JPH05505305A

JPH05505305A - クロストリジウム・ディフィシルに特異的なオリゴヌクレオチド

Info

Publication number: JPH05505305A
Application number: JP91502285A
Authority: JP
Inventors: タバキャリ，ソード; クレイトン，クリストファー　リースン; ウレン，ブレンダン　ウィリアム
Original assignee: スリーアイ　リサーチ　エクスプロイテーション　リミテッド
Priority date: 1989-12-29
Filing date: 1990-12-28
Publication date: 1993-08-12
Also published as: EP0507830A1; WO1991009973A3; ATE166395T1; WO1991009973A2; EP0507830B1; US5459034A; DE69032329D1; CA2066027A1; GB8929293D0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】グロストリジ恒二ｆイブイン□少□躬ぜ咳ノ艷庇１４二４二Ｖゴヌクレオチド本発明はクロストリジウム・ディフィシルＣＣＩｏｓｔｒ１ｄｉｕｙａ　ｄｉｆｆｉｃｉノｅ）種の細菌に特異的なすりゴヌグレオチドに関するものであり、クロストリジウム・ディブイシルＤＮＡプローブとして、またはクロストリジウム・デイフイシルＤＮＡの増幅に有用である。

クロストリジウム・ディフィシルは、グラム陰性で胞子を形成する嫌気性微生物で偽膜性大腸炎の主な原因として知られ、抗生物質関連性の大腸炎および下痢に関係する。この微生物の病原性は、腸毒素のＩ・キシンＡおよび強力な細胞毒素のトキシンＢの産生に関連している。クロストリジウム・デイフイシルに関連した疾病の診断は、患者の糞便検体中からの微生物の分離と同定および／または毒素のり明に依存しており、その目的のための単一抗原に特異的な抗体が、欧州特許ＩＩＩＩＡ−０１５３５１９およびＡ−０１５４０６４号の各明細書に開示されている。上記の方法は時間がかかり、治療の開始を促進するためには、より速やかな診断が本質的である。

本発明の意図するところは、クロストリジウム・デイフイシルＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドを提供してこれらの障害を排除することでありジャーナル・オブ・グリニカル・ミクロバイオロギー（Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）、２４　（３）、３８４−３８７　（１９８６、九月）に報告された研究の拡張である。この論文には、クロストリジウム・デイフイシルの各種の菌株に関する免疫障害の研究結果が報告されており、各種の免疫原性のある蛋白が、試験されたクロストリジウム・ディフィシルの９１１株全部に共通して同定された。＊に３種類の共通な抗原は、可能性として、５０ないし７０ｋＤａの分子量を有することが証明された。

上記の研究と同様にして、試験されたクロストリジウム・デイフイシルの全ての菌株に共通する別の抗原が同定され、これらの抗原を符号化した遺伝子が同定され、クローン化され、−例では、配列が決定されて、本発明すなわちクロストリジウム・ディフィシルＤＮＡ＆：特異的なりＮＡプローブおよびオリゴヌクレオチドブライマーの構造に、初めて到達した。

より詳細には、本発明の最初の問題点としてクロストリジウム・デイフイシルＡトキシン遺伝子の１９４７ｋｂＤＮＡフラグメントを符号化した部分が、同定され、クローン化され、配列が決定された、この配列は付表■に配ダリ＃す（Ｓ囮ＩＤＮｏ、）ｌとして記述され、本明細書の構成要素として考えられるべきである。

更に詳細に１９４７ｋｂ配列を解析すると、遅硬性の分離した読み枠は、繰り返しヌクレオチド配列の異なる４群を含んでいることが判り、各群内の同一性は８８ないし１００％である０本文においてＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄ　（Ａ＝８１　ｂｐ　；　Ｂ。

Ｃ，Ｄ＝６３ｂｐ）として同定されたこれらの群は、次のような配列である：ＡＢＣＣＣＤＡＢＣＤ旦ΔＢＣＣＣＤＡＢＣＣＤＡＢＣＤＡＢＣ上記の配列でＡ−５゛＾ＴＡ　ＧＧＧ　ＧＴＧ　ＴＴＴ　ＡＡＡ　ＧＧＡ　ＣＣＴ　ＡＡＡ　ＧＧＡ　ＴＴＴ　ＧＡＡＴＡＴ　ＴＴＴ　ＧＣＡｌｌｅ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　ＡｌａＣＣ丁　ＧＣＴ　ＡＡＴ　ＡＣＴ　ＴＡＴ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　ＡＡＣＡＴＡ　ＧＡＡ　ＧＧＴ　ＣＡＧ　ＣＣＴ　３　’Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　ＡｌａＢ　＝　５　’　ＡＴＡ　ＧＴＴ　ＴＡＴ　ＣＡＡ　ＡＧＴ　ＡＡＡ　ＴＴＣＴＴＡ　ＡＣＴ　ＴＴＣＡＡＴｌｉｅ　Ｖａｌ　丁ｙｒ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　ＡｓｎＧＧＴ　ＡＡ＾＾＾Ａ　ＴＡＴ　ＴＡＣＴＴＴ　ＧＡＴ＾＾Ｔ　ＡＡＣＴＣＡ　３′Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　５ｅｒＣ＝５°ＧＡＡ　ＧＣＡ　ＧＣＴ　ＡＣＴ　ＧＧＡ　ＴＧＧ　ＣＡＡ　ＡＣＴ　ＡＴＴ　ＧＡＴＧＧＴＧｌｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ＾Ａ＾＾ＡＡ　ＴＡＴ　ＴＡＣＴＴＴ　ＡＡＴ　ＡＣＴ　ＡＡＣＡＣＴ　ＧＣＴ　３“Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ＾１ａＤ　＝　５　’　ＡＴＡ　ＧＣＴ　ＴＣＡ　ＡＣＴ　ＧＧＴ　ＴＡＴ　ＡＣＡ　ＡＴＴ　ＡＴＴ　ＡＡＴ　ＧＴＴ＋１ｅ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　丁ｈｒ　Ｉｌｅ　ｌｌｅ　Ａｓｎ　ＧｌｙＡＡＡ　ＣＡＴ　ＴＴＴ　ＴＡＴ　ＴＴＴ　ＡＡＴ　ＡＣＴ　ＧＡＴ　ＧＧＴ　ＡＴＴ　３゜Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　１ｌｅＬ記のＡ、Ｂ、ＣおよびＤブロックの繰り返し配列は、１９４７　ｂ　ｐフラグメントのつちの１９３５ｂｐを説明する。残りの１２は、下線を施したＡおよびＤ群の間にある各々６ｂｐの２＠の結合域で説明される。

この情報を用いて、クロストリジウム・デイフイシルＡトキシン遺伝子に交雑が可能で、クロストリジウム・デイフイシル感染の早期の検出に潜在的に有用なオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡプローブを組み立てることができる。このプローブは、実質上、付表の配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、）１に示した完全な１９４７のヌクレオチド配列ないしオリゴヌクレオチド合成のために、より適当な長さの配列、例えば１５ないし３００のヌクレオチド、より一般的には１５ないし５０．特に１５ないし３０のヌクレオチドの大きさの範囲である。特別なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド対の最終的な選択は、この技術分野で良く理解されている多くの要素に依存し、就中、説得力のある必要条件、すなわち目標とするＤＮＡにおける相補性の配列との局所的なミス対合に耐えられるプローブの能力である。明らかに、プローブの長さが長い程、目標とするＤＮＡに対するオリゴヌクレオチドの交雑に悪影響を及ぼすことなく局所的なミス対合に抵抗する能力は良好になる。しかしながら、オリゴヌクレオチドの長さは、合成の容易さのようなその他の諸因子に対する均衡を取る必要があるやしかしながら、この選択に考えｂれる諸因子はよく知られており、この技術分野に精通している技術者の能力の範囲内である。

また、この技術分野に精通している技術者には明らかなように、特別なオリゴヌクレオチドおよび一本鋼で完全な１９４７ｂｐ配列よりなる配列の関係は、左から右に、すなわち５゛末端から３°末端へ読むように書かれるのが必要で、必然的に相補性の配列である。そればかりでなく、ＤＮＡ配列としてここに記載されたオリゴヌクレオチド配列はウラシル（Ｕ）をチミン（Ｔ）に変えたＲＮＡ配列として岨み立てられる。

既述のように、本発明の一般性は、以下に記載する１９４７ｂｐ配列に見出だされるヌクレオチド塩基の成る配列に相補的なりＮＡ　（およびＲＮＡ）プローブに拡張するものであるが、一定の配列および配列対が特に好ましいことが認められる１例えば、既述の繰り返し配列から選ばれた配列は、クロストリジウム・ディフィシルＡトキシン遺伝子の間隔があっても同一の二つの区画に相補性があるのが特に好ましい、−例としては２５単位のオリゴヌクレオチド・８Ｍ７１：　５’＾＾＾ＣＴＡＴＴＧＡ　ＴＧＧＴ＾＾＾＾＾Ａ　ＴＡＴＴ＾３゜が挙げられるが、（＋３Ｗ７１は単なる同定コードである）その配列は、上記のトキシンＡの繰り返しＣ配列に見出だされるものである。

本発明の支に特徴とするところは、クロストリジウム・ディフィシルオリゴヌクレオチドブローブの選ばれた対に関するものであり、プローブはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術およびオリゴヌクレオチドの選ばれた対をプライマーとして用いることによって、クロストリジウム・ディフィシルＡトキシン遺伝子またはその区画を増幅するのに用いられ得る。

最近、ＰＣＲは、検体中に存在する微量の遺伝物質の高度に鋭敏な検出が可能なりＮＡプローブ技術における手段として開発され、遺伝子または遺伝子フラグメントを最初に増幅することにより多数の同一の遺伝子または遺伝子フラグメントを複製する。これは遺伝子または遺伝子フラグメントのより良い検出を行なうばかりでなく、続いて行なわれる研究および分析のための、更に適当なベクターにおけるクローニングおよび発現のための遺伝物質の重要な貯蔵物を提供するものである。しかしながら、プライマーが増幅される遺伝子または遺伝子フラグメントにおける相補性の配列に交雑し、その点から遺伝子または遺伝子フラグメントのＰＣＲ複製が開始されるためのオリゴヌクレオチドブライマーを提供する必要上から、ＰＣＲは遺伝子または遺伝子フラグメントにおけるヌクレオチド配列についての、成る程度の知識を前提条件とする。異なる間隔で離れた位置にある標的のＤＮＡに交雑するプライマー対は、標的の遺伝子または遺伝子フラグメントの正確な長さに増幅させるのに用いることができる。

また、クロストリジウム・ディフィシルＡトキシン遺伝子の各種の点において交雑し得るオリゴヌクレオチド対を遺伝子のＰＣＲ増幅のプライマーとして用い、次に該遺伝子を検出、すなわち検体、例えば病院の検体中のクロストリジウム・デイフイシルを検出することは理論的に可能である。しかしながら、クロストリジウム・デイフィンルＡトキシン遺伝子に存在することが同定された繰り返し配列の一つの上の間隔を置いた位置に交雑するオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲのプライマーとして用いることは好ましい、かくして、ＰＣＲによる遺伝子の増幅において、繰り返し配列の複製は遺伝子における各区画で同時に起こり、従って実質的に複製速度が増加し、クロストリジウム・ディフィシル検出感度が増加するのみならず患者におけるクロストリジウム・ディフィシル感染の診断を行なうに要する時間を劇的に減少する０本発明者によって行なわれた検査において、クロストリジウム・ディフィシル感染の陽性の診断はＰＣＨにより５時間以内で確認されている。

上記の繰り返し配列に基づいて、各種のオリゴヌクレオチドの対合には多様な異なる長さ、および各繰り返し配列の５°および３°末端にある配列に相補的なヌクレオチド配列があることが示唆される。特に縦列Ｃの繰り返し配列の５°および３°末端に相補的なオリゴヌクレオチド対が好ましい０合成され、この発明に用いられた特別な２種の対合は、クロストリジウム・ディフィシルＡトキシン遺伝子の繰り返し配列Ｃの反対末端に相補的なりＷＢ２：　５’　ＧＡＡＧＣＡＧＣＴＡ　ＣＴＧＧＡＴＧＧＣＡ　３’ＢＷ７０：　ｓｌ　ＡＧＣＡＧＴＧＴＴＡ　ＧＴＡＴＴＡＡＡＧＴ　３’、およびクロストリジウム・ディフィシルＡトキシン遺伝子の繰り返し配列Ａの反対末端に相補的なりＷＢ２：　５°ＡＴＡＧＧＧＧＴＧＴ　ＴＴＡＡＡＧＧＡＣＣＴ　３’ＢＷ６６：　５°ＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴ　ＴＣＴＡＴＧＴＴＡＴ　３’　テある。

一般的な表現として、クロストリジウム・ディフィシルＡトキシン遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅のための好適な対合は、上記のＡ、Ｂ、ＣおよびＤの繰り返し配列、特にＡおよびＣ配列の５°および３°末端における１５ないし２５のヌクレオチド配列に相補性の１５ないし２５のヌクレオチドのオリゴヌクレオチド配列として同定され得る。

本発明の第二の特徴は、３１ｋＤａｔ１ｃ原が総てのクロストリジウム・ディフィシル菌株に共通して同定され、クロストリジウム・ディフィシルＤＮＡの１．８ｋ　ｂ　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ消化フラグメントによって符号化されることが明らかになったことである。かくして本発明の第二の特徴として、クロストリジウム・ディフィシルブローブは、クロストリジウム・ディフィシルのＨｉｎｄ　ＩＩＩ消化フラグメントまたはそのフラグメントの個々の配列から誘導され、または相補性であり、１５単位ないし本質的に完全な配列の大きさの範囲、より一般的には１５ないし１５ないし５０単位、より好適には１５ないし３０単位の大きさの範囲のオリゴヌクレオチドを含むものである。

正確な読み枠はまだ確定していないけれども、３１　ｋＤａクロストリジウム・ディフィシル抗原を符号化した１、　８　ｋ　ｂ　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ消化フラグメントの完全な配列は、付表ＩＩに配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、）　２として記載され、本明細書の一部を形成するものとして考慮される。

１、８　ｋ　ｂ　Ｈｉｎｄ　ＴＴＩフラグメントの選ばれた配列に相補的な特別なオリゴヌクレオチドプローブは以下のように同定される、括弧内の数値は単なる同定コー（０２８）　５°＾＾＾＾＾ＴＧＣＴＣＡＧＣＴＴＧＣＡＧ３°　３１８−３３６（０３１）　５’ＡＡ＾＾ＡＴＴＴＡＡ　ＣＴＡＡＧＴτ３’　７３４−７５０（０２９）　５’＾＾ＣＡＡＴＴＴＴＡ　ＴＴτＡ＾＾Ｃ３’　１４６０−１４７６に相補性（０３２）　５’ＴＴＴＴＧＡＴＧＴＴ　ＡＡＣＴＧＡＣＣ３’　１０５８−１０７５に相補性（０３７）　５°ＧＴＴＡＣＴＴＴＴＧ　ＡＴＡＣＡＧＴ＾３’　１０７６−１０９３従って広い意味で、本発明は、前記のＤＮＡ配列の１５以上のヌクレオチド塩基の何れかの配列に相補性であり、交雑することが可能で、それぞれがクロストリジウム・ディフィシルの１　、８　ｋ　ｂ　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　ＤＮＡフラグメントおよび１９４７ｋｂＡトキシンＤＮＡとして同定され、少なくとも１５のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドよりなるクロストリジウム・ディフィシルに特異的なオリゴヌクレオチドを提供するものであり、該プローブは同程度の長さを有し、完全な配列を含むものである。

この広いクラスの中に含まれる二つの広い下位間−は、本発明の好ましいクロストリジウム・ディフイシルに特異的なオリゴヌクレオチドを構成するか、または含むものである。最初の範−は完全な配列の下位の制限フラグメントによって構成され、このよつな下位の制限フラグメントとしては、特に次のものが同定されている。

トキシンＡ遺伝子のＥｃｎ　ＲＴ／ＰｓｔＴ　１４４８　ｂ　ｐの下位の制限フラグメント。

このような制限フラグメントは、勿論、既知の方法、例えばクロストリジウム・ディフィンルのゲノムＤＮＡを適当な制限酵素または酵素で消化し、次いで大きさに応じて個々のＤＮＡ制限フラグメントの分離のために知られている、ゲル電気泳動、グロマトグラフィーまたはその他の適当な方法によって得られる。

この発明のＤＮＡプローブの第二の主要な下位間−は、合成オリゴヌクレオチド配列、例えば前記のそれである。このようなオリゴヌクレオチド配列は、公知のオリゴヌクレオチドの合成技術を用いて容易に組み立てられる。

上記のオリゴヌクレオチドの選ばれた相補性の対をプライマーとして用いる場合、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、製造業者（Ｃｅｔｕｓ社）の仕様に従って行なわれ、クロストリジウム・ディフイシルＤＮＡの公知のフラグメント、クロストリジウム・ディフィシルａｉｍ、ｉｉ胞から分離され精製された全クロストリジウム・ディフィシルＤＮＡおよび粗製のクロストリジウム・デイフイシルＤＮＡの両者を増幅する。これらの実験において：オリゴヌクレオチド０３１および０３２は、クロストリジウム・デイフイシルＤＮＡの０．３０３ｋｂフラグメントを増幅；オリゴヌクレオチド０２８および０２９は、クロストリジウム・デイフイシルＤＮＡの１．２ｋｂフラグメントを増幅；オリゴヌクレオチド０３１および０２９は、クロストリジウム・デイフイシルＤＮＡの０．７ｋｂフラグメントを増幅；オリゴヌクレオチド０３７および０２９は０．３５ｋｂフラグメントを増幅：オリゴヌクレオチド０２９および０３２は、クロストリジウム・デイフイシルＤＮＡの０．８ｋｂフラグメントを増幅することが示された。

ＰＣＲ増幅は、この発明のクロストリジウム・デイフイシルに特異的なオリゴヌクレオチドを用いるクロストリジウム・デイフイシル検出の現在の好適な方法であると思われるが、その他の検出方法も適用され、この技術分野においてよく知られている。この目的のため、この発明のクロストリジウム・ディブイシルに特異的なオリゴメグ１ノオチドは、クロストリジウム・ディブイシルＤ　Ｎ　Ａに特異的な各種のＤＮＡプローブを堤供するため、多様な各種の標識体：放射性、蛍光性または酵素とし丁捷供され、総ては調査中のいかなる未同定１）　Ｎ　Ａ検体に交棹した（結合した）Ｉ）ＮＡプローブの検出が可能である７または、勿論、サンドイッチハイブリダイゼーション法には、この発明のＤＮＡプローブは公知の適当な方法、例えば多様な各種の図体基質、粒子、例えばガラス、セフ７デソクス、セファグリルビーズなど、のみならず連続表面基質にも共有結合によって固定される。ＤＮＡ標識および固定化の技術は一般にＤＮＡプローブを用いる微生物検出の方法としで、この技術分野でよく知られており、本発明のクロストリジウム・ディブイシルの特異的な検出に同様に適している。このような処置と方法は本発明の肝要な部分ではなく１．これ以」：、二二に記載する必要はない。

しかしながら、この発明のＤＮＡ　（またはＲＮＡ）プローブとして用いられるオリゴヌクレオチドの意味は、オリゴヌクレオチド順序配列自体と同様に標識された、端を切り取られた、および固定された型として考慮されると理解されるべきである、また、ここに与えられたオリゴヌクレオチドの長さは、プローブをポリ（ＤＴ）またはポリ（ＤＡ）ｌｌｉ覆表面表面定するような特別な目的のために加えられたポリ（Ｄ　Ａ　）またはポリ（ＤＴ）末端のような、付加的の非相補的な配列順序を含まない。

この発明に含まれるクロストリジウム・ディブイシルに特異的なオリゴメグ１フオチドは、−木調および二本ｍ型の両者であり、次のハイブリダイゼーション法、例えば病院、糞便またはその他の検体におけるクロストリジウム・ディブイシルの検出に際して、二本鋼オリゴヌクレオチドは変性を受けてプローブは一本鋼の形になる。

検体、例えば糞便検体におけるクロストリジウム・ディブイシルの検出法もこの発明の範囲に含まれ、検体を処理してＤＮＡまたはｍ　ＲＮ　Ａを放出させ、本発明のクロストリジウム・ディブイシルに特異的なオリゴヌクレオチドを用いてクロストリジウム・ディブイシルＤＮＡまたはｍ　ＲＮ　Ａの存在を検出するものである、特にＰＣＲ反応においてプライマーとしてのオリゴヌクレオチド対および患者のクロストリジウム・ディブイシル感染の診断のための本！！明のクロストリジウム・ディブイシルに特異的なオリゴヌクレオチドＪ−りなる診断キット、そして特にＰＣＲ反応においてプライマーとじての用途のためのオリゴヌクレオチド対を含むＰＣＲキットも含まれる。

本発明を以下の実施例により説明する。

＾鬼血上オリゴヌクレオチドＢＷ６９およびＢＷ７０を用いるクロストリジウム・ディフィシルＡトキシと１迩ｊのＰＣＲＩ鳳社ｆｆｌクロストリジウム・ディブイシルの代表的な９株、標識したＡないしＥおよびＷないしＺｌを特定の培地（シフ０セリン、セホキシチンおよびフルグトース糖）上で、３７℃で３６時間嫌気的にＮｉｌした＋Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｗ、ＸおよびＺの菌株は、毒素産生性であることが知られているので特に選択した。対照として選ばれたＡ、ＣおよびＹの菌株は毒素非産生性であることが知られている。

各棟の単一コロニーを、接種用白金耳で、滅菌水２００μ２を含む１．５−容のポリプロピレンチューブに掻き取り、１ｏ分間煮沸した。次いで、試料を５分間、１４００ｘｇで遠心分離し、」＝清のクロストリジウム・ディブイシル細胞抽出物を得た９オリゴヌクレオチドブライマーの合成オリゴヌクレオチドＢＷ８９およびＢＷ７０（上記参照）を、オートフィシ２ン化したリン酸アミダイトカップリング法により、アブライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）合成装置で合成した。

二旦旦各クロストリジウム・ディブイシル抽出物２μ２を、１０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８，３）、ゼラチン０．０１％、４種のデオキシヌクレオチド（Ａ、Ｃ。

Ｔ、Ｇ）の各々２００ｐＭ、２種のプライマーの各々の１００ｐ、Ｍ、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（カルフォルニア州、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌ−〇ｒ　Ｃｅｔｕｓ社）を含む反応容１１００μ２に加えた９反応泥合物をパラフィン油（１００μＱ）で積層し、熱循環！！　（Ｈｙｂａｉｄ社）に入れ３０サイクルで増幅した＋９４°および４６′″で各々３０秒間の迅速な；、！段階のサイグルを使用した、ただし、最初の９４°の段階は５分間延長して初期試料の変性を韓実にしｌ二生成物の分離増幅（、た検体の２０μＱづつを、ｌａｇ当り臭化エチジウムｎ　、）７ｔ　Ｑを含む水平な４　’、４　Ｎｕｓｉｅｖｅ　ＧＴＧアガロースゲル（ＩＣＮ　ｌ ’ｌｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）で電気泳動を行い、バンドを紫外線で明視化した。

同時に行なった実験において、培養したクロストリジウム・ディブイシル株Ｗを４続希釈しτｍ閑数３００．３０および３（および最初の糞便検体からのその他の嫌気性腸内細菌数１０７）を含む検体を得て、同様にＢＷ６９およびＢＷ７０のプライマーを用いてＰＣＲを行なった（検体１．２および、３）。

鼠！結果は、添付の図面の図１が示しているように、検体ＡないしＥ、Ｗないり、Ｚ、および１．２と３の各々について得られたバンドの分離を示している＋１ノ一ンＭは、対応するＤＮＡのサイズマーカーのバンドであって、６７．８０．１１０．１４７．１９ｏ、２４２および２６７ｂｐにバンドを示している。

Ｂ、Ｄ、、ＥＶＷ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、１および２（毒素産生性のクロストリジウム・ディフィンル株）の各レーンは、６３．１２６．１８９．２５２および３１５ｂｐに特徴的な５本のバンドを示し、毒素非産生性の菌株（Ａ、Ｃおよびｒ）からの検体には存在しないが、３００または３０のような少ないＷ敗の検体でも明らかであった。

以上の結果は、ＢＷ６９およびＢＷ７０のプライマー対を用いてＰＣＲ増幅を行なったクロストリジウム・ディブイシルの４５株全部で確かめられた。検査された４５株のうち、毒素産生性であることが知られている３３株全部は陽性であったが、毒素非産生性の１２株は陰性であった。

クロストリジウム・ディブイシル以外のクロスジラム属の異なる１３種からの１６株のうち、３株「その総てはクロスジラム・ソルデリ＜Ｃ，５ｏｒｄｅｌｉＤ　Ｆのみは陽性の結果を生じた。

これらの結果は表１に示すように、明らかに、二のオリゴヌクレオチドの毒素産生性のクロストリジウム・ディブイシルに対する実質的な特異性を示しており、陽性の診断が画数３０程度の少ない量で実施し得るという事実は、その感度をｊ γ証するものである。この感度に対する理由の一つは、クロストリジウム・ディフィシルＡトキシン遺伝子繰り返し配列Ｃの５°および３゛末端に相補性のプライマー対の特異的な選択であると思われる。しかしながら、本質的に同様な結果は、繰り返し配列Ａ、ＢおよびＤの５°および３゛末端に相補性の類似のプライマー対についても予想され得る。

！施見又オリゴヌクレオチドプローブ０２８および０２９Ｊ！去ンユに二ｊイフィシルＤＮＡのＰＣＲ増幅オリゴヌクレオチド０２８および０２９は、前記と同様に、アプライドバイオシステムズ合成装置により合成された。

次いで、この２種のプライマーの１μＭｊｌ１１度を用い、クロストリジウム・ディブイシル細胞を水５０μＱ中で１０分間煮沸することで得られたクロストリジウム・ディブイシルＤＮＡを増幅した。このＤＮＡは、９４℃で１分、３１℃ で】分、７２℃で３分のサイクル法を用いて増幅された。最終サイクルの後、重合工程を３ないし１０分間行なった。総計で、２Ｇサイクルの増幅を行った０反応は１００μｇの用量で行い、試料２０μＱをアガロースゲルで泳動させ、増幅したＤＮＡを臭化エチジウムで染色し、分子量標準物質と比較した。この方法により、クロストリジウム・ディブイシルＤＮＡは、クロストリジウム・ディブイシルの細胞数１０２程度の低い細胞濃度から増幅され、かくして本発明のクロストリ　ジウム・ディブイシルに特異的オリゴヌクレオチドは原著な感度を表わした。他のクロストリジウム属の菌種で行なった同様な対照実験では、増幅のいかなるｆ拠も示すことができず、本発明のプローブのクロストリジウム・ディブイシルに対する特異性を証明した。

増幅されたフラグメントがクロストリジウム・ディブイシルＤＮＡである証拠は、内因性オリゴヌクレオチドブローブとの交雑、および最初の増幅後ＰＣＲのために２種の内因性プライマー、例えばプローブ０２８および０２９を用いることによって１．２ｋｂの増幅されたフラグメントを生じ、次いでこの反応生成物の５％を用い、プローブ０３７および０２９で更にＰＣＲを行い、０．３５ｋｂフラグメン１・を生成する二つの事実から得られた．Ｘ惠豊ユブライマ−ＢＷ６５およびＢＷ６６を用いたクロストリジウム・ディフィンルＤＫ血匹二二旦曳嶌実施例Ｉと同様な操作により、プライマーＢＷ６５およびＢＷ６６を用い、毒素産生性および毒素非産生性クロストリジウム・ディフィシル株からＤＮＡを増幅した．結果を図２に示す．Ｂ．Ｄ．Ｅ．Ｗ．ＸおよびＺの各レーンは、毒素産生性クロストリジウム・ディフィシルの純粋なコロニーからのＰＣＲ増幅生成物を示し、レーンＡ．ＣおよびＹは毒素非産生性クロストリジウム・ディフィシル株からのそれを示す．１、２および３の各レーンは、その他の嫌気性腸内細菌数１０７を混合した細菌数３００、３０および３のＧ毒素産生性クロストリジウム・ディフィシル株Ｗの連続希釈を示す．レーンＭは、６７、８０、１１０、１４７、１９０、２４２および２６７ｂｐにＤＮＡレーンを示す分子量サイズマーカーである．（ブラスミドｐＨｃ３１４のＢｓｈＩおよびＭｓｐＩ消化物）．実施例１および３で得られた結果を、下記の表１に要約する．表１　：　ＢＷ６５／６６またはＢＷ６９／７０の何れかのプライマー対を用いた各種のクロストリジウム属の菌株でのＰＣＲ実験の要約．試験数　ＰＣＲ陽性　ＰＣＲ陰性毒素産生性クロストリジウム・ディフイシル　３３　３３　０毒素非産生性クロストリジウム・ディフィシル　１２　０　１２その他のクロストリジウム属菌株　１６　３　１３以上の結果、本発明の好適なオリゴヌクレオチド、すなわちＡおよびＣのＡトキシンの繰り返し配列の末端配列に相補性ヌクレオチドの特異性および感度は明らかであり、クロストリジウム・ディフィシルによる感染の検出および診断に有用である．付皇工配列の型：　ヌクレオチド配列の長さ：　１９４７ｂｐ鎖の数二　二本鎖トボロジー二　直鎖状配列の種＊：　ゲノムのＤＮＡ起Ｓ：　クロスジウム・ディフィシル実験の直接起源：　バクテリオファージλＥＭＢＬ３クロスジウム・ディフィシル、遺伝子ライブラリースクリーニング、大腸菌（ｇ．　ｃａｄｉ）でサブクローン化配列の特徴二　十分に確定していない性質：　クロスジウム・ディフィシルＡトキシン遺伝子（フラグメント）５’　ＡＴＡＧＧＧＧＴＧＴＴＴＡＡＡＧＧＡＣＣＴＡ＾＾ＧＧＡＴＴＴＧＡ八丁Ａ丁丁ＴＴＧＣＡＣＣＴＧＣＴＡＡＴＡＣＴＴＡＴ＾＾Ｔ`ＡＴ＾＾ＣＡＴＡＧ＾＾ＧＧＴＣＡＧＧＣＴＡＴＡＧＴτＴＡＴＣ＾＾＾ＧＴＡ＾＾ＴＴＣＴＴ＾＾ＣＴＴＴＧ＾＾ＴＧＧＴ＾＾＾＾＾ＡＴＡＴＴＡＣＴＴＴＧ`ＴＡＡＴＡ＾ＣＴＧＧＡＴＧＧＣＡＡＡＣＴＡ丁ＴＧＡＴＧＧＴＡＡＡＡＡＡＴＡＴＴＡＣＴＴＴＡＡＴＡＣＴＡＡＣＡＣＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＣＡＡbＴＧＧＴＴＡＴＡＣ＾＾ＴＴＡＴＴ＾＾ＴＧＧＴＡＡＡＣＡｎＴＴＴＡＴＴＴ丁＾＾ＴＡＣＴＧＡＴＧＧＴＡＴＴＡＴＧＣＡＧＡＴＡＧＧＡＧＴＧＴＴＴ`ＡＡＧＧＡＡＴＧＧＣＡＡＡＣＴＡＴＴＧＡＴＡＧＴＡ＾＾＾＾ＡＴＡＴＴＡ　ＣＴＴＴＡＡＴＡＣＴ　ＡＡＣＡＣＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＣＡＡ　ＣsＧＧＴＴＡＴ　Ａ　ＣＴＡＴＴＡＴＴＡＡＴＧＧＡＡＡＡＣＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡ＾＾ＴＡＣＴＧＡＴＧＧＴＡＴＴＡＴＡＧＣＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＴＡＴＡＣ＾OＴＴＡＴＴＡ＾ＴＧＧＴ＾＾Ｃ　ＣＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴ　ＡＡＴＡ　ＣＴＧＡＴＧＧＴＡＴＴＡ　ＴＧＡＡＡ　ＡＴＡＧＧＧＧＴＴＴＴＴＡＡＡＧＧ`　ＣＣＴＡ　ＡＴＧＧＡＴＴＴＧＡＡＴＡＴττＴＧＣＡＣＣＴＧＣＴＡＡＴＡＣＴＧＡＴＣＡＴＡＡＴＡＡＴＡＴＡＧＡＡＧＧＴＣＡＧＧＣＴＡＴＡＧＴＴＴＡＴＣＡ`ＡＧＴＡＡＡＴＴＣＴＴＡ　Ａ（：ＴＴＴＧＡＡＴＧＧＴＡＡＡＡ　ＡＡＴＡＴＴＡＴＴｒＴＧ　ＡＴＡＡＴＡ　ＡＴＴＣＡ　ＡＡＡＧＣ　ＡＧＴＴＡＣsＧＧＡＴＧＧＣＡＡＡＣＴＡＴＴＧＡＴＡＧＴ＾＾Ａ＾＾＾丁ＡＴＴＡＣＴＴＴ＾＾ＴＡＣＴＡＡＣＡＣＴＧＣＴＧ＾＾ＧＣＡＧＣ丁＾ＣＴＧＧＡＴＧＧＣＡＡＡＣＴＡsＴＧＡＴＧＧＴＡＡＡＡＡＡＴＡＴＴＡＣＴＴＴＡＡＴＡＣＴＡＡＣＡＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＧＣＡＡＡＣＴＡＴＴＧＡＴＧＧsＡＡＡＡＡＡＴＡＴＴＡＣＴＴＴＡＡＴＡＣＴＡＡＣＡＣＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＣＡＡ（：ＴＧＧＴＴＡＴＡＣＡＡＴＴＡＴＴＡＡＴＧＧＴＡＡＡＣＡsＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＡＴＡＣＴＧＡＴＧＧＴＡＴＴＡＴＣＧＧＡＧＴＧＴＴＴＡＡＡＧＧＡＣＣＴＡＡＴＧＧＡＴＴＴＧＡＡＴＡＴＴＴＴＧＣＡＣＣＴＧbＴＡＡＴＡＣＴＧＡＴＧＣＴＡＡＴＡＡＣＡＴＡＧＡＡＧＧＴＣＡＡＧＣＴＡＴＡＧＴＴＴＡＴＣＡＡＡＧＴＡＡＡＴＴＴＴＴＡＡＣＴＴＴＧＡＡＴＧＧsＡＡＡＡＡ＾ＴＡＴＴＡＣＴＴＴＧＡＴＡＡＴＡＡＣＴＣＡＡＡＡＧＣＡＧＴＴＡＣＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＡＣＴＡＴＴＧＡＴＡＧＴＡＡＡＡＡＡＴＡＴsＡＣＴＴＴＡ＾ＴＡＧＧＡＧＴＧＴＴＴＡＡＡＧＧＡＣＣＴＡＡＴＧＧＡＴＴＴＧＡＡＴＡＴＴＴＴＧＣＡＣＣＴＧＣＴ＾＾ＴＡＣＧＧＡＴＧＣＴＡＡＣ`ＡＣＡＴＡＧＧＴＴＡＣＣＧＧＡＴＧＧＣＡＡＡＣＴＡＴＴＧＡＴＡＧＴＡＡＡＡＡＡＴＡＴＴＡＣＴＴＴＡ　ＡＴＡＣＴＡＡＣＡＣＴＧＣＡＧ３　’．C 付！一■ 配列の型：　ヌクレオチド配列の長さ゛　１８５３ｂｐ鎖の数：　二本鎖トポロジー．　直頗状配列の種ｍ：　ゲノムのＤＮＡ起ｌ［：　クロスジウム・デイフイシル実験の直接起源：　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ消化によるクロスジウム・デイフィシル配列の特徴：　未確定性質：　不明ＴＧＧＣＡＡＡＡＧＣ　Ａ＾＾＾ＣＡＡＴＴＡ　ＡＴＣＴＴＴＡＣＡＧ　ＧＴＣＡＡＧＴＴＡ丁　＾＾＾＾ＧＣＴＧＡＴ　Ｇ＾＾ＧＣＴＧ＾O＾　２４０ＴＴＧ丁ＴＴＴＴＣＡ　ＡＣＴＡＡＡＣＡＣＣ　＾＾＾＾＾ＧＡＡＧＧ　＾＾ＴＧＴＣＡＧＣＴ　ＴＴＣＧＴＴＧ＾＾＾　＾ＧＡＧＡＧ＾＾fＣ　４８０ＭＣＡＧ＾＾ＡＴＡ　ＧＣＴ丁ＣＴＴＣＴＡ　ＣＴＡＡＧＡＧＡＣＣ　ＡＧＡＴＡ＾＾ＧＴＴ　ＡＴＡＧＧ＾＾ＴＧＣ　ＡＴＴ丁ＣＴＴ丁ＡO　１０２０ＴＣＣＡＧＴＴＣＣＴ　ＡＴＧＡＴＧＡＡＡＴ　ＴＡＧＴＴＧＡＡＧＴ　ＴＡＴＡＡＧＴＧＧＴ　ＣＡＧＴＴＡＡＣＡＴ　Ｃ＾＾＾＾ＧＴ丁`Ｃ１０８０ＴＴＴ丁ＧＡＴＡＣＡ　ＧＴＡＴＴＴＧＡＡＴ　ＴＡＣＴＴＡＡＧＡＧ　ＴＡＴＣＡＡＴＡＡＡ　ＧＴＭ：ＣＡＧＴＡＧ　ＡＴＧＴＡＴＣ丁fＡ　１１４０ＡＴＣ丁ＣＣＴＧＧＡ　ＴＴＴＧＴＡＧＴＡＡ　ＡＴＡＧＡＡＴＡＣＴ　ＴＡτ ＾ＣＣＴＡＴＧ　ＡＴＡＡＡＴＧＡＡＧ　ＣＴＧＴＴＧＧ丁OＴ　１２００＾〒＾丁ＧＣＡＧＡＴ　ＧＧＴＧＴＴＧＣ＾＾　ＧＴ＾＾＾Ｇ＾＾Ｇ＾　＾＾ＴＡＧＡＴＧ＾＾　ＧＣＴＡＴＧ＾＾ＡＴ　ＴＡＧＧＡＧＣＡO＾　１２６０ＣＣ＾丁ＣＡＡＴＧＧ　ＡＣＣＡＣＴＡＧＣＡ　ＴＴＡＧＧＴＧＡＴＴ　ＴＡＡＴＴＧＧＡＴＴ　ＡＧＡτＧ丁ＴＧＴＴ　ＴＴＡＧＣＴ＾丁OＡ　１３２０＾Ｔ＾＾Ｇ＾＾ＴＴ丁　ＧＧ＾＾Ｔ＾＾＾＾ＧＴＴＴ＾＾＾ＴＡ＾＾　＾ＴＴＧＴＴＴ＾＾＾　＾＾Ｃ＾＾ＴＴＴＣＧ　ＡＴＡＴＡＴＧ＾＾O　１５００Ｔτ丁てＴＡＧＧＧＧ　ＧＡＧＴＡＣＴＴＡＣＡＧＣＡＧＧＴＣＴＴ　ＧＧＡＣＡ＾＾＾ＴＡ　ＴＡＴＡＧＣ＾＾ＧＡＣ＾＾＾ＴＡＧＣＡＴ@１７４０ＴＡＧＧＡＧＣＡＧＧ　＾＾ＴＡＣＣＡＧＴＡ　ＧＡＡＡ＾＾ＣＣＡＧ　ＣＴＡＴＧＡ（：ＴＡＴ　＾＾ＡＴ＾丁ＡＣＴＴ　ＴＧＴＧＧＴＴbＴＧ　１８００Ｇ＾丁丁ＡＡＧＡＴＣＧＴＧＧＣＧＧＧＣＡ　ＣＴＣＣＧＡＡＣＧＴ　Ｇ＾＾ＣＧＧＧＴＣＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＴ　ＧＣ＾　１８５３ＭＡＢ（ＤＥＷＸＹｚ１２３ＭＡＢＣＤＥＷＸＹＺ　１２３要約書クロスジラム・ディフィシルに特異的なオリゴヌクレオチドクロスジラム・ディフィシルＤＮＡに対して、木質的に特異的な結合親和性を有するオリゴヌグしオチド、特にクロスジラム・ディフィシルＡトキシン遺伝子に特異性のオリゴヌクレオチドが開示される。該オリゴヌクレオチドは、ヒトの臨床検体、例えば糞便検体中のクロスジラム・ディフィシルの検出におけるＤＮＡプローブおよびＰＣＲプライマーとして有用である。

平成４年６月２４日

Claims

【特許請求の範囲】

１．クロスジウム・ディフィシルＤＮＡまたはＲＮＡに、本質的に特異的な結合親和性を示すオリゴヌクレオチド。
２．クロスジウム・ディフィシルＡトキシン遺伝子に、本質的に特異的な結合親和性を示す請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
３．クロスジウム・ディフィシルＡトキシン遺伝子フラグメントとして、本文に説明され、同定されたＤＮＡ配列の１５以上のヌクレオチドの何れかの配列と同じか、または相補性である少なくとも１５のヌクレオチド配列よりなる請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
４．クロスジウム・ディフィシルＡトキシン遺伝子の繰り返し配列Ａ、Ｂ、ＣまたはＤの５′若しくは３′末端にある１５以上のヌクレオチドの何れかの配列に同じか、または相補性である少なくとも１５のヌクレオチド配列よりなる請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
５．ヌクレオチド配列が、１５ないし５０単位を有する請求項１ないし４の何れかに記載のオリゴヌクレオチド。
６．ヌクレオチド配列が、１５ないし３０単位を有する請求項１ないし４の何れかに記載のオリゴヌクレオチド。
７．長さが１５ないし３０のヌクレオチドであり、クロスジウム・ディフィシルＡトキシン遺伝子の繰り返し配列ＡまたはＣの５′若しくは３′末端にある１５ないし３０のヌクレオチド配列に等しいかまたは相補性である配列よりなる請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
８．オリゴヌクレオチド：ＢＷ６９【配列があります】ＢＷ７０【配列があります】ＢＷ６５【配列があります】ＢＷ６６【配列があります】
９．クロスジウム・ディフィシルＤＮＡの１．８ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントに相補性であり交雑し得る請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
１０．クロスジウム・ディフィシルＤＮＡの１．８ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントとして、本文で説明され、同定されたＤＮＡ配列の１５以上のヌクレオチド塩基の何れかの配列と同一または相補性の少なくとも１５のヌクレオチド配列よりなる請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
１１．ヌクレオチド配列が１５ないし３０単位である、請求項９または１０に記載のオリゴヌクレオチド。
１２．オリゴヌクレオチドＢＷ７１、０２８、０２９、０３１、０３２または０３７。
１３．クロスジウム・ディフィシルＤＮＡの相補性配列に交雑する場合、プローブの検出を可能にする標識で標識された、請求項１ないし１２の何れかに記載のオリゴヌクレオチドよりな６ＤＮＡプローブ。
１４．標識がオリゴヌクレオチド配列に結合した放射性、蛍光性または酵素標識である請求項１３に記載のＤＮＡプローブ。
１５．固体の支持体に固定された、請求項１ないし１２の何れかに記載のオリゴヌクレオチドよりなるＤＮＡプローブ。
１６．検体を処理し、検体に存在する何れかのクロスジウム・ディフィシルよりＤＮＡまたはｍＲＮＡを放出させ、請求項１ないし１２の何れかに記載のオリゴヌクレオチドまたは請求項１３ないし１５の何れかに記載のＤＮＡプローブを用いてクロスジウム・ディフィシルの存在のために放出されたＤＮＡまたはｍＲＮＡを検出することよりなる、検体中のクロスジウム・ディフィシルの存在の検出法。
１７．患者からの検体中のクロスジウム・ディフィシルの検出に適用される請求項１６に記載の方法。
１８．該検体が糞便検体である、請求項１７に記載の方法。
１９．検出法が、請求項１ないし１２の何れかに記載のオリゴヌクレオチド対を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による、放出されたクロスジウム・ディフィシルＤＮＡの増幅よりなる検出法である、請求項１６、１７または１８に記載の方法。
２０．プライマーの選ばれた対が、請求項８記載のＢＷ６９：ＢＷ７０またはＢＷ６５：ＢＷ６６の何れかである請求項１９に記載の方法。
２１．請求項１ないし１２の何れかに記載のオリゴヌクレオチド、または請求項１３、１４または１５に記載のＤＮＡプローブよりなみ、患者におけるクロスジウム・ディフィシル感染診断のための診断用キット。
２２．ＰＣＲのプライマーとして、請求項１ないし１２の何れかに記載のオリゴヌクレオチド対よりなるＰＣＲキットである、請求項２１に記載の診断用キット。
２３．ＰＣＲのプライマーとして、請求項８記載のオリゴヌクレオチド対ＢＷ６９：ＢＷ７０またはＢＷ６９：ＢＷ６６よりなる請求項２２に記載の診断用キット。