JPH05506360A - イン・ビボにおける特定タンパク質のトランス脱安定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ユビキチンは７６個の残基から成るタンパク質であり、遊離状懸またはカルボキ シル末端グリシン残基部分で様々な細胞質タンパク質、核タンパク質、および完 全膜のタンパク質と共有結合した状態で真核生物中に存在する。ユビキチンと上 記タンパク質の結合は１群のユビキチンコンジュゲート化酵素（Ｅ２酵素とも呼 ばれる）によって触媒される。ユビキチンのアミノ酸配列は公知のタンパク質で は匹敵するものがないほど高度に真核生物に保存されているという事実から、ユ ビキチンが基本的な細胞機能に関与していることが示唆されているが、ユビキチ ンの生物学的役割については比較的最近までよくわかっていなかった。

ユビキチンは真核細胞中のＡＴＰ依存依存性タンパ分質分解要ないくつかの因子 の一つであることがわかってきた。細胞内タンパク質分解はＡＴＰ依存性である 場合が多いが、その機能の一つとして、損傷タンパク質やその他の異常タンパク 質の選択的除去が挙げられる。もう一つの機能は、例えば多くの調節タンパク質 の場合のように細胞内濃度が経時的に変化する未損傷タンパク質の半減期を短く することである。

などの大型の巨大分子複合体の成分として長命であるが、遊離の米会合状態では 代謝的に不安定である。（「代謝的不安定性（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　１ｎｓｔａ ｂｉｌｉｔｙ）」という用語は、インービボにおける物理的実体としてのタンパ ク質の半減期が比較的短いことを意味する。ここで「代謝的」という形容詞は、 この性質と、イン・ビボにおける物理的実体の存在としてではなく高次構造的安 定性または化学的安定性を意味することが多い用語「安定性」とを区別するため に用いている。）最近の研究で、多くの短命タンパク質の選択的分解のためには 、ユビキチンが標的化タンパク質分解基質にコンジュゲート化する予備的段階が 必要であることがわかった。ユビキチンの役割の一つに、ユビキチンータンパク 質コンジュゲートに特異的なプロテアーゼによる攻撃のシグナルとしての作用が あるとする提案がなされている［フィンレイとバルシャフスキー（Ｐｉｎｌｅｙ 　ａｎｄ　Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ　）　、　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　 Ｓｃｉ、　］］０：３４３−３４８（１９８５）が検討］。

ところが、この解釈では、どのようにして細胞内タンパク質が最初にタンパク質 分解基質として認識されるのかという標的化の問題は未解決のままであった。少 なくとも一部の短命タンパク質は、特定のタンパク質分解経路の基質たらしめる 配列〔分解シグナル（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌｓ）　）を含んで いるのでタンパク質分解基質として認識される。ある程度詳細に理解されるべき 第１の分解シグナル（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ）は、タンパク質 のアミン末端残基と特定の内部リジン残基という２つの異なる決定基から成る［ バクマイア（Ｂａｃｈｍａｉｒ）（１９８９）］　、このＮ−末端規則（Ｎ−ｅ ｎｄ　ｒｕｌｅ）、すなわちタンパク質の代謝安定性（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　５ ｔａｂｉｌｉｔｙ）をそのタンパク質のアミノ末端残基の同一性と関係付けてい る決まり［バクマイア（Ｂａｃｈｍａｉｒ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：１７ ９−１８６　（１９８６）］は、酵母から哺乳類まで調べた真核生物すべてにお いて異なる様式のＮ−末端規則（Ｎ−ｅ、ｎｄ　ｒｕｌｅ）が働いているという 点で普遍的である［ゴング（Ｇｏｎｄａ　）ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、 　２６４：１６７００−１６７１２　（１９８９）　］。

Ｎ−末端規則（Ｎ−ｅｎｄ　ｒｕｌｅ）に基づく分解シグナルの第２の必須決定 基、これを本明細書では第２決定基（ｓｅｃｏｎｄ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ） と呼ぶが、これは、マルチュビキチン鎖付着部位となる基質タンパク質内の特定 の内部リジン残基である。タンパク質のその後の分解のためには、標的化短命（ ｓｈｏｒｔ−１ｉｖｅｄ）タンパク質上にマルチュビキチン鎖ができることが不 可欠である（図１）。ユビキチンと他のタンパク質との酵素的コンジュゲーショ ン化では、ユビキチンのカルボキシル末端グリシン残基と受容体タンパク質のり ジン残基のε−アミノ基の間にイソペプチド結合が形成される。マルチュビキチ ンにおいては、ユビキチン自体が受容体となり、いくつかのユビキチン部分が最 初の受容体タンパク質に連続的に付着して分岐ユビキチンーユビキチンコンジュ ゲート鎖ができる［チャウ（Ｃｈａｕ）　ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４３：１５ ７６−１５８３　（１９８９）コ　。

細胞内のタンパク質の代謝安定性を支配する基本側の解明、特にＮ−末端規則に 基づく分解シグナルの解読によって、タンパク質を操作してイン・ビボの半減期 を変えることができるようになった［バクマイアとバルシャフスキー（Ｂａｃｈ ｍａｉｒ　ａｎｄ　Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ　）　、　Ｃｅ１ｉ　５６：ｌ０１９ −１０３２　（１９８９）］　、この強力な手法の能力を最大限に生かすために は、これらの分解シグナル、その成分、およびその相互関係をさらに詳細に理解 する必要がある。

発明の概要 本発明ハ、特定のタンパク質またはペプチドの代謝的脱安定化（ｍｅｔａｂｏｌ ｉｃａｌｌｙ　ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ）　（すなわちタンパク質またはペ プチドの分解（ｄｅｇｒａｄａ　ｔ　１ｏｎ）のための標的化）のための方法お よび組成物に関する。対象タンパク質またはペプチドはＮ−末端規則に基づく分 解シグナルの第２決定基（ｓｅｅａｎｄ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を含んでい なければならない。本発明の方法は、対象タンパク質またはペプチドを該タンパ ク質またはペプチドと特異的に相互作用する標的化タンパク質またはペプチドと 接触させるプロセスを含む。標的化タンパク質またはペプチドは、タンパク質分 解のＮ−末端規則に従って脱安定化するアミノ末端アミノ酸を有してはいるがＮ −末端規則に基づく分解シグナルの第２決定基を欠くことを特徴とする好ましい 態様においては、対象タンパク質またはペプチドおよび標的化タンパク質または ペプチドは生細胞内の同じオリゴマータンパク質のサブユニットまたはその一部 である。

タンパク質分解のＮ−末端規則に基づ（膜安定化性アミノ末端アミノ酸を有する がＮ−末端規則に基づく分解シグナルの第２決定基を欠いている標的化ペプチド またはタンパク質をコードする発現可能ＤＮＡ構築物で細胞を形質転換する。

膜安定化性アミノ末端アミノ酸残基を育する標的化（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）ペプ チドまたはタンパク質を作成する方法の一つは、対象タンパク質またはペプチド と特異的に相互作用するペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列とフ レーム内で融合させたユビキチンから成る発現可能ＤＮＡ構築物で真核細胞を形 質転換することである。

本明細書で説明する方法は、対象タンパク質またはペプチドの代謝的脱安定化を 容易にする。本方法の要件の一つは、対象タンパク質またはペプチドと特異的に 相互作用するペプチドまたはタンパク質を同定する必要があることである。はぼ すべてのタンパク質は他のタンパク質と特異的に相互作用するので、本方法は対 象タンパク質またはポリペプチドを代謝的に脱安定化させる方法として広く適用 できる。

図面の簡単な説明 図１は、モノマータンパク質におけるＮ−末端規則に基づく分解（ｄｅｇｒａｄ ａｔｉｏｎ）シグナルの２つの決定基の構成を示すダイアグラムであり、ｄとＳ はそれぞれ膜安定化性アミノ末端残基および安定化性アミノ末端残基を表わし、 第２決定基リジン（Ｋ）と連結している黒塗り楕円鎖はマルチュビキチン鎖を表 わす。

図２は、Ｎ−末端規則経路におけるシスおよびトランス認識を示すダイアグラム である。

図３は、Ｕｂ−Ｘ−βｇａｌで例示されるユビキチンータンパク質融合体を使用 してあらかじめ決めておいたアミン末端残基を有する供試タンパク質を作る方法 を示すダイアゲラに脱安定化させる方法を示すダイアグラムである。

図５は、対象タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一または実質的に相同のアミ ノ酸配列を有するペプチドを利用してイン・ビボで対象タンパク質を代謝的に脱 安定化させる方法を示すダイアグラムである。

図６は、遺伝子スクリーン（ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｃｒｅｅｎ）を利用して対象タ ンパク質のアミノ酸配列の一部と同一または実質的に相同のアミノ酸配列を有す るとともにイン・ビボで対象タンパク質を代謝的に脱安定化させるポリペプチド を同定する方法を示すダイアグラムである。

図７は、いくつかの遺伝子的構築物およびそれらを利用してＮ−末端規則に基づ く分解シグナルを切断する方法を示すダイアグラムである。

図８は、網状赤血球抽出物中のＸ−βｇａｌホモテトラマーのＡＴＰ依存性ユビ キチン化および分解を示すダイアグラムである。

図９は、網状赤血球抽出物中のＸ−βｇａｌヘテロテトラマーのＡＴＰ依存性ユ ビキチン化および分解を示すダイアグラムである。

図１０は、安定化性アミノ末端残基を有するＸ−βｇａｌサブユニットのトラン ス認識依存性（ｔｒａｎｓ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）分 解を示すダイアグラムである。

図１１は、α２−βｇａｌ融合体タンパク質の代謝不安定性を示すダイアグラム である。

図１２は、α２リプレツサーがイン・ビポで短命（Ｓｈｏｒｔ−１ｉｖｅｄ）で あることを示すダイアグラムである。

図１３は、α２−βｇａｌ中の分解シグナルの欠失分析（ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ａ ｎａｌｙｓｉｓ）の結果を示すダイアグラムである。

図１４は、α２分解を欠くニス・セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓ組口突然変 異体の単離を示すダイアグラムである。

図１５は、α２中の２つの分解シグナルが異なる経路で標的化されることを示す ダイアグラムである。

図１６は、イン・ビボにおけるサブユニット混合実験のデザインを示すダイアグ ラムである。

図１７は、オリゴマータンパク質の分解がサブユニット特異的であることを示す ダイアグラムである。

発明の詳細な説明 本願に開示する発明は、対象タンパク質またはポリペプチドの代謝安定性を操作 する新規方法に関する。当該分野では、「タンパク質」、「ポリペプチド」、お よび「ペプチド」という用語は互換的に使われることが多い。ただし、「ペプチ ド」は、常にそうであるとはいえないが、残基数が約（〜）５０個以下の比較的 短いポリペプチドを示すことが少なくない。本明細書においては、タンパク質と いう用語はタンパｐ　り質とポリペプチドの両者を指し、ペプチドという用語は 比較的短いポリペプチドを指すものとする。以下に述べるように、これらの方法 に共通する特徴は、本特許出願で述べるトランス認識（ｔｒａｎｓ　ｒｅｃｏｇ ｎｉｔｉｏｎ）を利用して代謝的に長命（１１ｏｎｇ−１ｉｖｅｄ）のタンパク 質をトランス認識（ｔｒａｎｓ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）の選択的分解に対し て標的化することによって該タンパク質を膜安定化（ｄｅｓ　ｔａｂ　ｉ　ｌ　 １ｚｅ）させることである。

モノマータンパク質基質においては、分解シグナルの２つの決定基はいずれも定 義上は同一のポリペプチド鎖中に存在する［７２認識Ｃｃｉｓ　ｒｅｃｏｇｎｉ ｔｉｏｎ＞　）　ｏ　ところが、マルチサブユニットタンパク質基質の場合、シ グナルの１１および第２決定基が異なる基質サブユニット内に存在すること（ト ランス認識）が考えられる。タンパク質分解経路の標的化成分および分解成分が 、分解シグナルを有するオリゴマータンパク質のサブユニットとシグナルを有し ないサブユニットを識別できるかどうか、あるいはそのサブユニットの一部だけ しか分解シグナルを保持しない場合でもオリゴマータンパク質全体が分解のため の標的化を受けるのかどうかという疑問が生じる。タンパク質分解基質のトラン ス認識（ｔｒａｎｓ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）またはサブユニット特異的分解 またはその両方が可能であるとすれば（図２）、機能的および実用的に重要な意 味を持つことになる。

Ｎ−末端規則に従うタンパク質分解経路は過去数年間にわたり数多くの学術論文 の主題となってきた。これらの研究の結果、Ｎ−末端規則に従うタンパク質分解 シグナルはタンパク質のアミノ末端残基および特定の内部リジン残基という２つ の異なる決定基から成ることがわかっている（図１）。

第１決定基はバクマイア（Ｂａｃｈｍａｉｒ）ら［５ｃｉｅｎｃｅ　２３４＋１ ７９−１８６　（１９８６）］によって最初に報告されたもので、タンパク質の アミノ末端アミノ酸残基である（図１で膜安定化性（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎ ｇ）の場合はｒｄＪ　、安定化性の場合はｒｓ］で示す）。バクマイア（Ｂａｃ ｈｍａｉｒ）らによる最初の報告では、アミノ末端残基が供試タンパク質の代謝 安定性に及ぼす影響を調べるために用いた測定法について述べている。酵母ニス ・セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、膜安定化性アミノ末 端残基群はＴｉｅ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、ＴｙｒＳＧｉｎ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ ＳＡｓｎＳＬｙｓＳＡｒｇおよびＴｒｐから成ることが判明した。ゴング（Ｇｏ ｎｄａ　）らによるその後の研究［Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４：１ ６７００−１６７１２　（１９８９）　］で、晴乳類網状赤血球中の膜安定化性 残基群が解明された。この群は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ａ ｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉ　ｓ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、ＴｙｒＳＡｌ　ａ、Ｓｅｒ およびＴｈｒから成っていた。以下に述べるように、これら２つの系における膜 安定化性残基の決定に使用した測定法は真核生物系のＮ類を問わず同様の決定を 行なうように容易かつ直接的に応用することができる。

調べたすべての真核生物において、ユビキチンーＸ−βｇａｌ（Ｕｂ−Ｘ−βｇ ａ　］）融合体タンパク質はイン・ビポまたは無細胞抽出物において内因性プロ セシングプロテアーゼによって正確に脱ユビキチン化されてアミノ末端に（あら かじめ決めておいた）残基Ｘを有するＸ−βｇａｌ供試タンパク質ができる（図 ３）［バクマイア（Ｂａｃｈｍａｉｒ）ら［５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：１７９− １８６　（１９８６）コ。Ｘの性質に応じてＸ−βｇａｌタンパク質は長命（ｌ ｏｎｇ−１ｉｖｅｄ）であるか代謝的に不安定であるかのいずれかとなり、膜安 定化性アミノ末端残基は対応するＸ−βｇａｌの半減期を短くする。このアミノ 末端分解シグナルはＮ−末端規則を成すものとして表われる。

Ｎ−末端規則の正確な形は細胞の種類によって異なることが以前かられかってい た。特定の細胞種におけるＮ−末端規則の正確な形を決める方法は技術的に簡単 であり、通常の発現ベクターを用いて対象細胞種において上記一連のＵｂ−Ｘ− βｇａｌ融合体タンパク質を発現させ、通常のパルス−チェイスプロトコール（ ｐｕｌｓｅ−ｃｈａｓｅ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）と免疫沈降法を利用して２０種 類のＸ−βｇａｌタンパク質のそれぞれの半減期を決定する。すなわち、Ｘ−β ｇａｌタンパ°り質（脱ユビキチン化によってＵｂ−Ｘ−βｇａｌから得られた もの）をイン・ビボで放射性アミノ酸によりパルス標識した後、低温チェイスを 行なうことでパルス標識物の代謝挙動を調べる。プロトコールのこの後半部分の 測定方法も当該分野に熟練せる者には公知であり、抗βｇａｌ抗体を用いて対応 する粗抽出物のパルス標識チェイス試料から各Ｘ−βｇａｌタンパク質を免疫沈 降させた後、免疫沈降Ｘ−βｇａｌの電気泳動分析を行うことにより対象細胞種 牛のＮ−末端規則の直接決定を完了せしめる［バクマイア（Ｂａｃｈｍａｉｒ） ら、Ｓｃｉｅｎｃｅｍａｉｒ　ａｎｄ　Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ　）　、　Ｃｅ１ ｌ　５６：１０１９−１０３２　（１９８９）コ　。

Ｎ−末端規則に従う分解シグナルの第１決定基はタンパク質のアミノ末端残基で あり、やはり不可欠である同シグナル第２決定基は同じタンパク質中の特定の内 部リジン残基（図１では「Ｋ」で示す）である。入手可能な証拠から、第２決定 基リジンの性質として関連があるのはタンパク質のアミノ末端残基に対する空間 的（ｓｐａｔｉａｌ）　（必ずしも「直線的（ｌｉｎｅａｒ）　Ｊてなくてもよ い）近接性およびリジン含有領域のセグメント移動度である。第２決定基を確率 的にみると、タンパク質分解基質の各リジンはリジンの時間平均空間位置と移動 度に応じてユビキチン化部位として利用される確率を有する。特定のタンパク質 におけるリジン残基のほとんどまたは全部について、それらがタンパク質のアミ ノ末端残基がら空間的に遠く離れていること、移動度を欠いていること、または その両者ゆえにマルチュビキチン化部位として機能する確率は極めて低い［バク マイアとバルシャフスキ−（Ｂａｃｈｍａｉｒ　ａｎｄ　Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ 　）　、　Ｃｅ１ｌ　５６：１０１３−１０３２　（１９８９）］　。

タンパク質中のりジン残基をＮ−末端規則に従う分解シグナルの第２決定基［ユ ビキチン化部位（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ　５ｉｔｅ）］たらしめるもの は何であるかについては正確な生理化学的理解ができていないが、それぞれの場 合に特定の対象タンパク質またはポリペプチドが効果的な第２決定基を有するか どうかを決める手順はよく確立されており、技術的に簡単である。実際、特定の 対象タンパク質が効果的なマルチュビキチン化部位（Ｎ−末端規則に従う分解シ グナルの第２決定基）を有するかどうかを決めるには、このタンノくり質のイン ・ビボ半減期がそのアミノ末端残基と関係しているかどうかを決めるだけで十分 である。Ｎ−末端規則に従う分解シグナルの機能には第１決定基と第２決定基の 両者の存在が不可欠であるため、対象タンパク質のアミノ末端残基がＮ−末端規 則に従う膜安定化性を示す場合にこのタンノくり質のイン・ビボ半減期が短いか どうかを判定することによって、そのタンノくり質に第２決定基が存在するかど うかを直接法めることができる。すなわち、もしタンパク質の代謝安定性がアミ ノ末端残基と密接な関係があるとすれば（例えばＡｒｇ−βｇａｌがＶａｌ−β ｇａｌより約（〜）５００倍短命（ｓｈｏｒｔ−ｔｉｖｅｄ）であるＸ−βｇａ ｌの場合）、このタンノくり質は定義上、Ｎ−末端規則に従う分解シグナルの第 ２決定基として効果的なものとなる。タンパク質の半減期のアミノ末端残基依存 性が無いか弱い場合、このタンパク質は効果的な第２決定基を欠いているとみな される。

第２決定基リジン［マルチュビキチン化部位（ｍｕｌｔｉｕｂｉｑｕｉｔｉｎａ ｔｉｏｎ　５ｉｔｅ）］が対象タンノくり質またはペプチド内のどの位置にある かを正確に示す情報は直接化学的マツピング［チャウ（Ｃｈａｕ）ら、５ｃｉｅ ｎｃｅ　２４３：１５７６−１５８３　（１９８９）コやその他の手段で得るこ とができるが、本発明の目的のためにはこの追加情報はほとんどの場合不要であ る。

本発明の方法によって可能となる長命タンノくり質の選択的分解は、広い意味で は、特異的ヌル表現型（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｎｕｌｌ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を 作る新たな手段とみることができる。特定遺伝子のヌル表現型またはほぼフルの 表現型を作ることは、基礎生物学および応用生物学研究の両分野において再浮上 してきた課題である。根本目標は、病原性ウィルスや異常なプロトオンコジーン 生成物などの有毒タンパク質およびその他の好ましくないタンパク質の機能を抑 制することから、対象タンパク質の機能を選択的に除去してその影響を観察する ことによってそのタンパク質の機能を分析することまで広がりがある。あらかじ め決めておいた遺伝子を欠失させると、目的のヌル表現型が直接得られる。この ような標的化欠失は細菌や酵母など一部の単細胞生物では技術的に簡単であるが 、はとんどの動物や植物では今のところ困難または不可能である。

特定遺伝子のヌル表現型（ｎｕｌｌ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）またはほぼヌルの表 現型を作成するもう一つのアプローチとして「従来の」薬学を利用することがで き、例えば特定の酵素の阻害剤の使用などが挙げられる。例えば、ペニシリンは 細菌細胞壁の合成に必要な酵素の一つを特異的に阻害することでこの酵素の遺伝 子の（部分的に）ヌルの表現型を実際に生成する。同様に、脳モノアミノオキシ ダーゼ阻害剤はこの酵素の遺伝子の（部分的に）フルの表現型を実際に生成する ことによってトランキライザーや抗うつ剤として作用する。アセチルサリチル酸 （アスピリン）はプロスタグランジンの一種の合成に関与する特定の酵素を阻害 することによってこの酵素の遺伝子の（部分的に）フルの表現型を生成し、それ によって特定のプロスタグランジンの合成を阻害し、その結果、炎症を抑える。

別の例ては、「アンチセンス」オリコ゛ヌクレオチド（よりトソンークリック塩 基対合を介して特定のｍＲＮＡの「センス」らせん領域と結合することによって 、例えばｍＲＮＡの５゛領域への開始因子の結合を阻害することでその翻訳を妨 害する。この阻害は、ｍＲＮＡがオリコ゛ヌクレオチド（こよって標的化される 遺伝子の（部分的に）ヌルの表現型を実際に生成する。

上記「ヌル表現型」という用語はまだ広く使われてはし）ないが、この用語を使 うことで、特定のタンノくり質また（よタンパク質複合体の機能の阻害を共通の 特徴とする様々な薬理学的（阻害剤に基づ（）および遺伝子的（遺伝子操作（こ 基づく）介入を統一的に説明することが可能となる。

特定のヌル表現型を作成するもう一つのアプローチ（よ、基本的には負の優性突 然変異体を作ることである（ヘルスコウィッツ、アイ、（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ 、［、）　［Ｎａｔｕｒｅ　３２９：２１９−２２２　（１９８７）　］が検討 ）。後者は定義上、例えば対象タンノくり質と機能的に不活性の複合体を形成す る突然変異型のタンノくり質を導入することによって野生型の存在下でも対象タ ンノくり質の機能を混乱させる。

以下に示すように、Ｎ−末端規則経路（Ｎ−ｅｎｄ　ｒｕｌｅ　ｐａｔｈｗａｙ ）中にトランス認識が存在し、選択的タンノくり質分解のサブユニット特異性が あると、本特許出願の対象たる新規な負の優性突然変異体群の作成が可能になる 。この新規突然変異体群の顕著な特徴は、トランス状態における分解のための標 的化を行なうことによって、本来長命であるはずの対象タンパク質を選択的に代 謝的膜安定化させることである。タンパク質の代謝安定性を低下させるとその細 胞内濃度が下がり、ヌル表現型作成のもう一つの手段となる。このトランス分解 法の一つのやり方（図４に示した）は、対象タンパク質またはペプチドと特異的 に相互作用するタンパク質（またはその一部）の遺伝子を必要とする。（大部分 の天然タンパク質はダイマー以上のオリゴマーとして存在し、イン・ビトロでモ ノマーとして存在するタンパク質でさえもほとんどの場合イン・ビボ機能時には 他のタンパク質と相互作用する。）対象タンパク質またはペプチドと特異的に相 互作用する標的化タンパク質またはペプチドの遺伝子は、例えばすでに確立され ているユビキチン融合体法［図３参照；バクマイア（Ｂａｃｈｍａｉｒ）ら、５ ｃｉｅｎｃｅ　２３４：１７９−１８６　（１９６６）　；バクマイアとバルシ ャフスキー（Ｂａｃｈｍａｉｒ　ａｎｄ　Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ　）　、Ｃｅ１ ｌ　５６：１０１３−１０３２　（１９８９）］を利用して修正されて、イン・ ビボ発現時には膜安定化性アミノ末端残基を有するがＮ−末端規則に従う分解シ グナルの効果的第２決定基（ｓｅｃｏｎｄ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）　（ｖル チュビキチン化部位）を欠く標的化タンパク質またはペプチドの変異体をコード するように変えられる。標的化タンパク質またはペプチドのイン・ビボにおける 作成は対象タンパク質またはペプチドとの複合体形成を引き起こし、次いで、こ の複合体はトランス状態における分解の標的と化することができる（図４）。タ ンパク質分解のサブユニット特異性に基づくこの新規方法の顕著な特徴の一つは 、分解シグナルの第２決定基を欠く標的化タンパク質が破壊されないことである 。

したがって、この方法は、選択的分解のための対象タンパク質のトランス標的化 において化学量論的に作用するのではなく触媒的に作用する。

図４で、ｒＡＪ　と「Ｂ」の楕円はポリペプチドサブユニ、。

トを示す。Ｎ−末端規則に従う分解シグナルの第１決定基（アミノ末端アミノ酸 残基）は、安定化性の場合は「Ｓノ、膜安定化性の場合は「ｄｊで示す。Ｎ−末 端規則に従う分解シグナルの第２決定基（ｓｅｃｏｎｄ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎ ｔ）　（特定リジン残基）はｒＫＪで示す。図４中、ユビキチンは「Ｕｂ」で示 している。図４に示したとおり、トランス分解法はホモマー標的（図４ｂ）また はヘテロマー標的（図４ａ）に適用できる。

すなわち、長命ＡＢへテロダイマー中のサブユニットＡを破壊するためには、膜 安定化性アミノ末端残基を有するが分解シグナルの効果的第２決定基を欠いてい る修正サブユニ・ノドＢを、例えば修正サブユニットＢをコードするベクターか ら発現させることによって細胞内に導入する（図４ａ）。長命ホモダイマーＡＡ の分解標的化は、少なくともホモダイマー（ｄ−Ａ”　／ｄ−Ａ”　）として機 能的に不活性であるサブユニットへの変異体（Ａ゛）をコードするように標的化 サブユニットをさらに修正させるという点を除いては上記方法と同しである。こ のようにして修正させたサブユニット八〇を細胞内に導入すると、修正サブユニ ットｄ−Ａ”がサブユニット八を分解のためのトランス標的化するヘテロダイマ ー、または長命ではあるが機能的に不活性のｄ−Ａ”　／ｄ−Ａ”ホモダイマー ができる（図４ｂ）。

タンパク質とうしの相互作用にはペプチドとしての結合特異性を保持する比較的 短い近接アミノ酸配列が関与している場合が多いので［オウシー（０’　５ｈｅ ａ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４５：６４６−６４８　（１９８９）］　、後者ま たはその細胞浸透性化学類似体もΣユＺ王分解法に有用である。さらに、トラン ス認識の可能性についての実験的証明は今のところＮ−末端規則に従う分解シグ ナルに限られているが、トランス認識はタンパク質中の他の分解シグナルの特徴 でもあるように見える。分解シグナルをシス／トランス認識の候補たらしめる性 質は、複数の異なる決定基が存在すること、および決定基の配置に関する厳密な 「直線」距離の制約を欠いていることである。Ｎ−末端規則に従う分解シグナル が多成分のものであってｙｘまたは上ランスのいずれかの状態で機能しうること を証明するために使われてきた実験法は、短命（ｓｈｏｒｔ−１ｉｖｅｄ）タン パク質中のほかの分解シグナルを同様のやり方で分析する目的で、またシス／ト ランス認識さらには本発明の方法がこれらのシグナルにも関係するかどうかを決 める目的で容易に応用することができる。以下に示すように、天然の状態では短 命の酵母α２リプレツサー中の分解シグナルのうちの少な（とも一つがサブユニ ット特異的に作用する限り、トランス分解法のもう一つの独立要素であるタンパ ク質分解におけるサブユニット特異性がＮ−末端規則経路（Ｎ−ｅｎｄ　ｒｕｌ ｅ　ｐａｔｈｔｖａｙ）に限定されることはない。

Ｎ−末端規則に従う分解シグナルおよびα２リプレツサー中に存在する分解シグ ナルの分析によって上記問題を解決する手段が確立されているので、当該分野に 熟練せる者であれば、いかなる分解シグナルであっても本発明のトランス分解法 が関連のある適応可能な方法であるかどうかを直接決めるさらに、本発明は、対 象タンパク質の成熟型と相互作用する標的化タンパク質またはペプチドのみなら ず、対象タン１＜り質またはペプチドの折りたたみ（ｆｏｌｄｅｄ）不完全型と 工２・ビポで相互作用する標的化タンパク質またはペプチドにも関係する。すべ てのイン・ビボ合成タンパク質は、比較的無秩序なタンパク質ポリペプチド鎖が リボゾームから出る際にそれを成熟タンパク質特有の明確な折りたたみ（ｆｏｌ ｄｅｄ）構造体に変換する過程である高次構造成熟を受けるはずである。この複 雑な過程のいくつかの面はわかっているが、実際の折りたたみ（ｆｏｌｄｅｄ） 経路がイン・ビトロでわかっているタンパク質は非常に少なく、折りたたみ（ｆ ｏｌｄｅｄ）経路が工２である。この後者の複雑さの理由には、細胞内に他にも 多くのタンパク質が存在すること、その一部は対象初期タンパク質と相互作用す ることがあること、およびイン・ビトロ折りたたみ試験は折りたたまれていない 全長タンパク質で始まるのが普通であるのに対しイン・ビボでの折りたたみはタ ンパク質のカルボキシル末端領域がまだリボゾームから出つつあるときに始まる ことなどが挙げられる。

モデルタンパク質ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を用いたホールとフリ ータン（Ｈａｌｌ　ａｎｄ　Ｐｒ１ｅｄｅｎ）による最近の研究［Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８６：３０６０−３０６４　（ １９８９）コで、一部のＤＨＦＲ断片は同じ全長ＤＨＰＲが最初の折りたたまれ ていない〔変性させた（　ｄｅｎａｔｕｒｅｄ））状態からイン・ビトロで再び 折りたたまれるのを阻害しうることが示されている。さらに、彼らは、一部のＤ ＨＦＲ断片は全長ＤＨＰＲの折りたたみを他のものよりはるかに効果的に阻害す ること、すなわち阻害効果は断片の配列と組成に対して非常に敏感であることを 明らかにした。これらの結果から、ホールとフリータン（Ｈａｌｌ　ａｎｄ　Ｆ ｒ１ｅｄｅｎ）は、タンパク質断片をプローブとして使用してイン・ビトロにお けるタンパク質折りたたみ機構を調べることを提案している。

成熟（折りたたみ）タンパク質のトランス標的化およびサブユニット特異的分解 の発見により、ホールとフリータン（Ｈａｌｌ　ａｎｄ　Ｆｒ１ｅｄｅｎ）のイ ン・ビトロ知見の新たな応用が可能になる。すなわち、対象タンパク質またはペ プチドのアミノ酸配列の一部と同一または実質的に相同であるアミノ酸配列を有 する折りたたみ妨害性標的化ペプチドを用いて、対象タン（Ｈａｌｌ　ａｎｄ　 Ｆｒ１ｅｄｅｎ）のイン・ビトロ７ブロー　ｆ　＋１ｍ　オイテは、ＤＨＦＲた たみ込みに効果があると期待されるという理由ではなく、比較的調製しやすいと いう理由から、これまで実際に使われてきた少数のＤＨＦＲ断片が選ばれた。一 方、我々の方法は、イン・ビホをベースとしタンパク質分解指向性であること以 外にも、いかなる対象タンパク質についても、その断片のどれが最も効果的に全 長タンパク質の折りたたみ、機能、および／または代謝安定性を妨害するのかを 直接確認するための組織的遺伝子的手法を提供するものである。

図５は、折りたたみ妨害性（ｆｏｌｄｉｎｇ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ペプチ ドを利用して対象タンパク質の分解標的化を行なう方法を示す。妨害は、図５に 示した様に全長タンパク質の折りたたみの際、またはタンパク質がリボゾームか ら出るときにそのアミノ末端近接領域の折りたたみの際にさえ起こりうる。

折りたたみ妨害性標的化ペプチドが可逆的に、または少なくとも解離現象と折り たたみ再開の前に比較的長期間にわたりタンパク質（ペプチドの由来光）の折り たたみを阻害すると、その結果上じる対象タンパク質の機能障害は標的化ペプチ ド−タンパク質複合体の代謝膜安定化（破壊）を伴わないでもイン・ビポで得ら れるであろう。しかし、このような捕捉複合体は「誤折りたたみ（ｍｉｓｆｏｌ ｄｅｄ）　Ｊタンパク質に似ているので細胞内［サーベイランス（ｓｕｒｖｅｉ ｌａｎｃｅ）　Ｊ　９ンバク質分解経路に入りやすくなるため、標的化複合体の 機能障害と上記タンパク質分解経路による実際の分解が組あ合わさって細胞内の 活性タンパク質濃度の効果的低下が引き起こされやす（なる。捕捉ペプチド（ｔ ｒａｐｐｅｄ　ｐｅｐｔｉｄｅ）−タンパク質複合体（図５）が分解されるかど うか、あるいはそれが長命でありかつ機能的に不活性のままでいるかどうかは、 対象タンパク質および折りたたみ妨害性標的化ペプチド（その配列は対象タンパ ク質のサブセットの配列と同一または相同である）のアミノ酸配列によって決ま る。

捕捉ペプチド（ｔｒａｐｐｅｄ　ｐｅｐｔｉｄｅ）−タンパク質複合体が歪にあ らかじめ決めておいた膜安定化性残基を生成するユビキチンーベブチド融合体と して生成されるよう折りたたみ妨害性標的化ペプチドを設計することができる（ 図５）。このようなペプチドが対象の折りたたみタンパク質を捕捉すると、すで に述べたようにして（図２）、その膜安定化性残基が対象の（一部折りたたまれ た）捕捉タンパク質のＮ−末端規則経路（Ｎ−ｅｎｄ　ｒｕｌｅ　ｐａｔｈｗａ ｙ）による分解のためのトランス標的化を可能にする。さらに、標的化ペプチド に補足されたタンパク質は定義上部分的に折たたまれている（図５）。このタン パク質種に不可避の高次構造不安定性（同じタンパク質の折りたたまれたものと 比べて）は、Ｎ−末端規則に従う分解シグナルの第２決定基（ユビキチン化部位 ）として作用しうる付加的な高次構造移動性リジン残基を与えるものと期待され る。したがって、捕捉されたペプチド−タンパク質複合体のＮ−末端規則介在ト ランス標的化は、対象の不完全折りたたみタンパク質内のりジン残基（分解シグ ナルの第２決定基になりうるもの）の高次構造安定化を欠いているという理由で ことのほか効果的であると期待される。さらに、特定の対象タンパク質に対して 最良の（最も効率の高い）折りたたみ妨害性標的化ペプチドが見つかれば（図６ および以下の議論を参照）、ペプチドのりジン残基（もしあれば）で相同非ユビ キチン化性（アルギニン）残基を置換してＮ−末端規則経路によるペプチド自体 のシス認識を不可能にするというのが常套手段である。標的化ペプチドをユビキ チン融合体として発現させると、いくつかの本来短命なペプチドをユビキチン部 分に融合させたものについてすでに知られているように［フィンレイ（Ｆｉｎｌ ｅｙ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３３８：３９４−４０１　（１９８９）　］、これら のペプチドを細胞内分解に対して一時的に安定化させるであろう。したがって、 マルチュビキチン鎖はタンパク質分解のシグナルであるが（図１と図２参照）、 アミノ末端モノユビキチン部分は該ユビキチン部分の「下流」に位置するタンパ ク質またはペプチド部分のイン・ビボ半減期を延長しうろことになる（フィンレ イ（Ｐｉｎｌｅｙ）らによって定められた特定の条件下で）。

普通サイズの対象タンパク質でさえ可能な断片数が非常に多いので、一般的応用 を目指す本発明の方法は、効果的に作用する折りたたみ妨害性標的化ペプチドと 作用が効果的でない折りたたみ妨害性標的化ペプチドを区別するとともに特定の 対象タンパク質について前者を積極的に見つける組織的かつ仮定に左右されない 方法を提供する。遺伝子に基づ（一般的に応用可能な上記識別法を図６に示した 。

まず、対象タンパク質とβ−ガラクトシダーゼ（βｇａｌ）などのマーカータ゛ ・バク質の融合体を宿主細胞内につくる。上記融合体をコードする構築物は、例 えば対象タンパク質をコードする遺伝子をβｇａｌなどのマーカータンパク質を コードする遺伝子と融合させて、βｇａ１部分の前に対象タンパク質部分を含有 する融合体タンパク質を得ることができるように、作成できる（図６−■）。そ の後、ユビキチンと対象タンパク質の様々な断片との融合体をコードするＤＮＡ ライブラリーを構築する（図６−１１）。上記ライブラリーを構築する方法の一 つは次のとおりである。

（ｉ）対象タンパク質をコードする遺伝子の３゛末端から段階的に欠失を作るこ とによって対象タンパク質のカルボキシル末端切断誘導体をコードする一連の遺 伝子を得る。このような「重ね合わせ式Ｊ　（ｎｅｓｔｅｄ）欠失手法は当該分 野に熟練せる者には公知である〔例えばサムブルーフ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、 　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

ＮＹ、１９８９参照］。

（ｉｉ）同様の方法で、対象タンパク質の段階的アミノ末端欠失を構築する。対 象タンパク質の１つの成熟末端（ｍａｔｕｒｅ　ｅｎｄ）　（カルボキシル末端 またはアミノ末端）を保持する異なる欠失誘導体の合計数は、できるだけ対象タ ンパク質中のアミノ酸残基数の２倍に近いものとする（タンパク質中のアミノ酸 残基数と同数のカルボキシル末端切断誘導体が存在し得る。同様のことはアミノ 末端切断誘導体にもあてはまる）（ｉｉｉ）別のクローン化段階において、対象 タンパク質ノアミノ末端切断誘導体（ａｍｊｎｏ　ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ　ｔｒ ｕｎｃａｔｅｄ　ｄｅｒｊｖａｔｉｖｅｓ）をコードする遺伝子を段階的にカル ボキシル末端欠失させて、対象タンパク質の内部断片をコードする一連の遺伝子 を得る。

（ｉｖ）このようにして作成した欠失誘導体をコードする３群の遺伝子（内部、 カルボキシル末端、アミノ末端）全部を上流ユビキチン部分をコードする遺伝子 と融合させるが、ユビキチンーペプチド結合部位に追加の（あらかじめ決めてお いた）残基Ｘをさらに育していてもよいし有さなくてもよい。

（Ｖ）β−ガラクトシダーゼを欠く酵母（例えばニス・セレビシェ（Ｓ、　ｃｅ ｒｅｖｉｓｉａｅ））または細菌（例えば大腸菌）細胞を対象標的化タンパク質 （ｔａｒｇｅｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　１ｎｔｅｒｅｓｔ）とβｇａｌの融合 体（ＩＮＳ−Ｔ）をコードする発現ベクターで形質転換した後、対象タンパク質 の異なる断片をコードするとともに誘導性プロモーター（例えば、酵母ではＧＡ Ｌプロモーター、大腸菌ではＰｔｒｃプロモーター）保有発現ベクターのバック グラウンド中に保持されている上記遺伝子ライブラリーで形質転換する。

（ｖｉ）上記手順（Ｖ）で得られた形質転換体をβｇａｌ活性の発色指示薬であ るＸ−Ｇａ１を含有する固形培地上で培養し［サムブルーフ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ）ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＮＹ、　１ ９８９］　、上記手順（Ｖ）の誘導性プロモーターが活性を示す条件下で、淡青 色または白色のコロニー（すなわちβ−ｇａｌをほとんどまたは全（生成しない コロニー）を探索するスクリーニングを行な（ｖｉｉ）上記コロニーが見つかっ たら、対応する形質転換体を上記手順（Ｖ）の誘導性プロモーターが不活性であ る（折りたたみ妨害性標的化ペプチドの発現がほとんとまたは全く無い）条件下 で再検定する。このようにして検定した形質転換体がペプチド発現されない状態 で青色でありかつペプチド発現された状態で白色または淡青色であれば、対応す る細胞クローンをさらに詳細な分析に付す。特に、特定のユビキチンーペプチド 融合体をコードするプラスミドを上記形質転換体から単離し、対応する単数また は複数の遺伝子のヌクレオチド配列（単数または複数）を決定することによって 対応する単数または複数のペプチドの配列を決める。次いで、これらのユビキチ ンーベブチド融合体を元のタンパク質−βｇａｌ標的（図６−■）を発現する細 胞中に別々に形質転換することによって、受容体細胞内でペプチドが実際に強力 にβｇａｌ活性を低下させることを確認する。さらに詳細な実験を行なって単数 または複数の折りたたみ妨害性ペプチドの特性決定、例えば折りたたみ妨害性標 的化ペプチドの発現が有る場合と無い場合において、供試βｇａｌ融合体（図６ −■）の代謝挙動を直接決定することも可能である。この決定は、当該分野に熟 練せる者には公知の方法であるパルス−チェイス分析［バクマイア（Ｂａｃｈｍ ａｉｒ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：１７９−＋８６　（１９８６）］によっ て行なう。

上記実験手順および図６の原理は次のとおりである。効果的な折りたたみ妨害性 ペプチドが対象タンパク質のイン・ビる（捕捉された）ペプチド−タンパク質複 合体および下流のβｇａ１部分は上記理由により分解のための標的化を受けやす くなる。その結果、βｇａｌの定常レベルが折りたたみ妨害性標的化ペプチドの 効率に応じて中程度または大幅に低下し、その結果生じるβｇａｌ活性の変化を 上記Ｘ−ｇａ１ベースのスクリーニングによって検出することが可能となる（図 ６）。図６に示した方法により、βｇａｌとの融合体状態の対象タンパク質をイ ン・ビポ分解標的化する対象タンパク質断片を直接的に検出、同定することがで きる。この方法は、遺伝子が手に入るものであればいずれのタンパク質にも適用 可能であり、その実施にあたり実質的に何らの仮定にも立たず、すべての関連手 順が当該分野に熟練せる者に公知であるという点で技術的に簡単である。

図６に示した方法は、タンパク質の折りたたみを乱すがそのタンパク質を分解標 的化しない折りたたみ妨害性標的化ペプチドを検出することはできない。このよ うな断片は本発明の目的のためには不要であるが（対象タンパク質の折りたたみ 妨害性分解標的化断片はまれでないと思われるので）、対象タンパク質の機能活 性を選択タイプ検定またはスクリーンタイプ検定（ｓｃｒｅｅｎ−ｔｙｐｅ　ｔ ｅｓｔ）のいずれかに合致させることでマーカータンパク質部分の必要性を無く すことができれば、これらの断片も図６に示した方法で識別可能となる。この場 合、タンパク質自体（βｇａｌとの融合体や他のマーカータンパク質ではなく） がマーカーとして作用し、その他の点は図６の方法と全く同様である。

図６の方法または同等の方法により最も効率の高い折りたたみ妨害性標的化ペプ チドが同定されると、これらの標的化ペプチドを修正してイン・ビボ分解に対す る抵抗性を高めることができる。さらに、初めに識別したペプチドと折りたたみ 妨害能力は同等であるが細胞内に直接侵入することができる「第２世代」標的化 ペプチドも設計することによって、ＤＮＡ構築物を経由してこれらのペプチドを 細胞内部から発現させる必要がなくなる。

以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。

短命タンパク質中のＮ−末端規則に基づく分解シグナルは膜安定化性アミノ末端 残基と特定の内部リジン残基から成る［バクマイア、−ｒ−−、（Ｂａｃｈｍａ ｉｒ、　Ａ、　）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：１７９−１８６　（＋９８６） 　；バルシャフスキー、ニー、（Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ、　Ａ。

）ら、「ユビキチンＪ　（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　）　（レフスタイナー、エム、 （Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ、　Ｍ、　）纒）中、２８７−３２４　（ブレナム社 （Ｐｌｅｎｕｍ）　、ニーｘ−ヨーク、＋９８８）　：バクマイア、ニー、とニ ー、バルシャフスキ−（Ｂａｃｈｍａｉｒ、　Ａ、　ａｎｄ　Ａ、　Ｖａｒｓｈ ａｖｓｋｙ）８９）：図７も参照のこと］。本実施例においては、マルチサブユ ニットタンパク質中ではこれら二つの決定基は異なるサブユニット上に位置しな がらもタンパク質を分解標的化しうることを示す。さらに、この場合（トランス 認識）、第２決定基（リジン）を有するサブユニットだけが実際に分解される。

したがって、オリゴマータンパク質は短命サブユニットＮ−末端規則経路のモノ マー基質においては、分解シグナルの二つの決定基がいずれも定義上同一のポリ ペプチド鎖内に存在するので、シスで認識されるといえる（図１および図２ａ） が、Ｘ−βｇａｌテトラマーなどのマルチサブユニットタンパク質の場合、個々 のＸ−βｇａｌサブユニットの標的化は該テトラマー中に他のサブユニットが存 在することの影響を受けることがある。特に、分解シグナルの第１および第２残 基決定基が異なるＸ−βｇａｌサブユニット内に存在するトランス認識の可能性 が考えられる（図２ｂＳ　ｃ）。また、Ｎ−末端規則経路の標的化および分解成 分は分解シグナルを保有するＸ−βｇａｌヘテロテトラマーのサブユニットと分 解シグナルを保有しないものを区別するかどうか、あるいはそのサブユニットの 一部だけが分解シグナルを保有する場合でもテトラマー全体が分解標的化される のかどうかという疑問が生じる（図２ｃ）。（ｍ論を簡単にするため、ダイマー タンパク質の場合のシスおよびトランスの概念を図２に示した。βｇａｌテトラ マーのＤ２対称性および関連特性［Ｃｈｅｍ、　２６３：１８４８−１８５８　 （１９８８）　；カニア、ジェー　とディーノ末端領域は各テトラマー形成ダイ マ一対内で空間的に接近しているがダイマー間では隔たりがあることを示唆して いる。）Ｘ−βｇａｌテトラマー内の個々のＸ−βｇａｌサブユニットの挙動を 調べるために、その大部分に１テトラマーあたり１個の標識サブユニットと３個 の未標識サブユニットを含有する放射標識Ｕｂ−Ｘ−βｇａｌへテロテトラマー を作成しく図９ａ）、これらのタンパク質を用いて上記疑問の解決を図った。

図８と図９は、それぞれＸ−βｇａｌホモテトラマーとへテロテトラマーのＡＴ Ｐ依存性ユビキチン化と分解を示す。

結果は、安定化性（Ｖａ　Ｉ）または膜安定化性（Ａ　ｒ　ｇ）アミノ末端残基 のいずれかを有するとともに分解シグナルの第２決定基を有するか欠いている” ｓ　ｗ識Ｘ−βｇａｌタンパク質のＡＴＰ添加網状赤血球抽出物中の分解の動態 を示している。混合オリゴマーアプローチの結果を述べる前に、再構築Ｖ−に一 βｇａｌ”／Ｖ−に−βｇａｌテトラｖ　（Ｉ　Ｓ　Ｓ標識サブユニットをアス テリスクで示す）は、解離／再会合処理を行なっていない最初のＶ−に−βｇａ ｌテトラマーより少し早い速度（ｔ　ｌ／２はそれぞれ約（〜）２０時間と約（ 〜）５０時間：図８ａ、曲線３；図９ｂ、曲線３）ｔ、ｍＴ網状赤血球抽出物中 で分解されたことを指摘しておく。

この分解はＡＴＰ依存性であるが、Ｎ−末端規則経路は関与しなかった。これは 、再構築■−Δに一βｇａｌ”／Ｖ−Δに一βｇａｌテトラマー（そのサブユニ ットはすべて分解シグナルの両方の決定基を欠いている）内の標識サブユニツト が網状赤血球抽出物中で同様の速度で分解されたからである（図９ｂ、曲線３と ６）。したがって、この付加的な遅い分解は再構築Ｘ−βｇａｌテトラマーを用 いた我々の測定のバックグラウンドであった。図９のタイムコースはすべて同− 実験内および異なる実験間のいずれについても定量的に再現可能であった。

標識Ｖ−に一βｇａｌサブユニットがＶ−に−βｇａ　１”／Ｒ−に−βｇａｌ ヘテロテトラマー内に存在すると、約（〜）３．３時間のｔ、７２で網状赤血球 抽出物中で連続的にユビキチン化され分解された（図９ｂ、曲線１）。一方、同 じＶ−に−βｇａ　Ｉ＋ブユニットがＶ−に−１３ｇａ　１”　／Ｖ　−に−β ｇａｌテトラマー中にとどまっていると、そのｔ１７２は２０時間となり、はと んどユビキチン化を示さなかった（図９ｂ、曲線３）。対照実験では、標識Ｖ− に一βｇａｌホモテトラマーを過剰量の未標識Ｒ−に一βｇａｌホモテトラマー と混合し、解離／再会合前処理をしないで網状赤血球抽出物中でインキュベート した。この条件下ではＶ−に−βｇａ１は長命であり、ｔ　ｌ／２は約（〜）５ ０時間とＲ−に−βｇａｌの非存在下でのＶ−に−βｇａｌのｔ　ｌ／２と同じ であった（図８ａ、曲線３）。

これらの結果を総合すると、安定化性アミノ末端残基を保持するサブユニットは 、Ｎ−末端規則に基づく分解シグナルを含有するサブユニットと物理的に会合さ せると、代謝的に膜安定化できることがわかる。これらの結果は、Ｎ−末端規則 経路中にトランス認識が存在すること（図２ｂ）、すなわちＶ−に−βｇａｌ° ／Ｒ−に一βｇａｌテトラマーのＲ−に−βｇａｌサブユニット中の膜安定化性 アミノ末端残基が認識されると、同じへテロテトラマーのＶ−に−βｇａｌサブ ユニット中の第２決定基リジン（Ｌｙｓ１５またはＬｙｓ１７；図７）のマルチ ュビキチン化が促進され、本来なら長命になるはずのこのサブユニットの分解が 起こりうることを示している。

注目すべきことに、Ｖ−に−βｇａｌ”／Ｒ−に−βｇａ１ヘテロテトラマーの 代謝不安定性は該テトラマーの本質的に短命なＲ−に−βｇａｌサブユニットの 分解には依存しなかった。すなわち、Ｖ−に−βｇａｌサブユニットは、Ｖ−に −βｇａｐ”／ＲＫ−βｇａｌまたはＶ−に−βｇａｌ”／Ｒ−Δに一βｇａｌ 内では網状赤血球抽出物中のｔ＋／□は約（〜）３．３時間であった（図９ｂ、 曲線ｌと２）。後者のへテロテトラマーのＲ−Δに一βｇａｌサブユニットは第 ２決定基Ｌｙｓ１５／１７を欠いていたので（図１と図７）、本来は同一である はずのＲ−に−βｇａ１サブユニットより網状赤血球中での寿命がはるかに長か った（ＩＵ８ａ、曲線１と２）。これらの結果Ｃ図９ｂ、曲線１〜３）を総合す ると、Ｘ−βｇａｌテトラマー内の短命サブユニットにトランス認識が存在する ことが直接証明された。

さらに別の対照試験を行ない、安定化性アミノ末端残基を有するＸ−βｇａｌサ ブユニットのトランス認識依存性分解は実際にＮ−末端規則経路が関与すること を確認した。このために、すでに確立されていたＮ−末端規則経路中に二次的な 膜安定化性残基が存在すること［バクマイア、ニー、（Ｂａｃｈｍａｌｒ、　Ａ 、）ら、５ｃＩｅｎｃｅ　２３４＋１７９−１８６　（１９８６）　；ボンダ、 ディー、ケー、（Ｇｏｎｄａ、　Ｄ、　Ｋ、　）ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｍ、　２６４：１６７００−１６７１２　（１９８９）　；フェルバー、ニス、 とニー、シエカノーパー（Ｆｅｒｂｅｒ、　Ｓ、　ａｎｄ　Ａ、　Ｃ１ｅｃｈａ ｎｏｖｅｒ　）　、Ｎａｔｕｒｅ　３２６：８０８−８１１　（１９８７）　］ を利用した。すなわち、アミノ末端Ｇｌｕ　（Ｅ）およびＡｓｐ（＃！状赤血球 においてはＣｙｓも）は、それらがＡｒｇ−ｔＲＮＡ−タンパク質トランスフェ ラーゼによって一次脱安定化性残基Ａｒｇにコンジュゲート化される能力ゆえに 機能するという意味で二次的な膜安定化性残基である［ボンダ、ディー、ケー、 （Ｇｏｎｄａ、　Ｄ、　Ｋ、　）ら、Ｊ、　Ｂｉ。

１、　Ｃｈｅｍ、　２６４：１６７００−１６７１２　（１９８９）　；フェル バー、ニス、とニー、シエカノーパー（Ｆｅｒｂｅｒ、　Ｓ、　ａｎｄ　Ａ、　 Ｃ１ｅｃｈａｎｏｖｅｒ　）、Ｎａｔｕｒｅ　３２６：８０８−８１１　（１９ ８７）　］　、このＡｒｇコンジュゲーション化、およびその結果生じる二次的 膜安定化性残基の膜安定化特性は、網状赤血球抽出物をＲＮＡアーゼでｔ　ＲＮ Ａ非存在下に前処理することによって選択的に阻害することができる［ボンダ、 ディー、ケー、（Ｇｏｎｄａ、　Ｄ、　Ｋ、　）ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｍ、　２６４：１６７００−１６７１２　（１９８９）　］　、図１０に示した ように、標識Ｖ−に一βｇａｌサブユニットは、網状赤血球抽出物中でインキュ ベートしたＶ−に−βｇａｌ”／Ｒ−Δに一βｇａｌまたはＶ−’に一βｇａｌ ”／Ｅ−Δに一βｇａｌテトラマーの内部では短命であった（後者は二次的膜安 定化性残基Ｅを存する）［バクマイア、ニー、（Ｂａｃｈｍａｉｒ、　Ａ、　） ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：１７９−１８６　（１９８６）　；ボンダ、ディ ー、ケー（Ｇｏｎｄａ、Ｄ、　Ｋ、）　ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６ ４：１６７００−１６７１２　（１９８９）、フェルバー、ニー　とニー、シエ カノーパー（Ｆｅｒｂｅｒ、　Ｓ、　ａｎｄ　Ａ、　Ｃ１ｅｃｈａ、ｎｏｖｅｒ 　）　、Ｎａｔｕｒｅ　３２６：８０８−８１１　（１９８７）］。しかし、同 じ測定をｔＲＮＡを除いた網状赤血球抽出物中で行なったところ、Ｖ−に−βｇ ａｌ”／Ｒ−Δに一βｇａ１中の同じサブユニットが代謝的に不安定なままであ ったのに対しく図１０ａ）、Ｖ−に−βｇａｌ”／Ｅ−Δに一βｇａｌ中のＶ− に−βｇａｌサブユニットは長命になった（図１０ｂ）。この結果は、他のＸ− βｇａｌサブユニットが膜安定化性アミノ末端残基を保持するテトラマー中のＶ −に−βｇａｌサブユニットのトランス認識依存性分解にＮ−末端規則経路が関 与することを直接確認するものであった。

Ｎ−末端規則経路によるマルチサブユニットタンパク質の分解はサブユニット特 異的である 標識Ｖ−に一βｇａｌサブユニットがＶ−に−βｇａ　１”／Ｒ−に−βｇａｌ テトラマー内で短命であったのに対し、第２決定基Ｌｙｓ１５／１７を欠く本来 は同一のＶ−Δに一βｇａｌサブユニット（図７）は、同じテトラマーバックグ ラウンド中ではるかに安定性が高かった（図９ｂ、曲ｐＪｌと４）。この結果の ひとつの意味は、安定化性アミノ末端残基を有するサブユニットのトランス認識 関与分解は、トランス標的化サブユニット内に第２決定基（マルチュビキチン化 部位）が存在することに依存するということである。注目すべきことに、この結 果は、オリゴマータンパク質は短命サブユニットと長命サブユニットの両者を含 有しうることも意味しティる。実際、■−Δに一βｇａｌ”／ＲＫ−βｇａｌの Ｖ−Δに一βｇａｌサブユニットが網状赤血球抽出物中で長命であったのに対し く　ｔ　＋／２は約（〜）１１．５時間；図９ｂ、曲線４）、このヘテロテトラ マーのＲ−に−βｇａｌサブユニットははるかに不安定であり、Ｒ−に−βｇａ ｌ”／Ｖ−Δに一βｇａｌのＲ−に−βｇａｌサブユニットのｔ＋／２は約（〜 ）２．０時間であった（［Ｎ９ｃ、曲線１０）。これらの結果のもう一つの意味 は、短命サブユニットの分解は、同じオリゴマータンパク質内に長命サブユニッ トが存在していても阻害されないということである。すなわち、網状赤血球抽出 物中のＲ−に−βｇａｌサブユニットのｔｌ／□は２．０時間であったが、この ２．０時間は、このサブユニットがホモテトラマー中にとどまっているか（図９ ｃ、曲線７）、長命Ｖ−Δに一βｇａｌサブユニットによって囲まれているか（ 図９０、曲線１０）にかかわらず同じであった。

Ｘ−βｇａｌヘテロテトラマー内の個々のサブユニットの選択的分解は、網状赤 血球抽出物中のＸ−βｇａｌサブユニットが一時的モノマー状態において、短命 サブユニットの標的化と分解を可能にするような急速な解離／再会合を受けたこ とによるものではなかった。βｇａｌテトラマーは安定性が高（、その解離には 強力な変性作用を有する溶媒が必要であることがわかっている［ジブサー、ディ ー、（Ｚｉｐｓ’ｅｒ、　Ｄ。

）　、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　７：１１３−１２１　（１９６３）；ギボ ル、ディー、（Ｇｉｖｏｌ、　Ｄ、　）　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ ｓ、　Ａｃｔａ、１１３：１２０−１２５　（１９６６）］。さらに、標識Ｖ− に一βｇａｌホモテトラマーと過剰の未標識Ｒ−Δに一βｇａｌを一緒に網状赤 血球中でインキュベートすると、Ｖ−に−βｇａｌ”／Ｒ−Δに一βｇａ１ヘテ ロテトラマー中のＶ−に−βｇａｌサブユニットは代謝不安定性を示すのに対し くｔ、７□は約（〜）３，３時間：図９ｂ、曲［２）　、Ｖ−に−βｇａｌサブ ユニットは長命になった（　ｔ　ｌ／２は約（〜）５０時間）。Ｎ−末端規則経 路によるオリゴマータンパク質の分解はサブユニット特異的であると結論した。

シス認識対トランス認識 安定化性アミノ末端残基を有するＸ−に−βｇａｌはトランスの状態でのみ分解 標的化することができる（上記および図２ｂ参照）。一方、分解シグナルの二つ の決定基をいずれも含有するＲ−に−βｇａｌサブユニットはＲ−に−βｇａ１ ”／Ｒ−に−βｇａｌおよびＲ−に−βｇａｌ”／Ｒ−Δに一βｇａｌ内ではシ スとトランスのいずれかの状態で標的化可能であるが、Ｒ−に−βｇａｌ”／Ｖ −に−βｇａｌおよびＲ−に−βｇａｌ”／Ｖ−Δに一βｇａｌ内ではシス状態 でしか標的化できない（図２および図９ｃ）。にもかかわらず、網状赤血球抽出 物中のＲ−に−βｇａｌサブユニットの分解タイムコース（およびユビキチン化 レベル）は、これらのテトラマーバックグラウンドのいずれの場合も識別不能で あった（図９ｃ、曲線７〜１０）。

分解速度を上昇させないことを示している。同時に、Ｘ−βｇａｌの場合、トラ ンス認識単独でシス認識単独と同等の効率がある。これは、少なくともシスで標 的化可能であるＲ−に−βｇａｌサブユニットで見られる速度の約（〜）６５％ の速度でＶ−に−βｇａｌ”／Ｒ−に−βｇａｌまたはＶ−に−βｇａｌ”／Ｒ −Δに一βｇａｌの内部でＶ−に−βｇａ１サブユニット（トランス状態でのみ 標的化可能）が分解されたからである（ｔ　Ｉ／ｌはそれぞれ約（〜）３．３時 間と約（〜）２．０時間、図９ｂ、曲線１と２、図９ｃ、曲線７〜１０）　。Ｖ −に−βｇａｌ°／Ｒ−に一βｇａｌまたはＶ−に−βｇａｌ”／Ｒ−Δに一β ｇａｌのいずれかの内部で同一の速度でＶ−に−βｇａｌサブユニットが分解さ れたのであるから（図９ｂ、曲線ｌと２）、シス認識オプションのにおける他の 段階によって制限される速度でＸ−βｇａｌサブユニットの分解を進行させるの にはシス認識だけで十分であるかも知れないというのが、これらの結果について 妥当と思われる説明である。

Ｎ−末端規則経路中のトランス標的化の存在（図２、図９、図１０）は、このタ ンパク質分解系による基質認識は、分解シグナルの２つの決定基がいずれも同じ ポリペプチド鎖内にあるかとうかをユビキチン化段階に先立ち確認するために使 うことができる直線状「追跡（ｔｒａｃｋｉｎｇ）Ｊ機構を含まないことを示し ている。したがって、トランス標的化は、Ｎ−末端認識（Ｅ３）タンパク質（単 独でまたは特定のユビキチンーコンジュゲート化（Ｅ２）酵素との複合体として ）が基質の膜安定化性アミノ末端残基結合部位とリジン結合部位を有する既報モ デル［バクマイア、ニー、とニー、バルシャフスキー（Ｂａｃｈｍａｉｒ、　Ａ 、　ａｎｄ　Ａ、　Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ）　、Ｃｅ１ｌ　５６：１０１９−１ ０３２　（１９８９）］と一致する。これらの部位のどちらも、タンパク質分解 基質の結合リジン部分でマルチュビキチン化が始まるように占有されていなけれ ばならない。認識成分の２つの結合部位どうしが相対的に空間的位置関係が固定 していれば、基質の結合は基質の２つの決定基の特定の空間配置またはこれらの 決定基どうしの相対的な高次構造移動性のいずれかが必要であり、その結果、そ れらの正しい空間配置が一時的に、しかし両者が認識複合体によって結合される のに十分に高い頻度で実現する［バクマイア、ニー、とニー、バルシャフスキー （Ｂａｃｔ＋＋ｎａｉｒ、　Ａ、　ａｎｄ　Ａ、　Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ）　、 Ｃｅ１ｌ　５６：１０１９−１０３２　（１９８９）］。

決定基含１ｒ領域（単数または複数）のセグメント移動性（Ｓｅｇｍｅｎｔａｌ 　ｍｏｂｉｌｉｔｙ）は短命Ｘ−βｇａｌにおけるシス認識とタンパク質のアミ ノ末端にある非βｇａｌ延長部（図７）はＩａｃリプレッサーの内部領域に由来 するものであるが、βｇａ１などの無関係タンパク質内の不自然な（アミノ末端 ）位置にあると無秩序化しやすい（セグメント移動性になりやすい）［バクマイ ア、ニー、とニー、バルシャフスキ−（Ｂａｃｈｍａｉｒ、　Ａ、　ａｎｄ　Ａ 、　、Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ）　、　Ｃｅ１ｌ　５６：１０１９−１０３２　（ １９８９）］。この延長部はセグメント移動性があるので、そのＬｙｓ１５／１ ７残基（図７）は、それ自体または同じＸ−βｇａ１テトラマー内にあってトラ ンス認識を可能にする別のサブユニットのいずれかの膜安定化性アミノ末端残基 に空間的に近い位置に一時的に生じる可能性がある。

タンパク質分解におけるサブユニット特異性分解シグナルの第２（必ずしも第１ でなくてもよい）決定基を含有する代謝的に不安定なＸ−βｇａｌテトラマーの サブユニットだけが実際に分解されることを示した（図９および上記参照）。す なわち、分解はユビキチン化可能なサブユニットに限定される。では、このタン パク質代謝回転の新規局面を支配する機構はどのようなものであろうか。あるモ デル群においては、マルチュビキチン鎖含有サブユニットの選択性（および明ら かにブロセシブな）［チャウ、ヴイー、（Ｃｈａｕ、　Ｖ、）　、Ｓ＋ｊｅｎｃ ｅ　２４３：１５７６−１５８３　（１９８９）　；　ヘルシュコ、ニー　（Ｈ ｅｒｓｈｋｏ、　Ａ、　）　、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３：１５２ ３７−１５２４０（１９８８）　］分解はオリゴマー基質内の隣接サブユニット からの解離と一時的に連絡する。これが起きるためには、ＡＴＰ依存性「下流」 プロテアーゼ［ヘルシュコ（Ｈｅｒｓｈｋｏ、　Ａ、　）、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｍ、　２６３：１５２３７−１５２４０　（１９８８）　］がマルチュビ キチン鎖を認識し［チャウ、ヴイー、（Ｃｈａｕ、　Ｖ、）　、　５ｃｉｅｎｃ ｅ　２４３：１５７６−１５８３　（１９８９）］　、それを利用して破壊スヘ キサフユニットを識別し、その後サブユニットのポリペプチド鎖を追跡し、おそ らく分解に先立ち折りたたみを解く。先験的には、解離と分解は必ずしも一時的 に並行しなくてもよい。上記と類似の力学的化学的プロセスを用いてマルチュビ キチン鎖含有サブユニットをオリゴマー基質から解離させ、サブユニットの分解 はその解離と並行させるのではなく後に行なうことができると思われるからであ る（Ｘ−βｇａｌサブユニットの自然解離／再会台はＮ−末端規則経路によるＸ −βｇａ１分解のサブユニット特異性の原因となりえないことはすでに示した） 。

サブユニット組成の組み合わせのバリエーションによるタンパク質複合体の機能 の変化は生体調節の一般的テーマであるため、サブユニット特異性は選択的タン パク質分解の一般的特徴として現われやすい［アベル、ティー、とティー、マニ アテイス（Ａｂｅｌ、　Ｔ、　ａｎｄ　Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ）　、Ｎａｔｕ ｒｅ　３４１：２４−２５　（１９８９）　：ゴウテ、シイ−６とエイ、ディー 、ジョンソン（Ｇｏｕｔｔｅ、　Ｃ，ａｎｄ　Ａ、Ｄ、　Ｊｏｈｎｓｏｎ　）　 、　Ｃｅ１ｌ　５２：８７５−８８２　（１９８８）］。例えば、多（の調節タ ンパク質は発育中の胚の異なっていはいるが重なり合っている部分で発現され、 細胞決定は少なくとも一部は胚発生の異なる段階で特定の領域に存在するこれら のタンパク質（その多くは短命である）の正確な組み合わせによって決まる［イ ングハム、ビー、ダブリュ、（［ｎｇｈａｍ、　Ｐ、Ｗ、）　、Ｎａｔｕｒｅ　 ３３５：２５−３４　（＋９８８）　ニスコツト、エム、ビー、とニス、ビー、 キャロル（Ｓｃｏｔｔ、　Ｍ、Ｐ、　ａｎｄ　Ｓ、Ｂ。

Ｃａｒｒｏｌｌ）　、Ｃｅ１ｌ　５１：６８９−６９８　（１９８７）コ。サブ ユニット特異性分解は、真核生物において細胞周期の進行を調節しているマルチ タンパク質複合体のサブユニットであるサイクリンの周期的破壊にも関与する［ エバンス、ティー、（Ｅｖａｎｓ、　Ｔ。

）ら、Ｃｅ１ｌ　３３：３８９−３９６　（１９８３）　；−１−イ、ダブリュ 、マレイ（Ｍｕｒｒａｙ、　Ａ、Ｗ、）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３３９：２８０−２ ８６　（１９８９）コ。分解シグナルに２つの決定基が有ること、およびシス認 識またはトランス認識のいずれかの可能性があることから、例えば決定基の一つ への接近可能性をマルチサブユニット基質内特定リン酸化現象に依存させること によってサブユニット特異的分解の融通性をさらに高めることができる。

このタンパク質代謝回転の新しい局面の一般性は、サブユニット特異的分解は天 然では短命の酵母ニス、セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）転写リプレ ッサーＭＡＴ（Ｚ２中に存在する２つの分解シグナルのうちの少なくとも一つに も特有のものであるという最近の知見によってさらに支持される。これらのシグ ナルのいずれも、Ｎ−末端規則経路中を介して機能するものはない（実施例２参 照）。

方法 それぞれＵｂ−Ｒ−に−βｇａｌとＵｂ−Ｖ−に−βｇａ１をコードするｐＫＫ ２３３−２ベ一ス大腸菌発現ベクターｐＫＫＵｂ−Ａｒｇ−βｇａ］およびｐＫ ＫＵｂ−Ｖａ　］　−βｇａｌが記載されている［ボンダ、ディー、ケー、（Ｇ ｏｎｄａ、Ｄ、に、）　ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６４＋１６７００− １６７１２　（１９８９）　）。Ｕｂ−Ｒ−Δに一βｇａｌとＵｂ−Ｖ−Δに一 βｇａｌをコードする構築物を次のようにして作成した。ｐＫＫＵｂ−Ｖａｌ− βｇａｌのＳａ　ｌ　Ｔ／Ｍｓ　ｔ　Ｉ　Ｉ小断片をＭ１３ｍｐ１８Δ（（Ｍｌ 　３ｍｐ　１８の誘導体）［アラシュベル、エフ、エム、（Ａｕ５ｕｂｅｌ、　 Ｆ、　Ｍ、　）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍブクローン 化し、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発［アラシュベル、エフ、エム　（ Ａｕｓｕｂｅｌ、　Ｆ、Ｍ、　）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉ ｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｗｉｌｅｙ−［ｎｔｅｒｓｃｉｅ ｎｃｅ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８７］を行なってＶ−に−βｇａｌリーディングフレ ームの３９番目と４０番目のコドンにまたがる位置に旦構築物Ｖ　［バクマイア 、ニー、とニー、バルシャフスキ−（Ｂａｃｈｍａｉｒ、　Ａ、　ａｎｄ　Ａ、 　Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ）　、　Ｃｅ１ｌ　５６：ｌ０１９−１０３２　（１９ ８９）］の小断片に連結して、ｐＫＫＵｂ−Ｖａ　１−ΔＬｙｓ−βｇａｌを得 た。採用した構築経路によって、元のＶ−に−βｇａｌの３９−４０位のＬｅｕ −ＡｌａをＶ−Δに一βｇａｌ中でＧｌｙ　Ｓｅｒと置換した。これらの変化は 我々のＸ−βｇａｌ供試タンパク質のアミノ末端にある大腸菌１ａｃｌコ一ド化 ４５位残基延長部に限定されていた［バクマイア、ニー、とニー、バルシャフス キー（Ｂａｃｈｍａｉｒ、　Ａ、　ａｎｄＡ、　Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ）　、Ｃ ｅ１ｌ　５６：１０１９−１０３２　（１９８９）］　、　ｐ　ＫＫＵｂ−Ａｒ ｇ−ΔＬｙｓ−βｇａｌを構築するために、ｐＫＫＵｂ−Ｖａｌ−ΔＬｙｓ−β ｇａｌの５ａｌＩ／ＢａｍＨＩ大断片をｐＫＫＵｂ−Ａｒｇ−βｇａｌの５ａｌ Ｉ／ＢａｍＨＩ小断片に連結した。Ｕｂ−Ｘ−βｇａｌタンパク質を大腸菌中で 発現させ、［”Ｓ］メチオニンで代謝的に標識し、３ｍＣｉの３５８トランスラ ベル（ＩＣＮ社）を標識化に用いることとＭ　ｇ　Ｃ１ｔを最終保存緩衝液から 除いたこと以外は既報［ボンダ、ディー、ケー、（Ｇｏｎｄａ、　Ｄ、　Ｋ、　 ）ら、Ｊ、　Ｂｉ。

１、　Ｃｈｅｍ、　２６４：１６７００−１６７１２　（１９８９）　］と同じ 手順でアミノフェニルチオピラノガラクトシド−（ＡＰＴＧ）−アガロース上の アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。

Ｕｂ−Ｘ−βｇａｌの特異的放射能は６〜８ｘｌＯ’ｃｐｍ／μｇであった。ウ サギ網状赤血球抽出物を調製し、既報［ボンダ、ディー６　ケー、（Ｇｏｎｄａ 、　Ｄ、に、　）ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４：１６７００−１ ６７１２　（１９８９）　］に従いＸ−βｇａｌタンパク質分解を測定した。な お、ＡＴＰを除いた抽出物中で１０分間のブレインキュベーションを行ない［ボ ンダ、ディー、ケ−、（Ｇｏｎｄａ、Ｄ、　Ｋ、）　ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｍ、　２６４：１６７００−１６７１２（１９８９）　］　、　］Ｕｂ−Ｘ− βｇａを脱ユビキチン化した。６．５％ポリアクリルアミド、０．１８％ビスア クリルアミドゲル中で５ＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後、フル才ログラフィ−を実 施した。網状赤血球抽出物中のＸ−βｇａｌのＡＴＰおよびユビキチン依存性分 解は、少なくとも最初の２時間は一次速度論に従ったので、異なるＸ−βｇａｌ タンパク質の抽出物中での半減期を比べることでそれらの分解を比較することが できた［ボンダ、ディー、ケー、（Ｇｏｎｄａ、　Ｄ、　Ｋ、　）ら、Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４：１６７００−１６７１２　（１９８９）　］　 、抽出物中の初期濃度を２０分の１に低下させても、Ｒ−に−βｇａｌのｔ、７ ２は変化しなかった。

Ｕｂ−Ｘ−βｇａｌサブユニットの変異体を構築し、（ホモテトラマーとして） 調製し、上記のようにして精製した。

ブラッドフォードアッセイ（バイオラド社）を用いて全タンパク質濃度を測定し た。Ｕｂ−Ｘ−βｇａｌのへテロテトラマーを調製するために［ウルマン、エイ 、とジエイ、モノドβｇａｌと１８０μ、ｇの未標識Ｕｂ−Ｘ−βｇａｌ（その アミノ酸配列は標識Ｕｂ−Ｘ−βｇａｌの配列と同一または異なる）の混合物を 保存用緩衝液（５０％（Ｖ／Ｖ）グリセリン、０．１ｍＭのＮａ−ＥＤＴＡ、１ ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）　、４０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，５）） 中１．５〜３ｍｇ／ｍｌの全タンパク質濃度としたものを、２ＭのＮａＣＩと８ Ｍ（脱イオン化）尿素を含有する緩衝液Ａ（１０ｍＭのＮａ−ＥＤＴＡ、５ｍＭ のＤＴＴ、２０ｍＭのＮａ−ヘベス（ｐＨ７，２））で８０μｇ／ｍｌのタンパ ク質濃度まで希釈した。０°Ｃで１時間放置した後、それぞれ８Ｍ尿素、４Ｍ尿 素と１０ｍＭのＮａＣ１，２Ｍ尿素と１０ｍＭのＮａＣ］、１Ｍ尿素と１０ｍＭ のＮａＣ１を含有する緩衝液入を交換して溶液を透析し、最後に緩衝液Ａに１０ ｍＭのＮａＣ］を加えたものを２回交換して透析した。１０個のＵｂ−ｘ−βｇ ａｌ試料を同時にマルチプルダイアライザー（スペクトラム社）中４°Ｃで１回 の緩衝液交換あたり約（〜）１４時間の透析を行なった。各透析試料をＮａＣ１ 濃度が１．６Ｍ、ＭｇＣ］□濃度が１０ｍＭになるように調製し、約（〜）０． ４ｍｌのＡＰＴＧ−アガロースに添加し［ゴンダディー、ケイ、（Ｇｏｎｄａ、 　Ｄ、　Ｋ、　）ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４：１６７００−１ ６７１２　（１９８９）コ、４°Ｃで１夜軽く振とうした。次いでｇａｌのアフ ィニティー精製用に処理しておいたカラムに懸濁液を通した。像識Ｕｂ−Ｘ−β ｇａｌサブユニットと未標識Ｕｂ−Ｘ−βｇａｌサブユニットの比率を１＝１０ として、ランダム再会合を行なうと、標識サブユニットの７５％はｌテトラマー あたり１個の標識サブユニットを含有するテトラマー中にとどまり、標識サブユ ニットの残り（２３％）の大部分は１テトラマーあたり２個のサブユニットに存 在することになるはずである。この予測を確認する試験において、サイズの異な るアミノ末端延長部を含有する２個のβｇａ１ベースホモテトラマーの１．１０ 混合物を解離／再会台プロトコールに付した。得られたテトラマーを非変性性ゲ ル中で電気泳動したところ、予想通りのへテロテトラマー組成分布が得られた。

このようにして再構築したＵｂ−Ｘ−βｇａｌタンパク質の酵素活性（既報［ガ レンテ、エル　（Ｇｕａｒｅｎｔｅ、　Ｌ、）　、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ 、　ｌｏｔ：１８１−１８２　（１９８３）　］に従い測定）は、最初の（ホモ テトラマー）対応物の活性の５０〜７５％の範囲で調製物間に変動があった。網 状赤血球抽出物中の分解測定およびＳ　Ｄ、Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅを上記のよう にして行なった。最初のＸ−βｇａｌテトラマーまたは再構築Ｘ−βｇａ１テト ラマーの０．４％未満はＡＴＰを除いた網状赤血球抽出物中で２時間以内に分解 された。

ｐＫＫＵｂ−Ａｒｇ−ΔＬｙｓ−βｇａｌの場合に上記したようにして、Ｕｂ− Ｅ−Δに一βｇａｌをコードするｐＫＫＵｂ−Ｇｌｕ−ΔＬｙｓ−βｇａ１発現 ベクターを構築した。上記のようにして対応するホモテトラマーからＵｂ−Ｘ− βｇａｌへテロテトラマーを作成した。網状赤血球抽出物を３単位／ｍｌのＲＮ ＡアーゼＡ−アガロース（シグマ社）と共に３７°Ｃで４５分間インキュベート し、遠心分離によって固定化ＲＮＡアーゼを除去し、ＲＮアシン（ＲＮＡアーゼ 阻害剤（プロメガバイオチク社）を１５００ユニット／ｍｌ単位になるように加 えることによってＲＮＡアーゼ処理［ゴ反応は５０μｇ／ｍｌのウシ肝臓由来精 製トータルｔ　ＲＮＡ（ベーリンガー社）の存在下で行なった。

代謝不安定性はイン・ビポにおける濃度が経時的に変化せサーはわずか約（〜） ５分という半減期を有することを本実施例で示す。Ｃ２の２つの構造ドメインは それぞれ、通常は長命のタンパク質を別々に標的化して急速破壊させることがで きる配列を有する。さらに、これらの２つの分解シグナルは異なる機構によって 機能することも本実施例で示す。Ｃ２の分解が無い突然変異体を単離し、他にも いくつかの欠陥があることがわかったことから、Ｃ２代謝回転の原因となってい る経路には複数の機能を示す成分が含まれることがわかる。これらのことから、 オリゴマータンパク質の短命サブユニットは同じタンパク質の他の長命サブユニ ットを膜安定化することなくイン・ビポで分解可能であることを証明することが 可能となった。すなわち、α２中の２つの分解シグナル（いずれもＮ−末端規則 に基づくシグナルとは区別される）の少なくとも一つはサブユニット特異的に機 能することを以下に示すことで、サブユニット特異的分解はＮ−末端規則経路に 限定されないことを明らかにする。

トシダーゼ（βｇａ　］）を免疫漂標識として使用し、Ｃ２−βｇａｌ融合体タ ンパク質を抗βｇａｌモノクローナル抗体で免疫沈降させることができた。α２ −βｇａｌをコードする高コピー数プラスミドを保持する細胞を３０’Ｃで７分 間［■Ｓ］メチオニンで標識した後、翻訳阻害剤の存在下で追跡を行ない、さら に抽出、抗βｇａｌ抗体による沈降、５ＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。アミノ末端 にα２の最初の３個の残基だけを保持するβｇａｌは代謝的に安定で、追跡中に 検出可能な分解は見られなかった（図１１ｃ）。一方、全長２１０残基α２配列 をβｇａｌにつないだところ、短命タンパク質ができた（図１１ｂ）。

α２−βｇａｌのイン・ビボ分解は一次速度論に従わず、経時的に遅くなった。

類似の現象は、Ｎ−末端規則経路で分解するように設計されたβｇａｌ誘導体で 観察されている［バクマイア、ニー　、（Ｂａｃｈｍａｉｒ、　Ａ、　）ら、Ｓ ＋ｊｅｎｃｅ　２３４：１７９−１８６　（１９８６）］。単一の半減期は非一 次速度論に従って分解されるタンパク質にはあてはまらないので、パルス（ゼロ 時間）と最も早い追跡時点（１０分または１５分）の間に一次速度論を仮定する ことによって「初期半減期」を計算した（以下に引用符で示す）。例えば、α２ −βｇａｌの’ｔｌ／２Ｊは３０″Ｃでは約（〜）１５分であった。

短命α２−βｇａｌの一部は、追跡の間に蓄積したことがらイン・ビポ切断の生 成物であると思われる、より小さいタンパク質（図１１ｂ中のホメオ（ｈｏｍｅ ｏ　）　）に変換された。

精製切断生成物のアミノ酸配列決定を行なったところ、α２におけるＤＮＡ結合 性ホメオドメイン内の主切断部位［ラフオン、ニー、とエム、ピー、スコツト（ Ｌａｕｇｈｏｎ、　Ａ、　ａｎｄ　Ｍ。

Ｐ、　５ｃｏｔｔ）　、　Ｎａｔｕｒｅ　３１０：２５−３１　（１９８４）　 ニジエフアート（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ、　Ｊ、Ｃ，Ｗ、）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３１ ０ニア０−７１　（１９８４）　；ポーター、ニス、ディー、とエム、スミス（ Ｐｏｒｔｅｒ、　Ｓ、Ｄ、　ａｎｄ　ＩＪ、　Ｓａ＋ｉｔｈ　）　、Ｎａｔｕｒ ｅ　３２０ニア６ロー７６８（１９８６）　；ホール、エム、エフ。

とニー、ディー、ジョンソン（Ｈａｌｌ、Ｍ、Ｎ、　ａｎｄ　Ａ、Ｄ、　Ｊｏｈ ｎｓｏｎ）、５ｃｉｅｎｃｅ　２３７：１００７．−１０１２　（１９８７）］ は、］ヘリックスーターンへリックスモチーフ（ｈｅｌｉｘ−ｔｕｒｎ−ｈｅｌ ｉｘ　ｍｏｔｉｆ）の位置決定へリックス中の１６５位と１６６位の残基の間（ 図１ｉｄ）にあることがわかった。切断生成物の定常濃度は、少なくとも一部は 半減期〔約（〜）２時間〕が長いという理由でインタクト（ｉｎｔａｃｔ）のα ２−βｇａｌの濃度より６倍も高かった。この切断はリプレッサーを不活化させ ると予想されるので、α細胞から且細胞への切り替えの際にα２をＤＮＡ結合部 位から取り除く機構を与えるかもしれない。この可能性については、今後の試験 を待たねばならない。

インタクト（ｉｎｔａｃｔ）のα２リプレツサーは、極めて短命であゑ 非修飾α２リプレツサーのイン・ビボ分解を調べるために、抗α２ポリクロ一ナ ル抗体を作成した。このアフィニティｆｆｔ製抗体は２４ｋＤのα２タンパク質 を酵母α細胞抽出物から特異的に免疫沈降させた（図１２ａ）。この抗体を用い る免疫蛍光染色によって、α２は主に核タンパク質であるこン・ビボで非常に短 命であることがわかった（図１２ｂ、１２ｃ）。３０″Ｃにおける半減期は約（ 〜）５分であったが、これはα２βｇａｌタンパク質の「ｔ１７□Ｊより約（〜 ）３倍短いものであった（［Ｎ１２ｂ）。さらに、インタクト（ｉｎｔａｃｔ） のα２リプレツサーはα２−βｇａｌと異なり、明らかな一次速度論に従って分 解されたことから、細胞内のα２分子の大部分は分解に対して同程度に感受性が あることがわかる。追跡（［”Ｓ］メチオニンまたは［３Ｈ］ロイシンで標識） の際に検出可能なレベルのα２分解中間体の蓄積はなかったことから、中間体が 急速に破壊されたか高度にブロセシブなタンパク質分解があったことがうかがわ れる。α細胞はα２含有量が少なかったことから、高コピー数プラスミド上にＭ ＡＴαを保持する細胞を用いて図１２ｂおよびＣに示したパルス−チェイス実験 を行なった。しかし、ＭＡＴαの単一染色体コピーから発現されたα２の半減期 が３０’Ｃで約（〜）４分と上記ｔ、７２値に近かったことから、α２の急速な 分解はその過剰生成（例えば化学量論的に過剰に合成されたりポゾームタンパク 質の代謝不安定性との類似性による）に起因するものではなかった［マイカス、 イー、（Ｍａｉｃａｓ、　Ｅ。

）ら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　８：１６９−１７５　（１９８８）　 ；　ツｘイ、ワイーエフ、（Ｔｓａｙ、　Ｙ−Ｆ、　）　ら、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅ ｖ、　２：６６４−６７６　（１９８８）　］。この結果は、α２分解に原因と なっている単数または複数の経路は正常な細胞内リプレッサーレベルでの飽和点 以下で機能するということも示している。

α２の２つのドメインはそれぞれ分解シグナルを含有するα２の代謝不安定性は 高次構造安定性の低さ［パーセル１、ディー、工＋、とアール、ティー、ザウア ー（Ｐａｒｓｅｌｌ、　Ｄ、Ａ、　ａｎｄ　Ｉ？、Ｔ、　５ａｕｅｒ）　、　Ｊ 、　Ｂ１１ｏ１．　Ｃｈｅｍ、　２６４ニア５９０−７５９５　（１９８９）　 ］などタンパク質の全体的性質またはより局在的な構造器官に標的化するシグナ ル配列と似ている［ディングウオール、シー、とアール、ニー、ラスキー（Ｄｉ ｎｇｗａｌｌ、　Ｃ，ａｎｄ　Ｒ、Ａ、Ｌａ５ｋｅｙ）　、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、 Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、２：３６７−３９０　（１９８６）　：コールマン、ニー 、とシー、ロビンソン（Ｃｏｌｍａｎ、　Ａ、　ａｎｄ　Ｃ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ）　、Ｃｅ１ｌ　４６：３２１−３２２　（１９８６）　：ワレン、ジー、（Ｗ ａｒｒｅｎ、　Ｇ、）　、Ｎａｔｕｒｅ　３２７：１７−１８　（１９８７）コ 。α２部分に欠失を有するα２−βｇａｌ融合体群を調べることによってα２中 の分解シグナルの探索を行なった（図１３）。α２のアミン末端またはカルボキ シル末＠（α２およびβｇａｌ配列の間の結合部分）で始まる２群の欠失α２− βｇａｌ誘導体をニス、セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で発現さ せ、イン・旦ず分解速度を測定した。すべての構築物はｐＭｃ　１８７１からサ ブクローン化された大腸菌βｇａｌ遺伝子（１ａｃＺ）の同一の野生型コード配 列を共有していた。代謝的に安定なタンパク質（Ｓ）と不安定なタンパク質（Ｕ ）は、初期イン・ビボ半減期がそれぞれ約（〜）３時間以上のもの（追跡中に検 出可能な分解がほとんどあるいは全く無い）と、約（〜）２０分以下のものであ ると機能に従い定義した。

２１０個の残基から成るα２部分のカルボキシル末端領域の３分の２以上は、融 合体タンパク質の分解速度を官憲に変ａ１欠失誘導体を示すが、これらはα２の アミン末端またはカルボキシル末端（α２配列とβｇａｌ配列の間の結合部分） で欠失が始まっている。例えば、Δ６８−２１０はα２の最初の６７個の残基だ けを含有しているが、全長α２−βｇａ１タンパク質とほぼ同程度に短命（ｒｔ ｌ／□」は約（〜）１０分）であった。ところが、アミノ末端に向けてさらに１ ５個の残基を欠失させたところ（Δ５３−２１０）、長命α２−βｇａ　ＩＭ誘 導体得られた（ＩｌｉＪＩ３）。さらにアミノ末端側に向けて欠失を行なったと ころ、代謝的に安定なタンパク質ができた。α２のアミノ末端領域はβｇａ１な どの通常は長命のタンパク質をイン・ビボ急速分解標的化することができる分解 シグナルを保持していること、およびこのシグナルの必須成分はリプレッサーの ５３−６７位の残基内に存在するとの結論に達した。遺伝的証拠（下記参照）に より、この分解シグナル（α２−βｇａ１融合体を利用して解読した）はインタ クト（ｉｎｔａｃｔ）の（融合していない）α２の分解にも関与していることが わかる。

注目すべきことに、全く異なるα２領域も分解シグナルとして機能しうる。α２ 配列のアミノ末端領域のほぼ３分の２を欠失させたところ、得られたα２−βｇ ａｌ誘導体Δ２−１３５は全長α２−βｇａｌとほぼ同程度に短命であった（’ ｉ＋ｚｚＪは約（〜）１５分）（図１３）。カルボキシル末端欠失の場合と同様 、代謝的に不安定なα２−βｇａｌ誘導体と安定なα２−βｇａｌ誘導体の間の シャープな移動も見られた。１３５位残基以後の５つの残基だけを除去したとこ ろ、長命タンパク質が得られた（Δ４−１４０、図１３）。

したがって、α２のカルボキシル末端７５残基領域は本来なら長命であるはずの タンパク質に対して代謝不安定性をもたらしうろことになる。また、１３６−１ ４０残基内の情報がこの性質に不可欠である。

α２中のカルボキシル末端分解シグナルをより詳細に解明するための手始めとし て、短命Δ２−１３５タンパク質から１５８−２１０位の残基を欠失させた。得 られた誘導体Δ２−１３５／１５８−２１０は代謝的に安定であった（図１３） 。したがって、分解シグナルが機能するためには１５７位残基下流と１４１位残 基上流の両方の情報が不可欠であることになる。

上記分析によってα２リプレツサー中で解読された２つの異なる分解シグナルは それぞれそのアミノ末端領域およびカルボキシル末端領域に存在する。これらと 同じ領域はリプレッサー中に構造的および機能的に異なる球状ドメインとして存 在することがすでにわかっている［ホール、エム、エフ。

とニー、ディー、ジョンソン（Ｈａｌｌ、　Ｍ、Ｎ、　ａｎｄ　Ａ、Ｄ、　Ｊｏ ｈｎｓ。

ｎ　）　、５ｃｉｅｎｃｅ　２３７：１００７−１０１２　（１９８７）　；ザ ウアー、アール、ティー、（Ｓａｕｅｒ、Ｒ，Ｔ、）　ら、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ 、　２：８０７−８１６　（１９８８）コ。さらに、以下に示すようにα２中の ２つの分解シグナルは遺伝的に異なる経路で機能する。

α２分解を欠く突然変異体の単離 α２の半減期は空胞性（リソシーム性）タンパク質分解またはＮ−末端規則経路 のいずれかを欠くニス、セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）突然変異体 において不変であった。そこで、α２分解障害性の突然変異体を見つける遺伝子 スクリーン（ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｃｒｅｅｎ）を考案した。α２−βｇａｌの細 胞内レベルは半減期の関数であるので、発色性βｇａ１基質Ｘ−Ｇａ１によるプ レート測定を行なえば、α２−βｇａｌが代謝的に安定化されている突然変異体 の検出が可能になるはずである。実際のスクリーンは、α２のアミノ末端分解シ グナルを有するがカルボキシル末端分解シグナルを有さない短命Δ６８−２１０ タンパク質（図１３）を利用した。Δ６８−２１０の利用により、全長タンパク 質中に両方のシグナルが存在することによって引き起こされ得る複雑性を回避す ることの他に、全長α２−βｇａｌに伴って見られる比較的長命のβｇａｌ含有 切断生成物の形成も防止できた。この生成物ができていれば、α２−βｇａｌの 定常レベルの変化に対するスクリーン感度は大きく低下していたであろう。

代謝的に安定化させたΔ６８−２１０タンパク質を有する２０の突然変異体がエ チルメタンスルホネート（ＥＭＳ）突然変異誘発（実験手順の項参照）における 約（〜）４０，０００の生存株のスクリーンから得られていた。対応する突然変 異には少なくとも４つの相補群が含まれていた。ｄｏａ　（アルファの分解（ｄ ｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｌｐｈａ）　）突然変異体のうちの２つｄｏａ 　１およびｄｏａ２の代表的対立遺伝子についてパルス−チェイス実験を行なっ た。Δ６８−２１０の代謝安定性はこれらの突然変異体中で大きく上昇し、野生 型の「ｔ＋ｙ２Ｊが約（〜）１０分であったのに対し、１時間の追跡中に検出可 能な分解は全くあるいはほとんど見られなかった（図１３、図１４）。

図１４ａに、２つのα２分解シグナルの一つだけを保持するα２−βｇａｌ誘導 体Δ６８−２１０の分解を欠く突然変異体を探索する遺伝子スクリーン（ｇｅｎ ｅｔｉｃ　５ｃｒｅｅｎ）についてまとめた。図１４ｂは、３６°Ｃにおける野 生型細胞およびｄＯａ突然変異体中のへ６８〜２１０タンパク質のパルス−チェ イス分析の結果を示す。図１４ｃは、３６°Ｃにおける様々な菌株のインタクト （ｉｎｔａｃｔ）　（ベータｇａｌと融合させていない）のα２リプレツサ一分 解能力を測定した検定結果を示す。

次いで、ｄｏｓ突然変異体のインタクト（ｊｒｕａｃｔ）　（未融合）のα２リ プレツサ一分解能力を調べた（図１４０）。検定したすべての場合（少なくとも ３つの相補群を代表する５つの突然変異体）において、α２の代謝安定性が強化 され、半減期は野生型に対して２〜７倍延長した。α２−βｇａｌ融合体の分析 によって同定したα２中のアミノ末端分解シグナルは真性（ｂｏｎａ　ｆｉｄｅ 　）リプレッサー中でも機能すると結論した。これらの結果は、α２−βｇａｌ 融合体を利用してα２中の分解シグナルと推定されるものの位置を決定すること およびβｇａｌベースのスクリーンを利用してα２分解における突然変異体を単 離することのいずれも有用であることを証明するものである。

ｄｏａ突然変異体についての詳細な説明は本願の範囲外であるが、四分子分析（ ｔｅｔｒａｄ　ａ口ａｌＹｓｅｓ）においていくつかの付加的表現型がα２分解 欠失と共に分離したことに注目している（実験手順の項参照）。一部のｄｏａ突 然変異体はホモ接合性ｄ　ｏ　ａ　／　ｄ　ｏ　ａ　２倍体として胞子形成する 能力がなかった。突然変異体のうちの少なくとも２つの成長は温度感受性であり 、それらのいくつかは常温（２３〜３０°Ｃ）で成長速度が落ちていた。これら の多面的効果はそのままの状態のα２の代謝安定化によるものとは思われないた め［ナスミス、ケイ、とディー、ショーレ（Ｎａｓｍｙｔｈ、　Ｋ、　ａｎｄ　 Ｄ、　５ｈｏｒｅ））］、α２分解経路が酵母中で多くの機能を持つことを示し ている。これらの機能には、急速な代謝回転が生理的に必須である他のタンパク 質の分解もおそら（含まれているであろアミノ末端シグナルのみを含有するα２ −βｇａｌ誘導体の分解の欠落によって同定したｄｏａ突然変異体のうちの３つ に、α２のカルボキシル末端分解シグナルのみを保持する（図１３）α２−βｇ ａｌのΔ２−１３５誘導体を導入した。このΔ２−１３５タンパク質は突然変異 体中で野生型と同じ速度で分解され続けた（図１５ａ）。α２−βｇａｌアプロ ーチを用いてα２中で検出可能な２個の分解シグナルは遺伝的に異なる経路によ って機能すると結論した。上記のように（図１４）、アミノ末端分解シグナルは α２−βｇａｌ内のみならずインタクト（ｉｎｔａｃｔ）の（未融合）α２リプ レツサー内でも同様に活性を示す。カルボキシル末端シグナルがインタクト（ｉ ｎｔａｃｔ）のα２の代謝不安定性に実際に寄与しているかどうかはわかってい ないが、この不確実性はα２中のアミノ末端分解シグナルとカルボキシル末端分 解シグナルの間の機構上の違いに関する結論に影響しない。この結論についての 独立の証拠を以下に示す。

オペレーターに選択的に結合する能力があるもののそれ自体だけではそれらの遺 伝子の転写抑制には不十分であることが示されている［ホール、エム、エフ、と ニー、ディー９　ジョンソン（Ｈａｌｌ、　Ｍ、Ｎ、　ａｎｄ　Ａ、Ｄ、　Ｊｏ ｈｎｓｏｎ　）　、５ｃｉｅｎｃｅ　２３７°１００７−１０１２　（１９８７ ）コ。第２のタンパク質ＭＣＭＩ　（ＧＲＭ、ＰＲＴＦ）も必要である［ケレハ ー、シー、　工、（Ｋｅｌｅｈｅｒ。

細胞特異的遺伝子の転写を停止させるテトラマー性すブレッ調節タンパク質と複 合体を形成する。したがって、ＭＣＭ　１はα２より豊富かつ代謝安定性が高い タンパク質であると思われる。このことは、短命α２タンパク質とのテトラマー 複合体中のＭＣＭＩの運命がα２自体の運命と異なるかどうかという疑問を引き 起こす。より一般的には、イン・ビボタンパク質分解の機構が、オリゴマータン パク質が長命サブユニットと短命サブユニットの両者を含有しつるようなもので あるかどうかという疑問が生じる。この疑問を解決するためのイン・ビボ「サブ ユニット混合」実験について図１６に示した。

上記したように、最初のα２−βｇａｌ融合体およびそのβｇａｌホモテトラマ ー誘導体は代謝的に安定である（図１３および図＋６ｂ）。大部分のサブユニッ トが短命型または長命型であるα２−βｇａｌヘテロテトラマー内の個々のサブ ユニットの代謝運命（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｆａｔｅ）はどのようなものであろ うか（図１６ｃ、ｄ）？例えば、ホモテトラマー中で長命であるα２−βｇａｌ サブユニット（図１６ｂ）が過剰の短命α２−βｇａｌ誘導体を含有するヘテロ テトラマー内に存在すれば（図１６ｃ）、長命サブユニットは長命のままで保持 するオリゴマータンパク質のサブユニットと分解シグナルを保持しないものとを 区別できるかどうか、あるいはそのサブユニットのサブセットのみが分解シグナ ルを保持している場合でもオリゴマー全体が分解標的化されるのかどうかという 疑問が生じた。

α２−βｇａｌサブユニットの一つを高コピー数プラスミドから、もう一つを同 じ細胞中の低コピー数プラスミドから発現させることによってサブユニット比率 を片寄らせた混合エム、エフ、とニー、ディー、ジョンソン（Ｈａｌｌ、　Ｍ、 Ｎ、　ａｎｄＡ、Ｄ、　Ｊｏｈｎｓｏｎ　）　、５ｃｉｅｎｃｅ　２３７：１０ ０７−１０１２　（１９８７）］　、短命（分解シグナル含有）α２−βｇａｌ サブユニットは長命のものより大きいので（図１３および図１６”）、５ＤＳ− ＰＡＧＥによって分離することができ、従って両者の代謝安定性を同時に測定す ることができる。過剰の分解シグナル含有Δ６８−２１０サブユニットを長命Δ ４−２１０サブユニットまたはΔ１４−２１０サブユニットとともに発現させた ２つの上記実験において、ホモテトラマー中で長命のサブユニットは過剰のα２ アミノ末端分解シグナル保持サブユニットを含有するヘテロテトラマー内でも長 命のままであった（図１７ａ）。この結果（図１７ａ）は、両方のタイプのα２ −βｇａｌサブユニットを共発現している細胞内ではへテロテトラマーよりもホ モテトラマーの形成が非常に優先されると解釈することもできる。Δ１４−２１ ０などの長命サブユニットが同じへテロテトラマー内に存在する場合には、本来 短命のΔ６８−２１０などのサブユニットの分解が阻害されえたという可能性も ある。

対照実験で、上記結果はイン・ビボにおけるヘテロテトラマー形成がなかったこ とによるものではありえないことが証明された。これらの対照実験は、アフィニ ティー精製抗α２抗体（実験手順の項参照）はα２部分のアミノ末端残基数が２ ６個未満のα２−βｇａｌ融合体を沈降させないという事実によって可能となっ た。例えば、Δ２６−２１０タンパク質（図１３）は抗βｇａｌ抗体によって沈 降されたが、抗α２抗体によっては同じ抽出物からでも沈降されなかった（図１ ７ｂ）。一方、細胞がΔ２６−２１０　（高コピー数プラスミド由来）とΔ６８ −２１０（低コピー数プラスミド由来）を共発現した場合、Δ２６−２１０サブ ユニツトは、抗βｇａ１または抗α２のいずれかによって沈降可能であった（図 １７０）。したがって、△２６−２１０／△６８−２１０へテロテトラマーが実 際にイン・ビボで形成され、抗α２抗体による△２６−２１０の共沈篩が可能と なった。このような共沈篩は、Δ２６−２１０と置換したΔ１４−２１０の場合 にも得られ、試料をＳＤＳで前処理することで無効となった抗α２を用いて免疫 沈降を行なったところ、Δ２６−２１０サブユニットは追跡中にΔ６８−２１０ とともに消失することがわかった（図１７０）。一方、抗βｇａｌを用いて同じ 実験を行なったところ、Δ２６−２１０は過剰の分解シグナル保持Δ６８−２１ ０サブユニツトの存在下でも短命にならなかった（図１７）。したがって、追跡 中に見られた明白なΔ２６−２１０の消失（図１７ｃ）は、Δ２６−２１０との 混合テトラマー中に存在するΔ６８−２１０の分解によるものであるはずで、後 者のサブユニットは同じへテロテトラマー内のへ６８−２１０サブユニットを経 由したときのみ抗α２で沈降できる。したがって、アミノ末端分解シグナルを欠 くサブユニットは、ヘテロテトラマー内でシグナル保持サブユニット数が超過し てもその破壊を阻害しなかった。α２−βｇａ１などのマルチサブユニットタン パク質のイン・ビボ分解はサブユニット特異的であること、すなわちオリゴマー タンパク質は長命サブユニットと短命サブユニットの両者を含有しつると結論す る。

ヘテロマータンパク質複合体中のα２のカルボキシル末端分解シグナルの阻害 カルボキシル末端分解シグナルのみを保持するα２−βｇａ１誘導体であるΔ２ −１３５を用いて、図１７ａに示したものと同様のイン・ビボサブユニット混合 実験を行なった（図１３および図１５ｂ、ｃ）。アミノ末端シグナルの場合と同 様（図１７ａ）、Δ２−１３５の過剰発現は分解シグナルを欠く共発現Δ２６− ２１０サブユニットの長い半減期に影響を及ぼさないことがわかった（図１３お よび図１５ｂ）。

抗α２抗体を用いてアミノ末端分解シグナルの実験と同様の対照実験を行なった ところ、Δ２−１３５とΔ２−２１０を共発現する細胞中に混合テトラマーがで きることが確認された。ところが、おもしろいことに、Δ２６−２１０の過剰発 現は同じ細胞中で発現されたカルボキシル末端シグナル保持Δ２−１３５サブユ ニツトの分解を阻害することがわかった（図１５Ｃ）。この作用はΔ２−１３５ 含有へテロテトラマー中のカルボキシル末端分解シグナルの立体的遮蔽によるも のではないと思われる。なぜなら、α２部分の一方の末端に由来する短いセグメ ントだけを保持するα２−βｇａｌの長命欠失誘導体は分解シグナルに対して同 じトランス不活性化を引き起こしたからである。したがって、おそらく、α２の カルボキシル末端シグナルはアミノ末端分解シグナルと異なり、オリゴマーアッ センブリー内の単一のサブユニツト中にのみ存在するときに不活性となるのであ ろう。テトラマーβｇａ１部分のＤ２対称性［ラングレイ、ケイ、イー、（Ｌａ ｎｇｌｅｙ、Ｋ、Ｅ、）　ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ　７２：１２５４−１２５７　（１９７５）　；カニア、ジエイ、とデ ィー、ティー、ブラウン（Ｋａｎｉａ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｄ、Ｔ、　Ｂｒｏｗｎ ）　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７３・３５２９ −３５３３　（１９７６）］およびα２リプレッサーのダイマー性［ホールエム 、エフ、とエイ、ディー、ジョンソン（Ｈａｌｌ、Ｍ、Ｎ、ａｎｄ　Ａ、Ｄ、Ｊ ｏｈｎｓｏｎ　）　、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３７：１００７−１０１２　（１９ ８７）：ザウアー（５ａｕｅｒ、　Ｒ，Ｔ、　）ら、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、　２ ：８０７−８１６　（１９８８）　］は、分解シグナルの活性にはα２のカルボ キシル末端ドメインのダイマー状態が必要であることを示唆するものである。α ２中のアミノ末端分解シグナルのサブユニ・ノド自立性およびカルボキシル末端 分解シグナルにこの性質が欠落していることは、これら２つのシグナルが機構的 に異なるものであることを示す遺伝的証拠となる。

は、ＤＢＹ１７０５（ＭＡＴα１ｅｕ２−３，１１２　ｕｒａ３−５２　１ｙｓ ２−８０１　ｇａ１２）、ＤＢＹ１８２６　（ＭＡＴａｌｅｕ２−３，１１２　 ｕｒａ３−５２　ｔｒｐｉ　ｈｉｓ３−Δ２００　ａｄｅ２−１０１）、および ＨＲ１２５−５Ｄａｌｆ　（Δ（ＭＡＴ）：　：ＣＡＮｌ−１４］ｅｕ２−３， １１２　ｕｒａ３−５２　ｔｒｐｌ　ｈｉｓ３　ｈｉｓ４）である［ホール、エ ム、エフ、とニー、ディー、ジョンソン（Ｈａｌｌ、　Ｍ、Ｎ、　ａｎｄ　Ａ、 Ｄ、　Ｊｏｈｎｓｏｎ　）’、５ｃｉｅｎｃα２−βｇａｌおよびα２を大腸菌 中に作成するための発菌発現ベクターｐＫＫ２３３−２のＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ ＴＩＩ断片［アマン、イー、とジエイ、ブロシウス（Ａｍａｎｎ、　Ｅ、　ａｎ ｄ　Ｊ、　Ｂｒｏｓｉｕｓ）　、　Ｇｅｎｅ　４０：１８３−１９０　（＋９８ ５）コをα２−±ａｃＺ’　を保持するＭｌ　３ｍｐ　１９のＨｉｎｄ　Ｉ　Ｉ 　Ｉ−３ａｃｌ断片に連結した。生じたＭ１３ｍｐ１９ファージ誘導体の１重ら せんＤＮＡに３８マ一合成オリゴデオキシヌクレオチドをハイブリダイズさせて 、ＰｔｒｃとＣ２の開始コドンの間の介在配列をループアウトした。ギャップの 生じた２重らせんを埋めて大腸菌ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳに形質転換した後［ クラマー、ダブリ、　、（Ｋｒａｍｅｒ、　Ｗ、　）ら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃｊｄ ｓ　Ｒｅｓ、　１２：９４４１−９４５６　（１９８４）］　、ファージＤＮＡ をアガロースゲル電気泳動によりスクリーンして目的の欠失を探索した。次いで 、（Ｐｔｒｃ−Ｃ２−１ａｃＺ’　）含有５ａｌＴ−Ｓａｃｌ断片をＳａｃ１部 位方向に１ａｃＺ　３’領域を保持するｐＫＫ２３３−２の５ａｌｒ−３ａｃＩ ベクタ一断片に連結した。得られたｐＫＫα２−１ａｃＺベクターをＩＰＴＧで 誘導すると、予想通りのサイズのβｇａｌ融合体タンパク質が大腸菌ＪＭＩＯＩ 中に生成した。この精製融合体タンパク質のアミノ末端マイクロシーフェンシン グ（以下参照）を行ない、正しいα２部分の存在を確認した。ｐＫＫα２発現ベ クターはＰｔｒｃプロモーターおよびα２コード領域の約（〜）７５％を保持す るＢａｍＨＩ　−Ｘｂ　ａ　Ｉ断片を、α２リーデイングフレームの残りを保持 するＭＡＴαのαＸ１５２誘導体のｐＵｃ１９ベースＸｂａｌ−Ｘｈｏｌ断片に 連結することによってｐＫＫα２−１ａｃＺから作成した［タッチエル、ケイ、 　（Ｔａｔｃｈｅｌｌ、　Ｋ、　）ら、Ｃｅ１ｌ　２７：２５−３５（１９８１ ）］。次いで、得られた断片をｐＫＫ２３３−２の大きい方のＢａｍＨＩ−Ｈｉ ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ断片に連結してｐＫＫａ２を得た。

大腸菌βｇａｌをコードするｐＭｃ１８７１［ガサダバン、エム、ジェイ、（Ｇ ａ５ａｄａｂａｎ、　Ｍ、　Ｊ、　）ら、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ。

１００：２９３−３０８　（１９８３）　］の約（〜）３ｋｂの５ａｌｌ断片を プラスミドＹＲｐ７［タッチエル（Ｔａｔｃｈｅｌｌ、　Ｋ、）ら、Ｃｅ１１２ ７：２５−３５　（１９８１）］中に保持されているｍａｔａ２：：ａＸ１８２ のＸｈｏｌリンカ一部位にサブクローニングすることによってΔ５３−２１０７ ２２−βｇａｌ誘導体（図１３）を構築した。得られたＡ５３−２１０構築物は Ｃ２の最初の５２個の残基と３ａｃＺとの融合体をコードしていた。次いで、Ａ ５３−２１０を含有するＨｉｎｄ　Ｉ　Ｔ　Ｉ断片を高コピー数プラスミド（Ｙ Ｅｐ　Ｉ　３）と低コピー数プラスミド（ＹＣｐ５０）の両者にサブクローン化 した［ペアレント、ニス。

ニー、（Ｐａｒｅｎｔ、Ｓ、　Ａ、　）　ら、Ｙｅａｓｔ　１：８３−１３８　 （１９８５）　］　、Δ５３−２１０をコードする低コピー数プラスミドだけが ニス−２１０タンパク質およびＡ２６−２１０タンパク質（図１３）がＨＲ１２ ５−５Ｄα菌株中の高コピー数プラスミド中のＭＡＴα２プロモーターから発現 されると致死的であることを認めた。この効果はＤＢＹ１７０５では見られず、 我々の酵母菌株の場合、Ａ６８−２１０が高コピー数プラスミドから発現される と毒性を示すという既報の知見〔ホール、エム、エフ、（Ｈａｌｌ、　Ｍ、Ｎ、 ）　ら、Ｃｅ１ｌ　３６：１０５７−１０６５　（１９８４）］を確認すること もできなかった。Ａ２−１３５／１５８−２１Ｏ誘導体（図１３）は次のように して構築した。ＹＥｐ１３〔ホール、エム、エフ、とニー、ディー、ジョンソン （ＨａＩｌ、　Ｍ、Ｎ、　ａｎｄ　Ａ、Ｄ、　Ｊｏｈｎｓｏｎ　）　、５ｃｉｅ ｎｃｅ　２３７：１００７−１０１２　（１９８７）コ中のＡ２−１３５をＸｂ ａＩで消化し、ｅｘｏＶＩＩ処理した後、Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉで消化した。Ａ ２−１３５由来Ｃ２アミノ末端をコードする約（〜）２ｋｂ断片が得られ、これ をｐＭＣ１８７１由来のＳｍａｌ−３ａｃＴ　１ａｃＺ′断片および３ａｃＺの カルボキシル末端領域をコードするＡ２−１３５のＳａｃ　ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉ　 Ｉ　Ｉ断片に連結した。

最終的に得られたプラスミド構築物のヌクレオチド配列決定を行なったところ［ クラフト、了−ル、（Ｋｒａｆｔ、　Ｒ）ら、肚ｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６： ５４４−５４６　（１９８８）］　、］Δ２−１３５／１５８−２１０９Ａ２− をコードしていることがわかった（図１３）。

パルス−チェイス分析 対象のプラスミドで形質転換［イトウ（［ｔｏ、　Ｈ，）ら、Ｌｅｒｍａｎ、Ｆ 、　）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｏ１ｄ 　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ　（１９８６）　コ　中３０°ＣでＡｓｏｏ値が約１　（ 中期対数増殖期）になるまで培養した。ミリボア社製マイクロタイター濾過プレ ート上で濾過を行なって１０ｍ１の培養物から細胞を集め、メチオニンを含まな いＳＤ培地で数回洗い、０．３ｍｌの０．５％グルコースと４０ｍＭリン酸カル シウム（ｐＨ７，４）中に再懸濁し、３０°Ｃで５分間にわたり（他に特に表示 がない限り）Ｏ、’１５ｍＣ１の”ｓ　−トランスラベルＣｌＣＮ社：約（〜） ８０％［３ＳＳ］メチオニン、約（〜）２０％［”Ｓ］システィン）で標識した 。標識した細胞を濾過して集め、１０ｍＭのＬ−メチオニン、０．２ｍｇ／ｍｌ シクロヘキシミド、５０Ｍｇ／ｍｌ）リコデルミン（レオファーマシューテイカ ルブロダクツ社（Ｌｅｏ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、 　Ｂａ１ｌｅｒｕｐ、　Ｄｅｎｍａｒｋ）　）を加えたＳＤ培地に再懸濁した。

（一部の実験においては、翻訳阻害剤を除いた。この場合標識化のわずかな上昇 が見られ、半減期は見かけ上１０％未満の上昇を示した（データは示さない）。

）試料（０，１ｍ１）を所定の回数採取し、ロイペプチン、ペプスタチンＡ１キ モスタチン、アンチパイン、アプロチニン（シグマ社）（それぞれ２０Ｍｇ／ｍ ］）を含有する低温緩衝液Ａ（１％トリトンＸ−１００，０，１５ＭのＮａＣ１ ，５ｍＭのＮａ−ＥＤＴＡ、５０ｍＭのＮａ−ヘベス、ｐＨ７，５）および０． ４ｍｌの０．　５ｍｍガラスピーズと混合した。他に特に表示がない限り、細胞 は４°Ｃて１分間隔で３回かき混ぜることによって破砕し、抽出物を１２，００ ０ｇで１０分間遠心分離した。（一部の実験では図の説明に示したとおり別の溶 菌手順を用いた。一定量の細胞懸濁液を等量の２％ＳＤＳ、３０ｍＭジチオスレ イトール、９０ｍＭのＮａ−へベス、ｐＨ７，５と混合し、１００°Ｃで３分間 インキュベートした。抽出物は緩衝液Ａにプロテアーゼ阻害剤を加えたもので１ ０倍に希釈し、上記のようにして遠心分離した。）懸濁液中の酸不溶性３１Ｓを 定量し、等量の酸不溶性３ＳＳを含有する試料を過剰等量のＣ２のアフィニティ ー精製抗体（下記参照）またはβｇａｌのモノクローナル抗体（マサチューセッ ツ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、　Ａｍｈ ｅｒｓｔ）のジエイ、パータレディスとティー、メイソン（Ｊ、　Ｐａｒｔａｌ ｅｄｉｓ　ａｎｄ　Ｔ、　Ｍａｓｏｎ）より分与を受け、ジェイ、ポールとアー ル、ハイネス（Ｊ、　Ｐａｕｌ　ａｎｄ　Ｒ，Ｈｙｎｅｓ）（ＭＩＴ）を通じて 入手；バクマイア、工、（Ｂａｃｈｍａｉｒ、　Ａ、）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２ ３４：１７９−１８６　（２９８６）参照）のいずれかで免疫沈降させた。４° Ｃで約（〜）２時間インキュベートした後、プロティンＡ−アガロース（レブリ ゲン社またはファルマシア社）を加え、懸濁液を振とうしなから４°Ｃで約（〜 ）１時間インキュベートした後、１５秒間低速遠心分離を行なった。ペレットを ０．１％ＳＤＳ含有緩衝液八で３回へい、電気泳動用試料緩衝液に再懸濁し［ラ エムリ、ニー、ケー、（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、に、　）　、Ｎａｔｕｒｅ　２ ２７：６８０−６８５　（１９７０）　］、ｌｏｏ’ｃで３分間インキュベート し、上記のようにして遠心分離し、６％ポリアクリルアミド−３ＤＳゲル中で電 気泳動を行なった後、フルオログラフィーを行なった。

アミノ酸配列決定 ＭＡＴα２プロモーター［ホール、エム、エフ、（Ｈａｌｌ。

Ｍ、　Ｎ、　）ら、Ｃｅ１ｌ　３６：ｌ０５７−１０６５　（１９８４）コ由米 のＣ２−βｇａ１を発現した高コピー数ＹＥｐ１３ベースプラスミドを保持する 約１０口個のＤＢＹ］７０５細胞をＳＤ培地中で後期対数増殖期まで培養し、ト リトン／ガラスピーズ法によって破砕した。抽出物を４°Ｃ１１３，０００ｇで １時間遠心分離し、上清を抗βｇａ！抗体で免疫沈降させた。沈降させたＣ２− βｇａｌおよびそのイン・ビボ切断生成物を５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＰＶＤＦ フィルター（ミリボア社）上に電気ブロッティングした［マッダイン（Ｍａｔｓ ｕｄａｉｒａ、　Ｐ、）　、Ｊ、　Ｂｉ。

１、　Ｃｈｅｍ、　２６２：１００３５−１００３８　（１９８７）　］　。ク ーマジーブルーで短時間染色した後、Ｃ２−βｇａｌ切断生成物を切り取り、オ ンライン１２０Ａ　ＰＴＨアナライザーを取付けたアプライドバイオシステムズ 社４７０Ａプロテインシークエンサーを用いて６サイクルのエドマン分解法によ るアミノ酸配列決定を行なった。

抗α２タンパク質抗体 Ｃ２−βｇａｌタンパク質は、ボング（Ｇｏｎｄａ）ら［Ｊ、　Ｂｉ。

１、　Ｃｈｅｍ、　２６４：１６７００−１６７１２　（１９８９）　］の記載 している方法に従って調製した抽出物をアミノフェニルチオピラノガラクトシド −セファロース（ＡＰＴＧ−セファロース）上のアフィニティークロマトグラフ ィーにかけることによって［ウルマン、ニー、（０１１ｍａｎｎ、　Ａ、）　、 　Ｇｅｎｅ　２９：２７−３１　（１９８４）］　、ｐＫＫα２−１ａｃＺを保 持するイソプロピルチオガラクトシド（Ｉ　ＰＴＧ）誘導大腸菌から精製した。

アフィニティー精製α２−βｇａｌは、分取用６％ポリアクリルアミド−３ＤＳ ゲル中の電気泳動によってさらに精製した。Ｃ２−βｇａ１バンドを切り取り、 ゲルスライスをフロイントの完全アジュバントに懸濁したものを雌性ニューシー ラント白色種ウサギに皮下注射した（ウサギ１頭あたり０．１または０．２ｍｇ のＣ２−βｇａｐ）［キャロル、ニス、ビー　とニー　ラフトン（Ｃａｒｒｏｌ ｌ、　Ｓ、Ｂ、　ａｎｄ　Ａ、　Ｌａｕｇｈｔｏｎ　）　、ディーエム、グロー バー（Ｄ、Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒ　）　ｔｌｒ、ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｐ ｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、　（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ ）、ｐｐ、８９−１１１、１９８７］　。

抗α２−βｇａｌ血清を１８％（ｗ／ｖ）Ｎａ２Ｓ○４で沈降させたところ、高 ＩｇＧ分画が得られた。第１のアフィニティーカラムにはＣＮＢｒ活性化セファ ロースに結合させた大腸菌βｇａｐ（シグマ社）を充填し、第２のカラムにはジ メチルピメリミデート（ビャース社）を用いて抗βｇａ］−セファロースと架橋 させたＣ２−βｇａｌを充填した（後者は第１カラムの溶出液を用いて作成した ）。第１カラム素通り液を第２カラムにかけ、結合した画分を４Ｍの塩酸グアニ ジンで溶出した。溶出液を４°Ｃで０．１５ＭのＮａＣｌ、ｌ０ｍＭのに２　Ｈ ＰＯ４（ｐＨ７，２）に対して透析し、βｇａ１−セファロースカラムに通して 残留抗βｇａｌ抗体を除去した。アフィニティー精製抗α２をセントリブレツブ チューブ（アミコン社）中で濃縮し、グリセリン中４０％（Ｖ／Ｖ）濃度とし、 −２０℃または一８５℃で保存した。この［”Ｓ］メチオニン探識ニス、セレビ シェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）抽出物とこの抗体との免疫沈降と５ＤＳ− ＰＡＧＥを行なったところ、予想とおりの分子量の単一のバンドがα細胞ではな くα細胞について得られた（図１ｄ）。さらに、予想された分子量の電気泳動バ ンドがＣ２またはＣ２−βｇａｌのいｆれかを発現する大腸菌の抽出物の免疫プ ロット分析で見られたが、対照抽出物では見られなかった。抗α２は、誘導体が Ｃ２の必須エピトープ（単数または複数）を保持する場合に抗βｇａ１抗体を用 いて検出可能であった同じＣ２−βｇａ１誘導体も沈降させた（図１３）。

ＤＯＡ突然変異体の単離 低コピー数ＹＣｐ５０ベクター［ホール、エム、エフ、（Ｈａｌｌ、　Ｍ、Ｎ、 ）ら、Ｃｅ１ｌ　３６：１０５７−１０６５　（１９８４）］中にΔ６８−２１ ０を保持する細胞であるＤＢＹ１７０５（図３）を最小培地で定常期まで培養し 、約（〜）２０％生存率までＥＭＳで突然変異誘発を行ない、最小プレートにま いた（生存細胞約（〜）４０，０００個）。次いで、細胞を発色性βｇａ１基質 Ｘ−Ｇａ１を含有するレプリカプレートにまき［ローズ、エム、（Ｒｏｓｅ、　 Ｍ、　）　ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７８ ：２４６０−２４６４　（１９８１）］　、２３°Ｃで３日間インキュベートし た後、３６℃で３日間インキュベートした。２３℃または３６°Ｃで青色に変わ ったコロニー（野生型コロニーは白色である）を採取し、細胞を９６穴マイクロ タイタープレート中で水に分散させ、細胞を新＃Ｘ−Ｇａ１指示プレート上にス タンプした。再スクリーニング検定を通った菌株を液体培地で培養し、オルトニ トロフェニルガラクトシド（ＯＮＰＣ）を基質としてβｇａｌ活性を定量した。

突然変異体である可能性のある６０株（βｇａｌ活性レベルが野生型より少なく とも３倍高い）を単離した。これらの突然変異体のパルス−チェイス分析を行な ったところ、Δ６８−２１０融合体タンパク質の’ｆ＋／２４の官憲な（少なく とも２倍）上昇を示した２５株が同定された。免疫蛍光分析で、これらのｄｏａ 　（アルファの分解（Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ａｌｐｈａ）　）突然変 異体のすべてにおいてΔ６８−２１０タンパク質が核に濃縮されていることがわ かりな。

これらの株を５−フルオロ−オロト酸プレート上にストリークして［ベーク、ジ エイ、ディー、（Ｂｏｅｋｅ、　Ｊ、Ｄ、　）　ラ、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅ ｎｅｔ、　１９７：３４５−３４６　（１９８４）　］　、Δ６８−２１０保持 プラスミドを失ったコロニーを単離した。次いで、これらのコロニーの細胞を野 生型ＹＣｐ５０　：　：△６８−２１０プラスミドで再び形質転換した。プレー ト培養物と液体培養物の両方におけるβｇａｌ活性の測定で、野生型より高いΔ ６８−２１０レベルを示し続けた株の数は２ｏに減ったことから、対応する突然 変異体は染色体性であってプラスミドと結合していないことがわかった。

ＹＩｐ３３ベクターを用いて、Δ６８−２１０融合体構築物をＬＥＵ２位置に挿 入することによってＤＢＹ１８２６から得たＭＨＹ　１０１株に、プラスミド処 理ｄｏｓ突然変異体を戻し交雑した［ペアレントニス、ニー、（Ｐａｒｅｎｔ、 　Ｓ、　Ａ、　）ら、Ｙｅａｓｔ　１：８３−１３８　（１９８５）　；オール −ライ−バー、ティー、エル、（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒ、　Ｔ、Ｌ、）ら、Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　７８：６３５４−６３５８　（１９８１）］。サザーンハイプリダイゼ ーション分析と対立性検定によって挿入部位を確認した。次いで、Δ６８−２１ ０をコードする挿入レポーター遺伝子とｄ。

トＣｓｅｇｒｅｇａｎｔｓ’）を同定した。次いで、これらのセグリガント（ｓ ｅｇｒｅｇａｎ　ｔ　ｓ）を用いて戻し交雑分析、相補性分析、および分離分析 を行なった。異なるｄｏａ突然変異体間の相補性検定をＸ−Ｇａ１プレート上で 行なった。また、不特定の場合に、四分子検定により各突然変異体対の分離パタ ーンを調べた。ｄｏａ突然変異体とＭＨＹ　１０１の間の戻し交雑を行ない、次 いで胞子形成分析と四分子分析を行なったところ、α２分解欠失と胞子形成不能 など他の突然変異体表現型との共分離の検定が可能となった。

ｒ−一一一−−−コ Ｌ−−−一−−−」 ｕｂ−ｘ−βｇａｌプラスミドで　Ｕｂ−Ｘ−βｇａｌ融合体９＞／＜’）’ｉ ｔ形質転換された真核細胞　の大腸面における発現とその精製ＦＩ６．３８　Ｆ ／θ３Ｃ ｎＩ Ｆ／θ６ 時間（分） 時間（分） 時間（分） Ｆ／θ９Ａ 時間（分） ＦＩＧ、　１０４ 懸　０　６０　１２０ 時間（分） ＦＩＧ、　１０８ 追跡時間（分）　追跡時間（分） ＦＩＧ、　ＨＢ　ＦＩＧ、　ｉｆｃ 追跡時間（分） Ｆ／θ１２Ｃ 野生型　ｄｏｌｌｌ　ｄｏａ２ 追跡時間（分） ＦＩＧ、　／４Ｂ 追跡時間（分） ＦＩＧ、　１４ｃ βｇａｌ 短命α２−βｇａｌ融合体タンパク質 ＦＩＧ、　／６Ａ 長命α２−βｇａｌ融合体融合体タン質ＦＩＧ、７６Ｂ 過剰の短命サブユニット Ｆ／θ／６Ｃ 過剰の長命サブユニ、ト Ｆ／θ／６０ 要　約　書 本発明は、イン・ビボにおける対象タンパク質またはペプチドの代謝的脱安定化 に関する。該対象タンパク質またはペプチドは、Ｎ末端規則に基づく分解シグナ ルの第２決定基を含有する。本発明の方法は、対象タンパク質またはペプチドを 、該対象タンパク質またはペプチドと特異的に相互作用する標的化タンパク質ま たはペプチドと接触することからなる方法である。該標的化ペプチドまたはタン パク質は、タンパク質分解のＮ−末端規則に従う脱安定化性アミノ末端アミノ酸 を含有しているがＮ−末端規則に基づく分解シグナルの第２決定基を欠いている 。該方法の必要条件として、対象タンパク質またはペプチドと特異的に相互作用 するペプチドまたはタンパク質を同定することが要求される。なぜなら、はぼ全 てのタンパク質が他のタンパク質と特異的に相互作用するからであり、拳法はイ ン・ビボにおける対象タンパク質またはペプチドの代謝的脱安定化のために、広 範囲に適用可能である。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成４年１１月１７日 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　９１１０３３６６ ２、発明の名称 イン・ビボにおける特定タンパク質のトランス脱安定化方法３、特許出願人 住所　アメリカ合衆国　マサチューセッツ　０２１３９ケンブリツジ、マサチュ ーセッツ　アベニュー。

名称　マサチューセッツ　インステイチュート　オブ　テクノロジー ４、代理人 住所　〒５４０　大阪市中央区谷町２丁目８番１号大手前Ｍ２ビル　細口国際特 許事務所 （１）補正書の写しく翻訳文）　１通 請　求　の　範　囲 １、対象タンパク質またはペプチドと特異的に相互作用する標的化ペプチドまた はタンパク質をコードするＤＮＡ配列とフレーム中において融合したユビキチン をコードするＤＮＡ配列を有する組換えＤＮＡ分子であって、該標的化ペプチド またはタンパク質がＮ−末端規則に基づく分解シグナルの第２決定基を欠いてい るものであり、タンパク質分解のＮ−末端規則に従う脱安定化性アミノ末端アミ ノ酸を有するものであって、対象タンパク質またはペプチド、および標的化ペプ チドまたはタンパク質が単一のすリボマータンパク質のサブユニットである、組 換えＤＮＡ分子。

２、対象タンパク質またはペプチドがタンパク質分解のＮ末端規則の第２決定基 を含むものである、対象タンパク質またはペプチドを真核細胞中で代謝的に脱安 定化する方法であって、該方法が、ユビキチンの直後におけるタンパク質分解の Ｎ−末端規則に従う、脱安定化性アミノ酸残基を有するが、Ｎ−末端規則に基づ く分解シグナルの第２決定基を欠いている標的化タンパク質またはペプチドをコ ードするＤＮＡ配列とフレーム中でかつ直接に５′位で融合したユビキチンをコ ードするＤＮＡ配列を有する発現可能なりＮＡ構築物で細胞を形質転換すること からなる方法であり、該対象タンパク質またはペプチド、および該標的化タンパ ク質またはペプチドが単一のオリゴマータンパク質のサブユニットまたはサブユ ニットの一部であり、そして該標的化タンノくり質またはペプチドと対象タンパ ク質またはペプチドとの会合が対象タンノくり質またはペプチドの脱安定化をも たらすものである、脱安定化する方法。

３、該真核細胞が酵母である、請求項２記載の方法。

４、脱安定化性アミノ酸残基が、［１ｅ、　Ｇｌｕ、　Ｈｉｓ、　Ｔｙｒ、　Ｇ ｉｎ、　Ｐｈｅ。

Ｌｅｕ、　Ａｓｐ、　Ａｓｎ、　Ｌｙｓ、　ＡｒｇおよびＴｒｐよりなる群から 選ばれるものである、請求項３記載の方法。

５、該単−のオリゴマータンパク質がホモメリック（ｈｏｍｏｍｅｒｉｃ）タン パク質である、請求項２記載の方法。

６、該単−のすリボマータンパク質がヘテロメリック（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ ）タンパク質である、請求項２記載の方法。

国際調査報告　ＯｒＴ／ＩＩｃ口＋／ｎｔｔｃｌ；国際調査報告

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．対象タンパク質またはペプチドを、該対象タンパク質またはペプチドと特異 的に相互作用する標的化ペプチドまたはタンパク質であって、タンパク質分解の Ｎ−末端規則に従う脱安定化性アミノ末端アミノ酸を有しているがＮ−末端規則 に基づく分解シグナルの第２決定基を欠いているものである該標的化ペプチドま たはタンパク質と接触させることからなる方法である、Ｎ末端規則に基づく分解 シグナルの第２決定基を含む対象タンパク質またはペプチドの代謝的脱安定化方 法。
2. ２．該対象タンパク質またはペプチド、および該標的化ペプチドまたはタンパク 質が、単一のオリゴマータンパク質のサブユニットまたはサブユニットの一部で ある、請求項１記載の方法。
3. ３．該接触が細胞内で行われるものであり、該標的化ペプチドまたはタンパク質 がその細胞内で生産されるものである、請求項１記載の方法。
4. ４．該標的化ペプチドまたはタンパク質が該細胞内でユビキチン融合体タンパク 質として発現され、さらに翻訳後に脱ユビキチン化により改変され、該標的化ペ プチドまたはタンパク質を生じるものである、請求項３記載の方法。
5. ５．該標的化ペプチドまたはタンパク質が、組換えＤＮＡ分子によりコードされ るものであり、該組換えＤＮＡ分子がフレーム中で標的化タンパク質またはペプ チドと融合するユビキチンをコードするＤＮＡ配列を有してなるものである、請 求項１記載の方法。
6. ６．該標的化ペプチドまたはタンパク質が、対象タンパク質またはペプチドの折 りたたみを妨害するものである、請求項１記載の方法。
7. ７．該標的化ペプチドまたはタンパク質が、対象タンパク質またはペプチドのア ミノ酸配列の一部と同一または本質的に相同であるアミノ酸配列を有するもので ある、請求項６記載の方法。
8. ８．該標的化ペプチドまたはタンパク質が、細胞透過性（ｃｅ１Ｉ−ｐｅｎｅｔ ｒａｔｉｎｇ）である、請求項１記載の方法。
9. ９．対象タンパク質またはペプチドと特異的に相互作用する標的化ペプチドまた はタンパク質であって、タンパク質分解のＮ−末端規則に従う脱安定化性アミノ 末端アミノ酸を有しているがＮ−末端規則に基づく分解シグナルの第２決定基を 欠いているものである標的化ペプチドまたはタンパク質、をコードする発現可能 なＤＮＡ構築物で細胞を形質転換することからなる方法である、対象タンパク質 がタンパク質分解のＮ末端規則の第２決定基を含む、対象タンパク質またはペプ チドを細胞中で代謝的に脱安定化する方法。
10. １０．該対象タンパク質またはペプチド、および該標的化ペプチドまたはタンパ ク質が、単一のオリゴマータンパク質のサブユニットまたはサブユニットの一部 である、請求項９記載の方法。
11. １１．該発現可能なＤＮＡ構築物が、対象タンパク質またはペプチドと特異的に 相互作用するペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列とフレーム中に おいて融合したユビキチンをコードするＤＮＡ配列を有してなるものである、請 求項９記載の方法。
12. １２．標的化ペプチドまたはタンパク質が、タンパク質分解のＮ−末端規則に従 う脱安定化性アミノ末端アミノ酸を有しているがＮ−末端規則に基づく分解シグ ナルの第２決定基を欠いているものであり、対象タンパク質またはペプチドと特 異的に相互作用するものである、標的化ペプチドまたはタンパク質をコードする ＤＮＡ配列とフレーム中において融合したユビキチンをコードするＤＮＡ配列を 有する組換えＤＮＡ分子。
13. １３．該対象タンパク質またはペプチド、および該標的化ペプチドまたはタンパ ク質が、単一のオリゴマータンパク質のサブユニットまたはサブユニットの一部 である、請求項１２記載の方法。
14. １４．該標的化ペプチドまたはタンパク質が、該対象タンパク質またはペプチド の折りたたみを妨害するものである、請求項１２記載の組換えＤＮＡ分子。