PL184378B1 - Nukleozydy o zmodyfikowanych cukrach i ich użycie do syntezy oligonukleotydów - Google Patents

Abstract

1. Nukleozydy o zmodyfikowanych cukrach, o strukturze w którym B oznacza tymidyne, i X oznacza O; R 1 ' oznacza CN, CHO, CONH2, N(CH3)3, CH2-alkil, lub atom wodoru; R2 oznacza atom wodoru; R3 oznacza grupe OH, = O gdy R3' nie istnieje, CH=CH2, blokujaca grupe hydroksylowa, epoksyd etyle- nowy, lub O-P(O-(CH2)CN) (N(iPr)2) ; R3' oznacza atom wodoru, CH3 lub CH2Y, gdzie Y oznacza CN, OH, hydroksylowa grupe blokujaca, NHCOCF3, NH2 lub N 3; R4' oznacza CH2Z, gdzie Z oznacza OCH3, NH 2, N 3, NHCOCF3, OH, blokujaca grupe hydroksylowa, lub atom wodoru; R5 oznaczagru pe OH, hydroksylow agrupe blokujaca, nie istnieje gdy R5 ' oznacza C H =C H 2, lub R5 i R5' razem oznaczaja epoksyd etylenowy; T PL PL PL PL PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy obszaru analogów polinukleotydowych zawierających zmodyfikowane cukry.

Tło wynalazku

Lecznicze zastosowanie oligonukleotydów jest obszarem o dużym znaczeniu i opisano je, na przykład, w (1) Zamecnik, P.C. i Stephenson, M.L., Proc. Natl. Acad.-Sci. USA 1978,75,280, 285.; (2) Uhlmann, E. i Peyman, A., Chemical Reviews, 1990,90,543 - 584; (3) Goodchild, J.

Bioconjugate chemistry, 1990,1,165 -187; i (4) Crooke, S. T. i Lebieu, B., „Antisense Research and Applications”, CRC Press (1993). Specyficzne powiązanie antysensownych polinukleotydów z interesującymi obiektami DNA lub RNA może unieczynnić funkcje związane z DNA lub RNA, takie jak odtwarzanie, transkrypcja lub translacja, zapewniając tym samym mechanizm zwalczania chorób takich jak rak i infekcje wirusowe. A więc powiązanie antysensownego oligonukleotydu z obiektem można użyć do zmiany wyrażenia genu w różno rodnych okolicznościach, np. w zakłócaniu cykli życiowych wirusa lub wzrostu komórek rakowych (Stein, C.A., Cheng, Y.C., Sciece, 1993,261,1004 -1012). Dodatkowo, niektóre oligonukleotydy są też silnie powiązane z obiektami białkowymi, przez co działająjako inhibitory enzymu. Block i in. opisuje oligonukleotydy, które hamują powstawanie u ludzi skrzepliny włóknika, katalizowane trombiną„in vńro” (Block, L.C., Griffin, L.C., Latham, J.A., Vermaas, E.H., Toole, J.J., Nature, 1992, 355, 564 - 566). Ecker i in. opisuje szereg oligonukleotydów, które przeciwdziałają wirusowi opryszczki zwykłej u ludzi, przy dawce 1,0 pmol. Polinukleotydy posiadające właściwości przeciwdziałania enzymom można łatwo odnaleźć stosując technologię kombinatoryjną(Ecker, D.J., Vickers, T.A., Hanecak, R., Driver, V., Anderson, K., Nucleic Acids Res. 1933,21, 1853-1856).

Znane są doniesienia, że oligonukleotyd zawierający 5'-C-metylorozgałęziony nukleozyd wykazuje wzmożoną oporność wobec nukleazy (Saka, A.K. i in., poster na 206th ACS Meeting, Chicago, 1993). Wiadomo też, że oligonukleotyd zawierający 2'-0-metylonukleozydy wykazuje wzmożoną trwałość wobec nukleaz i zwiększone powinowactwo powiązania z RNA (a. Inoue, H. Hayase, Y. Imura, A., Iwai, S., Miura, K., Ohtsuka, E., Nucleic Acids Res. 1987,15,6131; b. Shiba-hara. S., Mulai, S., Morisawa, H. Nakashima, H., Cobayashi, S., Yamamoto, N., Nucleic Acids Res. 1989,17,239). Wiadomo, że oligonukleotyd zawierający 1'-podstawiony nukleozyd wykazuje pewną oporność wobec nukleazy (Ono, A., Dan A., Matsuda, A., Bioconjugate Chemistry, 1993,4,499- 508).

Oprócz wykazywania specyficznego powinowactwa powiązania z uzupełniającym obiektem sekwencji polinukleotydu, oligonukleotydy antysensowne spełniają korzystnie wymagania lecznicze, np. siłę działania, biodostępność, niską toksyczność i niski koszt. Z uwagi na fakt, że oligonukleotydy, posiadające naturalny szkielet fosfodiestrowy, są niestałe wobec nukleaz i nie łatwo wnikają w błonę komórkową, badacze próbowali dokonać modyfikacji szkieletu polinukleotydu, zwiększającej oporność wobec nukleazy i wychwyt komórkowy. Głową wadą analogów oligonukleotydów w zastosowaniach antysensownych jest fakt, że zmodyfikowane wiązania międzynukleotydowe eliminują aktywację RNazy H antysensownych oligonukleotydów, która degraduje łańcuch RNA, z którym wiąże się analog oligonukleotydu. A więc korzystne jest stworzenie analogów polinukleotydu o wzmożonej oporności wobec nukleazy i wzmożonym wychwycie komórkowym przy utrzymaniu właściwości aktywacji RNazy H.

Streszczenie wynalazku

Wynalazek dotyczy nowych nukleozydów o zmodyfikowanych cukrach i odpowiadających oligonukleotydów o zmodyfikowanych cukrach, o właściwościach lepszych niż w przypadku naturalnych oligonukleotydów RNA i DNA przy zastosowaniu antysensownym, diagnostycznym lub innym.

184 378

Związki według wynalazku obejmują różne nukleozydy zmodyfikowane przez wprowadzenie podstawników w pozycjach C1', C3', C4' lub C5' cukrowego fragmentu nukleozydu.

Innym przedmiotem wynalazku jest stworzenie oligonukleotydów zawierających jeden lub więcej nukleozydów o zmodyfikowanych cukrach, według wynalazku.

Innym przedmiotem wynalazku jest stworzenie sprzężonych oligonukleotydów zawierających jeden lub więcej nukleozydów o zmodyfikowanych cukrach, według wynalazku.

Krótki Opis Rysunków

Rysunek 1 ukazuje realizacje oligonukleotydów, w których podstawniki nukleozydowe są podstawione fragmentem o ładunku dodatnim.

Rysunek 2 ukazuje schemat 1 reakcji syntezy 3'-C-rozgałęzionej tymidyny.

Rysunek 3 ukazuje schemat 2 reakcji syntezy 3'-C-rozgałęzionej tymidyny.

Rysunek 4 ukazuje schemat 3 reakcji syntezy 4'-C-rozgałęzionęj tymidyny.

Rysunek 5 ukazuje dodatkowe aspekty schematu 3 reakcji syntezy 4'-C-rozgałęzionej tymidyny.

Rysunek 6 ukazuje schemat 4 reakcji syntezy 4'-C-rozgałęzionej tymidyny.

Rysunek 7 ukazuje schemat 5 reakcji syntezy 5'-C-rozgałęzionej tymidyny.

Rysunek 8 ukazuje schemat 6 reakcji syntezy 5'-C-rozgałęzionej tymidyny.

Rysunek 9 ukazuje dodatkowe aspekty schematu 6 reakcji syntezy 5'-C-rozgaęzionej tymidyny.

Rysunek 10 ukazuje schemat 7 reakcji syntezy 5'-C-rozgałęzionej tymidyny.

Rysunek 11 ukazuje schemat 8 reakcji syntezy 5'-C-rozgałęzionej tymidyny.

Rysunek 12 stanowi tablicę ukazującą stereochemiczne przyporządkowania związku 44 i innych.

Rysunek 13 ukazuje schemat 9 reakcji syntezy 1'-C-rozgałęzionej tymidyny.

Rysunek 14 ukazuje schemat 10 reakcji syntezy 1'-C-rozgałęzionej tymidyny.

Skróty i definicje

DMTr = 4,4'-dimetoksytrityl

CEPA = 2-cyjarioetylo-(N,N'-diizopropylo)fbsforamido

TBDMS = t-butylodimetylosilil

Ac = acetyl

TBDMSM = t-butylodimetylosiloksymetylo

N₃ = azydo

CF3CO = trifhioroacetyl

Tf = triflubrometanbsulfonyl

THF = tetrahydropiranyl

OTs = tosyl

Określenie „nukleozyl” użyte w tym opisie dotyczy związku zawierającego zasadę purynową lub pirymidynową (lub ich pochodne), połączoną kowalencyjnie z 5-ciowęglowym cyklicznym cukrem (furanoza), np. ryboza, 2'-dezoksyryboza i 2', 3'-didezoksyryboza. Określenie „nukleozyd” jest użyte w szerszym sensie, obejmując nukleozydy o zmodyfikowanych cukrach, według wynalazku.

Określenie „polinukleotyd” użyte w tym opisie dotyczy polimerów obejmujących dwa lub więcej fragmentów nukleozydowych, przy czym każdy fragment nukleozydowy łączy się z jednym (końcowym) lub dwoma (wewnętrznymi) innymi fragmentami nukleozydowymi poprzez wiązania intemukleozydowe, takie jak wiązanie fosfodiestrowe, peptydowe, fosfonianowe, fosforotionianowe i podobne. RNA i DNA są przykładami polinukletydów. Określenie „polinukleotyd” użyte w opisie, o ile nie zaznaczono inaczej, ma szerszy sens obejmując polinukleotydy o zmodyfikowanych cukrach, według wynalazku.

Określenie „oligonukleotyd”, użyte w tym opisie, dotyczy stosunkowo małych polinukleotydów, np. polinukleotydów o długości pomiędzy 2 i około 50 podstawowych par; jednakże oligonukleotyd może być znacznie dłuższy.

184 378

Określenie „hydroksylowa grupa blokująca”, użyte w tym opisie, jest łatwo zrozumiałe dla osób przeciętnie obeznanych z chemią organiczną Przykłady hydroksylowych grup blokujących i innych grup blokujących można znaleźć (obok innych źródeł) w pracy Greene and Wuts, „Protective Groups in OrganicSynthesis”, John Wiley and Sons, NY, NY (1991).

Określenia „zasada” i „zasada nukleozydowa”, użyte w tym opisie, dotycząheterocyklicznych zasad nukleotydowych spotykanych w występujących naturalnie kwasach nukleinowych, takichjak adenina, cytozyna, hipoksantyna, uracyl, tymina, guanina i ich analogi, włącznie z występującymi nie naturalnie zasadami, zdolnymi do tworzenia powiązań w pary zasadowe z występującymi naturalnie zasadami nukleotydowymi. Takie nie naturalnie występujące zasady heterocykliczne obejmują, ale bez ograniczenia, analogi aza- i dezazapirymidyny, analogi azai dezazapuryny jak również inne analogi zasad heterocyklicznych, w których jeden lub więcej atomów węgla i azotu w pierścieniach puryny i pirymidyny jest podstawiony heteroatomami, np. tlenu, siarki, selenu, fosforu i podobnymi.

Opis Swoistych Realizacji

Przedmiotowy wynalazek zapewnia nowe nukleozydy i oligonukieotydy o właściwościach pożądanych dla stosowania antysensownego, diagnostycznego i innych metod wykorzystujących oligonukieotydy. Związki według wynalazku obejmują różne nukleozydy, które zostały zmodyfikowane przez włączenie podstawników w pozycjach Cl', C3', C4' lub C5' cukrowego fragmentu nukleozydu. Nukleozydy według wynalazku mogą zawierać jeden lub więcej podstawników, aby przystosować nukleozyd do syntezy w fazie stałej lub podobnych technik syntezy, np. przedmiotowe nukleozydy mogą występować jako pochodne fosforoamidytowe z 5'-dimetoksytritylem lub innymi grupami ochronnymi. Przedmiotowy wynalazek zapewnia też oligonukieotydy zawierające jeden lub więcej nukleozydów o zmodyfikowanych cukrach, według wynalazku, w łańcuchu kwasu nukleinowego.

Dodatek odpowiedniego podstawnika w pozycjach C3' lub C5' nukleozydu zmienia otoczenie wokół fosfodiestrowego szkieletu oligonukleotydów zawierających te nukleozydy o zmodyfikowanych cukrach. Korzystnie stosuje się podstawnik o dużej objętości w pozycjach C3' lub C5', aby zahamować niepożądane interakcje z enzymami lub ich aktywnymi miejscami. Te podstawniki C3' lub C5' mają na celu spowodowanie, aby fosfodiestrowy szkielet oligonukleotydów był niedostępny dla wielu enzymów. W wyniku obecności podstawników, oligonukleotydy zawierające te C3' lub C5' rozgałęzione nukleozydy mogą być bardziej oporne wobec nukleazy w porównaniu z DNA lub RNA. Podstawniki w pozycjach Cl' i C4' nukleozydów mogą wywierać takie same pożądane skutki jak te w pozycjach C3' i C5' nukleozydów. W tych realizacjach wynalazku, w których przedmiotowe oligonukleotydy obejmują naładowane, dodatnio cukry zmodyfikowane aminoalkilem, wynikowe ładunki ujemne przedmiotowych oligonukleotydów w warunkach fizjologicznych ulegają zmniejszeniu, co powoduje, że podwójna helisa utworzona przez co najmniej jeden łańcuch tych oligonukleotydów może być bardziej trwała niż odpowiadający niemodyfikowany oligonukleotyd (patrz Rysunek 1). A wiec, w tych realizacjach wynalazku, które obejmują cukry zmodyfikowane aminoalkilem lub podobnymi dodatnio naładowanymi podstawnikami, powinowactwo powiązania pomiędzy przedmiotowymi oligonukleotydami a obiektem hybrydyzacji polinukleotydu może być zwiększone przez ładunek dodatni. Osoby przeciętnie zorientowane w stanie techniki mogą stwierdzić, że podane powyżej teorie chociaż stanowią wskazówkę dla stosowania i projektowania dodatkowych realizacji wynalazku, nie musząbyć poprawne dla wykonania lub stosowania przedstawionego tu wynalazku.

Jedną z realizacji wynalazku są nukleozydy o zmodyfikowanych cukrach, o wzorze

B

(45)

184 3781 w którym R, oznacza rodnik alkilowy, aryloalkilowy, arylowy, podstawiony alkilowy, podstawiony aryloalkilowy, podstawiony arylowy, a podstawniki obejmują grupy: NO₂, CN, N₃, COOEt, OH, SH, CONH₂ CONHR, CONR₂, COOH, OAc, NH₂, NHAc, NMe₂, CF3CONH, OR, SR, SO2CH3, CF3, F, Cl, Br, J, OTs, ⁺NMe3, CH=CHR, C=CR, w których R oznacza rodnik alkilowy; R2 oznacza H, OH, rodnik alkoksylowy, aryloalkoksylowy; R3 oznacza OH, O-CEPA; R₄ oznacza OH lub hydroksylowągrupę blokującą; B oznacza heterocykliczną zasadę nukleozydową; X oznacza O, S, NH lub CH2.

Heterocykliczna zasada nukleozydowa, B, w nukleozydach o zmodyfikowanych cukrach, według wynalazku, przedstawiona we wzorach 45, 46, 47, 48, 49 i 50 jest dowolną heterocykliczną zasadą nukleozydowa, bądź występującą naturalnie bądź też nie występującą naturalnie. A więc heterocykliczne zasady nukleozydowe stanowiące zasadowe fragmenty nukleozydów o zmodyfikowanych cukrach, według wynalazku, sąpurynami (np. adenina, guanina lub ksantyna), pirymidynami (np. tymina, uracyl, cytozyna) i ich heterocyklicznymi analogami i tautomerami. Odpowiednimi zasadami heterocyklicznymi, które służą jako zasadowe fragmenty związków nukleozydowych według wynalazku są zasady, które można włączyć wjeden łańcuch polinukleotydu o podwójnym łańcuchu, tak, aby utrzymać strukturalną, zależność sparowania zasad z naturalnie występującą zasadą w uzupełniającym łańcuchu polinukleotydu. Dodatkowo, zasadowy fragment związków nukleozydowych według wynalazku łączy się z fragmentem cukrowym w takim miejscu zasady, które umożliwia zasadzie wchodzenie w zależności sparowania zasad, zgodnie z uprzednim opisem.

Inna realizacja wynalazku zapewnia nukleotydy o wzorze:

R

B

(46) w którym R, oznacza rodnik alkilowy, aryloalkilowy, arylowy, podstawiony alkilowy, podstawiony aryloalkilowy, podstawiony arylowy, a podstawniki obejmują grupy: NO2, CN, N3, COOEt, OH, SH, CONH2, CONHR, CONR2, COOH, OAc, NH₂, NHAc, NMe2, CF₃CONH, OR, SR, SO₂Me, CF₃, F, Cl, Br, J, OTs, ⁺NMe3, cH=CHR, C=CR, w których R oznacza rodnik alkilowy; R2 oznacza H, OH, rodnik alkoksylowy, aryloksylowy; R3 oznacza OH, O-TBDMS, O-CEPA; R₄ oznacza OH, CHO lub hydroksylowągrupę blokującą; B oznaczą heterocykliczną zasadą nukleozydową; X oznacza O, S, NH lub CH2; przy czym węgiel przyłączony równocześnie do r i R₄ jest w konfiguracji R lub S.

Inną realizacją wynalazku sąnukleozydy o wzorze:

(47) w którym R, oznacza rodnik alkilowy, aryloalkilowy, arylowy, podstawiony alkilowy, podstawiony aryloalkilowy, podstawiony arylowy, a podstawniki obejmują grupy: NO2, CN, N₃, COOEt, OH, SH, CONH2, CONHR, CONR₂, COOH, OAc, NH2, NHAc, NMe2, CF₃CONH, OR, SR, SO2Me, CF3, F, Cl, Br, J, OTs, ⁺NMe3, cH=CHR, C=CR, w których R oznacza rodnik alkilowy ;R2 oznacza H, OH, rodnik alkoksylowy, aryloksylowy; R₃ oznacza OH, OTBDMS, O-CEPA; R₄ oznacza OH lub hydrt^^l^i^s^ll^o^ćągrupę blokującą; B oznacza heterocyklicznę zasadę nukleozydową; X oznacza O, S, NH lub CH2.

184 378

Innym aspektem wynalazku jest zapewnienie nukleotydów o wzorze:

B

R

R (48) w którym Rj oznacza rodnik alkilowy, aryloalkilowy, arylowy, podstawiony alkilowy, podstawiony aryloalkilowy, podstawiony arylowy, a podstawniki obejmują grupy: NO2, CN, N3, COOEt, OH, SH, CONH2, CONHR, CONR2, COOH, OAc, NH2, NHAc, NMe2, CF3CONH, OR, SR, SO2Me, CF3, F, Cl, Br, J, OTs, ⁺NMe3, cH=CHR, C=CR, w których R oznacza rodnik alkilowy; R2 oznacza H, OH, rodnik alkoksylowy, aryloksylowy; R₃ oznacza OH, O-MBn, O-CEPA; R4 oznacza OH lub hydroksylową grupę blokującą; B oznacza heterocykliczną zasadą nukleozydową; X oznacza O, S, NH lub CH2.

Innym aspektem wynalazku jest zapewnienie różnych epoksydowych pochodnych nukleozydów o zmodyfikowanych cukrach, według wynalazku, o wzorach:

(49) (50) w których Rjest wybrany z grupy złożonej z CH2OH, CH₂ODMTr, CHO, COOH i COOEt; X jest wybrany z grupy złożonej z O i CH2. Epoksydy występują w dowolnej z dwóch możliwych konfiguracji stereochemicznych.

Nukleozyd o zmodyfikowanym cukrze, według wynalazku, powstaje w wyniku syntezy objaśnionej w przykładach podanych w tym zgłoszeniu. Osoba przeciętnie zorientowana w chemii organicznej może na podstawie tych przykładów dokonać syntezy licznych związków według wynalazku, dla których nie podano szczególnych syntez.

Oligonukleotydy zawierające nukleozydy o zmodyfikowanych cukrach.

Polinukleotydy według wynalazku zawierająjeden lub więcej nukleozydów o zmodyfikowanych cukrach, według wynalazku, przy czym nukleozyd o zmodyfikowanym cukrze, według wynalazku, łączy się bądź z drugim nukleozydem o zmodyfikowanym cukrze bądź też z niemodyfikowanym nukleozydem, a nukleozydy łączy się poprzez wiązanie międzynukleozydowe. Nukleozydy o zmodyfikowanym cukrze, wchodzące w skład oligonukleotydów według wynalazku, obejmują związki o wzorach 45, 46, 47 i 48. Analogi polinukleotydów nie są ograniczone pod względem liczby możliwych podjednostek nukleozydowych w pojedynczym analogu polinukleotydowym; jednakże na ogół wygodniej jest syntetyzować krótkie analogi polinukleotydowe, np. analogi polinukleotydowe zawierające mniej niż 50 zasad.

Pojedyncze nukleozydy według wynalazku mogąłączyć się ze sobąpoprzez wiązanie międzynukleozydowe tworząc nowe oligonukletydy o pożądanych sekwencjach zasad nukleozydowych. Wiązania międzynukleozydowe mogą być wiązaniami C3' z C5' lub C2' z C5'. Określenie „wiązanie międzynukleozydowe” użyte w tym opisie dotyczy nie tylko szkieletu fosfodiestrowe8

184 378 go typu, który tworzy wiązania międzynukleozydowe w DNA (kwas dezoksyrybonukleinowy) i RNA (kwas rybonukleinowy) ale również szeregu innych fragmentów, które mają taką samą funkcję strukturalną jak wiązania fosfodiestrowe w DNA i RNA. Przykłady innych wiązań międzynukleozydowych odpowiednich dla oligonukleotydów według wynalazku obęjmują fosforotioniany, metylofosfoniany, fosforoditioniany, fosfoniany boru, selenofosfoniany, fosforoamidany, acetamidany i podobne. Opisy syntez i zastosowania różnych wiązań międzynukleozydowych można znaleźć, oprócz innych źródeł, w Opisie Patentowym U.S. 5,256,775, Publikacji PCT W093/24507, Publikacji PCT W092/05186, Opisie Patentowym U.S. 5,264,562, Publikacji PCT W092/02534, Publikacji PCT W094/06811, Publikacji PCT W003/17717, OpisiePatentowymU.S. 5,212,295, Opisie Patentowym U.S. 5,292,875, Opisie Patentowym U.S. 5,218,103, Opisie Patentowym U.S. 5,166,387, Opisie Patentowym U.S. 5,151,516, Opisie Patentowym U.S. 4,814,448, Opisie Patentowym U.S. 4,814,451, Opisie Patentowym U.S. 4,096,210, Opisie Patentowym U.S. 4,094,873, Opisie Patentowym U.S. 4,092,312, Opisie Patentowym U.S. 4,016,225, Opisie Patentowym U.S. 4,007,197 i podobnych.

Polinukleotydy według wynalazku o pożądanej sekwencji zasad można łatwo wytworzyć stosując techniki syntezy polimeru kwasu nukleinowego, dobrze znane osobom przeciętnie obeznanym z chemią organiczną. Polinukleotydy według wynalazku syntetyzuje się korzystnie stosując metody chemii fosforoamidytów dla wprowadzenia jednego lub więcej nowych nukleozydów, według wynalazku, do analogu polinukleotydu.

Rozgałęzione podstawniki w pozycji C3' lub C5' nukleozydów, według wynalazku, mogą zmniejszyć szybkość sprzęgania zależnie od wielkości podstawników. A więc, dla niektórych nukleozydów z rozgałęzionymi podstawnikami o dużej objętości, czas sprzęgania należy przedłużyć nawet 10-ciokrotnie lub więcej. Powtarzane sprzęgania ze świeżymi reagentami i użycie bardziej stężonych reagentów sprzęgania można również zastosować w razie potrzeby dla przyspieszenia reakcji sprzęgania. Po syntezie oligonukleotydy poddaje się takiej samej obróbce jak typowe niemodyfikowane oligonukleotydy, a więc rozszczepieniu dla oddzielenia od stałych nośników, stosując 30% amoniak, usunięciu grup ochronnych poniżej 55°C w ciągu 8 godzin i oczyszczeniu przez HPLC z odwrotną fazą.

Dla sprawdzenia zarówno czystości oligonukleotydów jak i włączenia pożądanych nukleozydów o zmodyfikowanych cukrach, oczyszczone oligonukleotydy można scharakteryzować przez analizę produktów trawienia enzymami stosując takie enzymy jak fosfodiesteraza jadu węża i bakteryjna alkaliczna fosfataza, użyte do rozkładu oligonukleotydów. Rozłożone produkty poddaje się następnie analizie HPLC (lub innym technikom rozdzielania) i porównaniu z oryginalnymi próbkami nukleozydów Budowę oczyszczonych oligonukleotydów można też sprawdzić metodą spektroskopii masowej, taką jak technika elektrorozpylania.

Innym aspektem wynalazku są sprzężne oligonukleotydów o zmodyfikowanych cukrach, według wynalazku. Aminowe, hydroksylowe, tiolowe lub karboksyalkilowe elementy wiązania mogą przyłączyć się w pozycji C1', C3', C4' i C5' przedmiotowych nukleozydów zapewniając miejsce do sprzęgania pożądanego fragmentu z oligonukleotydem. Elementy wiązania przyłączone w pozycji C1' i C3' można użyć do kierowania sprzęganego fragmentu do małych bruzd kwasu nukleinowego o podwójnym łańcuchu, podczas gdy elementy wiązania przyłączone w pozycji C4' można użyć do skierowania sprzęganego fragmentu do dużych bruzd. Elementy wiązania przyłączone w pozycji C5' można użyć do skierowania sprzęganego fragmentu bądź do dużych bądź też do małych bruzd kwasu nukleinowego o podwójnym łańcuchu, zależnie od stereochemii elementu wiązania w pozycji C5'. Poprzez elementy wiązania można powiązać lub umieścić w pożądanej pozycji szereg różnych fragmentów funkcyjnych, takich jak sztuczna nukleaza, reagenty sieciujące, wstawki i cząsteczki zgłaszające.

Użyteczność i stosowanie

Oligonukleotydy według wynalazku odznaczają się znaczącą aktywnością wiązania wobec objektów kwasu nukleinowego o pojedynczym lub podwójnym łańcuchu tworząc dupleksy, tripleksy lub inne formy stałego związku z występującymi naturalnie polinukleotydarni i ich strukturalnymi analogami, a więc można je użyć w większości sposobów, w których stosuje się tra184 378 dycyjne oligonukleotydy. A więc, nukleotydy według wynalazku można użyć, na przykład, jako sondy hybrydyzacji polinukleotydowej, inicjatory reakcji łańcuchowej polimerazy (i podobnych cyklicznych reakcji wzmocnienia), inicjatory sekwencyjne i podobne. Oligonukleotydy według wynalazku można też użyć do diagnozy i leczenia chorób. Lecznicze zastosowanie oligonukleotydów według wynalazku obejmują specyficzne hamowanie ekspresji genów (lub hamowanie translacji sekwencji RNA zakodowanej w tych genach), powiązanych bądź z ustaleniem bądź z utrzymaniem stanów patologicznych przez użycie oligonukleotydów antysensownych. Oligonukleotydy według wynalazku można użyć do pośrednictwa przy antysensownym hamowaniu licznych obiektów genetycznych. Przykładowe geny lub kwasy rybonukleinowe (RNA) zakodowane przez te geny, które można uzyskać poprzez antysensowne oligonukleotydy według wynalazku, obejmują oligonukleotydy które kodują enzymy, hormony, białka surowicze, białka transmembranowe, cząsteczki adhezyjne (LFA-1, GPIIb/IIIa, ELAM-1, VACM-1, ICAM-1, E-selekcja i podobne), cząsteczki receptorowe obejmujące receptory cytokinezy, cytokiny (L-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6 i podobne), onkogeny, czynniki wzrostu i inter-leukiny. Docelowe geny lub RNA mogąbyć związane z dowolnymi stanami patologicznymi takimi jak związane ze stanami zapalnymi, zaburzeniami sercowonaczyniowymi, odczynami odpornościowymi, rakiem, infekcjami wirusowymi, infekcjami bakteryjnymi, infekcjami drożdżowymi, infekcjami pasożytowymi i podobnymi.

Oligonukleotydy według wynalazku są odpowiednie do użycia w zastosowaniach leczniczych zarówno in vivo jak też ex vivo. Wskazania do zastosowań ex vivo obejmują leczenie komórek, takich jak szpik kostny lub krew obwodowa w stanach takich jak białaczka (białaczka szpikowa przewlekła, białaczka limfocytowa ostra) lub zakażenie wirusowe. Geny docelowe lub kwasy rybonukleinowe kodowane przez te geny, które mogą stanowić cele w leczeniu raka, obejmująonkogeny, takie jak ras, k-ras, bcl-2, c-myb, ber, c-myc, c-abl lub nadmiernie wyraziste sekwencje, takie jak mdm2, onkostatyna M, IL-6 (mięsak Kaposiego), HER-2 i translokacje, takie jak bcr-abl. Sekwencje genów wirusowych lub kwasy rybonukleinowe kodowane przez te geny, takie jak polimeraza lub odwrotna transkryptaza, geny wirusów opryszczki, takie jak CMV, HCV-1, HCV-2, retrowirusy, takie jak HTLV-1, HIV-1, HIV-2 lub inne wirusy DNA lub RNA, takie jak HBV, HPV, VZV, wirus grypy, adenowirusy, flawiwirusy, rynowirusy i podobne stanowią także odpowiednie cele. Zastosowanie swoiście wiążących oligonukleotydów możną użyć w połączeniu z innymi działaniami leczniczymi. Inne lecznicze zastosowania oligonukleotydów według wynalazku obejmują (1) modulację reakcji zapalnych poprzez modulację wyrażenia genów, takichjak IL-4 receptor, IL-1, ICAM-1 lub E-Selekcja, które odgrywająrolę w pośredniczeniu zapalenia i (2) modulację rozrostu komórkowego w stanach takichjak zamkniecie tętnicy (restenosis) po angioplastyce przez modulowanie wyrażenia (a) wzrostu lub czynników mitogennych, takichjak niemięśniowa miozyna, myc, fox, PCNA, PDGF lub FGF lub ich receptory lub (b) czynników rozrostu komórki, takichjak c-myb. Inne odpowiednie czynniki rozrostu lub czynniki transdukcji sygnału, takie jak TGTa, IL-6, gINF, kinaza białkowa C, kinazy tyrozynowe (takie jak p210, p190) mogą stanowić cele w leczeniu łuszczycy lub innych stanów. Ponadto receptor EFG, TGFa lub allele MHC mogąbyć celami w schorzeniach antoimmunizacji.

Oligonukleotydy według wynalazku mogą. też z powodzeniem zastępować tradycyjne oligonukleotydy w wielu nie leczniczych metodach, takich jak hybrydyzacją dla wykrywania sekwencji kwasu nukleinowego, łańcuchowa reakcja polimerazy i podobne. Te nie lecznicze metody sądobrze znane osobom przeciętnie obeznanym z biologią molekularną i możnaje znaleźć, na przykład, w pracy Sambrook i in., Molecular Cloning Techniques 2nd Edition, Cold Spring Harbor (1989).

Dostarczenie oligonukleotydów według wynalazku do komórek można przyspieszyć dowolnym odpowiednim sposobem obejmującym transfekcję fosforanu wapnia, DMSO, gliceryny lub dekstranu, elektroporację lub przez użycie kompozycji kationowych, anionowych i/lub obojętnych lipidów lub liposomów sposobami opisanymi w (International Publications Nos WO 90/14704, WO 91/16024, WO 91/17427, Opisie Patentowym U.S. 4,897,355). Oligonukleotydy można wprowadzić do komórek poprzez stworzenie kompleksów z kationowymi lipi10

184 378 dami, takimi jak DOTMA (które tworzą liposomy lub nie tworzą liposomów), a taki kompleks styka się następnie z komórkami. Odpowiednie kationowe lipidy obejmują, bez ograniczenia, związek N-(2,3-di(9-(Z)-oktadecenyloksylo))-prop-1 -ylo-N,N,N-trimetyloamoniowy (DOTMa) i jego sole, związek 1-O-oleilo-2-O-oleilo-3-dimetyloaminoprooylo---hydroksyety loamoniowy i jego sole i 2,2-bis(oleiloksy)-3-(toimetyloamonio)propan i jego sole.

Przyspieszone dostarczenie oligonukleotydów według wynalazku można dokonać za pośrednictwem zastosowanych (i) wirusów, takich jak wirus Sendai (Bartzalt, R., Biotechnol. Appl/ Biochem., 1989, 11, 133-135) lub adenowirus (Wagner, E. i in.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 6099-6013); (ii) poliamin lub sprzężonych polikationów stosując związki takie jak polilizyna, protamina lub Na, N_I2-bis (etylo)spermina (Wagner, E. i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991,88, 4255-4259); Zenke, M. i in.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 3655-3659; Chank, B.K. i in., Biochem Biophys. Res. Commun., 1988,157,264-270; Opis Patentowy U.S. 5,138,045); (iii) kompkleksów lipopoliaminowych stosując związki takie jak lipospermina (Behr, J.-P. i in., 5 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989,86,6982-6986; Loef-fler, J.P. i in. J. Neurochem. 1990,54,1812-1815); (iv) anionowe, obojętne lub wrażliwe napH lipidy stosując związki obejmujące anionowe fosfolipidy, takie jak fosfatydylogliceryna, kardiolipina, kwas fosfatydowy lub fosfatydyloetanoloaminę (Lee, K.-D. i in., Biochem Biophys. ACTA, 1992, 1103. 185-197; Cheddar, G. i in., Arch. Biochem Biophys., 1992, 294. 188-192; Yoshimura, T. i in., Biochem Int., 1990,20,697-706); (v) sprzężne ze związkami, takimi jak transferryna lub biotyna lub (vi) sprzężne z białkami (włącznie z albuminą lub przeciwciałami), glikobiałkami lub polimerami (włącznie z glikolem polietylenowym), które wzmacniają właściwości farmakokinetyczne przedmiotowych oligonukleotydów·. Według tego opisu transfekcja dotyczy dowolnego sposobu odpowiedniego dla dostarczenia oligonukleotydów do wnętrza komórek. Dowolny reagent, taki jak lipid lub inny środek, taki jak wirus, który można użyć do transfekcji, określany jest zbiorczo jako „środek wzmagający przenikanie”. Dostarczanie oligonukleotydów do komórek może się odbywać przez kotransfekcję z innymi kwasami nukleinowymi, takimi jak (i) wyraziste fragmenty DNA kodujące białko(-a) lub fragment białka lub (ii) translatywne kwasy rybonukleinowe, które kodują białko(-a) lub fragment białka.

Oligonukleotydy według wynalazku mogą być w ten sposób włączone do dowolnego preparatu, który wzmaga dostarczenie oligonukleotydów do komórek. Odpowiednie preparaty farmaceutyczne obejmują również te, które są zwykle stosowane tam, gdzie związki dostarcza się do komórek lub tkanek przez działanie miejscowe. Związki takie, jak glikol polietylenowy, glikol propylenowy, azon, noksonyl-9, kwas olejowy, DMSO, poliaminy lub lipopoliaminy można stosować w działających miejscowo preparatach zawierających oligonukleotydy.

Synteza 3'-C-rozgałęzionych nukleozydów

Zastąpienie grupy hydroksylowej w pozycji C3' nukleozydów przez inne grupy funkcyjne z zachowaniem wodoru w pozycji C3' opisano, miedzy innymi, przez De Clercq, E., Antiviral Res. 1989,12,1 -20. Zastąpienie wodoru w pozycji C3' nukleozydów przez inne grupy funkcyjne podano w Fedorov, J.J. Kazmina, E.M., Novicov, N.A., Gurskaya, G.V., Bochkarev, A.V. Jasko, M.V. Victorova, L.S., Kuhkanova, M.K., Balzarini, J., De Clercq, E., J. Med. Chem., 1992, 35, 4567-4575. Wynalazek podaje sposoby wytwarzania dużej liczby różnych 3'-C-rozgałęzionych nukleozydów. Przykłady sposobów wytwarzania 3'-C-rozgalęzionych tymidyn ukazano na Schematach Reakcji 1 i 2 (Rysunki 2 i 3, odpowiednioo. Te sposoby można łatwo zaadaptować do syntezy innych nukleozydów według wynalazku, włącznie z realizacjami wynalazku, w których nukleozydy obejmują inną zasadę niż tymina. Związek 4 wytworzono w trzech etapach z tymidyny, zgodnie z opisem (Jorgensen, P.N., Thrane, H., Wengel, J., J. Am. Chem. Soc. 1994,116, 2231). Działając na Związek 4 chlorkiem tosylu w pirydynie otrzymuje się tosylan. Związek 5.

W reakcji Związku 5 z cyjankiem potasu w dMf otrzymuje się pochodną 3-C-cyjanometylotymidyny, Związek 6. W reakcji Związku 5 z azydkiem sodu w DMF otrzymuje się pochodną 3'-C-azydometylotymidyny, Związek 7. Podobnie, w reakcjach Związku 5 z różnorodnymi reagentami nukleofilowymi otrzymuje się szeroki krąg pochodnych 3'-C-rozgąłęzionej tymidyny, w których grupa 3'-C-hydroksylowa pozostaje w takim samym położeniu jak w tymidynie.

144 774

Działając na Związek 6 2-cyjanoetylo-N,N-diizopropylochlorofosforoamidytem i diizopropyloetylenoaminą w dichlorometanie otrzymuje się fosforamidyt. Związek 8, element budowy dla syntezy oligonukleotydu. Związek 7 poddaje się takiemu samemu działaniu otrzymując Związek 9. Podobnie, inne pochodne 3'-C-rozgałęzionej tymidyny można przekształcić w odpowiadające fosforoamidyty typowym sposobem. (F. Eckstein, „Oligonucleotide Synthesis”, Oxford University Press (1991)). Działając na Związek 5 wodorkiem sodu w THF otrzymuje się pochodną epoksydową. Związek 10. W reakcji Związku 10 z wodorkiem litowoglinowym w THF otrzymuje się pochodną3’-C-metylotynhdyny, Związek 11, któiy przekształca się w fosforoamidyt. Związek 12,. W reakcji Związku 10 z amoniakiem w metanolu otrzymuje się pochodną 3'-C-amino-metylotymidyny. Związek 13, na który działa się tiotrifluorooctanem etylu w THF otrzymując zabezpieczoną pochodną aminową. Związek 14. Związek 14 przekształcą się w fosforoamidyt, Związek 15. Podobnie, w reakcji Związku 10 z różnymi reagentami nukleofilowymi otrzymuje się szeroki krąg pochodnych 3'-C-rozgałęzionej tymidyny, w której grupa 3'-C-hydroksylowa pozostaje wtej samej pozycji jak w tymidynie, gdyż nukleofile atakująmniej osłonięty węgiel pierścienia epoksydowego. A więc reakcja Związku 10 z alkoholami w obecności zasady daje alkoksymetylotymidyny. Podstawione alkohole można też stosować dla otrzymania 3'-C-podstawionych alkoksymetylotymidyn. Podstawniki mogą zawierać, bez ograniczenia, NO2, CN, COOEt i zabezpieczone grupy aminowe. W reakcji Związku 10 z diolami otrzymuje się 3'-C-hydroksyalkoksymetylotymidyny, które można łatwo przekształcić w 3'-C-chlorowcoalkoksymetylotymidyny. W reakcji Związku 10 z nitrometanem otrzymuje się 3'-C-nitroetylo tymidynę. Redukcja 3'-C-nitroalkilotymidyn prowadzi do powstania 3'-C-aminoalkilotymidyn. W reakcji Związku 10 z cyjanopodstawionymi reagentami kadmoorganicznymi otrzymuje się 3'-C-cyjanoalkilotymidyny. W reakcji Związku 10 z reagentami etoksykarbonyloalkilocynkowymi otrzymuje się 3’-C-etoksykarbonyloalkilotymidyny, które łatwo hydrolizują do 3'-C-karboksyalkilotymidyn w środowisku zasadowym.

W niektórych reakcjach z użyciem miedzianoorganicznych pochodnych litu grupa amidowa tyminy musi być zabezpieczona. Jako grupę zabezpieczającą stosuje się korzystnie t-butylodimetylosiloksymetyl (TBDMSM), gdyż można go łatwo usunąć przy pomocy fluorku tetrabutyloamoniowego (TBAF) po uprzednich przekształceniach. Grupę N-TBDMSM można wprowadzić w reakcji 3,5-biacylowanej tymidyny z chlorkiem t-butylodimetylosiloksymetylowym w pirydynie. N-TBDMSM tymidynę poddaje się podobnemu działaniu jak opisane powyżej dla tymidyny otrzymując odpowiednio tosylan, pochodną Związku 5 i epoksyd, pochodną Związku 10, oba te związki stosuje się do wytwarzania 3'-C-alkilotymidyn i 3'-C-aikenylotymidyn w reakcji z reagentami litowymi. Hydroborowanie lub utleniające rozszczepienie powstałych 3'-C-(o-alkenylo) tymidyn prowadzi do hydroksyalkilotymidyn, których grupę hydroksylową można przekształcać w różnorodne funkcyjne grupy, takie jak NH2, OR, SR, SH i X, gdzie R oznacza H lub alkil, a X oznacza F, Cl, Br, J, OTs.

Synteza 4'-C-rozgałęzionych nukleozydów

Szereg 4'-C-rozgałęzionych nukleozydów podano w O-Yang C., Wu, H.Y., Fraser-Smith, E.B., Walker, K.A. M., Tetrahedron Letters, 1992,33,37-40. Wynalazek podaje sposoby wytwarzania wielu nowych 4'-C-rozgałęzionych nukleozydów. Wytwarzanie 4'-C-rozgałęzionych tymidyn ukazano na Schematach reakcji 3, 4, 5 (Rysunki 4, 5, 6 i 7, odpowiednio). Te sposoby można łatwo zaadaptować do syntezy innych nukleozydów według wynalazku, włącznie z realizacjami wynalazku, w których nukleozydy obejimyąbazę inną niż tymina. NaZwiązek 16, wytworzony z tymidyny, działa się chlorkiem dimetoksytritylu otrzymując Związek 17. Grupę t-butylodimetylosilylową (TBDMS) Związku 17 usuwa się działając TBAF i otrzymuje się Związek 18, który utlenia się do aldehydu, Związku 19 przez działanie dimetylosulfotlenkiem, DCC, kwasem trifluorooctowym i pirydyną. Związek 19 przekształca się w Związek 20, pochodną4'-C-hydroksymetylotymidyny sposobem podobnym do opisanego w (a. O-Yang C., Wu, H.Y., Fraser-Smith, E.B., Walker, K.A.M., Tetrahedron Letters, 1992,33,37-40; b. Jones, G.H., Ta-niguchi, M., Tegg, D., Moffatt, J.G., J. Org. Chem., 1979, 44, 1309-17). Grupę dimetoksytritylową Związku 20 usuwa się przy pomocy 80% kwasu octowego otrzymując Związek 21,

184 378

4'-C-hydroksymetylotymidyne. Przez selektywne benzoilowanie Związku 21 bezwodnikiem benzoilowym otrzymuje się Związek 22, którego grupy hydroksylowe w pozycji 3' i 5' zabezpiecza się tetrahydropiranylem (THP) w reakcji Związku 22 z dihydropiranem w obecności kwasu toluenosulfonowego w dichlorometanie. Na powstały Związek 23 działa się wodnym roztworem wodorotlenku sodowego otrzymując Związek 24, który poddaje się reakcji z jodkiem metylu w obecności wodorotlenku sodowego w 0°C otrzymując pochodną 4'-C-metoksymetylotymidyny, Związek 25. Po usunięciu grup zabezpieczających THP Związku 25 otrzymuje się Związek 26, 4'-C-metoksymetylotymidynę. Dla niektórych reakcji grupa zabezpieczająca TBDMS jest korzystniejsza niż THP, gdyż stosowanie THP powoduje powstawanie diastereoizomerów. A więc, działając na Związek 22 t-butylodimetylochlorosilanem otrzymuje się pochodną 3', 5'-O-(bis-TBDMS)tymidyny. Związek 27. Po usunięciu grupy benzoilowej przy pomocy etylenodiaminy w 50°C otrzymuje się Związek 28, który po reakcji z bezwodnikiem trifluorometanosulfonowym i pirydyną w dichlorometanie daje triflan. Związek 29. W reakcji Związku 29 z amoniakiem w dioksanie otrzymuje się pochodną 4’-C-ąminometylotymidyny. Związek 30. W reakcji Związku 29 z azydkiem sodowym w DMF otrzymuje się pochodne 4'-C-azydometylotymidyny. Związek 31. Po usunięciu grup zabezpieczających TBDMS ze Związku 30 i 31 otrzymuje się odpowiednio Związek 32 i 33, 4'-C-aminometylotymidynę i 4'-C-azydometylotymidynę. Grupę amonowąZwiązku 33 zabezpiecza się grupątrifiuoroacetylową otrzymując Związek 34. W reakcji Związku 32 i 34 z chlorkiem dimetoksytritylu w pirydynie otrzymuje się odpowiednio Związek 35 i 36. Związek 35 i 36 przekształca się w odpowiadające fosforoamidyty, Związki 37 i 38, działając 2-cyjanoetylo-N,N-diizopropylochlorofosforoamidytem.

W reakcjach Związku 29 z reagentami Grignarda otrzymuje się 4'-C-alkilotymidyny i 4'-C-alkenylotymidyny. Hydroborowanie lub utleniające rozszczepienie powstałych 4'-C-(o-alkenylo) tymidyn prowadzi do powstania hydroksyalkilotymidyn, w których grupę hydroksylową można przekształcić w różnorodne grupy funkcyjne, takie jak NH2, OR, SR, SH i X, gdzie R oznacza H lub alkil, a X oznacza F, Cl, Br, J lub OTs. W reakcjach Związku 29 z cyjanoalkilokadmem otrzymuje się 4'-C-cyjanoalkilotymidyny. W reakcjach Związku 29 z reagentami etoksykarbonyloalkilocynkowymi otrzymuje się 4'-C-etoksykarbonyloalkilotymidyny, które ulegają hydrolizie do 4'-C-karboksyalkilotymidyn. W reakcjach Związku 29 z alkanolanami sodu otrzymuje się 4'-C-alkoksymetylotymidyny. Podstawione alkohole i fenole stosuje się do wytwarzania 4'-C-podstawionych alkoksymetylotymidyn. Podstawnikami są grupy NO2, CN, COOEt, OAc lub zabezpieczone grupy aminowe. Po dokonaniu syntezy 4'-C-rozgąłęzionych tymidyn, grupy 5'-hydroksylowe zabezpiecza się dimetoksytritylem, a grupy 3'-hydroksylowe przekształca się w fosforoamidyty dla syntezy oligonukleotydu stosując typowy sposób (F. Eckstein, „Oligonucleotide synthesis”, Oxford University Press (1991)).

Synteza 5'-C-podstawionych nukleozydów

Wynalazek podaje sposoby wytwarzania dużej liczby 5'-C-rozgałęzionych nukleozydów. Przykłady sposobów wytwarzania 5'-C-rozgałęzionych tymidyn ukazują Schematy reakcji 6, 7 i 8 (Rysunki 8,9 i 10 odpowiednio). Te sposoby można łatwo zaadaptować do syntezy innych nukleozydów według wynalazku, włącznie z realizacjami wynalazku, w których nukleozydy obejmują zasadę inną niż tymina. Związek 42 wytwarza się w trzech etapach znanym sposobem (O-Yang C., Wu, H.Y., Fraser-Smith, E.B., Waler, K.A.M., Tetrahedron Letters, 1992, 33, 37-40). Alternatywnie, Związek 42 wytwarza się w reakcji 80% kwasu octowego ze Związkiem 41,3', 5'-O-(bis-t-butylodimetylosililo)tymidyną, wytwonzonąw reakcji tymidyny z nadmiarem t-butylodimetylochlorosilanu i imidazolu w pirydynie. W reakcji Wittiga Związku 42 z ylidem fosforu, wytworzonym z bromku metylotrifenylofosfoniowego i wodorku sodu w DMSO, otrzymuje się pochodną olefinową. Związek 43. Epoksydowanie Związku 43 kwasem m-chloronadtlenobenzoesowym w dichlorometanie prowadzi do powstania pochodnej 5’-(S)-epoksydowej, Związku 44 jako głównego produktu i pochodnej 5'-(R)-epoksydowej jako pobocznego produktu. Właściwości stereochemiczne Związku 44 i innych ukazuje Wykres 1 (Rysunek 12). W reakcji Związku 44 z metanolem w obecności węglanu sodu otrzymuje się 5'-(S)-C-metoksymety184 378 lotymidynę, Związek 45. W reakcji Związku 44 z amoniakiem w metanolu otrzymuje się 5'-(S)-C-aminometylotymidynę, którą zabezpiecza się trifluoroacetylem otrzymując Związek 46. W reakcji Związku 44 z cyjankiem potasu w DMF otrzymuje się SASTC-cyjanometylotymidynę, Związek 47. Grupy 5'-hydroksylowe Związków 45-47 zabezpiecza się dimetoksytritylem w reakcjach chlorku dimetoksytritylu i triflubrbmetanosulfonianu srebra w pirydynie otrzymując odpowiednio Związki 48 - 50. Grupy TBDMS Związków 48-50 usuwa się przy pomocy tBaF w THF otrzymując odpowiednio Związki 51 - 53. Związki 51-53 przekształcą się w odpowiadające fosforoamidyty, Związki 54 - 56. W reakcji Grignarda Związku 42 z bromkiem allilomagnezowym otrzymuje się mieszaninę izomerycznych pochodnych 5'-(R)-C-alliiotymidyny i 5'- (S)-C-allilotymidyny, Związki 57 i 58, które rozdziela się metodą chromatografii na krzemionce. Grupy TBDMS Związków 57 i 58 usuwa się działając TBAF w THF i otrzymując 5'-(R)- i 5'-(S)-C-allilotymidyny, odpowiednio Związki 59 i 60. Związki 59 i 60 przekształca się w odpowiadające fosforoamidyty. Związki 61 i 62. Podobnie, w reakcjach Związku 42 z różnorodnymi reagentami Grignarda otrzymuje się szereg 5'-(S lub R)-C-alkilotymidyn i 5'-(S lub R)-C-alkenylotymidyn. Hydroborowanie lub utleniające rozszczepienie otrzymanych 5'-C-(^alkenylo) tymidyn prowadzi do powstania hydroksyalkilotymidyn, w których grupy hydroksylowe przekształca się w różnorodne grupy funkcyjne, takie jak NH2, OR, SR, SH i X, gdzie R oznacza H lub alkil, a X oznacza F, Cl, Br, J, OTs.

W reakcjach Związku 44 z różnorodnymi reagentami nukleofilowymi otrzymuje się szereg różnorodnych pochodnych 5'-C-rozgałęzionej tymidyny. A więc, w reakcjach Związku 44 z alkoholami w obecności zasady otrzymuje się 5'-C-alkbksymetylbtymidyny. Podstawione alkohole stosuje się też do wytwarzania 5'-C-podstawionych alkoksymetylotymidyn. Podstawniki obejmują, bez ograniczenia, NO2, CN, COOEt i zabezpieczone grupy aminowe. W reakcji Związku 44 z diolami otrzymuje się 5'-C-hydroksyalkbksymetylbtymidyny, które łatwo przekształca się w 5^LC-chlorbwcoalkilbtymidyny. W reakcji Związku 44 z nitrometanem otrzymuje się 5'-C-nitroetylotymidynę. Po redukcji 5'-C-nitroalkilotymidyn otrzymuje się 5'-C-aminoalkilotymidyny. W reakcji Związku 44 z reagentami cyjanoalkilokadmowymi otrzymuje się 5'-C-cyjanbalkilotymidyny. W reakcji Związku 44 z reagentami etoksykarbonylocynkowymi otrzymuje się y-C-etoksykarbonyloalkilotymidyny, które łatwo hydrolizują do ^^^^^arboksynlkilotymidyn w środowisku zasadowym. Wszystkie przekształcenia izomerów 5'-(S) można również zastosować wobec izomerów 5'-(R). Na koniec, w reakcjach 5'-C-rozgałęzionych tymidyn z chlorkiem dimetoksytritylu i triflatanem srebra (silver triflate) w pirydynie otrzymuje się 5'-0-DMTr-5'-Crozgalęzione tymidyny, które przekształca się w odpowiadające fosforoamidyty typowymi sposobami (F. Eckstein, „Oligonucleotide synthesis”, Oxford University Press 1991)).

Dla oznaczenia konfiguracji w pozycjach C5' 5'-C-rozgałęzionych tymidyn wykorzystuje się wzmocnienie NOE przestrzennie ograniczonych protonów. Sztywne orientacje podstawników przy C5' są istotne dla doświadczeń NOE i dlatego wprowadza się pierścień TlPDS pomiędzy 3'-O- i 5'-O-pochodnych tymidyny (Schemat 8, Rysunek 11), gdzie 5'-protony orientują się bądź w kierunku 3'-prbtbnów bądź też oddalają się od 3'-protonów. Gdy 3-protony są nasycone wówczas stwierdza się łatwo obecność lub nieobecność wzmocnienia NOE 5'-prbtonów (Wykres 1. Rysunek 12). Dla 5'-C-allilotymidyn izomer posiadający 4,8 % wzmocnienia NOE jest wyraźnie izomerom 5'-(R), a inny, który nie ma wzmocnienia NOE jest izomerem 5'-(S). Bez użycia krystalografii rentgenowskiej bezpośrednie określenie stereochemii grupy 5'-epoksydowej jest trudne. Jednakże przekształcenie epoksydów w produkty o otwartym pierścieniu nie zmienia chiralności w pozycji C5'. Jeśli określi się stereochemięjednej pary takich produktów z otwartym pierścieniem, to znana jest też stereochemia pary epoksydowej. A więc, podobnie do 5'-C-allilbtymidyn, para produktów o otwartym pierścieniu, 5'-C-cyjanbmetylotymidyny, wytworzone z epoksydów, przekształca się w produkty o pierścieniu TIPDS. Gdy 3'-protony są nasycone to jeden izomer ma 6,3 % wzmocnienia NOE. Jest to niewątpliwie izomer 5'-(R), a pozostały jest izomerem 5'-(S).

184 378

Synteza 1'-C-rozgałęzionych nukleozydów

Znany jest szereg 1'-C-rozgałęzionych nukleozydów (a. Uteza, V., Chen, G-R., Tuoi, J.L.Q., Descotes, G., Fenet, B., Grouiller, A. Tetrahedron, 1993,49, 8579-8588; b. Azhayev, A., Gouzaev, A., Hovinen, J., Azhayeva, E., 5 Lonnberg, H. Tetrahedron Letts. 1993, 34, 6435-6438). Wynalazek podaje sposoby wytwarzania dużej liczby 1 ’-C-rozgałęzionych nukleozydów. Wytwarzanie 1'-C-rozgałęzionych tymidyn ukazuje Schemat reakcji 9 i 10 (Rysunek 13 i 14 odpowiednio). Związek 63 wytwarza się zgodnie ze znanym sposobem Uteza V., Chen, G-R, Tuoi, J.L.Q., Descotes, G., Fenet, B., Grouiller, A., Tetrahedron, 1993, 49, 8579-8588). Grupę 5’-hvdroksylową Związku 63 zabezpiecza się dimetoksytritylem otrzymując Związek 64, na który działa się t-butylodimetylochlorosilanem otrzymując Związek 65. Działając na Związek chlorkiem t-butylodimetylosiloksymetylu otrzymuje się Związek 66. Działając na Związek wodorkiem litowotrietoksyglinowym w eterze otrzymuje się aldehyd. Związek 67. Po redukcji Związku 67 borowodorkiem sodu, a następnie po działaniu bezwodnikiem trifiuorometanosulfenowym otrzymuje się pochodnątrinatanową(triflate), Związek 68. Działając na Związek 68 wieloma różnymi reagentami nukleofilowymi otrzymuje się szereg nowych 1'-C-podstawionych tymidyn. Związki 69. A więc, działając na Związek 68 cyjankiem sodu, azotynem sodu, azydkiem sodu otrzymuje się odpowiadające 1'-C-cyjanometylo-, 1'-C-nitrometylo i 1'-C-azydometylotymidyny. Działając naZwiązek 68 nitrometanem otrzymuje się 1-C-nitroetylotymidynę. Działając na Związek 68 siarczkami sodowoalkilowymi otrzymuje się Γ-C-alkilotiometylotymidynę. Działając naZwiązek 68 alkanolanem sodu otrzymuje się 1'-C-alkoksymetylotymidynę. Działając na Związek 68 reagentami litowomiedziano-organicznymi otrzymuje się 1 '-C-alkiloi 1'-C-alkenylo-5 tymidyny. Reagenty w postaci podstawionego alkilu lub alkenylocynku lub kadmu stosuje się do wytwarzania 1'-C-podstawionych alkilo- lub 1 -C-podstawionych alkenylotymidyn. Podstawnikami sąCOOEt, CN, NO2. Po hydroborowaniu lub utleniającym rozszczepieniu powstałych 3'-C-((o-alkenylo)tymidyn otrzymuje się hydroksyalkilotymidyny, w których grupę hydroksylowąprzekształca się w szereg grup funkcyjnych, takichjak NH2, OR, SR, SH i X, gdzie R oznacza H lub alkil, a X oznacza F, Cl, Br, J, OTs. Podstawione alkohole i fenole stosuje się do wytwarzania 1'-C-alkoksymetylo- i 1'-C-fenoksymetylotymidyn. Podstawnikami sąNO2, CN, COOEt lub OAc. 1'-C-Nitroalkilotymidyny redukuje się do odpowiadających aminoalkilotymidyn. Na Związki 69 działa się TBAF otrzymując odbezpieczone Związki 70, które przekształca się w odpowiadające fosforoamidyty, Związki 71.

Związek 63 jest całkowicie zabezpieczony grupą p-metoksybenzylową (MTM) dając Związek 72. Hydroliza Związku 72 w obecności nadtlenku wodoru i zasady prowadzi do powstania Związku 73, który poddaje się przegrupowaniu Hofmanna uzyskując aminę, którą można przekształcić przy pomocy bromku metylu w czwartorzędową pochodną amoniową, Związek 74. Zamiast dimetyloaminy można użyć różnych nukłeofilów Działając na Związek 74 alkanolanem sodu otrzymuje się 1'-C-alkoksytymidyny. Działając na Związek 74 siarczkiem sodowoalkilowym otrzymuje się 1'-C-alkilotiotymidyny. Po ogrzaniu z bromkiem sodu. Związek 74 przekształca się w 1'-C-bromotymidynę, na którą działa się azydkiem sodu, azotynem sodu lub nitrometanem otrzymując odpowiadające 1'-C-podstawione tymidyny. Na Związki 75 działa się azotanem cerowoamonowym otrzymując odbezpieczone Związki 76. Grupę 5-hydroksylową zabezpiecza się dimetoksytritylem, a otrzymane produkty. Związki 77 przekształca się w odpowiadające fosforoamidyty, Związki 78.

Oligonukleotydy zawierające nukleozydy o zmodyfikowanych cukrach

Oligonukleotydy zawierające nukleozydy o zmodyfikowanych cukrach opisano ostatnio (A. Jorgensen, P.N., Stein, P.C., Wengel, J. J. Am. Chem. Soc. 1994,116,2231; B. Fensholdt, J., Thrane, H., Wengel, J. Tetrahedron Letts. 1995,36,2535; C. Thrane, H., Fensholdt, J., Regner, M., Wengel, J. Tetrahedron, 1995,51,10389; D. Saha, A.K., Caulfield, T.J., Hobbs, C., Upson, D.A., Waychunas, C. Yawman, A.M. J. Org. Chem. 1995,60,788; E. Azhayev, A., Gouzaev, A., Hovinen, J., Azhayeva, E., Lonnberg, H. Tetra hedron Lett. 1993,34,6435-6438; F. Ono, A., Dan, A., Matsuda, A. Bioconjugate Chemistry, 1993, 4, 499-508; G. Inoue, H., Hayase, Y., Imura, A., Iwai, S., Miuta, K., Ohtsuka, E., Nucleic Acids Res. 1987,15,6131; H. Leśnik, E.A., Guinosso, C.J.,

184 378

Kawasaki, A.M., Sasmor, H., Zounes, M., Cummins, L.L., Ecker D.J., Cook, P.D., i Freier, S.M. Biochemistry, 1993,32,7832). Wynalazek podaje szereg nowych nukleozydów o zmodyfikowanych cukrach, które można łatwo włączyć do oligonukleotydów przy pomocy chemii fosforoamidytowej. Oligonukleotydy o zmodyfikowanych cukrach zawierają co najmniej jeden z nukleozydów o zmodyfikowanych cukrach, według wynalazku, mogą zawierać liczne nukleozydy o zmodyfikowanych cukrach, w sekwencji lub też mogą zawierać tylko nukleozydy o zmodyfikowanych cukrach, według wynalazku. Oligonukleotydy o zmodyfikowanych cukrach mogą też zawierać inne modyfikacje, takie jak modyfikacje szkieletu, modyfikacje bazy i dowolne inne modyfikacje cukrów. Jest rzeczą oczywistą, że rozgałęzione podstawniki w pozycji C3' lub C5' nukleozydów będą zmniejszać szybkość sprzęgania, zależnie od wielkości podstawników. A więc, dla pewnych rozgałęzionych nukleozydów o dużych podstawnikach czas sprzęgania będzie wzrastał. Dla syntezy 5'-C-rozgałęzionych oligonukleotydów i 4'-C-rozgałęzionych oligonukleotydów przyjęto czas sprzęgania 2-5 minut. Dla syntezy 3'-C-rozgałęzionych oligonukleotydów przyjęto czas sprzęgania do 45 minut (3x15 minut). Powtarzane sprzęgania ze świeżymi reagentami są konieczne tylko dla syntezy 3'-C-rozgałęzionych oligonukleotydów, gdyż grupa 3 ’-hydroksylowa jest trzeciorzędowa. Skład oczyszczonych oligonukleotydów o zmodyfikowanych cukrach sprawdza się przy pomocy analizy produktów przemiany enzymowej.

Przykłady

Opisany powyżej wynalazek będzie lepiej rozumiany dzięki następującym przykładom. Następujące przykłady mają na celu objaśnienie wynalazku bez jego ograniczania.

Przykład 1

Wytwarzanie 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-p-tosyloksymetylotymidyny

Roztwór 5'-Θ-(4,4α'-dimetoksytritylo)-3'-hydroksymetylotymidyny (2,12 g; 3,69 mmola), wytworzony zgodnie ze znanym sposobem (Jorgensen, P.N., Thrane, H., Wengel, J., J. Am. Chem. Soc. 1994,116,2231), chlorek p-toluenosulfonylu (1,76 g, 9,23 mmola), DMAP (0,180 g; 1,48 mmola) w bezwodnej pirydynie miesza się w temperaturze pokojowej przez noc. Mieszaninę reakcyjną chłodzi się do 0°C, rozcieńcza EtOAc (500 ml), przemywa 10⁰% NaHCO3, suszy nad Na2SO4 i zatęźa. Surowy produkt oczyszcza się przez chromatografię na krzemionce (5% CH3OH w CH2O2) otrzymując 2,389 g (89 %) 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-p-tosyloksymetylotymidyny w postaci bezbarwnego proszku.

Przykład 2

Wytwarzanie 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-C-cyjanometylotymidyny

Papkę 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-p-toluenosulfonyloksymetylotymidyny (0,50 g;

0,686 mmola) i cyjanku potasu (0,134 g; 2,06 mmola) w bezwodnym DMF (7 ml) miesza się w temperaturze pokojowej przez noc. Mieszaninę reakcyjnąrozcieńcza się EtOAc (60 ml) i przemywa wodą (3 x 75 ml), następnie 10% NaHCO3 (3 x 75 ml). Warstwę organiczną suszy się nad Na2SO4, zatęża i oczyszcza przez chromatografię na krzemionce (EtOAc-Heksany, 1:1), otrzymując 0,386 g (87%) 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-C-cyjanometylotymidyny w postaci bezbarwnego proszku.

Przykład 3

Wytwarzanie 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-C-azydometylotymidyny

Papkę 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-p-toluenosulfonyloksymetylotymidyny (0,40 g;

0,55 mmola) i NaN3 (0,11 g; 1,65 mmola) w bezwodnym DMF (3 ml) ogrzewa się w 50°C przez 3 dni. Mieszaninę reakcyjnąochładza się do temperatury pokojowej, rozcieńcza EtOAc (30 ml) i przemywa wodą(3 x 40 ml), następnie 10% NaHCO3 (3 x 40 ml). Warstwę organiczną suszy się nadNa2SO4, zatęża i oczyszcza przez chromatografię na krzemionce (EtOAc-Heksany, 1:1), otrzymując 0,30 g (92%) 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-C-azydometylotymidyny w postaci bezbarwnego proszku.

Przykład 4

Wytwarzanie 3'(2-cyjanoetylo-N,N-diizopropylofosforoamidytu 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-C-cyjanometylotymidyny

Do mieszanego roztworu 5'-0-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-C-cyjanometylotymidyny (0,20 g; 0,344 mmola) i diizopropyloetyloaminy (0,24 ml; 1,38 mmola) w bezwodnym dichlorometanie

184 378 (3 ml) w 0°C, w atmosferze argonu, dodaje się kroplami roztwór 2'-cyjanoetylo-N,N-diizopropylochlorofosforoamidytu (170 mg; 0,715 mmola) w dichlorometanie. Powstałą mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, ochładza do 0°C, rozcieńcza zimnym CH2O2 (20 ml) i przemywa zimnym NaHCO₃ (3x15 ml). Warstwę organiczną suszy się nad Na2SO4, zatęża. Pozostałość oczyszcza się przez chromatografię na krzemionce (Et₃N-EtOAc-CH2Cl2, 5:50:45) uzyskując 177 mg (66 %) 3'-(2-cyjanoetylo-N,N-diizopropylofosforoamidytu) 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-cyjanometylotymidyny w postaci piany.

Przykład 5

Wytwarzanie 3'-(2-cyjanoetylo-N,N-diizopropylofosforoamidytu) 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-C-azydometylotymidyny

Do mieszanego roztworu 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'--C-azydometylotymidyny (252 mg; 0,344 mmola) i diizopropyloetyloaminy (0,44 ml; 2,51 mmola) w bezwodnym dichlorometanie (3 ml) w 0°C, w atmosferze argonu, dodaje się kroplami roztwór 2'-cyjanoetylo-N,M-diizopropylochlorofosforoamidytu (296 mg; 1,25 mmola) w dichlorometanie. Powstałą mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, ochładza do 0°C, rozcieńcza zimnym C^C^ (20 ml) i przemywa zimnym NaHCO3 (3x15 ml). Warstwę organiczną suszy się nad Na2SO₄, zatęża. Pozostałość oczyszcza się przez chromatografię na krzemionce (Et3N-EtOAc-CH2Cl2,5:50:45) otrzymując 128 mg (38%) 3'-(2-azydometylo-N,N-diizopropylofosforoamidytu) 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-C-azydometylotymidyny w postaci piany.

Przykład 6

Wytwarzanie 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-C,O-metylenotymidyny

Do zawiesiny NaH (60 % w oleju mineralnym, 0,18 g; 7,5 mmola) w bezwodnym THF (18 ml) w 0°C, w atmosferze argonu, dodaje się kroplami roztwór 5'-0-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-p-toluenosulfonyloksymetylotymidyny (1,5 g; 2,06 mmola) w THF (10 ml). Powstałą mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, ochładza do 0°C i gasi dodając wodę. Mieszaninę rozcieńcza się EtOAc (250 ml), przemywa wodą (2 x 200 ml), następnie 10% NaHCO3 (2 x 200 ml), suszy nad Na2SO₄ i zatęża. Pozostałość oczyszcza się przez chromatografię na krzemionce (5% CH3OH w C^C^) otrzymując 0,97 g (85%) 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-C,O-metylenotymidyny w postaci piany.

Przykład 7

Wytwarzanie 5'-O- (4,4'-dimetoksytritylo)-3'-C-metylotymidyny

Do mieszanej zawiesiny wodorku litowoglinowego (58 mg; 1,53 mmola) w bezwodnym THF (10 ml) w 0°C, w atmosferze argonu, dodaje się kroplami roztwór 5'-0-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-C,O-metylenotymidyny (385 mg; 0,692 mmola) w THF (10 ml). Mieszaninę reakcyjną miesza się w 0°C przez 1 godzinę i gasi reakcję dodając powoli 10% NaHCO3. Powstałą mieszaninę rozcieńcza się EtOAc (30 ml), przemywa NaHCO3 (3 x 20 ml), suszy nad Na2SO₄ i zatęża. Pozostałość oczyszcza się przez chromatografię na krzemionce (5% CH3OH w CHC^) otrzymując 306 mg (79%) 5'-0-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-C-metylotymidyny w postaci piany.

Przykład 8

Wytwarzanie 3'-(2-cyjanoetylo-N,N-diizopropyloiOsforoamidytu) 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-C-metylotymidyny

Do mieszanego roztworu 5^0-(4,4-dimetoksytritylo)-3'-C-metylotymidyny (98 mg; 0,17 mmola) i diizopropyloetyloaminy (0,13 ml; 0,742 mmola) w bezwodnym dichlorometanie (2 ml) w 0°C, w atmosferze argonu, dodaje się kroplami roztwór 2'-cyjanoetylo-N,N-diizopropylochlorofosforoamidytu (85 mg; 0,36 mmola) w dichlorometanie. Powstałą mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej w ciągu 1 godziny, ochładza do 0°C, rozcieńcza zimnym CH₂Cl₃ (20 ml) i przemywa zimnym NaHC3 (3x15 ml). Warstwę organiczną suszy się nad Na2SO4, zatęża. Pozostałość oczyszcza się przez chromatografię na krzemionce (Et₃N-EtOAcheksan, 5:50:45) otrzymując 117 mg (88 %) 3'-(2-cyjanoetylo-N,N-diizopropylofosforoamidytu) 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-C-metylotymidyny w postaci piany.

144 774

Przykład 9

Wytwarzanie 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-C-aminometylotymidyny

Nasycony roztwór amoniaku w metanolu (9 ml) dodaje się do roztworu 5'-O- (4,4'-dimetoksytritylo)-3'-C,O-metylenotymidyny (901 mg; 1,62 mmola) w metanolu (3 ml), a powstały roztwór pozostawia w temperaturze pokojowej przez 3 dni. Nadmiar amoniaku i metanolu odparowuje się, a pozostałość oczyszcza przez chromatografię (CH^H-Heksany-CHCl' 1:1:8) otrzymując 414 mg (45%) 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-C-aminometylotymidyny w postaci bezbarwnego ciała stałego.

Przykład 10

Wytwarzanie 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-C-trifuoroacetamidometylotymidyny

Roztwór 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-C-aminometylotymidyny (361 mg; 0,628 mmola) i tiotrifluorooctanu etylu (490 mg; 3,12 mmola) w bezwodnym THF (6 ml) miesza się w temperaturze pokojowej przez 6 godzin. Rozpuszczalnik odparowuje się, a pozostałość oczyszcza przez chromatografię na krzemionce (5 % CH3OH w CH2Ć2) otrzymując 411 mg (98%) 5'-0-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-C-trifluoroacetamidometylotymidyny w postaci bezbarwnego proszku.

Przykład 11

Wytwarzanie 3'-(2-cyjanoetylo-N,N-diizopropylofosforoamidytu) 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-C-trifluoroacetamidometylotymidyny

Do mieszanego roztworu 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-C-metylotymidyny (411 mg; 0,614 mmola) i diizopropyloetyloaminy (0,64 ml; 3,65 mmola) w bezwodnym dichlorometanie (6 ml) w temperaturze 0°C, w atmosferze argonu, dodaje się kroplami roztwór 2'-cyjanoetylo-N,N-diizopropylochlorofosforoamidytu (410 mg; 1,83 mmola) w bezwodnym dichlorometanie. Powstałą mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, ochładza do 0°C, rozcieńcza zimnym CH2O2 (30 ml) i przemywa zimnym NaHCO₃ (3 x 20 ml). Warstwę organiczną suszy się nad Na2SO4 i zatęźa. Pozostałość oczyszcza się przez chromatografię na krzemionce (Et3N-EtOAc-CHCl3,5:30:65) otrzymując 386 mg (72%) 3'-(2-cyjanoetylo-NN-diizopropylofosforoam.idytu) 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-3'-C-trifluoroacetamidometylotymidyny w postaci proszku.

Przykład 12

Wytwarzanie 3'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-5'-formylotymidyny

Do mieszanego, zimnego roztworu 3'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)tymidyny, (wytworzonego z tymidyny zwykłymi sposobami; 40,4 g; 0,072 mola) w bezwodnym DMSO dodaje się roztwór DCC (4,86 g; 0,224 mola) w DmSo (180 ml). Powstały roztwór miesza się w 5°C przez 5 minut, dodaje pirydynę (2,94 g; 3,0 ml; 0,0371 mola), a po mieszaniu przez dalsze 5 minut dodaje się kroplami roztwór kwasu trifluorooctowego (2,11 g; 1,43 ml; 0,0185 mola) w DMSO (2 ml). Powstałą mieszaninę reakcyjną miesza się w 5°C przez 10 minut i w temperaturze pokojowej przez 6 godzin. Wodę (20 ml) dodaje się kroplami, chłodząc i miesza mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Osady sączy się i przemywa DMSO. Połączony roztwór DMSO wylewa się na pokruszony lód (4 1), mieszając. Po odstaniu przez 1 godzinę osady sączy się i przemywa dokładnie wodą. Placek filtracyjny rozpuszcza się w chlorku metylenu (500 ml) oddziela warstwę organiczną, suszy (NB2SO4) i zatęźa. Surowy produkt oczyszcza się przez chromatografię na krzemionce (3% metanol w chlorku metylenu) otrzymując 32,6 g, (81%) 3'-0-(4,4'-dimetoksytritylo)-5'-formylotymidyny w postaci bezbarwnego proszku.

Przykład 13

Wytwarzanie 3'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-4'-C-hydroksymetylotymidyny

Do mieszanego roztworu 3'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)- 5'-formylotymidyny (16,3 g; 30,07 mmola) w dioksanie (120 ml) w 0°C dodaje się kroplami, kolejno, 36% formaldehyd (24 ml) i 2NNaOH (60 ml). Powstały roztwór miesza się w temperaturze pokojowej przez 6 godzin. Mieszaninę reakcyjną ochładza się do 0°C i dodaje kroplami 10% kwas octowy w wodzie aż do osiągnięcia pH = 7,5. Mieszaninę rozcieńcza się octanem etylu (11), przemywa 10% solan.ką.(500 ml, następnie 2 x 300 ml), suszy (Na₂SO4) i zatęża. Surowy produkt oczyszcza się przez chromato18

184 378 grafię na krzemionce (EtOAc-heksan, 3:1) otrzymując 11,45 g (66,3%) 3'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-4'-C-hydroksymetylotymidyny w postaci bezbarwnego proszku.

Przykład 14

Wytwarzanie 4'-C-hydroksymetylotymidyny

Roztwór 3'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-4'-C-hydroksymetylotymidyny (6,32 g; 11,0 mmola) w 80 % kwasie octowym w wodzie (50 ml) odstawia się na 4 godziny w temperaturze pokojowej . Rozpuszczalniki usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem i dodaje wodę (200 ml). Powstałą mętną mieszaninę przemywa się eterem (3 x 80 ml) i odparowuje wodę. Pozostałość rozpuszcza się w metanolu i toluenie, a powstały roztwór zatęża się. Ten proces powtarza się dwukrotnie. Otrzymuje się 4'-C-hydroksymetylotymidynę (2,72 g, 91 %) w postaci piany.

Przykład 15

Wytwarzanie 4'-C-benzoiloksymetylotymidyny

Do mieszanego roztworu 4'-hydroksymetylotymidyny (3,72 g; 13,67 mmola) w bezwodnej pirydynie (10 ml) w 0°C dodaje się roztwór bezwodnika benzoesowego (4,64 g; 51 mmoli) w pirydynie (10 ml). Powstały roztwór odstawia się w 0°C na 1 godzinę, a następnie w temperaturze pokojowej na 20 godzin. Wodę (5 ml) dodaje się w 0°C, odparowuje pirydynę, a pozostałość chromatografuje na krzemionce (7% etanol w chloroformie) otrzymując 2,27 g (44%) 4'-C-benzoiloksy-metylotymidyny w postaci bezbarwnego ciała stałego.

Przykład 16

Wytwarzanie 3',5'-O-(bis-tetrahydropioanylo)-4'-C-hydooksymetylotymidyny

Do mieszanego roztworu 4'-C-benzoiloksymetylotymidyny (1,65 g; 4,39 mmola) i kwasu p-toluenosulfonowego (50 mg) w bezwodnym chlorku metylenu (70 ml) w 0°C dodaje się 10 kroplami dihydropiran (1,84 g; 1,89 ml; 21,80 mmola). Powstały roztwór miesza się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, dodaje 2MNaOH (20 ml) chłodząc, powstałą mieszaninę zateża, aby usunąć chlorek metylenu i dodaje dioksan (10 ml). Mieszaninę miesza się w temperaturze pokojowej przez 3 godziny i ekstrahuje chlorkiem metylenu (3 x 30 ml). Warstwę organiczną przemywa się wodą (3 x 50 ml), suszy (Na₂SO4) i zatęża. Pozostałość oczyszcza się przez filtrację na kolumnie krzemionkowej otrzymując 1,50 g (77,7%) 3', óLO^bis-tetrahydropiranylo^-C-hydroksymetylotymidyny w postaci piany.

Przykład 17

Wytwarzanie 4',C-metoksymetylotymidyny

Do mieszanej mieszaniny 3',5'-O-(bis-tetrahydropiranylo) -4'-C-hydroksymetylotymidyny (660 mg, 1,5 mmola) i wodorku sodu (60% w oleju mineralnym, 180 mg; 4,5 mmola) w bezwodnym THF (15 ml) w 0°C dodaje się kroplami jodek metylu (1,06 g; 0,46 ml). Powstałą mieszaninę miesza się w 0°C przez 1,5 godziny. Wodę (1 ml) dodaje się kroplami w 0°C i dodaje się kwas octowy doprowadzając do pH = 7. Mieszaninę rozcieńcza się octanem etylu (50 ml), przemywa wodą (3 x 30 ml), suszy (Na₂SO4,) i zatęża. Pozostałość rozpuszcza się w kwaśnej . mieszaninie (5 ml THF, 10 ml CH3COOH i 5 ml wody), roztwór odstawia w 50°C na 3 godziny, a rozpuszczalniki odparowuje się. Pozostałość rozpuszcza się w mieszaninie metanol-toluen, zatęża i powtarza powyższy proces. Po oczyszczeniu przez chromatografię na krzemionce (10% etanol w chloroformie) otrzymuje się 271 mg (63%) 4'-C-metoksymetylotymidyny w postaci bezbarwnego ciała stałego.

Przykład 18

Wytwarzanie 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-4'-C-metoksymetylotymidyny

Roztwór 4'-C-metoksymetylotymidyny (173 mg; 0,6 mmola) i chlorku dimetoksytritylu (287 mg; 0,84 mmola) w pirydynie odstawia się w temperaturze pokojowej na 5 godzin. Pirydynę odparowuje się, a pozostałość oczyszcza przez chromatografię na krzemionce (EtOAc-heksan, 2:1) otrzymując 264 mg (74%) 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-4'-C-metoksymetylotymidyny w postaci piany.

Przykład 19

Wytwarzanie 3'-(2-cyjanoetylo-N,N-diizopropylofosforoamidytu) 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-4'-C-metylotymidyny Do mieszanego roztworu 5'-O-(4,'^'^c^ii^m^e^^-^.ss^ltOt^ll—^^^C^-r^t^ecO<ί^s^lmety184 378 lotymidyny (200 mg; 0,34 mmola) i diizopropyloetyloaminy (176 mg; 236 μΐ; 1,36 mmola) w bezwodnym chlorku metylenu (3 ml) w 0°C, w atmosferze azotu, dodaje się kroplami roztwór 2-cyjanoetylo-N,N-diizopropylochlorofosforoamidytu (161 mg; 152 μΐ; 0,68 mmola) w chlorku metylenu. Powstały roztwór miesza się w temperaturze pokojowej przez 30 minut, ochładza do 0°C i rozcieńcza 5 octanem etylu (30 ml) . Mieszaninę przemywa się 10% NaHCO₃ (3 x 20 ml), suszy (Na2SO4) i zatęża. Pozostałość oczyszcza się przez chromatografię na krzemionce (Et3N-EtOAc-heksan, 5:45:50) otrzymując 190 mg (71%) 3'-(2-cyjanoetylo-N,N-diiz.opropylofosforoamidytu) 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-4'-C-metoksymetylotymidyny w postaci piany.

Przykład 20

Wytwarzanie 3',5'-(bis-t-butylodimetylosililo)-4'-C-hydroksymetylotymidyny

Do zimnego, mieszanego roztworu 4'-C-benzoilometylotymidyny (1,14 g; 3,03 mmola) i imidazolu (985 mg; 15,15 mmola) w pirydynie dodaje się roztwór t-butylodimetylo-chlorosilanu (1,37 g; 9,09 mmola) w pirydynie. Mieszaninę reakcyjną odstawia się na noc w 50°C, rozcieńcza octanem etylu (100 ml), przemywa wodą (3 x 50 ml), zatęża. Pozostałość rozpuszcza się w etanolu (10 ml) i dodaje mieszaninę, etylenodiaminy i etanolu (1:120 ml). Roztwór ogrzewa się w 50°C przez 2 dni. Etanol i etylenodiaminę odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozpuszcza w chloroformie (60 ml). Roztwór przemywa się wodą(3 x 40 ml), suszy (N2SO4) i zatęża. Pozostałość oczyszcza się przez chromatografię na krzemionce (EtOAcheksan, 1:1) otrzymując 780 mg (52%) 3',5'-(bis-t-butylodimetylosililo)-4'-C-hydroksymetylotymidyny w postaci białego ciała stałego.

Przykład 21

Wytwarzanie 3',5'-(bis-t-butylodimetylosililo)-4'-C-aminometylotymidyny

Do mieszanego roztworu 3',5'-(bis-t-butylodimetylosililo)-4'-C-hydroksymetylotymidyny (500 mg; 1,0 mmol) i pirydyny (0,4 ml) w bezwodnym chlorku metylenu (5 ml) w 0°C dodaje się kroplami mieszaninę bezwodnika trifiuorometanosulfonowego (564 mg; 332 μ1 2,0 mmole) i pirydyny (0,4 ml) w chlorku metylenu (5 ml). Mieszaninę reakcyjną miesza się w 0°C przez 30 minut i dodaje 0,5 ml 10% NaHCO3 w -10°C. Mieszaninę rozcieńcza się chlorkiem metylenu (20 ml), przemywa zimnym 10% NaHCO3 (2x30 ml), suszy (Na2SO4), zatęża i suszy pod próżniąprzez 1 godzinę. Surowy produkt rozpuszcza się w dioksanie (30 ml) i nasyca gazowym amoniakiem. Roztwór odstawia się na noc w temperaturze pokojowej, a następnie ogrzewa w 50°C przez 2 dni. Nadmiar amoniaku i dioksanu odparowuje się, a pozostałość oczyszcza, przez chromatografię na krzemionce (1% MeOH i 5% Et3N w CHO3) otrzymując 266 mg (53%), 3', 5'-(bis-t-butylodimetylosililo)-4'-C-aminometylotymidyny w postaci białego ciała stałego.

Przykład 22

Wytwarzanie 3',5'-(bis-t-butylodimetylosililo)-4'-C-trifluoroacetamidometylotymidyny

Roztwór 3',5'-(bis-t-butylodimetylosililo)-4'-C-amino metylotymidyny (260 mg; 0,52 mmola) i tiotrifluorooctanu etylu (635 mg; 0,52 ml; 4,0 mmole) w dioksanie miesza się w temperaturze pokojowej przez 5 godzin. Rozpuszczalnik odparowuje się, a pozostałość oczyszcza przez chromatografię na krzemionce (5% metanol w chloroformie) otrzymując 220 mg (71%) 3',5'-(bis-t-butylodimetylosililo)-4'-C-trifiuoroacetamidometylotymidyny w postaci białego ciała stałego.

Przykład 23

Wytwarzanie 4'-C-trifluoroacetamidometylotymidyny

Roztwór 3',5'-(bis-t-butylodimetylosililo)-4'-C-trifuoroaceltamidometylotymidyny (215 mg; 0,36 mmola) i TBAAF (1,0 M w THF, zobojętniony kwasem octowym do pH = 7,5; 0,72 ml) w THF (3 ml) odstawia się w temperaturze pokojowej na 20 godzin. Rozpuszczalnik odparowuje się, a pozostałość oczyszcza przez chromatografię na krzemionce (10% metanol w chloroformie) otrzymując 118 mg (89 %) 4'-C-trifluoroacetamidometylotymidyny w postaci bezbarwnego ciała stałego.

184 378

Przykład 24

Wytwarzanie 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-4'-C-trifuoroacetamidometylotymidyny

Roztwór 4'-C-trifluoroacetamidometylotymidyny (110 mg; 0,3 mmola) i chlorku dimetoksytritylu (152 mg; 0,45 mmola) w bezwodnej pirydynie (2 ml) pozostawia się na noc w temperaturze pokojowej. Pirydynę odparowuje się, a pozostałość oczyszcza przez chromatografię na krzemionce (EtOAc-heksan, 2:1) otrzymując 122 mg (61%) 5’-O-(4,4’-dimetoksytritylo)-4'-C-trifluoroacetamidometylotymidyny w postaci piany.

Przykład 25

Wytwarzanie 3'-(2-cyjanoetyło-N,N-diizopropylo fosforoamidytu) 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-4-C-trifluoroacetamidbmetylbtymidyny

Do mieszanego roztworu 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-4'-C-lLrifuoroacetamidometylc>tymidyny (110 mg; 0,165 mmola) i diizopropylbetylbaminy (129 mg; 174 μΐ; 1,0 mmol) w bezwodnym chlorku metylenu (3 ml) w 0°C, w atmosferze azotu, dodaje się kroplami roztwór 2-cyjanoetylo-N,N-diizopropylochlbrbfbsforoamidytu (78 mg; 74 μΐ; 0,33 mmol) w chlorku metylenu (1 ml). Powstały roztwór miesza się w temperaturze pokojowej przez 30 minut, ochładza do 0°C i rozcieńcza octanem etylu (20 ml). Mieszaninę przemywa się 10% NaHCO₃ (3x15 ml), suszy (Na2SO₄) i zatęża. Pozostałość oczyszcza się przez chromatografię na krzemionce (Et₃N-EtOAc-heksan, 5:45:50) otrzymując 137 mg (86%) 3'-(2-cyjanbetylo-N,N-diizoprbpylofosforbamidytu)5'-O-(4,4'-dimetoksytπtylo)-4'-C-metbksymetylbtymidyny w postaci piany.

Przykład 26

Wytwarzanie 3', 5'-O-(bis-t-butylodimetylbsililb)-4'-C-azydbmetylotymidyny

Do mieszanego roztworu 3',5'- (bis-t-butylodimetylosililb)-4'-C-hydroksymetylotymidyny (0,95 g, 0,19 mmola) i pirydyny (0,1 ml) w bezwodnym chlorku metylenu (1 ml) w0°C dodaje się kroplami mieszaninę bezwodnika triflubrometanbsulfonbwegb (107 mg; 0,38 mmola; 63 μΐ) i pirydyny (0,2 ml) w chlorku metylenu (2,5 ml). Mieszaninę reakcyjną miesza się w 0°C przez 30 minut, ochładza do -10°C i dodaje 0,5 ml 10% NaHCO3. Mieszaninę rozcieńcza się zimnym chlorkiem metylenu (10 ml), przemywa zimnym 10% NaHCO3 (2x10 ml), suszy (N2SO4), zatęża i suszy pod próżniąprzez 10 minut. Surowy produkt rozpuszcza się w bezwodnym DMF (1 ml) i dodaje azydek sodu (50 mg). Mieszaninę ogrzewa się w 50°C przez 14 godzin, rozcieńcza octanem etylu (20 ml), przemywa wodą(5 x 10 ml), suszy (Na2SO₄) i zatęża. Pozostałość oczyszcza się przez chromatografię na krzemionce (10% octan etylu w chlorku metylenu) otrzymując 42 mg 3',5'-O-(bis-t-butylodimetylosililo)-4'-C-azydometylotymidyny w postaci piany.

Przykład 27

Wytwarzanie T-C-azydometylotymidyny

Roztwór 3',5'-O-(bis-t-butylbdimetylosilo)-4'-C-azydometylotymidyny (25 mg) i TBAF (1,0 M w THF; 0,5 ml) w THF (1 ml) pozostawia się w temperaturze pokojowej na 30 minut. Rozpuszczalnik odparowuje się, a pozostałość oczyszcza przez chromatografię na krzemionce (6% MeOH w CH2G2) otrzymując 11 mg T-C-azydometylotymidyny w postaci bezbarwnego ciała stałego.

Przykład 28

Wytwarzanie 3'-O-t-butylbdimetylosililb-5'-dezbksy-5' -metylidenotymidyny

Zawiesina wodorku sodu (60% w oleju mineralnym, 2,88 g; 72 mmole) w bezwodnym DMSO (100 ml), po mieszaniu w 65°C przez 1,5 godziny w atmosferze azotu, zmienia się w klarowny roztwór, który ochładza się do temperatury pokojowej i przenosi do zimnej, mieszanej zawiesiny bromku metylotrifenylofosfbnibwegb (27,0 g; 75,6 mmola) w atmosferze azotu. Mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej przez 45 minut i dodaje, chłodząc, roztwór 3A)-t-butylodimetylosililo-5'-formylotymidyny (8,50 g; 24 mmole) w DMSO (40 ml). Mieszaninę reakcyjną miesza się w tem peraturze pokojowej przez 2 godziny, rozcieńcza octanem etylu (2 1), przemywa solanką(5 x 800 ml), suszy (Na2SO4), zatęża. Surowy produkt oczyszcza się przez chromątografię na krzemionce (EtOAc-heksan, 30:70) otrzymując 6,79 g (80,2%) 3'-0-t-butylodimetylosililo-5'-dezoksy-5'-metylidenotymidyny w postaci bezbarwnego ciała stałego, t.topn. 122°C (rekrystalizacja z octanu etylu i heksanu).

184 378

Przykład 29

Wytwarzanie 3'-O-t-butylodimetylosililo-5'-C,O-metylenotymidyny

Roztwór 3'-O-t-butylodimetylosililo-5'-dezoksymetylidenotymidyny (6,26 g; 17,78 mmola) i kwasu m-chloronadtlenobenzoesowego (4,61 g; 26,68 mmole) w chlorku metylenu (160 ml) miesza się w temperaturze pokojowej przez noc, rozcieńcza chlorkiem metylenu (200 ml) przemywa 10% NaHCO₃ (2 x 240 ml), a następnie solanką (160 ml), suszy (Na2SO4) i zatęża. Pozostałość chromatografuje się na krzemionce (EtOAc-heksan, 1:2) uzyskując nienaruszoną substancję wyjściową(2,25 g; 35,9%) 3'-O-t-butylodimetylosilo-5'-(S)-C,O-metylenotymidyną (3,2 g; 76%) i 3'-0-t-butylodimetylosililo-5'-(R)-C,0-metylenotymidynę (0,365 g, 8%).

Przykład 30

Wytwarzanie 3'-O-t-butylodimetyiosililo-5'-C-metoksymetylotymidyny

Roztwór 3'-O-t-butylodimetylosililo-5'-(R)-C,O-metylenotymidyny (1,84 g; 5 mmoli) i bezwodnego węglanu potasu (1,3 8 g; 10 mmoli) w metanolu miesza się w temperaturze pokojowej przez 90 godzin. Dodaje się octan etylu (70 ml) i zobojętnia mieszaninę kwasem octowym do pH = 7. Rozpuszczalniki odparowuje się, a pozostałość rozpuszcza w chlorku metylenu (30 ml). Osady sączy się, a roztwór zatęża. Pozostałość oczyszcza się przez chromatografię na krzemionce (EtOAc-heksan, 1:1) otrzymując 310 mg nienaruszonej substancji wyjściowej i 578 mg 3'-0-t-butylodimetylosililo-5'-C-metoksymetylotymidyny w postaci bezbarwnego ciała stałego.

Przykład 31

Wytwarzanie 3'-0-t-butylodimetylosililo-5'-C-trifluoroacetamidometylotymidyny

Roztwór 3'-O-t-butylodimetylosililo-5'-(R)-C,O-metylenotymidyny (0,84 g; 2,28 mmola) w metanolu miesza się z nasyconym roztworem amoniaku w metanolu (10 ml). Powstały roztwór pozostawia się w temperaturze pokojowej przez 15 godzin, a następnie odparowuje nadmiar amoniaku i metanolu. Suchą pozostałość rozpuszcza się w dioksanie (10 ml) i dodaje tiotrifluorooctan etylu (1,80 g; 11,4 mmola; 1,46 ml). Mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej przez 6 godzin, a następnie odparowuję rozpuszczalnik. Pozostałość chromatografuje się na krzemionce (EtOAc-heksan, 1:1) otrzymując 895 mg (81,8%) 3'-Θ-ί-1)ΐΚν1(^ΠΓ^1γ^ίhlo-5'-C-trifluoroacetamidometylotymidyny w postaci bezbarwnego ciała stałego.

Przykład 32

Wytwarzanie 3'-O-t-butylodimetylosililo-5'-(S)-C-cyjanometylotymidyny

Mieszaninę 3'-0-t-butylodimetylosililo-5'-C,O-metylenotymidyny (0,77 g; 2,09 mmola) i cyjanku potasu (520 mg; 8,0 mmoli) w DMF (10 ml) miesza się w temperaturze pokojowej przez 40 godzin, rozcieńcza octanem etylu (100 ml), przemywa solanką. (5 x 60 ml), suszy (Na2SO4) i zatęża. Surowy produkt oczyszcza się przez chromatografię na krzemionce (EtOAcheksan, 1:1) otrzymując 3'-O-t-butylodimetylosililo)-5'- (S)-C-cyjanometylotymidynę (580 mg, 70 %) w postaci białego ciała stałego.

Przykład 33

Wytwarzanie 3'-0-t-butylodimetylosililo-5'-(S)-C-azydometylotymidyny

Mieszaninę 3'-O-t-butylodimetylosililo-5'-(R)-C,O-metylenotymidyny (368 mg; 1,0 mmol) i cyjanku potasu (325 mg, 5,0 mmoli) w DMF (3 ml) ogrzewa się w 50°C przez 16 godzin, rozcieńcza octanem etylu (60 ml), przemywa solanką. (5 x 40 ml), suszy (N2SO4) i zatęża. Surowy produkt oczyszcza się przez chromatografię na krzemionce (EtOAc-heksan, 1:1) otrzymując 3'-O-t-butylodimetylosililo-5'-(S)-C-cyjanometylotymidynę (173 mg; 42%) w postaci białego ciała stałego.

Przykład 34

Wytwarzanie 3'-0-t-butylodimetylosililo-5'-C-allilotymidyn

Do zawiesiny bezwodnego cyjanku miedziawego (7,57 g; 84,7 mmola) w bezwodnym THF w -5°C, w atmosferze argonu, dodaje się kroplami bromek allilomagnezowy (2,0 M w THF; 46,6 ml; 93,2 mmola). Papkę miesza się przez 15 minut w -5°C i dodaje kroplami zimny roztwór 3'-O-t-butylodimetyiosiiilo-5'-foπnylotymidyny (5,0 g; 14,12 mmola) w THF (200 ml). Mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej przez 6 godzin, gasi dodając 10% NaHCO₃ (150 ml) w 0°C i rozcieńcza octanem etylu (200 ml). Warstwę organiczną przemywa się 10% NaHCO₃

184 378 (2 x 150 ml), suszy (NąSO') i zatęża otrzymując 5,18 g surowych 3'-O-t-butylodimetylosililo-5'-C-alliiotymidyn (zawierających dwa izomery: 5'-(R) i 5'-(S)). Dwa izomery (stosunek około 1:1) rozdziela się przez chromatografię na krzemionce (15% EtOAc w CHÓ3).

Przykład 35

Wytwarzanie 3'-O-t-butylodimetylosililo-5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-5'-(S)-C-metoksymetylotymidyn

Mieszaninę 3'-O-t-butylodimetylosililo-5'-C-metoksymetylotymidyny (258 mg; 0,645 mmola), chlorku dimetoksytritylu (1,09 g; 3,22 mmola) i bezwodnika soli srebrowej kwasu trifiuorometanosulfonowego (835 mg; 3,22 mmola) w bezwodnej pirydynie (3 ml) ogrzewa się w 50°C przez 18 godzin. Pirydynę odparowuję się, a pozostałość chromatografuje na krzemionce (EtOAc-heksan, 1:1) otrzymując 372 mg (82%) 3-O-t-butylodimetylosililo-5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-5'-(S)-C-metoksymetylotymidyny w postaci białego ciała stałego.

Podobnie wytwarza się następujące związki:

3-O-t-butylodimetylosililo-5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-5'-C-cyjanometylotymidynę wytwarza się z 3’-O-t-butylodimetylosililo-5’-(S)-C-cyjanometylotymidyny;

3'-O-t-butylodimetylosililo-5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-5'-(S )-C-azydometylotymidynę wytwarza się z 3'-O-t-butylodimetylosililo-5-(S)-C-azydometylotymidyny.

3'-O-t-butylodimetylosililo-5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-5'-(S)-C-allilotymidynę wytwarza się z 3'-O-t-butylodimetylosililo-5' -(S)-C-allilotymidyny.

3'-O-t-butylodimetylosililo-5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-5'-(R)-C-allilotymidynę wytwarza się z 3'-O-t-butylodimetylosililo-5'-(R)-C-allilotymidyny.

3'-O-t-butylodimetylosililo-5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-5'-(S)-C-trifluoroacetamidometylotymidynę wytwarza się z 3'-O-t-butylodimetylosiliio-5'-(S)-C-triiIuoroćκ::eetmUdomeeylotymidyny.

Przykład 36

Wytwarzanie 5'-0-(4,4'-dimetoksytritylo)-5'-(S)-C-metoksymetylotymidyn

Roztwór 3'-O-t-butylodimetylosililo-5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-5'-(S)-C-metoksymetylotymidyny (825 mg; 1,17 mmola) i TBAF (1,0 M wTHF; 3,6 ml; 3,6 mmola) w THF (15 ml) pozostawia się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, THF odparowuje się, a pozostałość chromatografuje na krzemionce (EtOAc-heksan, 3:2) otrzymując 551 mg (80%) 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-5'-(S)-C-metoksymetylotymidyn. Podobnie wytwarza się następujące związki:

5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-5'-(S)-C-cyjanometylotymidynę wytwarza się z 3'-O-t-butylodimetylosililo-5'-O-(4,4’-dimetoksytritylo)-5'-(S)-C-cyjanometylotymidyny.

5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-5'(S)-C-azydometylotymidynę wytwarza się z 3'-O-t-butylodimetylosililo-5'-O-(4,4'~dimetoksytritylo)-5'-(S)-C-azydometylotymidyny.

5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-5'-(S)-C-allilotymidynę wytwarza się z 3'-O-t-butylodimetylosililo-5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo) -5'-(S)-C-allilotymidyny.

5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-5'(R)-C-allilotymidynę wytwarza się z 3'-O-t-butylodimetylosililo-5'-0-(4,4'-dimet.oksytritylo)-5'(R)-C-allilotymidyny.

5'-O-(4,4-dimetoksytritylo)-5χS)-C-trifluoroaceearuidometylotymidynę wytwarza się z 3'-O-t-butylodimetylosililo-5'-O-(4,4,-dimetoksytritylo)-5’-(S)-C-trifiuoroacetamidometylotymidyny.

Przykład 37

Wytwarzanie 3'-(2-cyjanometylo-N,N-diizopropylofosforoamidytu) 5'-O-4,4'-(dimetoksytritylo)-5'-(S)-C-metoksymetylotymidyn

Do roztworu 3'-O-t-butylodimetylosililo-5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-5'(S)-C-metoksymetylotymidyny (490 mg; 0,83 mmola), diizopropyloetyloaminy (646 mg; 0,87 ml; 5,0 mmoli) w bezwodnym dichlorometanie (5 ml) w 0°C, w atmosferze azotu, dodaje się kroplami roztwór 2-cyjanoetylo-N,N-diizopropylochlorofosforoamidytu (592 mg; 2,5 mmola; 558 μΙ) w dichlorometanie (1 ml). Roztwór miesza się w temperaturze pokojowej przez 40 minut, ochładza do 0°C, rozcieńcza dichlorometanem (60 ml), przemywa zimnym 5% NaHCO3 (3 x 40 ml), suszy (Na₂SO') i zatęża. Pozostałość oczyszcza się przez chromatografię na krzemionce (Et₃N-EtOAc-heksan, 5:45:50) otrzymując 584 mg (89%) 3'-(2-cyjanoctylo-N,N-diizopropylofosforoamidytu) 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo) -5'-(S)-C-metoksymetylotymidyn w postaci piany.

184 378

Podobnie wytwarza się następujące związki:

3'-(2-cyjanoetylo-N,N-diizopropylofosforoamidyt) 5' -O-(4,4'-dimetoksytritylo)-5'-(S)-C-cyjanometylotymidyny wytwarza się z 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-5'(S)-C-cyjanometylotymidyny

3'-(2-cyjanoeeyjo-N,N-diizopropylofosforoamidyt) 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-5'-(S)-C-azydometylotymidyny wytwarza się z 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-5'-(S)-C-azydometylotymidyny.

3'-(2-cyjanoetylo-N,N-diizopropylofosforoamidyt) 5' -O- (4,4'-dimetoksytritylo)-5'-(S)-C-allilotymidyny wytwarza się z 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-5'-(S)-C-allilotymidyny.

3'-(2-cyjjmoetylo--N,N-diizopropylofosforoamidyt) 5' -O-(4,4'-dimetoksytritylo)-5'-(R)-C-allilotymidyny wytwarza się z 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-5'-(R)-C-allilotymidyny.

3'-(2-cyjanoetylo-N,N-diizopropylofosforoamidyt) 5'-O-(4,4'-dimetoksytritylo)-5'-(S)-C-trifiuoroacetamidometylotymidyny wytwarza się z 5'-O-(4,4'-dimetOksytritylo)-5'- (S)-C-trifiuoroacetamidometylotymidyny.

Przykład 38

Wytwarzanie 1'-cyjano'3'-t-butylodimetylosililo-5' -(4,4'-dimetoksytritylo)tymidyny r-Cyjano-5'-(4,4'-dimetoksytritylo)tymidynę w bezwodnej pirydynie dodaje się do mieszanego roztworu t-butylodimetylochlorosilanu (1,5 równoważnika) i imidazolu (3,0 równoważniki) w bezwodnej pirydynie w 0°C. Powstałą mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej przez noc. Pirydynę odparowuje się, a pozostałość rozpuszcza w octanie etylu, przemywa solanką. Surowy produkt używa się bezpośrednio do następnej reakcji.

Przykład 39

Wytwarzanie 3'-t-butylodimetylosililo-5'-dimetoksytritylo-1 '-formylo-5-metoksybenzylotymidyny

3'-t-Butylodimetylosililo-1'-cyjano-5'-dimetoksytritylo-5-(p-metoksybenzylo)tymidynę (1,0 mmol) w THF dodaje się do mieszanego roztworu wodorku litowotrietoksyglinowego (2,0 mmole) w THF w -20°C, w atmosferze azotu. Mieszaninę reakcyjną mieszą się w 5 - 10°C przez 1 godzinę, gasi wodnym roztworem chlorku amonu. Mieszaninę ekstrahuje się octanem etylu, a surowy produkt chromatografuje na krzemionce.

Przykład 40

Wytwarzanie 1'-amido-3',5 ',5-tris(metoksybenzylo)tymidyny r-Amido-3',3'.5-tris(metoksybenzylo)tymidynę dodaję się do mieszanego roztworu wodnego 30% nadtlenku wodoru i węglanu sodu w 0°C. Mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, rozcieńcza wodą, zobojętnia rozcieńczonym kwasem solnym, ekstrahuje dichloro-metanem. Surowy produkt oczyszcza się przez chromatografię.

Przykład 41

Wytwarzanie 1'-amino-3',5',5-tris(metoksybenzylo)tymidyny

Sposób wytwarzania jest podobny do opisanego w literaturze (Radhakrishna, A.S., Parkam, M.E., Riggs, R.M. i London, G.M., J. Org. Chem., 1979, 44,1746). 1'-Cyjano- 3',5',5-tris(metoksybenzylo)tymidynę (1,0 mmol) w bezwodnym THF dodaje się do mieszanego roztworu J,J-bis(trifluoro-acetoksy)jodobenzenu (2,0 mmole) w THF w 0°C. Mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej przez 5 godzin, rozcieńcza dichlorometanem, przemywa 5% węglanem sodu i solanką. Surowy produkt oczyszcza się przez chromatografię.

P r zy k ł a d 42

Wytwarzanie bromku trimetylo-3',5',5-tris(metoksybenzylo)tymidyn- Γ-yloamoniowego r-Ammo-3',5'.5-tris(metoksybenz.ylo)tymidynę dodaję się do mieszanego roztworu bromku metylu (10 równoważników) w THF w 0°C. Mieszaninę reakcyjną miesza się w 50°C przez noc. Rozpuszczalnik odparowuję się, a surowy produkt oczy szcza przez rekrystalizację.

Przykład 43

Wytwarzanie 1'-bromo-3',3',5-tris(metoksybenzylo)tymidyny

Sposób jest podobny do opisanego w literaturze (Deady, L. W., Korytsky, O.L., Tetrahedron Lett., 1979, 451). Bromek trimetylo-3',5',5-tris(metoksybenzylo)tymidyn-1-yloamoniowy

144 774 ogrzewa się w 150°C pod próżniąprzez noc. Powstały produkt używa się bezpośrednio do następnej reakcji.

Przykład 44

Wytwarzanie 1'-etoksy-3',5',5-tris(metoksybenzylo)tymidyny

1'-bromo-3,5',5-tris(metoksybenzylo)tymidynę w etanolu dodaje się do mieszanego roztworu etoksylanu sodu w etanolu w -10°C. Powstałą mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, zobojętnia rozcieńczonym kwasem solnym. Etanol odparowuje się, a pozostałą mieszaninę ekstrahuje octanem etylu. Surowy produkt oczyszcza się przez chromatografię otrzymując mieszaninę α i β diastereoizomerów/.

Podobnie wytwarza się następujące związki:

1'-(4-Nitrobutoksy)-3',5',5-tris(metoksybenzylo)tymidynę z 1'-bromo-3',5',5-tris(metoksybenzylo)tymidyny i 4-nitrobutanolu-1.

1'-Etylotio-3',5',5-tris(metoksybenzylo)tymidynę z 1'-bromo-3',5',5-tris(metoksybenzylo)tymidyny i tioetoksylanu sodu.

Przykład 45

Wytwarzanie 1'-aminotymidyny

Zawiesinę T-amino-3',5',5-tris(metoksybenzylo)tymidyny i 10% pallad na węglu drzewnym, w etanolu wytrząsa się w aparacie do uwodorniania pod ciśnieniem wodoru 50 psi przez 24 godziny. Ciało stałe sączy się, a przesącz zatęża. Surowy produkt oczyszcza się przez rekrystalizację.

Przykład 46

Wytwarzanie oligonukleotydów o zmodyfikowanych cukrach

Ten przykład objaśnia użycie Związku 55 (Rysunek 8) do syntezy losowego oligonukleotydu o sekwencji:

5' -d(ATC TCT CCG CTT CTT* TT* C)-3'

W tej sekwencji A, C, G i T oznaczają niemodyfikowane dezoksyrybonukleozydy, a T* oznacza 5'-C-aminometylotymidynę. Oligonukleotyd w tym przykładzie został zsyntezowany przy pomocy aparatu ABI394 Synthesizer. Wszystkie nukleozydy są włączone przy użyciu chemii fosforoamidytu. Włączenie dA, dC, d6 i T prowadzi się stosując typowe reagenty syntezy DNA i typowe sposoby. Z uwagi na zawadę przestrzenną rozgałęzionego podstawnika w pozycji C5', włączenie T* prowadzi się stosując dłuższy czas sprzęgania (5 minut). Po syntezie, obróbkę zsyntetyzowanego oligonukleotydu prowadzi się typowym sposobem. Surowy oligonukleotyd oczyszcza się na kolumnie z odwrotną fazą C18 aparatu Beckmana do HPLC, stosując bufor TEAA (pH =7,0) i acetonitryl jako fazę ruchomą. Uzyskuję się 62,4 ODs oczyszczonego oligonukleotydu.

Podobnie zsyntetyzowano następujące losowe oligonukleotydy o zmodyfikowanych cukrach:

5'-C-rozgałęzione oligonukleotydy o zmodyfikowanych cukrach:

1. 5' -TTCCTGTCTGATGGCTTC-3'

2. 5 '-XXCCTGTCTGATGGCTTC-3'

3. 5 '-TTCCTGTCXGATGGCTTC-3'

4. 5 '-ATCTCTCCGCTTCCTTTC-3'

5. 5 '-ATCTCTCCGCTTCCTTXC-3'

6. 5' -ATCTCTCCGCTTCCTXXC-3'

7. 5' -ATCTCXCCGCTXCCTTTC-3'

8. 5' -ATCTCTCCGCTTCCTTYC-3'

9. 5' -ATCTCTCCGCTTCCTYYC-3'

10. 5' -ATCTCTCCGCTTCCYTYC-3'

11. 5' -AYCTCYCCGCTYCCTTYC-3'

12. 5' -ATCTCTCCGCTTCCTTZC-3'

13. 5' -ATCTCTCCGCTTCCTZZC-3'

14. 5' -ATCTCTCCGCTTCCZTZC-3'

184 378

15. 5' -ATCTCTCCGCTTCCTTVC-3'

16. 5'-ATCTCTCCGCTTCCTWC-3'

17. 5' -ATCTCTCCGCTTCCVTVC-3'

18. 5' -ATCTCVCCGCVTCCTTTC-3'

19. 5' -AVCTCTCCGCTTCCTTTC-3'

20. 5' -ATCTCTCCGCTTCCTTWC-3'

21. 5' -ATCTCTCCGCTTCCTWWC -3'

22. 5' -ATCTCTCCGCTTCCWTWC-3'

23. 5' -ATCTCWCCGCWTCCTTTC-3'

24. 5' -AWCTCTCCGCTTCCTTTC-3'

X = 5'-(S)-C-metoksymetylotymidyna,

Y - 5'-(S)-C-aminometylotymidyna,

Z = 5'-(S)-C-cyjanometylotymidyna,

Y = 5'-(S)-C-allilotymidyna i

W = 5'-(R)-C-allilotymidyna.

4'-C-Rozgałęzione oligonukleotydy o zmodyfikowanych cukrach:

25. 5' -ATCTCTCCGCTTCCTTTC-3'

26. 5' -ATCTCTCCGCTTCCTTXC-3'

27. 5' -ATCTCTCCGCTTCCTXXC-3'

28. 5' -ATCTCTCCGCTTCCXTXC-3'

29. 5' -AXCTCTCCGCTTCCTTTC-3'

30. 5' -ATCTCXCCGCTXCCTTTC-3'

31. 5' -ATCTCTCCGCTTCCTTYC-3'

32. 5' -ATCTCTCCGCTTCCTYXC-3'

33.5' -ATCTCTCCGCTTCCYTXC-3'

34. 5' -AYCTCTCCGCTTCCXTXC-3'

35. 5'-ATCTCYCCGCTYCCTTTC-3'

X - 4' -C-metoksymetylotymidyna,

Y = 4' -C-aminometylotymidyna.

3'-C-Rozgałęzione oligonukleotydy o zmodyfikowanych cukrach:

36. 5' -ATCTCTCCGCTTCCTTTC-3'

37. 5' -ATCTCTCCGCTTCCTTXC-3'

38. 5' -ATCTCTCCGCTTCCTXXC-3'

39. 5' -ATCTCTCCGCTTCCXTXC-3'

40. 5' -ATCTCTCCGCXTCCTTTC-3'

41. 5'-AXCTCTCCGCTTCCTTTC-3'

42. 5' -ATCTCTCCGCTTCCTTYC-3'

43. 5' -ATCTCTCCGCTTCCTYYC-3'

44. 5' -ATCTCTCCGCYTCCTTTC-3'

45. 5' -AYCTCTCCGCTTCCXTXC-3'

46. 5' -ATCTCYCCGCTYCCTTTC-3'

47. 5' -ATCTCTCCGCTTCCTTZC-3'

48. 5' -ATCTCTCCGCTTCCTZZC-3'

49. 5' -ATCTCTCCGCTTCCZTZC-3'

X = 3' -C-aminometylotymidyna,

Y = 3' -C-metylotymidyna,

Z = 3' -C-cyjanometylotymidyna.

Włączenie Odnośników

Wszystkie opisy patentowe, zgłoszenia patentowe i publikacje cytowane w opisie są włączone jako odnośniki.

184 378

Równoważniki

Powyższe pisemne specyfikacje uważa się za wystar czające, aby umożliwić osobom obeznanym ze stanem techniki praktyczne wykorzystanie wynalazku. W istocie, różne modyfikacje opisanego powyżej wynalazku, oczywiste dla obeznanych z dziedziną chemii organicznej lub pokrewnymi dziedzinami, uważa się za zawarte w zakresie następujących zastrzeżeń.

184 378

Claims (14)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Nukleozydy o zmodyfikowanych cukrach, o strukturze w którym B oznacza tymidynę, i X oznacza O;

   R,' oznacza CN, CHO, CONH2, NfCHjh, CH2-alkil, lub atom wodoru;

   R2 oznacza atom wodoru;

   R3 oznacza grupę OH, = O gdy R3' nie istnieje, CH=CH2, blokującą grupę hydroksylową epoksyd etylenowy, lub O-P(O-(CH2)CN) (N(iPrh);

   R3' oznacza atom wodoru, CH3 lub CH2Y, gdzie Y oznacza CN, OH, hydroksylową grupę blokującą NHCOCF3, NH2 lub N3;

   R4' oznacza CH2Z, gdzie Z oznacza OCH3, NH2, N3, NHCOCF3, OH, blokującągrupę hydroksylową lub atom wodoru;

   R₅ oznacza grupę OH, hydroksylową grupę blokującą nie istnieje gdy R5' oznacza CH=CH2, lub R₅ i R5' razem oznaczają epoksyd etylenowy;

   R₅'oznacza atom wodoru, CH=CH2, lub CH2-W, gdzie W oznacza OCH3, NHCOCF3 CN; i z tym założeniem, że gdzie X oznacza O i R3', R4' i R5' oznaczają atom wodoru, R,' nie oznacza atomu wodoru; z dalszym założeniem, że gdy X oznacza O, R,, R4' i R5' oznaczają atom wodoru, R3 jest inny niż atom wodoru.
2. 2. Związek według zastrz. 1, w którym R,' oznacza CN, CHO, CONH2, N(C^h, lub CH2-alkil, i w którym R3 i R5 oznaczają OH, blokującągrupę hydroksylową, i w którym R2 i R3' oznaczają atom wodoru.
3. 3. Związek według zastrz. 2, w którym R4' oznacza atom wodoru.
4. 4. Związek według zastrz. 3, w którym R5' oznacza atom wodoru.
5. 5. Związek według zastrz. 1, w którym R3' oznacza CH3 lub CH2Y, gdzie Y oznacza CN, OH, hydroksylową grupę blokującą NHCOCF3, NH2, lub N3, w którym R3 oznacza OH lub blokującą grupę hydroksylową, i w którym R5 oznacza OH lub blo^ny^^i^g^pę hydroksylową
6. 6. Związek według zastrz. 5, w którym R3 oznacza OH.
7. 7. Związek według zastrz. 6, w którym R,' oznacza atom wodoru.
8. 8. Związek według zastrz. 1, w którym R4 oznacza CH2Z, gdzie Z oznacza OCH3, NH2, N3, NHCOCF3, OH, blokującą grupę hydroksylową i w którym R3 oznacza grupę OH lub blokującągrupę hydroksylową! w którym R₅ oznacza grupę OH lub blokującą grupę hydroksylową.
9. 9. Związek według zastrz. 8, w którym Rf oznacza atom wodoru.
10. 10. Związek według zastrz. 9, w którym R3 i R5 oznacza OH.
11. 11. Związek według zastrz. 1, w którym R₅' oznacza CH=CH2 lub CH2-W, gdzie W oznacza OCH3, NHCOCF3, lub CN, i w którym R₁' oznacza atom wodoru i R3 oznacza grupę OH lub hydroksylową grupę blokującą.
12. 12. Związek według zastrz. 11, w którym R4' oznacza atom wodoru.
13. 13. Związek według zastrz. 12, w którym R3 oznacza grupę OH.

    184 378
14. 14. Oligonukleotyd zawierający nukleozyd określony w zastrzeżeniu 1

    Obszar wynalazku.