JPH05505391A - 内皮由来のｉｌ―８ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は米国出願番号０７／２３２２２４（１９８８年８月１５日出願）の一部 継続である。

本発明は内皮由来のインターロイキン−８（Ｉ　Ｌ−８）に関する。過去に“白 血球接着阻害因子”（ＬＡＩ）と同定されたこれらのポ１ノペフ。

チドは、白血球の集団を細胞の基質に対する接着から阻害する過程に関与する。

また本発明は、抗炎症薬としての、並び（こ、血管内皮および他の組織の損傷か 起こる臨床的指標のための治療薬としての、内皮由来ＩＬ−８の使用に関する。

関連する技術の説明 細菌、ウィルス、その他の侵入性寄生生物などの外来の侵入物力・皮膚または粘 膜を透過すると、細胞の防御機構が直ちに誘発される。

この防御系の食細胞型細胞の２つである局部的および血液産出単核細胞および多 形核白血球（ＰＭＮ）が侵入物の周りに蓄積し、食作用を開始する。この防御系 に関する優れた総説か、Ｅｉｓｅｎ、　Ｈ，Ｗ、によって、“Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌｏｇｙ″、第３版、　２９０〜２９５頁および３８１〜４１８頁（Ｈａｒｐｅ ｒ　ａｎｄ　Ｒｏｗ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、　ＰＡ（１９８０））に記 述されている。

このような外来物質の存在は、（１）周辺の血管の拡張、（２）血管透過性の増 大、（３）漏出性出血（単核細胞およびＰＭＮが血管壁を通過して移動すること ）、によって特徴づけられる炎症性応答を引き起こす。

炎症および損傷部位における血液白血球の蓄積は、その血管裏打ちに対する血液 白血球の局在化した接着に依存する。局在化した接着は種々の病態生理学的過程 に不可欠な要素である。白血球は、これらの侵入物に対して宿主を適切に防御す るために、細胞の基質に対して結合可能でなければならない。また白血球は、そ れらが循環から進行中の炎症部位に移動できるように、内皮細胞にも結合しなけ ればならない。さらに白血球は、特異的免疫応答か起こり得るように、抗原提示 細胞に結合しなければならない。最後に、ウィルスに感染した細胞または腫瘍細 胞の溶解が起こり得るように、白血球は適切な襟的細胞に結合しなければならな い。

炎症および損傷の領域の血管内皮に対する白血球の接着は以前から知られていた 。また長い間、血管壁の分子変化かこれらの内皮−白血球相互作用に関与してい るのではないかと考えられてきた。しかし、この概念を支持する実験的証拠は最 近までなかった（Ｈａｒｌａｎ。

Ｊ、、Ｂｌｏｏｄ　６５：５１３−５２５（１９８５）を参照のこと）。

最近の研究によって、ある種の炎症性サイトカイン、例えばインターロイキン− １（ＩＬ−１）（例えば、Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ等、　Ｊ、　ＣＩ　ｉｎ、　Ｉ ｎｖｅｓｔ。

７６：２００３−２０１１（１９８５）　；　Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ等、“Ｌｅ ｕｋｏｃｙｔｅ　Ｅｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　１ｔｓ　５ｅｑｕｅｌａｅ” 、　Ｓ、　Ｋａｒｇｅｒ、　ＡＣ，Ｂａ５ｅｌ　ａｎｄ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　 ７９〜９３頁（１９８６）　：Ｄ■ ｎｎ等、’Ｔｈｅ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ、ＭｅＬａｂｏｌｉｃ、ａｎｄ　Ｉ ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ　Ａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　１ｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１” 、　Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　４５−５ ９頁（１９８５）　；　Ｓｃｈ撃■ ｉｍｅｒ等、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　＋３６：６４９−６５４（１９８６） 　；　Ｇａｍｂｌｅ等、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８２：８６６７−８６７１（１９８ ５）　；　Ｐｏｈｌｍａｎ等、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３６：４５４ｇ− ４５５３（１９８６）　；　Ｃａｖｅ■ ｄｅｒ等、　Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　４６：１１３−１１７（１９８７）を参照 のこと）、腫瘍壊死因子（ＴＮ　Ｆ　）（Ｇａｍｂｌｅ等、　Ｐ！ＩＡｓ　ＵＳ Ａ　８２：８６６７−８６７１（１９８５））、およびグラム陰性菌内毒素（リ ポ多糖ＸＬ　Ｐ　Ｓ　ＸＳｃｈｌｅｉｍｅｒ等、同上（１９８６）　；　Ｐｏｈ ｌｍａｎ等、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３６：４５４８−４５５３（１９８ ８））、が血管内皮に対して試験管内で直接作用し、血液白血球および関連する 白血球細胞株（ＨＬ−６０およびＵ９３７）に対する内皮細胞表面の接着性を増 大させることか示された。

精製した補体成分、ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニンおよび ロイコトリエンＢ４など他の走化性因子も、培養した内皮単層に対するＰＭＮの 結合を増大させ得る（例えば、Ｓｍ１ｔｈ等、ＥＸＩ）、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、 　１２２：１６９−１７７（１９７９）　：　Ｈｏｏｖｅｒ等、　Ｊ、　Ｃｅ１ ｌ　Ｓｃｉ、　４５ニア３−W６（１ ９８０）　；　Ｈｏｏｖｅｒ等、　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８１：２１９１−２１９ ３（１９８４）　：　Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ等、Ｔｈｒ。

ｍｂ、　Ｒｅｓ、　３５：２０３−２１７（１９８４）　；　Ｇｉｍｂｒｏｎｅ 等、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　１ｎｖｅｓｔ、７４：１５５２−１５５５（１９８４）　 ；　Ｔｏｎｎｅｓｅｎ等、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７４　：１５ ８１−１５９２（１９８４）　；　Ｃｈ≠秩B 等、Ｂｌｏｏｄ　６５：４７３−４７９（１９８５）　；　Ｈａｒｌａｎ等、　 Ｌａｂ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　５２：１４１−１５０（１９８５）を参照のこと） 。しかし、内皮対白血球応答の相対意義およびそれらの接着に関与する細胞機構 は多くは未だにわかっていない。

白血球接着の阻害は潜在的に、炎症性疾患過程の治療的介入にとって中心的重要 性を持つ。白血球接着は通常は望ましいものであるが、器官移植拒絶、組織移植 体拒絶、アレルギー性反応、自己免疫挟置１、リウマトイド関節炎、脈管炎、敗 血症性ンヨ、り、成人呼吸障害症候群（ＡＲＤＳ）、糸球体腎炎、およびその他 の組織または器官特異型急性および慢性炎症なとを含む、免疫および非免疫炎症 性疾患過程にも関連する。さらに、虚血−再潅流の状況において、白血球接着は 微細血管閉塞、組織損傷および死滅を饗し得る。したかって、ある種の患者にと っては、細胞接着を減少もしくは阻害し得るなんらかの手段か極めて望ましいで あろう。

定義 簡略のために、本明細書では次の略号を使用する。ＣＭ　調整培地（ならし培地 またはフンディ／ヨンド・メディウムともいう）。ＦＣ８・胎児ウシ血清。ＨＥ Ｃヒト済静脈内皮細胞。Ｔ■Ｓ　トランスフェリン／インスリン／セレン。ｈｍ ｌＬ−１：ヒト単核細胞由来インターロイキン１゜ｒ　Ｉ　Ｌ−１：組換えＩ　 Ｌ−１゜ｒＴＮＦ：組換え腫瘍壊死因子。ＬＰＳ　：グラム陰性菌内毒素。ＬＡ Ｉ：白血球接着阻害因子。Ｐ、ＭＮ　多形核白血球。ＧＭ−ＧＳＦ：顆粒球−単 核細胞コロニー刺激因子。ｆＭＬＰ：Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロインルーフ ェニルアラニン。ＬＴＢ、：ロイコトリエンＢ、。ＰＭＡホルボール・１２−ミ リステート・１３−アセテート。

情報開示の陳述 米国出願番号０７／２３２２２４は白血球接着阻害因子ＬＡＩに関する。その後 の研究により、ＬＡＩがポリペプチドの混合物からなり、その１つが、活性化さ れたＴ細胞および単核細胞から分泌される７２アミノ酸の好中球活性化ポリペプ チド、インターロイキン−８（Ｉ　Ｌ−８）であることが示された。したがって 本出願ではＬＡＩを“内皮由来＋Ｌ−８”と呼ぶ。

次に記載する文献は本発明に関連し、これらは本明細書の一部を構成する。

Ｈｏｏｖｅｒ等、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、９５：１０＾（１９８２）およびＢ ａ５ｆｏｒｄ等、Ｂｌｏｏｄ　６８ニア９ａ（１９８６）は、非刺激ヒトおよび ウシ内皮細胞からの調整培地が、刺激された好中球によるスーパーオキ７ド生産 の減少を貸すことを開示している。

Ｈａｒｌａｎ等、Ｂｌｏｏｄ　６６：１６７−１７８（１９８５）は、ＣＤｗ１ ８複合体（白血球表面分化抗原複合体）に対するモノクローナル抗体が、アゴニ スト（作用薬）が誘発する多形核白血球接着の有意な阻害を貸すことを開示して いる。

Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ等、　Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．１３４：１８６６−１８７４ （１９８５）は、内皮細胞のプロスタグランジン中間代謝物が、接着を含む数種 の白血球機能を阻害することを開示している。

Ｋｅｒｒ等、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０３：１７６０（１９８６）は 、多形核臼血球を非刺激内皮細胞またはこれらの細胞で調整した培地にさらすと 、非刺激内皮細胞および組織培養プラスチックに対する白血球の接着か阻害され ることを開示している。

Ｃｒｏｎｓｔｅｉｎ等、　Ｊ、　ＣＩ　ｉｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７８ニア６Ｏ −７７０（１９８６）は、アデンンンおおよびその類縁体２−クロロアデノンン が、培養したヒ）１９静脈内皮細胞に対するＮ−ホルミルメチオニル−ロイシル −フェニルアラニンによって刺激された好中球の接着を阻害することを開示して いる。

Ｗｈｅｅｌｅｒ等、　Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　４５：４５０（１９８６）および Ｔｈｅｅｌｅｒ等によるポスター発表（“第４回血管内皮細胞の生物学に関する 国際／ンポジウム”、１９８６年８月、オランダ）は、インターロイキン−１で 処理した内皮細胞が白血球−内皮接着の阻害因子を生産することを開示している 。

Ｗｈｅｅｌｅｒ等、　Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　４６：７５８（１９８７）は、内 皮由来の白血球接着阻害因子の天然型のいくつかの特徴を開示している。

Ｖａｒａｎｉ等ルａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　５９：２ ９２（１９８８）は、ラット内皮細胞をＴＮＦで予備処理すると、活性化したヒ ト好中球による致死に対するそれらの感受性が増大することを開示している。

発明の要約 本発明は、内皮細胞、具体的にはＩ　Ｌ−１、ＴＮＦまたＬＰＳで処理したヒト 謄静脈内皮細胞、が産出する因子に関する。これらの因子は、超接着性（サイト カインで刺激された）内皮表面に対するＰＭＮおよび単核細胞接着を遮断するが 、リンパ球接着は遮断しない非シクロオキシゲナーゼ由来の阻害因子である。こ れらの阻害因子の産出は、ヒト謄静脈内皮細胞に限らず、Ｓｖ４゜ウィルスで形 質転換したヒト−静脈内皮細胞およびヒト二倍体皮膚線維芽細胞を含む細胞型も 含まれる。内皮由来ＩＬ−８と呼ばれるこれらの因子には、白血球接着阻害分子 としての用途、並びに、好中球が媒介する損傷から内皮細胞を保護する薬剤とし ての用途がある。これらの因子の組成物およびその使用法を提供する。

本発明に包含される実質的に純粋な内皮由来ＩＬ−８は、少なくとも２つの、［ ＾ｌａ　Ｉ　Ｌ−８］？？および［Ｓｅｒ　Ｉ　Ｌ−８］７．と命名された独特 なポリペプチドからなる。この物質は、サイトカインで活性化された内皮培養物 に対する単核細胞および好中球接着の両方を阻害する。しかし、高度に精製した 内皮由来ＩＬ−８および組換えヒ１４Ａｌａ　Ｉ　Ｌ−８１７−ｖおよび二Ｓｅ ｒ　Ｉ　Ｌ−８１ｖｙは接着を阻害しない。したかって内皮由来＋Ｌ−８の天然 調製物には、血液単核細胞に対して活性な、１または複数の他の白血球接着阻害 活性か含まれているのであろう。

この内皮由来Ｉ　Ｌ−８（ＬＡ　Ｉ）の作用は、白血球に対して選択的に向けら れるようである。しかしこれは、ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルア ラニン、ロイコトリエンＢ４またはホルボール・１２−ミリステート・１３−ア セテートなどの可溶性炎症性刺激物に対する白血球応答性の全面的な阻害を貸さ ない。むしろこの新しく発見された阻害分子は、炎症および／または損傷のまさ にその部位における白血球−管壁相互作用の変調に役割を果すようである。

具体的には、サイトカインで刺激されたヒト内皮培養物および細菌内毒素で刺激 されたヒト内皮培養物は、活性化された内皮細胞の可溶性天然産物である内皮由 来ＩＬ−８を産出する。その産出にはデノボ・タンパク質合成（新規タンパク質 合成）が必要であるが、シクロオキ／ゲナーゼ経路には依存しないようである。

内皮由来ＩＬ−８活性は、極端な温度およびｐＨ下でも、生理学的条件下でも安 定である。この熱および酸安定性と、プロスタサイクリン生産を除去する濃度で のアスピリン処理の影響がないことから、内皮由来ＩＬ＝８と、接着を含む数種 の白血球機能を阻害することが示されている内皮細胞のプロスタグランジン中間 代謝物とを区別できる（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ等、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１ ３４：１８６６−１８７４（１９８５））。

検出可能な内皮由来ＩＬ−８活性は、非処理内皮培養から得た調整培地中には認 められない。これは、非刺激内皮細胞またはこれらの細胞で調整した培地にＰＭ Ｎをさらすと、非刺激内皮単膜および組織培養プラスチックに対するＰＭＮの接 着が阻害されるという報告と対照的である（Ｋｅｒｒ等、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂ ｉｏｌ、　１０３：９７１ａ（１９８６乃。非刺激ヒトおよびラン内皮から得た 調整培地は刺激された好中球によるスーパーオキシド生産の減少をも肩す（Ｂａ ｓｒｏｒｄ等、Ｂｌｏｏｄ　６８ニア９ａ（１９８６）；　Ｈａｒｌａｎ等、Ｂ ｌｏｏｄ　６６：１６７−１７８（１９８５））。これとは対照的に内皮由来＋ Ｌ−８は、細胞質ゾル・カルシウム濃度およびスーパーオキシド生産のアゴニス ト刺激による変化を含む白血球機能の全面的な阻害を貸すことなく、白血球接着 を選択的に遮断するよってある。

本発明者らは、内皮由来［Ｌ−８が、サイトカインで活性化されたヒト［静脈内 皮細胞に対するヒトＰＭＮの強固な結合を反転し得ることをも立証した。即ち、 活性化された内皮細胞に付着しているＰＭＮに内皮由来ＩＬ−８を添加すると、 内皮細胞表面からＰＭＮが解離する。この“解離”の速度論は迅速（１〜５分） であり、潜在的に可逆的である。

白血球接着に対する内皮由来ＩＬ−８の弁別的効果（即ちＰＭＮを有意に阻害す るか、単核細胞またはリンパ球接着を阻害しない）は、超接着性内皮細胞表面を 認識する別個の白血球受容体に、内皮由来ＩＬ−８の作用か関係することを示唆 している。同様に、前骨髄球性細胞株ＨＬ−６０および単核細胞様株Ｕ９３７に 対する効果がないことは、内皮由来Ｉ　Ｌ−８がこの未分化細胞株に不足してい る成熟白血球の表面構造または機能に向けられることを示唆している。

ＰＭＮと内皮の接着性相互作用には、白血球表面分化抗原複合体ＣＤｗｌ　Ｂ（ ＬＦＡ−１，Ｍａｃ−１，ｐ　１５０．９５）が関与することが立証されている （Ｇａｍｂｌｅ等、　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８２：８６６７−８６７１（１９８５ ）；Ｐｏｈｌｍａｎ等、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３６：４５４ｇ−４５５ ３（１９８６））。濃縮された内皮由来ＩＬ−８（５倍相対濃度まで）の存在下 で、ｆＭＬＰ、ＬＴＢ、またはＰＭＡ（以下、“定義”を参照のこと）で活性化 されたＰＭＮの対照内皮単層に対する接着は阻害されない。対照的に、ＣＤｗ１ ８複合体に対するモノクローナル抗体は、アゴニストが誘発するＰＭＮ接着の有 意な阻害を肩す（Ｈａｒｌａｎ等、Ｂｌｏｏｄ　６６：１６７−１７８（１９８ ５））。さらに、血清被覆組織培養プラスチックに対するＰＭＮの接着は内皮由 来ＩＬ−８の存在によって変化を受けないので、ＰＭＮ接着の内皮由来ＩＬ−８ 阻害は“超接着性”内皮細胞表面に特異的であると思われる。

内皮由来ＩＬ−８は、白血球が媒介する内皮細胞に対する損傷から保護すること もできる。この保護は、内皮由来ＩＬ−８の白血球接着阻害活性ゆえに起こり得 る。しかし、接着阻害活性以外の他の機構も関与し得る。したがって、本発明の 方法は開示された機構のいずれによっても限定を受けない。

本発明以前は、ＴＬ−８は前炎症性化学誘因物質と呼ばれていた。

白血球接着阻害活性かＩＬ−８に起因すると考えられたことはなかった。したが って本発明は、抗炎症薬および／または白血球が媒介する血管内皮または他の組 織の損傷が起こる臨床的指標のための治療薬としての、ＩＬ−８および血管内皮 細胞以外の供給源から得られる関連するペプチド類の使用を包含する。生体内に 投与されるべきＴＬ−８の有効量は、以下により詳細に説明するインビトロ（試 験管内）およびインビボ（生体内）生物検定によって決定できる。

本発明は内皮由来ＩＬ−８並びにその機能的誘導体に関する。または本発明は内 皮由来ＩＬ−８の製造および精製法、内皮由来ＩＬ−８に関するスクリーニング 検定法、内皮由来ＩＬ−８の診断的および治療的使用、内皮由来ＩＬ−８または その機能的誘導体を含有する組成物にも関連する。

具体的には、本発明は、天然の夾雑物を実質的に含有しない白血球接着阻害因子 内皮由来ＩＬ−８またはその機能的誘導体を包含する。さらに本発明は、検出で きるように標識された内皮由来ＩＬ−８およびその誘導体に関する。

また本発明は実質的に純粋な形態で内皮由来ＩＬ−８を回収する方法に関し、こ の方法は次に記載する操作を伴うが、これに限定されない： （ａ）細胞供給源から調整培地を採取する；（ｂ）Ｍ整培地の限外濾過によって 内皮由来ＩＬ−８含有画分を得る。

（Ｃ）内皮由来ＩＬ−８を限外濾過によって濃縮および脱塩する：（ｄ）内皮由 来ＩＬ−８をアセトン沈殿によって凍結乾燥および膜脂質化する。

（ｅ）ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって内皮由来ＴＬ−８をゲル濾過する。

（ｆ）内皮由来Ｉ　Ｌ−８をイオン交換クロマトグラフィーにかける：（ｇ）操 作（ｆ）で得た濾液を実質的に純粋な形態で回収する。

本発明は、上記の方法によって得られる内皮由来ＩＬ−８を包含する。

また本発明は、哺乳類対象における炎症の治療法であって、そのような治療を必 要とする該対象に該炎症を抑制するのに十分な量の、次の群：内皮由来ＩＬ−８ 、内皮由来ＩＬ−８の断片、内皮由来ＩＬ−８の化学的誘導体、内皮由来ｆＬ− ８の変種、および内皮由来ＩＬ−８の類縁体；から選択される抗炎症薬を与える ことからなる治療法に関する。

また本発明は、白血球が媒介する内皮細胞に対する損傷から保護するための組成 物および方法をも包含する。

また本発明は、上記の炎症治療法であって、該抗炎症剤が適切な担体中で投与さ れる方法をも包含する。また本発明は、次の群・内皮由来ＩＬ−８、内皮由来Ｉ Ｌ−８の断片、内皮由来ＩＬ−８の化学的誘導体、内皮由来ＩＬ−８の変種、お よび内皮由来ＩＬ−８の類縁体、から選択される抗炎症薬の炎症減少量を投与す ることからなる哺乳類対象の炎症治療のための医薬組成物にも関連する。

さらに本発明は、炎症を有すると思われる哺乳類対象における炎症の存在および 位置を診断する方法であって、（ａ）内皮由来ＩＬ−８に結合し、これを同定し 得る、検出できるように標識された結合分子（例：抗体）を含有する組成物を該 対象に投与し、（ｂ）該結合分子を検出することからなる方法に関する。

また本発明は、炎症を有すると思われる哺乳類対象における炎症の存在および位 置を診断する方法であって、（ａ）内皮由来ＩＬ−８を含有すると思われる該対 象から得た生物学的試料を、内皮由来■Ｌ−８に結合し、これを同定し得る、検 出できるように標識された結合分子（例、抗体）の存在下でインキュベートし、 （ｂ）該試料に結合した該結合分子を検出することからなる方法に関する。該生 物学的試料には、例えば生検標本、血液（血清または血漿）などの体液、関節／ 胸膜／腹膜滲出液、脳を髄液、または眼球液が含まれ得る。

したがって本発明は、新規内皮由来ＩＬ−８分子およびその機能的誘導体の回収 および精製法、哺乳類対象の炎症の診断および治療法、並びに、内皮由来ＩＬ− ８またはその機能的誘導体を含有する新規組成物を包含する。

白血球接着阻害のこの過程および内皮由来ＴＬ−８分子自体を理解することは、 リウマチ学、器官移植、アレルキーおよび腫瘍学なとの分野におけるその治療的 および／または診断的使用の開発を促進するであろう。さらに、内皮由来ＩＬ− ８は成人呼吸障害症候群、敗血症性ショック、脈管炎、心臓および生命維持に必 要な池の器官の虚血−再潅流損傷、および血管内皮または池の組織に対する白血 球（好中球）依存性損傷が起こる他の炎症性疾患過程の治療に有用であり得る。

本発明は医学分野において、炎症性疾患過程のより効果的な診断および治療を可 能にし、炎症の進行中の臨床的エピソードの時間経過および／または強度を監視 するために内皮由来ＩＬ−８の定量的検定を使用することを可能にするであろう 。さらに本発明は、炎症における白血球の機能および白血球−内皮細胞相互作用 の機構の研究を可能にするであろう。

■インジウムで標識したＰＭＮを、ｈｍＩＬ−１（５Ｕ／ｍｌ）で記載した時間 予備処理したＨＥＣ単層に添加し、付着したＰＭＮ数を標準的１０分間単層接着 検定法で決定した。黒丸（“洗浄”）は、Ｐ　Ｍ　Ｎ添加直前に調整培地を除去 し、単層を洗浄したウェルを示す。白丸（“非洗浄”）はＰＭＮを調整培地中に 直接添加したウェルを示す。調整培地の存在下（△）または非存在下（ム）にお ける、非処理ＨＥＣに対するＰＭＮ接着を１．４および８時間で示す。

図２．刺激および非刺激内皮細胞へのＰＭＮ接着に対する種々の調整培地の効果 を表す。調整培地は次のように集めた：（１）ｒｌＬ−１βで、またはｒ　ｌ　 Ｌ−１βなして、４時間予備処理し、洗浄し、［いｒＲＰＭＩ＋ＦＣ３中で５時 間インキュベートしたＨＥＣ単層からｌ　Ｌ−１および疑似ＣＭを集めるか（内 皮ＣＭ）、もしくは（２）内皮細胞を含まないセラチン彼覆ペトリ皿中で、ＲＰ ＭＩ＋ＦＣ３をｒ　Ｉ　Ｌ−１β（５ｕ　／ｍｌ）と共に、あるいはｒｌＬ−１ βなしで９時間イノキュベートした（無細胞ＣＭ）。標準的単層接着検定のため に、Ｉｌｌ　ｌ　ｎで標識したＰＭＮを、非インキュベートＲＰＭ［＋ＦＣ３（ 新鮮培地）、疑似、およびＩＬ−Ｉ　ＣＭ無細胞ＣＭまたは内皮疑似ＣＭおよび Ｉ　Ｌ−Ｉ　ＣＭ（２ｘ　１０’細胞／１）中に希釈した〈実施例５を参照のこ と）。さらに、検定の直前に、内皮疑似ＣＭの一部にｒＩＬ−β（５Ｕ／ｍｌ） を直接添加した。洗浄した非活性化（黒）または活性化（斜線）（５１ｊ／ｍｌ 　ｒ　Ｉ　Ｌ−β、４時間）ＨＥＣ単層に対するＰＭＮ接着を評価した。値を、 ３連で行ったこの代表的実験の平均値±標４偏差として表す。２回の追試でも同 様の結果か得られた。（＊ｐ＜ｏ、ｏｔ　疑似ＣＭと比較したＩＬ−ＣＭ）。

ｉ１３　：　ＬＡ　Ｉのヒト血管内皮生成のＩ　Ｌ−１刺激濃度依存性を表す。

全面成長ＨＥＣ単層を種々の濃度のｈｍＩ　Ｌ−１またはｒｌＬ−１βで４時間 予備処理し、洗浄し、ＲＰＭＩ士ＦＣ３中でさらに５時間インキュベートした。

ＩＬ−Ｉ　ＣＭおよび疑似ＣＭを集め、標準的単層接着検定法でＬＡＩ活性を検 定した。ＰＭＮ接着の阻害率（％）を実施例７に記述するようにして計算した。

各点は３回の別個の実験の平均値±ＳＥＭを表す。

Ｃ１０４：　ＬＡ　Ｉが誘発するＰＭＮ接着阻害のＩ　Ｌ−ＩＣＭ濃度依存性を 表す。ＩＬ−Ｉ　ＣＭを血清非含有ＴＩＳ補足培地中に集め、アミコン（Ａｍｉ ｃｏｎ）　Ｙ　Ｍ　３０限外濾過膜を通して濾過し、アミコンＹＭ５膜で２０（ ＠濃度（体積／体積）に濃縮した。次にこの濃縮液をＬＡＩ内皮由来Ｉ　Ｌ−８ 活性検定のためにＲＰＭＩ＋ＦＣ３で連続的に再希釈した。各点は５回の別個の 実験の平均値±ＳＥＭを表す。

１５　非処理およびｌ　Ｌ−１処理内皮細胞単層に対する異なる型の白血球の接 着に対するＬＡＩの効果を表す。単離した放射性標識ＰＭＮ、単核細胞、リンパ 球、またはＩ（、Ｌ　−６０細胞を疑似ＣＭ（斜線）またはＩＬ−Ｉ　ＣＭ（黒 ）中に再＠濁し、非処理（−）またはＩＬ−１処理（＋０２．５Ｕ／ｍｌ　ｒ　 Ｔ　Ｌ−１β、４時間）ＨＥＣに対する接着を１０分間検定法で評価した。値を 、平均値±ＳＥＭとして表すぐ＊Ｐ＜０．０１　疑似ＣＭ対ＩＬ−Ｉ　ＣＭ）。

図６　：　Ｉ　Ｌ−１で処理したＨＥＣ単層に対するＰＭＮ接着のホフマン微分 干渉兼顕微鏡検査を表す。単離したＰＭＮを疑似ＣＭ（Ａ）またはＩＬＩ　ＣＭ （Ｂ）に再懸濁し、Ｉ　Ｌ−１で予備処理したＨＥＣ（２，５０／＋ｎｌ　ｒ　 Ｉ　Ｌ−１β、４時間）に１０分間加え、非付着ＰＭＮを除去するためにその単 層を洗浄した。写真Ｂては、付着したＰＭＮ数が減少しており、ＨＥＣ単層の表 面に十分拡散していないように見えることに注意すること。（原倍率４００ｘ） 。

図７．アゴニストが誘発するＰＭＮ中の一時的Ｃａ”上昇および模膜分極を表す 。

（Ａ）Ｃａ　”およびＭｇ”（２ＩＩＩＭ）を含むＨＢＳ３　１．９ｍｌにＰ　 Ｍ　Ｎ（２Ｘ１０”／ｍｌ）を再＠濁し、５ＰＥＸ蛍光量計中３７℃で、ｄｉｓ Ｃ，−（５）（最終濃度１．５μＭ）と平衡化させた。１００μｌの２０倍濃縮 疑似ＣＭ（点線）またはＩＬ−、Ｉ　ＣＭ（実線）を加えた。５分後、１０−’ Ｍ　ｆＭＬＰ（上段）、１０−’Ｍ　ＬＴＢ、（中段）、または１１００ｎ／ｍ ｌ　ＰＭＡ（下段）を加え、蛍光の増大を記録した。Ｆ＝１０％フルスケール。

（Ｂ）Ｆｕｒａ−２充填ＰＭＮ（１ｘ　１０＠／ｍｌ）をＣａ”およびＭｇ”を 含むＨＢＳ３　１．９ｍｌに懸濁した。１００μｌの２０倍濃縮ｊＬ−ＩＣＭ（ 上段）または疑似ＣＭ（下段）を加えた。５分後、１０−’ＭｆＭＬＰを加え、 蛍光発光（励起３４０および３８０）の変化を５０５ｎｍで記録した。細胞質ゾ ル遊離カルシウム濃度（ｙ軸）を放出された蛍光信号の比から計算した（Ｇｒｙ ｎｋｉｅｗｉｃｚ等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、　２６０：３４４０− ３４５０（１９８５）を参照のこと）。

褒旦　高圧液体クロマトグラフィーによる１Ｌ−Ｉ　ＣＭの分画を表す。ＩＬ− Ｉ　ＣＭを血清非含有ＴＩＳ補足培地中に集め、アミコンＹＭ３０膜を通して濾 過し、ＹＭ５膜で濃縮し、塩を除去するために洗浄し、凍結乾燥した。その一部 を０．２Ｍ酢酸、ｏ　１Ｍトリエチルアミン（ｐＨ３，９）に再懸濁し、これを ウォーターズ・プロテインーバイト１２５ゲル濾過カラムにかけた。流速１．８ ｍｌ／分で分画を集め、ＰＢＳに対して透析し、ＬＡＩ活性検定（網目の棒）の ためにＲＰ　Ｍ　Ｉ　＋　Ｆ　ＣＳで１：１０に希釈した。ＰＢＳ中の非希釈分 画中のタンパク質含量を決定した（黒丸）。３回の追試で同様の結果が得られた 。

［１９：　ＬＡＩの分取を表す。分取（１時間ごと）によって決定した収集培地 中のＬＡＩ内皮由来ＩＬ−８の出現は、時間依存的であった。ＨＥＣ培養を５０ ／ｍｌインターロイ牛ンー１で時刻０に処理した。時刻１時間に培地を集め、新 鮮な培地で置換した。サイトカインを、時刻５時間まで置換培地に加えた。この 図に記載のように、内皮由来ＩＬ−８は１時間程度で培地中に明白になり、４〜 ５時間で極大産出に達し、９時間まで維持された。９時間後、活性の減少か観測 された。

暉土旦、内皮由来ＬＡＩによる、好中球が媒介する損傷からのサイトカイン活性 化内皮単層の保護。好中球と共に（５０・１）９０分間インキュベートした後の ＨＥＣ単層の顕微写真。（ａ）非活性化ＨＥＣ単層、（ｂ）サイトカイン活性化 ＨＥＣ単層：著しい単層収縮と細胞消失に注目のこと、（Ｃ）内皮由来ＬＡＩ存 在下でのサイトカイン活性化ＨＥＣ単層、（ｂ）で明示された損傷がないことに 注目すること。

好ましい態様の説明 本発明の一側面は、内皮由来ＩＬ−８と呼ばれる天然の細胞間接着阻害因子の発 見に関する。本発明は実質的に純粋な内皮由来ＩＬ−８に関する。実質的に純粋 な内皮ＩＬ−８には、ＩＬ−８分子の混合物が含まれる。この混合物は主要ポリ ペプチドとして［ＡＩａＩＬ−８］、７を含有し、少量成分として［Ｓｅｒ　Ｉ 　Ｌ−８］、ｔを含有する。一般に［Ａｌａ　ＩＬ−８Ｅ？？はこの混合物の約 ７０％から約９５％を構成するであろう。［Ｓｅｒ　ｒ　Ｌ−８］ｔｔから［Ａ ｌａ　Ｉ　Ｌ−８］？？を分離する生化学的方法およびｒＡｌａ　Ｉ　Ｌ−ｓコ ｔｔ自体は、同時係属米国出願番号４４３１３１（１９８９年１１月２９日出願 ）に記述され、請求されている。

用語“機能的誘導体”は、対象ポリペプチドの“断片”、“変種”、“類縁体“ または“化学的誘導体”を包含するものとする。内皮由来ＴＬ−８ポリペプチド の“断片”とは、ポリペプチドの部分集合を意味する。

ＩＬ−８ポリペプチドの“変種”とは、その全分子またはその断片に本質的に類 似している天然に存在する分子を意味する。内皮由来■Ｌ−８の“類縁体”とは 、その全分子またはその断片に本質的に類似している非天然分子を意味する。両 分子中のアミノ酸配列が実質的に同じであるとき、並びに、両分子が類似の生物 学的活性をを有するとき、ある分子が別の分子に対して“本質的に類似している ”という。したがって、２つの分子が類似の活性を有する場合、たとえそれらの 分子の一方が他方にはない追加のアミノ酸残基を含有していても、あるいはたと えそのアミノ酸配列が同一でなくても、それらは本明細書で用いる用語としての 変種であると見なされる。

本明細書で使用される場合、ある分子が通常はその分子の一部でない追加の化学 的部分を含有しているときに、その分子を別の分子の“化学的誘導体”であると いう。このような部分は、その分子の溶解度、吸収、生物学的半減期などを改善 し得る。あるいは、これらの部分がその分子の毒性を減少させたり、その分子の 望ましくない副作用を除去または緩和することなども可能である。このような効 果を媒介し得る部分の例は、“Ｒｏｓｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ ｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ″（１９８０）に開示されており、当業者には明白 であろう。

ある化合物が内皮由来ＩＬ−８機能的誘導体であるかどうかを決定するための適 切なスクリーニング法は、例えばＰＭＮ−内皮細胞接着について記述された生物 検定法、天然の内皮由来ＩＬ−８に対する特異的中和抗体（モノクローナルまた はポリクローナル）の生産に基づ＜ＲＩＡまたはＥＬＩＳＡ法を使用する免疫検 定法からなる。

本明細書に開示する内皮由来ＩＬ−８は、それを含有する調製物が、この産物が 通常天然に伴う物質を実質的に含まない場合、“天然の夾雑物を実質的に含有し ない”という。しかし前述のように、実質的に純粋な内皮由来ＩＬ−８はＣＡｌ ａ　Ｔ　Ｌ　−８］、７および［Ｓｅｒ　Ｉ　Ｌ−８］７．ポリペプチドからな る混合物である。本発明の方法によってこの混合物を天然の夾雑物から分離でき るが、本方法または当該技術分野で既知の他の方法でこの２つの成分を分離する ことはできない。

本発明の目的にとって好ましい精製法には、免疫アフィニティー・クロマトグラ フィー精製で使用するためのウサギ・ヘテロ血清およびマウス・モノクローナル 抗体の作成、Ｍｏｎｏ　Ｓなどのカチオン交換カラムでのイオン交換クロマトグ ラフィー、および調製用５ＤＳ−ＰＡＧＥとその後の電気溶出か含まれる。例示 のために、好ましい精製法に含まれる操作と物質を次に記述するが、これらに限 定されない・ ａ）内皮由来ＩＬ−８を、ＩＴｓ（コラボレイティブ・リサーチ（’Ｃ。

１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡりを補 足したＲＰＭＴ−１６４０（エム・エイ・ハイオブロタクツ（￥＾Ｂｉｏｐｒｏ ｄｕｃｔｓ））中の細胞供給源から集める。

ｂ）膜Ｙ〜１−３０を用いるアミコン撹拌限外濾過容器で培地を限外濾過する。

Ｃ）操作（ｂ）で得た培地をＹＭ−５で濃縮し、脱塩するためにミ１）−Ｑ精製 水（ミリボア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））で洗浄し、凍結し、凍結乾燥する。凍結 乾燥したベレットを５体積の水冷アセトンで洗浄することにより、混入している 脂質を除去する。

ｄ）凍結乾燥した物質を０．２Ｍ酢酸（フィシャー・サイエンティフイク（Ｆｉ ｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））および０．１Ｍ　トリエチルアミン（シグ マ・ケミカル・カンノぐニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、））中で 再構成し、プロティン−バック１２５ゲル濾過カラム（ウォーターズ）にかける 。

ｅ）（ｄ）で得た分画を１０１１ＩＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　５（ｐＨ７）（バイオラッ ド（ＢｉｏＲａｄ乃中に透析し、１０ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　５（ｐＨ７）中で平衡 化したＣＭ−セファデックスまたはＳＰ−セファデックス（ファルマシア（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ））ト共に２５℃で２０分間インキュベートする。両力チオン交 換樹脂によって内皮由来ＩＬ−８活性を取り出す。

クエン酸に基づく緩衝液系を使用することもできる。活性の溶出を、直線的塩勾 配（０，０１ＭからＩＭ　ＮａＣＩ）で遂行する。この操作で得た分画を内皮由 来ＩＬ−８活性について試験し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ る゛ことかできる。

精製した内皮由来ＩＬ−８断片、あるいは、有機合成または組換えＤＮＡ技術を 用いるか、もしくはタンパク加水分解によって製造したその誘導体も本発明に包 含される。　′本発明は、試料または対象中の内皮由来ＩＬ−８または機能的誘 導体の検出法をも包含する。例えば、内皮由来ＩＬ−８またはその機能的誘導体 に特異的な抗体を適切なリガンド（配位子）、例えば放射性同位体、酵素、蛍光 標識、常磁性標識あるいは遊離基、て検出可能に標識することかできる。検出可 能に標識されたこのような物質を使用することによって、炎症の存在を検出でき る。検出可能に標識されたこのような抗体またはその機能的誘導体の作成法およ び検出法は、当業者によく知られている。

このような検出可能に標識された抗体の集合位置の検出が、炎症の部位を示す。

−態様として、組織または血液の試料を取り出し、そのような試料を検出可能に 標識した抗体の存在下でインキュベートすることによって、炎症のためのこの試 験を遂行する。好ましい態様として、磁気撮像や蛍光間接撮影法などの使用に− よって、この技術を非侵入的な方法で遂行する。例えば、潜在的組織拒絶の初期 兆候について器官被移植者を監視する際に、このような診断的試験を使用するこ とができる。リウマトイド関節炎および他の慢性炎症性疾患において、対象の臨 床的状態を決定するためにこのような検定を実行することもできる。

内皮由来ＩＬ−８を含有すると思われる該対象の生物学的試料を、内皮由来Ｉ　 Ｌ−８を同定し得る検出可能に標識された結合分子（例：抗体）の存在下でイン キュベートし、試料に結合している該結合分子を検出することからなる内皮由来 ＩＬ−８に関する検定法を使用することによって、抗体またはその機能的誘導体 を、炎症を有すると疑われる哺乳類対象中の炎症の存在および位置を検出または 診断するために使用することかできる。

したがって本発明のこの側面では、生物学的試料をニトロセルロースまたは細胞 、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定化し得る他の固体支持体で処理しても よい。次にこの支持体を適切な緩衝液で洗浄した後、検出可能に標識した内皮由 来Ｉ　Ｌ−８特異的抗体で処理する。次にこの固相支持体を再度緩衝液で洗浄す ることにより、未結合の抗体を除去する。次に、結合した抗体上の標識の量を従 来の手段によって検出することができる。

内皮由来ＩＬ−８を含有する試料について本発明の検定法を実行する場合、その 工程は次の操作からなる・（ａ）内皮由来ＩＬ−８を含有すると疑われる試料を 固体支持体と接触させることにより、内皮由来ＩＬ−８の固定化を達成する：（ ｂ）該固体支持体を検出可能に標識した内皮由来ＩＬ−８特異的抗体と接触させ る： （ｃ）該検出可能に標識した内皮由来ＩＬ−８特異的抗体を、該支持体と共に、 固定化内皮由来ＩＬ−８に対して内皮由来ＩＬ−８特異的抗体が十分結合し得る 時間インキュベートする。

（ｄ）操作（Ｃ）で得たインキュベーンジン混合物から固相支持体を分離する。

（ｅ）結合した標識を検出し、それにより内皮由来ＩＬ−８を検出定量する。

本発明のこの側面は、次に記述する操作からなる、試料中の内皮由来ＩＬ−８ま たはその断片を検出する方法に関連する：（ａ）内皮由来ＩＬ−８を含有すると 疑われる試料を、内皮由来ＩＬ−８特異的抗体または内皮由来ＩＬ−８に結合す るその断片と接触させる。

（ｂ）錯体が生成するか否を検出する。

もちろん、検出可能に標識した抗体および内皮由来ｒＬ−８の特定の濃度、イン キュベージコンの温度および時間、並びに、他の検定条件は、その試料中の内皮 由来ＩＬ−８の濃度、その試料の性質などを含む種々の因子に応じて変更される であろう。当業者は日常的な実験を行うことにより、機能的で最適な検定条件を 各測定について決定できるであろう。

洗浄、撹拌、振盪、濾過などの他の操作を、常習的に、あるいは特定の状況にと って必要な場合に、この検定法に加えてもよい。

内皮由来ＩＬ−８特異的抗体を検出可能に標識できる方法の１つは、これを酵素 に結合することである。その後その酵素の基質にさらすと、この酵素は、例えば 分光光度測定法、蛍光測定法によって、あるいは目視によって検出し得る化学的 部分が生成するような様式で、その基質と反応するであろう。内皮由来ＩＬ−８ 特異的抗体を検出可能に標識するために使用できる酵素には、マレート・デヒド ロゲナーゼ、スタフィロコノカル・ヌクレアーゼ、δ−■−ステロイド・イソメ ラーゼ、酵母アルコール・デヒドロゲナーゼ、α−グルセロホスフェート・デヒ ドロゲナーゼ、トリオセホスフエート・インメラーセ、西洋ワサビ・ペルオキシ ダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アルバルギナーゼ、グルコース・オキシダ ーゼ、β−ガラクトンダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グ ルコース−ｖｌ−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびア セチルコリン・エステラーゼが含まれるが、これらに限定されない。

内皮由来ＩＬ−８特異的抗体を、ガンマ計数器やンンチレーション計数器などの 手段を使用するか、もしくはオージオラジオグラフィーによって測定できる放射 活性同位体で標識することもできる。本発明の目的にとって特に有用な同位体は 、３Ｈ，”’Ｉ　、１′’　１　％”Ｓ％１４Ｃ１および”Ｃｒである。

内皮由来ＩＬ−８特異的抗体を蛍光化合物で標識することもできる。蛍光的に標 識した抗体を適切な波長の光にさらすと、その色素の蛍光ゆえにその存在を検出 できる。フルオレセイン・イソチオシアネート、ローダミン、フィコエワセリン 、フィコシアニン、アロフィフシアニン、０−フタルアルデヒドおよびフルオレ サミン（ｆｌｕ。

ｒｏｓｃａｍｉｎｅ）は、もっとも一般に使用される蛍光標識化化合物の一部で ある。

内皮由来ＩＬ−８特異的抗体を、ｌＳ′Ｅｕまたは他のランタニド系元素などの 蛍光放出金属を用いて検出可能に標識することもできる。

ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミンテトラ酢 酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート基を用いて、これらの金属を内皮由来ＩＬ− ８特異的抗体に結合することができる。

内皮由来ＩＬ−８特異的抗体を化学発光化合物と結合させることによって、この 抗体を検出可能に標識することもできる。次いで、化学反応の進行中に発生する 発光（ルミネセンス）の存在を検出することによって、化学発光標識内皮由来Ｉ Ｌ−８特異的抗体の存在を決定する。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ル ミノール、イソルミノール、セロマティク（ｔｈｅｒｏｍａｔ　ｉｃ）アクリジ ニウム・エステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルで ある。

同様に生物発光化合物を用いて、本発明の内皮由来ＩＬ−８特異的抗体を標識し てもよい。生物発光は生物系に認められる化学発光の一種であり、生物発光では 触媒的タンパク質かその化学発光反応の効率を増大させている。発光の存在を検 出することによって、生物発光タンパク質の存在を決定する。標識化のために重 要な生物発光化合物は、ルンフェリン、ル／フェラーゼおよびアエクオリン（ａ ｅｑｕｏｒｉｎ）である。　・ 例えば検出可能標識が放射活性ガンマ放出体であるならば７ンチレー／ヨン計数 器によって、あるいは例えばその標識が蛍光物質であるならば蛍光光度計によっ て、内皮由来ＩＬ−８特異的抗体の検出を遂行できる。酵素標識の場合は、その 酵素の基質を使用する比色法で検出できる。基質の酵素反応の程度を、同様に調 製した標準と目視で比較することによって検出することもできる。

内皮由来ＩＬ−８は活性化された内皮細胞の可溶性産物であり、したがってこの 因子は炎症過程に関与する。用語“炎症”は、特異的および非特異的防御系の両 方の反応を包含するものとする。特異的防御系反応は、抗原に対する特異的免疫 系反応応答である。特異的防御系反応の例には、風疹ウィルスなどの抗原に対す る抗体応答、および、Ｔ〜細胞が媒介する遅延型過敏症応答（例えば、マント− （Ｍａｎｔａｕｘ）試験で“陽性”の個体に認められる）が含まれる。

非特異的防御系反応は、免疫記憶能力のない白血球が媒介する炎症応答である。

このような細胞には、顆粒球、マクロファージ、好中球などが含まれる。非特異 的防御系反応の例には、ハチの刺し傷の迅速な騰脹、やけどの部位に誘発される 赤色化および細胞浸潤、および細ｍ感染の部位でのＰＭＮ白血球の集合（例・細 菌性肺炎における肺浸潤、膿瘍での膿形成）が含まれる。

リウマトイド関節炎、急性および慢性炎症、虚血後（再濯流）白血球媒介性組織 損傷、急性白血球媒介性肺損傷（例　成人呼吸障害症候群）、および池の組織特 異型または器官特異型の急性炎症（例、糸球体腎炎）なとの炎症性疾患過程の診 断、監視および治療に、本発明が容易に適合することは理解されるであろう。

当業者には明らかであろうが、内皮由来ＩＬ＝８の治療的効果は、患者に全内皮 由来ＩＬ−８分子を与えるか、もしくは治療的に活性なそのペプチド断片を与え ることによって得られる。

また、内皮由来ＩＬ−８の活性を増大させるために加えられた、もしくは担体へ の結合を促進するために加えられた、追加のアミノ酸残基を有する内皮由来ＩＬ −８変異体また変種を使用することによって、内皮由来ＩＬ−８の治療的利点を 増大させ得ることも明らかである。本発明の範囲は、内皮由来ＩＬ−８の変異型 （その変異型内皮由来Ｉ　Ｌ１８分子が細胞接着に影響を与える能力を示すかぎ り、いくつかのアミノ酸残基が欠失しているか、あるいはアミノ酸残基か変更さ れている内皮由来ＩＬ−８分子を含む）をも包含すると見なされる。

医薬的に有用な組成物を製造する既知の方法に従い１、本発明の内皮由来ＩＬ− ８ポリペプチドまたはその機能的誘導体を医薬的に許容される担体賦形剤との混 合物中に混合することによって、これらの物質およびその機能的誘導体を製剤化 することができる。適切な賦形剤および他のヒト・タンパク質（例：ヒト血清ア ルブミン）を含むその製剤は、例えば“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａ ｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ″（第１６版、　０ｓｏｌ、　Ａ、　編、 　Ｍａｃｋ、、Ｅａｓｔｏｎ、　ＰＡ（１９８０））に記述されている。効果的 な投与に適した医薬的に許容される組成物を形成するために、このような組成物 は治療的に有効な量の内皮由来ＩＬ−８または機能性誘導体く炎症を減少させる 量、保護する量または白血球接着を阻害する量）を適切な量の担体賦形剤と共に 含有するであろう。

本発明の好ましい生産物は、静脈内投与に適する、内皮由来ＩＬ−８またはその 機能的誘導体を含有する治療的使用のための滅菌医薬組成物である。この生産物 は、適切な担体または希釈剤を添加することによって再構成して使用するための 凍結乾燥体であってもよいし、水性溶液の形態であってもよい。

本発明の凍結乾燥生産物を再構成するためには滅菌希釈剤を使用することができ 、この希釈剤には生理学的条件に近付けるために一般に知られている物質および ／または政府の規定が要求する物質が含まれ得る。これに関連して、滅菌希釈剤 には生理学的に許容されるｐ）ｌを与えるための緩衝化剤（例えば塩化ナトリウ ム、食塩水、リン酸緩衝化食塩水）、および／または、生理学的に許容され（お よび／または）使用に際して安全な他の物質が含まれ得る。一般にヒトの静脈内 注射のための物質は、この分野の人々に利用可能な“Ｆｏ。

ｄ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ″によって確立された規 定に従うべきである。

本発明の医薬組成物は、凍結乾燥生産物の再構成に関して上述した物質の多くを 含有する水性溶液の形態でもよい。

上述のように、本発明の生産物を治療目的で使用される医薬調製物中に組み込む ことができる。しかし用語“医薬調製物”は、本明細書における広義として、治 療目的だけでなく、当該分野で知られている試薬または診断薬のために、もしく は組織培養のためにも使用される、本発明のタンパク質組成物を含有する調製物 を包含するものとする。治療的使用を意図する医薬調製物は“医薬的に許容され る”または“治療的に有効な量”（即ち、予防的または治療的健康基準に必要な 量）の内皮由来ＩＬ−８を含有すべきである。医薬調製物を試薬としてまたは診 断薬として使用する場合は、試薬または診断薬量の内皮由来ＩＬ−８を含有すべ きである。

定義として、１単位の内皮由来ＩＬ−８活性は、標準化したインビトロ検定系に おいて２ｘＬＯ・細胞／ｓｌのＰＭＮＩＩＩｉで５０％のＰＭＮ接着阻害を賢す 。１０倍高濃度の内皮由来Ｉ　Ｌ−８（１０Ｕ／ｍｌ）は８５〜９０％の最大阻 害を貸す。

生体内に投与する治療的および／または診断的投与量は、関与する特定の炎症状 態に依存し、その哺乳類対象の年令、体重、身長、性別、一般的医学的状態、お よび、もしあるならば同時治療の種類に依存するであろう。一般に、約ＬＯＵ／ ｍｌより多い内皮ＩＬ−８活性の有効濃度が得られる量を受容者に与えることが 望ましいが、これより多いまたは少ない量も投与できる。内皮由来Ｉ　Ｌ−８ま たはその誘導体のある調製物の比活性は、以下の実施例の項に説明するインビト ロ生物検定法で決定できる。この方法で、あらゆる内皮由来ＩＬ−８または誘導 体の調製物について、投与量を決定することができる。

本発明の分子を投与するために有用な方法には、局部的、皮下、静脈内、動脈内 、関節内、腹腔内、胸膜内または眼球内投与が含まれる。内皮由来ＩＬ−８また はその機能的誘導体を注射によって投与する場合は、連続的注入または単一もし くは複数ポーラスによって投与することができる。

本発明の方法に有用な効果的分子は、例えば注射用滅菌懸濁剤の形態、あるいは ＥＬＡＭ−１などの炎症関連細胞表面構造に対する抗体を伴う特定の組織部位に 誘導するための封入剤などの形態で使用することができる（Ｂｅｖ　ｉ　ｌ　ａ ｃｑｕａ等、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８４：９２３８−９２４２（１９ｇ７）；　Ｃ ｏｔｒａｎ等、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６４：６６１−６６６（１９８ ６））。

作用の持続を制御するために、追加の医薬的方法を用いることもできる。制御さ れた放出調製物は、内皮由来ＩＬ−８またはその機能的誘導体を錯化または吸収 するためのポリマーを使用することによって達成できる。送達の制御は、適切な 高分子（例：ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレン ビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはプ ロタミン硫酸塩）および高分子の適切な濃度を選択すること、および放出を制御 するために取り込み法を選択することによって達成できる。

制御された放出調製物によって作用の持続を制御する際に考え得るもう１つの有 用な方法は、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）、または エチレン・ビニルアセテート・共重合体などのポリマー物質の粒子中に、内皮由 来ＩＬ−８またはその機能性誘導体を組み込むことである。

別法として、内皮由来ＩＬ−８またはその機能的誘導体をポリマ−粒子に組み込 む代わりに、これらの物質を、例えばコアセルベーション技術または界面重合に よって調製したマイクロカプセル（例：それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース またはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイク ロカプセル）中、コロイド薬剤送達系（例　リポソーム、アルブミン微小球、マ イクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）中、あるいはマクロエマ ルジョン中に封入することもできる。このような技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ 　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ″（１９８０）に開示され ている。

実施例 ここに本発明を完全に記述し終えたので、表示しない限り限定を意図せず、単に 例示の目的で本明細書に記載するいくつかの特定の実施例を参照することにより 、本発明をより明快に理解できるであろう。

炎症性物質および生化学的試薬 以下の試薬を記載した供給源から入手した。ヒト単核細胞由来のＩＬ−１（ｈｍ ｌＬ−１）、ヒト組換えＩ　Ｌ−１−β（ｒ　Ｔ　Ｌ−Ｌβ）およびヒト組換え 顆粒球−単核細胞コロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）：ジェンザイム・インコー ホレイテッド（Ｇｅｎｚｙｍｅ、　Ｉｎｃ、　、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）。大 腸菌中で発現したヒト組換えＩ　Ｌ−１−α（ｒＩＬ−１α）ニジストロン・テ クノロジー（Ｃｉｓｔｒｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｐｉｎｅ　Ｂｒｏｏｋ 、　ＮＪ）。グラム陰性菌内毒素（大腸１１０１１　にＢ４）：ディフッ・ラボ ラトリーズ（Ｄｉｆｃ。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍｌ）。アフィニティー精製 ヒト・インターフェロン・・カンマ（γ−ＩＦＮ）：インターフェロン・サイエ ンシズ・インコーホレイテッド（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　 Ｉｎｃ、　＋　Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）。トリプシン（Ｘ［型）、 トロンビン（ヒト血漿由来）、Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニル アラニン（ｆＭＬＰ）、ホルボール・１２−ミリステート・１３−アセテ−１− （ＰＭＡ）、ゼラチン−アガロースおよび硫酸アンモニウム（ＩＩＩ級）：シグ マ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｃａｌ　Ｃｏ、　、　Ｓｔ、 　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）。ロイコトリエンＢ、（ＬＴＢ、）：バイオモル・イン コーホレイテッド（Ｂｉｏ＠ｏｌ、　Ｉ　ｎｃ、　、　Ｐｈｉ　１ａｄｅｌｐｈ ｉａ、　ＰＡ）。

コンカナバリンＡ−アガロース：ベクター・ラボラトリーズ（ＶｅｃｔｏｒＬａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　ＣＡ）。ヘパリン−セファ ロースＣＬ−６Ｂおよびペプシン−アガロース：ファルマシア（Ｐｈａｒｃｉａ 、　Ｕｐｐｓａｌａ、　５ｖｅｄｅｎ）。フラボノバクテリウム・ヘパリニウム 由来のヘパリナーゼはＨＯｗａｒｄ　Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ博士（マサチニーセッ ツエ科大学、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　ＭＡ）によって提供された。組換えＴ　 Ｎ　Ｆ　（ｒ　Ｔ　Ｎ　Ｆ　）、ｒ　Ｉ　Ｌ−２およびｒＩ　Ｌ−１βはバイオ ジエン・インコーホレイテッド（Ｂｉｏｇｅｎ、　Ｉｎｃ、　、　Ｃａ＠ｂｒｉ ｄｇｅ、　ＭＡ）によって提供された。

以下の実施例では時々、内皮由来ＩＬ−８をＬＡＩ（白血球接着阻害因子）と記 載する。

実施例１ 細胞培養 ヒト書静脈内皮細胞（ＨＥＣ）を単離し、２ないし５帯分節から培養し、プール し、２０％胎児ウシ血清（Ｆ　ＣＳ　；Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 。

Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、ＮＹ）および過去に記述された抗生物質（Ｂｅｖｉ ｌａｃｑｕａ等。

Ｊ、　ＣＩ　ｉｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７６：２００３−２０１１（１９８５） ）を含む培地１９９（Ｍ１９９．Ｍ。

Ａ、　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＶＤ）を用いる一次培 養中で生育させた。０８１％ゼラチン（バクトゼラチン０１４３−０２；Ｄｉｆ ｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒ。

ｉｔ、　Ｍｌ）で被覆したコスタ−組織培養フラスコ（７５ｃ　ｍ　”　；Ｃｏ ５ｔａｒ、　Ｃａａｂｒｉｄｇｅ、　ＭＡ）中で、内皮細胞成長因子（５０〜１ ００　Ｉｔ　ｇ／ｍＬ：Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　 Ｉｎｃ、　、　Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ、　ＭＡ）およびブタ腸ヘパリン（５０−１ ００Ｉｔ　ｇ／＋ｓｌ；Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｇ＋１ｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏ ｕｉｓ、Ｍのを補足したＭ１９９−２０％ＦＣ３を用いて、数株を順次培養した （分配比１：３）。

実験で使用するために、１５１１Ｉｌサーマノツクス（Ｔｈｅｒａ＋ａｎｏｘ） 　・プラスチック・カバースリップ（Ｍｉｌｅｓ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎａ ｐｅｒｖｉｌｌｅ、ル）上、フィブロネクチン（１８ｇ　／　ｃ　ｍ　”　；　 Ｍｅｌｏｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、　ＶＡ） または０１％ゼラチンで被覆した組織培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｇｌａｓｓ　Ｗ ｏｒｋｓ、　Ｃｏｒｎｉｎｇ、　ＮＹ）、または微量滴定ウェル中に、ＨＥＣ株 を接正常なヒト・ボランティアから血液をＣＣＤ緩衝液（１：９；１０ＯＩＱＭ クエン酸ナトリウム、１３０ｄグルコース、ｐ　Ｈ６，５）中に採取した。ＰＭ Ｎの懸濁液（〉９５％）を、Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ等、　Ｊ、　ＣＩ　ｉｎ、　 Ｉｎｖｅｓｔ、　７６：２００３−２０１１（１９８５）の方法に従って調製し た。単核白血球をリンパ球分離培地（Ｌｉｔｔｏｎ　Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ、　Ｉ ｎｃ、　、　Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ、　ＳＣ）上で単離し、さらにＲｅｃａｌｄ ｅ等、　Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈ、　６９ニア１−７７（１９８４） の方法に従って単核細胞が豊富な集団（７５〜８８％）に分画するか、あるいは 血清で被覆したプラスチ、り・ベトリ皿上での単核細胞消耗によってリンパ球懸 濁液（〉９５％）に分画した。前骨髄球細胞株ＨＬ−６０および単核細胞様細胞 株Ｕ９３７を、Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ等（前掲）が記述したように培養した。そ れぞれの型の白血球を、Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ等（前掲）が記述した技術を用い て、目１インジウムーオキシン（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、　、　Ａｒｌｉ Ａｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、　ＩＬ）で放射性標識した。

実施例３ 培地の調製 Ｉ　ＬＬ−１調整培地（’ＩＬ−Ｉ　ＣＭ）または疑似調整培地（疑似ＣＭ）を 調製するために、次の成分・（１）追加タンパク質なし：　（２）５βｇ／ｍｌ 　トランスフェリン、５μｇ／ｍｌインスリンおよび５βｇ／ｍｌセレン（最終 濃度）を含有する限定された非血清添加物（Ｔ　Ｉ　Ｓ　；Ｃｏ１１ａｂｏｒａ ｔ　ｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｃａｍｂｒ　ｉｄｇｅ、　ＭＡ）　；　（３ ）　１％（Ｖ／Ｖ）胎児ウシ血清（ＦＣ３，内毒素＜　０　、０２７　ｎｇ／　 ｍｌ　；Ｈｙｃｌｏｎｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、　。

Ｌｏｇａｎ、　ＵＴ）　；および（４）１０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（Ｂ 　Ｓ　Ａ、　Ｖ画分；　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）　；を含有 するＲＰＭＩ−１６４０（ＲＰＭ　Ｉ　；　Ｍ、　Ａ、　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔ ｓ、　Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、　ＭＤ）中で、全面成長ＨＥＣ単層（１００ ｍｍ皿）をＴ　Ｌ−１（２，５〜５Ｕ／ｍｌ　ｈｍｌＬ−１またはｒＩＬ−β） と共に、あるいはＩ　Ｌ−１非存在下でインキュベートした。

４時間後、サイトカイン含有培地を除くために、すべての皿をＣａ”またはＭｇ ”を含まないハンクス緩衝塩類溶液（ＨＢ　Ｓ　Ｓ　；Ｍ、　Ａ、　Ｂｉｏｐｒ ｏｄｕｃｔｓ）　５　ｍｌで洗浄し、ＲＰＭＩ単独中で、あるいははＴＩＳ、Ｆ Ｃ８１またはＢＳＡを補足したＲＰＭＩ中で、さらに５時間インキュベートした 。培地を集め、遠心分離（４００ｘｇ、１０分間）し、通常は一８０℃で凍結し た。

いくつかの実験では、アクチノマイシンＤ（５βｇ　／　ｍｌ　；　Ｓｉｇｍａ 　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）、アセチルサリチル酸（５００μＭ　；’Ｆｉｓ ｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏ、　、　Ｍｅｄ’ｆｏｒｄ’、　ＭＡ）、 もしくはインドメタシン（５μＭ；Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｔ’　Ｃｏ、　 ）を、ｒｌＬ−１添加の３０分前に内皮培養に加え、前処理段階の間中その培地 中に残しておいた。

実施例４ ＬＡＩの酵素的処理 以下に記述するようにして、ＬＡＩを酵素的に処理した：ＲＰＭ＋＋ＴＩＳ中に 集めた疑似ＣＭおよびＩＬ−Ｉ　ＣＭを、Ｎ、下でアミコンＹＭ３０膜（名目排 除分子量３００００’　；　Ａｍ１ｃｏｎ　Ｃｏｒｐ、　、　Ｄａｎｖｅｒｓ’ 、　ＭＡ）を通して濾過し、トリプシン（１０００Ｕ／ａ＋ｌ、ｐＨ７，３７° Ｃ１１８時間）、トロンビン（２Ｕ／ｌ１１１．３７℃、２時間）、ヘノでリナ ーゼ（１’５Ｕ／＋１．３０℃、２時間）、もしくはペプシン結合アガロース（ ４５００Ｕ／ｍｌ、ｐＨ４，１８時間、３７°Ｃ）で処理した。

煮４（１５分間、１００℃）によって、あるいはペプシン結合アガロースの場合 はベックマン微量遠心器でアガロース・ビーズの除去を伴う遠心分離によって、 酵素処理を停止した。トリプシンおよびトロンビンは、それぞれ色素原基’Ｊｉ ＢＡＥＥ（Ｎ−α−ベンゾイル−し−アルギニン・エチルエステル；　Ｓｉｇｍ ａ　ＣｈｅＩＩｌｉｃａｌ　Ｃｏ、　）ノ加水分解オ・よび血漿凝固活性で決定 した疑似ＣＭ中およびＩＬ−Ｉ　ＣＭ中の完全な活性を保持した。

実施例５ ＬＡＩ活性の検定 ＬＡＩ活性を標準的放射線測定単層接着検定法（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ等、Ｊ。

ＣＩ　ｉｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、’　７６：２００３−２０１１（１９８５）を参 照のこと）で検定した。要するに、サーマノックス・カバースリ、プ上または微 量滴定ウェル中で生育した全面成長ＨＥＣ単層からなる標的単層を、ｒｌＬ−１ β（２５〜５Ｕ／ａ＋１）を含有するＲＰＭ）＋ＦＣ３，もしくはｒ　Ｉ　Ｌ− １βを含有しないＲＰＭＩ＋ＦＣ３中で４時間予備処理した。＋１インジウムで 標識した白血球懸濁液（２ｘｌＯ’細胞／＋ａｌ）をＩ　Ｌ−ＩＣＭ、疑似ＣＭ 、または新鮮なＲＰ　Ｍ　Ｔ　＋　Ｆ　ＣＳまたはＴＩＳ中に直接希釈（最終濃 度＝２ｘｌＯ″細胞／ｍ１）Ｌ、、洗浄した単層に加え、静置条件下３７°Ｃで １０分間インキュベートした。サーマノックス・カバースリップ上のＨＥＣ単層 について標準化された洗浄法（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ等（前掲）を参照のこと） を用いるか、あるいは微量滴定プレートの場合には封印し、反転させ、遠心分離 することによって（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：９２３ｇ−９２４２（１９８７）　；　Ｃｈ ａｒｏ等、a ｌｏｏｄ　６５：４７３−４７９（１９８５）を参照のこと）、この検定を停止 した。

付着している１ｌｌＩｎｌｌＩｎ標識白金、ガン７５５００計数器（Ｂｅｃｋｍ ａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、　、　Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、　ＣＡ ）を用いて、単層に結合した放射活性および白血球調製物の比活性（ａｐｅ／細 胞）から決定した。

阻害率（％）を次のように計算し、平均値上平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表 した： 両側スチ二−デントＴ−検定で有意性を試験した。

実施例６ サイトカインが誘発する、ＰＭＮに対する内皮細胞の接着性の増大図１に示すよ うに、ＨＥＣ単層のｈｍＩ　Ｌ−１による処理は、多形核白血球（ＰＭＮ）に関 する表面接着性の時間依存性増大を肩した。

本発明者らの標準的単層接着検定法（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ等、　Ｊ、　ＣＩ　 ｉｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ。

７６：２００３−２０１１（１９８５）を参照のこと）では、通常通りサイトカ イン含有培地を吸引し、放射性標識した白血球を添加する直前に各ウェルを新鮮 培地で洗浄した。この“洗浄”系では、Ｉ　Ｌ−１処理したＨＥＣ単層に対する ＰＭＮ接着が、Ｉ　Ｌ−１後１時間で非処理単層と比較して有意に増大し、３〜 ４時間で極大接着が起こった後、徐々に減少した。対照的に、予備処理培地を除 去せず、ＰＭＮをウェルに・直接添加した場合（“非洗浄”系）では、特に３時 間後に、ＰＭＮ接着が顕著に少なくなった。非刺激ＨＥＣ単層に対するＰＭＮ接 着は、洗浄および非洗浄の両条件について、すべての試験時点で同じであった。

これらの観測に基づいて本発明者らは、Ｉ　Ｌ−１で刺激したＨＥＣ単層から得 た調整培地はＰＭＮ−内皮接着を阻害する（“白血球接着阻害因子”、ＬＡＩ） 活性を含有するが、非刺激ＨＥＣ単層から得た調整培地はこの活性を含有しない という仮説をたてた。

実施例７ ＬＡＩＡＩ活性定および代謝的評価 刺激された内皮細胞がＰＭＮ−内皮接着の阻害因子を含有するという仮説を試験 するために、１０００１１１皿で生育させた内皮細胞培養から調整培地を集めた 。培養培地を除去するためにＨＥＣを洗浄し、Ｉ　Ｌ−１と共に、あるいはＩ　 Ｌ−１非存在下で、ＲＰＭＩ＋ＦＣ３中で４時間インキュベートし、この時点で ＨＥＣを再度洗浄した。新鮮なＲＰＭＩ＋ＦＣＳ中でさらに５時間インキュベー トした後、ＩＬ−Ｉ　ＣＭおよび疑似ＣＭを集めた。超接着性ＨＥＣ単層（２， ５〜５Ｕ／ａ＋ｌ　ｒ　Ｔ　Ｌ−１βで４時間予備処理したもの）に対するＰＭ Ｎ接着は、疑似ＣＭと比較してＩＬ−Ｉ　ＣＭの存在下で有意に阻害された（７ ２±６％、ｎ＝１０、Ｐ＜０．００１）（図２）。集めた後にｒｌＬ−１β（５ Ｕ／ｍｌ）を加えた疑似ＣＭは阻害効果を有さなかった。内皮細胞の非存在下で ｒｌＬ−Ｌβ（５Ｕ／ｍｌ）含有培地をインキユベートしても、阻害活性は生成 しなかった。

ＨＥＣのアセチルサリチル酸（５００ｇＭ）処理は、構成的ＰＣＩ。

生産およびカルシウム・イオノフオア刺激性ＰＣＩ、生産が減少する条件下で、 ＬＡＩ生産を変えなかった（非処理ＨＥＣのＬＡＩＡＩ活性０〜９７％、３実験 ）。同様の結果がインドメタシン予備処理についても得られ、これはシクロオキ シゲナーゼ経路によるアラキドン酸代謝がＬＡＩＡＩ活性成に不必要であること を示している。

しかし、ｒ　ＩＬ−１（２，５〜５Ｕ／ｍｌ、４時間）で刺激する３０分前にＨ ＥＣをアクチノマイシンＤ（５μｇ／ｍｌ）で処理すると、その後のＬＡＩ生産 が本質的に遮断された（非処理ＨＥＣからのＬＡＩＡＩ活性〜１０％、６実験） 。タンパク質を含まないＲＰＭＩ培地中（６５±４％ＬＡＩ活性、４実験）、血 清非含宵ＴＩＳ補足培地中（５８±３％ＬＡＩ活性、１０実験）、およびＢＳＡ 補足培地中（５７＋６％ＬＡＩ活性、５実験）に集めたＩＬ−Ｉ　ＣＭ中には同 等のり、ＡＩ活性が検出された。

上記の観測結果は、サイトカインで刺激された内皮細胞によるＬＡＩＡＩ活性成 にはデノホタンパク質合成が必要であること、並びに、ＬＡＩＡＩ活性くつかの 外から添加した培地成分（例：血清因子またはＩＬ−１）の中間代謝物から貸さ れるものではないことを示唆している。

ヒト組換えｒ　Ｌ−１βおよび天然のヒト単核細胞由来Ｉ　Ｌ−１に加えて、ヒ ト組換えＩ　Ｌ−１α（ＩＯＵ／ｍｌ）、ヒト組換えＴＮＦ（１００Ｕ／ｍｌ） 、および細菌Ｌ　Ｐ　Ｓ　（１１１ｇ／ｍＩ＞も、次の表１でわかるように、Ｈ ＥＣ単層によるＬＡＩ活性の生成を誘発した。

表１ 培養したヒト内皮細胞によるＬＡＩ生産の刺激因子メディエータ−ＰＭＮ接着の 阻害率（％）ｈｍ−Ｉ　Ｌ−１（５Ｕ／ｍｌ）　７２±６ｒ　［Ｌ−１ａ　（１ ０Ｕ／ｌｌ＋ｌ）　５８±７ｒｌＬ−１β（２，５Ｕ／ｍｌ）　６９±１０（＋ ポリミキシンＢ）　６６±７ （十熱）　７±１３ ＬＰＳ　（１βｇ／ａ＋１）　３９±８（＋ポリミキシンＢ）　１２±３ （十熱）　３３±５ ｒＴＮＦ　（２００Ｕ／＋１）　５４±４ＩＦＮγ　（２００Ｕ／ｍｌ）　１± ９ＧＭ−ＣＳＦ（２００ｎｇ／ｍｌ）　−１±１５Ｉ　Ｌ−２（５００Ｕ／ｍｌ ）　−９±９エータ−と共に４時間処理し、洗浄し、ＲＰＭＩ＋ＦＣ８中で５時 間インキュベートした。調整培地を集め、希釈することなく、洗浄したＩ　Ｌ− １処理（５Ｕ　ｒＩＬ−１β、４時間）ＨＥ　Ｃ単層に対して標準的単層細胞接 着検定法で検定した。データを平均値：ＳＥＭとして表す。

硫酸ポリミキシンＢ（２０μｇ／ｍｌ）処理は、ＬＰＳの刺激効果を中和したが 、ｒｌＬ−１βの効果を減じなかった。対照的に、ｒｌＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ ）、ｒ　Ｔ　Ｆ　Ｎ−γ（２００Ｕ／＋ｉｌ）、およびＧＭ−ＣＳＦ　（２００ Ｕ／ｍｌ）はＬＡＩ生産を刺激しなかった。さらに、下の表２に詳細を記載する ように、ＩＬ−Ｉ　ＣＭ中のＬＡＩ活性は、ＴＮＦ　（２００Ｕ／ｍｌ、４時間 ）およびＬＰＳ（１βｇ／ｍｌ、４時間）で活性化したＨＥＣ単層に対するＰＭ Ｎ接着をも阻害した。同様に、ＴＮＦ調整培地およびＬＰＳ調整培地もＩＬ−１ 、ＴＮＦ、およびＬＰＳて活性化した内皮単層に対するＰＭＮ接着を阻害した。

Ｉ　Ｌ−１で刺激したＨＥＣから得た調整培地は、ＴＮＦ（２００Ｕ／ｍｌ、４ 時間：５４±４％、５実験）、ＬＰＳ（１βｇ／３１．４時間；５６±７％、３ 実験）、またはＩ　Ｌ−１（２，５Ｕ／＋Ｌ　４時間；６８±４．５実験）で活 性化したＨＥＣ標的単層に対するＰＭＮ接着を同等に阻害した（下の表２を参照 のこと）。対照的にＩＬ−Ｉ　ＣＭは新鮮ヒト血／＊（４±３％阻害、４実験） 、補体除去ヒト血清く一１０＝４％、３実験）またはザイモサンで活性化したヒ ト血清（−８±１０％、３実験）で被覆したプラス千ツク表面に対するＰＭＮ接 着を阻害しなかった。これらの結果は、非活性化内皮細胞に対するＰＭＮ接着に 対する効果がないことと合わせて、ＬＡＩは“超接着性”内皮細胞表面と白血球 の相互作用を選択的に阻害するよう作用することを示唆している。

表２ サイトカイン活性化ＨＥＣ単層および内毒素活性化ＨＥＣ単層で検定した、サイ トカインで刺激したＨＥＣおよび内毒素で刺激したＨＥＣ由来のＬＡＩ活性 ＩＬ−ＩＣＭ　６８±４　５４±４　５６±７ＴＮＦ　ＣＭ　４５±９　３８± ９　３６±８ＬＰＳＣＭ　３９±８　３１±７　１２±３本サイトカインで刺激 したＨＥＣ単層および内毒素で刺激したＨＥＣ単層から実施例３に記述したよう に調整培地（ＣＭ　）を集めた。

標的ＨＥＣ単層をｒｌＬ−１β（５Ｕ／ｍｌ）、Ｔ　Ｎ　Ｆ　（２００Ｕ／ａ＋ １）、またはＬＰＳ（１μｇ／ｌ１ｌ）で４時間予備処理し、試験培地に再懸濁 したＩＩＩ　ｉｎ標識ＰＭＮを添加する直前に洗浄した。ＰＭＮ接着を定量的単 層接着検定法（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ等、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、 　７６：２００３−２０１１（１９８５））で決定した（実施例５を参照のこと ）。データを３回の別個の実験の平均値土ＳＥＭとして表す。

ＬＡＩ活性の生成はＩ　Ｌ−１度依存性であって、Ｑ、ｌＵ／ｍ１ｒｊＬ−１β に閾を有し、２５〜５Ｕ／ｍｌに最大を有することがわかった（図３）。ＩＬ’ −ＩＣＭ中のＬＡＩ出現は阻害活性に関して時間依存性であり、１時間毎に集め た培地中で、１〜２時間で検出可能であり（３０±６％、ｎ＝５）、Ｉ　Ｌ−１ 後５〜６時間で最大に達しく６５±２％）した。９時間後、活性の減少が認めら れた（図９参照のこと）。

ＬＡＩ活性はアミコンＹＭ３０（名目排除分子量−３００００）を通過したが、 アミコンＹＭ５（名目排除分子量＝５０００）で１０〜２０倍に濃縮された。Ｐ ＭＮ接着の阻害は５倍濃度のＩＬ−Ｉ　ＣＭで最大に遮断され（ＰＭＮ接着の７ ５±７％阻害、ｎ−５）（図４）、より低いＩＬ−Ｉ　ＣＭ濃度では検出可能な ＬＡＩ活性が比例して減ＬＡＩ活性の標的の評価 ＬＡＩ活性が白血球に対して阻害効果を発揮するのか、それとも内皮細胞に対し て阻害効果を発揮するのかを決定するために、それぞれの型の細胞を選択的に予 備処理した。活性化ＨＥ　Ｃｌ１ｌ（５Ｕ／ｍｌ　ｒ　Ｉ　Ｌ−１，４時間）を ＩＬ−Ｉ　ＣＭと共に３０分間インキュベートした後、新鮮培地（１，５＋］） で交換した場合、ＰＭＮ接着の阻害は認められなかった（５土８％阻害、Ｐ＞０ ．０５．３実験）。

対照的に、ＰＭＮ（１，５ｍｌ中に３ｘｌＯ’細胞）をＩＬ−Ｉ　ＣＭで３０分 間予備処理し、遠心分離（１００ｘｇ、２分間）し、同等量の新鮮培地に再懸濁 し、活性化したＨＥＣ単層を加えた場合、ＰＭＮ接着が有意に阻害された（２５ ±３％阻害、Ｐ＜０．００１．３実験）。

さらに、固定したＩ　Ｌ−１刺激ＨＥＣ単層（２％パラホルムアルデヒド（ＰＢ Ｓ中）、５分間、２２６Ｃの後、Ｐ　Ｍ　Ｓ　＋　Ｂ　Ｓ　Ａ中４℃で終夜保存 したもの）に対する非固定化ＰＭＨの接着はＩＬ−Ｉ　ＣＭによって有意な阻害 を受け続けた（４５土９％阻害、２実験）。対照的に、ＰＭＮを藺単に固定（２ ％バラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）、氷上５分間）すると、ＬＡＩの阻害効果 が８０％以上減少した。ＰＭＮ固定自体は非処理またはＩ　Ｌ−１処理Ｈ’ＥＣ 単層の接着を変化させなかった。これらの観測事実は、ＬＡＩの阻害作用が主と して白血球に向けられていることを立証している。

図５に示すように、ＬＡＩは、サイトカインで活性化した内皮および非活性化内 皮に対するいくつかの血液白血球の接着に弁別的に影響を与えるようである。Ｉ Ｌ−Ｉ　ＣＭは一貫して活性化ＨＥＣ単層に対するＰＭＮ接着の顕著な阻害を貸 したが（サイトカインで刺激した接着の７６±４％阻害、Ｐ＜０．００１．５実 験）、非活性化単層に対するＰＭＮ接着には効果を有さなかった。同様に、活性 化ＨＥＣ単層に対する単核細胞接着は有意に阻害されたが（サイトカインで刺激 した接着の５５±１２％阻害、Ｐ＜０．０１．５実験）、非活性化単層に対する 比較的大きい接着に対する効果は認められなかった。対照的に、ＩＬ−ＩＣＭは 、Ｉ　Ｌ−１で活性化したＨＥＣ単層や非活性化ＨＥＣ単層に対する末梢血液リ ンパ球（−４土６％阻害、Ｐ＞０．１．３実験）、ＨＬ−８０細胞（２土６％阻 害、ｐ＞ｏ。

１．４実験）、または０９３７（１土９％阻害、ｐ＞ｏ、ｔ、４実験）の接着に 有意な変化を与えなかった。

ＬＡＩ存在下および非存在下における活性化ＨＥＣ単層に対するＰＭＮ接着のバ イタル顕微鏡検査によって著しい相違が明らかになりた。疑似ＣＭでは単層表面 に多数のＰＭＮが強固に付着した（図６Ａ）。対照的に、ＬＡＩの存在下でＰＭ Ｎ接着の程度は顕著に減少し、これは定置的放射線測定検定に合致した。興味深 いことに、個々のＰＭＮは形状変化に耐えたが、それらは単層表面上に広がって いないようであった（図６Ｂ）。

実施例９ ＰＭＮ活性化の検定 可溶性刺激物質（１０−’Ｍ　ｆＭＬＰ、１０−’　ＬＴＢ、、１１００ｎ／Ｉ ｌｌｌＰＭＡ）に対するＰＭＮ応答性を、膜ポテンシャルおよび細胞質ゾル遊離 カルシウム濃度の変化を定量的に測定することによって評価した。

膜ポテンンヤルの変化を、３７°Ｃに制御したキュベツト隔室を伴う５ＰＥＸフ ルオロログＩ＋蛍光分光光度計を用いて、蛍光性シアニン・プローブｄ　ｉ　Ｓ 　Ｃ，−５（Ｔｈｉｔｉｎ等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５５＋１８ ７４−１８７８（１９８Ｇ）　；　Ｌａｚｚａｒｉ等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｔ　２６１：９７１０−９７１３（１９３６）を参照のこと）で見積もった 。

Ｃａ”感受性Ｆｕｒａ−２蛍光の測定のために、ＰＭＨの懸濁液（１０７細胞／ ｍｌ）を、Ｃａ”およびＭｇ”を含有しないＨＢＳＳ中に再懸濁し、最終濃度１ μ輩のＦ　ｕｒａ−２／　ＡＭ（保存液、ｌｌｌ１１ジメチルスルホキシド）と 共に３７℃で１０分間インキュベートした。冷ＨＢＳＳと共に遠心分離すること によって細胞を２回洗浄し、１０℃に保存した。細胞をＨＢＳＳで５倍に希釈し 、さらに３７℃で１５分インキュベートした。検定の直前に、べ・１クマン微量 遠心器（モデルＢ）で細胞をペレット化し、温かいＨＢＳＳ＋Ｃａ”およびＭｇ ”１．６＋ａｌに再懸濁し、キュベツト中で５分間平衡化した後、アゴニスト（ 作用薬）を加えた。

ビーム・スプリッター、励起モノクロメータ−２個、および２波長（３４０Ｇｍ および３８０　ｎａ＋）で迅速に変化（３０Ｈｚ）するＦｕｒａ−２の励起を可 能にするよう特殊化した光学的配置のデュアル・ミラー遮断機構を装着したＳ　 Ｐ　Ｅ　Ｘ　（Ｅｄｉｓｏｎ、　ＮＪ）フルオロログＩＩ（モデルＣＭ−１）蛍 光分光光度計で蛍光測定を行った。励起帯幅を６．６ｒ＋ｍ＋こ設定した。放出 された蛍光シグナル（５０５Ｇｍ、７．２ｎＭ）の比から、細胞数、色素充填お よび色素褪色に依存しない細胞内Ｃａ”濃度が計算できる。８０μＭジギトニン で細胞内および細胞外Ｃａ”を平衡化（最大）シタ後、ＩＭＴＲＩＳ、３０ｏＩ ＩＩＭＥＧＴＡ（ｐＨ〉１０゜０）を添加（最小）することにより、蛍光シグナ ルに目盛りをつけた。

細胞内Ｃａ”の基礎量および最大増大量を、Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ等、　Ｊ、 　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　２６０：３４４０−３４５０（１９８５）に記述されているように 計算した。Ｃｏｈｅｎ等、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　６１：１０８ １−１０８８（１９７８）に従って、スーパーオキシド生成を決定した。

（以下余白） 実施例１０ 他のＰＭＮ機能に対するＬＡＩの効果 可溶性炎症刺激物質に対する応答としての刺激応答シグナル化およびスーパーオ キシド生産をも試験した。ＩＬ−Ｉ　ＣＭまたは疑似ＣＭの添加は、休止膜ポテ ンシャルを変化させないか、もしくは１０−’ＭｆＭＬＰ、１０−’Ｉ　ＬＴＢ ４、または１００　ｎｇ／　ｍｌ　Ｐ　ＭＡが誘発する膜脱分極を阻害しなかっ た（図７Ａ）。同様に、ＩＬ−ＩＣＭおよび疑似ＣＭは共に、ｆＭＬＰか誘発す る細胞質ゾル・カルシウムレベルの増大に変化を与えなかった（図７Ｂ）。１０ −’１１ｆＭＬＰまたはｌ　ＯＯｎｇ／ｍｌ　ＰＭＡに対する応答としてのスー パーオキシド生産もＬＡＩによって阻害されなかった（データは示していない） 。これらの結果は、ＰＭＮにおいて、活性化シグナルの変換（膜脱分極および細 胞質ゾル遊離カルシウムの上昇に反映される）および細胞応答（スーパーオキシ ド生成など）がＬＡＩによって阻害されないことを示している。

生化学的特徴づけ 予備的な生化学的特徴づけを促進するために、血清非含有トランスフェリン／イ ンスリン／セレン補足培地中のＩ　Ｌ−１活性化Ｈ，ＥＣ単層からＬＡＩを集め た。これらの調製物中のり、ＡＩ活性は、煮沸２０分間、酸性化（ｐＨ２または ４）１８時間、凍結（−８０°Ｃ１３力月まで）、およびプロテアーゼ阻害剤を 添加せずに４°Ｃで１４日間までの保存、を含む種々の処理に対して安定である ことがわかった。ＬＡＩＡＩ活性沈降性（２５００００ｘｇ、４５分間）であり 、このことは、これが膜断片に結合しているのではなく、可溶性であることを示 唆している。ＬＡＩＡＩ活性ラチン−アガロースまたはコンカナバリン−Ａ−ア ガロースによって吸着されない。３００００分子量排除膜を通して濾過したＩＬ −Ｉ　ＣＭの、トリプシン（１０００Ｕ／ｍｌ、ｐＨ７，３７６Ｃ１１８時間） 、トロンビン（２Ｕ／１．３７°Ｃ，２時間）、またはヘバリナーゼ（１５Ｕ／ １Ｉｌｌ、３０°Ｃ，２時間）による処理は、ＬＡ■活性に影響を与えなかった 。しかし、ペプシン結合アガロース（４５００Ｕ／ｍｌ、ｐＨ４，３７℃、１８ 時間）による処理は、非処理対照中のＬＡＩを有意に減少させた。ＬＡｌ活性は ６０〜８０％飽和硫酸アンモニウムで沈殿し、この画分にすへての活性が回収さ れた。これらの結果はＬＡＩの生物学的活性がタンパク質成分に依存することを 立証している。

実施例１２ 高性能液体クロマトグラフィーによるＬＡＩの精製モデル５１．０溶媒ポンプ２ 個とプログラマブル・システム・コントローラー勾配調製装置からなるウォータ ーズ・アソシエーツ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、　ＭＡ）液体クロマトグラフィー・シス テムでＨＰＬＣを行った。

ウォーターズ・モデル４８１吸光度検出機を用いて、カラム流出液を２８０ｎｍ で監視した。ＲＰＭＩ＋ＴＩＳ中のＩＬ−Ｉ　ＣＭおよび疑似ＣＭをアミコンＹ Ｍ３０膜で濾過し、その流出液をＹＭ５膜（名目排除分子量５０００）で２０〜 ４０倍に濃縮し、蒸留水に対して透析（スペクトラポール７、排除分子量１００ ００　；　Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｍｅｄ。

Ｉｎｄ、　、　Ｌｏｓ　Ａｎｇｅｌｅｓ、　ＣＡ）　Ｌ、凍結乾燥した。凍結乾 燥試料を０．２Ｍ酢酸、０１Ｍトリエチルアミン釦Ｈ３，９）で約１ｍｇ／ｓｌ の濃度ζこＭＷ成し、ウォーターズ・プロティン−バック１２５ゲル濾過カラム （７，８ｍｍｘ　３０ｃａ＋）にかけた。このカラムを無勾配系として流速１． ８ｍｌ／分で行い、各０．９ｍｌの分画を集めた。分画をリン酸緩衝化食塩水（ １３６ｍＭＮａＣｌ、０．３ｄ　ＫＣｌ、０．８ｍＭ　ＮａｔＨＰＯ，，０，１ ｍＭ　ＫＨ，ＰＯ，、ｐ　Ｈ７，４）に対して１８時間（４°Ｃ）透析した。分 画をＲＰＭＩ＋ＦＣ３で希釈し、標準的単層接着検定法で検定した。バイオラッ ド・タンパク質試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈ ｍｏｎｄ、　ＣＡ）を用いてタンパク質量を決定した。

凍結乾燥ＩＬ−Ｉ　ＣＭの試料を、上述のように高圧液体クロマトグラフィーに よってウォーターズ・プロティン−パック１２５ゲル濾過で分画した。分画（０ ，８ｍ１）をリン酸緩衝化食塩水（ｐＨ７，４）に対して透析し、ＲＰＭＩ＋Ｆ Ｃ５で１・１０に希釈し、標準的単層接着検定法で検定した。この系では、ＬＡ Ｉ活性の極大（第１２分画）か主タンパク質極大（第９分画）から分離した（図 ８参照のこと）。極大分画中のＬＡＩ活性をＰＭＮＭＮＯＳ０％阻害までの連続 希釈によって計算したところ、８０倍の有効濃度で存在した。回収された活性と して連続希釈で評価したＬＡＩの収率は、９０％より高かった。予備的な実験で 、極大分画中のＬＡＩ活性は煮沸および酸性化に対して安定であり、ベプ／ン処 理によって完全に破壊された（非処理対照中６２±１０％ＬＡＩ活性に対してペ プシン処理試料中−８±６％ＬＡＩ活性）。

実施例１３ 内皮保護検定 ヒト内皮細胞をゼラチン被覆微量滴定ウェル上で過去に報告されたようにして全 面成長させた（Ｗｈｅｅｌｅｒ等、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８２ ：１２１１（１９８８）およびＬｕ５ｃｉｎｓｌｅａｓ等、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、　１４２：２２５７（１９８９）を参照のこと）。次のこの単層を培地（ ＲＰＭＩ＋１％ＦＢＳ）で２回洗浄した。

１００μ＋培地＋／−１０単位／ｍｌ　ｒ　ｈ　ｒ　Ｌ−１βを各ウェルに加え 、３７°Ｃで４時間インキュベートした。Ｉ　Ｌ−１処理後、単層を培地で１回 洗浄した。次にヒト血液ＰＭＮ（２ｘ　１０５〜２ｘｌＯ＠／ウエル）を、試験 物質を含有する１００μｍ培地（ｒ　ｈ　Ｉ　Ｌ−８に関して１〜５００ｎＭを 試験した）に加えた。次にこのプレートを３７℃で１０〜２時間インキュベート した。このインキュベート後、ウェルを培地で満たし、封印し、反転させ、２５ ０ｇで５分間遠心分離した。次にこのウェルの液体を排除し、２％バラホルムア ルデヒド　１００μｍを１５分間加えることによって固定した。固定後、ウェル をライトーゲイムサ染色（ｆｒｉｇｈｔ’　５−Ｇｅ１ｍ５ａ　５ｔａｉｎ）で 染色し、顕微鏡で調べることにより、ＰＭＮＭＮＯＳおよび内皮単層の損傷程度 を決定した。図１０を参照のこと。

本発明をその特定の態様に関して記述したが、さらなる改変が可能であることは 理解されるであろう。この出願は、一般に本発明の原理に従う本発明のあらゆる 変法、使用または適合、並びに、本発明が関連する技術分野において既知または 常法となるような本開示からの逸脱、および本明細書の上記の記述および後述の 特許請求の範囲に説明する基本的特徴に適用され得るような本開示からの逸脱を 含む本発明のあらゆる変法、使用または適合を包含するものとみなされる。

接　看　ＰＭＮ／ｍｍ” 接　看　ＰＭＮ／ｍｍ　２ ｒＩＬ−１β濃度（Ｕ／ｍＩ） 図３ Ｉ　Ｌ−１で処理した内皮細胞調整培地の相対濃度図４ 接　着　白血球／ｍｍ　２ ＦＩＧ、６Ａ ＦＩＧ、６Ｂ 図　７（Ａ） タンパク質含量　（ｍｇ／ｍｌ） （ＰＭＮ接看の阻害率（％）） 時間 図９ 国際調査報告 −一一−ａ−−−１昧ＰＣＴ／Ｕ５９Ｑ　／　Ｑ６　ｅ、Ａｎ−−＾−Ｃ−１１ ＠亡／ＩＩぐＱ／１／＾４く鮎

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．白血球の、別の細胞表面への接着を阻害し得る、実質的に天然の夾雑物を含 まない内皮由来ＩＬ−８ポリペプチド。
2. ２．該ポリペプチドが別の細胞表面に対する白血球の接着を阻害し得る内皮由来 ＩＬ−８の断片からなる請求項１の内皮由来Ｉレ−８。
3. ３．該分子が検出可能に標識されている請求項１または２の内皮由来ＩＬ−８ポ リペプチドまたはその断片。
4. ４．該ポリペプチドが、放射性同位体、酵素、蛍光標識、常磁性標識、および遊 離基標識からなる群から選択される標識で検出可能に標識されている請求項３の 内皮由来ＩＬ−８ポリペプチド。
5. ５．該ポリペプチドが、試料中の内皮由来ＩＬ−８の濃度を決定するための検定 に使用される請求項４の内皮由来ＩＬ−８ポリペプチド。
6. ６．炎症を有すると疑われる哺乳類対象中の炎症の存在および位置を診断する方 法であって、 （ａ）検出可能に標識された、内皮由来ＩＬ−８を同定し得る結合分子を該対象 に投与し； （ｂ）該結合分子を検出する； ことからなる方法。
7. ７．炎症を有すると疑われる哺乳類対象中の炎症の存在および位置を診断する方 法であって、 （ａ）該対象の組織の試料を、検出可能に標識された、内皮由来ＩＬ−８を同定 し得る結合分子の存在下でインキュベートし；（ｂ）該組織の該試料中に結合し ている該結合分子を検出する；ことからなる方法。
8. ８．（ａ）細胞供給源から調整培地を採取し；（ｂ）該調整培地を限外濾過する ことによって内皮由来ＩＬ−８含有分画を得； （ｃ）該内皮由来ＩＬ−８含有分画を限外濾過によって濃縮および脱塩し； （ｄ）該内皮由来ＩＬ−８含油分画をアセトン沈殿によって凍結乾燥および脱脂 質化し；（ｅ）該内皮由来Ｉし−８含有分画をＨＰＬＣクロマトグラフィーによ ってゲル濾過し； （ｆ）該内皮由来ＩＬ−８含有分画をイオン交換クロマトグラフィーにかけ； （ｇ）操作（ｆ）で得た濾液を実質的に純粋な形態で回収する；ことからなる実 質的に純粋な形態で内皮由来ＩＬ−８を回収する方法。
9. ９．請求項８の方法によって生産される内皮由来ＩＬ−８。
10. １０．炎症減少量のＩＬ−８および医療的に許容される担体からなる、哺乳類対 象の炎症の治療に有用な医薬組成物。
11. １１．該ＩＬ−８が内皮由来ＩＬ−８である請求項１０の医薬組成物。
12. １２．哺乳類対象の炎症を治療する方法であって、そのような治療を必要とする 該対象に請求項１０の医薬組成物を与えることからなる方法。
13. １３．該炎症が急性または慢性炎症性疾患過程の一部である請求項１２の方法。
14. １４．白血球によって媒介される別の細胞に対する損傷から保護する方法であっ て、 該細胞の近傍で、白血球が媒介する損傷を阻害するのに十分な有効濃度のＩＬ− ８またはその誘導体を確立する；ことからなる方法。
15. １５．該ＩＬ−８が内皮由来ＩＬ−８である請求項１４の方法。
16. １６．白血球によって媒介される別の細胞に対する損傷から保護する方法であっ て、 白血球が媒介する該細胞に対する損傷を阻害するのに有効な濃度のＩＬ−８また はその誘導体で白血球を処理する；ことからなる方法。
17. １７．該ＩＬ−８が内皮由来ＩＬ−８である請求項１６の方法。
18. １８．該細胞が内皮細胞である請求項１４または１６の方法。
19. １９．該白血球が好中球である請求項１８の方法。