JPH02288899A - 成熟肝実質細胞増殖因子（ｉ） - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〕 本発明は成熟肝実質細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔ
ｅｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：　　ＨＧ　Ｆ　）　、
詳しくは成熟肝実質細胞を生体外（ｉｎνｉ　ｔｒｏ）
で培養でき、これにより該細胞の維持、増殖を可能とす
る新しい生理活性を有するタンパク質に関するものであ
る。本発明の成熟肝実質細胞増殖因子は肝再生促進薬、
抗慢性肝炎薬、肝硬変への移行防止薬としての使用かで
きる。

〔従来の技術］ 肝臓は多種多様な機能を有し、生体の恒常性糾持に欠く
べからざる重要な役割を果たしている。

肝臓の主な機能として血漿タンパク質の合成分泌、糖新
生やグリコーゲン代謝による血糖調節、尿素合成、胆汁
分泌、解毒なとがある。また該肝臓の機能は、肝臓を構
成する該実質細胞が夫々担っていることが知られている
。しかるに生体内（ｉｎｖｉｖｏ）において、肝臓は各
種のホルモンをはじめとする極めて複雑な環境下におか
れており、これを構成する」二記成熟肝実質細胞の機能
などの研究は甚だ困難である。従って本発明者は、」二
記成熟肝実質細胞を、生体内と同等の機能を層１持した
状態で、単純な生体外の系で再現することができれば、
」１記した肝機能の研究、あるいは種々のホルモン類薬
物なとの成熟肝実質細胞に対する作用等の研究に極めて
有用であるとの観点から、上記成熟肝実質細胞を安定に
紙代培養できる体外培養系の確立を目的として鋭意研究
を重ねてきた。成熟肝実質細胞は、各種の株細胞が活発
に増殖する削孔動物血清の存在下でも全く増殖が認めら
れず、通常約１週間で脱落が起り、その生体外での長期
培養が不可能であった。本発明者は、血清に含まれる特
定のタンパク質成分の存在下において、成熟肝実質細胞
が極めて良好に増殖し、継代培養を行いうろことを見出
し、該特定の血清成分の分離に成功した（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、月招（
Ｎｏ、３）、　１４５０〜１１５９．１９８４）。更に
本発明者は、削孔類動物の血小板のトロンビン刺激上清
液より特定のタンパク質性の成熟肝実質細胞増殖因子（
ＨＧＦ）を単離することに成功し、これが生体外におい
て成熟肝実質細胞増殖活性を有することを見出し、この
知見を先に公表した（ＦＥＢＳ　ＬＥＴＴＥＲ２２４（
Ｎｏ、２）、　３１１〜３］、６．１．９８７）。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明者は、引き続き鋭意研究を重ねた結果、哺乳動物
の血小板や白血球などの血球細胞や肝臓、腎臓、肺臓、
胎盤、脳、ｌＩＩ！！臓などの生体組織ホモジネート中
にも、成熟肝細胞を生体外に於いて極めて良好に増殖さ
れる活性を有する物質が存在することを見出した。該物
質を精製、単離すべく種々検討を行ったところ、上記生
体組織中に含まれる成熟肝細胞増殖因子（ＨＧＦと略す
）にはα￥、＋ｉとβ鎖とを名付けた２種のザブユニ・
ノドからなる２本鎖型成熟肝細胞増殖因子（ＨＧＦ（Ｔ
）と略す）と１本鎖型成熟肝細胞増殖因子（］（ＣＦ（
Ｕ）と略す）の２種類が存在することを見出した。これ
ら２種のＨＣＦを分離し、それイれの生物学的及び化学
的物性を明らかにすることか期待された。

１課題を解決するための手段〕 すなわち本発明は、成熟肝実質細胞を生体外で増殖させ
る活性を有する熱及び酸処理に不安定なタンパク質で、
２種のザブユニッｌからなり、かつ、下記の理化学的性
質を有するポリペブチ１−からなる］（ｆＴ；Ｆ（Ｉ）
に係る。

（Ｉ）β鎖の次表のアミノ酸配列 Ｖ−Ｖ−Ｎ−Ｇ−１−Ｐ−Ｔ−Ｘ−Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｗ （式中、■はバリン、Ｎはアスパラギン、Ｇはグリシン
、■はイソロイシン、Ｐはプロリン、Ｔはトレオニン、
ＷはトリゾＩ・ファン、Ｘは任意のアミノ酸を示す。） （ｉｉ）還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量α　
賀ｉ　　　　６０，０００±３，０００β　鎖　　　３
２．０００±３，０００そして、具体的なＨＧＦ（Ｉ）
として、下記の理化学的性質を有するラット血小板由来
のＨＧＦ（Ｉ）（木頁以下余白） （Ｉ）次表のアミノ酸組成（モル比±１０％）ロイシン
、Ｋはリシン、Ｙはチロシン、Ｒはアルギニン、Ｈはヒ
スチジン、Ｃはシスティンを示す。） （ｉｉｉ　）還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量
α　鎖　　　６０，０００±３，０００β鎖　３２，０
００±３，０００ 下記の理化学的性質を有するラン１へ肝細胞由来のＨＣ
；　Ｆ　（Ｉ）、 （ｉ）　　β鎖の次表のアミノ酸配列 （ｉｉ）次表のアミノ酸配列 β−鎖 （式中、■はバリン、Ｎはアスパラギン、クリシン、１
はイソロイシン、ＰはゾロリＴはトレオニン、Ｑばグル
タミン、ＷはＩ・トファン、Ｍはメチオニン、Ｓはセリ
ン、Ｇ番Ｊ ン、 リプ Ｉ、ば −Ｗ （式中、■はバリン、Ｎはアスパラギン、Ｇはグリシン
、■はイソロイシン、Ｐはプロリン、Ｔはトリオニン、
Ｑはグルタミン、Ｗはトリプトファンを示す。） （ｉｉ）還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量α　
ｆＩｉ、６０，０００±３，０００β鎖　３２，０００
±３，０００ 及び下記の理化学的性質を有するヒト胎盤由来のＨＣ；
Ｆ（Ｉ） （りβ鎖の次表のアミノ酸配列 Ｖ−Ｖ−Ｎ−Ｇ−１−Ｐ−Ｔ−Ｒ−Ｔ−Ｎ−ＩＣ，−Ｗ
−Ｍ−Ｖ−３−Ｌ−Ｒ−Ｙ （式中、■はバリン、Ｎはアスパラギン、Ｇはクリシン
、■はイソロイシン、Ｐはプロリン、′１゛はトレオニ
ン、Ｒはアルギニン、ＷはトリプＩ・ファン、Ｍはメチ
オニン、Ｓはセリン、■、乙よｒ：１イシン、Ｙはチロ
シンを示す。） （Ｉ１）還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ６ｍよる推定分子■α
　鎖　　　６０．０００±３０００ β　鎖　　　３２．０００±３０００ が挙げられる。

ＨＧ　Ｆの従来の調製方法は、血小板のトロンヒン刺激
」二清液を出発物質として、陽イオン交換クロマトグラ
フィー→ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー→
逆相クロマトグラフィー系列での精製によるものであっ
た。ＦＥＢＳ　ＬＥＴＴＩｉＲ，２２４（Ｎｏ、２）、
　３１１〜３１６．１９８７参照のこと。

上記方法により得たＨＧＦばＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）て約８２　Ｋ、Ｄ
の位置に単一のハンドとして移動し、又還元化ＳＤＳ−
ＰＡＣ；Ｅで約６９ＫＤと約３４ＫＤの２木のハントと
じて移動することにより、２種の４ノ−ブユニットより
なる物質と考えられてきた。本発明者は、血小板のホモ
ジネートを硫安塩析後、陽イオン交換クロマトグラフィ
ー、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー、逆相
クロマ）・グラフィーで精製することによりあらたにＩ
　Ｃ，Ｆを得た。

本発明者は該方法で得たＨ　Ｇ　ＦがＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で約８０ＫＤの位置に単一なハントとして移動し、還元
化ＳＤＳ−ＰＡＣ，Ｅては約９０１（Ｄ及び約６０ＫＤ
、約３２ＫＤの３木のハントとして移動することを確認
した。すなわち該ＨＧ　Ｆは分子量約８万の２木鎖ＨＧ
Ｆ（ＨＧＦ（Ｉ））と１木鎖ＨＧＦ（ＨＣ；Ｆ（ＩＩ）
）の２成分よりなることをあらたに見出したのである。

本発明者は更に、該ＨＧ　Ｆを還元アルキル化して逆相
Ｃ４１１ＰＬＣにかげ電気泳動的に均一なＨＧ　Ｆ（Ｉ
）の２種のサブユニット（分子量約６０ＫＤのα鎖ペプ
チドと分子量約３２ＫＤのβ鎖ペプチド）画分を得（第
１図）、β鎖のＮ末※：；１アミノ酸配列を決定、その
エイコザペプチ］Ｓ合成物に対する抗体カラムを精製手
段として用いることによりＩ−Ｉ　ＣＦ　（＋　）を単
離した。本発明は、初めて均質なＨＧ　Ｆ　（Ｉ　）を
あたえるものである。本発明者は、ＨＣＦ　（Ｉ）β鎖
次表の２０個のベプタイドを合成、そのポリクローナル
抗体、更には抗体カラムを作成した。木発明者は、血小
板のホモシネ−１〜を硫安塩析後カチオン交換クロマト
グラフィー、次いで上述の抗体アフィニティークロマト
グラフィーにかげ、均質なＨＧ　Ｆ　（Ｉ）を調製する
ごとに成功した。更に本発明者は、］−ＩＩＧ　Ｆの臓
器分布を検索したところ、白血球などの血球細胞や肝臓
、肺臓、腎臓、肺臓、脳、胎盤など広く生体組織にＨＧ
Ｆが含まれていることを見出した。これらの生体組織の
ポモジ不一１・からイオン交換クロマトグラフィー、色
素アフィニティークロマトグラフィー、レクチンアフィ
ニティークロマトグラフィー、ヘパリンアフィニティー
クロマトグラフィー、逆相クロマ１−グラフィーなどを
組合わせた方法で精製し、ＳＤＳＰＡＧＥで約８０ＫＤ
の単一ハンドを示ずＨＧ　Ｆを得た。このＨＧ　Ｆは還
元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで、血小板ホモシネ−１−
から精製した場合と同様、約９０ＫＤ、約６０ＫＤと約
３２ＫＤの３木のハンドとして移動した。即ち、血小板
をはじめとする種々の生体組織ホモシネ−Ｉ・に由来す
るＨ　Ｇ　Ｆば２本鎖型１１ＯＦ（Ｉ）と１本鎖型ＨＧ
Ｆ（ＴＩ）の２成分よりなることを見出したのである。

本発明者はＨＧＦ（Ｉ）をより簡便に単離する方法を更
に横側したところ、疎水性クロマトグラフィーの一種で
あるフェニル５Ｐ−高速液体クロマトグラフィーにより
、均質なＨＧＦ（Ｉ）を得ることに成功し、本発明を完
成させるに至った。

本発明のＨＣＦ（Ｉ）は、外科手術による部分肝摘出後
の肝再生促進薬ならびに急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変へ
の移行、劇症肝炎などの肝疾患の治療薬として、また上
記各疾患の診断薬として有用である。更に該ＨＧ　Ｆ　
（Ｔ）の利用により、ヒトをはじめとして各種動物由来
の成熟肝実質細胞を、該ＨＧＦ（Ｉ）存在下に生体外で
極めて容易に増殖、維持することか出来、かくして増殖
維持される成熟肝実質細胞は、例えば肝機能などの基礎
的研究用に、また、各種ホルモン若しくは薬剤等の成ｙ
）肝実質細胞に対する作用の研究用に、肝疾患などのス
クリーニング試験用に、更に発癌試験用及び肝炎ウィル
スの生体外培養におりる宿主細胞としても極めて有用で
ある。本発明は、かかる有用′／：Ｉ：生理活性物質を
提供するものである。

以下、本発明のＨＣＦ　（Ｔ）の製造方法につき詳述す
る。本発明ＨＧＦ（Ｉ）は、例えば哺乳動物の血小板等
の生体組織より効率よく、しかも高収率で単離すること
が出来る。ここで原料として用いられる哺乳動物の血小
板等の生体組織としては、特に限定はなく、例えばヒ）
・、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラッ
トなどに由来する血小板等の生体組織のいずれをも使用
することができる。これらの血小板等の生体組織は、そ
の起源とする咄乳動物より、常法に従い分離される。

本発明ＨＧ　Ｆ　（Ｉ）は、」二記により分離されたＩ
ｆｌｌ小板等の生体組織のホモシネ−１−を精製するご
とにより単離される。Ｉ−Ｉ　ＣＦ　（Ｉ）の精製は、
該ＨＧＦ　Ｏ）の物理的、化学的、免疫学的性質を利用
した各種分離手段の組み合せにより実施することができ
る。特に好ましい精製手段の一例としては、塩析法及び
イオン交換クロマトグラフィー、抗体アフィニティーク
ロマトグラフィー、色素アフィニティークロマトグラフ
ィー、レクチンアフィニティーク１つマＹ・グラフィー
、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水性り１コマトゲラ
フイー、逆相クロマトグラフィー、ヘパリンアフィニテ
ィークロマトグラフィーを組み合せた方法を例示できる
。塩析には硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩
を使用することができる。また該イオン交換クロマトグ
ラフィーに用いられる担体としては、タンパク質分離の
ために用いられている通常の各種イオン交換クロマトグ
ラフィー用の担体を、いずれも用いることができる。そ
の具体例としては、ＣＭ−セルロース、ＣＭ−セファデ
ックス、Ｐ−セルロース、Ｃ門−トヨパール、５Ｐ−１
−ヨパール、モノＳＸ　Ｓ−セファロース、ＤＥＡＩＥ
−セファロース、ＤＩＥＡＨ−セファデックス、０−セ
ファロース等のイオン交換樹脂を例示できる。抗体アフ
ィニティークロマトグラフィーに用いられる担体として
は、例えばアフィゲル、トワパール、セファロースなと
の各種の不溶性担体に、抗体を共有結合により不溶化さ
せた担体であれば、いずれも使用できる。

上記精製手段により精製された本発明の１１ＧＦ（Ｉ）
は、通常のタンパク質の純度検定手段、例えば５Ｏ３−
ＰＡＧＥ、逆相高速液体クロマトグラフィーなどにより
、均一な単品であることが確認される。

〔実施例〕

以下に参考例及び実施例を示し、本発明をより具体的に
述べるが、本発明はこれに限定されるものではない。

参考例１ （ＨＣＦ活性の測定そのＩ）：Ｎａｋａｍｕｒａ、　Ｔ
、、　ｅｔ　ａｌＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、ｌｌ５Ａ、、８０．７２２９〜７２３３（Ｉ９８３
）　。

ウィスター系雄ラット（Ｉ８０〜２００ｇ）を用い、１
ｎｓｉｔｕ　コラ−ケン潅流法（Ｔａｎａｋａ、に、、
ｅｔ　ａｌ、　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、（ＴＯＫＹＯ）　８４，９３７〜９４
６（Ｉ９７８）、　　中村敏−初代培養肝細胞実験法、
学会出版センター　ｐｐ５〜５３　（Ｉ９８７）　）に
より肝実質細胞を分離、精製した。

この肝実質細胞を５％生血清及び１０−’Ｍインスリン
を添加したウィリアムスＥ培地（フロー・ラボラトり一
社製）に懸濁させ、ウェルマルチプレート　（リンブロ
ン社製）に３．３Ｘ１０’個／ウェルの低濃度でまき込
み、５％炭酸ガス及び３０％酸素ガスの存在下で培養し
た。培養４時間後、培地を１０−９Ｍデキサメサゾンを
含む無血清ウィリアムスＥ培地に交換した。２０時間後
、さらに同−培地交換及び所定量の被験試料（本発明Ｈ
ＧＦ（Ｉ）又は他の各種増殖因子）の添加を行った。１
２時間後、３１］−チミジンの２．５　ｔｌ　Ｃ４／ｍ
ｌ　（５４，２Ｃ４／ｍ　ｍｏｌ）を添加し、さらに２
４時間培養した。尚上記３１１−チミジンによるラヘル
の１５分前に、アフィディコリンの５μｇ／ｍｌを添加
した群をコントロール群とした。

上記２４時間の培養によるラベル後、細胞をＰＢＳで洗
い、冷１０％Ｉ・リクロル酢酸（ＴＣＡ）水溶液で固定
した。細胞を１ウェル当り０．５ｍｌのＩＮ−水酸化す
ｌ・リウム水溶液で可溶化し、一部をとってタンパク質
をローリ−法に従って測定した。残液にＴＣＡを２０％
になるように添加し、ＴＣＡ不溶性画分を遠心沈澱によ
り集め、５％ＴＣＡ水溶液で洗浄後１０％ＴＣＡ水溶液
１ｍｌを加え、９０’Ｃで１５分間煮沸し、」−清画分
の放射能を１−ルエンーエタノール系シンチレータ−に
より測定した。被験試料により成Ｗ）肝実質細胞に取り
込まれた３１１−チミジン量を、コントロールとのカウ
ントの差として求め、これを成熟肝実質細胞１　ｍｇタ
ンパク質当りに換算して、ＤＮＡ合成活性（ｄｐｍ／ｍ
ｇタンパク）とし、これを被験試料のＨＧＦ活性の指標
とした。尚、ＨＧ　Ｆ　活性を単位（Ｕ）で示す場合は
、同一試験においてト）ＣＦ　２０％ｇ／ｍｌを用いた
場合のＤＮＡ合成活性（ＥＧＦは該用量で最大活性を示
す）の５０％に相当する活性を１単位として定義する。

参考例２ （ＨＧ　Ｆ活性の測定その２） ＨＧ　Ｆ活１生は、また、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　、八
ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８０．７２２９　（Ｉ９８３）
に記載の方法に順して次のように測定した。ウィスター
系ラットからコラ−ケン還流法によって肝実質細胞を分
離精製した。得られたラット肝実質細胞を５％ウシ血清
、２Ｘ１０−９閃インスリンおよび２Ｘ１０−９Ｆ　デ
キサメサゾンを添加したウィリアムスＥ培地（フローラ
ポラトリ社）に懸濁し、２４ウエルマルチプレートに１
．２５×１０５個／ウェルの濃度で播いた。５％ＣＯ２
および３０％０□および６５％Ｎ、の存在下、３７°Ｃ
で２０時間培養後、０．１μｇ　／　ｍｌのアプロチニ
ンを添加したウィリアムスＥ培地に交換すると同時に所
定量の被試料を添加した。１５時間後、１５μＣ４／滅
の２５１デオキシウリジン１０μｌ／ウエルを添加した
。コン］・ロール群には、　１′Ｉデオキシウリジン添
加の１５分前に５μｇ　／　ｍｌのアフィディコリンを
添加した。さらに６時間培養した１２５Ｉでラヘルした
。細胞をｐＨ７，４のＰＢＳで２回洗浄後、冷１０％ト
リクロロ酢酸水溶液（ＴＣＡ）で固定した。細胞を１ウ
ェル当り０　、５　ｖｒＲのＩＮ水酸化ナトリウム水溶
液で可溶化し、その放射能をガンマカウンターにより測
定した。また放射能測定後の試料の１部をとってローリ
−法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

１９３、２６５．１９５１）に従い蛋白量を測定した。

被験試料を添加したとき肝実質細胞に取り込まれた２５
Ｊの量をコントロールとのカウントの差として求め、こ
れをラッＩ・肝実質細胞蛋白質１ｍｇ当りに換算して、
ＤＮＡ合成活性（ｃｐｍ／ｍｇ蛋白質）とした。被験試
料のＨＧ　Ｆ活性は、同一試験において上皮細胞成長因
子（Ｅ　Ｇ　Ｆ　）　Ｉｏｎ（Ｈ／　ｍＱを用いた時の
肝実質細胞のＤＮＡ合成活性の５０％に相当する活性を
１単位と定義して表示した。

参考例３ （抗ＨＧ　Ｆ　（Ｉ）抗体カラム作成法）β鎖次表の２
０個、即ちＶ−Ｖ−Ｎ−Ｇ−１−ＰＴ−Ｑｌ−Ｔ−Ｔ−
Ｖ−Ｇ−Ｗ−Ｍ−Ｖ−３−ＬＫ−Ｙ−Ｒよりなる合成ペ
プチＦ　（ＨＣＦ　（、Ｉ　）・１．２０）は、ペプチ
ド合成装置（ＡＢＩ社４３０Ａ型）を用いて、フェニル
アセトアシドメチル（ＰＡＭ）　　リンカ−を有するレ
ジン（ＡＢＩ社製）上で合成した。固相からの合成ペプ
チドの切断は、トリフルオロメタンスルポン酸（ＴＦＭ
ＳＡ）法により行い、得られた粗合成ペプチドを、逆相
高速液体クロマトグラフィーにより精製した。次に水溶
性カルボジイミドを用いたＹ、　ＩＫＥＤＡらの方法（
Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ。

ｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、　１０７．６５６
〜６６２（Ｉ９８２））に従い、該ＨｃＦ（Ｉ）・ｌ７
２０とキーホールリンベットヘモシアニン（ＫＬＨ）を
結合させ、ＨＧＦ（Ｉ）・Ｌ２０−ＫＬＨを抗原として
、常法に従いウサギ皮下に１００μｇ宛２週問おきに３
回免疫した。３回投与２週間後に全採血し、抗血清を得
て、該抗血清をプロティンＡ−セファロースカラムに負
荷し、０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐ＋＋　２．０で溶
出される両分を、１８６画分として精製した。続いて、
この１８６画分を旧。

１１−セファロースカラムにかけ、抗に１．１１抗体を
吸着し、抗ＨＣＦ　（Ｉ　）・１，２０抗体を得た。常
法に従い、ブロムシアン（ＣＮＢｒ）活性セファロース
ＣＬ−４８＋ｆＪｌｌｔｊ（ファルマシア社製）に抗Ｈ
Ｇ　Ｆ　（Ｉ）・Ｌ２０抗体を結合させ、抗ＨＧ　Ｆ　
（Ｉ）抗体カラムを作成した。

実施例１ ■　血小板抽出液の調整： １２００匹のラット（２００〜４００ｇ）から採取した
血液を遠心分ＦＩＡＩ　（２５００ｇ　Ｘ　１５分）し
て血小板を沈査として得た。血小板沈査を５００ｍ　ｌ
　の０．５ｍＭＰＭＳＦを含むＰＢＳ　（リン酸緩衝化
生理食塩水、　ｐＨ７，０）に懸濁させ、ポリトロンホ
モジナイザー（ダイアル７）で５分間ボモジナイスした
。ボモシネートは２／Ｉ　０００×ｇで３０分間の遠心
分離を行い、上清を得た。

氷上清液のＨＧＦ活性（参考例１の方法で測定した）は
１１００ｕ／ｍｌの添加量で２．４　Ｘ　１０’ｄｐｍ
　／　ｍｇ肝細胞タンパクであった。全活性は１３６．
０００ユニツト、比活性は３３．３ｕ／ｍｇタンパク質
であった。

■　上記■で得た上清液に硫酸アンモニウムを８０％飽
和になるように添加して、４°Ｃで一夜放置後、２４、
ＯＯＯＸｇ、３０分間の遠心分離を行い沈査を得た。

沈査を緩衝液Ａ　［５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｔｌｃＩ（ｐ
Ｈ８，５）　　０．１５ＭＮａＣ１，］ＯｍＭ　１ｌｅ
ｐｅｓ、　　２ｍＭ　ＣａＣｌ□］　３００ｍ１　に）
容解させ、同一緩衝液で一夜透析した。透析後２４．’
０００Ｘｇ、３０分間の遠心分離を行い、不溶物を除去
し、上清を得た。

■　得られた遠心上清を緩衝液Ａで充分平衡化したＳ−
セファロースＦａｓｔ　Ｆｌｏｗカラム（２，６Ｘ３０
ｃｍファルマシア社製）に３０ｍ１／ｈの流速でかけた
。緩衝液Ａでカラムをよく洗浄し、八２゜０工が０．１
以下にまで低下したところで０．１５からＩＭＮａＣｌ
の直線濃度勾配でＨＧＦ（Ｉ）を溶出した。溶出のさい
の流速は３５ｍ１／ｈで１フラクション８ｍｌのサイズ
で集めた。その結果を第２図に示す。図において縦軸（
Ｉ）は２８０ｎｍにおける吸光度（八２８０）を（２）
はＨＧ　Ｆ（Ｉ）活性（参考例１の方法で測定した）を
、また（３）はＮａＣｌ濃度を各々示し、横軸はフラク
ションＮｏ、を示ず。該図よりＨＧＦは約０．６８１’
ｌのＮａＣｌ濃度（フラクションＮｏ、３４〜４０）に
溶出された。

■　上記のフラクションＮｏ、３４〜４０の両分を５０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）にて３倍希釈し、
０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含む１０ｎ＋Ｍ　　トリス塩酸
緩衝液（ｐｌ＋　７．４）で平衡化した抗ＨＣＦ　（Ｉ
）　、Ｌ２０抗体セファロースＣ１、−４Ｂカラム（ヘ
ッドボリューム１ｍ１）に負荷、０．５Ｍ−ＮａＣ１含
有１０ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ４，０）で洗浄
後８Ｍ尿素を含む１０ｍＭ　　ｈ　’Ｊス塩酸緩衝液（
ｐＨ７，４）で溶出を行った。結果を第３図に示す。図
において、縦軸（Ｉ）は２８０ｎｍにおける吸光度（７
１２８０）を、（２）はＨＧ　Ｆ　（Ｉ　）活性（参考
例１の方法で測定した）、横軸はフラクションＮｏを示
す。該図よりフラクションＮｏ、　８〜１２にＨＣＦ　
（Ｉ）を得た。

■　上記■〜■の精製工程の結果を下記第１表に示す。

第１表 ■　また上記■の工程で得られたＨＧＦ（Ｉ）の肝実質
細胞増殖に与える効果（ＨＧＦ（Ｉ）活性）の用量依存
効果を下記第２表に示す。

（木頁以下余白） 第２表 ■　ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＣ，Ｅ） １２．５％アクリルアミドを用い、ラメリらの方法（Ｌ
ａｍｍｅｌｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕ’ｒｅ、、２７
７、６８０〜６８５（Ｉ９７０））に従ツーＣ１上記■
で得、ｌ’、：　Ｉ（ＣＦ　）Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　
ＧＥを行った。泳動後、ゲルを４０％メタノール１０％
酢酸で９０分間固定し、１０％エタノール−５％酢酸で
洗浄後、銀染色を行った。ＨＧ　Ｆ　（Ｉ）は、単一の
ハンドとして染色され、その相対移動度より約ＥＩＯＫ
Ｄの分子量を有すると推定された。また還元ＳＩ）　Ｓ
　−Ｐ　Ａ　ＧＥは試料に２メルカプトエタノール（２
ＭＥ）を５％加えて、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥと同様の
方法にて実施した。非還元で約８０ＫＤの分子量を有す
るＨＧＦ（Ｉ）は、２本のハンドとして検出され、それ
らの相対移動度より、それぞれの分子量は、約６０ＫＤ
　（α鎖）と約３２Ｋｌ）　（β鎖）であることが推定
された（第４図）。

■　アミノ酸分析および次表のアミノ酸配列の決定 上記■で得たＨＧＦ（Ｉ）画分にフウィーン２ｏ及び塩
化すトリウムを、濃縮最終濃度でそれぞれ０．１７及び
０．２Ｍとなるように加えて、遠心濃縮器（トミー精工
社製）にて濃縮した。濃縮１−Ｔ　Ｇ　Ｆを、八、Ｊａ
ｈｎｓｓｏｎらの方法（ＢＢＲＣ，１０４、６６（Ｉ９
８２）　）を一部変更して、還元アルキル化した。すな
わちＩ］ＧＦを４Ｍ−グアニジン塩酸を含む０．５Ｍ　
　トリス塩酸緩衝液ｐ＋１８．０テロ０°Ｃ１３０分処
理した後、最終濃度２０ｍＭとなるようにジチオスレイ
Ｉ・−ルを加えて窒素置換して、暗所室温で２時間還元
反応を行った。

ついで最終濃度４０ｍＭとなるようにヨードアセトアミ
ドを加えて窒素置換した後、暗所室温で１時間アルキル
化反応を行った。得られた還元アルギル化ＨＧ　Ｆ　（
Ｉ）は旧−Ｐｏｒｅ　３０４（旧ｏ−Ｒｍｄ礼製、ＣＳ
）カラムを用いた逆相高速液体クロマＩ・クラフィーで
分離した。溶出は、３０ｍＭ　ＮａＣ１及び０．１％Ｔ
ＦＡ存在下にてアセト二Ｉ・リル濃度を４０％から５０
％迄直線的に上昇させて行った。第５図に、得られた熔
出パターンを示す。図において、縦軸（Ｉ）は２８０ｎ
ｍに於ける吸光度（Ａ　２８０）を（２）はアセトニト
リル濃度を、横軸はフラクションＮＯを示す。図に示す
如く、アルキル化ＨＧＦ（Ｉ）はピークＩとピークＨに
分離され、■項のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により、ピークＩ
は分子量約６０ＫＤのα鎖、ピーク■は分子量約３２Ｋ
Ｄのβ鎖であることを確認した。上記のＩ］ＣＦ　（Ｉ
）α鎖画分およびＨＧ　Ｆ　（Ｉ）β鎖画分を６Ｎ４１
Ｃ１で１１０°Ｃ１２４時間加水分解後、アミノ酸自動
分析装置（日立製８３５型）を用いてアミノ酸分析を行
った。その結果は前記した通りである。上記方法で得ら
れた１１　ＣＦ　（Ｉ）　β鎖画分３００ｐｍｏｌｅを
ペプチドシークエンサー　（アプライドバイオシステム
社４７７八型）を用いて３０ザイクル解析して、ＨＧ　
Ｆ　（Ｉ）　　β鎖の次表の側アミノ酸配列を決定した
。β鎖次表の側２７個のアミノ酸配列は、■−■Ｎ−Ｇ
−１−Ｐ−Ｔ−Ｑ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｇ−ＷＭ　−Ｖ　−Ｓ
　−Ｌ　−Ｋ　−Ｙ　−Ｒ−Ｎ　−Ｋ−１−■−ＩＣ−
Ｃ−Ｃであった。

実施例２ ■肝抽出液の調製 ラット（系統ＳＤ、体重２００〜３００　ｇ　）　　１
００匹の腹腔内にザラダ油に溶解した２０％四塩化炭素
溶液を１０ｍＲ／ｋｇ投与しく四塩化炭素として２　ｍ
ｌ、　／　ｋｇ投与）、３０時間後に肝臓を摘出した。

摘出した肝臓ば０．１５Ｍ　ＮａＣ１、ｉｍＭＰｌ″Ｉ
ＳＦ、１ｍＭ　　モノヨード酢酸、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ
を含む緩衝液Ｂ　（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ｃＩ（ｐ
Ｈ８，５）、１０ｍＭ　１ｌｅｐｅｓ、２　ｍＭ　Ｃａ
ＣＩｚ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ　８０）　４４２　中で
ワーリングブレンダーで破砕した。破砕後、冷却遠心機
（日立２０Ｉ’Ｒ−５２）で１０．０００回転／分の遠
心を行い、沈澱物を除いた。

上澄を濾紙で濾過し、濾液を肝抽出液として得た。

■陽イオン交換クロマＩ・グラフィー 肝抽出液約４ρを約４倍容の０．１．５Ｍ　ＮａＣ１を
含む緩衝液Ｂに２時間以」二を３回透析した後、０．１
５ＭＮａＣ］を含む緩衝液Ｂで平衡化したＳ−セファロ
ースＦＦ　（ファルマシア社製）のカラム（サイズ：内
径１１．３ｃｍＸ高さ１０ｃ＋ｎ）に添加した。

０、］５５ＭＮａＣ１を含む緩衝液で洗浄後、０．１５
Ｍから１、ＯＭのＮａＣ１の直線濃度勾配（全量６Ｎ）
により溶出した。溶出画分を参考例２に示した方法によ
りＨＧ　Ｆ活性を測定し、活性画分を集めＳ−セファロ
ースＦＦ）岩田液とした。第６図にその溶出パターンを
示す。

■色素アフィニティークロマトグラフィーＳ−セフーｙ
Ｔ：Ｊ−スＦＦ’ｌ岩田？夜をＩＮ　ＩＩｃ］テｐＨ７
，５に調製後、同量の０．０１％Ｔｗｅｅｎ　８０を含
む蒸留水で希釈し、緩衝液Ｃ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１
１ＣＩ　（ｐＨ７，５）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ　８０
）で平衡化したＢｌｕｅ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　Ｍカラ
ム（ＩＢＦ社製、カラムサイス：内径＝２．６ｃｍＸ高
さ１３．５ｃｍ）に添加した。緩衝液Ｃで洗浄後、０か
ら０．５Ｍのアルギニンの直線濃度勾配（全量３５０ｍ
Ｒ）により？岩田した。溶出パターンを第７図に示す。

ＨＣ，Ｆ活性の高い両分を集め旧ｕｅ−Ｔｒｉｓａｃｒ
ｙｌ　Ｍ溶出液とした。

■ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーＢｌｕｅ
−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　ｈｌ容出液を９イｇ容の緩衝液
Ｄ（］ＯｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ｃＩ　（ｐｌ（７，５）
、０．０１％Ｔｗｅｅｎ　８０）て希釈した後、０．３
Ｍ　ＮａＣ１を含む緩衝液りで平衡化したヘパリンセフ
ァロースＣＬ−６Ｂカラム（ファルマシア社製、カラム
ザイス：内径１．６ｃｍＸ高さ７ｃｍ）に添加した。０
．３Ｍ　ＮａＣｌ　を含む緩衝液りで洗浄後、Ｏ１針か
ら２．０Ｍ　Ｎ、ｌＣＩ　直線濃度勾配（全量１５０ｍ
Ｒ）により溶出した。）岩田パターンを第８図に示す。

ＨＧＦ活性の高い両分を集めヘパリンセファロース溶出
液とした。

■疎水性クロマトグラフィー 溶媒Ａ　（２０ｍＭ　　リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）、
４ＭＮａＣ１）と溶媒Ｂ　（２０ｍＭ　　リン酸緩衝液
（ｐｌ−１７，５）、５０％エチレングリコール）の２
：１混液により平衡化されたフェニル５ＰＷカラム（東
ソー社製、カラムザイス：内径７．５ｍｍＸ高さ７．５
ｃｍ）にヘパリン・セファ１コース？容出液を小力１１
シた。？岩田は？容媒ΔとＢの組成比を２：１からＯ：
１に連続的に変えることにより行った。その溶出パター
ンを第９図に示す。４５分前後に溶出したＩ−Ｉ　Ｇ　
Ｆ活性を示す画分を集め精製ＨＧ　Ｆ　（Ｉ）を得た。

尚、８５分前後に溶出したＩ（ＣＦ活性画分はＩ−（Ｏ
Ｆ（Ｉｔ）であった。

■ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動実施例１の■の
項に示した方法に従い、本実施例の０項及び０項で得ら
れたヘパリン・セファロース溶出液と精製ＨＣ；Ｆ（Ｉ
）のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った。結
果を第１０図に示す。

ヘパリン・セファロース溶出液は、非還元条件で約８０
ＫＤの単一ハンドを示した。しかし、還元条件下では約
９０ＫＤ、約６０ＫＤと約３２ＫＯの３木のハントを与
え、２木鎖型ＨＧ　Ｆ　（Ｉ’）　１本領型ＨＧＦ（Ｔ
Ｉ）の存在を示した。一方、精製ＨＧ　Ｆ　（Ｉ　）は
非還元条件で同じく約８０ＫＤの単一ハンドを、還元条
件で約６０ＫＩ）　（α鎖）と約３２ＫＩ）　（β鎖）
の２木のハンドを示し、疎水性クロマトグラフィーによ
りＨＣＦ（Ｉ）が均一に単離されたことを示した。

■本実施例での■〜■の精製工程の結果を下記第３表に
示す。尚、本実施例でのＨＧＦ活性は参考例２に示した
ＨＧＦ活性測定法（その２）に従っで行った。

第３表　肝油出液からのＩ−Ｔ　Ｇ　Ｆ　（、Ｉ　）精
製工程■次表のアミノ酸配列の決定 本実施例の■で得られた精製１（Ｃ，Ｆ　（Ｉ）のＮ端
アミノ酸配列を、実施例１の０項に示した方法に従い、
決定した。即ち、精製ＨＣＦ　（Ｉ）を還元アルキル化
後、Ｃ４逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃによりα鎖とβ鎖に分離し、
ペプチトシークエンサーによりＮ端のアミノ酸配列を決
定した。β鎖次表のの１３個のアミノ酸配列はＶ−Ｖ−
Ｎ−Ｇ−１−Ｐ−Ｔ−Ｑ−ＴＴ−Ｖ−Ｇ−Ｗと決定され
、血小板ホモジネート由来のＨＧ　Ｆ　（Ｉ　）アミノ
酸配列と一致した。

実施例３ ■ヒト胎盤抽出液の調製 ヒト胎盤（Ｉ個約５００ｇを５個）の皮をはぎとり、ナ
イフとハサミで組織を細かく切断したのち、１０ρ　の
緩衝ン夜Ｅ　　（０，０２Ｍ　　Ｔｒｉｓ−１１ｃＩ（
ｐＨ８，５）、　０．１ＭＮａＣ１，０，０１％Ｔｗｅ
ｅｎ　８０）を加え、ワーリングブレンダーでポモゲナ
イズした。いったん低速遠心分離（６００ｇＸ　５分間
）により、大きな組織断片を除いた後、上清を再度高速
遠心分離（Ｉ０，０００ｇ　ｘ２０分間）にかけた。上
清液をとり、沈まなかった粒子や脂肪をガーナでこしと
った後、緩衝液Ｅで平衡化しておいたＤＥＡＥ・セファ
クリル（チッソ社製、湿重量２００ｇ　）を加え、４°
Ｃにて１夜撹拌させた。樹脂を濾別し、緩衝液Ｅでくり
返し十分洗浄し、水分を切った後、１．５ＭのＮａＣｌ
を含む緩衝液Ｅｌｐ、に投入し、約２時間攪拌して吸着
物を樹脂より溶離させた。濾過して得た溶離液を緩衝液
Ｆ　Ｃ０，０２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、
０．３Ｍ　ＮａＣｌ　、０．０１％Ｔｗｅｅｎ　８０）
に対し、外液１０倍量で３回透析し、胎盤抽出液を調製
した。

■ヘパリンセファロースクロマトクラフィー０項で得た
胎盤抽出液を緩衝液Ｆで平衡化したヘパリン・セファロ
ースＣＬ−６Ｂカラム（ファル−ンシア社製、カラムサ
イズ：直径２．６ｃ＋ｎＸ高さ２０ｃｍ）に流速２０Ｑ
ｍｆｆｉ／時間でかけた。緩行ｊ液Ｆにて非吸着物質を
十分流し出した後、０．３Ｍから２．０Ｍ　ＮａＣｌの
直線濃度勾配溶出により、ＨＣＦ活性物質を溶出させた
。このヘパリンセファロースクロマトクラフィーの溶出
パターンを第１１図に示す。ＨＣＦ活性は約１．ＯＭ　
ＮａＣ１付近に溶出され、その両分を集めてヘパリン・
セファロース溶出画分を得た。

■コンカナバリンＡセファロースクロマＩ・グラフィあ
らかじめ緩衝液Ｇ　（０，０２Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１ｃＩ
（ｐＨ７，５）、０．５Ｍ　ＮａＣｌ　、０．０１％Ｔ
ｗｅｅｎ　８０）て平衡化させておいたコンカナバリン
Ａセファロースカラム（ファルマシア社製、カラムサイ
ズ：直径１．．６ｃｍＸ高さ５．０ｃｍ）にヘパリン・
セファロース溶出画分ヲ添ｊＪＩＩした。緩衝液Ｇで洗
浄後、０から０．５Ｍのメチルα−Ｄ−グルコシドを含
む緩衝？ｖ、Ｇにより、直線濃度勾配溶出を行った。流
速は２０ｍ１／時間で行った。そのクロマトグラフィー
？岩田パターンを第１２図に示す。ＨＧ　Ｆ活性を示す
両分を集めコンカナバリンＡセフブロースカラム溶出画
分を得た。

■疎水性クロマトグラフィー 最終精製工程は疎水性クロマトグラフィーの１つである
フェニル５ＰＷ　ＩＩＰＬｃ　　（東ソー社製、カラム
ザイズ：直径０．７５ｃｍＸ高さ７．５ｃｍ）によって
行った。溶媒Ｃ（０，０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５
）、４ＭＮａＣ１）と溶媒Ｄ　（０，０２Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，５）、５０％エチレングリコール）の２：
１混液でフェニル５四カラムを平衡化した後、コンカナ
バリンＡセファロースカラム溶出画分を添加した。その
後、溶媒ＣとＤの組成比を２；１から０：１に連続的に
変化させることにより溶出を行った。流速はＱ、５ｍＲ
／分で行った。フェール５ＰしＩＨＰＬＣの溶出パター
ンを第１３図に示す。保持時間４５分前後に溶出したＩ
−Ｉ　Ｇ　Ｆ活性画分を集め精製ＨＧＦ（Ｉ）画分を得
た。

収量はヒト胎盤５個より約１５μｇの精製ＨＧ　Ｆ（Ｉ
）が得られた。全工程の収率は約２０％で、圧部性は４
５．０００倍に上昇した。尚、本実施例でのＩ−Ｔ　Ｇ
Ｆ活性測定は参考例２に示した）ＩＧＦ活性測定法（そ
の２）に従って行った。

■ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動実施例１の■の
項で述べた方法により、本実施例の０項及び０項で得ら
れたコンカナバリンＡセファロース溶出画分と精製ＨＣ
；Ｆ（Ｉ）画分のＳ　ＤＳ−ＰＡＧＥを行った。結果を
第１４図に示す。実施例１及び２と同様コンカナバリン
Ａセファロス溶出画分には２本領型ＨＣＦ　（Ｉ　）と
１本鎖型１４ＧＦ（ＴＩ）が存在し、疎水性Ｔ（Ｐ　Ｌ
　ＣによりＨＣＦ（Ｉ）が均質に単離されたことが示さ
れた。

■次表のアミノ酸配列の決定 本実施例の■の項で得られた精製ＨＧ　Ｆ　（Ｉ　）の
Ｎ端アミノ酸配列を実施例１の０項に述べた方法と同し
方法により決定した。即ち、精製ＨＧ　Ｆ（Ｔ）を還元
アルキル化後、Ｃ４逆相クロマトグラフィーにより分子
量約６０ＫＤのα鎖と約３２ＫＤのβ鎖とを分離し、ペ
プチドシーケンザーによりＮ端アミノ酸配列を決定した
。β鎖次表のの１８個のアミノ酸配列が決定され、その
配列は、Ｖ−Ｖ−ＮＧ−Ｉ−Ｐ−Ｔ−Ｒ−Ｔ−Ｎ−１−
Ｉ；−Ｗ−ＭＶ　−３−Ｌ−Ｒ−Ｙであった。

〔発明の効果〕

本発明によれば、成熟肝実質細胞の生体外での増殖を可
能とする二種のサブユニッｌ−からなる成熟肝実質細胞
増殖因子（Ｉ）が提供される。

【図面の簡単な説明】

第１図は非還元ＨＧ　Ｆ及び還元アルキル化ＨＣＦの旧
−Ｐｏｒｅ　３０４　（Ｃ４逆相）ＨＰＬＣの溶出パタ
ーンとＳＤＳ−ＰＡＣ，Ｅ泳動図、第２図は塩析再溶解
液のＳ−セファロースＦＦ　　ＦＰＬＣの溶出パターン
、第３図はＳ−セファロースＦＦ　　ＦＰＬＣ処理液の
ＨＣ，Ｆ（Ｉ）　　・Ｉ、２０抗体カラムの溶出パター
ン、第４図は精製１（ＯＦ（Ｉ＞　のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
泳動図、第５図は還元アルキル化ＨＧＦ（Ｉ）の旧−Ｐ
ｏｒｅ　３０４　（Ｃ４逆相）カラムの溶出パターン、
第６図は肝油出液のＳ−セファロースＦＦクロマトグラ
フィーの溶出パターン、第７図は肝油出液の色素アフィ
ニティークロマトグラフィーの？容量パターン、第８図
は肝油出液のヘパリン・セファロースクロマトグラフィ
ーの溶出パターン、第９図は肝油出液のフェニル５　Ｐ
Ｗ　ＨＩ−Ｐ　Ｃ溶出パターン、第１０図は肝油出液か
ら精製したＩ−Ｉ　ＣＦの３ＤＳ−ＰＡＣ；Ｅ、第１１
図は胎盤抽出液のヘパリン・セファロースクロマトグラ
フィーの溶出バタン、第１２図は胎盤抽出液のコンカナ
バリンＡ・セファロースクロマトグラフィーの？岩田パ
ターン、第１３図は胎盤抽出液のフェニル５　ＰＷ　Ｉ
−１１−Ｐ　Ｃ溶出パターン及び第１４図は胎盤抽出液
から精製したＨ　Ｇ　ＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、二種のサブユニットからなり、かつ、下記の理化学
   的性質を有するポリペプチドからなる成熟肝実質細胞増
   殖因子（ I ）。 （ｉ）β鎖のＮ末端アミノ酸配列 【遺伝子配列があります。】 （式中、Ｖはバリン、Ｎはアスパラギン、Ｇはグリシン
   、Ｉはイソロイシン、Ｐはプロリン、Ｔはトレオニン、
   Ｗはトリプトファン、Ｘは任意のアミノ酸を示す。） （ｉｉ）還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量α鎖
   ６０，０００±３，０００ β鎖３２，０００±３，０００ ２、ポリペプチドが下記の理化学的性質を有する請求項
   １記載のラット血小板由来の成熟肝実質細胞増殖因子（
   I ）。 （ｉ）次表のアミノ酸組成（モル比±１０％）▲数式、
   化学式、表等があります▼ （ｉｉ）Ｎ末端アミノ酸配列 【遺伝子配列があります。】 （式中、Ｖはバリン、Ｎはアスパラギン、Ｇはグリシン
   、Ｉはイソロイシン、Ｐはプロリン、Ｔはトレオニン、
   Ｑはグルタミン、Ｗはトリプトファン、Ｍはメチオニン
   、Ｓはセリン、Ｌはロイシン、Ｋはリジン、Ｙはチロシ
   ン、Ｒはアルギニン、Ｈはヒスチジン、Ｃはシステイン
   を示す。） （ｉｉｉ）還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量α
   鎖６０，０００±３，０００ β鎖３２，０００±３，０００ ３、ポリペプチドが下記の理化学的性質を有する請求項
   １記載のラット肝細胞由来の成熟肝実質細胞増殖因子（
   I ）。 （ｉ）β鎖のＮ末端アミノ酸配列 【遺伝子配列があります。】 （式中、Ｖはバリン、Ｎはアスパラギン、Ｇはグリシン
   、Ｉはイソロイシン、Ｐはプロリン、Ｔはトレオニン、
   Ｑはグルタミン、Ｗはトリプトファンを示す。） （ｉｉ）還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量α鎖
   ６０，０００±３，０００ β鎖３２，０００±３，０００ ４、ポリペプチドが下記の理化学的性質を有する請求項
   １記載のヒト胎盤由来の成熟肝実質細胞増殖因子（ I
   ）。 （ｉ）β鎖のＮ末端アミノ酸配列 【遺伝子配列があります。】 （式中、Ｖはバリン、Ｎはアスパラギン、Ｇはグリシン
   、Ｉはイソロイシン、Ｐはプロリン、Ｔはトレオニン、
   Ｒはアルギニン、Ｗはトリプトファン、Ｍはメチニオン
   、Ｓはセリン、Ｌはロイシン、Ｙはチロシンを示す。） （ｉｉ）還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量α鎖
   ６０，０００±３，０００ β鎖３２，０００±３，０００