DD274448A1 - Verfahren zur herstellung humaner monoklonaler antikoerper gegen strukturproteine des hiv - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung humaner monoklonaler Antikoerper (hmAk) gegen Strukturproteine des Human Immunodificiency Virus (HIV, Erreger der Immunschwaechekrankheit AIDS). Die hmAK CB-hp25-1 bis -3 sowie CB-hgp41-1 und -2 werden aus den Hybridomen H-CB-hp25-1 bis -3 sowie H-CB-hgp41-1 und -2 (ZIM-0315 bis -0317 sowie ZIM-0318 und -0319) gewonnen, die ihrerseits aus der Human-Maus-Heteromyelomzellinie CB-Fu2 (ZIM-0314) nach Fusion mit HIV-tragenden B-Lymphozyten erhalten werden. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung humaner monoklonaler Antikörper (hmAk) gegen Strukturproteine des Human Immunodeficiency Virus (HIV). Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Die Produktion hmAK stellt eine relativ neue Quelle von Antikörpern für die Diagnostik, Prophylaxe und Therapie verschiedener Erkrankungen des Menschen dar. International werden große Anstrengungen zur Erzeugung hmAk gegen bakterielle und virale Antigene, Tumor- und Zeil- bzw. Gewebsantigene unternommen (James, K. u. G,T. Bell: Human monoclonal antibody production. Current status and future prospects. J. Immunol. Meth. 100 [1987], 5-40). Erstmalig hatten Köhler und Milstein (Nature, 1975,256,495) durch somatische Fusion von murinen antikörperbildenden Zellen und Zellen einer permanent wachsenden Plasmozytomzellinie Hybridome erzeugt, die nach entsprechenden Klonierungsschritten monoklonal Antikörper von der Maus gegen eine gewünschte Antigenspezifität produzierten. Nach dieser prinzipiellen biotechnologischen Lösung sind auch monoklonale Antikörper gegen Determinanten des HIV erzeugt worden. (Chassagne, J., Verelle, P., Klatzmann, D., Montagnier, L., Dionet, C, Gluckman, J.C, Patent Cooperation Treaty [1986] WO 86/04336; Mc Dougal, J. S., Nicholson, J. K., Gross, G.D., Cort, S. P., Kennedy, M.S., Mawle, A.C.: J.Immunol. 137 [1986] 2937-2944; Robert-Guroff, U., Brown, U., GaIIo, H.C: Nature316 [1985] 72-74).
Die effektive Gewinnung humaner monoklonaler Antikörper (hmAk) gegen die verschiedensten Antigenspezifitäten ist weltweit bisher durch 2 Hauptprobleme erschwert (Engleman, E. B., S.K.Foung, J.Larrickund A.Raubitschek; Human hybridomas and monoklonal antibodies, Plenum Press, New York 1985):
1. Die Verfügbarkeit einer Fusionszellinie, die mit vergleichbarer Fusionsfrequenz wie im Maus χ Maus-System in der Lage ist, humane B-Lymphozytcn zu immortalisieren.
2. Die geringe Frequent an Antigen-spezifischen B-Precursorzellen im peripheren Blut des Menschen.
Mit diesen beiden Pi oblemen ist eine geringe Ausbeute an Hybridomzellklonen verbunden, die spezifische Antikörper gegen ein vorgegebenes Antigen produzieren. Damit ist auch mit großer Wahrscheinlichkeit der Umstand zu erklären, daß weltweit trotz intensiver Bemühungen die Herstellung hmAk gegen Strukturproteine des HIV durch somatische Zellhybridisierung bisher selten beschrieben wurde (Banapour, B., K.Rcsenthal, L.Rabin, V.Sharma, L. Young, J.Fernandez, E. Engleman, M.McGrath, G. Reyes u. J. Lifson: Characterization and epitopo mapping of a human monoclonal antibody reactive with the envelop glycoprotein of human immunodeficiency virus. J. Immunol. 13911987), 4027-4033; McClure, J., EP-PS 251612). Die bisher beschriebenen humanen mAk gegen HIV-Proteine wurden mit Hilfe der Transformation humaner B ..ymphozyten mit Epstein-Barr-Virus (EBV) erzeugt, ua das EBV ein humanpathogenes Virus darstellt, ist die prospektive Anwendung der so produzierten Antikörper beim Menschen mit Problemen belastet. Trotz intonsiver Bemühungen gelang es anderen Arbeitsgruppen nicht, z. B. durch 30 Fusionen von peripheren Blutlymphozyten HlV-lnfizierter mit der NS-1 Parental .ellinie, humane mAk gegen HIV-Antigene zu erzeugen (Zolla-Pazner, S., Pinler, A., Mizuma, H.: J.Virol.Meth. 17 [1987] 45-53). Zur Patentanmeldung kommt hier ein Verfahren zur Herstellung humaner mAk gegen HlV-Strukturproteine und die Gewinnung entsprechender mAk mn neuen, verbesserten Eigenschaften unter Verwendung der Fusionszellinie CB-Fu2 (ZIM-0314).
Ziel der Erfindung
Das Ziel der Erfindung besteht darin, der medizinischen Diagnostik humane monoklonale Antikörper zur Verfügung zu stellen, die zum Aufbau eines Testsystems zur Erkennung von Antigenen des HIV geeignet sind.
Darlegung des Wesens der Erfindung
' Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem zunächst effektiv Hybridomzellinien erzeugt werden können, von denen in anschließenden Verfahrensschritten humane monoklonale Antikörper (hmAk) gegen verschiedene Determinanten des HIV isoliert werden können. Die t lybridomzellinien sollen mit ökonomisch günstigem Aufwand in vitro und in vivo kultivierbar sein und für eine Reinigung ausreichend hohe Mengen an hmAK sezernieren.
Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß eine Human-Maus-Heteromyelomzellinie (CB-Fu 2) aus normalen humanen B-Lymphozyten und einer Maus-Myelomzellinie hergestellt, mit dieser Zellinie nach Fusion mit B-Lymphozyten aus dem peripheren B.ut HlV-infizierter Probanden Hybridomzellen (H-CB-hp25-1 bzw. -3 sowie H-CB-hgp41-1 und -2) selektiert, zur Züchtung eingesetzt und aus dem zellfreien Überstand humane monoklonal Antikörper (CB-hp25-1 bis -3 sowie CB-hgp41 -1 und -2) isoliert worden. Die Hoteromyelomzellinie CB-Fu 2 wurde durch Sektion solcher Hybridomzellen gewonnen, die keine eigene Antikörperproduktion aufwiesen und aus deren Subklonen die Linie CB-Fu 2 hervorgeht. Die Human-Maus-Heterofusionszellinie CB-Fu 2 zeichnet sich durch eine hohe Fusionsfrequenz und eine hohe Immortalisationsrate Immunglobulin-produzierender B-Lymphozyten aus. Mit dieser Zellinie wurden nach Fusion mit B-Lymphozyten aus dem peripheren Blut HlV-infizierter Probanden verschiedene hmAk gegen Strukturproteine des HIV erzeugt. Die Spezifität dieser Antikörper wurde in verschiedenen Testsystemen charakterisiert.
Tabelle 1 zeigt die Resultate des Primärscreenings der Zellkulturen etwa 3 Wochen nach der Fusion. In 99% der angelegten Zellkulturen wurde in HAT-(Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidinl-Medium progressives Zellwachstum beobachtet, zum großen Teil mehr als ein Zeilklon. In mehreren Kavitäten wurc.'r» die Produktion von IgM bzw. IgG nachgewiesen. In einigen Zellkulturüherständen konnten im EIA IgM- bzw. IgG-Antikörper gegen HIV-Bestandteile bestimmt werden.
Durch mehnache Klonierungen wurden IgM- und IgG anti-HIV produzierend Zellklone etabliert. Die L-Ketten der Antikörper sind vom kappa-Typ, die IgG-Antikörper vom IgGi-Subtyp. Zwei der spezifischen IgG anti-HIV Antikörper wurden näher unterrucht und als CB-hgp41 -1 und CB-hp25 bezeichnet.
Mit Hilfe des Westernblots wurde die Antigenspezifität der Antikörper näher untersucht. U monokionale Antikörper CB-hgp41-1 reagiert mit dem gp41 Transmembran-Env-Protein des HIV. Die Reaktion mit rekombinanten M..*'nenen erbrachte auch eine Bande im gp160-Bereich, dem Precursorprotein von gp120 und gp41. Mit Hilfe von mehreren Peptiden, die analog verschiedener Bereiche des gp41 synthetisiert wurden, wurde die genaue Bindungsstelle des Antikörpers im Bereich der Aminosäuren 606-612 identifiziert. Der monoklonal Antikörper CB-hp25zeigt eine Reaktion mit dem Major-Corprotein p25 und den Precursorproteinen p55undp41.
Der Immunofluoreszenztest weist mit den HlV-infizierten Zellen charakteristische Reaktionsmuster der monoklonalen Antikörper aus. Die Zellinien zeigen stabiles Wachstum und kontinuierliche Antikörperproduktion über einen Zeitraum von mehreren Monaten.
Überraschenderweise bewirken diese Antikörper in einem biologischen Testmodell gegenüber entsprechenden Kontrollen eine Verzögerung der Infektion humaner T-Zellen mit dem HIV und zeigen damit eine potentielle Wirksamkeit zur Prophylaxe bzw. Therapie des AIDS.
Die Hybridome sind in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstituts für Molekularbiologie der AdW der DDR, Berlin Buch, unter folgenden Nummern registriert:
H.CB-hp25-1alsZIM-0315
H-CB-hp25-2alsZIM-0316
H-CB-hp25-3alsZIM-0317
H-CB-hgp41-1alsZIM-0318
H-CB-hgp41-2alsZIM-0319,
die Fusionslinie CB-Fu2 unter ZIM-0314.
Die Hybridomzellkulturen eignen sich zur in vitro- bzw. in vivo-Produktion der humanen monoklonalen Antikörper CB-hp25-1, CB-hp25-2, CB-hp25-3 sowie CB-hgp41-1 und CB-hgp41-2.
Ergebnisse der Fusbn zwischen der Parentalzeilinie CB-Fu2 und peripheren Blutlymphozyten eines HIV-Antikörperträgers
| Zellkul turen | angelegt | mit Wachstum | IgM+ | IgG+ | HIV^M+ | HIVk1Q+ |
| η | 468 100 | 462 99 | 348 74 | 62 13 | 6 1 | 5 1 |
Ausführungsbeispiele
1. Zellpräparation: Mononukleäre Zellen (MNZ) werden aus heparinisiertem Blut von HIV-A: 'ikörperträgern durch Dichtegradientenzentrifugation gewonnen. Die Heteromyelomzellinie CB-Fu2 ist durch Fusiot. on normalen humanen B-Lymphozyten und der Maus-Myelomzellinie P3X63 Ag8/653 entstanden. Es werden solche Hybridomzellen selektiert, die keine eigene Antikörperproduktion aufweisen. Diese Zellinien werden mohrfach in 8-Azaguanin passagiert bzw. kloniei:, cn HAT-sensitive Subklone zu erhalten. Die Linie CB-Fu2 zeichnet sich durch ein gutes Wachstum und eine hohe Immortalisierungsrate humaner B-Lumphozyten nach Hybridisierung aus.
2. Zellfusion und Zellkulturbedingungen: Die mononukleären sowie die CB-Fu2-Zellen werden in Serum-freiem RPM11640 (SIFlN, DDR) zweimal sedimentiert und anschließend in einem 1:5 Verhältnis von Heteromyelomzellen zu MNZ gemischt und erneut sedimentiert. Nach dem Dekantieren des Überstandes und der Resuspendierung des Sediments in der Restflüssigkeit wird langsam unter ständiger Bewegung des Sediments autoklaviertes, noch flüssiges Polyethylenglykol 1500 zugegeben. Nach einer Wirkzeit von 90sec wird das Polyethylenglykol durch Zugabe von RPM1160 langsam verdünnt. Anschließend werden die Zellen nochmals gewaschen und danach mit RPM11640 mit einem Anteil von 10% fetalem Kälberserum (FKS) auf eine Konzentration von 106 Zellen/ml verdünnt. 100μΙ dieser Zellsuspension werden pro Näpfchen einer 96-well-Zellkulturplatte einpipettiert. Nach 24 Stunden wird pro Näpfchen 100μΙ einer doppelt konzentrierten HAT-Lösung zugesetzt. Nach 2-4 Wochen
Kultivierung in feuchter, 5% CGyhaltiger Atmosphäre werden von den Zellkulturen die Überstände gesammelt und hinsichtlich einer spezifischen Antikörperproduktion getestet. Positive Kulturen werden mehrfach mit der Grenzverdünnungstechnik kloniert.
3. Enzymimmunoassay (EIA): Der Nachweis von spezifischen anti-HIV Anitkörpern orfolgt mit Hilfe eines „Sandwich'-EIA. Elektronenmikroskopisch reine HIV-Partikeln aus Zellysat von HlV-inf izierten H9-Zellen werden in einer Proteinkonzentration von 10ng/ml an Flachboden-Mikrotiterplatten aus Polystyren adsorbiert. 50μΙ der Zellkulturüberstände werden in den Antigenbeschichteten Platten über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen werden 50μΙ einer Lösung von Peroxidasekonjugierten Antikörpern spezifisch gerichtet gegen humane Immunglobuline, dazugegeben und 2h bei Raumtemperatur inkubiert. Om gebundene Konjugat wird durch die Substratreaktion mit Wasserstoffperoxid und o-Phenylendiamin nachgewiesen. Die Farbreaktion wird bei 492 nm mit einem Multiscan Vertikalphotometer gemessen. IgG- und IgM-lsotypen werden in den Zellkulturüberständen mit einem Zweiseiten-Bindungsassay getestet (Jahn, S., S.T. Kiessig, A. Lukowsky, H.-D. Volk, T. Porstmann, R. Grunow u. R. v. Baehr: Pokeweed mitogen induced synthesis of human IgG and IgM in vitro. Biomed. Biochim. Acta 45 [1986), 467).
4. Immunoblottlng: Das gereinigte Virusmaterial wird denaturiert und mit 2,5% Sodium Dodecylsulfat (SDS) und 5% 2-Merkaptoethanol bei 900C für 5 min reduziert und danach in einem 10%igen Polyacrylamid-Slebgel elektrophoretisch getrennt. Die Proteinbanden werden auf Nitrozellulosepapier elektrotransferriert. Nach dem Blocken mit 5% Trockenmilch werden die Streifen in 5ml 1:2 verdünnten Zellkulturüberstand eingetaucht. Die gebundenen Antikörpei werden mit Peroxidase-markierten anti-human IgO-Antikörpern und Färbung mit Diaminobenzidin (0,1 % NiCI2) nachgewiesen.
5. Immunofluoreszenztest: H9- oder K37-Zellen, die eine hohe Infektionsrate mit HIV aufweisen, werden auf 10-FeId-Objektträger aus dem Sediment aufgeschwemmt und luftgetrocknet. Die Zellen werden mit eiskaltem Azeton für 10min fixiert und die Zellkdiurüberstände auf die Präparate für 2 h bei 370C gegeben. Nach dem Auswaschen der überschüssigen Antikörper wird für 45min mit einem FITC-antihuman IgG-Antikörper (ATAB, USA) inkubiert und deren Bindung nach dem Waschen mit einem Umkehrfluoreszenzmikroskop untersucht. Als Positivkontrolle dient ein Serumpool von HIV-Antikörperträgern, und als Negativkontrollen werden negative Zellkulturüberstände bzw. zum Ausschluß von anti-zellulären Antikörpern nicht-infizierte H9- oder K37-Zellen verwendet.
6. Neutralisationstest: Es werden humane T-Zellenlinien (K37) gezüchtet, die mit HIV infiziert (K371") oder nicht infiziert (K37~) sind. Die Infektion der K37 -Zellen kann durch Inkubation dieser Zellen mit einem HlV-haltigen, zellfreien Überstand von K37+- Zellen (Variante 1) oder durch Vermischen von K37~- und K37+-Zellen im Verhältnis 100:1 erfolgten (Variante 2). Die Ausbreitung der Infektion in den davon angelegten Zellkulturen wird mit dem Immunfluoreszinztest unter Verwendung eines spezifischen anit-HIV-Antiserums festgestellt. Wird während der Infektionsphase bestimmtes polyklonales anti-HIV-Humanserum den Kulturen zugesetzt, kommt es zur Verhinderung oder Verzögerung der Infektionsausbreitung. Setzt man anstelle des Antiserums z. B. den humanen mAK CB-hgp41 -1 zu, kommt es überraschenderweise zu einem ähnlichen Effekt, insbesondere bei der Variante 2.
Claims (2)
- Verfahren zur Herstellung humaner monoklonaler Antikörper, die verschiedene Strukturen des Human Immunodeficiency Virus (HIV) erkennen, dadurch gekennzeichnet, daß normale humane B-Lymphozyten mit einer Maus-Myelomzellinie fusioniert und solche Hybridomzellen selektiert werden, die keine eigene Antikörperproduktion aufweisen, daraus Subklone gewonnen werden, von denen die Heteromyelomzellinie CB-Fu
- 2 (ZIM-0314) ausgewählt wurde, mit der Zellinie CB-Fu 2 (ZIM-0314) nach Fusion mit B-Lymphozyten aus dem Blut HlV-infizierter Probanden Hybridomzellen selektiert, daraus die Hybridomzellen H-CB-hp25-1 (ZIM-0315), H-CB-hp25-2 (ZIM-0316), H-CB-hp25-3 (ZIM-0317) sowie H-CB-hgp41-1 (ZIM-0318) und H-CB-hgp41-2)(ZIM-0319) ausgewählt, zurZüchtung eingesetzt und aus dem zellfreien Überstand die humanen monoklonalen Antikörper CB-hp25-1, CB-hp25-2, CB-hp25-3 sowie CB-hgp41-1 und CB-hgp41-2 isoliert werden.Anwendungsgebiet der Erfindung
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD31847888A DD274448A1 (de) | 1988-07-29 | 1988-07-29 | Verfahren zur herstellung humaner monoklonaler antikoerper gegen strukturproteine des hiv |
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| Publication Number | Publication Date |
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| DD274448A1 true DD274448A1 (de) | 1989-12-20 |
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ID=5601376
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| DD (1) | DD274448A1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0535154A4 (en) * | 1990-06-15 | 1993-12-01 | New York University | Heterohybridomas producing human monoclonal antibodies to hiv-1 |
-
1988
- 1988-07-29 DD DD31847888A patent/DD274448A1/de not_active IP Right Cessation
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| EP0535154A4 (en) * | 1990-06-15 | 1993-12-01 | New York University | Heterohybridomas producing human monoclonal antibodies to hiv-1 |
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