　Ｓ、Ｆ、。 ｙ、Ｃ１１ｎ−１ｎｖｅｓｔ　６ｍ：９３２−９４１　（１９８１）。 Ｌ２　、Ｐｔｒｕｓｓｉａ　Ｂ、　、　Ｔｒｉｃｈｉａｒｉ　ｃ＋、　Ｌｅｈｕ ｎＤ、　、　Ｊａｒｍｉａｗｉｃｚ　Ｊ、　。 Ｌａｎｇｅ　Ｂ、、　Ｒｏｖｅｒａ　Ｇ、Ｂｌｏｏｄ　Ｓ９：３Ｂ２−４９２　 （１９８２）。 １３、入ｎｄｒｅｗｓ　Ｒ，Ｇ、、Ｔｏｒｏｋ−５ｔｏｒｂ　Ｂ、、Ｂｅｒｎｓ ｔｅｉｎ　工、Ｄ、　Ｂｌｏｏｄ４２　：　１２４（コ２　（１９８コ）。 １４、にｒｉｆｆｉｎ　Ｊ、Ｄ、、Ｌｉｎｃｈ　Ｄ、、５ａｂｂａｔｈ　Ｋ、、 Ｌａｒｃａｍ　Ｐ、。 Ｓｃｈｌｏｓｇｍａｎ　Ｓ、Ｆ、　Ｌａｕｋ、Ｒａｓ、口：５２１−５１４　（ １９８４）。 １５、Ｃ１ｖｉｎ　Ｃ，工、、５ｔｒａｕｓｓ　Ｌ−Ｃ，、Ｂｒｏｖａｌｌ　Ｃ ，、Ｆａｅｋｌｅｒ　Ｍ−Ｊ、、Ｓｃｈｗａｒｔｚ　Ｊ、Ｆ、、５ｈａｐｅｒ　 Ｊ−Ｌ　Ｊ、工ｍｍｕｎｏ工。　工３３Ｌ１５７−１６５（１９８４）。 １６、Ｋａｔｚ　Ｆ、Ｅ、、Ｔｉｎｄｌａ　Ｒ，，５ｕｔｈｅｒｌａｎｄ　Ｄ、 Ｒ，、Ｇｒａａｖｅｓ　Ｍ、Ｆ。 Ｉａｕｋ、Ｒａｓ、９：１９１−４９８　（１９８５）＋１７、　入ｓｋｅｗ　 ｏ−ｓ、、Ｅａｖｅｓ　Ａ−Ｃ，、Ｔａｋａｉ　Ｆ、　Ｌ４！ｕｋ、Ｒａｓ、９ ：ｌコ５−１４５　（１９８５）。 １Ｂ、Ｆｅｒｒｅｒｏ　Ｄ、、Ｇｌｂ　ｂｉａｎａｌｌｉ　Ｍ、、Ｐｅ５ｉｃｈ ｌｅ　ｃ、、ＴＪｋｎｑｅ　Ｂ、。 Ｒｏｖａｒａ　Ｇ−Ｂｌｏｏｄ　６ｉ：９４６−５０２　（１９８５）。 １９、Ｄｒａｘｌｅｒ　Ｈ−Ｇ、、Ｓａｇａｗａ　Ｋ、、Ｍｅｎｏｎ　Ｍ、、Ｍ ｉｒ＋、ｏｗａｄａ　Ｊ。 Ｌａｕｊｃ、Ｒｅ５−　工Ｃ１：１７−２３　（１９８６）。 １９Ａ、Ｋａｔｚ　Ｆ−Ｅ、、Ｔｉｎｄｌｅ　Ｒ，，５ｕｔｈａｒｌａｎｄ　Ｄ −Ｒ，、Ｇａｒａｖｅｓ　Ｍ、Ｆ。 しれよ、Ｒｅｓ、９１：１９１（９Ｂ　（１９８５）。 ２０−　Ｐｅｎｇ　Ｒ，、ＡニーＫａｔｉｂ　人、、Ｋｎｏｗｌｅｓ　Ｄ−に− 、Ｌｕ　Ｌ、、ＢｏｒｘｍｅｙｅｒＨ，、Ｔｏ工ｉｄフ１ｉａｎ　Ｂ、、こｈｉ ａｏ　、７−Ｗ、Ｋｏｚｉｎｅｒ　Ｂ−、Ｗａａｑ　Ｃ−Ｙ。 Ｂｌｏｏｄ　Ａ４：１６９−１１７８　（１９８４）。 ２ｘ、Ｗｉｇｎｉｅｗｓｋｉ　ｏ、、Ｋｎｏｗｌｅｓ　Ｒ−、Ｗａｃｈｔｅｒ　 Ｍ、、５ｔｒｉｆｅ　Ａ、。 Ｃ１ａｒｋｓｏｎ　ａ、　Ｂｌｏｏｄ　６１４１９−４２９　（１９８７）。 ２２、５ｔｒｉｆ＠　入、、　Ｌａより（ｋ　Ｃ，、Ｗｉｓｎｉａｗｓｋｉ　Ｄ 、、　Ｇｕユａｔｉ　５．。 Ｇａａｓｏｎ　Ｊ、Ｃ，、にａｌｄ＊　Ｄ、Ｗ、、Ｗｅｅｔｓ　Ｋ、、Ｇａｂｒ ｉユｏｖｅ　Ｊ−Ｌ−ｒ（ｌａｒｋｘｏｒ＋　Ｂ、　Ｂｌｏｏｄ　６ｔ：１５０ ｓ（５２コ　（１９８７）。 ２１　Ｂａ１ｌ　Ｅ、Ｄ、、　Ｍｉｌｌｓ　Ｌ、］：、、　Ｃｏｕｇｈｌｉｎ　 Ｃ，τ−，Ｂｅｃｋ　Ｒ，、。 Ｃ０ｒｎＷｅｌｌ　Ｇ、Ｇ、　Ｂｌｏｏｄ　６１１コ１ニー１３１５　（１９８ ６）。 ２４、　Ｂａ１ｌ　Ｅ、Ｄ、、　ｂａｒｎｉａｒ　Ｇ−Ｍ、、Ｃｏｒｎｗａｌｌ 　Ｇ、Ｇ、、Ｍｃ工ｎｔｙｒｅＯ，Ｒ，、Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌ　Ｊ、？、、Ｆａｎ ｇａｒ　ａ、ｗ、　Ｂｌｏｏｄ　６２　：１２０コー１２１０（１９８コ）。 ２５、　Ｆｏｏｎ　Ｋ−人、、　τｏｄｄ　Ｒ，Ｆ−Ｂｌｏｏｄ　６Ｕ１−３１ 　（１９８６）。 ２６、入１ｖｅｙ　Ｐ−Ｌ、、Ｇｒｅａｖｅｓ　Ｋ、Ｆ、　Ｌ：５２７−５４０ 　（１９８７）。 ２７、Ｗｉ１ｍｏｎ％ｉ、Ｌｃ、、Ｗａｌｊｃｅｒ　工、Ｒ，，５ａｅｓｉｄ　 Ｎ、、ＭｃＢｒｉｄｅ　Ｊ、人。 Ｂｌｏｏｄ　４１：１コ５５−Ｌ３６２　（：Ｌ９８６）。 ２Ｌ　Ｇｒｉｆ？ｉｎ　：、Ｄ−、Ｌｉｎｃｈ　Ｄ−、５ａｂｂａｔｊｘ　Ｆ、 、シ１ｒｅａｕ　Ｐ、。 Ｓｃｈｌｏａｓｍａｎ　Ｓ、Ｆ、　Ｌａｕｋ　Ｒａｇ　Ｉ：５２１−５３４　（ ｘ９８４）。 ２９−　ＤｉＮ１ｄｏｒ＝　ｐ、入、、入ｎｄｒａｖｇ　Ｒ，Ｇ、、Ｂｅｎｊａ ｍｉｎ　Ｄ、、ＲｉｄｇｖａｙＤ−、Ｗｏｌｆ：　Ｌ−、Ｂｅｒｎｇｔｅｉｎ　 ニーＤ、　Ｂｌｏｏｄ　≦７：ユ０４８−：ＬＯ５］（１９８６）＋ コＯ−Ｐｅ５ｓａｎｏ　Ｓ、Ｐａｌｕｍｂｏ　入、Ｆａｒｒａｒｏ　Ｄ、、Ｐａ ｇｌｉａｒｄｉ　Ｇ、Ｌ、。 Ｂｏｔｔｔｒｏ　Ｌ、、Ｌａｉ　Ｓ、に、、Ｍ＠ｏ　Ｐ、、Ｃａｒｔｅｒ　Ｃ， 、Ｈｍｂｅ二１　Ｈｌ。 シｕｘｑ＊　Ｅ、、　Ｒｏｖａｒａ　Ｇ、Ｂｌｏｏｄ　４４：２７５−２８１　 （１９Ｂ４）。 コｌ　Ｇｒｉ？？ｉｎ　Ｊ、Ｄ、、ＭａＹｅｒ　Ｒ，，７，，１Ｊａｉｒｕｉｔ ａｉｎ　Ｈ，Ｊ、、Ｒｏｓｅｎ？−ｈａｉＤ＋５．、Ｃｏｒａｌ　Ｆ、Ｓ、、Ｂ ｅｖｅｎｄｑａ　Ｒ，Ｐ、、ＳＣｈｌｏｓｇｍａｎ　Ｓ、ＦＢｌｏｏｄ　ｇ２： ５５７−５６３　（１９８］）。 １２、　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｒｅ１ｊｄａｎ　ｋｌ、Ｊ−、Ｖａｎ　Ｒｈａｎａｎ 　Ｄ、Ｊ、、ＬａｎｓｄｃｒｐＰ−Ｍ、、Ｖａｒ＋’ｔ　Ｖｅｅｒ　Ｍ、Ｄ、、 Ｌａｎｇｅｎｈｕｉｊｓｅｎ　Ｍ、Ｍ、入−Ｃ，、Ｅｎｇａ工ｆｆ１ｒｉ＊ｔ　 Ｃ，Ｐ、、Ｖａｎ　ｄａｍ　Ｂｏｒｎｅ　入−Ｆ、Ｇ、に、　Ｂｌｏｏｄ≦１＝ ４４３−４４８　４１９８］）。 ３コ、　ＬＬＩＩＣｈ　Ｄ、Ｃ，、ＡＬｌｅｎ　ｃ、、Ｂｅｖｔｒｌａｙ　Ｐ、 Ｃ，Ｌ、、Ｂｙ′ｒＩｏｅ　Ａ、Ｇ、。 ５ｃｏｔ４＋　Ｃ−５，、Ｈｏｇｇ　Ｎ、　Ｂｌｏｏｄ　６コ：５６６−５７コ 　（１９８４）。 ３４、　Ｄｒ＊ｘｌｅｒ　Ｈ，Ｇ、、　ＭｌｎＯＷａｄａ　Ｊ、　ＬａｕＪｃ、 ＲａＳ、　ＬＯ：２７９−２９０（１９８６）。 コ５．　Ｂａｌユ　Ｅ、Ｏ−、Ｂａｒｎｘｅｒ　Ｇ、Ｍ−、Ｃ０ｒｎＷｅｌｌ　 Ｇ、Ｇ、、ＭＣ工ｎｔ’／ｒｅＯ，Ｒ，、Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌ　Ｊ、Ｆ、、Ｆａｎ ｇｅｒ　Ｍ、Ｗ、Ｂｌｏｏｄ　６２：１２０コ−１２ユ０（１９８３）。 ３６、　Ｂａ１ｌ　Ｅ−Ｄ、、　Ｍｉｌｌｓ　Ｌ−Ｅ、、　Ｃｏｕｇｈユｉｎ　 Ｃ，τ−，Ｂａｃｋ　Ｒ，。 Ｃｏｚｗｅｌｌ　Ｇ、Ｇ−Ｂｌｏｏｄ　６ａ：Ｄ工１−エコユ５　（１９８６） 。 コア、　Ｇｒｉ：？ｉｎ　Ｊ、Ｄ、、　Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ　Ｂ−Ｂｌｏｏｄ　 ４Ｌ１１８５−１１９５（ニー９８６）＋ ３Ｂ、　Ｌａｎｇｅ　Ｂ、、Ｆｅｒｒｅｒｏ　Ｄ−、Ｐｅ５ｓａｎｏ　Ｓ−、Ｐ ａｌｕｍｂｏ　λ−ｒ　ＦａｕｓｔＪ　Ｈｌ　に＠ｏ　Ｐ、、Ｒｏｖ＠ｒｏ　Ｇ −Ｂｌｏｏｄ　１４：６９３−７００　（１９８４）。 ３９、　５ａｂｈａｔｈ　Ｋ−Ｄ、、Ｂａ１ｌ　Ｅ、Ｄ、、Ｌａｒｃｏｍ　Ｐ、 、Ｄａｖｉｓ　Ｒ，Ｂ、。 Ｇｒｉ？？ｉｎ　ｊｔＤ、　Ｊ、Ｃ１工ｎ、　工ｎｖａｇｔ−７５ニア４６−７ ５３　（１９８５）４０、　Ｌｏｖ＠ｎｂｅｒｇ　Ｂ−、Ｂａｕｍａｎ　Ｊ、に −Ｊ、　Ｂｌｏｏｄ　−ｇ＝１２２５−１２３２（１９８５）＋ ４１　Ｐｅ１ｐｅｒ　Ｓ、Ｃ，、Ｌｅｍｏｎｓ　Ｒ−５，、入５ｈｘｕｎ　Ｒ− Ａ、、Ｌｏｏｋ　入４゜工ｎ：ＭｃＪ仁ｃｈａｅｌ　ＡＪ、　ａｄ、　Ｌａｕｃ ｏｃｙｔａ　Ｔｙｐｉｎｇエエエ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：０ｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉ ｖｅｒｓｉｔｙ　ＰＲ＠１５８．　６２２−６２５　（１９８７）。 ４２、Ｂａｒａｎｓｉｏｎ　Ｒ，Ｊ、、Ｂｔｎｓｉｎｑｅｒ　Ｗ、ニー＊　Ｋａ ｌＪｕｓｚ　Ｄ−：。 エエ＝ｕｎｏ１．Ｍａ凸ｏｄｓ　９工：１１−１９　（１９８６）。 ４コ、　Ｃ４ｖｉｎ　Ｃ，工、、５ｔｒａｕｓｓ　Ｌ、Ｃ，、Ｂｒｏｖａｌｌ　 Ｃ，、ｌ”ａｃｋｌａｒ　Ｍ、Ｊ、。 Ｓｃｈｗａｒｔｚ　Ｊ、Ｆ、、５ｈａｐｅｒ　Ｊ、＋（、Ｊ、ニーｕｎｏ１．１ ３：Ｌ５７（６５（１９８４）＋ ４４、５ｔｒａｕｓｓ　Ｌ、Ｃ，、ＲｏｗＬ＠Ｙ　ｓ、ｏ、、　ＬａＲｕ５ｓａ 　ｖ、ｙ、、　５ｈａｒｋｉｓＳ−：、、５ｔｕａｒ’＝　Ｒ，ｘ−、Ｃ土ｖｉ ｎ　Ｃ＋工、　ＥＸｐ、Ｈａｍａｔｏｌ、工４：８７８−１ｉ８６　（Ｌ９８６ ）。 ４５、Ａｉｋｅｗ　Ｄ、Ｓ、、Ｅａｖｅｓ　入、Ｃ，、Ｅａｖｅｓ　Ｃ，Ｊ、、 Ｔａｋｅｉ　Ｔ、Ｂｌｏｏｄｇ７：２０９８−１１０２　（１９８６）。 ４６、入ｓｋ＊ｗ　Ｄ、５．、Ｅａｖｅｓ　入−Ｃ，、Ｔａｊｃｅｉ　Ｆ、　Ｌ ｅｕｊＣ，Ｒｅｓ、９：ｌコ５−１４５　（１９８５）。 ４７、Ｂｔ：Ｔｌ５ｔａｉｎ　Ｊ、Ｄ、、Ｓｉｎｇｔｒ　Ｊ、Ｗ−、Ａｎｄｒａ ｗｓｉ　Ｒ−Ｇ、、Ｍｅｅｔｉｎｇ入、、Ｐｏｗａａｌｌ　Ｊ−５−、Ｂｊｏｒ ｎｓａｎ　Ｂ−Ｈ−、Ｃｕｔｔｎｅｒ　Ｊ、、ＮａｊｆｅｌｃｉＶ、、ＲａａＪ ！Ｌａｊ−Ｉ　Ｇ−、Ｒａ５ａｋｉｎ　ｉＪ、、５ｕｔｔｏｎ　Ｄ、Ｍ、Ｃ，Ｆ ｉａｌｋａｗ　Ｐ、Ｊ。 ｗ、Ｃ１ｘ、ｎ、工ｎ’ｖｅｇｔ、フＳ：１１５３−１５９　（１９８７）。 ４８、入ｎｅｉｒ＠ｗｓｉ　Ｒ，Ｇ−、Ｔａ１ｃａｈΔａｈ工Ｍ、、Ｓａｇａｌ 　Ｇ、Ｍ、、Ｐｏｗｅｌユ、７．Ｓ、。 Ｂｅ−”ＴＬＳｔｌｌｉｎ　：、Ｄ、、　Ｓ４ｎｇｔｒ　Ｊ、ｗ、、　Ｂｌｏｏ ｄ　＠５１：ｌｏ’３Ｏ−１０３５（：Ｌ９［１６）　。 ４９、入ｎｄｒ＠Ｗｍ　Ｒ−Ｇ、、Ｔｏｒｏｋ−５ｔｏｒｂ　Ｂ−、Ｂｅｒｎｓ ｔｅｉｎ　工、Ｄ、、　Ｂｌｏｏｄ６２：：２４−Ｌ３２　（１９８コ）−５０ 、Ｇｒｉ？ｆｆ１ｉｎ　Ｊ、Ｄ、　、　ｌｔｚ　Ｊ、　、　Ｎａｃ！ｌｅｒ　Ｌ 、Ｍ、　、　Ｓｃｈｌｏｓｇｍａｎ　Ｓ、Ｆ−。 、７．Ｃ１土ｎ、”ｎＶ＠ａｔ　ｇ虐：９コ２−９４：１　（１９８１）。 ５ユ、　Ｐｅｎｑ　１．　入１−Ｋａｔｉｂ　入、、′Ｋｘ１ｏｗｌｅｓ　Ｄ、 に、、Ｌｕ　Ｌ、、Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒｋｌ、、ＴｏｌＷｊｉａｎ　Ｂ、、Ｃｈ ｉａｏ　Ｊ−Ｗ、Ｋｏｚｉｎｅｒ　Ｂ、、Ｗａｎｇ　Ｃ，Ｙ、、。 Ｂｌｏｏｄ　ｇ４：１１６９−４１７８　（１９８４）。 ５２、Ｗｉｓｎｉａｗｓｋｉ　Ｄ、、Ｋｎｏｗｌａｓ　Ｒ−、Ｗａｃｈｔｅｒ　 Ｍ、、５ｔｒｉｆｅ　λ０、Ｃ１ａｒｋｓｏｎ　Ｂ、、Ｂｌｏｏｄ　６ｇ＝４１ ９−４２９　（１９＋３７）。 ５コ、　Ｋｏｈ工ｓｒ　Ｇ、、Ｍｉｌｓｔａｉｎ　Ｃ，Ｎａｔｕｒａ　２５６： ４９５−４９７　（１９７５）。 ５４、Ｌａｒｓｏｎ　５−Ｍ、Ｊ、　ＮＬＩＣｌ、　Ｍａｄ　ｚ６：５３８−５ ４５　（１９１１５）。 ５５、　ＨｏｕｇｈｔＱｎ　Ａ、Ｎ、、ＳｃｈａｉｎｂＣｘｇ　Ｄ−λ−Ｓｅｗ 、０ｎｃｏ１．　Ｌ３：Ｌ６５−１７９　（１９８６）。 ５６、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ　Ｄ、に、、　Ｄａｌａｎｄ　Ｆ、、　Ｋｉｎ　Ｅ 、　ａｔ　ａｌ、Ｎ、　Ｅｎｇｌ。 ：、Ｍｅｄ、２９８：ユ３８４−１３８８　（１９７８）。 ５７、Ｂｕｎｎ　Ｐ、Ａ、、Ｊｒ、、Ｃａｒｒａｇｑｕ工１１ｏ　Ｊ、Ａ、、Ｋ ｅｅｎａｎ　入、Ｍ、ｅｔθ１．　τ＋ａｎｃｓｔ　２：１２１９−】ｚ：ｎ　 （：１．９８４）。 ５８、Ｌａｒｓｏｎ　Ｓ、Ｍ、、Ｂｒ０ＷＴＩ　Ｊ−Ｐ、、ｗｒｌｇｈｔ　Ｐ− Ｗ、ａｔ　ａｌ、　ｉ＝。 Ｎｕｃｌ、Ｍａｄ　２４：１２コ−１２９（１９８３）。 ５９、ＰＴ＠５５０．Ｗ、、　Ｅａｒｙ　Ｊ、Ｔ−、ａａｃｉｇｅｒ　ｃ−ｃ、 　ａｔ　ａｌ、Ｊ、　Ｃ１ｘｎ。 ０ｎｃｏｌ　フ：１０２７−４０：３８　（１９ａ９）。 ６０、　Ｒｏｓｅｎ　Ｓ、、Ｚｘｍｍｅｒ　入−、ＧＯＬＩｉｌａｎ−Ｌｅｌｋ ｉ！’Ｉ　Ｒ，ａｔ　ａｌ、　Ｊ。 Ｃ１１ｎ、０ｎｃｏ１．５＝５６２−５７３　（Ｌ９ｇ７）。 ６１　Ｃａｒｒａｓｑｕｉｌｌｏ　Ｊ−に−、Ｂｕｎｎ　Ｐ、入、、Ｋｅｅｎａ ｎ　Ａ、Ａ、ｅｔ　ａｌ−Ｎ。 Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、３工５：６７３−６８０　（１９８６）。 ６２、Ｅｐｔｅｉｎ入、Ｌ、、Ｚｕ＝ｅｒ　Ａ、Ｍ、、５ｐｉｅｓ　Ｓ、Ｍ、ｅ ｔ　ａニー、ＣａｖａｌｌｉＦ、、Ｂｏｎａｄｏｎｎａ　ｃ、、Ｒｏｚｅｎｃｖ ｅｉｑ　Ｍ、、ａｄｓ　５ｏｓｔｏｎ　ＭｊｌｒｔｉｎｕＳＮｉｊｈｏｆｆ　（ １９８５）− ６３、ＤａＮａｒｄｏＳ、Ｊ、、ＤａＮａｒｄＯ（、−Ｌ−、Ｏ市ＧｒａｄｙＬ 、Ｆ、ｅｔａｌ。 入ｎｔｉｂｏｄｙ　工！ＩＩ！１ｌｕｎＯｃＯｎフ、Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ、Ｌ ＝１７−３３　（１９８８）。 ６４−　Ｒａｏ　Ｄ、Ｖ、、Ｎａｒｒａ　Ｖ、Ｒ−、Ｈｏｗａｌｌ　Ｒ−Ｗ、ａ ｔ　ａｌ、　Ｌａｎｃｅｔマロニー２：６５０−６５３　（Ｓｅｐｔ、１６．　 １９Ｅ１９）。 ６５、Ｗｏｏ　Ｄ、Ｖ、、Ｌｉ　Ｄ、、ＭＡｔｔｉｓ　Ｊ、入−ａｔ　ａｌ−Ｃ ａｎｃｅｒ　Ｒａｓ、４１：２９５２−２９５２　（１９８９）。 ６６、　５ｃｈｅ月仕鳩；ｑ　Ｄ−人、、ＳｔｘａｎｄＭ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒ ａｓ、４３：２６５−２７２（１９＋ｉ３）　。 ６７、１！（ｈａｙ　Ｂ、Ａ−、Ｃｏｏｎ＠ｙ　Ｊ−、］！ｄｇｉｎｇｔｏｎ　 τ、、ａｔ　ａｌ、　Ｊ、Ｎｕｃｌ。 Ｍｅ＋１．２７＝１２９３−１２９９　（１９８６）。 ６ｇ、Ｃａｒｒａｓｑｕｉｌｌｏ　Ｊ−人−、Ｍｕｌｓｈｉｎｅ　Ｊ、Ｌ、、Ｂ ｕｎｒ＋　Ｐ、Ａ−、Ｊｒ−ａｔａｌ、Ｊ、ＮｕＣ工、Ｍａｄ、２畠：２８１− ２８７　（１９８７）。 ６９、Ａｎｄｔｒｓｏｎ　Ｗ、Ｍ−、Ｓｕ：ａｎｄ　！−，ＷＣＸ　Ｍｏｎｏｇ ｒ　３：１４９−１５１゜７０、シｕｍｎ　Ｍ、！、、Ｂｏｙｓａ　］］！−λ −、Ｏ１ｄＬ−Ｊ、ａｔ　ａｌ、Ｊ−１ｍｍｕｎｏｌ。 １０工：９９−１０３　（１９６ｇ） ７Ｌ　Ｓｈａｗｌａｒ　Ｄ−Ｌ、、　１ｕｃａｌｌｉに−Ｃ，，Ｗｏｎｗｌｅｙ 　Ｓ、Ｂ、、Ｒｏｙｓｔｏｎ工、、　Ｄｉｌシ関」Ｒ−０−Ｃａｎｃｅｒ　Ｒａ ｓ、　４４：５９２１−５９２７　（１９８４）。 ７２、　Ｐｒｅｓｓ　Ｏ−ｉ＋Ｆ、、Ｆａｒｒ　人−に、、Ｂｏｒｒｏｚ　Ｋ、 工、ａｔ　ａｌ、　ＣａｎｃｅｒＲ６葛、４１４９０６−４９０Ｌ２　（１９８ ９）。 ７コ、　Ｍｎｔｚｋｕ　Ｓ−、Ｂｒｏｃｋａｒ　Ｅ、−Ｂ、、Ｂｒｕｇｅｎ　Ｊ 、ｅｔ　ａｌ、　ＣａｎｃｅｒＲａｓ、４６：３８４８−３８５４　（１９８６ ）。 ７４、Ｗａｎｇ　Ｂ−５−、シ１聞りｑ　ｌ　ａ　ｓ　入、Ｌ、、５ｉｌｖａ　 Ｊ、ａｔ　ａｌ、　Ｃａ１ｌニーｖｎｘｎｏ　１．　工０６：１２−２１　（ｌ Ｌ９Ｆ４７）。 ７５、Ｏｌｓｎａｇ　５−、Ｓａｎｄｖｉｇ　Ｋ、、Ｐａｅｅｒ露ｅｎ　Ｏ−Ｗ 、、ｖａｎ　Ｄｅｕｒｓ　Ｂ。 工ｒａｕｎｏ１．Ｔｏｄａｙ　ｉｏ：２９０−２９５　（１９８９１゜７Ｌ　Ｋ ｉｒｓｃｈ　ＫＥ、Ｉ（ａｍｍｅｒ工ｉｎｇ、ＵＬ、　ｏ　：８０５−９１０゜ ３．９８Ｌ。 ７７、　Ｂａｒｎｓｔａｉｎ　より、Ｔａｊ！ｌ　ＭＲ，Ｎｏｗｉｎｓｋｉ　Ｒ Ｃ，Ｌ１１旦遼Ｌユニ６８−７１．　１９８０゜ ７Ｂ、Ｓｃｈａｉｎｂａｒｇ　ＤＡ、　ａｎｄ　５ｔｒａｎｄ　Ｍ、　ｅ　＠　 、　；４４−４９．１９１３２゜ ７９、　Ｓ−Ｊ’Ｌ＠Ｌｎｂ＠ｒｑ　ＤＡ、５ｔｒａｎｄ　Ｍ、ａｎｄ　Ｇａｎ ｓｏｗ　ＯＡ、　旦三ｉ！困９！讃：’５１１（５１３，１９８２゜ ８０、Ｎａｃｉｌａｒ　ＬＭ、５ｔａｓｈａｎｋｏ　Ｐ、Ｈａｒｄｙ　Ｒ，ｅｔ 　ａｌ：　θｌヱＩＬＬＬｉＱ：コ１４７−３１５４．　１９８０゜８工、Ｓｈ ａｗｌｅｒ　ＤＬ、　ＭＩＣａｌｉ　ＭＣ，Ｗｏｒｍｓａｌｙ　ＳＢ、ａｔ　ａ ｌ：ｍシ臣−４４：５９２１−５９２７．ｘ９ａ４．８２、　５ａｓｔ＝”’ｙ 　ＫＳＲ，Ｒａｏ　ＤＶ−ＤＯｇｌ！１ｌｅｔｑｏｆ　ｌｏｗ　ｅｎｅｒｇｙｅ ｌｅｃｔｘｏｎｓ、　Ｒａｏ　ＤＶ、Ｃｈａｎｄｒａ　Ｒ，にｒａｈ＆ｍ　ＭＣ ，ａｄｓ、１川：ｇ　ｅ　ａａ　ｅ　、Ａｊ！１ｅｒｉｃａｎ　Ａｓ５ｏｃｉａ ｔｉｏｎ　ｏｆＰｈｙｓｉｃｉｓｔｓ　ｉｎ　Ｍｅｄ工Ｃ１ｎｅ、１９ｓ４゜８ ３、Ｒａｏ　ＤＶ、Ｎａｒｒａ　ＶＲ，Ｈｏｖｅｌｌ　ＲＷ、Ｇｏｖｅｌｉｔｚ 　ＧＦ、５ａｓｔｒｙＫＳＲ，工用！工ｖｇ　ｒａｄｉｏｔｏｘｉｃｘｔｙ　ｏ ｆ　ＤＮＡ−１ｎｃｏｑｏｒａｔｅｄ　”ＩＣｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈ ａｔ　ｏｆ　ｄｅｎｓｅｌｙ　ｉｏｎｉｚｉｎｇ　ａｉｐｈａ−ｐａｒｔｉｃｌ ｅｓ、シ狙ｚ聾６５０−６５３．Ｌ９８９゜８４、Ｇｒｌｆｆｌｎ　ＪＤ、Ｌｉ ｎＣｋｌ　Ｄ、５ａｂｂａｔ、’ｌ　Ｆ、Ｌａｒｃａｍ　ｐ、Ｓｃ、ｈｌｏｓｓ ｍａｎＳＦ、　シ彪８−シ五り互：５２１−５３４．１９８４゜＋１１５．　５ ａｂｂａｔｈ　ＫＤ、Ｂａ１ｌ　ＥＤ、Ｌａｒｃｏｍ　Ｐ、Ｄａｖｉｓ　ＲＢ、 Ｇｒｉｆｆｉｎ　ＪＤ。 １　〒　マ　４−７　ニア４６−７５３．１９８５゜８６、　Ｂ＠ｒｒｓｓｔｅ ｉｎ　より、　Ｓ工ｎｇａｒ　ＪＷ、　入ｎｄｒａｗｓ　ＲＧ、Ｋｅｅｔｉｎｇ 　Ａ。 Ｐｏ％ｔｅｌｌ　ＪＳ、Ｂ］ｏｒｎｓｏｎ　ＢＨ，Ｃｕｔｔｎａｒ　；、Ｎａｊ ｆｅｌｄ　Ｖ、Ｒａａ二ΔｎＧ、Ｒａ５ｋｉｎｄ　Ｗ、　Ｓｕ：ｔｏｎ　ＤにＣ ，Ｆｉａｌｋｏｗ　ＰＪ、　ｚ−≦こ＝Ｌ１エニ！！夏１−ヱ、ｌ：１１５３− １１５９．　１９８７゜８７、　Ａｎ（３１ａＷＳ　ＲＧ、　Ｔａｊｃａｈａｓ ｈｉ　Ｍ、　Ｓ＠ｑ＆Ｉ　ＣＭ、　Ｐｏｗｅｌｌ　ＪＳ。 ａｅｒｎｓｔａｉｎ　より、　Ｓｉｎｇａｒ　ＪＷ、　ｌ１９９【ニー４旦：１ ０コｏ−１０２５、８ｇ、　Ｔａｎｉｍｏｔｏ　Ｍ、５ｃｈｅユｎｂａｒｇ　Ｄ Ａ、Ｃａｒｄｏｎ−Ｃａｒｄｏ　Ｃ，）ｌｕｉｅ　Ｄ。 （ｌａｒｋｓｏｎＢＤ、ａｎｄｏｌｄＬｌ、　シ！只λ！罠ム農−１：３コ９− １１３．　１９８９゜８９、　Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ　ＤＡ、’ｒａｎＬｍｏｔ ｏ　Ｍ、ＭＣＪＣａｎＺｌｅ　Ｓ、５ｔｒｘｆｅ　Ａ、０１ｄＬ７．ａｎｄ　Ｃ １ａｒｋｓｏｎ　ＢＤ、シ四ｘ剋殖Ｌｌ：４”−４４５，１９８９゜９０−　Ｒ ｏｂｅｒｔｓａｎ　ＷＪ、Ｇｒｉｆｆｉｎ　Ｊ、＄ｏｉｆｆｅｒ　Ｒ，入ｎｄｅ ｒｓｏｎ　ＫｒＦｒ＠ａ−ｎ　Ａｓ、Ｎａｄｌｅｒソ＜、Ｅｒｖｉｎ　Ｔ、Ｒｌ ｔｚ　Ｊ、　Ｌ２−ヱｊ：２８３！、１９８９＋ ９ユ、　ＬｅｍＯＬｉ　ＲＭ、（、ｕユａ”１．ｌ　ＳＣ，５ｃｈｅ１ｎｂｃ二 ｇ　ＤＡ、ｃａｓｐａｒｅ＝＝口　ｃ。 Ｍｏｏｒｅ　ＭＡＳ、Ｃ１ａｒｋｓｏｎ　ＢＤ、Ｇｅｅ　Ｔ−ｌ１２２（−ヱｉ ：２８０ａ。 １９８９゜ ９２、讐ａｌｃＬａａｎｒ＋、”、−人、　（’９８９）　入ｎｎｕ、Ｒｅｖ、 Ｂｉｏｃｈａｍ、５８．　８７５−９３、υｃｈｉｙａｍａ、τ、、Ｂｒｏｄｅ ｒ、Ｓ−＆　Ｗａｌｄｍａｎｎ、Ｔ、λ、　（１９８ユ）　５゜工ｅｕｌ’ｌロ ユ、１２６．　：３９３−二３９７゜９４、　Ｌａｏｎａｒｄ、　冒−、：：、 、　Ｄｅｐｐｅｒ、　Ｊ、Ｍ−、口ｃｈｉｙａｘａ、τ。、　５ｚｉｔｈ。 Ｋ０人、、Ｗａｌ由込ｒｍ、τ８人、＆　Ｇｒｅｅｎｓ、Ｗ−Ｃ，［１９８２） 　Ｎａｔｘｅ３００、　２６７−２６９゜ ９５、　Ｇ１１ｂｏａ、Ｅ＋、Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ　Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆ ｅｒ：　入ｐｐ工１ｃａｔｉｏｎｔｏ　Ｈｕｍａｎ　τｈａｒａｐｙ、Ｒ＠’Ｃ ：ＯＶ工ｒｕｓｅｓ　ａｎｄ　Ｄｉｓａａｓａ　（１９８９）λｃａｄａｍｉｃ 　Ｐｒａｓｓ、ｐｐ、９５−１１１・９６、Ｋａｂａｔ、Ｅ、、ａｔ　ａｌ、、 Ｓａｑｕａｎｃｅｇ　ロｆ　Ｐｒ口ｔｅｌｎＪｉ　ｏｆｘｍｎｕｎｏｌｏｑｉｃ ａユ　エｎｔａｒｔｓｔ、ａ、ｓ、Ｄａｐａｒｔｘａｎｔ　ば　Ｈｅａｌｔｈａ ｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ、（１９８７）。 ９７−　ｃｈＣｌ　廿ｕａ　ｌｎｄ　Ｌ４Ｓｋ　＊　Ｊ　−Ｍｏ　１．Ｂ　ＬＱ 　１．ｒ　志ｒ　９　Ｑ　ｌ−９ｘ　７（ｉ９８７）。 ９Ｂ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓ、Ｌ、、Ｊｏｈｎｓ口ｎ、Ｍ、、７．、Ｈｅｒｚｅ ｎｂｅｒｇ、１．−Ａ、、Ｏｉ。 Ｖ、Ｔ、、！’ｒｏｃ−Ｎａｔｌ、入ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８１：　６８５ １−６８５５（１９８４）＋ ９９、　Ｊｏｎｅｓ、Ｐ、Ｔ、、Ｄｅａｒ、Ｐ＋　Ｈ−Ｆｏｏｔｅ、Ｊ、、Ｎｅ ｕｂｅｒｇｅｒ、Ｍ、Ｓ−＆　Ｗｉｎｔｅｒ、ｃ、（１９８６）　５ａｔｕｒｅ 　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３２工：５２２−５２５゜１００、Ｖａｒｈｏｅｙａｎ、 　Ｍ、、　Ｍユ１ｓｔａユｎ、　Ｃ−＆　Ｎ１ｎｔｈ、　Ｇ、　（１９ｇ８）Ｓ ｃ工ａｎｅｅ　２３９：１５３４−１５コロ。 １０１、、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ、Ｌ、（ｌａｒｋ、Ｍ−、Ｗａｌｄｍａｎｎ、Ｈ ，＆　Ｗｉｎｔｅｒ、Ｇ−（１９８Ｂ）　Ｎａｔｕｒａ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３ ３２：３２３−３２７゜ユ０２、　ＰＣＴ　ＩｎｔｅｒＴｌａｅｌＯｎ＆ｌ　ｐ ａｔｅｎｔ　Ｐｕｋ）ＩＩｃ！ＬｔｌＯｎ　Ｎｏ、　ｗ。 ８９１０９６２２、ｐｄ工１ｓｈｅｄ　０ｃｔｏｂｅｒ　ｘ９，１９８９　ａｎ ｔｉｔｌａｄ　”ＸＬ−２Ｒａｃａｐｔｏｒ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｃｈｉｍｅｒ ｉｃ　入ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”。 １０コ、ａｕｔｓｏｎ　ｅｔ　ａユ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉ 、ＴＪ、Ｓ、Ａ、ｌ　ｕ、＋５１１１７９−５８８３　（１９８８）。 ：ＬＱ４．　Ｂｉｒｄ　ａｔ　ａユ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２−ＬＬ　４２３−４ ２６　（１９８Ｂ）−：０４Ａ、、　ｃａｘｒ’ｎｃｒｏｓｓ　Ｊ−Ｃ−、Ｍａ ｔｉｅｓ　Ｍ−Ｊ−、Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄ　Ｈ−Ｒ，、入１ｂｉｎｏ　入−Ｐ− 、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ　Ａ、、、Ｎ−、Ｌｌｏｙｄ　Ｋ−ｏ、、ロ１ｄＬ、Ｊ、、 　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ＋　ＳＣユ、ＵＳＡ　７９：５６４１−５６４ ５（１９８２）。 １０４Ｂ、　ｓｈ９λＨ，Ｔａｊｃａｈａｓｈｉ　＝−、ｏｅｔ＝ｑｅｎ　ｕ、 ｒ、ｏｌｄＬ、、：：、。 Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍａｄ　１４４：８７３−８１１１１　（１９７６）。 １０５、Ｍａｔｔａｓ　Ｊ、ｌ　、Ｔａｎ工ｍｏｔｏ　Ｍ、、Ｐｏ１Ｌａｃｋ　 Ｍ、Ｓ、、Ｍａｘｅｒ　Ｄ、Ｈ，。 、ｆｆ、、Ｉ！！ｌ！１ｌｕｎｃｌ　Ｍａｔｈｏｄｇ　６エ：１４５−ｘ５０　 （１９８３）。 １０６、Ｃａｙｒｅ　Ｙ−、ＲａｙｎａユＭ−Ｃ−、ＤＪＬｒ！”／ｋｉ１１！ ％／Ｉｃ：！　Ｚ−、Ｄｏ＝ｎｅｒ　に、Ｈ，。 ｐｒｏｃ、　Ｎａ’Ｃ１，ＡＣＩＬ（１，５Ｃ’−、ＵＳλ１４ニア６１９−７ ６２３　（１９８７）。 ）０７．Ｍｅｌｔ　Ｓ−、Ｃａｒｓｗｅｌｌ　Ｅ、Ａ、−、Ｖｏｇｅｌ　Ｃ，Ｗ 、、Ｏａｔ：ｇａ＊　Ｍ、Ｏｌｃ：Ｌ−ｗ　９ｇ　ＣＮＬｎ−工：ロｎｕｎｏ１ ．　工ｍｍ、ｕｎｏｐａｔｈｏ１．　４Ｓ二２１４−２２９（１９８７）＋ １０１ｉ１．　Ｏｌｄ　Ｌ−、ｆｆ−、５ｔｏｃｋｅｒｔ　Ｅ、、Ｂｏｙｓ、ｅ 　Ｅ−人−ｒ　ＫＪ−’１５５　Ｊ−Ｈ−ｒ　Ｊ−Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、Ａ２７：５ ２３−５３９　（１９６８ン。 １０９、Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ　Ｄ、入−、Ｔａｎｉｍｏｔｏ　Ｍ、、ＭｃＫａ ｎｚｉａ　Ｓ−、５ｈｉｆｅ入、、Ｏｌｄ　Ｌ、Ｊ−、Ｃ１ａｒ）Ｃ５０ｎ　Ｂ 、Ｄ、、　Ｌａｕｊｃｅｍｉａ　３：４４０−４４５（Ａ９８９）。 １１０、Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ　Ｒ，Ｓ、、　ひｍｐｉａｒ＝ｅ　Ｓ、入、、　Ｇ ｏｌｄｓｔｅｉｎ　Ｄ、Ｐ、。 Ｊｕｔｄａｒｓｅｎ　Ｄ、；、、Ｇｙｎｅｃｏｌ、０ｎｃｏ１．２９＝９４−ｍ ｏｏ　（１９８Ｒ）。 Ｌｌｌ−Ｓａｊｃａｍｏｔｏ　ニー、Ｆ＋ｕｒｕｋｌＷａ＝　Ｋ、、Ｃａｒｄｏ ｎ−Ｃａｒｄｏ　Ｃ−、ＹｘｈＢ、ｗ、Ｔ、、Ｒｅ：”−ｉｇ　Ｗ、Ｊ、、０ｅ ｔｔｑｅｎ　Ｈ，Ｆ、、Ｏｌｄ　Ｌ、、；、、ＬｌｏｙｄＫ、Ｏ−Ｃａｎｃｅｒ 　Ｒｅｓ、４６：：５５コー１５６１　（：Ａ９８６）。 １１２、Ｄｒｅｘｌｅｒ　ｌ！、Ｇ、、　Ｓａｇａｗａ　Ｋ−、Ｍｅｎｏｎ　Ｍ 、、　Ｍｉｎｏｖａｄａ　：、。 Ｌａｕｋｅｍｉａ　Ｒａｓ　工０：ユ７−２３　（工９８６）−１１３、Ｍｃに 土ｃｈａｅＬ　入−１，、ｃｄ、Ｌａｕｋｏｅｙｔｅ　Ｔｙｐｉｎｇ　：＝：、 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：０ｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉ’：ｙ　Ｐｒｅｓｓ、５７ ７−６０２　（１９８７）。 １１、Ｋｒｏｌｉｃｋ　Ｋ、Ａ、、Ｖｉｌｌａｒｕｎｅｚ　Ｃ−、工５ａｋｓｏ ｎ　Ｐ、、σｈｒＪ−Ｗ、。 Ｖｉｔｅｔｔａ　Ｅ、Ｓ−、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、入ｃａｄ、Ｓｃユ、ｔＪｓＡ 　フ７：５４１９−５４２３　（１９８０）。 １１５、Ｓｈｉｍａｚａｌｃｉ　Ｃ，、Ｗ工ｓｎｉ＠ｖａｋｉ　Ｄ、、　Ｓｃｈ ｅｉｎｂｅｒｇ　Ｄ、人、。 Ａｔｐｏｄｉｅｎ　Ｊ−、５ｔｘｉ、ｆｅ　人、、　にｕｌａｔｉ　Ｓ、、　Ｆ ｒ１ａｄ　Ｊ、Ｗｉｓｎｉｅｗｏｌｇｋｉ　Ｒ−、Ｗａｒ＋ｇ　（、Ｙ−、Ｃ１ ａｒｋｓｏｎ　Ｂ、Ｄ、、Ｂｌｏｏｄ）２：１２４Ｂ−１２５４（１９ｇｓ）。 ｘ１６．　Ｌｅ二ｏ１ｉ　Ｒ，Ｍ、、　Ｇｕｌａｔｉ　ｓ、ｃ−、５ｃｈａｉｎ ｂｅｒｑ　Ｄ、λ、。 Ｇａ５ｐａｒｅｔｔｏ　Ｃ，、Ｍｏｏｒｅ　Ｍ、Ａ、Ｓ、、Ｃ１ａｒｋｓｏｎ　 Ｂ、Ｄ、、Ｇａｓ　τ、。 Ｂｌｏｏｄ　７４（７）：５ｕｐｐｌ、ｐ２８０ａ　ａｂｓ讐ａｃｔ　（１９８ ９）。 １１７、　Ｈｕｄｓｃｎ、　ＡＪ’Ｌｒｌ！−ＭａＬｒｌａ、　Ｍｊｌ）Ｃｒ） ’ｎ１ｋｏｌａ、　Ｖ−、）Ｃａｋ）ｒ２Ｌｌ　）−−１Ｂｒａｄｓｔｏｃｋ　 Ｋ−Ｆ、、　工ｍｍｕｎｏｐｈａｎｏｔｙｐｉｃ、、、Ｂｌｏｏｄ。 ７４（６）：２１１２−２１２０　（Ｎｏｖ、１．１９８９）。 ｘｌａ、Ｔａｎｉｍｏｔｏ　Ｍ、、５ｃｈｅｉｎｂｅｒｑ　Ｄ、入、、Ｃａｒｄ ｏ　Ｃ，Ｃ，、Ｈｕｉａ　Ｄ、。 Ｃ１ａｒｋｓｏｎ　Ｂ＋Ｄ、、Ｏｌｄ　Ｌ−Ｊ、　Ｌａｕｋｅｍｉａ　３＝３３ ９−３４８　（１９８９）。 １１９、　Ａｎ由：ａｖｓ　Ｒ，Ｇ、　、　Ｔａｊｃａｈａｓｈｉ　Ｍ、　、　 Ｓｅｇａｌ　Ｇ、Ｍ、　、　Ｐｏｗｅｌｌ　Ｊ、Ｓ、　。 Ｂａｒｎｓｔａｉｎ　工、Ｄ、、　５ｚｎｑｅｒ　Ｊ−Ｗ、　Ｂｌｏｏｄ　！！ Ｉ：１０コ０−４０３５（１９８６）。 １２０、Ｂｅｎｎｅｔｔ　Ｊ、Ｍ、、Ｃａｔｏｖｓｋｙ　Ｄ、、Ｄａｎｉｅｌ　 Ｍ−Ｔ、、Ｆｌａｎ由：ｉｎＧ、。 Ｇａ１ｔｏｎ　Ｄ、Ａ、Ｇ、、Ｇｒａｌｎｉｃ）ｃ　ｋｌ−，５ｕｌｔａｎ　Ｃ ，ｋｎｎ、工ｎ　Ｅｅ！ｒｎ　−Ｍｅ＋：ｌ　１０３：６２６−６２９　（１９ ８５）。 Ｌ２Ｌ　Ｐｅ１ｐｅｒ　Ｓ＋Ｃ，、Ｌａｍｏｎｓ　Ｒ−５，、Ａｓｈｍｕｎ　Ｒ −λ−，Ｌｏｏｋ　λ、τ。 工ｎ：ｍｃＭｌｃｈａｅｌ　Ａ、Ｊ、、ａｄ、Ｌａｕｋｏｃｙｔｅ　’ｒｙｐユ ｎｇ　エエエ、０ｘｆｃｒｄ：０ｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒａｓ ｓ、６２２−６２５　（１９８６）。 工２２．　Ａｌｖｅｙ　Ｐ−Ｌ−、Ｇｒ＠ａｖｅｓ　Ｍ、Ｆ、Ｌｅωｃ　ａｍｉ 　ａｌ：５２７−５４０　（１９８７）。 １２１　Ｎａａｍａ　Ｐ、Ｂ、、　ＳｏａｍｂＯｏｎｇｒｕｐ　Ｐ、、　Ｂｒｏ ｖｍａｎ　Ｇ、Ｐ、、　ＭｅｙｅｒＲ，Ｍ、、Ｂｅｎｄａｒ　入−、ｗ工ＩＳロ ｎ　ｗ、Σ、Ｃ−，Ｗａｌｋｅｒ　１．Ｒ，、５ａｅｅｄＮ−、ＭｃＢｒｉｄｅ 　Ｊ、入、　Ｂｌｏｏｃｉｇｌ：ｌコ５５−１コロ２　（１９８６）。 １２４、Ｐａ５ｓａｒ＋ｏ　ｓ、、ＰａｌｕｍｂＯ入、、Ｆｅｒｒｓ＝ｒｏ　Ｄ −、Ｐａｑ工ｘａｒｄｉ　ｃ−＝、。 Ｂｏｔｔａｒｏ　Ｌ、、Ｌａｉ　ＳＪ、、Ｍａｏ　Ｐ、、Ｃａｒｔａｒ　Ｃ−、 Ｈｕｂｂｅユ１　Ｈ８゜工、ａｎｇａ　Ｂ、、Ｒｏｖａｒａ　Ｇ、　Ｂｌｏｏｄ 　＆４：２７５−２１３　コ、　（１９８４）　、Ａ２５．　Ｇｒｉｆｆｉｎ　 Ｊ−Ｄ、、ＭＡｙｅｒ　Ｒ−Ｊ−、Ｗ’ａｉｒｈｇｔａ工ｎ　Ｈ−Ｊ、、Ｒｏｓ ｅｎ２ａｌＤ＋５−、Ｃｏｒａｌ　Ｆ、Ｓ＋、Ｂｅｖｅｎｄｇａ　Ｒ＋Ｐ＋、Ｓ ｃｈｌｏｓｓｍａｎ　Ｓ、？。 Ｂｌｏｏｃｌ　６２二５５７−５６３゜１２６、　ＬｉｎｃｈＤ−Ｃ，、Ａ１１ ｅｎ　Ｃ−、Ｂｅｖａｒｌａｙ　Ｐ、Ｃ，Ｌ−、Ｂｙｎｏｅ　Ａ、Ｇ、　。 ５ｃｏｔｔ　Ｃ，Ｓ、、Ｈｏｑｑ　Ｎ、　Ｂｌｏｏｄ　ｇ３：５６６−５７３　 （１９８４）。 １２７、ＢｅＸｎ５ｔｅＬｎ　工、Ｄ、、Ｓ工ｎｇａｒ　Ｊ、１ｇ、、入ｎｄｒ ｅｗｓ　Ｒ，Ｇ、、Ｋａａ’−ｉｒ＋ｑ人、、Ｐｏｗｅｌｌ　Ｊ−５−、ＢｊＬ ＪｒｎｇＯｎ　Ｂ−Ｆｉ−、ｃ”ａ＝ｔｎｅｒ　：、、ＮａｊｆｅｌｄＶ、、Ｒ ｅａｚｍｎ　Ｇ、、　Ｒａｇｋｌｎｄ　Ｗ、、５ｕｔｔｏｎ　Ｄ−Ｍ−Ｃ−、Ｆ １ａ１ｋｏｖｉＪ、　Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｉｎｖ＠ｓｔ　フＩ　：１１５３−１１５ ９　（１９８７）。 １２Ｂ、Ｔａｎ１ｘｏｔｏ　に、、Ｓｃｈａｉｎｂｅｒｇ　Ｄ、λ、、Ｃａｒｄ ｏｎ−Ｃａｒｄｏ　Ｃ，、ＨｕｉｅＤ、、　Ｃ１ａｒｋｓｏｎ　Ｂ、Ｄ、、　０ １（ｉ　Ｌ−Ｊ、、　Ｌａｕｋ、ａｍｉａ　３：３３９−３４８（Ａ９［１９） 　＋ １２９、Ｓｃｈａｉｎｂａｒｇ　Ｄ、入、、Ｔａｎ１ｘｏｔｏ　Ｍ、、ＭＣＫｅ ｎＺｉｅ　Ｓ、、５ｔｒｉｆｅ入、、Ｏｌｄ　Ｌ−Ｊ、、Ｃ１ａｒｌｃｓｏｎ　 Ｂ、Ｄ、、　Ｌａｕｊｃｅｍｉａ　３：４４０−４４５（１９８９）。 １コｏ、Ｍｉｔｔｌａｒ　Ｒ−５，、Ｔａ１ｌｅ　Ｍ−λ、、Ｃａｒｐａｎｄｅ ｒ　Ｋ、ａｔ　ａｌ、　、ｆ。 Ｘｘｘｕｎｏ　工３１：１７５４−４７６１　（１ｓａｘ）。 １３１　Ｎａｍｅｒｏｗ　Ｇ、Ｒ−、Ｗｏｌｆａｒｔ　Ｒ，、ＭｃＮａｕｇｈｔ ｏｎ　Ｍ−Ｅ、ｅｔ　ａｍ、Ｊ。 Ｖｉｒ口１．　５５：：１４７−３５１　（１ｃｉｓｓ）。 １３２、　Ｈｕｎｔａｒ　Ｗ−Ｍ−、ｃｒｅｅｎｗｏｏｄＦ、Ｃ＋、　Ｎａｔｕ ｒｅ　ｘ９４：４９５−４９６（１９６２）。 Ｄ３．　Ｌｉｎｄｍｏ　Ｔ−、Ｂｏｖｅｎ　Ｅ、、Ｃｕｔｔｉｔｔａ　Ｆ、ａｔ 　ａｌ、Ｊ、ニーｕｊｌｏユＭａｔｈｏｄｓ　７２ニア７−８９　（１９８４） 。 １３４、Ｋｒｅｊｃａｒａｋ　Ｇ、Ｅ、、Ｔｕｃｋｅｒ　Ｋ、Ｌ、　Ｂｉｏｃｈ ｓ＝ｍ、Ｂｉｏｐｈｙ　Ｒｅｓ。 Ｃｏ＋ｚｕｎ　７フ：５ａｌ−５８５（１９７７）１３５、Ｂｒｅｃｈｂｉａユ 、Ｍ、Ｗ、、Ｇａｎｓｏｗ、Ｏ，λ、、入ｔｃｈｏｒ、Ｒ−Ｗ、、ａｔ　ａｌ、 。 工ｎｃｒｇ、　Ｃｈａｍ、　２５：２７７２−２７８１　（１９１３６）、　＠ ９゜’ｒ３６．　Ｄｌｖｑｉ　α、Ｍｉｎｎｉｔｉ　Ｊに、Ｏｌｄ　Ｈ７，Ｓｃ ｈｇｉｎｂｅｒｇ　ＤＡ。 Ｃ＠　＠　ｖ　、’Ｏ：４０４ａ、１９８９゜１：１７．　ＳｃｈｅｘｒＬｂ４ ｒｇ　ＤＡ、５ｔｒａｕｓ　ＤＪ、Ｙａｈ　ＳＤ、Ｄｌ’Ｖ９１　ＣＲ，Ｇａｒ ｘｎ−Ｃｈａｓａ　Ｐ、　Ｇｒａｈａｍ　Ｍ、Ｐａｎｔｌｏｗ　Ｋ、Ｃｏ１ｔ　 Ｄ、Ｏｅｔ？ｇｅｎ　ＨＦ。 Ｏｌｄ　−、ＬＳＬｌＣｏ　’７９−１！　３．　９０゜１３Ｂ、Ｈｕｎｔａｒ 　ＷＭ、　工”　ＤＭ　””　（”’Ｌ　菖１１［１勘Ｓ５す（−」ｌ【ｅ　ｗ ｅｎｔ　ｏ　、　ＦＡ　Ｄａｖｉｓ　ＣＯ，。 Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９６７゜：３９．　５ｎｙｄｅｒ　１＋ｉＳ、Ｆ ｏｒｄ　ＫＲ，Ｗａｒｎｅｒ　ＧＣ；、Ｗａｔｓｏｎ　ＳＢ、　Ｗ工８ｐｓｔ　 ａ、　”　ａｏｃ＊ｔｖｏ’　ｅｓａ”　、ｅ！４ｍ’ｎａヒ四二道Ｘ文、」α 、１９７５゜ １４０、Ｋｅｒｉｅａｋｅｓ　Ｊ、５ｅｌｔｚｅｒ　Ｒ，Ｂｌａｃ）ｃｂｕｒｎ 　Ｂ、Ｓａａｎｇａｒ　Ｅ。 ｓ　１　：９９９．１９６５゜ １４１、　Ｋａｓｓｌｓ　Ａ１．　入ｄｅｌｓｔｅｉｎ　ｓｙ、Ｈａｙｃｏｃｊ ：　ｃ、５ａＳｔｒｙ、ＫＲ５゜８　：４０７−４２５．１９８０゜ １４２−　Ｂｒｏｗｎｓ　Ｅ、　ｒｘｒｅｓｔｏｎｅ　ＲＢ、　Ｔａｂｌｅ　ｏ ｆ　Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ工５ｏｔｏｐｅｓ−Ｗ　、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１ ９８６゜１４コ、５ｈｌｔｉｅｎ　Ｂ、Ｔａｒｐｉｌａｊｃ　Ｍｓ、ａｄｓ　６ ｏ、、　ＮｕｃｌｅｏｎＬａｃｔｅｒｒ＋ｓ入５ｓｏｃｉａｔａｓ、工ｎｃ、、 Ｏ工ｈａｙ、ＭＤ、１９８４゜１４４、Ｈｉｄｄａｍｒｍ　Ｗ、Ｃ１ａｒｋｓｏ ｎ　ＢＤ、ＢＱｃｈｎｅｒ　τ、Ｍａｌａｍａｄ　ＭＲ。 Ａｒ、ｄｒａｅｆｆ　Ｍ、　１じ旦１」ｌ：２１６−２２１，１９８２−１４５ 、Ｂｉｇｌａｒ　ＲＥ、ＺＪＬｒｌＺＯｎｌＣＯＰ、Ｌａｏｎａｒｄ　Ｒ，ｃｏ ｓｍａ　Ｍ、ａｔ　ａｌ。 ＢＯｎ＠　ｍＶｌｒｒＯＷ　ｄｏｓ工ｍａｔｒｙ　ｆロｒｍロｎ口ｃｌｏｎａｌ 　ａｎｔｉｂｏｄｙＲｉｃｉｑｅ　Ｔｎ、１９ｓ５− ｘ４６．　Ｓｏｌｏｍｏｎ　ＤＨ，Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｔ　ｃｒａｖｅｓ　 ＨｙｐｅｒＪ＞ｙｒｏｉｄｉｓｍ。 Ｘｎ：ｗ　ｅ”ｓ　−＠”　Ｏｅｔａ　ｅｌ　’Ｃａ！Ｉ工、ｐ９９８．Ｓ、工 ｎｑｂａｒ　ａｎｃｉ　Ｌ、Ｂｒａｖｔｒｍａｎ　−Ｅｄｓ、ＪＢＬ工ｐｐ工ｎ Ｃ口＝、ｐｈ工１ｄａｌｐｈｉａ。 １４７、Ｈｏｕｑｂｔｏｎ　入Ｎ、Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ　ｏ入、　旦ｍニー［ ：１６５−１７９゜９８Ｌ １４ａ−Ｃｏ１１ｉｎｓ　５５．　にａｌｌｏ　ＲＣ，（：ａｌｌａｇｈｅｒ　 ＲＥ：　Ｎａｔｕｒｅ２７〇二３４７．　１９７７゜ １４９−　Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ　Ｄ、５ｔｒｉｆｅ　Ａ、入ｒｌｉｎ　Ｚ、Ｋ ｎｏｗｌｅｓ　Ｒ，ＬａｘｎｂｅｋＣ，Ｃｕ１ａｔｉ　ＳＣ，ＭｃＨｅｎｄｒｙ 　Ｂ、ＭｃＫｅｎｚｉｅ　Ｓ、Ｃ１ａｒｋｓｏｎ　ＢＤ：Ｌｅｕ）ｃａｚｉａ　 ３：４４６．　１９８９−１５０、　５ｔｒｉｆｅ　λ、Ｌａｍｂｅｋ　Ｃ，Ｗ ｉｓｎｉｅｗｓｋｉ　Ｄ、Ｃｕ１ａ？ｉ　ＳＣ，Ｇａ５５ｏｎＪＣ，Ｇｏｌｄａ 　ＤＷ、Ｗｅｌｔｅ　Ｋ、Ｇａ１ｘｉｌｏｖｅ　エ、Ｃ１ａｒｋｓｏｎ　ＢＤ： Ｂｌｏｏｄ　６９：１５０Ｂ、１９８７゜１５１、Ｔａｎ１＋ｎｏｔｃ　Ｍ、Ｓ ｃｈｅｉｎｂｅｒｇ　０人、Ｃｏｒｄｏｎ−Ｃａｒｄｏ　ｃ、Ｈｕｉｅ　Ｄ。 Ｃ１ａｒｋｓｏｎ　ＢＤ、Ｏｌｄ　Ｌ、：：　Ｌｅｕｊｃａｍｉａ　３：３コ９ 、　：Ｌ９８９゜１５２、Ｃ１ｖｉｎ工Ｃ，ＳｔｊＬｕｊｇ　ＬＣ，Ｂｒｏｖａ ｌｌ　ｃ、Ｆａｃｋｌａｒ　ｘｃ、ｓｃｈｗａｒｔｚＪＦ、５ｈａｐｅｒ　ＪＨ ：　Ｊ　工ｍｍｕｎｏｌ　ｌＢ３：　１５７．　１９８４−１５３、Ｇｏｌｄａ 　ＤＷ、Ｑｕａｎ　ＳＧ：　Ｂｌｏｏｄ　５２：１０６８，１９７９゜１５４、 Ｓｍ１ｔｈ　Ｃ，Ｇａ５ｐａｒａｔｔｏ　Ｃ，Ｃｏ１１ｉｒｕ＝　Ｎ、Ｇ１１ｌ ｉｏ　Ａ、ＨａｕｎｃｈＭ、　Ｏ’Ｒｅ１ｌｌｙ　ＲＪ、　Ｍｏｏｒｓ　ＫＡＳ ：　λ「１ｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐａｒｔｉａｌｃｈ＆ｒａｃｔａｒｉｚ ａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｈ＋、ｕｏａｎ　ｐｒｅ−ＣＰＵ　ｐａｒｃｕｒｓｏｒ ｐｏｐｕ工ａｔｉｏｎ、（Ｓｔｔｈ！ｕｔｔａｄ）。 １５５−　Ｌｍ、、ｍｏｌｉ　ＲＭ、Ｇｕｌａｔ工、ＳＣ，５ｔｒｉｆａ　Ａ、 Ｌａｍｂａｋ　Ｃ，Ｐａｒｅｚ　Ａ。 Ｃ１ａｒｋｓｏｎ　ＢＤ：　Ｐｒｏｌｉｆａｒａｔｉｖａ　ｒａｓｐｏｎｓａ　 ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｉｄ　ｌｅｕｋａｍｉａ　ｃａｌｌｓ 　ａｎｄ　ｎｏｒｍａｌ　ｍａｒｒｏｗ　ｅｎｒｉｃｈｅｄｐｒｏｇａｎｉｔｏ ｒ　ｃａｌｌｓ　ｔｏ　ｈｕｍａｎ　ｒａｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｇｒｏ讐ｔｈ　 ｆａｃｔｏｒｓ工Ｘ、３．　にＭ−Ｃ５Ｆ　ａｎｃｉ　Ｇ−Ｃ５Ｆ　ａｌｏｎｅ 　ａｎｄ　ｉｎ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ、　（ｉｎｐｒａｓｓ　−Ｂｌｏｏｄ 　１９９１）１５６、　５ｈａｒｋｉｓ　ＳＪ、Ｓａｎｔｏｇ　ＧＷ、Ｃｏ１ｖ ｉｎ　ＯＭ：　Ｂｌｏｏｄ　５５：５２１゜１９１！０゜ １５７、Ｓｔｅｗａｒｔ　ｐ、Ｂｕｃｌｃｎａｒ　■、Ｂｔｎｓｉｎｔ７ｅｒ　 Ｗ、Ａｐｐｅｌ＋ａｕｚ　ｎｔ。 Ｆ＠ｆｅｒ　Ａ、Ｃ１１ｆｔ　Ｒ，５ｒ−ｏｒｂ　Ｒ，５ａｎｄａｒｓ　Ｊ、ａ ｅｙｅｒｓ　Ｊ、ＨｌｌｌＲ，Ｔｈｏｍａｓ　ＥＤ：　Ｅｘｐ　！（ａｍａｔｏ ｌ　１３：２６７．１９８５゜１５Ｂ、Ｙｅａｇｅｒ　ＡＭ、Ｋ＠１ｚａｒ　Ｊ 　５ａｎｔｏｓ　ＧＩＪ、５ａｒａｌ　Ｒ，Ｃｏ１ｖｉｎ　ＯＭ。 Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ　コ１５：１４１．　１９８６−１５９、ｃｃｒｉｎ 　ＮＣ，入ｅｇｅｒｔｅｒ　Ｐ、　Ａｙｖｅｒｔ　Ｂ、　ｔｈｅ　Ｅ己！ｆｒに ：入ｕｔｏｌｏｇｏｕｓ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔ ｉｏｎ　（ｋｕＢＨτ）　ｆｏｒａｃｕｔｅ　ｌｅｕＪｃａｍｉａ　ｉｎ　ｒａ ｍｉｓｓｉｏｎ：　入ｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｏｎ　）コ２２ｃａｓｅｓ、Ｂｏ ｎｅ　ｍａｒｒｏｗ／　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　４：コ、１９Ｂ９　 （Ｓｕ、ｐｐ１２）・ １６０、Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ　ＤＡ、Ｔａｎ１ｚｏｔｏ　Ｍ、ＭｃＫａｎｚｉ ｅ　Ｓ、５ｈｒｉｎｅ　Ａ、０１ｄＬＩ、Ｃ１ａｒｋｓｏｎ　ＢＤ：　Ｉレ−＝ ｕｋｅｘｎ工ａ　］：４４０．　コ、９８９゜１６２、Ｇｒｉｆｆｉｎ　ＪＤ、 Ｒｉｔｚ　Ｊ、Ｎａｄｌａｒ　ｒ、ｘ、ＳＣｈｌｏｌｉＧｍａｎ　ＳＦ：　：Ｃ １１ｎ　工ｎｖａｓｔ　６ｇ＝９３２．　１９８１１６コ＋　Ｂａｌユ　ＥＤ、 　Ｂｔｒｎｉｔｒ　Ｑ’！、　Ｃ０ｒｋＷｓｔｌｌ　ＧＧ、　ＭＣ工ｎｔ’ｙｒ ｅ　ＯＲ。 ０’Ｄｏｎｎ＠ｌ　ＪＦ、Ｆａｎｇａｒ　ＩＮ：　Ｂｌｏｏｄ　６２：１２０］ 、１９１０゜１６４、　Ｂａ１ｌ　ＥＤ：　Ｂｏｎｅ　Ｋａｒｒｏｗ　Ｔｒａｎ ｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　３：３Ｆｉｌ、　１９８８゜１６５、Ｂａ１ｌ　ＥＤ 、Ｍｉｌｌｓ　ＬＥ、ＧよりｂＯｎＳ　Ｇｒ　ＣＯｒｎＷｅｌｌ　ＣｒＧｔ　Ｄ ＡＶ　１Ｓ　ＢＨ＋Ｂｌｏｏｄ　７５：１Ｌ９９，１９９０゜１６６、Ｒｏｂｅ ｒｔｓｏｎ　ＫＪ、Ｇｒｉｆｆｉｎ　ｙ、５ｏｉｆｆｅｒ　＝、Ａｎｄｅｒｓｏ ｎ　Ｋ。 Ｂｌｏｏｄ　７４（１）：　２Ｅ１３ａ、１９８９゜１６７、Ｃｈａｎｇ　Ｔｒ 、Ｇｕｌａｔユ　ＳＣ，Ｃｈａｎ　ＴＣ，Ｃｏ１ｖｉｎ　ＯＭ、Ｃ１ａｒｋｓｏ ｈＢＤ：　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒａｓ　４７：１９．１９８７゜１６ｇ、Ｌａｍｏｌ ｉ　ＲＭ、Ｇｕｌａｔｉ　ＳＣ：　Ｅｘｐ、Ｈａｍａｔｏｌ−１８：１Ｏ０８， １９９゜１６９、Ｔａｍａｙｏ　Ｅ、Ｈｅａｒｖｅ　Ｐ：　Ｅｘｐ　Ｈａｍａｔ ｏｌ　１６：９７．　工９８８゜１７０−　ＤｅＣｏｒｍｉｃｋ　Ｅ、Ｔａｍａ ｙｏ　Ｅ、Ｈｅｒｖｔ　Ｐ：　Ｂｏｎｅ　ＭａｒｒｏｖＴｒａｎｓｐ工ａｎｔａ ｔｉｏｎ　５：１コ、！、９９０゜ｘ７１．　Ｎａｒａ　Ｎ、５ｕｚｕｊｃｉ　 τ、Ｙａｍｇｈｉｔａ　Ｙ、Ｍｕｒｏｈａｓｈｉ　工、Ａｏｋｉ　Ｎ：ｃａｎｃ ｅｒ　Ｒｅｓ　４８：２コ４ｇ、１９８Ｂ。 １７２−　５ａｂｂａｔｈ　τＨ，Ｂａ１ｌ　ＥＤ、ＬＯｒｃｓｘｎ　Ｐ、Ｄａ ｖｉｓ　ＲＢ、Ｃｒ１ｆ：ｉｎ　ＪＤ：Ｊ　Ｃ１１ｎ　工ｎｖｅｓ；ｔ　７５ニ ア４６．１９８５゜１７３＋％４ｏｕｔｅｒｓ　Ｒ，Ｌａｗｅｎｂｅｒｇ　Ｂ： 　Ｂｌｏｏｄ　６１６８４，１９８４゜１７４、Ｐｅｒｓｓａｎｏ　Ｓ、Ｐａ１ ｕｘ＋ｂｏ　入、　Ｆｔｒｒｅｒｏ　ｐ、Ｐａｇｌｉａｒｄｘ　ＧＬ。 Ｂｌｏｏｄ　６４：２７５，１９８４゜１７５、Ｕｃｋスｕｎ　ＦＭ、Ｇａつ１ −Ｐｅｃｚａｌｓｋａ　Ｋ、Ｍｅｙｅｒｓ　ＤＥ、Ｒａ；１１ａｙ　ＮＣ。 Ｂｌｏｏｄ　６９：３６１，１９８７゜１７６、　Ｄｅ　Ｆａｂｒｉｔｉｉｓ　 Ｐ、Ｂｒｅｇｎｉ　Ｍ、Ｌｉｐｔ−ｏｎ　Ｊ、Ｇｒｅｅｎｂａｒｇｅｒ　Ｊ。 Ｂｌｏｏｄ　６５：１０６４，１９８５゜１７７、　Ｇｕｌａｔｉ　５Ｃ，５ｈ ａｎｋ　Ｂ、５ａｒｒｉｇ　λ、Ｂｅｒｍａｎ　Ｅ、Ｇｅｅ　ＴｔＢｏｎｅ　Ｍ ａｒｒｏｗ　Ｔｒａｎｓｐ上ａｕｘｔａｔｉｏｎ　４Ｊ１６．　Ｌ９８９゜１７ ９＋　Ｋｅｉｚａｒ　Ｈ，５ｔｕａｒｔ　ＲＸ、Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ　Ｒ，Ｂｅ ５ｃｈｏ＝＋ｅｒ　ｈＴ。 Ｂｌｏｏｄ　６５：１５０４，１９８５−１８０、　入ｎｄｒｅｗｓ　ＲＧ、　 Ｓｉｎｇｅｒ　ＪＷ、　Ｂａｒｎｓｔａｉｎ　より：　Ｂｌｏｏｄ６７：８４２ ．　１９８６＋ ｉ８Ｌ　Ｂｒａｎｄｔ　Ｊ、Ｂａ１ｒｄ　Ｎ、Ｌｕ　Ｌ、５ｒｏｕｒ　Ｅ、Ｈｏ ｆｆｍａｎ　Ｒ：　、７Ｃ１工ｎ工ｎｖｅｓｔ　Ｂ２：１０１７，１９８８．１ ｓ２．　ｋπテｅｗｓ　ＲＧ、Ｓｘｎｇｅｒ　藷、ｎｅＪｓｔａ工ｎより：　Ｊ 　ｏｆ　Ｅｘｐ　Ｍａｄ１６９：１７２１．　１９８９゜ １８コ、　Ｂａｒｅｎｓｏｎ　ＲＪ、Ａｎｄｒ＠ｗｓ　ＲＧ、Ｂｅｎ５工ｎｇｅ ｒ　Ｗ工、ＩＣａｌａｍａｓｚ　ＤＦ。 Ｊ、Ｃｈｉｎ　工ｎｖｅｓｔ　１１！１：９５１，１９１１１１３゜１８４、Ｂ ｅｓｉｎｇｅｒ　６丁、Ｂａｒｅｎｓｏｎ　ＲＪ、入ｎｄｘｅｗｓ　ＲＧ、Ｋａ 工ａｍａｓｚ　ＤＦ。 Ｂｏｎａ　Ｍａｒｒｏｗ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　４：８６．１９８ ９　（Ｓｕｐｐｌ　２１’。 １８５、　５ｉａｎａ　Ｓ、Ｂｒｅｇｎｉ　Ｍ、Ｂｒａｎｄｏ　Ｂ、Ｒａｖａｇ ｎｏｎｉ　Ｆ、ＢｏｎａｄｏｒｕｖａＧ、　Ｂｌｏｏｄ　７４：１９０５．１９ ８９−１８６、Ｍｏｏｒｅ　ＫＡＳ、Ｗａｒｒｅｎ　Ｄ：　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ 　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ｌｌＪ、５−Ａ−８４＝７Ｄ４，１９８７゜ １８７、　工ｇｃｏｖｅ　１→ＩＮ、Ｓｈａｗ　入Ｒ，Ｋｅｌｌｅｒ　Ｇ二　Ｊ 　ｏｆ　工＝ｕｎｏ１１４２：２コ３２．　１９８９゜ １ｓｓ、Ｒｏｗｌａｙ　ＳＤ、Ｊａｎ＠ｓ　ＲＪ、ＰｉａｎｔａｄＯＧｉ　Ｓ、 Ｂｒｏｖｉｎｅ　ＨＧ、Ｂｌｏｏｄ７４：５０１，１９８９゜ １８９、Ｌａｍｏｌｉ　ＲＭ、Ｔａｆｕｒｉ　λ、Ｓｔｒ工ｆａ　Ａ、入ｎｄｒ ｅａｆｆ　Ｍ、Ｃｌａｒｋｇｏ。 ＢＤ、Ｇｕｌａｔｉ　ＳＣ：　入ｂｓｉｔｒａｃｔ　ａｃｃａｐｚａｄ、１９９ ０゜１９０、Ｃ１ａｒｋｓｏｎ　ＢＤ、Ｇａｅ　ＴＳ、ａｅｒｅａｘｇ−υ■　 Ｒ，ｅｔ　ａｌ−ＣＲＣｃｒｉｔｉｃａｌ　ｒｅｖｉｅｗ　工ｎ　Ｏｎｃｏｌｏ ｇｙ／Ｈａｍａｔｏｌｏｇｙ　４：２２ニー２４８゜１９Ｌ　Ｇａ１ｅ　ＲＰ、 Ｈｏｒｏｗｉｔｚ　ＭＭ、Ｂｉｇｇｓ　ＪＣ，ｅｔ　ａｌ、　シｎｃｅ＝８６４ ７：：Ｌ１１９−　ＬＬｌｌ、１９８９゜１９２、Ｃ１ａｒｋｓｏｎ　ＢＤ、　 、：ｒ　Ｃ１１ｎ　０ｎｃｏｌ　３：１コ５−１コ９．　１９８５゜１９コ、Ｓ ｃｈｅｉｎｂｅｒｇ　ＤＡ、Ｈａｕｇｈｔｏｎ　λＮ、０ｎｃｏ１ｏｑ７１＝３ １−４０．　１９Ｂ７゜１９４、Ｒｏｓａｎ　Ｓ’Ｔ、Ｚｘｍｎｅｒ　入Ｍ、ａ ｔ　ａｌ、　Ｊ　Ｃ１１ｎ　０ｎｃｏ１　５：５６２−５７３゜１９５、Ｐｒｅ ｓｓ　Ｏ，Ｅａｒｙ　Ｊ、Ｂａ、ｄｇｅｒ　Ｃ口、ａｔ　ａｍ、　Ｊ　ＣＬｉｎ 　０ｎｃｏ１１７：１０２７−１０’３８．　１９８９゜１９６、Ｂａ１ｌ　Ｅ Ｄ、Ｂｅ７１ｅｒｉ　ＧＭ、Ｃｏｒｎｗｅｌｌ　ＧＧ、ｅｔ　ａｌ、　Ｂｌｏｏ ｄ　６２：ユ２０３（２１０，１９８コ。 １９７、Ｔａｎｈａａｔｏ　Ｍ、Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ　ＤＡ、Ｃｏｒｄｏｎ− Ｃａｒａｄｏ　Ｃ，ａｔ　ａｌ。 Ｌａｕｋａｍｉａ　］：コ３９−３４８．　１９８９゜１９８、Ｓｃｈｅｉｎｂ ｅｒｇ　ＤＡ、Ｔａｎｉｍｏｔｏ　Ｍ、ＭｃＫａｎｚｉｅ　Ｓ、ｅｔ　ａ、ｌ、 Ｉ７ｅｕｋｅｍｉａ　］：４４０−４４５．　１９８９゜工９９．　ＢｅｒｎＳ ｔｔ工ｎ　より、Ｓユｎｇｅｒ　ＪＷ、入ｎｄｒａｗｓ　ＲＧ、ａｔ　ａｌ、　 Ｊ　Ｃ１ｉ。 工ｎｖａｓｔ　７９：１１５３−１１５９．　１９８７゜２ｏｏ、Ｇｒｆ：ｉｎ 　ＪＤ、Ｌｉｎｃｈ　Ｄ、５ａｂｂａｔｈ　Ｋ、ａｔ　ａｌ、　Ｌａｕｋａｍｉ ａ　Ｒｅ５Ｆ１：５２１−５３４．　１９８４゜ ２０１、Ｄｉｖｇｉ　ＣＲ，Ｍｉｎｎｉ？、ｉ　ＪＧ、Ｏｌｄ　Ｌ７．　Ｓｃｈ ｅｉｎｂｅｒｇ　ＤＡ、　Ａｍｅｒ入５ｓｏｃ　Ｃａｎｅａｒ　ＲＥｓ　コ０： 　λｂｓ　／１６０６．　１９８９゜２０２、　Ｈｏｕｇｈｔｏｎ　ＡＪＪ、に １ｎ＝ｚｅｒ　ｏ、ｃａｒｄｏｎ−ｃａｒｃｉｏ　ｃ、ａｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　υＳλ　８２：　１２４２−１２４６．　１９８ ５゜２０３、ＫａＳｓｌＳ　ＡＩＩ　入ｄｅｌｓｔａｉｎ　ｓ、７．　Ｔ（ａ’ ｙＣ口ｃｋ　Ｃ，５ａｓ＝ｒｙ、ＫＳＲ。 Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　８４．　４０７−４２５．　１９８０ ゜２０４、Ｃｏｆｆ１ｎ、；、Ｍ、ｉｎ　ＬＮＡ　Ｔｕ＝ｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ 、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ａｄｓ。 Ｗｅｉｓｓ、Ｒ，、Ｔａ１ｃｈ、Ｎ、、Ｖａｒｍｕｓ、Ｈ，＆　Ｃｏｆｆ工ｎ、 Ｊ、（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、、Ｃ口ｉｓ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｉ ａｒｂｏｒ、ＮＹ）、ｐｐ、３６−７３（１９８５）。 ２０５、Ｔｅｅｉｎ、Ｈ，Ｍ−ｉｒ＋　Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ、ｅｄ−Ｋ ｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ、Ｒ。 （Ｐｌｅｎｕ＝、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、ｐｐ、１４９−４８７゜２０６、Ｇ１１ ｂｏａ、Ｅ、Ｂ工ｏＥｓｓａｙｓ　５，２５２−２５８゜２０７、Ｗｉｌｌｉａ ｍｓ　ｅｔ　ａｌ、、　五旦；トＢ３区し２工Ｙｒ　””　ｅｄ土゛ヒｉｏｎ、 　ＭＣＣｒａＷＨｌｌｌ、ｘｃ＋９ｏ。 ２０Ｂ、Ｋａｒｌｓｓａｎ　ａｔ　ａｌ、ＰＮＡＳ　旦乏：６０６２　（１９８ Ｂ）。 ２０９、Ｇｒａｂｅｒ　ａｔ　ａｌ、旦；よ旦二；塵　２コ０ＪＯ５７（１９８ ５）。 ２１０、Ｃｕ１ｓｈａｎｂｉｒ　ａｔ　ａｌ、　旦−ユニ二二塵　２３コニ１１ ９２　（１９８６）。 ２”−ニー　Ｇｏｕｄ　ａｔ　ａｌ　！＝ニス匹ヱ田：２５１　（１９８８Ｌ２ １２、Ｓｃｈａｉｎｂｔｒｇ　ａｎｄ　５ｔｒａｎｄ　ｙ＋　”’　Ｑ：４４　 ４１９Ｂ２）。 ２１１　Ｓｈｉｍ工＠ｔ　ａｍ、、Ｌ！Σ！」包≦ｋＩ：８７］　（１９７６） 。 ２１４、Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ、Ｇ、Ｌ、、Ｈｏｚｕｍｉ、Ｎ、、５ｈｕｎｕり、 Ｍ、Ｊ、、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、］ｌ：６４３　［１８８４）。 ２１５、　Ｎｅｕｂａｒｇａｒ、　Ｍ−５，、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　（ Ｌｏｎｄｏｎ）　３１４＋　２６８（１９８５）。 ２１７、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ、　Ｍ、Ｍ工１ｓｔｅユｊｉ、　ｅ−、Ｗｉｎｔａ ｒ、　Ｇ−、ＲａｓｈａｐｉｎｇＨｕｍａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ｇｒａ ｆｔ工ｎｑ　ａｎ　Ａｎｔｉユｙｓｏｚｙｍｅ　ＡＣ＝ｉｖｉｔｙ。 ５ｅｌａｎＣｅ　２：１９：１５４４−６　（：１９８８）。 ２ｉ８．Ｒｉａｃｈｍｏｎｄ、Ｌ、、Ｃ１ａｒｋ、Ｍ、Ｒ−、ＷａｌＣ３５ａｎ ｎ、Ｈ，、Ｗｉｎｔｅｒ。 Ｇ、、Ｒａ５ｈａｐｉｎｑ　ＨＬｉｍａｎ　入ｎｔｉｂｏｄ工ｅｓ　ｆａｒ　Ｔ ｈｅｒａｐｙ、Ｎａ１ｔｕｒａ：ｌ’！２：３２３−２７　（１９９０）。 図３ ｏ　ｏ　＋１　１　１０　１ｏ。 ＩｇＧ添加されたｍｌ当たりの１１２ 図４ 分 ２．０　図５ 罷 図６ ｎｏｎｅ　Ｍ１９５　Ｍｙ９　Ｌ４Ｆ３　！ｔｙフ　ＯにＢフ　にコ１標よされ ていないブロッキングＩｇＧ 図１２ ｃ　−０− １蟲　甑 ｊ 区 ！ □ 図１５ｔＢ）　□ ２０二 を 時間ｉｈ’Ｈ 図１８ μｌ当にりのＷＯ 日 図１９ 血小板／１０００ 日 図２０ 図２０（Ａ）ＤＮＲ／ＡＲＡイ１：よ、誘導図２［］　［Ｂ） 細胞カウント／＋０００ 日 図２１ ＷＥＣ／ＬＯＯＯ 図２２ シト０ウイルスベクター　マウスモノクローナル抗−レトロウィルス外被蛋白質 ウサギ 標的レトロウイルスヘクターを始原細腎こ特異　３ト標的細胞的に結合させ、引 き続いて内在化させる（次図）要約書 白血病を治療および診断するための治療剤および方法が提供される。係る治療剤 はモノクローナル抗体Ｍ１９５　、Ｍ＋９５の抗原に対して結合できるポリペプ チドまたはキメラ抗体を含有し、これら成分は単独で、或いは例えば放射性アイ ソトープのような細胞障害剤に結合されて含有される。標的細胞に遺伝情報を導 入する方法もまた提供される。 国際調査報告 曜＋ｍ中１１１．工、−＾−−＋−ｍ、ＰＣＴ／ＵＳ≧フーＤ１０７４３６

Claims (63)

【特許請求の範囲】
1. １．モノクローナル抗体Ｍ１９５（ＡＴＣＣ番号：ＨＢ１０３０６）が結合する 抗原に対して特異的に結合し得るアミノ酸配列から実質的になるポリペプチド。
2. ２．前記アミノ酸配列が、前記抗原に結合するために必要なモノクローナル抗体 Ｍ１９５（ＡＴＣＣ番号：ＨＢ１０３０６）の超可変領域のアミノ酸配列から実 質的になる請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。
3. ３．前記アミノ酸配列が、モノクローナル抗体Ｍ１９５（ＡＴＣＣ番号：ＨＢ１ ０３０６）の超可変領域のアミノ酸配列と実質的に同一である請求の範囲第２項 に記載のポリペプチド。
4. ４．前記アミノ酸配列が、モノクローナル抗体Ｍ１９５（ＡＴＣＣ番号：ＨＢ１ ０３０６）の超可変領域のアミノ酸配列と同一である請求の範囲第３項に記載の ポリペプチド。
5. ５．請求の範囲第１項、第２項、策３項または第４項の何れかに記載のポリペプ チドを具備したキメラ抗体。
6. ６．前記抗体は、夫々がジスルフィド結合で連結されたヘビー鎖およびライト鎖 を含む二つのダイマーを具備し、少なくとも一つの鎖が前記ポリペプチドおよび 定常領域を含む請求の範囲第５項に記載のキメラ抗体。
7. ７．前記定常領域がヒト免疫グロブリンの定常領域である請求の範囲第６項に記 載のキメラ抗体。
8. ８．前記夫々の鎖が前記ポリペプチドおよびヒト免疫グロブリン由来の定常領域 を含む請求の範囲第６項に記載のキメラ抗体。
9. ９．更に、ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列およびヒト抗体の定常領域の アミノ酸配列を具備する請求の範囲第５項に記載のキメラ抗体。
10. １０．更に、ＣＤＲ−移植抗体を具備する請求の範囲第５項に記載のキメラ抗体 。
11. １１．請求の範囲第１項、第２項、第３項または第４項に記載のポリペプチドと 、これに結合された細胞傷害剤とを具備した治療剤。
12. １２．請求の範囲第５項、第６項、第７項、第８項、第９項または第１０項に記 載のキメラ抗体と、これに結合された細胞傷害剤とを具備した治療剤。
13. １３．モノクローナル抗体Ｍ１９５（ＡＴＣＣ番号：ＨＢ１０３０６）と、これ に結合された細胞傷害剤とを具備した治療剤。
14. １４．前記細胞傷害剤が放射性アイソトープである請求の範囲第１１項、第１２ 項または第１３項に記載の治療剤。
15. １５．前記放射性アイソトープがアルファ粒子放出剤である請求の範囲第１４項 に記載の治療剤。
16. １６．前記アルファ粒子放出剤が、鉛−２１２、ビスマス−２１２およびアスタ チン−２１１からなる群から選択される請求の範囲第１５項に記載の治療剤。
17. １７．前記アルファ粒子放出剤がビスマス−２１２である請求の範囲第１６項に 記載の治療剤
18. １８．前記放射性アイソトープがベータ粒子放出剤である請求の範囲第１４項に 記載の治療剤。
19. １９．前記ベータ粒子放出剤が、ヨウ素−１３１、スカンジウム−４７、レニウ ム−１８６、レニウム−１８８及びイットリウム−９０からなる群から選択され る請求の範囲第１８項に記載の治療剤。
20. ２０．前記ベータ粒子放出剤がヨウ素−１３１である請求の範囲第１９項に記載 の治療剤。
21. ２１．前記べーク粒子放出剤がイットリウム−９０である請求の範囲第１９項に 記載の治療剤。
22. ２２．前記放射性アイソトープがオージェ電子発生剤である請求の範囲第１４項 に記載の治療剤。
23. ２３．前記オージェ電子発生剤がヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、臭素−７７ およびインジウム−１１１からなる群から選択される請求の範囲第２２項に記載 の治療剤。
24. ２４．前記オージェ電子発生剤がヨウ素−１２３である請求の範囲第２３項に記 載の治療剤。
25. ２５．前記放射性アイソトープが融合可能な核種である請求の範囲第１４項に記 載の治療剤。
26. ２６．前記融合可能な核種がポロン−１０またはアクチニドである請求の範囲第 ２５項に記載の治療剤。
27. ２７．白血病を治療するのに有効な量の請求の範囲第５項のキメラ抗体と、薬剤 的に許容され得る担体とを含有する薬剤組成物。
28. ２８．白血病を治療するのに有効な量の請求の範囲第１１項、第１２項または第 １３項の治療剤と、薬剤的に許容され得る担体とを含有する薬剤組成物。
29. ２９．白血病を治療するのに有効な量のモノクローナル抗体Ｍ１９５（ＡＴＣＣ 番号：ＨＢ１０３０６）と、薬剤的に許容され得る担体とを含有する薬剤組成物 。
30. ３０．白血病の患者を治療する方法であって、白血病細胞を破壊するように、請 求の範囲第５項のキメラ抗体を患者に投与し、これにより愚者を治療することを 具備する方法。
31. ３１．白血病の患者を治療する方法であって、白血病細胞を破壊するように、請 求の範囲第１１項、第１２項または第１３頂の治療剤を患者に投与し、これによ り患者を治療することを具備する方法。
32. ３２．前記治療剤の量が約０．０５ｍｇ〜約５００ｍｇである請求の範囲第３０ 項または第３１項に記載の方法。
33. ３３．前記治療剤が静脈内投与される請求の範囲第３０項または第３１項に記載 の方法。
34. ３４．前記治療剤がヨウ素−１３１を含有し、また約５０ｍＣｉ〜約２００ｍＣ ｉのヨウ素−１３１が投与される請求の範囲第３１項に記載の方法。
35. ３５．前記治療剤がイットリウム−９０を含有し、また約１０ｍＣｉ〜約５０ｍ Ｃｉのイットリウム−９０が投与される請求の範囲第３１項に記載の方法。
36. ３６．前記治療剤がビスマス−２１２を含有し、また約２０ｍＣｉ〜約ＳＯｍＣ ｉのビスマス−２１２が投与される請求の範囲第３１項に記載の方法。
37. ３７．前記治療剤がヨウ素−１２３を含有し、また約１００ｍＣｉ〜約３００ｍ Ｃｉのヨウ素−１２３が投与される請求の範囲第３１項に記載の方法。
38. ３８．ヒト患者の生来の骨髄細胞を破壊する方法であって、該患者に対して、そ の骨髄細胞を破壊するために有効な量の請求の範囲第５項のキメラ抗体を投与す ることを具備した方法。
39. ３９．ヒト患者の生来の骨髄細胞を破壊する方法であって、該患者に対して、そ の骨髄細胞を破壊するために請求の範囲第１１項、第１２項または第１３項の治 療剤を投与することを具備した方法。
40. ４０．前記治療剤またはキメラ抗体の量が約０．０１ｍｇ〜約５０ｍｇである請 求の範囲第３８項または第３９項に記載の方法。
41. ４１．前記治療剤またはキメラ抗体が静脈内投与される請求の範囲第３８項また は第３９項に記載の方法。
42. ４２．白血病を治療する方法であって、ヒト白血病患者から、白血病細胞を含む 骨髄細胞を取り出すことと；こうして取り出された骨髄細胞を、その中に存在す る白血病細胞を破壊するために、請求の範囲第５項のキメラ抗体と接触させるこ とと；こうして得られた骨髄細胞を、患者に自己的に再注入することとを具備す る方法。
43. ４３．白血病を治療する方法であって、ヒト白血病患者から、白血病細胞を含む 骨髄細胞を取り出すことと；こうして取り出された骨髄細胞を、その中に存在す る白血病細胞を破壊するために、Ｍ１９５モノクローナル抗体（ＡＴＣＣ番号： ＨＢｌ０３０６）およびウサギ若しくはモルモット補体と接触させるＢとと；こ うして得られた骨髄細胞を、患者に自己的に再注入することとを具備する方法。
44. ４４．白血病を治療する方法であって、ヒト白血病患者から、白血病細胞を含む 骨髄細胞を取り出すことと；こうして取り出された骨髄細胞を、その中に存在す る白血病細胞を破壊するために、請求の範囲第１１項、第１２項または第１３項 の治療剤と接触させることと；こうして得られた骨髄細胞を、患者に自己的に再 注入することとを具備する方法。
45. ４５．患者から取り出された白血病細胞を含む骨髄細胞の前記接触が、ウサギ補 体、モルモット補体またはヒト補体の存在下で行われる請求の範囲第４２項また は第４４項に記載の方法。
46. ４６．ヒト患者の白血病を診断する方法であって、該患者に対して、画像化剤で ラベルされた請求の範囲第１項、第２項、第３項または第４項のポリペプチドを 、該ポリペプチドと患者内に存在する何れかの白血病細胞との間の複合体が形成 されるような条件下で投与することと、こうして形成された何れかの複合体を画 像化して白血病を診断することとを具備した方法。
47. ４７．ヒト患者の白血病を診断する方法であって、該患者に対して、Ｍ１９５（ ＡＴＣＣ番号：ＨＢ１０３０６）モノクローナル抗体が結合する抗原に向けられ 且つ画像化剤でラベルされた抗体を、該抗体と患者内に存在する何れかの白血病 細胞との間の複合体が形成されるような条件下で投与することと、こうして形成 された何れかの複合体を画像化して白血病を診断することとを具備した方法。
48. ４８．前記抗体がＭ１９５（ＡＴＣＣ番号：ＨＢ１０３０６）モノクローナル抗 体である請求の範囲第４７項に記載の方法。
49. ４９．ヒト患者の白血病を診断する方法であって、該患者に対して、画像化剤で ラベルされた請求の範囲第５項のキメラ抗体を、該抗体と患者内に存在する何れ かの白血病細胞との間の複合体が形成されるような条件下で投与することと、こ うして形成された何れかの複合体を画像化して白血病を診断することとを具備し た方法。
50. ５０．前記画像化剤が白血病細胞中に内在化される、請求の範囲第４６項、第４ ７項、第４８項または第４９項に記載の方法。
51. ５１．前記画像化剤が放射性アイソトープである請求の範囲第５０項に記載の方 法。
52. ５２．前記放射性アイソトープが陽電子放出性の放射性金属である請求の範囲第 ５１項に記載の方法。
53. ５３．前記放射性アイソトープがガンマ線放出性の放射性金属である請求の範囲 第５１項に記載の方法。
54. ５４．前記放射性アイソトープがヨウ素−１３１である請求の範囲第５１項に記 載の方法。
55. ５５．前記放射性アイソトープがヨウ素−１２３である請求の範囲第５１項に記 載の方法。
56. ５６．前記放射性アイソトープがインジウム−１１１である請求の範囲第５１項 に記載の方法。
57. ５７．前記放射性アイソトープがテクネチウム−９９ｍである請求の範囲第５１ 項に記載の方法。
58. ５８．造血性細胞内に遺伝情報を担持させる方法であって、該細胞を、遺伝情報 が付着された請求の範囲第１項、第２項、第３項または第４項のポリペプチドと 接触させ、該ポリペプチドを前記細胞に結合させて複合体を形成した後、これを 前記細胞中に内在化させて前記遺伝情報を細胞中に担持させることを具備した方 法。
59. ５９．造血性細胞内に遺伝情報を担持させる方法であって、該細胞を、遺伝情報 が付着された請求の範囲第５項のキメラ抗体と接触させ、該抗体を前記細胞に結 合させて複合体を形成した後、これを前記細胞中に内在化させて前記遺伝情報を 細胞中に担持させることを具備した方法。
60. ６０．造血性細胞内に遺伝情報を担持させる方法であって、該細胞を、遺伝情報 が付着され且つＭ１９５（ＡＴＣＣ番号：ＨＢ１０３０６）モノクローナル抗体 が結合する抗原に向けられた抗体と接触させ、該抗体を前記細胞に結合させて複 合体を形成した後、これを前記細胞中に内在化させて前記遺伝情報を細胞中に担 持させることを具備した方法。
61. ６１．前記抗体がＭ１９５（ＡＴＣＣ番号：ＨＢ１０３０６）モノクローナル抗 体である請求の範囲第６１項に記載の方法。
62. ６２．前記遺伝情報がレトロウイルスベクター内のものである請求の範囲第５８ 項、第５９項、第６０項または第６１項に記載の方法。
63. ６３．インビボで白血病を診断するための、請求の範囲第１項のポリペプチドの 使用。