JPH05504553A - 新規の結合を有するオリゴヌクレオチドアナログ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規の結合を有するオリゴヌクレオチドアナログ技術分野 本発明は、ヌクレアーゼに耐性で、細胞を通過する能力を増強させ、そしてイン ビトロおよびインビボで標的オリゴヌクレオチド配列と結合し得る、改変された オリゴヌクレオチドの構築およびその構成成分に関する。本発明の改変されたオ リゴヌクレオチドは、タンパク質の合成を妨害する、あるいはオリゴヌクレオチ ドを不活性化するアンチセンスＤＮＡを利用する治療に特に有用である。さらに 詳細には、本発明は充分に安定化された電子吸引性基を有するホルムアセタール ／ケタール型結合によるホスホジエステル結合の置換を少なくとも１個含有する オリゴマーに関する。

背景技術 病因が特定のＤＮＡあるいはＲＮＡの配列によって特徴付けられているか、ある いはこれらと関連している疾病に対してアンチセンス治療を開発することが合理 的であることは、何年も前から認識されていた。この基本原理は非常に簡単であ る。

直接投与するかあるいはｉｎ　５ｉｔｕで生成するのかを問わず、この究極の治 療剤は、疾病の進行に必要なりＮＡあるいはＲＮＡに相補的なオリゴマーである 。この標的ＤＮＡあるいはＲＮＡに特異的に結合することによって、これらの物 質の正常機能は阻止される。

この方法の背後にある論理は、例えば疾病の進行に必要なタンパク質をコードし ているｍＲＮＡの配列に相補的な塩基配列を有するオリゴマーの投与を思い浮か べることによって容易に理解される。このＲＮＡに特異的にハイブリダイゼーシ ョンすることによって、タンパク質の合成は阻止される。しがしながら、投与さ れたオリゴマーを二重鎖ＤＮＡのメジャーグループの中に挿入することによって 、特異な二重鎖の形成を行い得る適切なオリゴマーの使用により、二重鎖ＤＮＡ に結合することも可能である。もちろん、治療に対する標的を形成する配列の解 明は、各々標的とする病状あるいは疾病に特有の課題である。一般的原理は充分 理解され、確立されているが、特定のオリゴマープローブの設計に要求される多 くの予備的な配列情報は解明されないまま残っている。

しかしながら、多（の標的で共通するオリゴマープローブの一つの特徴は、内因 性のヌクレアーゼに対して耐性であり、そしてインビボで安定であるが、標的Ｄ ＮＡあるいはＲＮＡにハイブリダイズする能力も保持するような投与されたオリ ゴマーの基幹の構造である（　Ａｇａｒｖａｌ、に几、ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅ５（１９７９）　ｉ：３００９；　Ａｇａｒｖａｌ、Ｓ、ら、Ｐ ｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９８ｇ）■ニア０７９．　） 。ヌクレアーゼはホスホジエステル結合を攻撃するので、別の結合を含有する多 くの改変されたオリゴヌクレオチドが構築された。これらの中には、メチルポス ポン酸エステル（リンに結合した酸素の一つがメチルで置換されている）ホスホ ロチオエート（イオウがこれらの酸素の一つと置換している）および種々のアミ デート（ＮＨ２あるいは有機アミン誘導体、例えばモルフオリデートあるいはピ ペラジデート、で酸素が置換されている）がある。これらの置換により、多くの 場合安定性が増強するが、結合中にキラルなリン原子を生成し、その結果ｎをオ リゴマー中の改変されたジエステル結合の数とすると、２°個のジアステレオマ ーを形成するという欠点がある。これらの複数のジアステレオマーの存在は、標 的配列にハイブリダイゼーションする能力をかなり弱める。これらの置換の幾つ かはまたマイナスの荷電を維持する能力を保持している；荷電した基の存在は細 胞膜を通過する化合物の能力を減少させる（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｐ、Ｓ、ら、Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉ■ｕ（１９８１）　２０＋１８７４；　Ｍａｒｃｕｓ−Ｓｅｃｕｒ ａ、Ｃ１，ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ口Ｌｌ競（１９８７）　ｌｊ、：５７４９ ；　Ｊａｙａｒａｍａｎ、Ｋ、ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ　Ｕ ＳＡ　（１９８１）　７８：１５３７）　ｏ　これらの改変された結合に関連す る結合に特有の性質に依存した多くの他の欠点がある。

カルボン酸ジエステルの使用もまた示唆されている；しかしながら、これらはか なり不安定であり、そしてカルボン酸ジエステル結合は、ホスホジエステル中の リン原子が示す四面体構造の立体配置をとらない。同様に、カルバメート結合は キラルではなく、三角形のシンメトリ−構造をしており、この結合を有するポリ ｄＴはボッｄＡと強くハイブリダイゼーションしないことが示されている（　Ｃ ｏｕｌ　１．　Ｊ、　Ｍ、ら、ｎＬ江旦（１９８７）　２８ニア４５；　５ｔｉ ｒｃｈａｋ、Ｅ、Ｐ、ら、Ｌ立匡コニ讐（１９ｇ？）　５２：４２０２）。

本発明と関連して、結合置換として酸素ではなくイオウを包含する改変されたホ スホジエステル結合がある。例えば、３−チオチミジンを含有するオリゴヌクレ オチドを記載しているＣｏ５５ｔｉｃｋ、　Ｒ，ら、Ｔｅｔ　Ｌｅｔｔ　（１９ ８９）　３０：４６９３−４６９６を参照。

アンチセンス治療に有用なオリゴマーを構築する一般的な方法は、例えばｖａｎ 　ｄｅｒ　Ｋｒｏｌ、　Ａ、Ｒ，ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ　（１９８８ ）　ｉ：９５８−９７６および５ｔｅｉｎ、　Ｃ，Ａ、ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ ｓ　（１９８８）　４８：２６５９−２６６８によって総説が書かれている。本 明細書ではこれらを両方とも参考文献として援用する。

本発明は、天然の分子中に見いだされるホスホジエステルと同じ立体構造である が、ヌクレアーゼ消化に対して耐性であり、そして生理的条件下で安定であり、 そして細胞への浸透を促進するために中性であり得る、オリゴマー結合を提供す る。さらに、この結合はキラルでなくとも良く、従って、その結果生じた化合物 には複数のジアステレオマーの問題は起こらない。

ｌ匪立笠ｊ 本発明は、二量体および三量体を包含する改変されたオリゴヌクレオチドに関す る。この改変は、オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のホスホジエステル結合 を一般式ＹＣＸ２Ｙのホルムアセタール／ケタール型結合で置換する工程を包含 する。

ここで、Ｙは独立して０あるいはＳである。Ｘはそれぞれ独立に選択され得るが 、炭素をキラルでなくするために２つのＸは同一であることが好ましい。適切な 安定性を供与するために、Ｘは、例えば、一般的な電子供与性置換基とは逆の性 質の、結合を安定化させる置換基でなければならない。Ｘの必要条件は、さらに 以下に述べているように各Ｙの性質に依存して異なる。

本発明は一つの局面では、少なくとも１個のホスホジエステルあるいは他の通常 の結合の代わりに、一般式−ＹＣＸ２Ｙ−の結合を含有する、オリゴヌクレオチ ドおよびこれらを生成する中間体に関する。ここで、各Ｙは独立して０あるいは Ｓであり、そして、同じ炭素に結合した各Ｘは独立して選択されるが、２つのＸ は同じであることが好ましい。Ｘは、ホルムアセタール／ケタール結合−０ＣＸ ２０−１−ＳＣＸ２０−および−〇ＣＸ２Ｓ−結合の混合結合、あるいはジチオ アナログである一５ＣＸ２Ｓ−で要求される結合の安定化のために充分な電子吸 引性を供与する。別の方法で述べると、本発明は以下に定義される、下記の一般 式一般式１ の化合物およびこれらの誘導体、に関する。ここでＢはそれぞれ、独立して以下 に定義される、プリンあるいはピリミジン残基あるいはこれらのアナログ体、で ある。ここで、Ｙはそれぞれ独立してＯあるいはＳであり、そして、２はそれぞ れ独立しで あるいは通常のホスホジエステル置換基（−Ｐ（０）Ｓ−、−Ｐ（０）ＮＲ２− 、−Ｐ（０）Ｒ−、あるいは−Ｐ（０）ＯＲ’−；　−Ｃｏ−あるいは−ＣＮＲ どを含有するがこれらに限定されない。ここでＲはＨあるいはアルキル（１−６ Ｃ）であり、モしてＲ゛はアルキル（１−６Ｃ）である）であり、ここでＸは以 前に定義した通りで、そして讃はそれぞれ独立して０あるいは１であり、ｎは１ −２００である。少なくとも１個の２はＣス２である。

本発明はさらＩこ別の局面では、本発明の化合物を生成する中間体に関し、また 、標的オリゴヌクレオチドへの特異的結合に依存する治療法（「アンチセンス」 治療法）にこれらの化合物を用いるための組成物および方法に関する。

［Ｌ立！工亙且旦 図１は、ＤＮＡの二重鎖結合のフットプリントアッセイのアウトライン、および 理想化した結果を示す。

日を　るための５能 Ａ、定義 本明細書の用語「アンチセンス」治療は、標的核酸配列に特異的に結合する、Ｄ ＮＡあるいはＲＮＡオリゴマーあるいはこれらの誘導体を、投与あるいはｉｎ　 ５ｔｔｕで生成することを意味する。該結合は、通常の塩基対の相補的によるも の、あるいは例えば、ＤＮＡの二本鎖に結合する場合には、二本鎖のメジャーグ ループへの特異的相互作用であり得る。一般に、「アンチセンス」とは、当該分 野で一般的に用いる一連の技術を意味し、そしてオリゴヌクレオチド配列への特 異的な結合に依存する全ての治療法を含む。

「オリゴマー」あるいは「オリゴヌクレオチド」は１個以上のヌクレオチドの配 列を含む。そして特に二量体および三量体のような短い配列を含む。

オリゴマーの「誘導体」は、当該分野で通常認識されているオリゴマーを含む。

例えば、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ二重鎖のマイナーグループに特に相互作 用する物質である、インターカレーターのような種々の部分および標識（放射能 、蛍光、酵素、など）のような任意に選択される他の複合体に共有結合し得る。

これらの付加された部分は結合の一部分としてホルムアセタール／ケタール型結 合によって誘導され得る（が、必ずしも必要ではない）。例えば、アクリジンの ようなインターカレーターは任意に用い得る一ＯＨあるいは−ＳＨを有する一Ｙ −ＣＨ２−Ｙ−を介して結合し得る。例えば、ＲＮＡあるいはＤＮＡの５′末端 位、ＲＮＡの２°位、あるいはピリミジンの５位に例えば、シトシンの５メチル の代わりに、５位に−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２０Ｈあるいは−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ■２Ｓ Ｈを含む誘導により導入したＯＨあるいはＳＲ。

多様な置換基が結合し得、通常の結合を介した結合が含まれる。従って、一般式 （１）のオリゴマー中に示した一〇Ｈ部分は、ホスホネート基に置換されるか、 標準的な保護基で保護されるか、あるいは、他のヌクレオチドへのさらなる結合 を作製するために活性化される、あるいは複合置換基に結合し得る。

５°末端のＯＨは通常リン酸化される；３′末端の２°−ＯＨあるいはＯＨ置換 基もまたリン酸化し得る。水酸基も標準的な保護基に誘導し得る。さらに、本明 細書と同じ日に出願され、同じ出願人に譲渡され、そして本明細書中に参考文献 として援用されている、米国特許出願系（Ａｔｔｙ、　ｄｏｃｋｅｔ　４６１０ −０００３）号に開示された、ヌクレオチド残基の２−誘導体が特に含まれる。

図に示したホスホジエステル結合は、１個の結合が−ＹＣＸ２　Ｙ−の形態であ る限り、別の結合グループで置換し得る。これらの別の結合グループは、実施態 様に含まれるが、これに限定されない。ここで、ｒＺＪはＰ（０）Ｓ、　Ｐ（０ ）ＮＲ２，Ｐ（０）Ｒ，Ｐ（０）ＯＲ’、ＣＯｌあるいはＣＮＲ２であり、ここ でＲはＨあるいはアルキル（１−６Ｃ）、およびＲ゛はアルキル（１−６Ｃ）で ある。同じオリゴマー中の２は必ずしも同じである必要はない。

プリンおよびピリミジンの「類似」体は、当該分野で一般に周知のものであり、 これらの多くは化学療法剤として用いられている。完全に網羅はしていないが典 型的なリストには、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル ）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチ ルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシ ル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチル アデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノ シン、２．２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、 ３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチル グアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２− チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキ二エオジェオシンメトキシカルボニルメチ ルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチル−チオ−Ｎ６−イソペンテニル アデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢 酸、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キュエオシン、２−チオシトシン、 ５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メ チルウラシル、トウランルー５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オ キシ酢酸、プソイドウラシル、キュエオシン、２−チオシトシン、および２，６ −ジアミツプリンが含まれる。特に好ましいアナログは５−メチルシトシンであ る。

本発明は、アンチセンスに基づいた治療法に有用である新しい化合物およびこれ らを生成する中間体に関し、そしてこれらの化合物およびこれらの中間体を合成 する方法に関する。

一般に、本発明の化合物は、これらの改変された結合によってヌクレアーゼに関 する安定性の増大、および細胞浸透能力が増強、を示す。改変されていないオリ ゴヌクレオチド中の複数のホスホジエステル結合は、対応するホルムアセタール ／ケタール結合あるいはこれらのイオウを含むアナログで置換されるのが望まし い。これらの置換基を有する結合はハイブリダイゼーションする能力を増強する 性質において非キラル性であるのが好ましいが、本発明の有用な化合物はＸがそ れぞれ独立して選択される置換基である化合物を含む。この結果、キラル体もま た用いられ得る。そして複数のホルムアセタール／ケタール結合あるいは類似体 のチオ結合した結合がオリゴヌクレオチドが存在する場合、多くのＸ−の実施態 様が含まれ得る。

上述したように、結合部分−ＹＣＸ２Ｙ−は、ポルムアセタール／ケタールであ り得る。あるいは１個あるいは両方の酸素がイオウで置換され得る。チオール結 合による１個あるいは両方の酸素の置換は、炭素−イオウ結合の長さは本来のオ リゴヌクレオチド中のリン−酸素結合の長さにより厳密に対応するという利点を 有し得る。さらに、チオアナログは特に酸性条件下での加水分解に対してより安 定であるので、以下にさらに記載しているように置換基Ｘに関連して、より大き な範囲が可能である。さらに、調製反応は中間体のＳＨ基の核性を増強するため によりスムーズに行われ得る。

表示を容易にするために、「野生型」オリゴヌクレオチド（および、上記に定義 されるこれらの誘導体）は時々下記の速記体で示される： この表示では、Ｂは、Ａ、　Ｔ、　Ｃ１Ｇのような通常のプリンあるいはピリミ ジン塩基、および特有の治療剤あるいは化合物に望ましいこれらの塩基の改変型 を表す。ある特有の応用の場合には、１個あるいはそれ以上のｒＢＪ基は、置換 基がオリゴマーの目的の作用を妨害しない限り、任意の置換基で置換され得る。

多くの場合、これらは上記で定義されているように類似体の置換基で置換され得 る。

同様に、本発明の改変されたオリゴマーの対応する速記体は であり、ここで同様の定義がＢの性質および誘導体の可能性に適用される。さら に、本発明の結合は、ヌクレアーゼの攻撃に安定であるので、改変された型態の ＤＮＡに加えて、同様に改変された型態のＲＮＡも本発明に含まれ得る。

本発明の化合物は均一の結合型のオリゴマーに限定されず、そして別の、あるい はランダムに分布したホスホジエステル（あるいは他の置換基）およびホルムア セタール／ケタール型結合が意図されることは明かである。本発明のオリゴマー は、−回で１個のヌクレオチド残基を合成し得るので、各特有の結合、および各 特有のｒＢＪ置換基の性質は随意に選択され得る。しかしながら、多くの応用で は、治療用に設計されたオリゴマーの主要な部分は、ヌクレアーゼによって攻撃 される分子の部分を最小化し、そして細胞浸透を増強するために、ホルムアセタ ール／ケタール型置換結合を含むことが意図される。

Ｘは本発明の置換基の結合を安定化させるような性質を有さなければならない。

Ｙが両方とも０−１すなわち、−０ＣＸ２０−である実施ｔｑｓでは、ケタール Ｃに結合した１個のＸが他のＸの強い電子吸引性で補正されなければ、アルキル 置換基は機能不可能である。この場合のＸの好ましい実施態様は単純に■である ：これは適切な安定性を生じるのに充分な電子吸引性の特性を有する。Ｘの他の 好ましい実施態様は、カルボキシルあるいはそれらのエステル類あるいはそのア ミド類；　Ｆ、　Ｃ１，Ｂｒおよび！を含むハロゲン化物：Ｎ０２；低ｐＦＩの ホスフェートあるいはホスホレート、Ｒ１が典型的にはアルキル（１−６Ｃ）で ある有機残基の一５ＯＲあるいは一３Ｏ２Ｒ；あるいは、−ＣＮあるいは−ＣＦ ３を含む。他の実施態様は、１−３メチレン基による一０ＣＸ２０−の結合Ｃか ら電子吸引性の基を分離したものを含有する；すなわち、Ｘは−（ＣＨ２）Ｊで あり、ここでｎは１−３であり、そしてＷは電子吸引性の置換基である。一般に 、ｎの数値が大きいほど、Ｗの電子吸引性も大きくなる。Ｗの典型的な実施態様 は一級、二級、あるいは三級アミン類を包含する。あるいは、Ｗはざらにヒドロ キシメチル、あるいは０ＣＨ２０ＣＨ２０ＦＩのような置換されたヒドロキシメ チル、あるいは例えば０ＣＲ２ＣＦＩ２０Ｈ，のようなヘテロ原子を含有する。

さらに、２つのＸは、少な（とも１個のへテロ原子を含む環状置換基を構成し得 る。その場合、これらの実施態様ではケタール結合は例えば であり得る。

従って、適切なＸの置換基は−Ｈ１−Ｆ、−Ｃ１，−Ｂｒ、−ＮＯ２、−ｓｃ１ １２ＣＥ１３、−Ｃｏｏｎ、−ＣＯＯＣＨ３、−ＣＯＯＣＨ（ＣＨ３）２、−Ｃ ＯＮＨＣＨ３、−ＣＨ２Ｆ。

−ＣＦ３、−ＣＨ２Ｃ００Ｃ［１３、−Ｃ［１２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＩｂ、−ＣＨ ２ＣＨ２ＣＯＯＨ，−ＣＨ２ＣＨ２ＭＨ２、−Ｃ１３２Ｃ［２１４ＨＣＷ２ＣＩ （３、−ＣｈＣＢ２Ｃｈ、などを含む。ケタール結合に結合したＸが異なる場合 、Ｘは両方ともこのオリゴマーを安定化させるために充分な電子吸引性に寄与し なければならない。

１個あるいはそれ以上の結合酸素が硫黄で置換されたホルムアセタール／ケター ル型結合は、酸素を含むアナログよりも本質的にさらに安定である。この結果、 一般式−〇ＣＸ２Ｓ−１−３ＣＸ２０−および−５ＣＸ２Ｓ−の結合は、−０Ｃ Ｘ２０−の結合より電子吸引性をあまり必要としない。従って、ホルムアセター ル／ケタール結合に関する上述したＸの実施態様は全て適切であるが、さらに、 又はまた、一般には低級アルキル（１−４Ｃ）のアルキル、あるいは、フェニル が適切な位置で電子吸引性置換基を含有すれハ：例えば２−ニトロフェニル、４ −ニトロフェニルあるいは２，４．−ニトロフェニルのフェニルでもあり得る。

もちろん、−５ＣＸ２　Ｓ−結合は電子供与に対して最も耐性である。Ｘ用の置 換基のスペクトルの範囲は、得られた生成物の安定性を簡単なアッセイで測定す ることで容易に、潜在的に電子供与性である置換基に拡張し得る。そして、この 判断およびこれらの結合の耐性に関する予測は当該分野の技術の範囲である。

Ｘがそれ自身官能基を含む場合、Ｘは治療法の補助として有用な所望の部分、例 えば、ネトロブシンおよびその誘導体、アントラマイシン、キノカリン抗生物質 、アントラマイシン、およびピロロ（１−４）ベンゾジアゼピン誘導体のような インターカレーターあるいはマイナーグループに反応性の物質を結合するために 用い得る。

本発明のオリゴマーは、本発明のホルムアセタール／ケタール型結合を任意の数 で包含し得る。これらは、Ｘを選択する実施態様によッテ、モして／あるいは、 −０ＣＸ２０−１−ｓｃｘ２ｏ−１−ｏｃｘ２　ｓ＝あるいは一５ｃｘ２ｓ−の 選択によって、互いに同じであるか、あるいは異なり得る。オリゴマーは連続し て順次調製されるので、結合型、塩基置換基、および糖残基の任意のパターンが 用いられ得る。

いくつかの好ましい実施態様では、ホルムアセタール／ケタール型結合で通常の パターンが変更される。好ましい実施態様では例えば、ジエステル結合に関して 通常の領域の３−８個の連続した、ホルムアセタール型結合にした変更を有する オリゴマーが包含される。特に好ましい実施態様は、ホルムアセタール型結合の 次にホスホジエステル結合、次にホルムアセタール結合、次にホスホジエステル 結合、など、二種類の結合が次々に変換する別の構造である。別の変更には、例 えばホルムアセタール型結合の次に２個のジエステル結合、次に１個のホルムア セタール型結合、次に２個のジエステル結合、など、である。種々の規則的な変 更パターンを容易に誘導し得る。

これらの糖残基の１個あるいはそれ以上に任意の改変を行い得ることもまた明白 である；しかしながら、大部分の場合、リボシル残基の間の標準的な３゛と５′ のヌクレオチド結合が最も都合がよい。このような場合、構造のさらなる省略形 が用い得る。例えば、標準的ＤＮＡ　（あるいは１ｉＮＡ）では、配列は一般に 例えば、ＡＴＧ　ＣＧＣＴＧＡのように塩基配列のみで示される。

一般に、これがＲＮＡあるいはＤＮＡ配列を表すかどうかはあらかじめ簡単に述 べられている。本発明の化合物においては、同様の記載法を生理的ＤＮＡあるい はＲＮＡ分子の改変については用いるが、ホルムアセタール／ケタール型によっ て置換されるホスホジエステル結合は構造式で表記される。従って、５−ＡＴＧ 　（ＯＣＸ２０）　ＧＴＣＡ　（ＳＣＸ２０）　ＡＧＧ−３°は、２個のホスホ ジエステル結合が示された位置で改変されたオリゴヌクレオチドＡＴＧＧＴＣＡ ＡＧＧを示す。

本発明の改変されたオリゴマーは、上述したように、アンチセンス治療への応用 に有用である。このような治療法の特異的探的には：ウイルス性疾患、悪性細胞 の増殖、細菌性疾患、および特徴的なりＮＡあるいはＲＮＡの存在およびその産 生物に関連する事実上全ての症状、が包含される。本発明の化合物は、改変され た別のオリゴヌクレオチドのアナログと同じ方法で適用され得る。そして、その ような適用方法は当該分野では一般的である。

Ｂ、　および 従って、本発明の改変されたオリゴマーは治療、診断、おヨヒ研究の分野で有用 である。治療においては、このオリゴマーは、一般的にアンチセンス治療に適切 な方法で使用される。上述のように、本明細書の用語アンチセンス治療は、相補 性を介して、または他の特異的な結合手段、例えばＤＮＡ二重鎖のメジャーグロ ーブ中の配列の特異な配向、または任意のその他の特異な結合方法を通してを介 して、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列を標的することを含む。その他の生物学的 な物質、例えばタンパク質も標的し得る。そのような治療のために、本発明のオ リゴマーは、全身的および局所的、または局部を含む、種々の投与に処方し得る 。一般的な技術および処方は、Ｒｅｍ１ｎ　ｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ ’ｃａ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　ＭｅａｄｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、　Ｅ ａｓｔｏｎ、　ＰＡ、最新版、に記載されている。　。

全身投与のためには、経筋肉、静脈内、腹腔内および皮下を含む注射が好ましい 。注射のために、本発明のオリゴマーは、好ましくは、ハンクスまたはリンゲル 液のような生理学的に許容可能な緩衝液の液体溶液に処方される。さらに、この オリゴマーは、固体の形にも処方し得、使用前に速やかに再溶解または懸濁され る。凍結乾燥形態も含まれる。

全身の投与は、経粘膜または経皮的手段によって、または化合物が経口で投与さ れ得る。経粘膜または経皮投与のために、浸透されるバリヤーに適切な浸透剤が 処方に用いられる。

この様な浸透剤は当分野で知られており、例えば、経粘膜投与のためには胆汁酸 塩およびフシジン酸誘導体などを含む。

さらに、透過を促進するために界面活性剤を使用し得る。経粘膜投与は、鼻腔噴 霧により、または、例えば、串刺の使用により投与され得る。経口投与のために は、このオリゴマーは、カプセル、錠剤、トニックのような従来の経口投与形態 に処方される。

局所投与のためには、本発明のオリゴマーは、当技術分野で一般的に知られてい るように、外用薬、軟膏、ゲルまたはクリームに処方される。

治療法での使用に加えて、本発明のオリゴマーは、診断用試薬として、オリゴマ ーに特異的に結合する標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の存在の有無を検出するため に使用し得る。そのような診断試験は、塩基相補性または二重鎖形成を利用した ハイブリダイゼーションによって行なわれ、続いて一般的手段によって検出され る。例えば、オリゴマーは、放射性、蛍光、または色素を用いたラベルを使用し てラベルされ得、固形支持体に結合したラベルの存在が検出される。あるいは、 二重鎖または二重鎖の存在は、これらの形を特異的に認識する抗体によって検出 され得る。このようなオリゴマーをプローブとして使用してアッセイを行なう手 段は、公知である。

以上の゛用法に加えて、遺伝子の発現を抑制するためのオリゴマーの能力は、組 替えシステムの中での発現のレベルを測定することにより、インビボのシステム 中で確認し得る。

本発明の特異的に結合するオリゴマーが、標的ＲＮＡまたはＤＮＡの活性を妨げ るまたは抑制する機構は、常に解明されておらず、そして本発明の一部ではない ことを記しておく。

もしもオリゴマーが、例えば、ｍＲＮＡを捜し当てれば、翻訳は抑制される。さ らに、標的を結合することにより、ｍＲＮＡメソセージの分解は高められ得、あ るいはさらなるＲＮＡのプロセッシングは抑制される。二重鎖の形成により、目 的ＤＮＡの転写または複製が抑制される；さらに、感染性ＲＮＡの逆転写または 感染性ＤＮＡの複製が妨げられる。また、全身性エリテマトーデスを抑制するた めに使用された、ｒａｍｐｌｉｇｅｎＪ　システムあるいは類似のシステムによ り例証された二重鎖ＲＮＡに誘起される生理的メカニズムに似た生理的メカニズ ムにより、免疫機構が調節されると考えられている。

本発明のオリゴマーは、標的のメカニズムにかかわらず、または効果のメカニズ ムにかかわらず、特異的なオリゴヌクレオチド配列を標的とするそれらの能力と により、特徴付けられる。以上の記載では、他の生物学的分子を標的とするオリ ゴマーの用法にも同様に適用される。

最後に、ＤＮＡは種々の成分により誘導体化され得る。その成分は、インターカ レーター、キレータ−１親油性基、標識または骨格のオリゴマーの特性を修飾す るが著しく破壊しないその他の置換基を含む。

０．１皿生立主底 置換されたホルムアセタール／ケタール結合を有する本発明のオリゴマー（ダイ マーおよびトリマーを含む）は、Ｎｉｃ。

１ａｏｕ、　Ｌ　Ｃ，、ら、　Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ　（１９８３）　ｌ ｊＱ：２４３０の三糖類の合成法を改変した方法を用いて結合される。結合に用 いられる糖の誘導体である単糖類は、結合が所望されない位置において保護され る；一方が、ＣＩＣｌ−ＣＸ２Ｓのようなチオアセタール中間体を形成するため の試薬で、塩基存在下で不活性の溶剤中で処理され、メチルチオアセタール誘導 体が遊離水酸基の位置に得られる。その後この活性化された糖は、結合される多 糖類と反応する。この多糖類は、結合の形成が意図される水酸基以外のすべての 位置で保護されている。この反応は、Ｎ−プロモフハク酸イミドおよび立体障害 の大きい弱い塩基の存在下で行なわれ、保護されたダイマーが得られる。適切に 脱保護されたダイマーは、その後この結合を繰り返すことで伸長され得る。ホル ムアセタール結合されたトリマーの形成のためのこの一般的なアプローチの使用 法を反応スキーム１に示す。

（以下余白） 反へ゛７．秒ｔＡ１− ｉ１城ん Ｊイ’＃−’４ｔｈ−ｐ、オリダで− Ｃろ搏嘉葎煉を千１２′マ〆 反ρスキーへ２ ＝ ’　ＳＡｃ 反にみ千−／Ａ３ 斥へ′　ス！−Ｌｑ４ 例として、デオキシリボースのチミジン誘導体を使用している。第１段階では、 ５°位をジメト牛シトリチル（ＤＭＴ）で保護されたチミジンが、メチルチオア セタールまたはその他のチオアセタールに変換される。スキーム中のＣｌＣＨ２ ＳＣＨ３試薬の代わりに、対応する臭化物、または一般式ＣＩＣＸ２ＳＲまたは ＢｒＣＸ２ＳＲの他のチオエーテルも使用し得る。第２段階の反応は、メチレン クロリド中で、Ｎ−ブロモコハク酸イミド（ＮＢＳ）および２．６−ジーｔ−ブ チルピリジン（２，６ＤＴＢＰ）の存在下で、このチオアセタールと、３°位で テキシルジメチルシリルで保護されたチミジンの５°の水酸基を反応させるため に行なわれる。立体障害の大きいピリジン、２．６−　ｔ−ブチルピリジンが第 ２段階で要求されることに注意すべきである。これは、立体障害の小さいジメチ ル体は活性化されたアセタールによってアルキル化されるためである。この反応 で、所望されるホルムアセタール／ケタール結合を有する保護されたダイマーが 生じる。酸中の脱保護により、５°位のトリチル基の保護が解かれたダイマーが 得られる。このダイマーは、付加的な第４段階において策２段階と同様に５°− ＤＭＴ−３’−メチルチオアセタールと反応し得、これにより保護されたトリマ ーが得られる。このトリマーは、付加的な第５段階において第３段階と同様に脱 保護され得る。

これらの段階は、第２段階と類似する反応において、５”保護され３°誘導され た試薬として任意の糖の誘導体を選択して、繰り返され得、所望される任意の長 さのオリゴマーが得られ反応スキーム２．３および４は、３−ＯＣＸ２Ｓ−５’ 形の結合を有するダイマーおよびトリマーの生成を示す。反応スキーム２および ３は、ダイマーの個々の成分の調製を示す。この例では、チミジン誘導体を使用 している。反応スキーム２は、５゜位にＳｌｌを有する３−保護されたチミジン の調製を記載している。

一連の反応に示されるように、５°ジメトキシトリチルチミジンは、テキシルジ メチルシリルクロリドを用いてシリル化される。生成される３−シリル化された 糖を、８０％酢酸中で加水分解し、その後、５−水酸基をピリジン中でＩ）−ト リルスルホニルクロリドを使用して活性化する：ｐ−トリルスルホニル基を、そ の後、Ｒｅ１ｓｔ、　Ｅ、、らＪ　Ａｍ　Ｃｈｅｗ　Ｓｏｃ　（１９６４）　２ ９：５５４に記載されているようにチオ酢酸の塩を用いて置換する。アセチルチ オエステルは、Ｒｅ１ｓｔの論文に記載されているように、保存され得、ジスル フィド形成を避けるために、使用直前に加水分解される。

反応スキーム３は、保護されたスルフヒドリルへの５°位の変換に続いて、所望 されるならば、３゛ＯＨを活性化することを記載している。示されるように、５ °がジメトキシトリチルで保護されたチミジンは、ＴＨＴ中で水素化ナトリウム を塩基として、ヨウ化ナトリウムを触媒として用いて、クロロメチルチオメタン でアルキル化される。３゛チオアセタールを得るために、クロロメチルチオメタ ンの他にも、例えば、クロロメチルチオベンゼンおよびクロロメチル−２−チオ ピリジン、または上記のいづれかに対応する臭化物等の他の試薬が使用され得る 。これらはむしろ優れ得るか、示されているメチルチオより優れた脱離基を有す るチオアセタール生成物を与え得る。

その後、保護しているジメトキシトリチル基を、例えば、８０％酢酸で除去し、 反応スキーム２に記載されているように活性化してチオエステルに変換−トシル クロリドにより活性化してその後チオ酢酸の塩で処理、する。

アセチルチオエステルは、それ自身が続いて反応スキーム２の生成物との縮合反 応において使用され得るが、ＳＨの保護のためのより良い方法が可能である。そ のような１つのスキームでは、アセチルチオ基が加水分解され、生成されるスル フヒドリルは、Ｈｉｓｋｅｙ、　Ｒ，Ｇ−ら、　Ｌ虹り用田（１９６６）　３１ ：１１８８のプロセスによって、トリチルスルフィドを生成するジメトキシトリ チルクロリドまたはトリメト牛シトリチルクロリドと反応する。その後の脱保護 は、穏やかな酸性条件で行なわれる。第２のアプローチでは、加水分解された遊 離ＳＨ基は、Ｆｏｎｔａｎａ、　Ａ、、　Ｊ　Ｃｈｅ＋＊　Ｓｏｃ　Ｃｈｅｗ　 Ｃｏｖ＋＋ｕｎ　（１９７５）　９７６の方法によって、ジニトロフェノールス ルホニルクロリドと反応し、トエタノールまたは水素化ホウ素ナトリウムのよう な還元剤で除去され得る。脱保護が行なわれるとき、保護のためのこれらの交換 可能なスキームは可視色を発する。

スキーム３から生じる保護されたチオアセタールモノマーは、その後、反応スキ ーム４に示されるように、反応スキーム２の３−保護された５°スルフヒドリル 生成物と反応する。これらの成分を、示されたような２．６−ジーし一ブチルビ リジ・ン等の立体障害の大きい塩基の過剰量の存在下で、ｎ−プロモフハク酸イ ミドの同量よりわずかに少ない量と混合する。先ずＮＢＳおよび２．６−ＤＴＢ Ｐを、ブロック化したチオアセタールに加え、この活性化された３゛チオアセタ ールチミジンを、その後５°ＳＨチミジンと反応させた。この添加の順番は、５ ’ＳＨ基と試薬との副反応を防ぐために要求される。生成したダイマーは、反応 スキーム４に示されるように、他のチオアセタール等個体との縮合反応を繰り返 すことによって、伸長し得る。

３°チオヌクレオシドは従来技術でも入手可能であり、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ、 Ｒ，、ら、ｕｃｌ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８５）　１５：５３０５に記載 されているように合成され得、また、３°チオチミジンは、上記のＣｏ５５ｔｉ ｃｋ、　Ｒ，、ら、　Ｔｅｔ　Ｌｅｔｔ　（１９８９）　３０：４６９３−４６ ９６に記載のようにオリゴヌクレオチドの合成のために使用されている。

３°チオヌクレオシドは、反応スキーム１の第１段階または反応スキーム３の第 １段階と類似した方法で、アセタールのジチオ類似体に変換し得、反応スキーム ｌまたは４に示される方法と類似した方法での、隣接するヌクレオシドの５°位 のＳＨまたはＯＨのいずれかによる核攻撃に適切な脱離基が与えられる。このよ うにして、ホルムアセタール／ケタールおよび式−〇ＣＸ２Ｓ−の結合の調製の ために示された方法と類似した方法において、式−５ＣＸ２０−および一５ｃｘ ２ｓ−の結合を有するダイマー、トリマーおよびオリゴマーが入手し得る。

所望されるならば、生成されるダイマー、トリマーまたはオリゴマーは、ＴＩＩ ＩＦのような不活性溶剤中で、テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ ）で、脱シリル化され得、制御された多孔グラス（ＣＰＧ）のような固体の担体 に結合するために都合のよいリンカ−としてメタンニル化される。結合された改 変オリゴマーは、例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ、　Ｂ、、ら、　Ｎｕｃ　ｅｉｃ　 Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８６）　１４：５３９９に記載のようなＨ−ホスホ ネート化学の手法を用いる、標準的なオリゴヌクレオチド合成のための出発物質 として使用され得る。この合成は、ジクロロアセチル酸をメチレンクロリド中で 使用する５°水酸基の脱保護、およびアセチルクロリド／ピリミジン／アセトニ トリルの存在下で５°ＤＭＴ−保護された塩基の３゛ホスホネートでの処理、お よびこの脱保護および結合のプロトコールの、所望される任意の回数の繰り返し を含む。

あるいは、保護を解かれた３°０■は、オリゴヌクレオチドを伸長するために、 標準的なオリゴヌクレオチド合成（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、　Ｍ、、ら、　Ｊ　Ａ ｍ　Ｃｈｅｗ　Ｓｏｃ　（１９８１）　１０３：３１８５）に類似するエステル 結合を通して固体の担体と結合され得る。

さらなるホルムアセタール／ケタールタイプの結合が、反応スキーム１−４で説 明したようにして得られるダイマー、トリマー、ペンタマー等のリン酸化によっ て、およびオリゴマー鎖伸長において付加物としてこれらを使用することによっ て、オリゴマーに挿入され得る。最終生成物は、ＴＨＦまたは他の不活性溶剤を 含む塩基性水性溶媒におけるヨウ素処理に続く水酸化アンモニウム処理のような 、標準的工程によって、固体の担体から除去される。加えられるヌクレオチドに 結合しているヌクレオチド塩基の脱保護もまた、標準的工程によって行なわれる 。

ホルムアセクール／ケタールタイプの結合は、連続合成において、従来のモノマ ーを、ホルムアセタール／ケタールタイプの結合を有する保護されたダイマーで 置換することにより、オリゴヌクレオチド中の任意の位置に含まれ得る。このダ イマーは、例えば、上記の反応スキーム４または反応スキーム１に説明されてい る第１から第３段階によって、合成されたものである。ただしスキームｌの第３ 段階における加水分解／脱保護試薬は、ＴＢＡＦに続くリン酸化（Ｆｒｏｅｂｌ ｅｒ、　Ｂ、、ら、上記）と置換され、または反応スキーム４のダイマーはこの ように脱保護され、保護基が除去された３°位はリン酸化される。このホスフェ ートは、トリエチルアミン塩として存在すると都合がよい。このダイマーは、そ の後合成工程において所望される任意の位置に組み込まれる。

（以下余白） このようにして、標準的技術を用いるオリゴマーの合成は、弐Δ のホルムアセタールダイマーのシントンを使用して行ない得る。これらの一連の シントンの使用により、ホルムアセタールおよびホスホジエステル結合の１つお きの置換が生じる。

ホスホジエステル結合を含む長い領域は、単体ヌクレオチドで鎖を伸長すること により、容易に取り入れられる。

ホスホロアミデートまたはホスホネート化学のようないかなるＤＮＡ合成化学の 手法も、上記に説明した方法に類似の方法で単体またはダイマーを結合するため に、使用し得る。

以下の実施例は本発明を例示するものであって、限定するものではない。

（以下余白） 実ｍ ５°ＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＴＴ　０ＣＩＩつＯＴ　ＯＣＲＯＴ−３°　の　１ Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、Ｍ、Ｄ、、Ｔｅｔ　Ｌｅｔｔ　（１９９０）　３１：２３ ８５も参照。

バートＡ：　オリゴマーの−１ ５°ジメトキシトリチル３゛−メチルチオメチルチミジンの−ｆｆ程」Ｄ−ニ ジメトキシトリチルチミジン（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｓ）　（０，９４ｇ ）をピリジンから２回、次にメチレンクロリド／トルエンから１回ロータリーエ バポレートした。生成した泡状物を７５＋＋＋１の乾燥ＣＢ２ＣＩ２および１０ ｍ１の乾燥Ｔｌ１Ｆに溶解した。　１０ａ＋ｇのＮａｌおよび、２１ｇのＮａＨ （６０％の油中の分散体）を、アルゴン雰囲気下で、２０℃で撹拌しながら加え た。１５分後、このＨ２の発泡は止まり、その反応物をもう１時間撹拌した。ク ロロメチルチオメタン（１５８μｌ）を加え、アルゴン雰囲気下での撹拌を、２ ０℃で１６時間続けた。この反応物をＩＭのＮａ２ＳＯ４でクエンチし、抽出し 、その有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥した。次に、この溶液を泡状物になるまでロ ータリ−エバポレートし、５％のイソプロピルアルコール／ＣＢ２Ｃ１２を溶離 液として用いたシリカゲルカラムで精製した。画分を純粋な泡状物に濃縮した（ 収率０．５６ｇ）。

’ＨＮＭＲスペクトルは、目的の構造を支持した。

３°テキシルジメチルシリルチミジンの−ニジメトキシトリチルチミジン（Ｐｅ ｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｓ）　（１ｇ）、２０ｍ１の乾燥ＤＭＦ、１９３ｍｇの イミダゾール、および０．４５ｍ１のテキシルジメチルンリルクロリドを、アル ゴン雰囲気下で混合し、２０℃で１６時間撹拌した。次に、この反応物を２ｍｌ のＭｅＯＨでクエンチし、泡状物になるまでロータリーエバポレートし、ＥｔＯ Ｈ（２０ｍｌ）中に溶解し、０．　Ｓｍｌのジクロロ酢酸で２０″Ｃで１６時間 処理した。この反応物をＩＭのＮａＨＣＯ３でクエンチしｓ　ＣＦ［２Ｃ１２で 抽出した。その有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥した。この溶液を泡状物になるまで ロータリーエバポレートし、Ｓｍｌのジエチルエーテル中に溶解し、５０ｍ１の へ牛サン中に沈澱させた。このエーテルをロータリーエバポレートして除くと、 この白色沈澱物が重くなり、濾過して、乾燥すると、０．５ｇの純粋な白色泡状 物を回収した。この’ＨＮＭＲスペクトルは、目的の構造を支持した。

５°ＯＨ３°テキシルジメチルシリルチミジンホルムアセ　−ルチミジンの−２ および３　： ５゛ジメトキシトリチル３°メチルチオメチルチミジン（７８Ｂ）および３′テ キシルジメチルシリルチミジン（６Ｇ＋ｓｇ）をトルエンからロータリーエバポ レートし、２鳳ｌの乾燥トルエン中に溶解した。５０■ｇの活性化した４Ａモレ キユラーシーブ、およびジ−ｔ−ブチルピリジン（０，１４４ｍ１）を加え、こ の反応物をアルゴン雰囲気下で１６時間撹拌した。次に、Ｎ−ブロモコハク酸イ ミド（１３ｍｇ）を加え、この反応物を２０℃で１時間撹拌した。この反応物を ＩＭのＮａＨＣＯ３でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。その有機層をＮａ ２　Ｓｏ　４で乾燥した。この溶液を泡状物になるまでロータリーエバポレート し、４１の２０％ｌｈｏ／ＨＯＡｃで、２０℃で２時間処理した。この反応物を 、ＩＭのＮａ２ＳＯ４中でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、Ｎａ２５Ｏａで 乾燥し、泡状物になるまでロータリーエバポレートした。この泡状物を、３％か ら１０％までのｌ５ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を溶離液として用いたシリカゲルクロマ トグラフィーにより精製し、溶媒をエバボレートして６０ｍｇ５の純粋な生成物 を得た。この’ＨＮＭＲスペクトルは、目的の構造を支持した。

５°ジメトキシトリチル３゛ＯＨチミジンホルムアセ　−ルチミジンホルムアセ 　−ルチミジンの　３　；５°ＯＨ３°テキシルジメチルシリルチミジンホルム アセタールチミジン（５５ｖｇ）をジメトキシトリチル３′メチルチオメチルチ ミジン（７ｇ＋ｇ）と混合し、トルエンからロータリーエバポレートした。この 生成した泡状物を２ｍｌのトルエン／　ＣＨ２Ｃｌ２　（１／１）中に溶解し、 ５ｈｇの活性化した４Ａそレキュラーシーブ、およびジ−ｔ−ブチルピリジン（ ０，１４４＋ｓｌ）を加え、この反応物をアルゴン雰囲気下で１６時間撹拌した 。次に、Ｎ−ブロモコハク酸イミド（２１ｍｇ）を加え、その反応物を２０℃で １時間撹拌した。この反応物をＩＭのＮａＨＣＯｌでクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２ で抽出した。その有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥した。この溶液を泡状物になるま でロータリーエバポレートし、１＋ｍｌのＴＨＦ中のテトラブチルアンモニウム フルオリドで３時間処理し、通常の方法で、抽出し、乾燥し、エバボレートした 。この生成した泡状物を、１ｏｚのｌ５ＯＨ／Ｃ）１２ｃ１２を溶離液として用 いた、分取用シリカゲル薄層クロマトグラフィーにより精製した。この’ＨＮＭ Ｒスペクトルは、所望の構造を支持した（収量：　２５ｍｇ）。少量（５ｍｇ） を、通常の方法で、５°末端で脱保護した。

この生成した５’　０８３’　Ｏｆｆチミジンホルムアセタールチミジンホルム アセタールチミジンを用いて、さらに特性計画を行った。この物質のｄ　ＢＤＭ ＳＯ中での’ＨＮＭＲは、目的の構造を支持した。この一部ヲヘルシリル化し、 ＦＡＢマススペクトル（Ｆａｓｔ　Ａｔｏｍ　Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ　Ｍａｓ ｓ　Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を記録した。これにより、所望の分子量を確認した。さ らに、このジヒドロキシ物質を前記の化学的および酵素的安定性の研究において 用いた。

５゛ジメトキシトリチル３°スクシニレートチミジンホルムアセールチミジンホ ルムアセ　−ルチミジンの　：５゛ジメトキシトリチル３°ＯＨチミジンホルム アセタールチミジンホルムアセタールチミジン（１６ｍｇ）を、９１℃ｇの無水 コハク酸および微量のジメチルアミノピリジンでピリジン中、２０℃で１６時間 処理した。次に、この反応物をロータリーエバポレートし、Ｈ２Ｏに対して３０ ％のＢｕＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。この有機層を乾燥し、ロータリーエバ ポレートし、１０％の３２０／ＣＹｉ３ＣＮを溶離液として用いたシリカゲルカ ラムで精製した。ロータリーエバポレートにより１５ｍｇの生成物を得た。

５゛−τＣτＣＣＣＴＣＴＣＴＴ　ＯＣＲＯＴ　ＯＣＩ’ｌ　ＯＴ−３°の　： 前の段落の３°スクシニル化５−ＤＭＴチミジンホルムアセタールチミジンホル ムアセクールチミジンを、次に固形担体に結合させ、脱保護した。標準方法を用 いて、そのオリゴマーを伸張させ、タイトル化合物を得た。

バートＢ：　に・　る 上記の段落（Ａ）の精製された生成物を２０％の水／ギ酸で、８０℃で１時間処 理し、完全な加水分解物を得た。しかし、ＩＭの［ＩＣ１を用いて２０℃で３時 間、あるいは２０％の水／酢酸を用いて４５℃で３時間のような穏やかな酸処理 を行った場合、加水分解物は観察されなかった。

このタイトル化合物はまた、ホスホジエステル結合の加水分解だめの標準的な条 件のもとで、ヘビ毒ホスホジェステラーゼに対して安定であった。

バート　：　・ＲＮＡへのバイブ【　イゼーションこのタイトル化合物に相補的 なＲＮＡ配列をＴ７転写（Ｍｉｌｌｉｇａｎ、　Ｔ、　Ｆ、　、ら、Ｎｕｃｌｅ ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８７）　１５：　８７ｇ３＞を用いて調製し た。このＲＮＡを用いて、このタイトル化合物がその相補体へハイブリダイゼー シヨンする能力を、そのアセタール結合がホスホジエステル、ホスホロアミデー トで置換されているか、あるいはその３°末端チミジルヌクレオチドが欠失して いる、類似の配列と比較して試験した。このタイトル化合物およびこれらのフン トロールを用いて形成した複合体の融解温度を、１００＋＋ＭのＮａＣ１，５０ ｍＭのＴｒｉｓ、　ｐＨ７，５を用いて、Ｓｕｍｍｅｒｓ、　Ｍ、　Ｆ、　、ら 、Ｎｕｅｌｅｊｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８６）　１４：　７４２１に記 載されるような標準的な条件のもとで測定した。この結果を表１に示す。ここで 、「１２量体Ｊ　（１２ｍａｒ）は、これらの試料の全てに共通のＴＣＴＣＣＣ ＴＣＴＣＴＴヌクレオチド配列を表す。３番目のオリゴマーにおいて、「Ｗ」は 、このアミデートにおける置換基−ＣＨ２Ｃｌ２０Ｍｅを表す。

（以下余白） 表」− プ ＩＺｍｅｒ−Ｔ（ＯＣＨ２０）Ｔ（ＯＣＲ２０）Ｔ　５９．０１２ｍｅｒ−ＴＴ Ｔ　５９．５ １２ｍｅｒ−Ｔ（ＰＯＮＨ）Ｔ　（ＰＯＮＨＷ）　７　５８．５１２ｍａｒ　５ ６．５ 表１に示すように、ホルムアセタール結合により結合したこれら３つのチミジン は、１２量体のみに比べて、この１２量体にざらにハイブリダイゼーション能力 を付与する。この付加されたハイブリダイゼーシヨンは、従来のホスホジエステ ル結合による伸長により付与されたものに匹敵する。

バートＤ：　二　ＤＮＡへの　４ 以下（７）実施Ｎ２のバートｃに詳細に記載されるフットプリント法を用いると 、本実施例のホルムアセタールを含有するオリゴヌクレオチドは、二重鎖のＤＩ ＩＩＡと結合する能力を示す。

五ｌ旦星５’ＴＣＴＣ’匹°゛匹”ＴＣ”ｐ≦し］鼠歪バートＡ：オリゴマーの − Ｃｏは５−メチルシトシンを表し、ｃｏとＴとの開のドツトはこの一連の４つの オリゴマー間の変えられた結合を表す、示されるような一連の４つのオリゴマー を合成した。「ホスポジェステル」コントロールオリゴマーでは、このドツトは 、従来のホスホジエステル結合を表す。「メチルホスボネート」オリゴマーでは 、このドツトは、メチルホスホネート結合を表す。「メト牛ジエチルアミデート 」オリゴマーでは、このドツトは、メト牛ジエチルアミデート結合を表す。本発 明の「ホルムアセタール」オリゴマーでは、このドツトは、本実施例に記載のよ うな、および上記のようなホルムアセタール結合を示す。

ホスホジエステルオリゴマーを、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ、　Ｂ、Ｃ，、ら、ＮｕｃＩ 　ｉｃ　ａｉｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８６）口：　５３９９に記載の従来の方法を 用いて合成した。残りの３つのオリゴマーを、適当なダイマーのシントンを用い ること以外はこの方法と同様にして合成した。

メチルホスホネートおよびメトキシエチルアミデートダイマーのシントンを、５ °−ＤＭＴ−Ｎ−ベンゾイル−５−メチルデオキシシチジンおよび３−ｔ−ブチ ルジメチルシリルチミジンを用いて、各々、Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｐ、Ｓ、、ら、Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　（１９８６）　２５：　５０９２、およびＦｒｏｅｈｌ ｅｒ、　Ｂ、Ｃ−、Ｔｅｔ　Ｌｅｔｔ　（１９８６）　２７：　５５７５に記載 されるように構築した。ホルムアセタールダイマーのシントンを、上記のように 、および、上記のＭａｔｅｕｃｃｉ、　Ｍ、Ｃ，、ら、Ｔｅｔ　Ｌｅｔｔ　（１ ９９０）　３１：２３８５．に報告されるように調製した。これらの合成により 生成したオリゴを、濃アンモニアを用いて、１６時間２０℃で脱ブロツク化し、 従来の方法を用いてゲルで精製した。

ハートＢ：ＲＮＡ　へのバイブ１　イゼーシ：＋７テスト化合物として用いるた めの相補的ＲＮＡを、Ｍｉｌｌｉｇａｎ。

Ｊ、　Ｆ、　、らＮｕｃｌｅｊｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９ｇ？）　１５： ８７８３．に記載されるように適当なプライマーテンプレート上でＴ７ポリメラ ーゼ反応により合成した。適当な相補的ＤＮＡオリゴマーも構築した。

このハイブリダイゼーションを、細胞内の塩組成および濃度−一すなわち、１４ ０ｍＭのＭＣＩ、１ｈＭのＮａＣ１，５ｍＭのＮａＨ２ＰＯａ。

５ｍＭのＭｇＣｌ２．　ｐＨ７に類似するように設計した、塩を含有する緩衝液 中での熱変性比較を用いてテストした。紫外線の吸収を、２０℃から８０℃まで の温度範囲で測定したところ、全てのオリゴマーに一相性遷移が見られた。Ｔ、 値を、曲線の勾配が最大になる温度を見い出すことにより特定した。

これらの結果を表２に示す。

表」ユ Ｔ。

１エヱヱニ　可Ｍ　ｕｍ値 ホスホジエステル　６０．０”Ｃ４９，５℃メチルホスホネー）　５０．５ メト牛ジエチルアミデート　４フ、　５　３８．５ホルムアセタール　５９．０ 　３９．０この表に示すように、ホスホジエステルと比較して、ホルムアセター ルオリゴマーのＴ、Ｉは、−末鎖ＲＮＡでは、はぼ等シい。

一方、他の類似体、メチルホスホネートおよびメトキシエチルアミデートオリゴ マーの温度のＴ、値は、かなり低い。このように、ホルムアセタール結合により 付与される利点−一例えば、細胞膜を横切る能力の向上およびヌクレアーゼ耐性 の増強にもかかわらず、−末鎖ＲＮＡへのハイブリダイゼーション力の低下は見 られなかった。

パートＣ：　二　ＤＮＡへの　４ Ｃｏｏｎｅｙ、　Ｍ、、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８ｇ）　２４１＋４５６に 記載の「フットプリント」アッセイを用いた。このアッセイは、二重鎖に結合し たオリゴマーの、その二重鎖をＤＮＡ５ｅ　ｌによる消化から保護する能力に基 づく。０．１〜１０μＭの様々な濃度のテストオリゴマーを、１ｎＭの濃度で標 的配列を有する、ｐ　３２で放射標識された制限断片を用いて、１０ｍＭ（７） ＮａＣ１，１４０ｍＭノＫＣ１，１＋ａＭ（７）Ｍｇｃ１２．１ｍＭのスペルミ ン、および２０＋＊ＭのＭＯＰＳ緩衝液中で、ｐＨ７で２時間インキュベートし た。この実施例のパートＡにおいて調製された一群のオリゴマーの標的配列は、 以下のようであった。

ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡ　□ ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＴ　− ＤＮＡｓｅ　ｌを加えて、限られた消化を行い、次に、それらの試料を変性させ 、ＤＮＡ断片を大きさにより分離する、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ た。

このフットプリンドアｌセイの原則の概要および理想化された結果を図１に示す 。図１に示すように、標識された二重鎖は、ＤＮＡ５ｅで処理されると、各々の ジエステル結合での開裂に対応するオリゴマーの長さを生じ、理想化されたゲル の左に示されるバンドの−続きが得られる。一方、この二重鎖を、オリゴマーに 結合することにより保護すると、そのオリゴマーに結合することにより保護され た部位におけるジエステル結合での開裂により示される長さの−続きは、ゲルか ら消失する。この「フットプリント」により、保護の部位がわかる。

この結果は、フットプリントの部位におけるバンドが完全に消失しているか、ま たはわずかに見られるのみのいずれかを観察することにより、半定量的に評価さ れる。

ホルムアセタールオリゴマーおよびホスホジエステルオリゴマーは、そのオリゴ マーの０．１μＭの濃度で、標的配列の部分的な保護を示し、１μＭの濃度で９ ０％を超える保護を示した。

一方、メトキシエチルホスホロアミデートおよびメチルホスホネートは、１μＭ で部分的な保護のみを示し、１０μＭで９０％を超える保護を示した。このよう に、これらのオリゴマーは、ホルムアセタールオリゴマーよりも明らかに低い二 １！１１への親和性を有すようであった。

＊Ｐ□　二＊、ｔ１ 国際調査報告

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．本願で定義されるような、改変されたオリゴマーまたはその誘導体であって 、生体成分を結合するのに有用なヌクレオチド配列を含有し、該改変が、個々の ヌクレオチド残基間の１つ以上の結合を、式−ＹＣＸ２Ｙ−の結合に置換するこ とを包含する、 ここで、Ｙは各々独立してＯまたはＳであり、Ｘは各々独立して選択され、安定 化置換基であり、残りの結合は、ホスホジエステル結合またはそれに代わる従来 の結合である、 改変されたオリゴマーまたはその誘導体。
2. ２．本願で定義されるような、以下の式のオリゴマー：▲数式、化学式、表等が あります▼（１）ここで、Ｂは各々独立してプリン残基もしくはピリミジン残基 、または本願で定義されるような類似の残基であり、Ｚは各々独立して、 本願で定義されるような、ホスホジエステルの−Ｐ（Ｏ）Ｏ−−またはそれに代 わる従来の結合、または、−ＣＸ２−であり、 ここで、Ｘは各々独立して安定化基であり、ｎは１〜２０Ｏであり、ｍは各々Ｏ または１であり、少なくとも１つのＺはＣＸ２であり、 Ｙは各々独立してＯまたはＳである、 またはその誘導体であって、生体成分を結合するのに有用なヌクレオチド配列を 含有する、オリゴマーまたはその誘導体。
3. ３．単−の−ＹＣＸ２Ｙ−結合に含有される両方のＸが同−であり、および／ま たは少なくとも２つの結合が該−ＹＣＸ２Ｙ−結合である、請求項１または２に 記載の改変されたオリゴマー。
4. ４．前記−ＹＣＸ２Ｙ−結合およびホスホジエステル型結合が交互にある、少な くとも４つのヌクレオチドからなる領域を少なくとも１つ含有する、請求項３に 記載の改変されたオリゴマー。
5. ５．請求項１〜４に記載の改変されたオリゴマーであって、ここで、Ｘは各々、 Ｈ；カルボキシル、またはそれらのエステルもしくはアミド；−ＳＯＲまたは− ＳＯ２Ｒから成る群から選択され、ここで、Ｒは、アルキル（１−６Ｃ）；−Ｃ Ｎ；および−ＣＦ３であり、または、Ｘは−（ＣＨ２）ｎＷであって、ここで、 ｎは１〜３の整数であり、Ｗは、ハロゲン；カルボキシル、またはそれらのエス テルもしくはアミド；ホスフェートもしくはホスホネート、またはそれらのエス テル；−ＳＯＲまたは−ＳＯ２Ｒから成る群から選択され、ここで、Ｒは、アル キル（１−６Ｃ）；−ＣＮ；−ＮＯ２；−ＣＦ３；−ＯＨ、−ＯＲ，および第一 級アミン、第二級アミンまたは第三被アミンであり、あるいは、両方のＸが複素 環からともに選ばれる、改変されたオリゴマー。
6. ６．Ｘが各々Ｈである、請求項１〜４に記載の改変されたオリゴマー。
7. ７．少なくとも１つの−ＹＣＸ２Ｙ−が以下の式である：▲数式、化学式、表等 があります▼；▲数式、化学式、表等があります▼；▲数式、化学式、表等があ ります▼；▲数式、化学式、表等があります▼；▲数式、化学式、表等がありま す▼；ｏｒ▲数式、化学式、表等があります▼請求項５に記載のオリゴマー。
8. ８．ダイマーまたはトリマーである、請求項１〜７に記載のオリゴマー。
9. ９．前記−Ｐ（Ｏ）Ｏ−の代わりとなる従来の結合が、Ｐ（Ｏ）Ｓ、Ｐ（Ｏ）Ｎ Ｒ２、Ｐ（Ｏ）Ｒ，Ｐ（Ｏ）ＯＲ′，ＣＯ，またはＣＮＲ２であって、ここで、 ＲはＨまたはアルキル（１−６Ｃ）であり、Ｒ′はアルキル（１−６Ｃ）である 、請求項１〜８に記載のオリゴマー。
10. １０．前記誘導体が標識を有する複合体、インターカレーター、または薬剤を含 有する、請求項１〜９に記載のオリゴマー。
11. １１．式１の化合物を処理することを包含する、式−ＹＣＸ２Ｙ−の結合を少な くとも１つ含有する改変されたオリゴヌクレオチドを合成する方法であって、 ここで、ｎ＝１〜３、および全てのＺがＣＸ２であり、該式１の化合物は、他の ヌクレオチドヘのホスホジエステル結合を形成するために、標準試薬で固形担体 に付着されている、 方法。
12. １２．ヌクレオチドまたは他のＤＮＡに結合する生体成分が存在することにより 媒介される疾病を治療する方法であって、このような治療を必要とする患者に、 特異的に該成分を結合し得る、請求項１〜１０に記載の改変されたオリゴマーを 、該成分を不活性化するのに有効な量だけ投与することを包含する、治療方法。
13. １３．以下の式で示され： ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、ＹはＯまたはＳであり、 Ｂは、プリン残基もしくはピリミジン残基、または本願で定義されるような類似 の残基であり、Ｘ′は、両方のＸ′がＨであり得ないという条件で、各々独立し て安定化基であり、 Ｒは、さらに複素環を含有し得る、脂肪族ヒドロカルビルラジカルまたは芳香族 ヒドロカルビルラジカルであり、Ｐｒは、Ｈまたは保護基である、 化合物。