JPH05504465A - 扁平上皮癌の抗原分化のためのモノクローナル抗体および同抗体の使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 扁平上皮癌の抗原分化のための モノクローナル抗体および同抗体の使用法発明の背景 １、発明の分野 本発明は扁平上皮癌の抗原分化のための特異的結合抗体、およびそのモノクロー ナル抗体の使用法に関する。特に、分子量４８〜５０キロダルトンおよび５７キ ロダルトンの細胞骨格タンパク質の扁平上皮癌抗原の分化のためのマウスモノク ローナル抗体、およびそのモノクローナル抗体の使用法に関する。

２、従来技術に関する記述 Ｇ、　ＫｏｈｌｅｒとＣ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎは、”Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　Ｃｕ １ｔｕｒｅ　ｏｆ　ＦｕｓｅｄＣｅｌｌｓ　５ｅｃｒｅｔｉｎ　Ａｎｔｉｂｏｄ ｉｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ　５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”と題するＮａｔ ｕｒｅ　２６５：４９５　（１９７５）の論文でリンパ球融合法について報告し ている。彼らは、前以て抗原に免疫させたマウスから取り出したひ臓細胞にマウ スの骨髄腫腫瘍細胞を融合することによってモノクローナル抗体を産生じた。こ の抗体産生法の発見は、純粋な抗体および抗原試薬の無限な供給法を呈示するこ とであった。これら抗体は癌の診断上、治療上において有効な道具となる。

形層上皮が、表皮、口や口腔、食道、喉頭蓋、喉頭、咽頭、ちつ、および子宮頚 管にある。これらは扁平上皮癌やその形質転換過程での前駆体細胞が存在する場 所である。前駆体細胞は、形質転換のどの段階にあろうと、扁平上皮細胞であっ て侵襲性の扁平上皮癌になる準備をする。この１′扁平上皮癌の予備段階」は［ 真の悪性」状態の細胞の前段階に生ずる段階（癌的細胞）である。扁平上皮癌の 予備段階は形態学的に正常な扁平上皮細胞、異型（過形成、化生、過角化）、著 しい異型、異形成［ディスブラシー］（穏やかなディスブラシー−ＣＩＪｌ、中 程度のディスブラシー−ＣＩＮ　Ｉｆ、重度のディスブラシー−ＣＩＮ　ＩＩＩ ）　、あるいは上皮内癌（ＣＩＳ）である。扁平上皮癌の予備段階にある良性の 扁平上皮細胞は侵襲性扁平上皮癌に貢献することはない。

扁平上皮癌（以下ｒｓｃｃＪと言うことがある）は、頭、首、肺、口腔、または 子宮頚管の癌の昔からの通常のタイプである。扁平上皮癌に関係する分子標識の 同定および特性は、扁平上皮癌のいち早い診断法および治療法を可能にする。扁 平上皮癌の標識に関する機能的研究は、この種の癌の生物学についての理解を深 めるのに役立つ。

モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）は腫瘍関連の抗原を研究するのに分子的、機能 的なプローブとして有効な道具である。扁平上皮癌に対して発生するモノクロー ナル抗体の大多数は扁平上皮癌の細胞系を免疫原として用いることにより産生さ れる。かかるモノクローナル抗体により規定される抗原分子は、フィブロネクチ ン［ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）や細胞骨格化合物を含む。扁 平上皮癌に反応するいくつかのモノクローナル抗体がこれまでに報告されている が、これら抗体の多くはその他の癌にも交差反応するか、あるいはその反応性は 一定組織の扁平上皮癌だけに限定されたものである。

抗体は表皮ケラチン細胞上に発生するが、その扁平上皮癌への反応性は評価され ている。ヒト表皮ケラチン細胞に発生したモノクローナル抗体、Ｖ）Ｊ−２は、 扁平上皮癌や基底細胞癌は勿論、表皮の基底層に選択的に結合することが報告さ れている。この抗体は次の２つの文献に述べれられている。即ち、Ｍｏｒｈｅｎ ｎ等の“Ａ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ａｇａｉｎｓｔ　Ｂａ ５ａｌ　Ｃｅ１ｌ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ：　Ｐｏｔｅｎｔｉ ａｌ　Ｕｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｃｅｒｖｉｃａｌ　 Ｎｅｏｐｌａｓｉｓ″Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　７６：　１９７８ −１９８３．１９８５、および０ｓｅｒ。

ｆｆ等の“Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｍｕｒｉｎｅ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏ ｄｙ　Ｗｈｉｃｈ　Ｂｉｎｄｓ　ｔ。

ｌｊａｌｉｇｎａｎｔ　Ｋｅｒａｔｉｎｏｅｙｔｅｓ　ｔｏ　Ｄｅｔｅｃｔ　Ｔ ｕｍｏｒ　Ｃｅ１ｌｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａｌｌｙ　Ｃｏｎｔｒｏ ｌｌｅｄ　Ｓｕｒｇｅｒｙ”　Ｊ、　Ａｍ、　Ａｃａｄ、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ、 、　８：６１６−６１９．１９８３である。

サイトケラチン（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎｓｉに発生したモノクローナル抗体は 正常上皮および悪性上皮におけるケラチン発現の研究用プローブとして利用され ている。サイトケラチンは形層上皮の異なる層では分配の分化特異的パターンを 示す。特定のケラチンポリペプチドもまた扁平上皮癌の分子メーカーであると報 告されている。抗ケラチンＭＡｂｓは扁平上皮癌を含む膿瘍の治療用ツールとし て報告されている。

扁平上皮癌の抗原に反応するものとして知られている抗体としては、ＭＡｂｓ　 ＡＥｌ、　ＡＥ３．　ＭＡｂ　１７．１３．　ＭＡｂｓ、　ＰＫＫＩ、及びＰＫ Ｋ２がある。これらの抗体は下記の文献等、多くの文献に記載されている。しか しこれらの抗体は、約４８から５０キロダルトンおよび５７キロダルトンの分子 量の細胞骨格タンパク質を分化することができない。

！ｊＡｂｓ　ＡＥＩおよびＡＥ３はＴ、Ｔ、Ｓｕｎ等のＪ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　 Ｄｅｒｍａｔｏｌ、、　８１：　１０９５　（１９８３）：　Ｗ、Ｇ、Ｎｅ１ｓ ｏｎ等のＣａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４４：　１６００　（１９８４）；　Ｈｙｂ ｒｉｔｅｃｈ、　Ｉｎｃ、　（Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ）のＭＡｂｓ　ＡＥＩおよび ＡＥ３の入った製品：　Ｊ、　Ｒｅ１ｂｅ１等のＡｃｔａ　Ｐａｔｈ、　Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌ、　１ｍｍｕｎｏ１．５ｃａｎｄ。

５ｅｃｔ、　Ａ　９３：　３２３　（１９８５）　ＭＡｂ　ＡＥＩの組織特異性 は上皮基底層と殆ど全ての上皮組織である。ＭＡｂ　ＡＥ３の組織特異性は表皮 全体と全ての上皮組織である。ＭＡｂ　ＡＥＩは非扁平上皮癌（例えば腺癌）は 勿論、扁平上皮癌にも結合する。ＭＡｂ　ＡＥ３のみを用いて扁平上皮癌を染色 する方法についてはまだ情報がない。ＭＡｂ　ＡＥＩは酸性のケラチン（Ｍｒ　 ４０．５０および５６．５キロダルトン）を認識するが、ＭＡｂ　ＡＥ３は塩基 性のケラチン（５８，５２および６５−６７キロダルトン）を認識する。）ｌｙ ｂｒｉｔｅｃｈは「これら２つの抗体のコンビネーションが殆ど全ての既知のヒ ト上皮ケラチンを認識する」と主張している。これらの抗体はケラチンに対して 広い反応域を持っているので、上皮組織ならびにその新生物［１６０ｐ　ｌａｓ ｍ］を非上皮組織およびその新生物から識別するのに有効である。しかしこれら 抗体のいずれも「形層扁平上皮組織」およびそれから派生する新生物を、ほかの 種類の上皮組織（例えば単純な上皮組織）やその他の上皮組織起源の膿瘍から識 別することができない。

ＭＡｂ　１７．１３についてはＲ，Ｒａｎｋｉｎ等がＣａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　 ４７：　５６８４　（１９８７）に、また欧州特許出願第８７３１１４０２．０ 号（Ｉｎｔｅｋ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）に記載している。（後者は多数の抗扁 ヰ上皮癌抗体の特性について要約している）　この抗体に認識された抗原の特徴 については何も報告されていない。抗原は電子顕微鎮のデータに基づき中間型の フィラメントであろうと推測されている。上記欧州特許比願は抗原かサイトケラ チンではない、と述べている。この抗原は形層扁平上皮組織の基底層に特異性で ある。Ｃ１Ｎ（Ｉ　−■段階）の前癌病変に対するその反応性は約３０％強であ る。ＭＡｂ　１７．ｉ３抗原の分子量その他の特徴についてはまだ報告されてい ない。ＭＡｂ　１７．１３の扁平上皮癌に対する反応性は一様である。

ＭΔｔ）　１７．１３の動物組織に対する反応性は知られでいない。

ＭＡｂｓ　ＰＫＫＩとＰＫＫ２はＨｏ１ｆｈｏｆｅｒ等によりＬａｂ、）ｎｖｅ ｓｔ、　４９：　３１７（＋９８３）に記述さねている。また、ＭＡｂｓ　ＰＫ ＫＩおよびＰＫＫ２のための丁、ａｂＳｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、　（Ｃｈｉｅ ａｇｏ、　１ｌｌｉｎｏｉｓ）の製品がある。これらの抗原は各々サイトケラチ ン（Ｍｒ　４１キロダルトン、４５キロダルトン、４８キロダルトンおよび５６ キロダルトン）であるＰＫＫ　１抗原およびまだよく知られていないＰＫＫ２抗 原を認識する。ＭＡｂＰＫＫＩは形層上皮組織の全層に結合する。ＰＫＫ２は、 正常肺の円柱上皮は勿論、形層扁平上皮組織の基底層ならびに単基底層に結合す る。ＭＡｂ　ＰＫＫ２は扁平上皮癌に結合するが、細気管支肺胞上皮癌にも結合 する。ＭＡｂ　ＰＫＫＩは形層上皮組織の全層に結合し、広範囲のサイトケラチ ンに反応する。ＭＡｂ　ＰＫＫ２もまた形層上皮組織は勿論、正常の円柱上皮（ 肺）に反応する点で広い反応性を示す。このようにそれは、ほかの種類の上皮組 織から形層扁平上皮組織を識別することができない。一方、その腫瘍の反応性も また非扁平上皮癌型の肺腫瘍に反応するという点で特異性を欠く。

従来、多くの器官中の扁平上皮癌抗原に特異性で、診断薬、治療薬として有用な 抗体剤は存在しない。

発明の概要 本発明は、扁平上皮癌（以下、ＳＣＣと言うことがある）および形層上皮組織の 幹細胞集団に結合する抗原だけを必須に認識する抗体製剤に関する。好ましくは この製剤は、モノクローナル抗体ＭＡｂ　１７４Ｆ１．６４またはその特異結合 ７ラグメントを包含する。

ＭＡｂ　１７４１（，６４に認識される抗原には、約４８から５０キロダルトン および５７キロダルトンの分子量の細胞骨格タンパク質を含む。

本発明は免疫組織学によって扁平上皮癌膿瘍の治療用に使う方法、血清中の循環 する扁平上皮癌抗原の免疫シンチグラフイ、非侵襲性診断の免疫画像処理による インビボでの処置、細胞障害薬に結合されているかまたはラジオアイソトープで 標識された抗体を用いた扁平上皮癌腫瘍の処置、および形層扁平上皮組織の正常 および病的状態の研究手段としての使用法もある。

本発明は抗体、抗体製剤、または本発明の方法が使用されるキットも含む。

図面の簡単な説明 第１図は扁平上皮癌組織に結合するＭＡｂ　１７４Ｈ，６４の状態を示す。ヒト の肛−＝と亘腸の扁平上皮癌の末梢層が免疫過酸化酵素で選択的に染色される。

第２図はＤＭ（ダウノマイシン）単独の場合と比較して種々の抗体および抗原抱 合体の細胞殺傷の特異性を示す。

第３図は”’Ｉ−ＩＵＤＲの取り込みを接種したＳＣＣ細胞に対し示すものであ る。

第４図は、いろいろに前処理されたＳＣＣ細胞の結果として取り込みが減少した ことを示す。

＠５！は、ＳＣＣ細胞をマウスに注射後、それらマウスがＤＩＪ、　ＭＡｂ　１ ７４Ｈ，６４またはＭＡｂ　１７４Ｆ１．６４−ＤＭ抱合体で処理されたときの 取り込みを示す。

第６図は、腫瘍のあるマウスの生存率についてのＭＡｂ　１７４Ｈ，６４−ＤＭ 効果を示す。

第７図は、１７４Ｉ（，６４−ＤＭ抱合体によって胸上部へ転移した頚部扁ニド 皮癌を持つ一息者の肺のスキャン写真である。

発明の詳細な説明 本発明の中には抗体製剤が含まれる。′抗体製剤”という言葉は本発明によるす べての抗体ならびにこれら抗体の特異結合７ラグメントを包含する。本発明に基 づく抗体あるいは抗体フラグメントは他の物質と抱合させることができる。この ような抱合する物質にはラベル体（制限なしに、放射性同位元素、酵素、補酵素 、酵素阻害剤、蛍光団と蛍光消光剤を含む）、ダウノマイシンのような細胞毒薬 剤および高分子クロマトグラフ支持体がある。抗体製剤はモノクローナルでもポ リクローナルでもよいが、もしポリクローナルの場合、それは本質的に扁平上皮 癌と扁平上皮の基底細胞集団に対して単一特異的であることが必要である。でき ればモノクローナル抗体の使用が好ましい。

本発明は扁平上皮癌抗原を区別するためのマウスモノクローナル抗体と、その七 ツクローナル抗体の使用法を含む。この発明によるモノクローナル抗体は、選択 的にかあるいは木質的に、扁平上皮癌と関連する抗原と形層上皮［５ｔｒａｔｉ ｆｉｅｄ　ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍｉの基底細胞集団だけを認識する。この抗体は 、よく分化した扁平上皮癌膿瘍中で、その腫瘍の末梢増殖区分と優先的に結合す る。本発明のモノクローナル抗体によって認識される抗原は、分子量が約４８か ら５０キロダルトンと５７キロダルトンのタンパク質を含んでいる。この抗体の 応用の可能性としては免疫組織学による扁平上皮癌腫瘍の診断、放射性核種や細 胞毒薬剤とモノクローナル抗体の抱合体を用いての、扁平上皮癌腫瘍細胞の非侵 襲性診断的画像処理によるｉｎ　ｖｉｖｏでの処置、および研究手段として形層 扁平上皮の正常と病的状態を調べることなどがある。モノクローナル抗体は、Ｔ ｎ−Ｈ３Ａに対して働かせても、この非−３ＣＣ免疫原にはなんらの反応性を示 さず、扁平上皮癌組織に対して高度の選択性を示す。

本発明の好ましいモノクローナル抗体はＭＡｂ　１７４Ｈ，６４と呼ばれるもの である。本発明の記載は主としてこの好ましいモノクローナル抗体に関するもの となる。本記載における発明の好ましい具体例に対する引用に際しては、本発明 による好ましいモノクローナル抗体と本質的に同じ偏位を除外するつもりはない 。

原発臓器としては口と口腔、食道、喉頭蓋、喉頭、咽頭、腔および！ＩＩＩ部が 可能なものとして含まれる。

ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４は原発臓器のいかんにかかわらず、ヒト扁平上皮細胞癌 （発明者の研究では１００％）と選択的に結合する。この抗体は単純上皮由来の 腫瘍や非上皮原発の＠瘍とは結合しない。この抗体の扁平上皮細胞癌に対する特 異的反応性は、雌蟲、イヌおよびネコを含むヒト以外の哺乳動物の偶発ｓｃｃ様 腫瘍にまで及ぶ。ＭＡｂ　１７．１３およびＶＩＪ−２と動物腫瘍との反応性に ついてのデータは得られていない。

ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４は正常なヒトの形層扁平上皮の幹細胞集団（基底および 準基底層）と選択的に結合する。当抗体はまた肺臓上皮や胸管の筋上皮細胞とも 選択的に結合する。当抗体は単純上皮や非上皮組織とは結合しない。このことは 、ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４が形層扁平上皮の基底細胞集団に特徴的な分化抗原を 認識することを示唆する。ＭＡｂ　１７．１３とＶＭ−２も形層扁平上皮の基底 層に対して選択性を示す。ＭＡｂ　１７ｔ１３はまたヒト陶管の筋上皮細胞とも 反応することが報告されている。これら２つの抗体と胸腺上皮との反応性および ＶＭ−２と筋上皮細胞との反応性に関するデータはない。

高度に分化した扁平上皮細胞癌騰瘍は増殖速度の速い原始細胞を含む腫瘍の末梢 層で優先的に結合する。腫瘍の由心方向にある、より分化した細胞は抗体とはほ とんど結合せず染色されない。この事実は、ＭＡｂ　１ハ■、６４により認識さ れるエピトープは扁平上皮細胞癌の増殖区画に特異性をもち、より分化した扁平 上皮細胞癌＠瘍の細胞によっては発現されないことを示唆している。他のどんな モノクローナル抗体も、扁平上皮細胞癌の増殖区画に対してこのような選択的反 応性をもたないと思われていることからみて、このことは驚くべきことである。

この特性の故に本発明は、診断上ならびに治療上、貴重な有用性を提供すること ができる。

ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４は正常ヒト頚部とユニークな染色パターンを示す。ｕＡ ｂ　１７４Ｈ−６４と成熟扁平上皮の基底層および準基底層との反応性はそれぞ れ９７％と８１％であり、未成熟扁平上皮については反応性がそれぞれ７３％と ５９％に低下する。頚部の柱下（予備）細胞７０％の反応性を示す。これらの結 果から、ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４により認識された分化抗原はまた頚部における 上皮の成熟についてのマーカーでもあることを示唆する。

ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４は前悪性化病変［ｐｒｅｍａｌｉｇｎａｎｔ　１ｅｓｉ ｏｎｊと結合することがわかる。頚部の上皮内腫瘍（ＣＩＮ）において、症例の ６９％が基底層と反応し、症例の５４％が準基底層と反応した。キロサイトティ ック（ｋｉｌｏｃｙｔｏｔｉｃ）異型性（ＫＡ）では、テストした症例のすべて が抗体との反応性を示した。

〜Ａｂ　１７４Ｈ，６４により認識される抗原は、分子量が約４８から５０キロ ダルトンと５７キロダルトンの二つの細胞骨格タンパク質である。これらの分子 量から、非ケラチン化形層扁平上皮のマーカーであるヒトサイトケラチン＃１４ と＃５が示唆されるけれども、それらとは異なる。というのは、サイトケラチン ＃１４と＃５は超基底層にも分布しているからである。

本発明のモノクローナル抗体は、診断上の試薬、扁平上皮細胞癌組織の治療薬、 それに研究手段として用いることができる。

ｖＡｂ　１７４Ｈ，６４の高い選択的反応性の故に、原発組織が何であるかにか かわらｖ１扁逗上皮細胞癌の確定診断のための試薬としで用いることかでさる。

この診断上の有用性の中には免疫組織学的診断、診断的画像処理および血清診断 が可能なものとして含まれる。治療においては標的細胞毒薬剤としての使用があ りうる。研究上の用途としては細胞研究や細胞治療に関する多くのものがある。

この抗体はまｊ；５ｃｃ−関連抗原の免疫精製にも使用できるかもしれない。こ こで述べた使用法に関して、モノクローナル抗体やポリクローナル抗体を得るた めに精製抗原が使用されるであろう。

ＭＡｂ　！７４Ｈ，６４は凍結切片山での膿瘍の組織学的分類のための試薬とし て使用できる。たとえば、頚部の腺扁平上皮癌の診断は、未分化領域が扁平上皮 か腺由来かをはっきりさせる点で難しいことがある。電子顕微鏡によってすら難 しいこの問題はＭＡｂ　１７４Ｈ，６４による陽性染色によって解決できる。こ のような診断上の目的のために、組織学的使用に適した標識法はどんなものでも 用いられ、それらのものとしては放射性標識、蛍光団、酵素および７エリチンな どが含まれるが、これらのものに限定されるわ（すではない。標識には直接ある いは！ＩＩＡ接（を二とえばアビディン−ビオチンによる、タンパクＡ−Ｆｃ、 あるいは抗体−Ｆｃブリッジ）がある。

ＭＡｂ　！７４）１．６４は扁平上皮細胞癌の診断画像処理に使用することかで きる。放射性標識した！ＪＡｂ　１７４Ｈ，６４がｉｎ　ｖｉｖｏで選択的に局 在することを基礎にした扁軍上皮＠瘍の確定診断は、以下の応用のためにとくに 価値がある。この方法により原発腫瘍の場所、大きさ、および浸潤の程度を決め ることができる。それは＠瘍の転移による拡がりを追跡したり、リンパ節や臓器 中の小さな転移領域を検出することができ、それよって診査手術の必要がなくな る。この方法で膿瘍の組織発生が非侵襲的に決められる。この方法はまた、治療 に対する腫瘍の応答を非侵襲的にモニターすることも可能にする。診断画像処理 への使用にとって必要な、ｍ瘍中でのモノクローナル抗体の局在の様子を表１に 示す。腫瘍の実際の画像は実施例３に示しである。

表１ 抗体注入後７２時間におけるＤＢＡ２マウスの正常肺と担癌（ＫＩＮ−２０５マ ウス扁乎上皮癌）肺中の”Ｊ−１７４Ｈ６４と’　３’　］　−ＭＯＰＣ−２１ （アイソタイプマンチした対照抗体）のバイオディストリビューション 組織１ｇ当りの注入量％　臓器中の注入量％１７４Ｈ，６４ＭＯＰＣ−２１１８ ４Ｈ，６４ＭＯＰＣ担癌の肺　７．７　１．６　５．４　１．．１６土０．９９ 　上０゜５１　上２゜８５　±０．９７正常な肺　５．５　１．９　０，９４　 ０．３４±０．２０９　上１゜３　上０゜０６２　上０゜２４もしＭＡｂ　１７ ４Ｈ，６４で検出された抗原が面清山に流入していれば血清診断を実施できる。

その場合、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡあるいはその他の免疫倹定法を用いて、血清かモ ノクローナル抗体と結合する能力を用いて検出できる。この原理は、診断手段と して、膀胱扁′Ｘｔト皮細胞癌において原画へ流入した抗原、あるいは、生物学 的体液中に適当量流入した抗原の検出にも拡張できる。

本発明のモノクローナル抗体は、扁平上皮細胞癌に対する特異的治療を可能にす る。このような治療におけるモノクローナル抗体は、単独で使用することもでき るし、あるいは標的ｓｃｃ細胞に対して細胞毒性や放射性標識抱合体を与える形 で使用できる。この抗体とダウンマイシンとの抱合体に関する研究によって、マ ウス扁平上皮細胞癌細胞株を選択的に殺す能力が抱合体にあることが証明された 。表２と３はこのような治療上の有用性を示したものである。

表２ 標的特異性免疫抱合体（１７４Ｈ，６４ダウノマイシン）で混在するＫＩＮ−２ ０５扁平上皮細胞を除去した同系の骨髄を持つ致死量照射ＤＢＡ２Ｊマウスの造 血再構成処理群　肺−のｃｐｍＸｆＬ均士標準偏差骨髄のみ　１３７２±４４９ 骨髄−ＫＩＮ−２０５（非処理）　２９３３６±４５０５骨髄−ＫＩＮ−２０５ （ＤＩＪ処理）　１１０６５＝６ｉ４４骨髄十ＫＩＮ−２０５（抗’Ｊ処理）　 ２９１９７±２４９０骨髄十ＫＩＮ−２０５（免疫抱合体処理）４２０７±２１ ２１１Ｘ１０’個のＤＢＡ２Ｊ骨髄細胞とｌＸｌ０’個のＫＬＮ−２０５細胞の 混合物をｉｎ　ｖｉｔｒ。

で４℃２暁間処理、洗浄して各８５０ラド照射したレシピエンドに接種した。

２５ヨ攪、２μＣ１の１２′！＝＋ＵｄＲを注入し、１４時間接に肺口の＋ｚＳ ｉ−１１ＪｄＲの取り込みをカランＮした。免疫抱合体の濃度はダウンマイシン （ＤＭ）の含量がｌＯμｇ／ｍｌになるように調整した。

表３ ＤＲＡ２７マウス中で増殖するＫＬＮ−２０５ＳＣＣｌｉ１ｇＸをｉｎ　ｖｉｖ ｏで処理したときの！ＪＡｂ１７４Ｈ，６４ダウノマイシン（ＤＭ）抱合体の効 果群　動物数　ＣＰ！Ｊ（’　２’　Ｔ−ＩＵｄＲ取り込み）正常　４　８．０ ３８±３．４７！ ！７４Ｈ，６４ＤＭ抱合体　５　３２．６６８土２０．３５４非処理　３＊　１ ０８．４６４±８２．５７０＊非処理マウスの２匹は実験３０日８に死亡し腫瘍 が肺中に広汎に広がっていた。

＊　ＫＩＮ−２０５（１０’個細胞）をＤＢＡ２雄マウスに接種して２群（各５ 匹）に分けた。各群５匹のマウスに対し、ＫＬＮ−２０５細胞の接種後５８目と １０日８にｙＡｂ１７４Ｈ，６４−ＤＭ（！００μｇのＤ）Ｊ、１．８ｍｇのＭ Ａｂ）注入した。３４日８に各マウスに２μＣ１の”Ｉ−ＩＵｄＲを静脈内注射 し、肺を取り出してガンマカウンタでカウントした。

ダウノマイシンが好ましいけれども、本発明は特定の細胞毒薬の使用に限定され るものではない。癌細胞に対して効果的なことが知られている他の薬剤としては シリンがある。まＩ；、細胞毒薬剤を抗体に抱合するのに酸感受性のシスーアコ ニチルスペーサーの使用が好ましいけれども、なんらか特定の抱合法に限定され るものではない。

！４Ａｂ　＋７４Ｈ，６４は１３１１．１２５１．９０Ｙ、２ｉ１Ａｔ、６７Ｃ ｕおよび１８６Ｒｅのような放射性核種で標識することができ、扁軍上皮細胞癌 ＠瘍組織に対して選択的に治療量の放射線を＝すのに用いられる。特許請求範囲 の追加の目的で、細胞毒薬と包合した抗体を引用したのは、治療用放射ｉ核種で 標識した抗体を含める意図による。

ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４は９９Ｔｃ、　１１１１ｎ、６９Ｇａのような放射性核 種で標識した場合には画像処理用として用いることができる。本発明は特定の放 射性核種あるいは特定の放射性標識法の使用に限定されるものではない。

本発明のモノクローナル抗体は以下のような研究手段として使用することができ る。細胞骨格タンパク質の発現は正常形層上皮の分化の間にＭＡｂ　１７４Ｈ， ６４によって検出し得るし、その機能的意吸をはっきりさせるのに用いられる。

また、ＣＩＮやＫＡのような子宮頚部の前悪性化病変の判定を行うこともできる 。このモノクローナル抗体は基底ＣＩＮの６９％と、またテストしたＫＡ組織試 料のすべてと結合する。陽性と陰性の臨床的ならびに治療上の意義は、注意深く 臨床的ならびに病理学的に追跡することによって決定できる。病変の予後はこの 抗体の陰性あるいは陽性の程度で定めることができる。モノクローナル抗体は、 トランスフォーメーションの間での抗原の発現、進行およびｌ！Ｉ瘍の分化に関 して扁工上皮細胞癌の生物学を研究するのに用いることができる。

本発明のモノクローナル抗体は、以下の実施例に従って作られ使用することがで きる。ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４を分泌するハイブリドーマ細胞株は、１９８９ｍ ４月１８日のブタベスト条約下にＭａｒｙｌａｎｄ州Ｒｏｃｋｖｉｉｌｅ市のＡ ｍｅｒｉａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ ）に寄託され、ＡＴＣＣＨＢ　１０１０５と命名された。この細胞株を送って貰 って所存するとしても、その受領者にその細胞株を使用する認可を与えたものと 解釈されるものではない。

実施例１　：　ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４の調整と特性についての記載この実施例 は本発明の好ましい具体例からのものである。本発明の好ましい具体例はＭＡｂ 　１７４Ｈ，６４と名づけられなモノクローナル抗体である。以下の手順は本発 明のモノクローナル抗体をいかにして得、いかにテストするかについての最良の やり方を示す。本発明の思いが」すない、そして好ましい特性を示すために比較 データが提供される。

免疫およびハイブリドーマ−生成 ＲＢＦ／Ｄｎマウスを一週間隔で２種の連続腹腔的注射、すなわちヒこのコリオ ゴナトドロフィン（ＨＣＧ　、　５０！ｇ）と、ヒト血清アルブミンと抱合した 合成炭水化物の投与で免疫する。ヒト血清アルブミンと合成炭水化物の抱合体（ Ｔｎ−ＩＳＡ）はＮ−アセチルガラクトサミンが完全７レンドアジユバント巾の 担体（５０！ｇ）分子あたり４０残基の割合でヒト血清アルブミンにα−結合し たものである。１２０目にマウスに対してリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）命でＨＣ Ｇ（４００ｔｔ　ｇ）とＴｎ−ＩＳＡ　（４００，ｕ　ｇ）を混合したものを腹 腔内注射する（　ＰＢＳは１４０ｍＭ　ＮａＣ１，２，６８ｍ！ｊ　ＫＣｌ、８ ．１＋ｔ＋Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２０゜！、４ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４，ＰＨ７ ，２）　、　１３日百計、それぞれＦＩＣＧとＴｎ−ＦＩＳＡ　（各２００μｇ ）の混合液を静脈内注射と腹腔内注射することによって免疫する。この操へを］ ４ヨ目にもくり返す。１５日百計！（ＣＧと〒ｎ−Ｈ５Ａに対して高い抗血清力 価をもってマウスからの牌細胞をＦＯＸ−ＮＹ＆胞（！（−ｙｃｌｏｎｅ　Ｌａ ｂ、、ＮＹ）と融合させる。Ｔｎ−ＩＳＡに対する陽性活憎のハイブリッドと！ （ＳＡと陰ｉ活性の７・イブリｑ−マを選択じエフローン化する。再クローン化 細胞の上溝を免疫組織学的染色法により、膿瘍組織に対する反応性をテストする 。ニア４″Ａ、６４と名つけられた再クローンは、Ｔｎ−ＩＳＡとは何らの反応 性も示さないけれども、ヒト扁乎上皮細胞癌とは強力かつ選択的な反応性を示し た。この）・イブリドーマ（二重に再クローン化された）を扁＝上皮細胞癌組織 との選択的反応性に基づくより一層の研究のために選んだ。

アイソタイピング ｙＡｂ　１７４Ｆ＋、６４をＭｏｕｓｅ　Ｔｙｐｅ　Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ　Ｋｉ ｔ　（Ｂｉｏｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔ−ｏｒｉｅｓ、　Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ 、　０ｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を用い、酵素免疫検定法（Ｅ：Ａ）法によ りアイソタイプ化した。微小力価プレートを、無血清培２＠口で生長したハイブ リドーマの培養上清を４℃で一層インキユベートすることにより抗体でコートす る。マイクロ力価ウェルを順次に、３７℃３０分間Ｐ”ｌＳ口でウシ血清アルブ ミン（１％）、室温で２時間アイソタイプ試薬（ウサギ抗マウス１ｇサブタイプ ）と、そして西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と抱合したヤ？抗ウサギ！ ｇＧと室温で１時間インキュベー（した。上記各ステンプのあと、プレートはＰ ＢＳで洗浄した。前擾に、マイクロ力価ウェルを室温で３０分間ＨＲＰ基質とイ ンキュベーζし、Ｅ１＾読取器で吸光度を読んだ。

ニア４Ｈ，６４，Ｒ２４の精製：放射ｉ標識とビオチニル化ブリスタン感作（Ｐ ｒｉｓｔａｎｅ−Ｐｒｉｍｅｄ）　Ｂａ１ｂ／Ｃマウスニハイブリｇ−マ！７４ Ｈ，６４細胞（２Ｘ　！ＯＳ）を腹腔内注射して腹水液を生成させた。抗体を硫 酸アンモニウム（５０％）沈澱とタンパク質入セファロースカラムクロマトグラ フ法の二つのステップからなる手順で精製した。Ｉｔ製した抗体画分はセルロー スアセテ−（電気泳動上で単一タンパク質バンジを含有し、免疫ペルオキシダー ゼ染色によって示されるように扁＝上皮細胞癌凍結切片上で免疫的に活性であっ た。

抗体はヨードゲンによって放射性ヨードを標識した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ 、５０！ｇ）　ｑ＝＋の精製ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４，Ｒ２４（５０／Ｊ　ｇ） をＰＢＳ　（１０μＩ）　ｃｐの“担体無添加”Ｎａ１２！　（５００Ｃｉ）と 混合し、ついでヨードゲン（２μｇ）でコートした珪８酸ガラス管中に移した。

室温で２分間反応を進行させた後、その溶液をＰＢＳ（１００／μｉｃ’０．０ ５％に＋を含む他の管に移し、３分間乎衡させ、ＢｉｏｇｅｌＰ−１００スパン カラムを用いて無機ヨードから抗体を分離した。

ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４を既知の、すでに報告されている方法に従ってビオチニ ル化した。すなわち、ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４（２ｍｇ）のＰＢＳ　（４００μ ｍ）溶液を０．１５Ｍ塩化カリウムＰＨ８，１を含む０．２ｖの重炭酸ナトリウ ム溶液と混合した。これにビオチン−ＬＣ−ＮＦＩＳ　（１２５μｇ、Ｐｉｅｒ ｃｅ）のＰＢＳ（２５μｌ）溶液を加えて室温で２０分間インキュベートした。

反応をｌｖ塩化アンモニウム溶液ＰＨ６，０（５０！ｇ）を加えてスミツブさせ 、ついでその溶液をＰＢＳに対して十分に透析した。

細胞株 すべての肩車り皮細胞癌細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ 　Ｃ。

ｆｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｅｋｖｉｌｌｅｊｊａｒｙｌａｎｄから入手し、１０％ のラン胎児血Ｆｒ　（Ｆｅ２）とゲンタマイ／ン（４０単位／ｍ１）を含むＰＰ Ｍ　Ｉ中で生育させた。正常ヒトケラチン細胞はＣ１ｏｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｒｐ ｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ　Ｄｉ＋４ｏ、　ＣＡから入手し、無血清ケラチン細胞 生育培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）−で培養した〇マウ ス表皮ケラチン細胞の分離 表皮ケラチン細胞を、既知の、すでに報告された方法に従ってＩＣＲマウスの新 生児（生模１日）から分離した。笥単に述べると、マウスを断頭死させ、皮膚を 取衆き、ついでハンクス液（ＨＢＳＳ）ｉ）で洗浄した。ついでトリプシン（０ ，０２５％）、ＥＤＴ＾（０，０２％）を含むＨＢＳＳ甲に表皮を下にして皮膚 を置き、３７°Ｃ１時間イ〉・キュベートした。トリプシンＥＤＴＡ溶液を吸引 し、１０％ＦＣ３をもつＲＰＶ　Ｉで買換した。ついで鉗子を用いて真皮から表 皮を分離し、培地口でゆるやかに撹壜しｔ；。ついで、得られた細胞懸濁液を表 皮ど真皮層から分離し、ＲＰＶ　Ｉで２旦洗浄し、ついでＰＢＳで洗浄した。こ の細胞懸濁液を免疫ペルオキシダーゼ染色のために使用した。

免疫組織学 免疫組織学的研究のための膿瘍組織はＯＣＴ中に包埋し、インペンタン中で凍結 して一７０°Ｃで貯蔵した。凍結切片あるいは細胞塗抹標本の免疫ベルオキシダ ーゼ染色は、その方法が知られているアビディンービオチンペルオキシダーゼ複 合体（ＡＢＣ）法に従って行った。８μｍの凍結切片をクリオスタント上で切り 、ポリＬ−リジン（ＰＬＬ）でコートしたガラススライド上に置いた。

細胞塗抹標本はＰＬＬでコートしたプレートを用いて細胞の朧−細胞懸濁液から 調製して風乾した。ついで、順次ガラススライドを一次抗体（１７４Ｈ，６４） と１５分間、０．０２％グルタルアルデヒドと４°Ｃで５分間、ビオチニル化二 次抗体（抗マウスＩｇＧ）と３０分間、そしてＡＢＣ試薬と２０分間インキュベ ートした。上記の各ステ７プのあと、０．５％過酸化水素を含むスライド溶液を 水出で洗浄し、ヘマトキシリンで逆染色しくｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎｅｄ’、 、バーマウントｃｂに装着した。細胞中の褐色は抗体との陽性反応に対応する。

マウス組織が上記方法で染色されるときはいつでも、ビオチニル化された一次抗 体を用い、抗マウスＩｇＧによるステップは省略した。アイソタイプにマンチし たマウス骨髄庫タンパクＩｔ　（ＭＯＰＣ−２１）をすべての免疫ペルオキシダ ーゼ染色における陰性対照抗体として使用した。

ｙＡｂ　１７４Ｈ，６４と癌組織との反応性種々の起源のヒト癌組織の凍結切片 を、ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４との反応性に関してＡＢＣ法による免疫ペルオキシ ダーゼ染色法でテストした。アイソタイプマンチした対照抗体（ＭＯＰＣ−２１ ）を陰性対照として用いた。これらの研究の結果は表４に要約されている。

表４ ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４といろいろな起源のヒトｌｌＩ瘍凍結切片との結合欅　 瘍　テスト数　正の数 扁平上皮癌 肺　３６　３６ 皮膚　９９ 舌　１１ 子宮預　４４ 鼻咽頭　２２ 喉頭　３３ ペニス　１１ 陰門　２２ 非扁平上皮性肺癌 （腺、小細胞と大細胞）７０ 腺癌 乳　１０　０ 結腸　７０ 卵巣　１５　０ 前立腺　１０ 扁平と皮成分を持つ 非唾液膀の二相性悪性質 成熟扁平上皮成分の 子宮内漠の［線束細胞 ｍ４が混在した腺癌　３　３（扁以上皮成分のみ）悪唯扁軍上皮成分の膵臓の 像扁逗上皮癌を有する腺癌　１　ｉ（扁以上皮成分のみ）肩章上皮成分の肺の 癌嘲憚を有する癌向Ｉｌｌ　ｌ　１（肩章上皮成分のみ）唾液腺の二相性悪性度 粘膜表皮癌Ｉｌｌ　ｌ　ｌ（筋上皮起源の鱗状細胞成分） 腺様嚢胞性癌＠　ｌ（しばしば［擬嚢胞」の近くにあり、筋上皮起 源と考えられている、 電子顕微鏡で扁平上 皮の特徴がいくらか 見られる細胞集団）。

移行細胞癌腫 膀胱　１０ 良性腫瘍 卵巣　ｌＯＯ 乳　５０ 扁平上皮粘膜　２　２（基底細胞のみ）メラノサイト性はくろ　６０ 唾液腺１１瘍　３　３（二相性の染まった筋上皮細胞のみ） 胸腺＠　ｌ　１（上皮成分のみ） 他の癌腫 腎臓　２０ リンパ腫 Ｂ細胞リンパＩＩＩ　１０　０ ホジキン　２０ 肉腫 雑多な軟組織　４０ 皮膚の　５０ 胸管の筋上皮細胞は正であった。

ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４は、臓器や原発のいかんにかかわらず、テストしたすべ てのヒト扁平上皮細胞癌と選択的に結合し、組織学的に異なる他の各種の腫瘍に ついても結合がみられた。図１はＭＡｂ１７４Ｉ（，６４が腫瘍の末梢層に優先 的に結合しなから扁平上皮細胞癌組織と結合する様子を示す。腫瘍のすぐ近くの 正常組織は抗体と全く結合していないことがわかる。他の哺乳動物にできたいく つかの偶発膿瘍についてもＭＡｂ　１７４Ｈ，６４に対する反応性をしらべ、そ の結果を表５に示しｔ；。

表５ ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４と非ヒト腫瘍凍結切片との結合腫瘍　テスト数　正の数 イヌの＠瘍 扁品上皮／基底細胞癌＠　１０　１０ 他の癌腫　１４　０ 良性基底細胞癌　４４ 表４（続き） ｖＡｂ　１７４Ｈ，６４といろいろな起源のヒト腫瘍凍結切片との結合腫瘍　テ スト数　正の数 イヌの腫瘍（続き） パピローマ＊４４ 肛ｌ″＝周囲腺挿本　２２ 他の良性上皮性！！Ｊ！瘍　５０ 間葉ｕｌｌ！！　４５　０ ウシの扁平上皮癌　４４ ネコの肩車上皮癌　２２ 本パピローマおよび肛−ｉ周囲腺唾では、基底細胞集団だけが抗体の染色を示し た。

イヌの扁平上皮細胞ならびに基底細胞癌組織もこの抗体と選択的に結合したが、 他の癌腫および間葉原発の腫瘍はなんらの反応性も示さなかった。この抗体の反 応性はウシおよびネコの扁平上皮細胞癌についてもみられた。よく分化した転移 ウシ肺扁平上皮癌の染色で、末梢膿瘍細胞への抗体の結合増大が観察された。イ ヌの良性上皮腫瘍に関しては、基底細胞腫瘍は均質に染色されたが、パピローマ と肛門周囲腫瘍の場合には染色は基底細胞のみに限られた。

正常組織に対するＭＡｂ　１７４Ｈ，６４の反応性正常組織についてＭＡｂ　１ ７４Ｆ！、６４との反応性について調べ、結果を表６に要約した。形層上皮の基 底細胞、胸腺上皮および胸管周囲の筋上皮細胞に関して高い選択的反応性が観察 された。

非形層上皮Ｃｆ−とえば結腸）や非上皮性由来の組織については反応性がみられ なかった。

表６ 組　織　テスト数　正の数　細胞染色（特に断らない限り主として細胞質が正） 結腸粘膜　６０ 心臓　１０ 肝臓　３０ 卵巣　７０ ファロビウス管　２０ 乳　１４　１４　管筋二皮細胞のみ 子宮内摸　ｌＯＯ 子宮頚部　２５　０　基底細胞と連続している柱下細胞は特定の環境下で正にな り得る。

結合組！　４０　０ 骨格筋　３０ 甲状腺　４０ 甲状腺周囲　１０ 表皮　５　５　（基底細胞および醜基底細胞す本）外頚部　２５　２５　基底細 胞と準基底細胞す零値の扁平上皮粘’！１５１５　基底細胞と準基底細胞気管支 粘贋を含む 呼吸器粘膜　１５　０ 他の肺＠瘍　１２　０ 移行上皮　５０ 腎　４０ 脳　３０ 前立腺　２０ 膵臓　２　２　管筋上皮細胞 唾液腺　５　５　管および葉筋上皮細胞胸腺　３　３　胸腺皮質の外縁に沿い、 中央胸腺髄質領域ａ＊内に伸びた突起糸状構 造を有する胸腺上皮細胞 ３本　１７４Ｈ，６４免疫染色で顕著な細胞膜強染色する唯一の正常ヒト細胞、 および大さく伸びた細胞過程の顕著な強染色は胸腺上皮細胞である。

ｂ＃　扁平上皮の炎症で、１７４Ｈ６４免疫染色における細胞膜の顕著な強染色 と延長細胞線維状化過程の顕著な強染色が、ケラチン細胞由来と思われる分離散 乱した上皮内無咳樹状突起細胞についてみられた。さらに、生育可能ではあるが 非活性のケラチン細胞間に位！する＋７４Ｈ，６４線維状洗査を含む細胞外プー ルが、炎症性とくにウィルス性炎症扁平上皮についてみられた。

形層上皮の基工層に対する抗体の反応性はウシおよびマウス皮１についても証明 されている。基底細胞の豊富なマウスのケラチン細胞懸濁液を新生仔マウスの皮 膚をトリプシン分解して調製した。この懸濁液の細胞塗抹標本は免疫ペルオキシ ダーゼ染色において、細胞の３０−５０％が抗体との反応性に関して陽性を示し た。基底細胞特性をもつ正常ヒトケラチン細胞培養は全細胞が抗体との反応性に 関して陽性を示した。

ＳＣＣ細胞株に対するｖＡｂ　１７４Ｈ，６４の反応性前に述べられたようにＭ Ａｂ　１７４Ｈ，６４はテストしたすべてのＳＣＣ組織と反応したが、一方いく つかのヒト扁平上皮癌細胞株（ＳＣＬ−１，５ＩＨＡＡｊＪＥ１８０．Ｃ−３３ Ａ）は細胞塗抹標本免疫ペルオキシダーゼ染色で抗体との反応性をテストしたが 結果は陰性であった。

反対に、マウスの転移肺扁平上皮癌細胞株（ＫＬＮ−２０５）は抗体と反応した 。

扁平上皮癌動物モデルとＭＡｂ　１７４Ｉ（，６４との反応性ＫＬＮ−２０５細 胞（１０６）を標準の方法で８週令の雄ＤＢＡ／Ｚマウスに静脈内注射した。２ １日後にこれらのマウスから切り取った肺には大きな腫瘍コロニー形成がみられ た。免疫ペルオキシダーゼ染色でこの腫瘍は抗体と強い反応性を示し、腫瘍周辺 の細胞が優先的に染色された。近接する正常組織は正常マウスから取った肺組織 とはじく抗体とはなんの反応性も示さなかった。

抗原の特性 以下に示す方法で、ウシ転移肺扁平上皮癌腫瘍、ヒト肺扁平上皮癌’ＩＩ瘍、ヒ ト卵巣腺癌腫瘍およびｉｎ　ｖｉｔｒｏで増殖した正常ヒトと皮ケラチン細胞か らタンパク質抽出物を調製した。組織試料すなわち細胞ペレットを１０倍容量の Ｎｏｎ１ｄｅＬＰ−４０（ＮＰ〜４０、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍ ｐａｎｙ）抽出緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣＩ緩衝液ＰＨ７，５巾、１％ＮＰ− ４０，２ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド、　２ ｍＭペプスタチン１０ｍＭ　Ｏ−７エナンスロリンおよび１５０ｍＭ　ＮａＣ１ ）中で４℃、３０分間ホモジナイズし、ついで１００．０００ｇで１時間遠心し た。残査を再び１０倍容量のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ５）抽出緩衝液（１ ０ｍＭ　トリスＩ（ＣＩ緩衝液ＰＨ７，５巾２％ＳＤＳと１０ｍＭ　２メルカプ トエアタノール）を用いて室温で１０分間抽出し、１００℃ｌＯ分煮沸し、つい で１０．０００ｇで１５分間遠心した。これら抽出物中のタンパク質を標準還元 条件下で非連結グラジェント５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（４％ス タフキングゲルと４％から１５％のグラジェントレゾルピングゲル）上で分離し た。電気泳動のあと、ゲルを２００　のタンパク質再生緩衝液（４Ｍ尿素、２ｍ Ｍ　ＥＤＴＡ、５０ｍＭ　Ｎａｃｌ、　トリス　ＨＣＩ　ＰＦＩ７．５中０．１ ｍＭジチオスレイトール）中、室温で１回緩衝液を換えて１８時間インキュベー トし、ついで転移緩衝液（２５ｍ）ｊ）リス）ＩＣＩ　ＰＨ８，８中１９０ｍＭ クリシン）ｄ：Ｉ、４°Ｃで１時間平衡化させた。これらのタンパク質を電気泳 動的にゲルからニトロセルロース膜（Ｂｉｏｒａｄ）に１８０ｍＡ　、定常電流 で１８時間移動させた。ニトロセルロースシートを取り％ｌｉ、ＰＢＳ中３％ゼ ラチンを含むプロ７キング緩衝液中で１時間インキュベートし、ＴＰＢＳ　（０ ，０５％Ｔｖｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）中で５分間２回にわたり洗浄した。つい で抗体緩衝液（１％ゼラチン含有ＴＰＢＳ）山で１２５Ｉ標識した抗体（５Ｘ　 ｌｏ’ｅｐｍ／　ｍｌ）と２時間インキュベートし、１回ごと５分間で６回ＴＰ ＢＳ出で洗浄した。

ニトロセルロースシートを風乾し一７０℃でＸ線フィルムで感光した。上記組織 のＮＰ−４０抽出物と腺癌のＳＤＳ抽出物のイムノブロツ）　ｊｉｍｍｕｎｏｂ ｌｏｔｓ）はｌ”　Ｉ　ＩＥ［１ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４と全く結合しなかった のに対して、ウシ扁平上皮癌、ヒト扁平上皮癌およびヒトケラチン細胞のＳＤＳ 抽出物はｌ！Ｊ標識ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４と特異なタンパク質バンドを有する 選択的結合を示した。ケラチン細胞ＳＤＳ抽出物中の免疫活性タンパク質バンド は分子量が約４８から５０キロダルトン（おそらくダブレット）と５７キロダル トンであった。

ウシおよびヒト扁平上皮癌ＳＤＳ抽出物はただ１個のはっきりしたバンドを示し 、分子量は前者が約４８から５０キロダルトン、後者が約５７キロダルトンであ った。対照抗体（１５５Ｆ１．７）は上記腫瘍抽出物のいずれとも結合しなかっ た。

正常および頚部の前悪性上皮に対する１７４Ｈ，６４との反応性頚部の正常およ び前悪性上皮の凍結切片についてＭＡｂ　１７４Ｈ−６４との結合をしらべた。

結果を表７と表８に要約して示す。

表７ ＭＡＢ　！７４Ｈ，６４の頚部正常上皮との反応性上皮　正の数／テスト数　正 の％ 成熟形層と皮 基底層　３６／３７　９７．３ 単基１層　３０／３７　８”、１ 未成熟形層よ皮 基底層　５１／７０　７２．９ 準基底層　４１／７０　５８．５ 柱状下上皮　８／１６　５０ 表８ ＶＡＢ　１７４Ｈ，６４の頚部前癌性発疹との反応性前癌性発疹　正の数／テス ト数　正の％頚部の上皮内腫瘍（ＣＩＮ） 基底層　３６１５２　６９．２ 準基底層　２８１５２　５３．９ コイロサイトチツク異型　１６／１６　１００正常頚部の成熟および未成熟肩章 上皮では染色は基底層と単基五層にみに限られた。成熟上皮では実際上基底およ び単基底層の１００％が染色されたのに対して、未成熟上皮での染色は７１から ７３％の開−こ限られた。症例の７０％の柱状下上皮で染色は予備細胞に関して 観察された。これらの結果から、この抗原の発現は上皮の成熟過程−に獲得され 、成熟上皮の幹細胞か分化する間に失われることか示唆される。予備細胞の染色 パターンは、予備細胞が形層上皮の幹細胞になるような症例の割合を反映する。

実施例２　：　ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４の免疫療法的使用補乳動物の扁平上皮癌 （以下Ｓｑ　Ｃａということかある）の増殖細胞上に発現されたエピトープを選 択的に認識するＭＡｂ　１７４Ｈ。

６４を、酸感受性リンカ−でダウノマイシン（ＤＭ）に共有結合させてＳＯＣａ に対する選択的細胞毒性をテストした。ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４−ＤＭ抱合体を 用いて化学免疫療法に関するマウス肺Ｓｑ　Ｃａモデルを開発した。このモデル は、静脈内注射のあと肺へ転移するＫＬＮ−２０５Ｓｑ　Ｃａ細胞株を用いて、 中心（１７４１４，６４と反応しない）に向うケラチン化した分化細胞を有する 膿瘍（１７４Ｈ，６４と反応する）の周辺部で高度に増殖する細胞で特徴づけら れるところの偶発Ｓｑ　Ｃａの増殖パターンと同じパターンを示す。ＭＡｂ　１ ７４Ｈ，６４−ＤＭ抱合体はＫＬＮ−２０５細胞に対してｉｎ　ｖｉｔｒｏでも 、また肺転移を有するマウスへの静脈内注射でもいずれも著しい、そして特異な 細胞毒性を示した。抱合体はＫＬＮ−２０５とｉｎ　ｖｉｔｒｏでインキユベー トシたときは０Ｍ単独とほとんど同じ効果を示したが、ｉｎ　ＶｉＶＯでは０Ｍ 単独よりもはるかに効果があった。Ｊ’Ｈ＆に、抱合しない１７４Ｈ，６４ＭＡ ｂはＫＬＮ−２０５転移を有するマウスの生存時間を有意に増大させたが、明ら かに長期間生存（＞１００日）を示したいくらかのマウスで１７４Ｆ＋、６４− ＤＭ免疫抱合体を与えたときによりずっと長い生存がみられた。ＭＡｂ　１７４ Ｈ，６４はＳｑ　ｃａに対しておそらく治療上の利益をもつものと結論する。

材略と方法 実験動物：　８−１２週令のＤＢＡ／２雄マウス全マウスｉｃａｌ　５ｃｉｅｎ ｃｅ　Ａｎ−ｉｍａｌ　Ｃｅｒ＋ｔｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ａｌｂ ｅｒｔａから購入した。

細胞株：マウスＳｑ　Ｃａ株、ＫＬＮ−２０５（Ｋａｎｅｋｏ、ｅｔ　ａｔ、、 　１９７８）、　マウス白血病細胞株、５Ｌ２Ｒ５，Ｗｏｌｃｓｉｎ、ｅｔ　ａ ｉ、、１ｎｔＪ、Ｃａｎｃｅｒ、２３＋５１９　（１９７９）　、８よびヒト骨 髄白血病株、ＨＬ６０−２．Ｇａｌｌａｇｈｅｒ、ｅｔａｌ、、Ｂｌｏｏｄ、５ ４ニア１３　（１９７９）をＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ ｏ１１ｅｅｔｉｏｎ、ＲｏｃｋｖｉｌｌｅＪＤから入手した。すべての細胞株は Ｉｏ％ＦＣ３を加えｔ：ＲＰＶｌ　ｉ＋３４０培地工で継代した。ＫＬＮ−２０ ５は静脈内注射により肺へ転移するマウス肺Ｓｑ　Ｃａ細胞株であるＪａｎｅｋ ｏ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、２８：２０８４　（！９７８）　 、肺にできた転移はＭＡｂ　１７４Ｈ，６４と反応し、この場合それぞれの腫瘍 の周辺の増殖する細胞と選択的に反応することが示された。Ｓａｍｕｅｌ、ｅｔ 　ａｌ、、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、４９：２４６５（１９８９）　、　Ｗｉ　 Ｉ　Ｉ　ｉａｍｓ　、　ｅｔ　ａｌ　、　、　Ｊ　、Ｎａｔ、Ｃａｎｃ、　Ｉｎ ５ｔ、５１　：　１５１３i１９７３）。

免疫抱合体の調１！：免疫抱合体は細胞毒成分であるダウノマイシン（ＤＭ）を 酸感受性のシスーアコニチルスペーサ−（ＣＡ）を通じて標的特異性の抱合体に 付着させて作られている。５ｈｅｎ　、　ｅ　ｔａ　］　、　、　Ｂ　ｉｏｃｈ ｅｍ、Ｂ　１ｏｐｈｙｓ　、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、　、　１０２　：　１０４８（ １９８１）。これらのダウノマイシン免疫抱合体は標的細胞に高い特異的細胞毒 性を示し、骨髄からｌｌｌ瘍細胞と機能性Ｔ細胞を排障するのに用いることがで きる。当研究で意図したのは、＋ｕｂ　１７４Ｈ，６４−ダウノマイシン免疫抱 合体のＫＬＮ−２０５Ｓｑ　Ｃａ肺挿瘍に対する標的治療への可能性をテストす ることであっｔ；。免疫抱合体は以下の文献の記載に従って調製した：　Ｄｉｅ ｎｅｒ、ｅｔ　ａｌ、、ｉｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ＭｅｄｉａｔｅｄＤｅｌｉｖ ｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐ、ｌ（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ、、Ｎ、 Ｙ、１９８８）ａＱｄ　Ｘｉｅ。

ｅｔ　ａｌ、、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｉｏｎ、４４ニア７０（１９８７）、ａ ｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈａｄ　ｏｆ　５ｈｅｎ、ｅｔ　ａｌ 、、（１９８１）、ＭＡｂは腹水液を４０％（ＮＨ４）２ＳＯ４でタンパク質を 沈澱させ、ついで４°０２４時間リン酸緩衝食塩水で透析して得た。このタンパ ク質分画をさらにタンパクＡ−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ）上 でアフィニティクロマトグラフで精製した。ダウノマイシンとシス−アコニット 無水物はＳｉ）＜ｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯか ら購入した。精製モノクローナル抗体１７４Ｈ，６４は上に述べた方法で得た。

ＭＡｂ抗−Ｔｈｙｌ、２はＮＥＮがら得、ヒト骨髄細胞と反応する！ｊＡｂ　８ ６Ｈ，１（Ｓｅｅ　Ｊａｎｏｗｓｋａ−Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋ、ｅｔａｌ、、ｉｎ 　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｔｙｐｉｎｇ　ＩＩ、Ｖｏｌ、３）、ヒト骨髄および造 血細胞Ｐ、１７１（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒ！ａｇ、Ｎ、Ｙ、１９８６）はＨ Ｌ−６０細胞を含めてわれわれの研究室で作られた。

細胞毒免疫抱合体その他の作用物質による細胞の処理ニリン酸緩衝食塩＊（ＰＢ Ｓ）ＣＩ：Ｉの細胞に対して免疫抱合体や他の作用物質を氷上で２時間菖作用さ せＩ：。そのあと細胞を３回洗浄し、レシピエンドのマウスに静脈内注射するが 、３７°Ｃで２４時間インキュベートし、そのあと細胞にょる３Ｈ−チミジンの 取り込みを測定した。

３Ｈ−チミジンの取り込み：細胞培養液を０．５μＣｉ／ｗｅｌｌの３Ｈ−チミ ジン（比活性２．０μＣ４／ｍｍｏｌ）　（ＮＥＮ）で４時間バＪＬ、７．した 。

細胞をＴｉｔｅｒｔｅｋ半自動多重試料収集器（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ。

Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、０ｎｔａｒｉｏ）を用いてガラスファイバー山に採取 した。

チミジン取り込みを液体シンチレーション分光光度計で定量した。

扁乎上皮癌動物モデル：　ＫＬＮ−２０５細胞（Ｋａｎｅｋｏ、ｅｔ　ａｌ、。

１９７８）を用い、前に述べた方法（Ｓａｍｕｅｌ、ｅｔ　ａｌ、、１９８９） による。

：２５１−１１１ＤＲの敗り込み：マウスに１匹当り２μＣ１の１２５１−ＩＵ ＤＲ（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ　Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｅｎｔ ｅｒ、Ｅｄｍｏｎｔｏｎ、Ａｌｂｅｒｔａ、Ｃａｎａｄａ）を注射し、４時間後 に肺を切線し、これを細片に切り、３５間１０％のトリクロロ酸ＩＩ！（丁ＣＡ ）で３旦洗浄してγ−カウンターを用いて放射活性含量を測った。

統計的解析：はとんどのデータは５ｔｕｄｅｎｔのＬ−検定法で評価した。生存 データは修正Ｗｉ　１ｃｏｘｏｎ法で評価した。

結果 ＶＡｂ　１７４Ｈ，６４−ＤＶによるＫＬＮ−２０５細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏで の増殖の阻害・前にわれわれはＫＬＮ−２０５マウス肺扁平上皮癌細胞株を含め て、テストしたすべての晴乳動物Ｓｑ　Ｃａに対してＭＡｂ　１７４Ｈ，６４が 選択的に反応することを記述した（Ｓａｍｕｅｌ、ｅｔ　ａｌ、、１９８９）。

免疫抱合体の特異的細胞毒性をしらべるために、ＫＬＮ−２０５細胞株、５Ｌ２ Ｒ５細胞株およびＨＬ６０−２細胞株を氷上で２時間ＪＡｂ　１７４Ｆ１．６４ −ＤＭ。

ＶＡｂ８６Ｈ，ニーＤＭＪＡｂ抗−Ｔｈｙｌ　、２−Ｄ！ｊ、抱合しなイＤＭ１ ＭＡｂ１７４Ｈ，６４ｊＪＡｂ抗−Ｔｈｙ’、、２あるいは！ＪＡｂ　８６Ｈ， １で処理し、洗浄ののち、細胞を２４時間培養した。叉２はダウノマイシン単独 の場合と比較して、種々の抗体の細胞殺傷の特異性を示す５ＦＩＬ−６０細胞と ５Ｌ２Ｒ５細胞はそれぞれそれらに対応する〜Ａｂｓで阻害されたが、ＫＬＮ− ２０５細胞りｌ：ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４−Ｄ！ｊ抱合体で阻害された。ＭＡｂ 　１７４Ｈ，６４−ＤＭ抱合体によるＫＬＮ−２０５細胞のｉｎ　ｖｉＬｒｏで の増殖の阻害はダウノマイシンのみの場合とほぼ！程度の効果があったことは注 目すべきである。

Ｉｎ　ｖｉｔｒｏでＫＬＮ−２０５細胞をＭＡｂ　１７４Ｆ１．６４−ＤＭで処 理すると静脈力注射巳だマウスの肺の口での腫瘍細胞の増殖か阻害された二二の 実験のために、肺中でのＫＬＮ−２０５１１１瘍細胞の増殖の尺度として：２５ １−！ＵＤＲの取り込み検定法を用いた。まず最初に、肺中での！２５１−ｉＵ ＤＲの取り込みは少なくとも１０５〜１０６細胞の範囲内では静脈内注射したＫ ＬＮ−２０５細胞の数に直接比例することを確かめた（ズ３）。

ついでＫＬＮ−２０５細胞を氷上で２時間、！ｊＡｂ　１７１Ｈ，６４−Ｄ）ｊ 抱合体あるいはＰＢＳ、）ＪＡｂ　１７４）１．６４単独ないし抱合しないＤＭ を含めた種々の対照で処理した。そのあと細胞を３回洗浄しＤＢＡ／２マウスに 接種した（１匹あたり１０６細胞）。接種後２３日目に１２５１−ＩＵｒ）Ｒ取 り込みを用いて肺中の腫瘍増殖をモニターした。図４の結果は、ｖＡｂ　１７４ Ｈ，６４−ＤＭによる前処理によって肺腫瘍の増殖を有意に約８５％減少させ、 それはＤＭ単独で細胞とインキュベートシｔ；ときと貝程度に効果があった。

静脈内注射したＭＡｂ　１７４Ｆ１．６４−ＤＭはｉｎ　ｖｉｖｏで確立された 肺転移ＫＬＮ−２０５細胞の増殖を阻害する：邑実験の目的はｉｎ　ｖｉｖｏで のＭＡｂ１７４Ｈ，６４−ＤＭの特異的細胞毒性をしらべることであった。１０ ６個のＫＬＮ−２０５細胞をＤＢＡ／２マウスに接種した。３日後ＭＡｂ　１７ ４Ｈ，６４−ＤＭを１０５間にわたり２日毎に静脈内注射した（５回注射）。膿 瘍細胞を接種後２３日目に肺中での１２５１−４ＵＤＲ取り込みをしらべること によって１瘍増殖を測定した。！５の結果は、ＭＡｂ　１７４Ｈ。

６４−ＤＭが１２５１−ＩＵＤＲ取り込みを有意に（Ｐ＜０．００１）約８０％ 減少させるのに対して、ＭＡｂ　８６Ｈ，ｌ−ＤＭは有意な効果のないことを示 している。ダウノマイシン量独ではいくらか効果があったが有意ではなかった。

しかしＭＡｂ　１７４．６４単独の場合腫瘍細胞の増殖を約４２％減少させた（ Ｐ＜０．００１）。

ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４〜ＤＭ療法をうけたマウスの生存案二上の実験ハくり返 されたが、肺−のＫＬＮ−２０５細胞の増殖をモニターするためマウスを殺すか わりにマウスの生存率だけをモニターシｔ＝。図２の結果は、ＭＡｂ　＋７４． ６４−Ｄ〜投与マウスは非投与あるいは抗体投与マウスよりも有意に長期Ｍ　（ Ｐ＜０．００１）生存したことを示す。ＭＡｂ　１７．４Ｈ，６１独も腫瘍をも つマウスの生存率を改善した（Ｐ＜０．００１）。

考察 当研究は扁二と皮癌の増Ｍ（ＳＴＥｙ）細胞区分に指向性をもつＭＡｂは治療能 力をもつという仮説をテストするために計画された。

われわれは新しいＭＡｂ　１７４／Ｈ，６４を用いたが、これは正常形層扁乎上 皮と肩章上皮癌中の幹細胞集団に関するマーカーとして働く細胞骨格タンパク質 上のユニークなエビ１−ブを検出するようにみえる（Ｓａｍｕｅｌ、ｅｔ　ａｌ 、、１９８１）。！ＪＡｂ　１７４Ｈ，６４は、組織学的な起源のいかんにかか わらず、テストしたすべてのＳｑ　Ｃａと反応するしくｌｄｅｍ）、また司じよ うにヒト（テストしｆ＝＞６２）、イヌ（テスしした１０）、ウシ（テストした ４０）およびネコ（テストした２）を含めてテスにしたすべてのＳｑ　Ｃａにつ いても反応する。

光研究でわれわれはＭＡｂ　１７４Ｈ，６４がマウス転移肺Ｓｑ　Ｃａ、ＫＬＮ −２０５と反応するという利点を生かしてＭＡｂ　１７４）１．６４とダウンマ イシンとの抱合体（ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４−ＤＭ）による化学免疫療法に関す る動物モデルを開発した。ＫＬＮ−２０５細胞株を用いた以前の研究によって、 肺転移結節の！ｉ！瘍周辺は＠瘍の中心部分にある、より分化した細胞の子孫で ある高い増殖能をもつ細胞から成っていることが示された。われわれはＭＡｂ　 １７４Ｈ，６４はヒトおよびウシ５ＱＣａと同じようにＫＬＮ−２０５肺膿瘍の 周辺層を選択的に染色することを示した。このことはＫＬＮ−２０５モデルを用 いて腫瘍の“幹“細胞に対する選択的な標的療法を試みることに対する理論的根 拠を与えた。というのは内部にある、より分化した細胞はもはや悪性増殖をする 能力はないからである。

ダウノマイシンについて広範な経験をもっていたので、免疫抱合体の細胞毒成分 としてわれわれはダウノマイシンを選んだ。

Ｄｉｅｎｅｒ、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２３１＋１４８（１９８６）： Ｄｉｅｎｅｒ、ｅｔ　ａｌ、、ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂａ５ｉｓｏｆ　Ｉｍ ｍｕｎｅ　Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ、Ｐ、５０９（Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、Ｉｎ ｃ、、Ｎ。

Ｙ、１９８８）；Ｄｉｅｎｅｒ、ｅｔ　ａｌ、（１９８８ＸＭａｒｃｅｉ　Ｄｅ ｋｋｅｒ）；ｘｉｅ、ａｔ　ａｌ、（１９８７）。われわれは前に抗−Ｔｈｙｌ 、２ＭＡｂとダウノマイシンの免疫抱合体が標的細胞に対して高い特異的細胞毒 活性を有すること、そして骨髄からＴｈｙｌ、２↓挿瘍細胞とマウスの機能性Ｔ 細胞を特異的に排途するのに使用しうろことを示した。われわれはＭＡｂ１７４ Ｈ，６４とダウノマイシンとの免疫抱合体も、関連する抱合体、７リーのモノク ローナル抗体あるいは抱合しないダウノマイシンと比咬して、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ でもｉｎ　ｖｉｖｏでもＫＬＮ−２０５マウス扁平上皮癌の増殖を、顕著にそし て特異的に阻害することを見出した。

最初の実験でわれわれは免疫抱合体がｉｎ　ｖｉｔｒｏで特異的に細胞を殺すこ とを証明しようと計画した。このために３つの細胞株と３つの免疫抱合体で交差 実験を行ったが、これらのものは免疫蛍光および／または免疫酵素テスト法に基 づいて、それらに特異的な細胞株に対して特異的であるべきである。それぞれの ケースについて非常に強い特異性とすぐれた細胞殺傷作用が認められた：　ＭＡ ｂ　８６Ｈ，１−ＤＭはＨＬ−６０細胞だけを、ＭＡｂ抗−Ｔｈｙｌ　、２−Ｄ Ｍは５Ｌ２−Ｒ５細胞だけを、そしてＭＡｂ　１７４Ｈ，６４はＫＬＮ−２０５ 細胞だけを殺した。面白いことに、１７４１（，６４免疫抱合体にょるＫＬＮ− ２０５細胞の殺傷効果は培養系に加えた抱合しないフリーのダウンマイシンとほ ぼ同程度であった。

つぎにｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験の拡張として、ＫＬＮ−２０５細胞をｉｎ　ｖｉｔ ｒ。

で免疫抱合体、フリーの抗体あるいはフリーのダウノマイシンと一緒に培養、洗 浄、静脈内接種して肺中での転移増殖をモニターする実験を実施した。この場合 、ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４−ＤＭ抱合体とのプレインキュベージ１ンによって肺 中のＫＬＮ−２０５細胞の転移増殖を著しく減少させることができた。ここでも また、免疫抱合体で達成された増殖の減少はフリーのダウノマイシンによる減少 と大体司じ程度であった。非抱合ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４とのｉｎ　ｖｉｔｒＯ インキュベーションによって肺中のＫＬＮ−２０５細胞の増殖についてわずかな 、しかし統計的には有意でない減少がみられた。

ついで、ＭＡｂ−１７４Ｈ，６４−ＤＭ抱合体のｉｎ　ｖｉｖｏ治療能力を直接 テス１する２つの実験を計画した。免疫療法は１０６個のｋＬＮ−２０５細胞の 静脈内接種？＆３日目百計なわち肺転移細胞が十分に確立されたとさにスタート した（Ｋａｎｅｋｏ、ｅｔ　ａｌ、、１９８１；Ｗｉｌｌｉａｍｓ、ｅｔ　ａｌ 。

、＋９７３）、　ＭＡｂ−１７４Ｈ，６４−ＤＭヲＩＱ日間にわたり、２日間隔 で５回静脈内注射した。読口のＫＬＮ−２０５細胞の増殖を１２５１−ＩＵＤＲ の取り込み検定法を用いて２３ヨ目にモニターし、生存率は１００日百以後にモ ニターした。種々の化合物の治療能力についての２つの評価は非常に似た結果を 与えた。ＭＡｂ　８６Ｈ，１−Ｄ）ｊを注射したマウスでは治療による好結果は なく、腫瘍増殖と生存率についてＰＢＳを注射したマウスと同じであった。ダウ ノマイシン単独では増殖がわずかに減少し、生存率はわずかに増加した。むしろ 、より大きな治療利益が非抱合〜Ａｂ　１７４Ｈ，６４についてみられた。しか しながら、最良の治療はＭＡｂ　１７４Ｈ，６４−ＤＭ免疫抱合体を静脈注射し た後に達成され、その場合肺中の膿瘍細胞増殖が８０％以上減少し、生存期間の 延長もみもれた。１００日以上生存したマウスの２０％（５匹のマウス）につい て大きな生存期間の延長がみもれた。１７４Ｈ，６４免疫抱合体の治療利益は、 当実験で用いた治療方式が最良なものとは限らないだろうことを考えたときより 印象的である。

ＭＡｂ　１７４Ｆ！、６４−Ｄ！Ｊが有効なのは、多分それが標的細胞の表面に 特異的に結合し、標的細胞の内部に薬剤が蓄積することによる。

Ｂｒｏｘｔｅｒｍａｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍａｅｏｌ、 、３７：２３８９（１９８８）；Ｄｉ−１１ｍａｎ、ｅｔ　ａｌ、、ｃａｎｃｅ ｒ、、４８：６０９７（１９８８）；Ｐｉｍｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃａｎｃｅｒ　 ＩｍｍｕｎｏＩ　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、、２７：２６７（１９８８）、Ｐｉｍ ｍと共同研究者達はダウノマイシン免疫抱合体を注射したヌードマウスにおける ヒト腫瘍の増殖について研究した。その結果、薬剤と抗体の両者が腫瘍のところ に局在し、解析の時点（注射後３日目）で膿瘍内のダウノマイシン濃度はフリー のダウノマイシンを注射したマウスの場合の１００倍以上であることを見出した 。免疫抱合体のエンドサイトーシスにひき続いて、細胞毒性能をもつ成分はリゾ ソーム中の酸感受性スペーサーから遊離されて完全な薬理活性を取り出すように みえる（Ｄｉｌｌｍａｎ、ｅｔ　ａｌ、１９８８）。これらの結果は、同じダウ ノマイシン濃度でも、免疫抱合体ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４−ＤＭは１ｎｖｉｖｏ でＫＬＮ−２０５細胞の増殖を顕著に抑えるのに、７リーのダウノマイシンは抑 えないというわれわれの観察と矛盾しない。ただし、７リーのダウンマイシンは ｉｎ　ｖｉｔｒｏでインキュベートしたとぎは免疫抱合体と同程度かより大きな 細胞毒活性を示した。

Ｇａｌｌｅｇｏ　ｅｔ　ａｌ、（１９８４）はダウノマイシンを抗体にカップル させるための４つの異なるリンケージ基を研究した。かれらは当研究で用いたの と同じく、シスーアコニチル結合で作られた抱合体が膿瘍細胞に対して最大の選 択的細胞毒性を現すことを見出しｔ；。われわれの研究結果は、シスーアコニチ ル結合基で作られたダウンマイシン免疫抱合体の有効性を実証したように思われ る。

ＭＡｂ　１７４Ｆｔ、６４は正常および悪性の形層扁平上皮の幹細胞集圀のみに 発現されたいくつかの細胞骨格タンパク質上に発現されｔ；新しいエビソーブを 検出するようにみえる。以前の観察ならびに当実験からＭＡｂ　１７４Ｈ，６４ で検出されるエピソープはＫＬＮ−２０５細胞の表面にも発現されることが示唆 される。ある細胞骨格タンパク質に関してはその他の細胞表面抗原法定基が報告 されている：　Ｄｉａｚ、ｅｔ　ａ！、、Ｊ、１ｎｖｅｓｔ、Ｄｅｒｍａｒｏｌ 、、８９：２８７（１９８７）；Ｚｉｍｍｅ−ｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃ ｅ１１．Ｂｉｏｌ、、９５：２３７ａ（１９８２）−１７４Ｈ，６４エピトープ は形層扁平上皮の基底細胞表面にも存在すると思われるので、当実験においても いくらかの皮膚毒性か期待されるかもしれない。しかしながら、長期（１００日 以上）生存マウスを含めて、フリーの１７４Ｈ，６４ＭＡｂあるいはＭＡｂ　１ ７４Ｈ，６４−Ｄ藺抱合体のいずれかを複数旦注射した１００匹以上のマウスに ついて、なんらの皮膚傷害の証拠もないし、その他の明かな肉眼的病変もみられ なかった。

マウスについての研究を基礎にして、われわれはＭＡｂ　１７４Ｈ，６４は扁平 上皮細胞癌の患者に対する有望な治癒能力をもつだろうと結論する。放射性標識 ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４を用いた予備的な放射免疫画像処理研究で、このＭＡｂ がｉｎ　ｖｉｖｏでヒト扁平上皮癌中に非常によく局在することが観察された。

実施例３　：　ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４を用いた画像処理ＭＡｂ　１７４Ｈ，６ ４の臨床的有用性Ｉｎ　ｖｉｖｏでの膿瘍局在物質としての放射性標識ＭＡｂ　 １７４Ｆ＋、６４の臨床的有用さをテストするために、精製した抗体全体をテク ネチューム−９９ｍで標識し、扁平上皮癌の患者何人かに注射した。

標識は以下の手順で行った： 酒石酸ナトリウムカリウム（０，２８２ｇ）と７タール酸カリウム（０，８１７ ｇ）の混合物を１００ｍ１の滅菌水に溶解し、常時撹拌しながら発熱物質のない ビーカー中に注入した（“緩衝液”）。乾いた、そして微粒子を含まない窒素を 溶液に通じてこれを蒸発除去した。窒素は微量に存在する酸素を除去するために 前もって窒素精製器を通し、ついでどんな痕跡量の粒子不純物をも除去するため に０．０２μフイルターを通した。つぎに２０ｍ１の濃塩酸に１．８９６ｇの無 人塩化第：錫を溶かして０．麹の塩化第１錫（Ｓｎｃ　１２）溶液を得た。この ＷＩ液１ｍｌを直ちに前もって調製した緩衝液に加え、この最終混合液のＰＨを ＩＯＮの水酸化ナトリウム溶液を用いて注意深く５．６±０．０５に調整した。

その混合液を窒素ガスで除去し、０．２２μフイルターに通した。これを還元溶 液と呼ぶ。リン酸緩衝液山のＭＡｂ　１７４Ｆ１．６４１ｍｇをフィルターに通 した還元溶液０．６７ｍ１と混合し、混合液が１ｍｌあたり１ｍｇの抗体を含む ようにＭＡｂの最終濃度を調整した。混合後、抗体と還元溶液を含むバイアルに 数分間窒素を通して液を除去し、室温で２１時間窒素気流下においた。インキュ ベーション終了後、処置したその抗体溶液を０゜２２μフイルターに通した。こ のフィルターはタンパク質含量、発熱物質、純度（大きさで除去するカラムクロ マトグラフィを用いて）および免疫反応性に関して検定した。もとの処理しない 全抗体と上記のような処理を施した抗体との間には免疫反応性や分子量について 差はなかった。つぎに調製した抗体の溶液を臨床的に使用時まで凍結させた。使 用時に、凍結した還元抗体を含むバイアルを室温で解氷し、ＴＣ−９９ｍパーチ クネートナトリウム溶液（５０ｍＣｉまで）の必要量を加え、その溶液を室温で １時間インキュベートした。インキュベーションが終わった時点で、アセトンを 展開溶媒として厚層クロマトグラフィでなにか非結合のＴＣ−９９ｍがないかを テストした。放射性標識の有効度は９５％であった。

臨床結果 頭部とくび、頚部および肺に転移肩車上皮癌をもつ１１名の１−者についての臨 床研究を実施し、■”ＴＣ−標識ＭＡｂ　１７４Ｈ，６４を静脈注射してのちの 取り込みをしらべた。２ｍｇ　（約５０ｍＣｉ　）量の抗体を１００ｍ１の正常 食塩水で希釈し、３０分間かけて注入した。どんな異常な取り込みも、注入後に 何回も平面単一７才トン発光コンピュータトモグラフＩで測定した。２４時間以 内に得られた結果から、２名の患者では見かけ正負の取り込みであったのに対し て９名については実際陽の取り込みがみられた。胸上部へ転移した頚部扁平上皮 癌をもつ１人の患者で観察されたこのようなスキャンを図７に示す。そこには直 径２−４ｍｍの病変部中の抗体の取り込みが示されている（図７参照）。

標識全抗体の薬動力学は、フラグメントのすでに知られている挙動と実際同じあ るという異常さを見出した。血液クリアランスは迅速で、取り込みは注入後早く も３時間でみられた。患者の尿；の放射活性の分析によって分泌された放射活性 は遊離のパーチク不りテートによるのではなく、むしろ結合放射活性によること が証明された。

第１図 第２図 Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ処理 培養ｆ由ＣＰＭ　（平均−標準誤差） 第５図　・ 静脈内注射 肺中のＣＰＪ　（平均−標準誤差） 担癌マウスの生存に対するＭＡＢ１７４Ｈ，６４−ＤＭ効果第６図 第７図 国際調査報告 ｗ＝＝＾−−、Ｃ−ｂ−−−＋−，ＰＣＴ／ＵＳ９０１０２１５２

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. １．本質的に扁平上皮癌に関連する抗原と形層上皮の幹細胞だけに結合する抗体 から成る抗体製剤。
2. ２．抗原が分子量約４８から５０キロダルトンと５７キロダルトンの細胞骨格タ ンパク質を含む請求項１記載の抗体製剤。
3. ３．扁平上皮癌特異的反応性がヒト以外の哺乳動物の偶発腫瘍にまで及ぶ請求項 １記載の抗体製剤。
4. ４．抗体がいわゆるヒト扁平上皮癌の増殖区分に対して優先的に反応する請求項 １記載の抗体製剤。
5. ５．抗体が基底および準基底成熟扁平上皮と優先的に反応する請求項１記載の抗 体製剤。
6. ６．成熟扁平上皮がヒト頚部扁平メタブラジアである請求項５記載の抗体製剤。
7. ７．製剤がＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１０５あるいはそこからの再クローンを有 するハイブリドーマにより分泌された抗体から作られる請求項１記載の抗体製剤 。
8. ８．製剤が標識抗体あるいはそれとの結合フラグメントから成る請求項１記載の 抗体製剤。
9. ９．抗原が分子量約４８から５０キロダルトンと５７キロダルトンの細胞骨格タ ンパク質を含み、そこでのいわゆる抗体とは細胞毒物質と結合し、その抗体は本 質的にそれ自身の特異性を保持しているヒト扁平上皮細胞癌と関連した抗原およ び形層上皮の幹細胞集団と選択的に結合する抗体から成る治療物質。
10. １０．請求項１に従って放射標識したモノクローナル抗体製剤を患者に投与し、 つぎにいわゆる放射性標識したモノクローナル抗体の免疫画像処理によってその 扁平上皮細胞癌の場所を決定する、ことから成る扁平上皮細胞癌に局在化させる 方法。
11. １１．抗体がＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１０５あるいはそれの誘導体を有するハ イブリドーマによって分泌される請求項１０の方法。
12. １２．請求項１によるモノクローナル抗体が結合する条件下で治療的有効量を癌 患者に投与する（ここでいうモノクローナル抗体は細胞毒薬剤と結合しており、 それは本質的にそれ自身の特異性を保持しているものである）ことから成る扁平 上皮細胞癌の処置法。
13. １３．モノクローナル抗体がＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１０５あるいはそれの再 クローンを有するハイブリドーマにより分泌される請求項１１記載の方法。
14. １４．請求項１によるモノクローナル抗体製剤をそこでいう試料と、少なくとも 抗体のいくらかがそこでいう抗原と結合するのに十分な時間インキュベートし、 つぎに結合した抗体を検出する、ことから成る試料中の扁平上皮癌関連抗原の存 在を検出する方法。
15. １５．モノクローナル抗体がＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１０５あるいはそれの再 クローンを有するハイブリドーマによって分泌される請求項１１記載の方法。
16. １６．抗原が分子量が約４８から５０キロダルトンと５７キロダルトンの細胞骨 格タンパク質を含み、いわゆる抗体はヒト扁平上皮細胞癌の増殖区分と優先的に 反応する本質的にヒト扁平上皮細胞癌関連の抗原と形層上皮の幹細胞集団だけに 結合するモノクローナル抗体。
17. １７．モノクローナル抗体が基底および準基底成熟扁平上皮と優先的に反応する 請求項１６記載のモノクローナル抗体。
18. １８．成熟扁平上皮がヒト頚部扁平メタブラジアである請求項１７記載のモノク ローナル抗体。
19. １９．抗原が分子量約４８から５０キロダルトンと５７キロダルトンの細胞骨格 タンパク質から成る群から選別されるヒト扁平上皮細胞癌と関連した抗原および 形層上皮の幹細胞集団と優先的に結合する抗体から成る抗体製剤。
20. ２０．モノクローナル抗体がヒト胸管の胸腺細胞および筋上皮細胞と選択的に結 合する請求項１記載の抗体製剤。
21. ２１．雌牛、イヌあるいはネコの扁平上皮細胞癌と反応する請求項１９記載の抗 体製剤。
22. ２２．ヒト扁平上皮細胞癌および形層上皮の幹細胞集団と結合する抗原−結合フ ラグメントの製剤あるいは抗体抱合体から成り、そこでいう抗原の分子量は約４ ８から５０キロダルトンと５７キロダルトンである請求項１９記載の抗体製剤。
23. ２３．請求項１８の記載に従って調整された放射性標識抗体製剤。
24. ２４．放射性標識抗体が１３１Ｉ，１２５Ｉ，９０Ｙ，２１１Ａｔ，６７Ｃｕ， １２６Ｒｅ，９９ｍＴｃ，１１１Ｉｎおよび６７Ｇａより成る群から選択された 放射性核種を含む請求項３１記載の放射性標識抗体製剤。
25. ２５．請求項８記載の酵素標識抗体製剤。
26. ２６．請求項１記載の薬剤抱合抗体。
27. ２７．請求項１記載の抗体製剤を固体支持体上に固定すること、この固体支持体 と生物試料をコンタクトさせること、固体支持体から非結合不純物を分離するこ と、および抗原を固定化した抗体製剤から純粋な形で溶離することから成る抗原 を分離するプロセス。
28. ２８．固体支持体上に１７４Ｈ．６４を固定すること、その固体支持体を生物試 料とコンタクトさせること、固体支持体から非結合不純物を分離すること、およ び抗原を固定化した１７４Ｈ．６４製剤から分離した形で溶離することから成る 請求項２７記載のプロセス。
29. ２９．請求項１記載の抗体製剤とその反応相手との結合反応を検出し、あるいは 定量化することから成る扁平上皮細胞癌を診断する方法。
30. ３０．検出され、あるいは定量化された反応がｉｎ　ｖｉｖｏで起こる請求項２ ９記載の方法。
31. ３１．扁平上皮細胞癌の診断あるいは治療のための成分の製造における請求項１ 記載の抗体製剤の使用。
32. ３２．細胞毒性物質がダウノマイシンである請求項９記載の治療物質。
33. ３３．細胞毒性物質が酸感受性シス−アコエチルスペーサによって抗体と結合し ている請求項９記載の治療物質。