JPH05504960A - 内皮細胞の増殖抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 内皮細胞の増殖抑制剤 新しい毛細血管の形成（脈管形成）は、整然とした順序で進行する、即ち、新し い血管技（Ｇｅｆａｌｓｐｒａβ）が生長開始する点（大抵は血管後細静脈の範 囲内）で、内皮細胞は局所的に基底膜を崩壊し、血管形成を刺激する因子の出所 の方向に移動し、生長しかつ分裂し、血管腔を形成し、他の血管技又は生じる毛 細管の上に達して、新しい毛細管部分が生じ、最後に、この囲りを新しく形成さ れた基底膜が取り囲む。

生長性固体においては、通常、脈管形成作用は殆ど完全に抑制されている。創傷 治癒の際にのみ及び女性における排卵周期と関係してのみ、激しい脈管形成過程 が進行する。しかしながら、一般には、臓器中での内皮細胞の変換速麿は僅かで ある。生じる内皮細胞ポピユレーションの完全な新生は、数年もかかるが、この 場合には、明確な臓器−及び組織特異的な差異が生じる［Ｆｏｌｋｍａｎ、１ｌ ｅｄｉｃｉｎｅ　２９　（１９８５）　、１０〜３６］。

脈管形成が通常生じるこの厳しい制御は、固定腫瘍の生長時には取り止められて いる。１〜２ｍｍの直径の腫瘍の生長のためには、強方な脈管形成が絶対必要で ある。

血管の腫瘍は、即ち、ガス及び栄養物の供給時及び廃物除去の際の限られた拡散 により、非常に僅かな大きさに限定されている。固定腫瘍の、脈管形成の必要誘 導の不存在時に、臨床的に有意な大きさまで生長するため又は転移を形成するた めの能力の不足は、脈管形成を抑制する化合物の研究の際には、非常に興味を惹 起した。

このような開始剤の産業上の利用性は、一般に腫瘍生長の抑制時に、一般に、殊 に、内皮細胞の基礎となる腫瘍例えばカポシ肉腫及び血管腫の抑制時に特に存在 する。更に、過剰な毛細管生長に帰因しているその他の病気の際の治療的使用性 もある。殊に、この場合、糖尿病性網膜症及び水晶体後方線維増殖、両眼眼病が 挙げられる。更なる使用可能性は、創傷治癒の場合であり、この際、脈管形成の 抑制剤が創傷治癒の調節のために使用でき、即ち、血管の新生を遅延させる際に 使用できる。更に、リウマチ性関節炎の治療の分野における脈管形成抑制剤を使 用することも可能である。この病気の場合には、軟骨の脈管化（例えば、この範 囲での炎症時の）が観察され、これは、脈管形成抑制剤で抑止されつる。

血管組織から、一連の脈管形成抑制性エキスが製造された［Ｄ’＾ｍｏｒｅ及び ＢｒａｕｎｈｕｔのＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅ１ｌｓ。

Ｍｏ１．　ＩＩ　、Ｕ、Ｓ、　Ｒｙａｎ、ＣＲＣＰｒｅｓｓＳＢｏｃａ　Ｒａｔ ｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ、　１３−３７］、消炎作用物質［Ｒｏｂｉｎ等、＾ｒｃ ｈ、　Ｏｐｈｔｈａｍｏｌ、　１　０　３　（１９８５）　、２　８　４−２８ 　７　；　Ｐｏ１ｖｅｒｉｎｊ及びＮｏｖａｋ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙ ｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、　１４０　（１９８６）　、９０１−９０７１　、例え ばプロタミン［ＴａｙｌＯｒ及びＦｏｌｋｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ　２９７　（１ ９８２）　、３０７−３１２］、脈管静止性ステロイド［Ｃｒｕｍ等、５ｃｉｅ ｎｃｅ２３０　（１９８５）、１３７５−１３７８１　、胎盤性ＲＮＡ５ｅ−抑 制剤［５ｈａｐｉｒｏ及びＶａｌｌｅｅｌＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８４　（１９８７）、２２３８−２２４１］及びマトリックス 合成及び安定性に影響をする一連の化合物［例えばＩｎｇｂｅｒ及びＦｏｌｋｍ ａｎ、　Ｌａｂ、　Ｉｎｖｅｓｔ。

５９　（１９８８）　、４４−５１１　も、脈管形成を抑制する。これら抑制剤 のいくつかにおいては、腫瘍生長の阻止又は生体内での減少が確認されたが、全 ての腫瘍においてではない。更に、これらの脈管形成抑制剤の毒性の問題も残っ ている。

Ｒａ５ｔｉｎｅｊａｄ等［Ｃｅ１ｌ　５６、（１９８９）　、３４５〜３５５］ は、生体内での新脈管化を阻止する脈管形成抑制剤を、ハムスター細胞及びハム スター雄バイブリド細胞を有する媒体中に発見した。この化合物は明らかに、分 子量１４０ＫＤを有する糖蛋白質である。

しかしながら、この抑制剤も、低い安定性を示し、殊にこれは、熱安定性ではな い。

従って、本発明の課題は、安定であり、かつ治療に良好に使用可能な脈管形成抑 制剤を製造することであった。

本発明の課題は、ベビーハムスター腎臓細胞（ＡＴＣＣＣＣＬＩＯ）から入手さ れ、自然条件下でのゲル濾過時に約６０〜１００ＫＤの分子量を有し、大きい熱 安定性を示す内皮細胞の増殖の抑制剤として作用する蛋白質により解決される。

本発明における抑制剤とは、トリプシン及びキモトリプシンを用いる消化の際に 、内皮細胞増殖に対するその抑制作用が完全に破壊される蛋白質である。この抑 制剤は、それ自体が６０℃で４５分加熱の後にも、その当初活性の少なくとも５ ０％を有するので、熱安定である。天然の形におけるその分子量は、ゲル濾過実 験から得られた。更に、本発明の蛋白質は、これはヘパリン−セファロースに結 合せず、こうして、内皮細胞に関するヘパリン結合性の生長因子から分離できる ことにより優れている。

この抑制作用の立証は、ＢＡＥ−増殖テストで行った。更に、牛大動脈からの内 皮細胞（Ｂ　Ａ　Ｅ　Ｃ＝　ｂｏｖｉｎｅ　ａｏｒｔｉｃ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉ ａｌ　ｃｅｌｌｓ）を、変法増殖試験で、抑制剤の活性測定のために使用した。

更に、本発明の目的は、ベビーハムスター腎臓細胞（ＡＴＣＣＣＣＬＩＯ）から 、本発明の蛋白質を得る方法である。細胞の培養は、牛胎児血清の添加のもとで 、生長媒体中で、充分に集合性の細胞芝（Ｚｅｌｌｒａｓｅ）に達するまで行っ た。引続き血清不含媒体中で培養媒体のコンディショニングを有利に２〜３週間 、試験管壁からの細胞芝の剥離の増加が認められるまで行う。次いで、プロテア ーゼ処理、有利にトリプシン／ＥＤＴＡ−処理によるベビーハムスター腎臓（Ｂ ＨＫ）−細胞の完全剥離及び個々の細胞の再懸濁及び集合（Ｋｏｎｆｌｕｅｎｚ ）に至るまでの改めての培養を行う。

ＢＨＫコンディショニングされた媒体からの抑制剤の単離の第１工程は、有利に 、限外濾過であり、この際、ｌ０ＫＤの公称排除限界を有する限外濾過膜を使用 する。この場合、濾液を捨て、残留物中の蛋白質を、引続き硫酸アルミニウムー 沈殿に供する。

このために、硫酸アンモニウムを約７５％飽和に達するまで添加すると、本発明 の蛋白質は沈殿する。この沈殿物を遠心分離により取得し、再等濁させ、適当な 緩衝液に対して透析させる。

ＢＨＫ−細胞でコンディショニングされた媒体中の内皮細胞増殖の抑制剤の存在 は、ＢＡＥ−テストで媒体の１０倍濃縮の後に既に認識可能である。媒体中での 全抑制活性は、７５％飽和における硫酸アンモニウム−沈殿により沈殿すること ができる。

引続き、場合によっては、ヘパリン−セファ０−スでのアフィニティクロマトグ ラフィにより精製を行うことができる。このことは、ヘパリンに結合する脈管形 成活性化剤もしくは抑制剤の分離のために役立つ。

更に精製するために、カラムに結合しない蛋白質を使用する。

更なる精製の次の工程として、Ｑ−セファロースでのアニオン交換体−クロマト グラフィを行うのが有利である。本発明の蛋白質は、アニオン交換体カラムに結 合し、適当な緩衝剤特に５０ｍモル／ｌトリスーＨＣ１ｐＨ７，５）中の０〜１ モル／１Ｎａｃｌ塩勾配を用いて溶離させることができる。

この記載条件下で、抑制剤は、０．２４〜０．３２ＭのＮａｃｌ−濃度でカラム から溶離される。

Ｑ−セファロースを用いるここに記載の慣用のクロマトグラフィに対して二者択 一的に、この工程は、Ｍ。

ｎｏＱ’ＩＯ／１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／　Ｌ　Ｋ　Ｂ　：　Ｆｒｅｉ ｂｕｒｇ）でのＦＰＬＣによっても実施することができる抑制活性を有するアニ オン交換−クロマトグラフィのフラクションを集め、限外濾過により４６倍まで 濃縮する。この濃縮さ・れた試料を、引続き、ゲル濾過カラム有利にＴ　Ｓ　Ｋ 　ＨＷ　５５　Ｓ　（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）上に装入し、結合した 蛋白質を溶離剤としてのＰＢＳを用いて再びカラムから除去する。

ＴＳＫＨＶ１５５８−材料でのゲル濾過は、更なる精製効果をもたらさないが、 これにより、抑制剤の分子量は約６０ＫＤａまで測定できた。これと並行して実 施された同じ緩衝剤条件下で、ＦＰＬＣを用い、スペロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ）　１２−カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／　ＬＫ　Ｂ　；　Ｆｒｅｉｂｕｒｇ） でのゲル濾過は、同じ結果をもたらした。

このゲル濾過の後に、抑制活性を有するフラクションを混合した牛血清アルブミ ン（ＢＳＡ）は、引続くアフィーゲルーブルー（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ−Ｂｌｕｅ） でのクロマトグラフィにより除去することができた。それというのも、抑制剤の 大部分はこの物質により結合されないからである。この工程は、ヘパリン−セフ ァロース−クロマトグラフィに直接又はイオン交換体工程に接続することもでき る。

引続き、ＨＰＬ’Ｃ−装置、有利にＨＩＣ−スフエロゲルＣＡＡ−カラム１００ 　Ｘ　４．６　ｒｒＬｎ　（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　ＭＬ ｌｎｃｈｅｎ）での疎水性相互作用（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉ。

ｎ）−クロマトグラフィを行う。試料に、有利に３モル／ｌの高濃度硫酸アルミ ニウムを付与する。結合した物質の溶離は、線状逆勾配塩を用いて行う。この工 程の後の抑制活性を立証するために、溶離後のフラクションを、２０ｍモル／ｌ トリスー１’１ｃｌｐＨ７，５）１ｍ対して透析させるべきである。

この工程は、抑制剤を富化させ、同時に混入蛋白質を分離除去するもう１つの有 効な方法である。抑制剤は、選択された条件下で、マトリックスに結合し、勾配 の開始後２１〜２３分でカラムから溶離される。

本発明の方法の後に存在する最終生成物は、なお少量の異種蛋白質を含有する。

しかしながら、更なる精製工程により、純粋な生成物を得ることができ、これで 、アミノ酸部分配列を決定することができる。これから、なお、ＤＮＡ−オリゴ ヌクレオチド−プローブを製造することができ、これにより、ｃＤＮＡ又はゲノ ム　ＤＮＡを介して、抑制剤の全アミノ酸配列を決定することができる。この方 法は、分子生物学の分野の専門家には周知である。

本発明の蛋白質を得るための出発物質として、新生児組織有利にベビーハムスタ ー腎臓細胞（ＡＴＣＣＣＣＬＩＯ）を使用することができる。それというのも、 この新生児組織は、成熟組織よりもかなり高い濃度の抑制剤を含有するからであ り、この際、成熟組織が概してこの抑制剤を含有するかは疑わしい。

更に、本発明の目的は、作用物質としての本発明の蛋白質並びに慣用の充填剤、 担持剤及び／又は助剤を含有する医薬品である。

本発明による蛋白質は、上昇した脈管形成が起こる前記のような全ての病気の処 置の際に使用することができる。殊に、本発明による蛋白質は、腫瘍生長例えば カポシ肉腫又は血管腫の抑制のため、上昇性の毛細管生長が現われる眼病殊に糖 尿病性網膜症及び水晶体後方線維増殖、並び、にり、ウマチ性関節炎の場合又は 創傷治癒の調節のために使用することができる。

体重１ｈｖ当りの本発明の蛋白質の有利な用量は、μ９〜最大ｍｇの範囲にある べきである。

次の実施例につき、本発明を詳述する。

例１ 細胞培養液 コンディショニングされた媒体の製造のために、ＢＨＫ−２１型の細胞（ＡＴＣ ＣＣＣＬ　１０）を使用した（通過１５０−１５９）。

細胞の培養 ＢＨＫ−細胞を、まずＤＭＥＭ／Ｆ　１２−媒体（１：　１　：　Ｇ　Ｉ　Ｂ　 ＣＯ、Ｐａ１ｓｌｅｙ、５ｃｈｏｔｔｌａｎｄ）中の生長面積７５ｃｍ２を有す るコスタ−細胞培養面に、５％牛脂児血清（Ｆ　ＣＳ　、　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の添加のもとに接種し、細胞の集合まで、恒温筒中、３ ７℃で、ｃｏ、７％及び水分９５％でインキュベートした。

集合の達成後に、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ−処理により溶解させ、ＤＭＥＭ ／Ｆ　１２＝媒体中に入れ、遠心分離しく　［Ｉａｒｅｕｓ、　１０００　ｕｐ Ｈで５分間）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２−媒体中に再懸濁させ、生長面積１６５ｃｒｒ Ｌ２を有するコースタ−細胞培養面中に移した。前記と同じ条件下で、集合に達 するまで細胞のインキュベーションを行った。

生長面１１６５　ｃｍ２を有する細胞培養面の細胞を、再びトリプシン／ＥＤＴ Ａ−処置により溶解させ、５０ｍ１　ＤＭＥＭ５０ｍｌ／Ｆ１２−媒体、５０％ ＦＣＳ、１０ｍＭＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，５）中に再懸濁させ、生長面積９００ ｃｍ”を有する細胞培養−ローラびん（コースタ−）中に移した。このローラび んを、被覆せずに又は、ゼラチンで被覆の後に使用した。培養は、ローラびん中 に移した細胞の培養媒体（下記参照）のコンディショニングと同様に、ローラ系 （１゜５ｕ、ｐ、ｍ）上でかつ、Ｆａ　・Ｔｅｃｎｏｔｓａｒａ社のＶｉｓ＋＊ ａｒａ−恒温箱上で、３７℃で、二酸化炭素の吹込みなしで行った。ＢＨＫ−細 胞の培養媒体のコンディショニングは、ローラびん中の細胞が充分に集合した細 胞芝を形成した後にはじめて開始した。ここまでは、培養媒体（ＤＭＥＭ／Ｆ　 １２．５％ＦＣ３，１０モル／１ＨＥＰＥＳ、　ｐＨ７，５）を３日毎に交換し た。

培養媒体のコンディショニング ローラびん中のＢＨＫ−細胞を、血清不含の媒体（ＤＭＥＭ／Ｆ　１２、ｌｏｍ モル／ｌ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７，５）５０ｍｊ！中で、４〜６時間洗浄し、洗液 を捨て、媒体２００ｍ１を加える。その都度２００ｍＡ’の血清不含媒体を用い る培養媒体のコンディショニングは、３７℃で７２時間及び１．５ｕｐｍ、　２ 〜３週間、細胞芝の試験管壁からの剥離の増加が認められるまで行った。

この時点で、ＢＨＫ−細胞は、トリプシン／ＥＤＴＡ−処理により完全に試験管 壁から剥離され、ばらばらになるから、１００ｍｌ　ＤＭＥＭ／Ｆ　１２．５％ ＦＣ８及び１０　ｍ　ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ中に再懸濁させ、２個のローラビン中に 同量充分け、ここで、１．１．１に記載のように再び、集合するまで培養した。

このコンディショニングされた培養媒体から遠心により剥離された細胞を除き、 無菌濾過の後に４℃で保持した。

例２ ＢＨＫ−コンディショニングされた媒体からの抑制剤２、１．１　限外濾過 コンディショニングされた媒体４〜６１を、ミニタン（Ｍｉｎｉｔａｎ）限外濾 過装置（Ｍｉｌｌｐｏｒｅ　ＧｍｂＦＩ、Ｅｓｃｈｂｏｒｎ）を用いて、当初量 の１／１０量まで濃縮した。限外濾過膜として、公称排除限界（Ｎｏｍｉｎｅｌ ｌｅｎ　Ａｕ５ｓｃｈｌＵβｇｒｅｎｚｅ）　１０　ｋ　Ｄ　ａを有する再生セ ルロースからのＰＧＬＣ型のＨ（夏１１１ｐｏｒｅ　ＧｍｂＨｌＥｓｃｈｂｏｒ ｎ）を使用した。濾液を捨て、硫酸アンモニウム−沈殿の残留物中の蛋白質を保 持した。

２、１．２．　硫酸アンモニウム−沈殿コンディショニングされた媒体を更に濃 縮するために、限外濾過の残留物に、ｐＨを６．５に調整の後に、絶えず撹拌し ながら固体硫酸アンモニウム（２３２゜２ｇ／ｆニア５％飽和）を少量宛添加し 、蛋白質を１晩沈殿させた。沈殿物を、２００００９で３０分間の遠心により取 得し、冷蒸留水１００〜１５０　ｍ　ｌ！中に溶かし、ＰＢＳ　（ｐＨ７，５） ３ｘ５１に対して透析させた（　Ｖｉｓｋｉｎｇ−透析ホースの公称排除限界： １２〜１４ＫＤａ　；Ｆａ−Ｒｏｔｈ社）。この透析の間に生じた少量の沈殿を 、次の精製工程の前に、遠心により除去した。

ｌｘ５ｃｍカラム中のヘパリン−セファロース（Ｐｈａｒｔｒａｃｉａ／ＬＫＢ 、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）を、ＰＢＳで平衡化させ（流速：　４０ｍｊ！／ｈ）　、 ＰＢＳに対して透析された同じ流速の物質を、カラム上に装入した。カラムに結 合しない蛋白質を更に精製することな（使用した。

ヘパリン−セファ０−スにより結合されなかった物質を、５０ｍモルトリス／Ｈ Ｃｌ−緩衝液（ｐＨ７，５）で３倍量まで希釈し、２５０　ｍ　ｌ　／　ｈでＱ −セファロース・ファスト・フｏ　−（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫＢ、Ｆｒｅｉ ｂｕｒｇ）充填カラム（５０ｍモル／ｌトリス／ＨＣｌ−緩衝液、ｐＨ７，５で 平衡化）上にポンプ導入した。導入緩衝液でのカラムの洗浄の後に、結合した蛋 白質を、５０ｍモル／ｌトリス／ＨＣｌ−緩衝液（ｐＨ７，５）中のＮａＣ１０ 〜１モル／ｌの直線勾配塩（含量＝１６００ｍｌ）を用いて溶離させた。

抑制活性を有するアニオン交換−クロマトグラフィのフラクション（例３、ＢＡ Ｅ−テスト参照）を集め、アミコン限外濾過室（＾ｍ１ｃｏｎ　Ｕｌｔｒａｆｉ ｌｔｒａｔｉｏｎｓｋａｍ−ｅｒ）中で、４０倍に濃縮した（アミコンのＰＭＩ Ｏ限外濾過液）。

この濃縮された試料を、引続きＰＢＳ中で平衡化されたＴＳＫＨＷ５５ｓ−カラ ム（Ｍｅｒｃｈ、　Ｄａｒｍｓｔａｄｔ；１．５Ｘ７０ｃｍ）上に装入し、溶離 液としてのＰＢＳを用い、流速２０　ｍ　ｌ　／　ｈでクロマトグラフィを実施 クロマトグラフィによるＢＳＡの除去 ２．４の工程からの活性フラクションを集め、同量の２０ｍモル／１燐酸ナトリ ウムー緩衝液（ｐＨ６゜８）で希釈し、同じ緩衝液で平衡化されたアフイーゲル ーブルー力ラム（５０〜１００メツシｓ　；　Ｂｉｏ［ｌａｄ；１．５　Ｘ　ｌ 　２ｃｒｎ）上に、４９　ｍ　ｊ’　／　ｈの流速で装入した。結合しなかった 殆ど完全なりＳＡ不含の物質を、次の工程で更に使用した。

コノ工程を、コントロン社（Ｆｉｒａ＋ａ　Ｋｏｎｔｒｏｎ、Ｅｃｈｉｎｇ）の ＨＰＬＣ−装置を用いて実施した。

２．５の工程からの結合しなかった物質の部分量４ＴｒＬｌを、セントリコン（ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）　ｌ　Ｑ−又はセントリコン３０−マイクロコンセントレ ータ−（Ｍｉｋｒｏｋｏｎｚｅｎｔｒａｔｏｒｅｒ＋：＾ｍ１ｃｏｎ）上で１５ ０〜２００ｕｌまで濃縮し、ＨＩＣ−スフヱロゲルＣＡＡ−カラム（１０Ｑ　ｘ 　４　、５　ｍ　ｍ　；　Ｂｅｃｋｍｅｎｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　ＭＬ ｌｍｃｈｅｍ）上に、硫酸アンモニウム濃度３モル／ｌｃ緩衝液として５０ｍモ ル／ｌ燐酸ナトリウムｐＨ６，８）で装入した。結合した物質の溶離は、５０ｍ モル／ｌ燐酸ナトリウム／　１　ｍモル／１酢酸ナトリウム（ｐＨ６，８）後の ３０モル／ｌ燐酸アルミニウム／　５０　ｍモル／ｌ燐酸ナトリウム（ｐＨ６， ８）の直線状逆勾配塩を用いて、３５分間実施した。

ＢＡＥ−テスト（１，３参照）での抑制活性を立証するために、このフラクショ ンを、２０ｒｒＬモル／ｌトリス／ＨＣ１（ｐＨ７，５）に対して透析させるべ きであった。

例３ ＢＡＥ−増殖テストでの抑制剤の立証 中大動脈からの内皮細胞（Ｂ　Ａ　Ｅ　Ｃ＝　ｂｏｖｉｎｅ　ａｏｒｔｉｃｅｎ ｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ）を変法増殖試験で内皮細胞−抑制剤の同定の ために使用した。コースタ−多重培養シャーレのウェル（シャーレ１個当り２４ 個のウェル）１個当り、ＤＭＥＭ、５にＦｅ２中のＢＡＥＣ６０００〜９０００ を接種し、７％二酸化炭素含有恒温箱中、３７℃で、１晩インキユベートした。

次の日に、付着しなかった細胞を、媒体交替（ＤＭｆ　／　ｍ　ｌ媒体）により 除去した（培養媒体にＦＧＦを添加することにより、内皮細胞は、その増殖を対 照値に比べて１．５〜３倍刺激する核分裂刺激を得る）。

抑制剤の存在を試験すべき各フラクション００４ｍ１までを、培養シャーレのそ れぞれ２個のウェルにピペソド導入しく二重測定）、恒温筒中で７２時間インキ ュベートの後の細胞数を、クールターカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｕｎｔ ｅｒ）中で測定した。

抑制活性フラクションを、６０℃で１０分間もしくは４５分インキュベートし、 次いで滅菌濾過し、ＢＡＥ−テストで、なお存在する活性を試験した。

４．２　プロテアーゼ−敏感性 抑制性フラクションＱ、１ｍｊ’を、２０　ｍ　Ｍ　トリス／ＨＣｌ−緩衝液（ ｐＨ７，５）中で、９０分間、トリプシン（Ｓｉｇｍａ）又はキモトリプシンＡ 　４　（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ）０．０５ｍｐと共に３７℃でインキュベートした 。

引続き、アプロチニン（Ｓｉｇｍａ）の添加により、試料の消化を停止させ、試 料を滅菌濾過し、ＢＡＥ−テストで試験した。

寄託セルラインＡＴＴＣＣＣＬＩＯは、１９６５年６月１０日に、Ａｍｅｒｉｃ ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（１２３０１Ｐａｒｋ ｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｏｖｉｌｌｅ、１ｌａｒｙｌａｎｄ２０８５２ −１７７６、ＵＳＡ）に前記名称で寄託した。

要　約　書 ベビーハムスター腎臓細胞（ＡＴＣＣＣＣＬＩＯ）から得られ、自然条件下での ゲル濾過時に６０〜１００ＫＤの分子量を有し、６０℃での熱安定性を有する、 内皮細胞の増殖抑制剤としての作用をする蛋白質並びに、その富化法及び病気の 処置のためのその使用国際調査報告 １−ｍ−１＝−−＋　１ｌＨｋ！−−−＋ｉ−，ＰＣＴ／ＥＰ　９１１００３８ Ｂ

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．ベビーハムスター腎臓細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１０）から入手され、内皮細胞 の増殖抑制剤としての作用をする蛋白質において、これは、自然条件下でのゲル 濾過時に、６０〜１００ＫＤの分子量を有し、６０℃での熱安定性を有すること を特徴とする、内皮細胞の増殖抑制剤としての作用を有する蛋白質。
2. ２．６０℃で４５分間の処置の際に、なお７０％のその当初活性を有する、請求 項１記載の蛋白質。
3. ３．ヘバリン−セファロースには結合しない、請求項１又は２記載の蛋白質。
4. ４．胚子細胞のコンディショニングされた媒体からの蛋白質を、濃縮及び硫酸ア ンモニウム沈殿により取得し、引続き、更に精製を行う、請求項１から３までの いずれか１項記載の蛋白質を冨化する方法。
5. ５．胚子細胞として、ベビーハムスター腎臓細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１０）を使用 する、請求項４記載の方法。
6. ６．媒体の濃縮を、公称排除寸法１０ＫＤを有する膜を用いる限外部濾過により 行い、硫酸アンモニウムの添加による硫酸アンモニウム沈殿を、約７５％飽和に 達するまで行い、この際、沈殿中に蛋白質が存在する、請求項４又は５記載の方 法。
7. ７．更なる精製を、アニオン交換体−クロマトグラフィ及び疎水性相互作用クロ マトグラフィを包含する複数クロマトグラフィ工程を用いて実施する、請求項４ ，５又は６記載の方法。
8. ８．付加的に、ヘバリン−アフィニティクロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグ ラフィ及び／又はアフィーゲル−クロマトグラフィを実施する、請求項４から７ までのいずれか１項記載の方法。
9. ９．作用物質としての請求項１，２又は３に記載の蛋白質、場合により慣用の担 持剤、助剤及び／又は充填剤を含有する、医薬品。
10. １０．毛細管生長の抑制が必要である病気の処置のために、請求項１，２又は３ 記載の蛋白質を使用すること。
11. １１．腫瘍、リウマチ性不整脈、糖尿病性綱膜症及び水晶体後線維増殖症の処置 のために請求項１，２又は３記載の蛋白質を使用すること。
12. １２．創傷治癒のため、血管の新形成を調節するするために、請求項１，２又は ３記載の蛋白質を使用すること。