JPH05507202A - ヘミセルロース含有食品及び動物用飼料のエネルギー効率を改善するためのヘミセルラーゼ補充物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘミセルロース含有食品及び動物用飼料のエネルギー効率を改善するためのへミ セルラーゼ補充物 発明の背景 例えば、グルカナーゼ、キシラナーゼ、もしくはマンナナーゼ（ａｉａａＩａＪ ｓｅ）のような様々な酵素は、特定タイプのへミセルラーゼとして、それぞれ、 グルカン、キシラン、もしくはマンナンからなる異種多糖類の加水分解を触媒す る能力に基づいて分類される。ガラクタンもしくはグルコマンナンのようなマン ナン類の加水分解を行う酵素は細菌及び真菌類を含む多様な微生物類により産生 され、かつ、それらはある種の動物及び多数の植物内にも存在することが知られ ている。

そのようなマンナナーゼ類を産生ずる微生物類には、アエロモナス（Ａｅ＋ｏｍ ｏＩｌｘｔ）　、アスペルギルス（Ａｔｐｅｒｔｉｌｌｗｔ）、ストレプトマイ セス（５Ｉｒｅｐｌｏ＋＋Ｈｅ＋）　、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃａｃｅｍｓ ）　、及び、バチルス（Ｂ麿ｅｉｌｌａ＋）がある。

ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮ２ＹＭＯＬＯＧＹ　、　Ｖｏ　１．　１６０．　Ｉ ’ｘｒｌ　Ａ、　５ｅｃｔ。

Ｉ＋（１９８８）を参照のこと。

ヘミセルラーゼ類は、コーヒー、チョコレート、ココア、紅茶、及び、セリアル 食品類の加工において商業的に利用されている。これに関するヘミセルラーゼを 利用することにより得られる主たる利点は、溶液粘性の低下であり、それにより 食品類のより安価な加工が可能になる。従って、ヘミセルラーゼ類は、果汁を清 澄化するため、スラリーもしくはピユーレの粘性を低下させるため、ある種の細 胞壁固体物を液化させるため、及び、味を改良するために用いられる。しかし、 ヒト用食品及び動物用飼料製品の利用可能なエネルギー含量を、特に動物飼料に おいて増加させることができるならば、コスト節減の機会となる。

家禽類用食餌中のトウモロコン補足物としての、グルカナーゼ処理した大麦の成 功裏の使用は、このような例の−っである。

ドｅｅｌ＋ｌ１ｌｌｆｔ　６２　（４）　＋　１０　（１９９０）を参照のこと 。

７　／ｌ、　７７　／Ｌ／　７７、ココナツツ残留物（ｃｏｃｏｆｆｉＩｔ　ｒ ｅ＋１ｄｉｅ）　、グアー、ローカストビーンガム、力ロブビーンガム（ｃｘｒ ｏｂ　ｂｅ１ｎｇｕｍＬカッサバ、コブラ、タイプ類のようなヘミセルロース系 物質は、食品及び飼料製品の共通の構成成分である。タイプの誘導物は、実質的 な比率のヒト消費用の豆腐の成分を含み、更に、例えば、タイプ蛋白質の濃縮物 は、イヌ及びネコ、スワン、魚、及び、ニワトリ用の多くの飼料に使用されてい る。タイプのあら粉（ａｅｓｌ）は、ニワトリの錘用の飼料の２５％はどを含む 。

ブロイラーのようなニワトリ用の飼料は、最も安い費用を基本として、多数の成 分から処方される複雑な混合物である。この飼料は、非常に大量に必要である。

その結果、その飼料成分のための高価な貯蔵施設が混合作業に必要である。この 飼料成分を混合して、蛋白質、必須アミノ酸類、無機質（またはミネラル）類、 ビタミン類、及び、カロリー（つまり、エネルギー源）の至適栄養混合物を提供 する。主エネルギー源とは考えられてはいないものの、タイプあら粉は、必須ア ミノ酸を有する好ましい濃縮された蛋白質源であることが見出されている。タイ プあら粉は、ブロイラーニワトリの必要エネルギーの約２０％を供給する。

タイプあら粉はエネルギーを産生ずる幾つかの炭水化物類及び油類を提供するも のの、その総炭水化物含有量の約１０％はガラクタン類及びベントサン類からな る。これらの炭水化物類は、単胃動物によってはさほど吸収されないため、この 動物は更なる生化学的な酸化のための単糖類を得るほど迅速に炭水化物類を消化 することができない。タイプあら粉のエネルギー含量を増加させるための一つの 方法は、ガラクタン類及びペントサン類を、単胃動物によりより簡単に代謝され 得る低分子量のオリゴ糖類もしくは単糖類に低分子化することである。

直接給餌用微生物培養物が、今世紀初頭以来利用されている。

消化妨害物質を調節するための栄養付加物としてのラクトバチリ（Ｌｌｃｌｏｂ ｓｃｉｌｌｉ）の利用は、最初に、Ｅ、　Ｉ！ｅｔｃｈ＋＋ｉｋｏ目、ＰＲＯＬ ＯＮＧＡＴｆＯＮ　ＯＦ　ＬＩＦＥ　（Ｇ、　Ｐ、　Ｐｓｌａｓｍ’＋　５ｅａ ｓ　、１９０８年）により示唆された。それ以来、微生物は、食品類の栄養価を 増加させるための試みにおいて多様な方法で利用されてきている。

例えば、ラクトバチルス培養物の直接給餌法は、腸管内での乳酸の産生のために 、体重及び飼料効率を増加させることが報告されている。Ｄ、　Ｐ、　Ｒａ１ｃ ｈｅ＋ｏｎ、”Ｈｉｓ＋ｏ＋ｉｃｇｌ　Ａ＋ｐｅｃｌ＋、　”ｉｎ　ＤＩＲＥＣ Ｔ　−ＦＥＤ　ＭＩＣＲＯＢＩＡＬＳ　ＩＮ、ＡＮＩＭＡＬ　ＰＲＯＤＵＣＴＩ ＯＮ　（Ｎ＊ｊ’１Ｆｅｅｄ　ＩｎＨｅｄｉｃｅｎＡ＋＋ａｃ、、　１９９１年 ）。一般的には、栄養付加物としてのラクトバチルスの有益な効果は、動物によ り摂取された食料に直接作用するというその微生物の能力よりはむしろ、腸管を 活性化させ、有害な微生物と効果的に拮抗し、かつ、乳酸を産生ずるというその 微生物の能力による。

酵母及び真菌類は、１９６０年代初期以降、栄養付加物として同様に利用されて いる。酵母と真菌類は、食品の利用可能なエネルギー含量を増大させることがで きるある種の消化酵素類、未同定の成長因子類、及び、ビタミンＢ類を産生ずる と考えられている。これに関して、ある種のこぶ胃に存在する真菌類は、動物に おけるセルロースの利用を高めることが示されている。

１！ｗｌｃｂｅ＋ｏｎ　（止揚）参照のこと。この結果は、反舞動物は典型的に は、その腸における微生物作用によってその栄養物の主に全てを取得していると いう事実により説明することができる。

それとは対照的に、ヒト及び単胃動物類は、腸の微生物プロセスを通してはかな りの量の栄養物を取得することがない。従って、それらは、食品及び飼料品類の マンナン含有性ヘミセルロース成分のようなある種の炭水化物を消化することが できない。そのため、マンナン含有性うミセルロース成分を、単胃動物類により 代謝されることができる低分子量の炭水化物類に変換させることにより、食品及 び飼料品類のヘミセルロース成分の利用できるエネルギー含量を増大させる方法 についての必要性が存在する。

発明の概要 従って、本発明の目的は、組成物が新規のへミセルラーゼを含有するための消費 されるときにエネルギー含量が増大するヘミセルラーゼ含有組成物を提供するこ とである。

本発明の別の目的は、ヘミセルロース系炭水化物を含む食品もしくは飼料、及び 、そのようなヘミセルラーゼを産生じ、それによって、消費されるときにエネル ギー含量の増大をもたらす微生物から本質的になる培養物を提供することである 。

本発明の別の目的は、複輪な炭水化物類を含むが、それにもかかわらず、ヒトも しくは単胃動物により利用されることができる栄養物質を産生ずる方法を提供す ることである。

これら及び他の目的を達成するために、本発明の一態様に従って、（Ａ）栄養学 的に単胃動物もしくはヒトに適する蛋白質、ビタミン、及びミネラル；（Ｂ）、 マンナン含有へミセスロースを含む炭水化物源；及び、（Ｃ）該マンナン含有ヘ ミセルロースの分解を触媒し、該分解を触媒する活性に関して約ｐＨ４，５から 約ｐＨ１１までの範囲のｐＨプロフィルを有する酵素〜を含む消費可能組成物（ ｃｏｎｇｗｍｔｂｌｅ　ｃｏｍｐＯｔｉｔｉｏｎ）を提供する。好ましい実施態 様においては、この消費可能組成物はヒトの消費のためのものであり、つまり、 その成分は、動物用飼料に対立するものとして、ヒトの食品のための適切な規制 要件にかなうものである。それとは対照的に、他の好ましい実施態様においては 、本組成物は単胃動物用のものであり、従って、動物用飼料に適用される規制要 件にのみかなう必要がある。

本発明の他の態様に従い、成分（Ｃ）として、（１）ｐＨが８−１１の範囲であ り、かつ、（２）温度が少なくとも６０℃であるという両方の条件下において、 マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒する活性を示す酵素を含む、上述の成 分を含む組成物が提供される。

本発明の更に別の態様に従い、タイズあら粉と、ヘミセルロースの分解を触媒す る活性に関して約ｐＨ４，５から約ｐ　Ｈｌｌまでの範囲のｐＨプロフィルを有 するバチルス（Ｂｔｃｉｌｌｓｔ）から本質的に構成される酵素成分とを含む、 消費可能組成物を提供する。１つの好ましい実施態様においては、上述のｐＨプ ロフィルは、約ｐＨ７と約ｐＨ９の間にピークを有する。

本発明の更に別の態様に従い、（Ａ）栄養学に的単胃動物もしくはヒトに適する 、蛋白質、ビタミン及びミネラル；　（Ｂ）マンナン含有へミセスロースを含む 炭水化物源；及び、（Ｃ）該マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒し、該分 解を触媒する活性に関し約ｐＨ４，５から約ｐＨ１１までの範囲のｐＨプロフィ ルを有する酵素を産生ずる微生物から本質的に構成される培養物、を含む消費可 能組成物を提供する。好ましい実施態様においては、成分（Ｃ）は、ｐＨが８〜 １１の範囲であり、かつ、温度が少なくとも６０℃であるという両条件下で、マ ンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒する活性を有する酵素を産生ずる微生物 から本質的になる培養物である。

本発明の更に他の態様に従い、タイズあら粉と、ヘミセルロースの分解を触媒す る活性に対して約ｐｌ（４，５から約ｐＨ１１の範囲のｐＨプロフィルを有する 酵素を産生ずる微生物から本質的に構成される培養物とを含む、消費可能組成物 を提供する。１つの好ましい実施態様においては、上述のｐＨプロフィルは、約 ｐＨ７と約ｐＨ９との間にピークを有する。

本発明の更に別の態様に従い、（Ａ）栄養学的に単胃動物もしくはヒトに適する 蛋白質、ビタミン及びミネラル；　（Ｂ）マンナン含有へミセスロースを含む炭 水化物源；並びに、（Ｃ）（ｉ）　該マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒 し、該分解を触媒する活性に関し約ｐＨ４，５から約ｐＨ１１までの範囲のｐＨ プロフィルを有する酵素を産生ずる微生物から本質的に構成される培養物、及び 、（ｉ　ｉ）該酵素を含む発酵ブロス、を含む消費可能組成物を提供する。好ま しい実施態様においては、成分（Ｃ）は、（ｉ）ｐＨが８〜１１の範囲であり、 かつ、温度が少なくとも６０℃であるという両方の条件下で、マンナン含有ヘミ セルロースの分解を触媒する活性を有する酵素を産生ずる微生物から本質的にな る培養物、及び、（ｔ　ｉ）該酵素を含む発酵ブロスである。

本発明の更に別の態様に従い、タイズあら粉と、（ｉ）ヘミセルロースの分解を 触媒する活性に対して約ｐＨ４，５から約ｐＨ１１の範囲のｐＨプロフィルを有 する酵素を産生ずる微生物から本質的に構成される培養物、及び、（ｉ　ｉ）該 酵素、を含む発酵ブロスとを含む消費可能組成物を提供する。１つの好ましい実 施態様においては、上述のｐＨプロフィルは、約ｐＨ７と約ｐＨ９との間にピー クを有する。

本発明の更に他の態様に従い、（Ａ）栄養学的に単胃動物もしくはヒトに適する 蛋白質、ビタミン、及びミネラルを含むと共に、更に、マンナン含有ヘミセルロ ースからなる炭水化物源を含む消費可能組成物を製造するステップ、及び、（Ｂ ）単胃動物もしくはヒトによる該ヘミセルロースのマンナン含有部分の使用を可 能にするために、マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒し、該分解を触媒す る活性に関し約ｐ）（４，５から約ｐＨ１１までの範囲のｐＨプロフィルを有す る酵素を該組成物中に配合するステップ、を含む栄養増強法（ｎｗｌｒｉｌｉマ ｅ　ｍｅ＋ｂｏｄｌを提供する。あるいは、ステップ（Ｂ）は、マンナン含有ヘ ミセルロースの分解を触媒し、その活性について上述のｐＨプロフィルを有し、 かつ、先に記載したように、単胃動物もしくはヒトによるヘミセルロースのマン ナン含有部分の使用を可能にする酵素を産生ずる微生物から本質的に構成される 培養物を該組成物中に配合することを包含する。それに代わる更に別の方法にお いては、ステップ（Ｂ）は、先に記載したように、（ｉ）培養物及び（ｉｆ）酵 素を含む発酵ブロスを、組成物中に配合することを含む。好ましい実施態様にお いては、上記の炭水化物源は、タイズ、アルファルファ、グアー、ローカストビ ーンガム、力ロブビーンガム、カッサバ、コプラ、及びココナツツ残留物からな る群より選択される植物性物質であり、より好ましくは、タイズ及びアルファル ファである。他の好ましい実施態様においては、ステップ（Ｂ）は、該酵素及び 該組成物を含む混合物を製造し、その後、その混合物をペレット化することを含 む。更に他の好ましい実施態様においては、ステップ（Ｂ）は、該組成物、及び 、先に記載したような酵素を産生ずる微生物から本質的になる培養物、を含む混 合物を製造することを含む。更に他の好ましい実施態様においては、ステップＣ Ｂ）は、該組成物、及び、先に記載したような（ｉ）培養物及び（ｉ　ｉ）酵素 を含む発酵ブロス、を含む混合物を製造することを含む。

本発明の他の目的、特徴、及び利点は、以下に示す詳細な説明から明らかになろ う。しかしながら、詳細な説明及び具体的な実施例は、本発明の思想及び範囲内 での多様な変更及び変形が、この詳細な説明から、当業者には明らかであろうと いう単なる理由から、本発明の好ましい実施態様を示しながら説明さ本発明の実 施態様を説明する図面においては、図１は、本発明の範囲内のへミセルラーゼの 活性を、それぞれ、６０℃、７５℃、及び９０℃で（ｐ）（９，０）　、時間に 対してプロットしたグラフである。

図２は、本発明のへミセルラーゼの酵素活性のｐＨプロフィルを、公知の市販酵 素のものと比較したグラフである。

図３は、時間量に対する粘度の減少を示す代表的データであり、希釈した酵素を グアー溶液と共にインキュベートした。

図４は、対照食餌で生後２１日間養育したニワトリの平均体重を、ヘミセルロー ル含有動物飼料の食餌で養育したニワトリの平均体重に対して示したデータであ る。両方の集団について、増加した体重の量に対する飼料消費の量の比率（飼料 ／体重増加（Ｉｃｅｄ／ｇｓｉｏ））も示している。

図５は、対照食餌で生後４６日間養育したニワトリの平均体重を、ヘミセルロー ル含有動物飼料の食餌で養育したニワトリの平均体重に対して示したデータであ る。両方の集団について、増加した体重の量に対する飼料消費の量の比率（飼料 ／体重増加）も示している。

好ましい実施態様の詳細な説明 食品物質中のヘミセルロースの分解を触媒し、その結果、その物質の有効エネル ギー含量（＊ｗ＊ｉｌ＊ｂｌｅ　ｅｓｅ＋Ｂ　ｅｏｓｊｅ＊ｊ）を増加させるこ とが可能なヘミセルラーゼが、該酵素を産生ずる微生物から得ることができるこ とを発見した。本発明の範囲内のへミセルラーゼを産生ずる能力を有する微生物 は、土地に固有の微小植物群（■１ｃｒｏ［ｌｏ＋畠）が繁殖することができる 限定されたサブセクションを含む土壌から、従来の方法により単離することがで きる。ヘミセルラーゼ産生微生物は、バチルス・スブチリス（ｌｌ、　■ｂ目１ ０）もしくはバチルス・プレビス（Ｂ。

ｂｅｅマｔｓ　）のような他の微生物を、このような土地固有の土壌微小植物群 から標準的な組換えＤＮＡ技術によって得られるヘミセルラーゼコーディングＤ ＮＡで形質転換することにより製造することもできる。

本発明のへミセルラーゼを産生ずる微生物から本質的に構成される培養物におい て、当業界で周知の単離技術により、商業的に意味をなす量の該酵素を得ること ができる。この説明において、ヘミセルラーゼ産生微生物のような「特定の種類 の微生物から本質的に構成される培養物」とは、その培養物の顕著な機能特性が それらの微生物により決定される程度に、その種類の微生物から主に構成される 培養物である。しかしながら、他の種類の微生物は、例えば、ヘミセルラーゼ産 生微生物から本質的に構成される培養物中に、その培養物によるヘミセルラーゼ 産生を明らかに妨害しない限り、存在することができる。

本発明の範囲に含まれるヘミセルラーゼを産生ずる微生物を、広範な地理的区域 から採取した土壌試料から単離することができる。この土壌試料は主に、上部２ インチの土壌から採取され、更に、選択的な集積培地中で培養される。

特定の希望する特性を有する微生物を選択的に単離するための技術は当業界で良 く知られている。複製及び増殖が希望する酵素を産生ずる能力に依存する条件に 、このような微生物を潜在的に含む試料を暴露させることにより、特定の酵素を 産生ずる能力について微生物を選択することができる。広く用いられている１つ の選択法は、多大で多様な微生物集団を含む試料を、単一の炭素源からなる培地 に暴露させることである。ＭＥＴＯＤＳＩＮ　ＥＮ２Ｙ１１０ＬＯＧＹ、　Ｖｏ 　１．　１６０　：　１８０−８６　（１９８８）を参照のこと。その炭素源を 分解することができる酵素を産生ずることができるそれらの微生物のみがこの方 法により回収されるだろう。この種の選択的培養技術により、試料採取した生息 地の通常の植物群を含む無数の他の微生物から、希望する酵素を産生ずる微生物 が効果的に選択される。

本発明の好ましい実施態様においては、土壌試料のアリコートを、ヘミセルロー スが単一の炭素源として働くアルカリ性培養培地中に接種する。同一培地中で増 殖した二次培養物の希釈物を、単一の炭素源としてヘミセルロースをも含む固体 培地上にブレーティングする。形態学的に異なるコロニーを単離して、その後、 ヘミセルラーゼ活性についてスクリーニングする。本発明の特に好ましい実施態 様においては、グアーが単一の炭素源である、９〜９．５のｐＨ範囲の選択的富 栄養ブロスを土壌試料と共に接種し、３７℃でインキュベートし、好気的に振盪 する。インキュページタン後１１選択的集積培地を使珀して初期培養物の更なる 希釈を行う。数回の継代後、最も希釈したブロス培養物の一連の希釈物を通常の 食塩水中で調製し、グアーを単一の炭素源として含む固体培地上にブレーティン グする。

３４℃で５〜７日間インキユベーシツンした後、形態学的に異なるコロニーをそ の固体培地から単離し、更に、ヘミセルラーゼの活性についてスクリーニングす る。

高められたｐＨで、単一の炭素源としてヘミセルロースを利用する微生物につい ての初期選択により、全ての土壌微生物の有限の両分が回収される。典型的には 、約４０％の単離物は、本発明のへミセルラーゼを産生ずる能力を特徴とする。

この画分の特に好ましいサブグループは、グラム陽性バチルス（Ｂａｃｉ　ｌ　 １ｗ＋）馬の種を含む。

この好ましいサブグループの例は、０ＭＧ１２４０と表示されるバチルス・レン チイス（Ｂ、１ｅａｔｉ＋　）株であり、この一般的な性質を下記表Ｉにまとめ である。ＣＭＧ　１２４０株は、ブダペスト条約に従い、アメリカン・タイプ・ カルチャー・コレクシ言ン（ロックビル、メリーランド州）に、受託番号第５５ ０４５号として寄託されである。好ましいサブグループの任意の微生物株として の、ＣＭＱ１２４０株の要所となる性質は、本発明に記載の用途に適するヘミセ ルラーゼを培養培地中に産生ずる能力である。

セルラーゼ／ヘミセルラーゼ活性を測定するための従来の方法は、例えば、ＭＥ ＴｔｌＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮ２ＹＭＯＬＯＧＹ　、　Ｖ　ｏ　ｌ、１６０：１８０ 〜８６及び３６８〜７６　（１９８８）に記載されている。

これらの方法は、一般的に、予め決定しである量の基質を、予め決定しである量 の粗製のまたは精製された酵素調製物に暴露させることを伴う。基質の、希望す る最終生成物への変換率を、ｐＨ及び温度の特定の条件下で測定する。粗製の酵 素調製物は、適切な培地中で微生物を培養し、その後、沈殿もしくは限外濾過の ような従来の方法を使用して、細胞を囲んでいるブロス内に蓄積している酵素を 濃縮することにより製造することができる。得られる酵素調製物は、それぞれ要 所となる、不溶性基質の重量損失、多糖類懸濁液の濁度変化、還元性末端基の増 加、β−マンナン類のような多糖類の粘性の減少、比色測定、多糖類−アガー中 でのクリアランスゾーンの測定、もしくは、ポーラログラフイー等を含む、当業 界で公知の方法により、比活性についてアッセイすることができる。

表Ｉ ａ、形態学： （１）　バチルス形状：　（０，８Ｘ１．７〜２．３）μｍ０（２）　単−及び 対をなすものが主に生じる。

（３）　内生胞子を形成することができる。

（４）　ダラム陽性（ダラム可変性もしくはグラム陰性のものも出現する）。

ｂ、増殖条件： （１）　トリプシン処理のグイズーアガープレート培養：コロニーは不規則で、 凸状、滑らか、波状、酪酸性（ｂｉ１７＋ａｕ＋）、不透明、及び直径２ｍｍ　 （７２時間、３７℃）である。

Ｃ１生物学的特性： （１）　好気性。

（２）　カタラーゼ陽性。

（３）　オキシダーゼ離性。

（４）　非運動性。

（５）　増殖温度：３０〜５０℃、最大増殖率は４１℃において生じる。

（６）　増殖ｐＨ（グルコース−無機塩基本培地中で、３４℃で３５Ｏｒｐｍに おいて１０時間培養した）ニア、Ｏ〜８．５、最大増殖率はｐＨ７，５において 生じる。

（７）　カゼイン及びゼラチン分解：陰性。

（８）　デンプン加水分解：陽性。

（９）　１〜５％ＮａＣｌ中での増殖：陽性。

（１０）利用された炭素源：Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクト ース、Ｄ−キシロース、乳糖、マルトース、シ碧糖、α−シクロデキストリン、 デキストリン、グリコーゲン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｌ−アラビノース、 セロビオース、ゲンチオビオース、ラクツロース、マンニトール、Ｄ−マンノー ス、Ｄ−メリビオース、Ｄ−トレハロース、ツラノース、α−ケトブチル酸、ウ リジン、及び、ｍ−イノシトールを含む。

（１１）硫化水素生成：陰性。

（１２）インドール生成：陰性。

（１３）クエン酸の利用：陰性。

（１４）ウレアーゼ：陰性。

（１５）　Ｗａｇｅｓ　−Ｐ＋ｏｓｋ＊ｗｅ＋　：陰性。

（１６）フェニルアラニンデアミナーゼ：陰性。

（１７）リシンデカルボキシラーゼ：陰性。

（１８）オルニチンデカルボキシラーゼ：陰性。

（１９）アルギニンデヒドロラーゼ：陰性。

本発明に従い、ヘミセルロース含有ブロス培地中で、単離した微生物のコロニー を培養することにより、土壌単離物をヘミセルラーゼ産生についてスクリーニン グする。インキュベーシロン後、そのブロス培地を遠心し、得られる上清を濾過 して細胞を除去し、ヘミセルロースの粗製調製物を得る。この酵素を、好ましい ヘミセルロースのアルカリ性で粘性がある調製物に添加して、その基質の液化の 度合いの経時変化を測定する。

土壌単離物を、マンナン含有ヘミセルロースが単一の炭素源であるブロス培地中 で培養することが好ましい。インキュベージラン後、そのブロス培地を遠心し、 得られる上溝を濾過する。

得られるこの粗製酵素調製物を、８〜１１の範囲内のｐＨで、マンナン含有ヘミ セルロースの高粘性を有する調製物に添加する。該酵素の相対活性を、ヘミセル ロースを液化させるのに必要な時間量により測定する。

土壌単離物を、先に記載した本うに、グアーが単一の炭素源である選択的集積培 地中で培養することが特に好ましい。インキュベージラン後、この培養物を遠心 し、得られる上溝を濾過して粗製酵素を回収する。この粗製酵素を、その後、架 橋結合させたグアー調製物を含む管の中に、９〜９．５の範囲内のｐＨで、この 調製物の粘性を上昇させるｐＨ金属イオン類と共に導入する。３９〜４０℃で少 なくとも１時間インキュベーションした後、従来の粘度測定法を使用して、酵素 ／グアー溶液の粘性を決定することにより、酵素活性を測定する。

例えば、Ｂｉｏｃｂｅｔ　Ｂｉｏｐｂｙｓ、　Ａｃｔｓ　Ｌ　３９　：　２３８ 及び２４８（１９６７）　；　Ｅｏｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｋｅ■、５１：２０７ （１９７５）を参照のこと。

先に記載したようにして取得されるヘミセルラーゼは、一般的に、最小値の約ｐ Ｈ４，５と約ｐＨ１１のそれぞれの間の、幾分６．　５ｐ）ｆ単位を越える範囲 にわたるｐｌ（プロフィルー−特定の酵素活性とｐＨとの間の関係により定義さ れる曲線−一により特徴付けられる活性を示す。このようなｐＨプロフィルは、 例えば、約ｐＨ８以上では事実上不活性である既知のバチルスマンナナーゼにつ いての対応するプロフィルと比較する場合、かなり異なる。Ａｒ５ｗ１ｏとＷｔ 、ｒｄ　、　１．、　Ａｐｐ、Ｂｘｅ＋ｓ＋ｉｏ１．．６８　：　２５３〜６１ （１９９０）を参照のこと。

本発明において使用されるヘミセルラーゼは、約ｐＨ９から約ｐＨ７の間の範囲 内にピーク（つまり、活性が最大になる該曲線の一部分）を有するｐＨプロフィ ルを有することが好ましい。また、この酵素が、高いアルカリ性及び高められた 温度の両方により特徴付けられる条件下において、顕著な生物学的活性を示すこ とが好ましい。このような適切な酵素は、例えば、ｐＨが８〜１１の範囲内であ り、かつ、温度が６０℃もしくはそれより高い場合に、顕著な活性を示す。

本発明に記載の用途に特に好ましいヘミセルラーゼは、以下に示す特性を有する エンド−β−Ｄ−マンチナーゼテする：（１）活性：好ましい酵素は、ガラクト マンナン、グルコマンナン、及び、マンナンのようなマンナン炭水化物類を含有 するヘミセルロース系物質に作用する。この関連の活性は、以下に示す方法で測 定することができる。１．０％グアーを含む水性懸濁液を基質として使用し、２ ｍＬの２Ｍグリシンを１６．０ｍＬの基質に添加する。この混合物を完全に混ぜ 合わせ、その後、３８℃に予備加熱する。酵素をその基質に添加し、良く混ぜ合 わせ、その後、ストップウォッチを用いてピペットの仕込み一排出時間を測定す るような簡単な方法、もしくは、ブルックフィールド（ＢｒｏｏＨｉ＋ｌｄｌも しくはファン（Ｆｉｎｅ）の粘度計のようなより複雑な装置を使用して、酵素／ グアー溶液の粘度を測定する。マイルズ製Ｂ１５００のような、既知の活性を有 する、市販のへミセルラーゼ酵素を使用して、標準曲線を作成する。市販のへミ セルラーゼのグラム数もしくは単位数を粘度を変化させるのに必要な時間に対し てプロットし、新規のへミセルラーゼを市販品のものと比較する。

（２）基質特異性、酵素は、Ｄ−ガラクトースとＤ−マンノースとがβ−１，４ 結合したポリマーであるグアーガム、及びローカストビーンガム、のような比較 的単純な炭水化物のポリマー類、並びに、例えば、ダイス及びアルファルファか らの、より複雑なマンナン含有炭水化物類を分解する。他の適切な基質には、マ ンナン含有ココナツツ残留物（ｃｏｃｏ＋＋Ｉｌ　ｔｅｓｉｄｍｅ）　、カロブ ビーンガム、カッサバ、コブラ、及び、グアーを化学的に改質したものなどがあ る。

（３）至適ｐＨ：この酵素の至適ｐＨは、約７．０もしくはややそれを上回り、 例えば、７．１から７．５の範囲である。この酵素は、約４．５から１１の範囲 のｐＨで安定である（図２参照）。

（４）至適温度：酵素活性に対する至適温度は４０℃であるが、酵素活性は、２ ０℃から９０℃の範囲の温度で観察される。図１に示すように、この酵素は、６ ０℃から９０℃の範囲の温度で顕著な活性を示す。

（５）温度及びｐＨによる不活性化：ｐＨ９，０においては、６０℃で５．５時 間後、７５℃で４５分後、及び、９０℃で１５分後に、この酵素は、最大活性の ５０％を保持している（図１参照）。

（６）ｅ−ＰＩ：均質になるまで精製した後、この酵素は、５ＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動により測定したところによると、約３２．０００の分子量 を有している。培養ブロスから粗製酵素調製物を得るために、細胞及び細胞破砕 物を最初に０．１ミクロンのフィルターで除去する。この酵素を、その後、１０ ．０００分子量カットオフの膜で濃縮する。しかしながら、一度酵素を濃縮する と、酵素の大部分がその膜を通過することができる。

この最終透過物中の酵素は、５，０００分子量カットオフ膜で濃縮するか、ある いは、３倍容量のアセトンで沈殿させることができる。沈殿物を遠心した後、上 溝をサイフオンを利用して除去し、ベレットを５０ｍＭのリン酸バッファー中に 再懸濁させる。この濃縮物を１０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７，０）に対し て透析し、その後、ＤＥＡＥ−セファセルカラム上に載置する。この酵素を、５ ０ｍＭのリン酸バッファー（ｐ　Ｈ７，０）中における、０〜１．２５Ｍの範囲 の上昇イオン強度の塩化ナトリウム勾配溶液で溶出する。画分を集め、酵素活性 についてテストする。最大活性を示す画分をプールし、５ＤＳ−ポリアクリルア ミドゲル電気泳動を使用して分析し、蛋白質分子量標準と比較する。

本発明に従い、商業的に有用な量のへミセルラーゼを、従来の発酵技術を用いて 前述のへミセルラーゼ産生微生物を培養することにより製造することができる。

この関連において、「発酵」は、有用な生成物が微生物が作用する基質から得ら れる任意の調節された微生物作用を広く意味するために使用される。

本発明に従い、発酵は、攪拌タンク反応器内で行うことができる。この種の反応 器は、主に、撹拌機、バッフル、熱交換コイル、並びに、温度、空気流、圧力、 ｐＨ，及び泡立ちのための自動制御を含む密閉された円筒型タンクである。この 種の発酵容器には、必須栄養物、及び、グアーガムのようなヘミセルラーゼ誘導 物（ｉｎｄｗｃｅｒ）が仕込まれる。滅菌後、反応容器に、先に記載したように ヘミセルラーゼを産生ずる能力について予め選択されている微生物類から奉賀的 に構成される培養物を接種する。

バッチ培養の非稼働時間を排除した連続培養は、発酵生産率を増加させることが できる。しかし、大規模連続培養において生産率を保持することは、時々困難で ある。従って、本発明の細菌を利用するバッチ発酵が好ましい。

本発明の好ましい実施態様においては、バチルス・レンチイス（Ｂ、Ｉｅｌｉｓ 　）　ＣＭＧ　１２４０のようなダラム陽性バチルス株を、商業的に有用な量の 酵素を生産するのに利用する。工業用等級の栄養物類、グリセロール（炭素源） 、及び、グアーのようなマンナン含有ヘミセルロースからなる培地を仕込んだ発 酵容器に、先に記載したようなダラム陽性バチルス株から主になる培養物を接種 する。この発酵容器を、約３５℃に（５００〜１．００Ｏｒｐｍ撹拌）、約１２ 時間保持する。グアーのようなヘミセルロースを増殖期の間、発酵容器に添加し て、更に酵素産生を誘導する。この発酵物を約１から７．５時間後に収集して、 更にその後、例えば、粘度測定法により、酵素活性を測定する。

発酵産物の酵素活性は、発酵ブロスの一部を遠心し、更に、得られる上清をテス トすることによりアッセイする。上溝のくもしくは、その希釈物）のアリコート をグアー溶液に添加し、−室孔径のピペットから予め決定した容量を排出するの に必要な時間をルーチンに記録することにより、酵素／グアー溶液の粘度低下を 測定する［先に列挙した、好ましいヘミセルラーゼの特性における項目（１）を 参照のこと］。

０．５ミクロンのフィルターを通す濾過で、細胞を除去し、その後、５，０００ ．１０，０００．もしくは５０．０００分子量カットオフ限外濾過膜を使用する 限外濾過により、発酵ブロスから酵素を回収する。この濃縮物を、約４℃で３倍 量のアセトンと混ぜ合わせて酵素を沈殿させる。この沈殿物を約２４時間放置し て沈降させた後、上清をサイフオンにより除去する。

次いで、沈殿物を約４℃で遠心し、得られるペレットをリン酸バッファー中に再 懸濁させてペーストを形成する。

本発明の範囲内に含まれるヘミセルラーゼを製造する特に好ましい方法において は、バチルス争レンチイスＣＭＧ１２４０のようなグラム陽性バチルス株を利用 して商業的に有用な量の酵素を生産する。例えば、グリセロール、イースト抽出 物、必要なミネラル、及び、微量元素類からなる培地を仕込んだ２機の１４リッ トル発酵容器に、先に記載したようなグラム陽性バチルス株から主になる培養物 を接種する。６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）が約２．０に達するまで、この発 酵容器を３６〜３７℃で、〉４０％の溶存酸素濃度、及び、３００〜１１０００ ｒｐの撹拌速度にして維持する。

ＯＤが２．０に達すると、温度を２９〜３０℃に下げ、インキュベーションを、 ＯＤが１４に達するまで更に約１３．５時間継続し、そのＯＤになつた時点で、 温度を１０℃に下げる。

その後、先に記載した培地ではあるが実質的にはより濃いイースト抽出物含量を 含む培地を仕込んだ２５０リツトルの発酵容器に、２機の１４リットル発酵容器 の内容物を接種する。

３００と５０Ｏｒｐｍとの間の撹拌速度で、溶存酸素を約７０％の飽和状態に保 持する。温度は２８℃に保持し、ｐＨは、８．０から８．４５の範囲に保持する 。泡立ちは、例えば、シリコーン泡防止剤で制御することができる。約１５．５ 時間のインキュベーション後、ＯＤが１４に達し、温度を２０℃に下げる。イキ ュベーシタンは、一般的には、ＯＤが２０に達するまで、約２５時間継続する。

グリセロール、イースト抽出物、ダイズ粉、グアーガム、及び、必要な栄養物、 及び、微量元素類からなる培地を仕込んだ１５００リツトルの発酵容器に、先に 記載したように、２５０リツトル発酵容器の内容物を接種する。温度を２８℃に 維持し、ｐＨを約８．１１〜８．４４の範囲に維持する。２４０〜２８８ｒｐｍ の撹拌速度で、溶存酸素濃度を約２５％以上の飽和濃度に維持する。発酵容器内 の空気流は、１分当たり６００〜１０００リツトルに保持し、かつ、タンクの空 気圧力を３ｐｓｔと１ｌｐｓｉとの間に保つことが好ましい。また、泡立ちをシ リコーン消泡剤で制御することができる。

接種後約４．５時間で、ＯＤが約５．６に達したとき、グアーガムを発酵容器に 添加する。つまり、１リツトル当たり総量的１３．８グラムが添加されるまで、 約９時間にわたり毎時間グアーガムの大体１から２キログラムを添加することが できる。

接種後１０から１３時間目に、１リツトル当たり総量約３グラムが添加されるま で、グリセロールをゆっくりと発酵容器内に添加する。発酵は、ＯＤが約２３に 達した時点で、接種後約１４時間目に停止し、酵素活性を測定すると、１リツト ル当たり約２．６７Ｘ１０７単位となった。

この酵素は、ウエストファリア（ｖ！ｓｌｐｈｇｌ目）製連続遠心機もしくは類 似の装置を通すことによる細胞塊及び培地固形物の除去により回収される。残存 している固形物及び高分子量物質を、例えば、０．１ミクロンの中空系繊維フィ ルターを通す濾過により除去する。その後、この粗製酵素を、５０，０００分子 量カットオフ中空系繊維限外濾過膜を使用して濃縮する。この濃縮物をその後、 滅菌した０、１ミクロンのフィルターにより濾過し、更にその後、粗製酵素を塩 析する目的で、１リツトル当たり５５０グラムの濃度で硫酸アンモニウム中に懸 濁させる。この酵素沈殿物を、その後、５℃、８．００Ｏｒｐｍでの遠心により 回収する。このような方法により、この沈殿物の酵素活性を測定すると、１キロ グラム当たり一般的に、約５．０ＸＩＯ８単位となった。

本発明の範囲内のへミセルラーゼの製造の代替方法においては、ヘミセルラーゼ をコードするＤＮＡを単離し、これを用いて、既知の方法により、この酵素を組 換え宿主により商業的に有用な量で産生ずるような適切な宿主生物を形質転換さ せることができる。ヘミセルラーゼをコードするＤＮＡは、本発明に記載のへミ セルラーゼを発現する微生物から作製された核酸ライブラリーをスクリーニング することにより単離することができる。例えば、Ａ＠５ａｂｅｌ　ら、ＣＵＲＲ ＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ　、セク ション５及び６　（Ｊｏｈｎ　ＷＮｅ７＊Ｉｌｄ　５ｏｏｔ　、　Ｎｅｗ　Ｔｏ ｒｋ）　（１９８７年、１９９０年）（ｒＡａｚｕｂｅｌ　Ｊ　）を参照のこと 。このようなライブラリーは、例えば、本発明の範囲内のへミセルラーゼのＮ末 端部分をコーリゴヌクレオチドプローブによりスクリーニングされる。このよう なＮ末端部分の例としては、後述の実施例１４に記載しであるような、アミノ酸 配列、Ａｌｔ　−３ｅｔ　−ＧＩ７−Ｐｈｅ　−Ｔ７ｒ　−Ｖｇｌ　−Ｉｗｘ　 −ＧＩ７　−Ｔｈｒ　−１１ｅ　−Ｌｅｔ　−１ｘｘ　−Ａ＋ｐ　−３ｅｒ　− Ｔｂｒ　−ＧＩ７−Ａｓ＋＋　−Ｐｒｏ　−Ｐｂｓ　−ＬＨ−１１ｅ　−Ｘｘｘ 　−Ｇ１７−１１１−Ａ＋ａ　［！！Ｉは、未決定アミノ酸を表す］である。＾ ＊■ｂｅｌのセクション６を参照のこと。

それに代わるものとして、例えば先に記載したＮ末端配列に基づき、本発明のへ ミセルラーゼをコードするポリヌクレオチドを単離するために有用な他のプロー ブを作製するための鋳型としてのプローブを用いて単離する場合、本発明のへミ セルラーゼの内在性コーディング配列を含むかあるいはそれに隣接する他の部分 を使用することができる。このようなプローブは、先に記載したようなゲノムも しくはｃＤＮＡのライブラリーをスクリーニングするための公知の方法（先に引 用した八ｗｓｉｂｅｌを参照のこと）、あるいは、本発明のへミセルラーゼをコ ードする単離したＲＮＡから作製されるｃＤＮＡを増幅させるのに用いるための ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プローブを合成するための公知の方法で使用す ることができる。このようなｃＤＮＡを、その後、適切な発現ベクター内にクロ ーン化し、宿主生物を形質転換させるのに使用することができる。

Ａｗｓａｂｅｌのセフシラン１５．４を参照のこと。

これに関する適切なポリヌクレオチドは、以下に記載するように、コドン使用、 翻訳の開始、及び、本発明の範囲内の商業的に有用なヘミセルラーゼの回収可能 な量の発現に関して、選択宿主に対して至適化される、所望のアミノ酸配列に対 応するヌクレオチド配列を含むのが好ましい。また、このようなポリヌクレオチ ド分子で選択宿主生物を形質転換させるために選択されたベクターは、該ポリペ プチドをコードする配列の効果的な保持及び転写を可能にすべきマある。このよ うなベクターは、簡単に、市販の供給源から手に入れることができるか、あるい は、そこから誘導することができ、かつ、本発明のへミセルラーゼを発現させる ために使用される特別な宿主細胞に適合している。本発明に使用するのに適する ベクターの例については、Ａｏｇａｔ＋ｃｌのセクシヨン２〜４を参照のこと。

本発明のへミセルラーゼを発現させるのに適する宿主細胞には、原核生物もしく は真核生物細胞があり、それらは例えば、細菌１Ｉｌｒ＃ｉ、藻類細胞、イース ト細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、及びヒト細胞である。従って、本発明に適する 宿主細胞には、アエロモナス（ＡｅｒｏｌｌＡＩ）、アスペルギルス（Ａ＋ｐｅ ｔＩｉｌ１ｗｇ　）　、バチルス（Ｂ＊ｃｉｌ１ｗｓ）　、ニジエリシア（Ｅｓ ｃｈｅ＋１ｃｂｉｘ　）　、クルイベ０フイセス（ＫＩｓ７ｖｅｒａｍ７ｅｅ＋ 　）、ピキア（Ｐｉｅｂｉ＊）　、ｏドコッヵス（Ｒｈｏｄｏｃｅｃｃｗｓ　） 　、サツカロマイセス（５Ｉｃｃｈ＊ｒｏｌＹｅｅｓ　）　、及びストレプトマ イセス（Ｓｒｒｅｐｒｏｍｒｃｅｓ）がある。この適切な宿主微生物類のより具 体的な例は、細菌である大腸５１　（Ｅ、ｅｏｌｉ）、バチルス・スブチリＸ　 （Ｂ、ｓ＋＋ｂｍｌｉｌｉｓ）　、バチルス−プレビス（ｆｌ、ｂｒｅｖｉ＋　 ）　（Ｊ。

Ｂｓｃｌｅｒｉｏｌ、１７２：１３１２−２０）％及び、バチルス・レンチス； 遺伝子型ｔｒｐｌ　ｇｇｌｌ　ｓｄ；ｌ　ｈｉ＋２を有するイーストＳ。

セＬＬ’シ７工（ｓ、ｃｅｒｅｗｔ＋ｉｓｅ　）株Ｘ２１８１−ＩＢ　（イース ト・ジェネティック・ストック・センター、バークレー、カルフォルニア州から 入手できる）；遺伝子型ｂｉ１２　ｗｄｅｌ　ｌｒｐ１ｍｅ目４　ｙｒｔ３を有 するＡＴＣＣ５２６８３株（アメリカン・タイプタメルチャー・コレクシタン、 ロックビル、メリーランド州から入手できる）；及び、遺伝子型り目１　＋ｒｐ ｌを有するＡＴＣＣ４８１８３株（これもアメリカン・タイプ・カルチャー・コ レクシタンから入手できる）である。本発明のへミセルラーゼをコードするポリ ヌクレオチドを含む宿主細胞は、回収可能な、もしくは、商業的に有用な量の本 発明のへミセルラーゼの発現を提供する条件下において増殖することができる。

例えば、Ａａｓａｂｅｌのセクシヨン１及び１３を参照のこと。

タイプのような植物性物質の多数の供給源は、エネルギー含有蛋白質及び炭水化 物に富んでおり、かつ、動物用飼料の成分としてしばしば利用される。タイプは また、ヒトの消費のための食品の成分としても広く使用されている。ガラクタン 類は、市販のタイプ製品の総炭水化物含量の主要成分であるが、しかし、それら の炭水化物類は簡単に消化されないために吸収されないという理由により、単胃 動物用飼料の成分として使用される場合には、タイプあら粉の有効エネルギー含 量にさほど寄与するわけではない。それらのエネルギー含量を活用するためには 、ガラクタン類は、単胃動物及びヒトにより吸収かつ代謝されることができるよ り小さい分子量の炭水化物類へ低分子化させる必要がある。

本発明に従い、上述の性質を有するヘミセルラーゼを、食品及び動物用の飼料品 のヘミセルロース系成分中に存在するガラクタン類及び他のマンナン炭水化物類 特にタイプからの複合炭水化物類を含むもの、を分解させるのに使用することが できる。

本発明の消費可能な組成物中に含まれる酵素成分は、好ましくは、上述したよう なヘミセルラーゼ、特にバチルスへミセルラーゼから本質的に構成されるべきで ある。これに関して、［本質的に構成される」とは、酵素成分が、主に前述のへ ミセルラーゼにより決定されるヘミセルロース分解活性を示すことを意味する。

しかしながら、酵素成分のヘミセルロース分解活性を甚だしく妨害しない限り、 恐らくは他の活性を有する他の酵素が存在してもよい。

好ましい実施態様においては、本発明のへミセルラーゼの有効量を、タイプあら 粉の一部分呻添加し、乾燥させる。得られる組成物を挽いて微粉末にし、その後 、例えば、トウモロコシ及び他の栄養物からなる乾燥動物飼料と混合する。

この種の混合物は、従来のへミセルラーゼ類を不活性化させる条件、特に、熱及 びｐＨの条件下にで加工することができる。

従って、前述のタイプをベースにした組成物を、圧縮ミルを通して処理して、予 め決定されている比率で、ヘミセルラーゼ、タイズあら粉、及び、他の動物飼料 用成分を含む動物飼料のベレットを形成することができる。ヘミセルラーゼ含有 動物飼料の食餌で養育する場合、ニワトリは平均して、ヘミセルラーゼを含まな い同一の食餌で養育したニワトリよりも、摂取した飼料１ポンド当たりの体重が 増加する。

本発明の他の態様に従い、本発明の範囲内のへミセルラーゼを産生ずる微生物か ら本質的に構成される培養物を、一旦摂取されると微生物が本発明の範囲内のへ ミセルラーゼを産生ずるように、適切な消化管を有するブタのような単胃動物類 に対して直接給餌することができる。このような培養物を、飼料量のヘミセルロ ース成分類中に存在するガラクタン類及び他のマンナン炭水化物類、特にタイズ からの複合炭水化物を含むもの、の分解を促進する目的で、飼料量と混合して上 述の動物に直接給餌することができる。これに関して、「本質的に構成される」 とは、その培養物成分が、本発明の範囲内のへミセルラーゼを産生ずる微生物か ら主としてなることを意味する。しがしながら、この培養物成分のへミセルラー ゼ産生活性を甚だしく妨害しないかぎり、他の微生物が存在してもよい。本発明 の消費可能組成物中に含まれる培養物成分は、好ましくは、先に記載したような ヘミセルラーゼ、特にバチルスヘミセルラーゼから本質的に構成されるべきであ る。好ましい実施態様においては、本発明の微生物から本質的に構成される培養 物の有効量をタイズあら粉の一部に添加し、更に、乾燥させる。得られた組成物 を挽いて微粉末にし、その後、例えば、トウモロコシ及び他の栄養物からなる乾 燥動物飼料と混合することができる。この組成物を、その後、圧縮ミルを通して 処理して、予め決められた比率で、本発明の微生物の培養物、タイズあら粉、及 び、他の動物飼料成分を含む動物用飼料のベレットを形成することができる。

あるいは、上述の培養物のみからなる調製物を製造し、そのような動物に直接給 餌することができる。このような調製物は、本発明の範囲内の生きている微生物 からなる濃縮ペーストの有効量からなる。この調製物はまた、そのような微生物 の凍結乾燥した培養物の有効量からなる。

本発明の更に他の態様に従い、本発明の範囲内のへミセルラーゼを産生ずる微生 物の培養物を含む発酵ブロスを、先に記載したようなガラクタン類及び他のマン ナン炭水化物類の分解を促進させる目的で、飼料量と混合して単胃動物類に直接 給餌する。本発明の消費可能組成物中に含まれる発酵ブロス成分が、先に記載し たようなヘミセルラーゼ、特にバチルスヘミセルラーゼを産生ずる微生物の培養 物、及び、本発明の範囲内のこのようなヘミセルラーゼの有効量を含むことが好 ましい。これに関して、発酵ブロスは、上述の培養物及びそのような培養物によ り産生される酵素に加えて、本発明の酵素を産生ずる微生物を培養するのに適す る栄養物類を含む。

好ましい実施態様においては、このような発酵ブロスの有効量を噴霧乾燥させて 、他の飼料成分類に添加する乾燥粉末を製造する。あるいは、他の好ましい実施 態様においては、先に記載したような発酵ブロスを、タイズあら粉のような飼料 成分類の一つと直接混合し、乾燥させ、更にその後、他の成分類と混合する。更 に別の実施態様におりては、このような発酵ブロスを、完全飼料と直接混合する 。特に好ましい実施態様においては、発酵ブロスを乾燥して濃縮物を形成し、こ れを飼料用ミルに輸送し、別の完全飼料混合物と配合される。このような飼料組 成物を、その後、圧縮ミルを通して、予め決められた比率で、微生物の培養物及 び本発明のへミセルラーゼの有効量からなる発酵ブロス、タイズあら粉、及び他 の動物飼料成分を含む動物飼料のベレットを形成することができる。

本発明を、以下に示す例示的な実施例を参照とすることにより、以下に更に記載 する。これらの実施例においては、以下に示す培地を使用した： 選択的集積ブロス（量／リットル） １０．０ｇ　グアーガム ５．０ｇ　（ＮＨ４’＞　２Ｓｏ４ ｐＨ９，５ 選択的集積アガー（量／リットル） ２．０ｇ　グアーガム １　、Ｏｇ　Ｎ　ａ　２　ＨＰ　Ｏ４ ３，０ｇ　（ＮＨ４）２Ｓｏ４ ０．２ｇ　ＮａＣｌ　。

０．２ｇ　Ｍｇ５０　・７Ｈ２０ ５０、Ｏｍ　ｇ　Ｃａ　ＣＩ　・２　Ｈ２０１，０ｍＬ　微量元素溶液Ｉ　（以 下を参照のこと）１５．０ｇ　アガー　ノープル（Ａ１＋　Ｎｏｂｌｅ）５０、 ＯｍＭ　ｈリスバッフｙ−（ｐＨ９，０）１．０ｍＬ　ビタミン溶液（以下を参 照のこと）微量元素溶液Ｉ（量／リットル） １００．０ｍｇ　ＥＤＴＡ ２３０．０ｍｇ　Ｚｎ５Ｏ−７Ｈ２０ １８０−Ｏｍ　ｇ　Ｍ　ｎ　Ｓ　Ｏ４・Ｈ２０６０、０ｍ　ｇ　Ｈ３Ｂ　Ｏ３ １００，０ｍｇ　ＣｕＳ０　・５Ｈ２０４０，０ｍｇ　Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２ ０４０、Ｏｍｇ　ＣｏＣｌ　・６Ｈ２０ ７０，０ｍｇ　Ｋ１ ４０．０ｍｇ　ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０ ０，４ｍｇ　ＮｉＣｌ　・６Ｈ２０ ８，０ＭＬ　Ｏ，ＬＭ　Ｈ２Ｓｏ４ ビタミン溶液（量／リットル） １．０．　ビタミンＢ１２ １．０ｇ　リボフラビン、Ｂ２ １、Ｏｇ　ピリドキシン、Ｂ６ １．０ｇ　Ｄ−ビオチン １、Ｏｇ　塩酸チアミン １、Ｏｇ　Ｄ−Ｃａ−パントテン酸 シードブロス（量／リットル） ７．５ｇ　グリセロール １０．０ｇ　イースト抽出物 ２．５ｇ　）ウモロコシ浸漬液（ＣｏｒｌＳｔｅｅｐ　Ｌｉｑ箇ｏ＋１．０ｇ　 ＫＨ２Ｐ０゜ ２、Ｏｆ　（ＮＨ，）２Ｓｏ。

０、！Ｍ　ＭｇＳＯ４−７Ｈ２０ １、ＯｍＬ　微量元素溶液ＩＩ（以下を参照のこと）２０、　ｏｇ　グリセロー ル ２０．０ｇ　イースト抽出物 ５．０ｇ　トウモロコシ浸漬液 ２．０ｇ　ＫＨ２ＰＯ４ ４，０ｇ　（ＮＨ４）　２Ｓｏ４ １、Ｏｇ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０ ２、ＯｍＬ　微量元素溶液ｌｌ ｐＨ８，５ 微量元素溶液ＴＩ（量／リットル） ２０．０ｇ　ＦｅＳＯ４”　７Ｈ２０ ２Ｑ　−Ｏｇ　Ｆ　ｅ　ＣＩ　・８　Ｈ２００、５ｇ　Ｍ　ｎ　Ｓ　Ｏ４＠Ｈ２ ０ ５０，０ｍ　ｇ　Ｃｏ　Ｓ　Ｏ４・７　Ｈ２０１０，０ｍｇ　Ｃｕ５Ｏ−５Ｈ２ ０ ２０、０ｇ　Ｃａ　ＣＩ　＋１２　Ｈ２０５０，０ｍｇ　Ｈ３ＢＯ３ １００、Ｏｍｇ　Ｚｎ５Ｏ＠７Ｈ２０ １００、Ｏｍ　ｇ　Ｎ　ａ　２　Ｍ　ｏ　Ｏ４・２　Ｈ２０振盪フラスコブロス ２０、Ｏｇ　ソイトーン（Ｓｏ７ｊｏｃｅｌ　（ディフコ社）４、Ｏｇ　ＫＨ２ ＰＯ４ ４，０ｇ　（ＮＨ４）２５ｏ４ １、Ｏｇ　Ｍｇ５Ｏ・７Ｈ２０ １×　微量元素溶液ｌｌｌ ｐＨ８，０ １４リットル発酵容器用ブロス（量／リットル）３０．０ｇ　グリセロール １０．０ｇ　イースト抽出物 ４．０ｇ　ＫＨ２ＰＯ４ ４、Ｏｆ　（ＮＨ４）　ｚＳｏ４ １−　Ｏｇ　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ１７Ｈ１！　０２×　微量元素溶液ｌｌｌ ｐＨ８，５ 注二二のイースト抽出物は、他の成分類とは別にして滅菌する。蒸気滅菌後、こ 、１らの成分類を配合する。

２５０リットル発酵容器用ブロス ３０．０ｇ　グリセロール ４０．０ｇ　イースト抽出物 ４．０ｇ　ＫＨ２ＰＯ４゜ ４．０ｇ　（ＮＨ４）、５ｏ４ １、Ｏｇ　Ｍｇ５０　・７Ｈ２０ ２×　微量元素溶液ｌｌｌ ｐＨ８，５ 注：°このイースト抽出物は、他の成分類とは別にして滅菌する。蒸気滅菌後、 これらの成分類を配合する。

１５００リットル発酵容器用ブロス ８．９０ｇ　グリセロール ６．３２ｇ　イースト抽出物（Ａｒｄａｍｉｏｅ　Ｙ　Ｅ　Ｐ　）５．０８ｇ　 ＫＨ，Ｐｏ。

５．０６ｇ　（Ｎ）ｆ４）２３０４ １．２６ｇ　Ｍｇ５Ｏ−７Ｈ２０ ３７，９０ｇ　ダイズ粉（Ｃｘｒｇｉｌｌ　２００　／　７０　）２．３５ｇ　 グアーガム（Ｓｉｇｉｉ　）２×　微量元素溶液ＩＩＫ ｐＨ８，３３ 注：ｐＨを蒸気滅菌の前に、硫酸で６．０に調整する。蒸気滅菌後、アンモニア の添加によりｐＨを８．３３に調整し、８．１１と８．４４との間の範囲に保持 する。

１ｏｏｏｘ微量元素溶液ＷＩＴ　（量／リットル〕０　、　２　ｇ　Ｚ　ｎ　Ｓ 　Ｏ會７　Ｈ２００、５ｇ　Ｍ　ｎ　Ｓ　Ｏ４・Ｈ２０ ０，１ｇ　８３Ｂ０゜ ０　、　１　ｇ　Ｃｕ　Ｓ　０　・５　Ｈ２００，１ｇ　Ｎａ、ＭｏＯ２，２Ｈ ２０ ０，０５ｇ　ＣｏＣｌ　Ｉｌ　７ＨＯ ０，１ｇ　ＫＷ １、Ｏｇ　ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０ ０，００１ｇ　Ｎ１ＣＩｅ６Ｈ２０ ０，００８ｍ１　Ｈ２ＳＯ４（０，１Ｍ）１、Ｏｇ　Ｆ　ｅ　Ｃ１ｓ ｌ、０ｇ　ＮａＣｌ ２　、　０　ｇ　Ｃａ　ＣＩ　＋＋２　Ｈ２０実施例１：土壌からのへミセルラ ーゼ産生性微生物の単離熱帯雨林及び温和な庭園の両方から採取した土壌試料を 、１０％ｗ　／　ｖ濃度の選択集積ブロスに添加した。この培養物を、３７℃で ４日間、調節装置を付けたエルレンマイヤーの震盪フラスコ内で農産した。初期 培養物の４種類の希釈物［１：１０．１：２０．１　：　８００、及び、１：５ ０，０００］を、新しい選択的集積ブロスで作製し、３７℃で４日間インキュベ ートシた。１５０，０００の希釈物を使用して、０．８５％のＮａＣｌ中におけ る一連の希釈物（１０から１０−’）を作成し、これを、選択的集積アガロース 上に塗付し、３４℃で５〜７日間インキュベートし、た。インキュベージタン後 、単離したコロニーを塗付した培養物から選択し、純度を保つために適切なアガ ー培地上に３回連続して筋を付けるように塗り付けた。

このスクリーニング過程の結果、熱帯雨林から採取した土壌からの９種類の単離 物、及び、温和な庭園から採取した土壌からの２４種類の単離物を選択した。

熱帯雨林の土壌からの精製した各単離物を、選択的集積ブロスを含む振盪フラス コに移し、３４℃で４８〜７２時間振盪した。インキュベージラン後１、この培 養物を、１０．０００ｒｐｍで２０−３０分間遠心したく４℃）。得られた上清 を、０．８及び０．４５ミクロンのフィルターを連続して通して濾過して、微生 物細胞を含まない粗製酵素を回収した。温和な庭園の土壌から精製した各単離物 を、選択的集積ブロスを含む管に移し、３４℃で１２〜４８時間振盪した。イン キュベージタン後、先に記載したように、この培養物を遠心し、濾過した。

この粗製酵素溶液を、５ｍＬの架橋結合させたグアー調製物（水４００ｍＬ考た り、５．０ｇのグアー、２．０ｇの（ＮＨ４）２　ＳＯ２、及び、０．６ｇの四 ホウ酸ナトリウム、ｐＨ９，５）を含む管に添加し、少なくとも１時間、３９〜 ４０℃の水浴中でインキュベートした。酵素活性を測定するために、一定直径の １ｍＬ用ピペットに、１．０ｒｎＬの混合物を充填し、０．９ｍＬを押し出した 。ストップウォッチを使用Ｉ７て、この押し出しが起こるのに必要な時間を測定 した（本明細書中では、以降「滴下時間」とする）。２秒を下回る滴下時間は、 ヘミセルラーゼ活性の測定できる量を示す。温和な庭園の土壌から回収した２４ 種類の単離物の内１２種類が、更に、熱帯雨林の土壌から回収した９種類の単離 物のうち４種−が、測定できる量のへミセルラーゼを産生じた。

実施例３：脂質分析によるバチルス・レンチスＣＭＧ　１２４０の性質決゛定 先の実施例１及び２の方法に従って単離した微生物のうちの一つのものの脂肪酸 含量の分析を行った。微生物の性質を決定しかつ同定するために使用される脂肪 酸分析の方法は、ｇｅｒｏｌｉ　ｓａｄ　Ｏ，Ｐ、ＬｓＮｏａｓｍ　、１．Ｃｌ １ｎ、Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ、Ｖｏｌ、２６：１７４５−１７５３　（１９８８） 　、及び、Ｇ、Ｍ、Ｍａｋｖｇｌａ　ａｎｄ　ＤＦ、ＷｅｌｃＬ　Ｊ、Ｃｌ１ｎ 、Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ、ｖｏ　１．　２　７　：　２　８　４　０〜２６４６　 （１９８９）により報告されている。これらの方法は、Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ　Ｉ Ｄ５Ｉｌｃ　、社（ネヮーク、プラウエアー州）、及び、ｔｌｅｖｌｅ口　−Ｐ ｘｃｋｇｒｄ社により改善されている。Ｍ（Ｄｒ微生物同定系として引用される この改善された方法は、ガスー液体クロマトグラフィーにより微生物の脂質類か ら調製される脂肪酸のメチルエステルを分析する。実施例１及び２の方法に従っ て単離した微生物、及び、命名されている株ＣＭＧ　１２４０を、このＭＩＤＩ 微生物同定系を使用して分析した。この分析の結果を、表ＩＩに示している。テ スト１から４においては、細胞は、標準的な微生物ＩＤ法によるＴＳＢＡアガロ ース上で、２８℃及びｐＨ５，７において増殖させた。テスト５においては、脂 肪は、脂質組成に顕著な変化を引き起こす条件である、３５℃及びｐ）（８，５ で増殖させた。

表Ｉｆ ｌｌｌｌ＋　のパーセント 曙　肪１ｍ！　テスト１　テスト寞　テスト３　テスト４　テストロ１４１６１ ｇ０　１．＋１５　！、３！　ｉｌｌ、　Ｌｇａ　１．０１１１１１、＋１　１ ７．６９　！１．１１　１＠、ａａ　１ａ、ｌＩ　ｔｏ、ａ２表ＩＩにおいて示 されている脂肪酸プロフィールの、ＭＩＤＩ脂肪酸データーベースにおける既知 のバチルス種の全ての株のプロフィールとの比較により、標題プロフィールは、 バチルス・レンチスとして同定される微生物のプロフィールに最も近似している ことが明らかになった。

実施例４：商業的に有用な量のへミセルラーゼの産生バチルス・レンチス（ＣＭ Ｇ　１２４０）の単一の、単離されたコロニーを、５０ｍＬの脳心臓浸出ブロス を含む、調節装置を取付けであるエルレンマイヤーの振盪（ブレーシード）フラ スコ内へ接種した。接種したフラスコを、３５℃で１２〜１６時間インキュベー ト中は振盪した（３００　ｒ　ｐｍ）。インキュベージタン後、このプレーシー ドフラスコの全ての容量を、無菌的に、１リツトルの種培地を含むｌＩＳ装置を 取付けである４Ｌのエルレンマイヤー振盪フラスコ（シード）に移した。このシ ードフラスコを、３５℃において１２〜１６時間振盪しながらインキュベートし た。このシードフラスコの全ての容量を、無菌的に、９，０リツトルの発酵ブロ スを含む１４リツトルの発酵容器へ移した。発酵容器は、４０℃、〉２０％溶存 酸素、及び、５００〜１１０００ｒｐに保持した。０．０５％の最終濃度となる ようにグアーガムを、増殖期中に２もしくは３回、更に、定常期中に１回（０， ５％）添加して、酵素産生を誘導した。１〜７．５時間後、発酵を停止して、実 施例６の方法に従って酵素活性をアッセイした。アッセイデーターを図３に示す 。

実施例５　ヘミセルラーゼ産生のための至適培養条件を決定するためのへミセル ラーゼ活性の測定 最高の粘性を得るために３時間混合した、水に溶解している１％グアーの２０ミ リリツトルアリコート、及び、２Ｍグリシン−ＮａＯＨバッフｙ−（ｐＨ９，０ ）の２ｍＬアリコートを、循環式の水浴方法によって４０℃に保持されているガ ラス性のジャケット付の反応容器に添加した。発酵産物の一部分を、マイクロフ ージ内で５分間遠心し、得られた上清を使用して、酵素活性についてのテストを 行った。この上清の１００〜２００ＭＬの試料を反応容器に添加した。酵素活性 は、実施例６において記載したように測定した。試料の酵素活性を、標準として 使用しているヘミセルラーゼ（マイルズ　Ｂ−１５００）の希釈物の滴下時間（ 秒）のｌｏｇ値を、分で表示しであるインキュベーシッン時間に対してプロット することにより作成した標準曲線から算出した。ｌｏｇプロットの勾配（直線記 法における）を算出し、ヘミセルラーゼのグラム数もしくは［室単位（ｃｈａｍ ｂｅｒ　ｕｎｉｔｓ）Ｊに対して再プロットシタ。

実施例６：標準物及び精製した酵素調製物をテストするのに適するヘミセルラー ゼ活性のためのアッセイ標準へミセルラーゼもしくは精製した酵素調製物の酵素 活性をスクリーニングするのに適する方法においては、水に溶解している１％の グアーガムを含む約１６．０ｍＬのグアー調製物、及び、２．０ｍＬの２Ｍグリ シン（ＮａＯＨでｐＨ９，０１：調節しである）を、循環性の水浴方法によって ３８℃に保持してある、ガラス性のジャケット付の１００ｍＬの反応容器に添加 した。この溶液を、該温度に達した後、磁石性の攪拌機により、完全に混合した 。−窓内径の１ｍＬのピペットにおいて、１．０ｍＬの印からＱ、７ｍＬの印ま でその溶液を滴下させるのに必要な時間を測定することにより、ゼロ時間におけ る粘度を決定した。酵素を添加しなかつたグアー溶液の初期滴下時間は、７５か ら９０秒であった。反応容器への酵素添加（２００〜５００ＭＬ）の後、グアー ／酵素溶液をインキュベートした。

その溶液のゼロ時間の測定値は速やかに決定した。滴下時間測定は、５回の測定 が行われたか、あるいは、滴下時間が３０秒を下回るまで行った。標準曲線は、 滴下時間のｌｏｇ値を、異なる標準酵素希釈物を使用してインキュベーションの 時間に対してプロットすることにより作成した。

実施例７：発酵物からのへミセルラーゼの回収実施例４において記載しである方 法を、６回の１４リットル発酵の各々におけるヘミセルラーゼの有効量の産生に 使用した。

発酵を停止した後、ｏ、ｉミクロンのフィルターを用いる限外濾過により、細胞 を６０Ｌの培養ブロスから除去した。その後、１０．０００分子量を取り除く限 外濾過を使用して、約３．５Ｌの容積にまで酵素を濃縮した。この濃縮物を３倍 量のアセトンと混ぜ合わせて、ヘミセルラーゼを沈殿させた。この沈殿物を２４ 時間沈ませるることにより沈殿物を回収し、その後、上清をサイフオンを利用し て除去した。その後、こΦ沈殿を、４℃において１０分間、６０００ｒｐｍで遠 心した。得られたベレットを直ちに１７０ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウムバッフ ァー　（ＰＨ７，０）中に再懸濁させて、３００ｍＬの最終容量にした。得られ たヘミセルラーゼ溶液の酵素活性を、実施例６の方法に従って決定した。回収さ れたヘミセルラーゼペーストは、９．４５ｘｌＯ’室単位／リットルであり、こ れは、６．３ｋｇ／Ｌの標準物としての市販のへミセルラーゼ（ｐＨ９，０にお いてアッセイした）、もしくは、標準へミセルラーゼ処方物の１゜８９Ｋｇ総量 に等しかった。

実施例８：へミセルラーゼを回収するための別な方法実施例７において記載した 方法において、ヘミセルラーゼを沈殿させるのに代わりにメタノールを使用して ヘミセルラーゼを回収した。上清はサイフオンにより除去し、沈殿を先に記載し たように遠心した。ペースト様の沈殿物を、その後、１０倍量（Ｗ／Ｗ）の乳糖 と混ぜ合わせ、４０℃以下での温度における真空下で乾燥させた。

膜を使用して、約１５Ｌの容量にまで濃縮した。固体の硫酸アンモニウムを、継 続的に混ぜ合わせながら、７５％飽和になるまでゆっくりと添加した。溶液から 生成した沈殿は８．００Ｏｒｐｍで４５分間の遠心分離により回収した。得られ たペレットの酵素活性は、実施例６の方法に従って決定した。酵素活性の回収率 は、１．８５Ｘ１０５単位／グラム（総計２．２２Ｘ１０８単位）であった。沈 殿の酵素活性の回収率は、１５Ｌ濃縮物の総酵素活性の７７％であった。

実施例１０：へミセルラーゼの商業的に有用な量の産生のための別の方法 Ａ、接種材料を含む振盪フラスコの準備バチルス・レンチス（ＣＭＧ　１２４０ ）の単一な、単離したコロニーを、各々、５０ｍ１の脳心臓浸出ブロスを含む、 制御装置を取付けた５　００ｍＬのエルレンマイヤーの振盪（ブレシード）フラ スコ内に接種した。３５℃において１２〜１６時間インキュベートしている間に 、接種したフラスコを振盪した（３００ｒｐｍ）。インキュベーション後、各フ ラスコの全ての容量を無菌的に、各々５００ｍ１の振盪フラスコブロスを含む、 制御装置を取付けた２１Ｗの４Ｌのエルレンマイヤー振盪フラスコのうちの一つ に移した。この振盪フラスコを、３５℃において１２〜１６時間振盪させながら インキュベートした。

８．１４リットル発酵容器の準備 各振盪フラスコの全ての容量を無菌的に、各々８．０す、トルの１４リットル発 酵ブロスを含む、２台の１４リットル発酵容器のうちの一つに移した。１４リッ トル発酵容器は、〉４０％の溶存酸素濃度、及び、３００ｒｐｍとＬＯＯＯｒｐ ｍとの間の撹拌速度を用い、３６から３７℃の温度に維持した。発酵容器内での 泡形成は、シリコンの消泡剤（ユニオン　カーバイド社、ＳＡＧ　５６９３）を 利用して調節した。細胞密度は、６００ｎｍにおける吸光度の変化を観察するこ とにより評定した。温度は、吸光度（ＯＤ）が２，０に達した時点で、２９〜３ ０℃に下げた。約１３．５時間後、ＯＤが１４に達した時点で、温度を１０℃に 下げた。

Ｃ，２５０リツトル発酵容器の準備 次いで、１６０リツトルの２５０リツトル発酵容器プロスを含む２５０リツトル 発酵容器に、１４リットル発酵容器の成分を接種した。溶存酸素の濃度はｓ３０ ０ｒｐｍと５０Ｏｒｐｍとの間の撹拌速度を使用して、７０％飽和に維持した。

ｐＨは、８．０と８．４５の範囲に維持した。発酵容器内の泡形成は、シリコン の消泡剤（ユニオン　カーバイド　ＳＡＧ　５６９３）を使用して制御した。接 種倹約１５．５時間後に、６００ｎｍのＯＤが１４に達するまで、温度は２８℃ に維持した。この時点において、接種倹約２５時間でＯＤが約２０に達するまで 、温度を２０℃に下げた。

０．１５００リットル発酵容器の準備 その後、８００リツトルの１５００リットル発酵容器ブロスを含む１５００リッ トル発酵容器に、２５０リツトル発酵容器の１６６リツトルの成分を接種した。

培地のｐＨは、８．１１から８，４４のｐ　Ｈ範囲に保持した。温度は２８℃に 保持し、かつ、溶存酸素の濃度は、２４０ｒｐｍと２８８ｒｐｍとの間の駆動速 度及び６００リットル／分と１０００リツトル／分の間の空気流量で、２５％飽 和を越える価に保持した。タンク−の空気圧は、３ｐｓｉと１ｌｐｓｉとの間に 保持した。泡形成は、シリコンの消泡剤（ユニオン　カーバイド社　５ＡＧ５６ ９３）で制御した。

接種倹約４．５時間、つまり、８００ｎｍにおける発酵容器成分のＯＤの測定値 が５．６となった時点で、発酵容器にグアーガムを添加した。約１から２キログ ラムの固体のグアーガムを、ここからの９時間の間、毎時間発酵容器に添加した 。総量で１３．８グラム／リツトルのグアーガムを、発酵容器に添加した。接種 後１０．５時間と１３時間の間、グリセロールをゆっくりと発酵容器に添加した 。総量で３グラム／リツトルのグリセロールを発酵容器に添加した。接種倹約１ ４．２５時間に成分のＯＤが６００ｎｍにて２３．３に達した時点で発酵を停止 し、酵素活性は２．６７Ｘ１０’単位／リットルと測定された。

実施例１１：発酵物からのへミセルラーゼの回収のための別の方法 実施例１０の方法による発酵を停止した後、細胞塊と固体培地類とを、ウェスト ファーリアの連続遠心機を通すことにより部分的に除去した。ウェストファーリ ア遠心流出液中に残存している固体類及び高分子量物質類を、０．１ミクロンの 中空繊維フィルターを通すことにより除去した。０．１ミクロンフィルターを通 過した未精製の酵素溶液を、その後、５０．０００分子量カットオフ中空系繊維 の限外濾過膜を使用して濃縮した。

この濃縮物を、０．１ミクロンの滅菌したフィルターで滅菌濾過し、その後、粗 製酵素を塩析させる目的で、５５０グラム／リツトルの濃度の硫酸アンモニウム 中に懸濁させた。

５℃において、Ｇ５３０−ターを使用したソルノ（−ル遠心機中で、８．００Ｏ ｒｐｍで遠心することにより、酵素沈殿を回収した。得られた沈殿物の酵素活性 は、約５．０Ｘ１０８単位／キログラムであった。

実施例１２：へミセルラーゼの精製 より精製された産物を生産するために、２つの沈殿段階を使用して、精製された 酵素を取得した。限外濾過からの濃縮物は、実施例７に記載の方法に従って調製 した。その濃縮物は、６．３９Ｘ１０’単位／リットルであり、比活性は１．１ １Ｘ１０３単位／ｍｇであった。等量のく２．２リツトル）の濃縮に、得られた 沈殿物を、その後、１０℃において１８時間沈殿させた。上清を回収した後、追 加量のアセトンを添加して７５％溶液（ｖ／ｖ）を作製した。得られた沈殿物を 、１０℃で２４時間沈ませ、その後、最初にサイフオンを利用し、最終的には５ ０００ｒｐｍでの遠心により上滑を除去した。この沈殿物を、その後、２２２ｍ Ｌの５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７，０）に溶解した。活性を決定したとこ ろ、５．７１×１０７単位／リットルで、比活性は６．１７Ｘ１０３単位／ｍｇ であった。この精製段階の結果、単に２０％の蛋白質で９０％の総活性を回収し 、比活性が５．５６倍上昇したことに別の精製法を利用して、実施例１２の沈殿 段階を回避した。

ヘミセルラーゼを、実施例１２において記載したように、限外濾過により希望す る濃度に濃縮した。この濃縮物の液体処方物を、その後、エチレングリコール、 もしくは、それに代わるものとして、グリセロール、ソルビトール、安息香酸ナ トリウム、クエン酸ナトリウム、メチルパラベン、アスコルビン酸ナトリウム、 もしくは、等偏動のような、安定化及び保存用試薬を添加することにより調製し た。

０．１ミクロンの膜で除去し、更に、酵素を１０．０００分子量を取り除く膜で 濃縮した。酵素が濃縮された状態になった時点で、いくらかのへミセルラーゼが 膜を通過したことが観察された。この通過画分を、１０．０００分子量カットオ フ膜で再濃縮し、その後、更なる精製に使用した。再濃縮した通過物は、４℃に おける３倍量のアセトンの添加により沈殿させた。上溝をサイフオンを利用して 除去し、沈殿物を５０ｍＭのリン酸ブッファ−（ｐ　Ｈ７，０）中に再懸濁させ て、最終容量を２２２ｍＬとした。この酵素濃縮物を、続いて、１０ｍＭリン酸 バッファー（ｐＨ７，，０）に対して透析して、全ての塩を除去した。透析した 濃縮物を、その後、ＤＥＡＥ−セファセルカラム（２，８Ｘ３０ｃｍ）に供した 。ヘミセルラーゼの溶出は、１ｍＬ／分の流速で、カラムに対してイオン強度を 増加した溶液を添加することにより行った。この溶液は、５０ｍＭのリン酸バッ ファー中に溶解している０〜１．２５ＭのＮａＣｌからなる。１０ミリリツトル の両分を回収して、実施例６に記載しであるように、１％グアー溶液の粘性低下 を測定することにより酵素活性のテストを行った。最高活性を示した画分９６〜 １０９を−まとめにし、その後、１２．５％の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル 上で（分子量マーカー蛋白質と共に）分析した。この分析の結果により、ヘミセ ルラーゼは高度に精製され、かつ、３２，０００の分子量を有することが示され た。ヘミセルラーゼ画分を同じ種類の５ＤＳ−ゲル上での電気泳動により完全に 精製し、更に、イモピロン（Ｉｍｍｏｂｉ　Ｊｏｎ）　ＰＰＶＤＦ膜上にプロッ トし、Ｍ＊Ｉ■ｄ＊＋ｒ＊、１．　８＋ｏ１．　Ｃｈｅｗ。

２６２　：１００３５−３８　（１９７８年）の方法により、クマシーブルーで 染色した。この膜上のへミセルラーゼのバンドを切り出し、アミノ酸配列分析に 使用した。この酵素は、バイオシステムス社の気相配列決定機を使用するエドマ ン分解法により分析した。精製した酵素のＮ−末端配列は、以下に示すように決 定された： ＋５１０ ＡＩ！ｌ　−Ｓｅｒ　−Ｇｌｙ　−Ｐｂｅ　−Ｔｙｒ　−Ｖａｌ　−Ｘｘｘ　− Ｇｌｙ　−Ｔｈｒ　−１１ｅ　−Ｌｅｕ　−Ｘｘｘ　−Ａｓｐ　−Ｓｅｒ　−Ｔ ｈｒ　−Ｇｌｙ　−Ａｓｎ　−Ｐｒｏ　−Ｐｈｅ　−Ｌｙｓ　−１１ｅ　−Ｘｘ ｘ　−Ｇｌｙ　−Ｘｘｘ　−ＡｓＤ（ＸＫＫ　＝不確定アミノ酸） 実施例１５７体重増加／摂取した飼料重量（ボンド）を調べるための動物飼料の 組成物 ３種類の異なるバッチの動物飼料を比較した。これらのバッチを、（ｉ）出発用 飼料、（ｉｊ）成育用飼料、及び、（ｊ　ｉ　ｉ）仕上げ用飼料（ｆｉｎｉｓｈ ｅｒ　ｆｅｅｄ）として引用した。３種類の飼料の組成物類を、表■ｆｆに示し ている。

表ＩＩＩ 成分　％８発用鯛料％成育用飼料％仕上げ用飼料コーンイエロー　５６．４２９ 　６２．１１５　６２．０１７ダイズ　ＭＬ−９８％　蛋白質　３５．４２９　 ２９．６１９　２９．７４５トウモロコシのグルテン　ＭＬ−６１％　蛋白質　 ０　０．４６７　０脂肪（３７００ｋｃｍｌ／ポンド＞　４．９２６　４．４５ ５　４．９４１メチオニン　８８％　０．２４３　０．３０４　０．３１１１Ｎ 　ａ　Ｃｌ　０．３２１　０．２７８　０．２８９炭酸カルシウム　０．６７８ 　０．６８０　０．６９２脱フツ素化したリン＊　１．６ｇ４　夏、５６７　１ ．４５１１コリン　ｃＩ−７０％　活性　０．０９０　０．１０５　０．ＪＯｊ 微量無機質プレミックス　０．（１５００，Ｑ１０　Ｏ，０２５Ｊ＜　シトラ！ ／　：／　Ｍ　Ｄ　Ｏ，０５００，０５００，０５０ビタミン　プレミックス本 ＊　０．０５０　０．０５０　０．０５０コフシジオスタット本＊＊　０．０５ ０　０．０５０　０マリーゴルドの抽出液　０　０．２０２　０．３１０本　３ ２％カルシウム−１８％リン 本本　１６種の共通ビタミン類及び必須宋Ｉ！素類本本本　アグリバイオ　コー ポレーション社（アテンス、ジョーシア州）実施例１６：へミセルラーゼ／タイ ズあら粉飼料補充物の調製実施例４において記載した方法を有用な量のへミセル ラーゼの産生に使用した。ヘミセルラーゼは、実施例９において記載した様にし て回収した。得られた約２．２ポンドのへミセルラーゼペーストを、少量（８， ８ポンド）のタイズのあら粉（４８％の割合）に混合させて、ポンド当たりのへ ミセルラーゼ／タイズあら粉混合物の酵素活性が３１．７５ｘｌＯ６単位になる 濃度にした。この混合物を、ドラフト下に置いた広い蓋なしの皿の中で空気乾燥 させた。この乾燥混合物をワーリングブレンダー内で挽いて微細粉末にして、使 用するまで４℃に保トン当たり２ポンドのへミセルラーゼ／タイズあら粉混合物 を含む３種類の動物用飼料を、実施例１６の方法に従い調製した。実施例１５に おいて記載されている方法に従って調製された、２ポンドのへミセルラーゼ／タ イズあら粉混合物を、実施例１５に従って調製した３覆類の動物用飼料の各々か らなる成分（イエローコーン及びタイズあら粉を除外する）に添加した。

このヘミセルラーゼ／タイズあら粉混合物と他の成分層とを垂直振盪機内で１分 間混合した。この混合物を、その後、予め決定しである量のイエローコーン及び タイズあら粉と配合させ、更に、垂直振盪機内で３．５分間混合した。結果とし て得られるヘミセルラーゼ／飼料混合物を、水蒸気（１０％　Ｖ　／　Ｗ　）を 配給するために装着しであるカリフォルニア圧縮ミル内でその飼料混合物を処理 することにより、ベレットに成形した。この飼料混合物を型に合わせて圧断して ベレットにし、これを、垂直強制空気冷却用塔内で直ちに冷却させた。ベレット を揺すって任意の微細粉末物質を除去し、この粉末は、ベレット室へ戻した。出 発用飼料ベレットを、回転ミルを通して処理することによって粉砕した。

実施例１８：飼料添加物としてのへミセルラーゼの使用ニワトリの平均体重増加 ／摂取した飼料重量（ポンド）に影響する要因としての、タイズのあら粉を含む 動物用飼料に対するヘミセルラーゼ添加の効果を調べた。１日令のヒヨコ（パダ ーリン　Ｘ　アーバー　アクレス種）をこの研究のために選択した。この鳥は、 マレック疾患及びニューキャッスル−気管支炎に対してワクチン接種した。各性 別の２５羽の鳥をランダム−に捕獲して体重測定して、容認できる体重の範囲を 確立した。

平均の＋／−５グラムの範囲を各性別ごとに決定した。鳥をランダムに捕獲し、 適切な体重についてスクリーニングし、７６羽の雄雌を混ぜ合わせたブロイラー 用ニワトリからなる群にランダムに割り振った（３８羽の雄及び３８羽の雌）。

総計で、テスト用ニワトリの７群及び対照用ニワトリの７群が存在した。

各群を個別のおりの中に居住させた。おりの温度は、研究の最初の２週間の間毎 日検査した。居住温度及び湿度は、研究期間中毎日検査した。空気交換を、壁に 取付けであるファンで促進した。鳥は積み上げた敷き藁の上に配した。以前の研 究からの湿った敷き藁を除去して、１インチの新しい敷き藁に置き換えた。人工 照明を継続的に行ない、全ての鳥は水に接近できるようにしてあった。

研究の最初の７日間の内に死亡した全ての鳥は、鳥の同一の搬入光からの同一の 性別の鳥と置き換えた。研究７日目の１２：０１ｐｍ後に置き換えた鳥はいなか った。

全てのヒヨコを、研究０日目に、それぞれの食餌に配した。

ヒヨコには、０〜２１日目に日日用飼料の粉砕したベレットを給餌した。２２〜 ３９日目には、成育用飼料のベレットをヒヨコに給餌した。４０〜４６日目には 、仕上げ用飼料のベレットをヒヨコに給餌した。研究の間、おりは日に３回調査 した。研究の間に死亡した鳥を検屍して死因を決定した。食事と水分を採ること ができない鳥は淘汰した。全ての死亡及び淘汰した鳥の体重及び除去した日にち を記録した。ヒヨコの体重を、研究の２１日目及び４６日目に測定した。増加し た体重（ポンド）によって、ニワトリが消費した飼料の量（ポンド）を割ること により、飼料効率を決定した。２１日目の研究の結果を、表ＴＶＳＶ及びＶｌに 報告してあり、これらを、図５にお０て図説しである。４６日目の結果は、表Ｖ ＩＴ、Ｖｌｌｌ及びＩＸにおいて報告してあり、これらを図５において図説しで ある。

ダンカンの新多重範囲テスト（Ｎｅｗ　ＭｕｌｔｉｐｌｅＲａｎｇｅ　Ｔｅ５ｔ ）を利用した、この結果の統計学的解析を、表Ｘに示している。

６５　テスト　１．１８４　１．３６６６６　テスト　１．１２９　１．３８０ ６７　テスト　１，２０５　１．３５８６８　テスト　１．１９４　１．３６３ ６９　テスト　１，２１６　１．３６８７０　テスト　１．２２８　１．３７１ ７２　テスト　１．２９０　１．３６４６４　対照　Ｌ１７７　１．３９２ ６３　対％　１．１３０　１．３８８ ６３　対照　１．１４１　１．３８３ ２７　対Ｉ！９１　１．０６２　１．４１９３０　対照　１，１３０　１．４０ ６ １８　Ｎｊ！ｌｌｌ　１．１０３　１．３８５７１　対照　１．１８６　１．４ ５２ データーのまとめ テスト　１．２０６　１．３６７ 表Ｖｌ に肱乱肚 ２１日目の体重 ＤＩＦ＊　ＳＳ＊＊　ＭＳ＊本＊　Ｆ＊本＊本処理　１　０．０１９９　０．０ １９０９　１３．３０８５６複製　６　０．０１６３５　０．００２７３　１． ８９９ｅｊ瞑差　６　０，００８６１　０．００１４３処理　１　０．００４６ ５　０．００４６５　１２．１４５７２複製　６　０．００１７３　０．０００ ２９　０．７５３７１誤差　６　０．００２３０　０．０００３８総計　１３　 ０．００８６７ ＋ｅ＊ｚ９につ告帥 本牢率　平均値の蓼準誤差 本申＊＊　有意性（ｓｉｇｒ＋ｒｆｔｃｏｒ＋ｃｔ　）１−１１表Ｖｌ！ ６５　？ス）　４．９７０　１．９０２６６　テスト　４．８６８　１．８７９ ６７　テスｌ−４，６７２１，９３６ ６８テスト　４−８０３　１．８９６ ６９　テスト　４．９０８　１．９２５７０　テスト　４．９４１　１．８２４ ７２　テスト　４，８２０　Ｌ　８５９５３　対照　４，４１５　１，９９６ ｚ７　対照　４．２０５　１．９２４ ７Ｉ　対Ｍｌ　４，７３８　１．９０９対照　４．５８７　１．９３１ テスト　４．８５４　１．８８９ 表４Ｘ 表Ｉ！（絖Ｉｊ） 総計　１３　０．０２０９７ 本　自由度 ＊＊　２動令叶 ＊＊＊　平均値の標準誤差 本本本車　有意性の秤イめ ！工 本発明の範囲内に含まれるヘミセルラーゼを産生ずる微生物から主になる培養物 を、実施例１．２、及び、１０をこ記載した方法に従って調製することができる 。一度摂取すると、このような微生物に本発明に記載のへミセルラーゼを産生さ せる消化管を有する動物により摂取された飼料の量１こ対する増加体重の比率を 増加させる目的で、このような培養物の効果的な量を、実施例１５において記載 したもののような動物飼料ノ（ツチと配合することができる。

実施例２０：直接給餌用微生物培養物及びヘミセルラーゼを含む発酵ブロスから なる動物用飼料の調製微生物類及び本発明の範囲内に含まれるヘミセルラーゼを 含む発酵ブロスを、実施例１００の方法に従って調製することができる。摂取し た飼料の量に対する増加体重の比率を増加させる目的で、このような発酵ブロス の有効量を、実施例１５に記載したもののような動物用飼料のバッチと配合する ことができる。

例えば、３０％のダイスのひき割り粉を含む飼料混合物のトン当たり、実施例１ ０Ｄの方法に従って調製した約３リツトルの発酵ブロスを添加することができる 。この発酵ブロスを噴霧乾燥させて乾燥粉末を作製することができ、この乾燥粉 末は、その後、飼料成分と配合させることができる。この発酵ブロスを、例えば 、ダイスあら粉もしくはダイスあら粉の一部分のような、飼料成分の幾つかのも のと直接混合し、その後、乾燥させることもできる。次には、粉の乾燥させたブ ロス／クイズあら粉混合物を、他の飼料成分と後で混合することができる。その 他の方法として、この発酵ブロスを、完全な飼料混合物と直接混合することがで きる。輸送費用を低減し、かつ、微生物の混入を制御する目的で、飼料用製粉所 へ輸送して、更に、完全飼料混合物と配合させることができる濃縮物を形成する ためこの発酵ブロスを乾燥させることができる。

キ目欠：ｒう占・ＦＬ　（物） 移層（滴下時間（秒）１０・　３ｍＬ）９殿η１２、ケー／ｌ／ Ｉ島１朋当たりの平均体重 剣米＋／イ＄ｔ４→口（’ｔｍ１１仲ψ（寸−シトリ／１辛Ｉ【ン「韓（寸マ〉 ドフン７４１９３当たりの平均体重 ″？’Ｆｌ−／イ奈ｔ４でり　（１声り忰←（１？シト）／イ９−ｆＬ４１り（ １？ンド“υ！ＪＴ ヘミセルロース系食糧の有効エネルギー含量を増加させる上で特に有用なヘミセ ルラーゼを産生ずる土壌微生物が得られる。これらの微生物は、それ自体を培養 するか、又は前記酵素を産生ずる他の微生物を工学的に作りだすための遺伝情報 源として使用し得る０例えば、商業的に有用な量の天然のへミセルラーゼ又は組 換えへミセルラーゼは、この酵素を産生ずる微生物で本質的に構成された培！Ｉ ￥ＩＩＪを用いて製造することができる。ヘミセルラーゼ、このようなヘミセル ラーゼを産生する微生物で本質的に構成された培養物、又はこのような培養物と へミセルラーゼとを含む発酵ブロスは、その後、前記酵素によって分解される複 合炭水化物を含む消費可能組成物中で使用することができ、その組成物の栄養価 を高めるｍ能を果たす。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法東１８４条の７藁１項）平成４年１１月 ３０日 特許庁長官　麻　生　渡　殿　− １、特許出願の表示　ＰＣＴ／ＵＳ　９１１０３７５４２、発明の名称　ヘミセ ルロース含有食品及び動物用飼料のエネルギー効率を改善するためのへミセルラ ーゼ補充物３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国、メリーランド・２０８１１、ガイザースバーグ、イン ダストリアル・ドライブ・１６０１６名　称　ケムジエンΦコーポレイション４ 、代　理　人　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビル５、補正嘗の提出 年月日　１９９１年１１月４日６、添附書類の目録 （１）補正書の翻訳文　１通 ４７、前記炭水化物源が大豆である請求項４３に記載の方法。

４８、前記培養物が本質的に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物からなる請求 項４３に記載の方法。

５０、前記酵素がマンナナーゼである請求項３に記載の消費可能組成物。

５１、前記マンナナーゼがエントートマンノシダーゼである請求項５０に記載の 消費可能組成物。

５２、前記へミセルラーゼがマンナナーゼからなる請求項１０に記載の消費可能 組成物。

５３、前記マンナナーゼがエントートマンノシダーゼである請求１０ＩＩ５２に 記載の消費可能組成物。

５４、前記酵素がマンナナーゼである請求項１２に記載の消費可能組成物。

５５、前記マンナナーゼがエンド−Ｂ−マンノシダーゼである請求項５４に記載 の消費可能組成物。

５６、前記酵素がマンナナーゼである請求項１３に記載の消費可能組成物。

５７、前記マンナナーゼがエンド−６−マンノシダーゼである請求項５６に記載 の消費可能組成物。

５８、前記へミセルラーゼがマンナナーゼである請求項１８に記載の消費可能組 成物。

５つ、前記マンナナーゼがエンド−６−マンノシダーゼである請求項５８に記載 の消費可能組成物。

６０、前記酵素がマンナナーゼである請求項２０に記載の消費可能組成物。

６１、前記マンナナーゼがエントートマンノシダーゼである請求項６０に記載の 消費可能組成物。

６２、前記酵素がマンナナーゼである請求項２２に記載の消費可能組成物。

６３、前記マンナナーゼがエントートマンノシダーゼである請求項６２に記載の 消費可能組成物。

６４、前記へミセルラーゼがマンナナーゼである請求項２６に記載の消費可能組 成物。

６５、前記マンナナーゼがエントートマンノシダーゼである請求項６４に記載の 消費可能組成物。

６６、前記へミセルラーゼがマンナナーゼである請求項２７に記載の消費可能組 成物。

６７、前記マンナナーゼがエンド−６−マンノシダーゼである請求項６６に記載 の消費可能組成物。

６８、前記へミセルラーゼがマンナナーゼである請求項２８に記載の消費可能組 成物。

６９、前記マンナナーゼがエントートマンノシダーゼである請求項６８に記載の 消費可能組成物。

７０、前記酵素がマンナナーゼである請求項２９に記載の消費可能組成物。

７１、前記マンナナーゼがエントートマンノシダーゼである請求項７０に記載の 消費可能組成物。

７２、前記酵素がマンナナーゼである請求項３０に記載の栄養増強方法。

７３、前記マンナナーゼがエントートマンノシダーゼである請求項７２に記載の 栄養増強方法。

７４、前記酵素がマンナナーゼである請求項３５に記載の栄養増強方法。

７５、前記マンナナーゼがエンド−６−マンノシダーゼである請求項７４に記載 の栄養増強方法。

７６、前記酵素がマンナナーゼである請求項４１に記載の栄養増強方法。

７７、前記マンナナーゼがエントートマンノシダーゼである請求項４６に記載の 栄養増強方法。

７８、前記酵素がマンナナーゼである請求項４３に記載の栄養増強方法。

７９、前記マンナナーゼがエントートマンノシダーゼである請求項７８に記載の 栄養増強方法。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成４年１１月３０日 鉱

Claims (48)

【特許請求の範囲】
1. １．（Ａ）栄養学的に単胃動物又はヒトに適しているタンパク質、ビタミン及び ミネラルと、 （Ｂ）マンナン含有ヘミセルロースからなる炭水化物源と、 （Ｃ）前記マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒する酵素 とを含んでおり、前記酸素が、前記分解を触媒する活性に関して約ｐＨ４．５〜 約ｐＨ１１のｐＨプロフィルを有する消費可能組成物。
2. ２．前記プロフィルが約ｐＨ７と約ｐＨ９との間にピークを有する請求項１に記 載の消費可能組成物。
3. ３．前記酵素がＢａｃｉｌｌｕｓ酵素である請求項２に記載の消費可能組成物。
4. ４．前記炭水化物源が、大豆、アルファルファ、グアー、ローカストビーンガム 、カロブビーンガム、カッサバ、コブラ及びココナッツ残留物からなる群から選 択した植物性物質である請求項１に記載の消費可能組成物。
5. ５．前記群が大豆及びアルファルファからなる請求項４に記載の消費可能組成物 。
6. ６．前記組成物がヒトによって消費されるものである請求項１に記載の消費可能 組成物。
7. ７．前記組成物が単胃動物用のものである請求項１に記載の消費可能組成物。
8. ８．大豆あら粉を含むと共に、ヘミセルロースの分解を触媒する活性に関して約 ｐＨ４．５〜約ｐＨ１１の範囲のｐＨプロフィルを有するＢａｃｉｌｌｕｓヘミ セルラーゼで本質的に構成された酵素成分を含む消費可能組成物。
9. ９．前記プロフィルが約ｐＨ７とｐＨ９との間にビークを有する請求項８に記載 の消費可能組成物。
10. １０．前記ヘミセルラーゼが６０℃以上の温度で前記分解を触媒する活性を示す 請求項９に記載の消費可能組成物。
11. １１．（Ａ）栄養学的に単胃動物又はヒトに適しているタンパク質、ビタミン及 びミネラルと、 （Ｂ）マンナン含有ヘミセルロースからなる炭水化物源と、 （Ｃ）前記マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒する酵素 とを含んでおり、前記酵素が（１）８〜１１の範囲のｐＨ及び（２）６０℃以上 の温度で前記分解を触媒する活性を示す消費可能組成物。
12. １２．（Ａ）栄養学的に単胃動物に適しているタンパク質、ビタミン及びミネラ ルと、 （Ｂ）マンナン含有ヘミセルロースからなる炭水化物源と、 （Ｃ）前記マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒する酵素を産生する微生物 で本質的に構成された培養物とを含んでおり、前記酵素が、前記分解を触媒する 活性に関して約ｐＨ４．５〜約ｐＨ１１の範囲のｐＨプロフィルを有する消費可 能組成物。
13. １３．前記プロフィルが約ｐＨ７と約ｐＨ９との間にピークを有する請求項１２ に記載の消費可能組成物。
14. １４．前記培養物が本質的に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物からなる請求 項１２に記載の消費可能組成物。
15. １５．前記炭水化物源が、大豆、アルファルファ、グアー、ローカストビーンガ ム、カロブビーンガム、カッサバ、コブラ及びココナッツ残留物からなる群から 選択した植物性物質である請求項１２に記載の消費可能組成物。
16. １６．前記群が大豆及びアルファルファからなる請求項１５に記載の消費可能組 成物。
17. １７．大豆あら粉を含むと共に、ヘミセルロースの分解を触媒する活性に関して 約ｐＨ４．５〜約ｐＨ１１の範囲のｐＨプロフィルを有するヘミセルラーゼを産 生するＢａｃｉｌ−ｌｕｓ属に属する微生物で本質的に構成された培養物を含む 消費可能組成物。
18. １８．前記プロフィルが約ｐＨ７とｐＨ９との間にビータを有する請求項１７に 記載の消費可能組成物。
19. １９．前記ヘミセルラーゼが６０℃以上の温度で前記分解を触媒する活性を示す 請求項１７に記載の消費可能組成物。
20. ２０．（Ａ）栄養学的に単胃動物に適しているタンパク質、ビタミン及びミネラ ルと、 （Ｂ）マンナン含有ヘミセルロースからなる炭水化物源と、 （Ｃ）前記マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒する酵素を産生する微生物 で本質的に構成された培養物とを含んでおり、前記酸素が（１）８〜１１の範囲 のｐＨ及び（２）６０℃以上の温度で前記分解を触媒する活性を示す消費可能組 成物。
21. ２１．（Ａ）栄養学的に単胃動物に適しているタンパク質、ビタミン及びミネラ ルと、 （Ｂ）マンナン含有ヘミセルロースからなる炭水化物源と、 （Ｃ）発酵ブロス とを含んでおり、前記発酵ブロスが、 （ｉ）前記マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒する酸素であって、前記分 解を触媒する活性に関して約ｐＨ４．５〜約ｐＨ１１の範囲のｐＨプロフィルを 有する酵素を産生する微生物で本質的に構成された培養物と、（ｉｉ）前記酵素 とを含んでいる消費可能組成物。
22. ２２．前記プロフィルが約ｐＨ７と約ｐＨ９との間にビークを有する請求項２１ に記載の消費可能組成物。
23. ２３．前記培養物が本質的に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物からなる請求 項２１に記載の消費可能組成物。
24. ２４．前記炭水化物源が、大豆、アルファルファ、グアー、ローカストビーンガ ム、カロブビーンガム、カッサバ、コブラ及びココナッツ残留物からなる群から 選択した植物性物質である請求項２１に記載の消費可能組成物。
25. ２５．前記群が大豆及びアルファルファからなる請求項２４に記載の消費可能組 成物。
26. ２６．大豆あら粉と発酵ブロスとを含んでおり、この発酵ブロスが、 （ｉ）ヘミセルロースの分解を触媒する活性に関して約ｐＨ４．５〜約ｐＨ１１ の範囲のｐＨプロフィルを有するヘミセルラーゼを産生するＢａｃｉｌｌｕｓ属 に属する微生物で本質的に構成された培養物と、 （ｉｉ）前記ヘミセルラーゼ とを含んでいる消費可能組成物。
27. ２７．前記プロフィルが約ｐＨ７と約ｐＨ９との間にビータを有する請求項２６ に記載の消費可能組成物。
28. ２８．前記ヘミセルラーゼが６０℃以上の温度で前記分解を触媒する活性を示す 請求項２６に記載の消費可能組成物。
29. ２９．（Ａ）栄養学的に単胃動物に適しているタンパク質、ビタミン及びミネラ ルと、 （Ｂ）マンナン含有ヘミセルロースからなる炭水化物源と、 （Ｃ）発酵ブロス とを含んでおり、前記発酵ブロスが、 （ｉ）前記マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒する酵素であって、（１） ８〜１１の範囲のｐＨ及び（２）６０℃以上の温度で前記分解を触媒する活性を 示す酸素を産生する微生物で本質的に構成された培養物と、（ｉｉ）前記酸素 とを含んでいる消費可能組成物。
30. ３０．（Ａ）栄養学的に単胃動物又はヒトに適しているタンバク質、ビタミン及 びミネラルを含むと共に、マンナン含有ヘミセルロースからなる炭水化物源を含 む消費可能組成物を製造するステップと、 （Ｂ）単胃動物又はヒトによる前記ヘミセルロースのマンナン含有部分の使用を 可能にするように前記マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒する酵素であっ て前記分解を触媒する活性に関して約ｐＨ４．５〜約ｐＨ１１の範囲のｐＨプロ フィルを有する酵素を前記組成物に配合するステップ。 とを含む栄養増強方法。
31. ３１．前記炭水化物源が、大豆、アルファルファ、グアー、ローカストビーンガ ム、カロブビーンガム、カッサバ、コブラ及びココナッツ残留物からなる群から 選択した植物性物質である請求項３０に記載の方法。
32. ３２．前記群が大豆及びアルファルファからなる請求項３１に記載の方法。
33. ３３．ステップ（Ｂ）が、（ｉ）前記酵素と前記組成物とを含む混合物を製造し 、次いで（ｉｉ）この混合物を６０℃以上の温度を含む条件下でペレット化する ことを包含する請求項３０に記載の方法。
34. ３４．前記炭水化物源が大豆である請求項３０に記載の方法。
35. ３５．（Ａ）栄養学的に単胃動物に適しているタンパク質、ビタミン及びミネラ ルを含むと共に、マンナン含有ヘミセルロースからなる炭水化物源を含む消費可 能組成物を製造するステップと、 （Ｂ）単胃動物による前記ヘミセルロースのマンナン含有部分の使用を可能にす るように前記マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒する酵素であって前記分 解を触媒する活性に関して約ｐＨ４．５〜約ｐＨ１１の範囲のｐＨプロフィルを 有する酵素を産生する微生物で本質的に構成された培養物を前記組成物に配合す るステップとを含む栄養増強方法。
36. ３６．前記炭水化物源が、大豆、アルファルファ、グアー、ローカストビーンガ ム、カロブビーンガム、カッサバ、コブラ及びココナッツ残留物からなる群から 選択した植物性物質である請求項３５に記載の方法。
37. ３７．前記群が大豆及びアルファルファからなる請求項３６に記載の方法。
38. ３８．ステップ（Ｂ）が、（ｉ）前記培養物と前記組成物とを含む混合物を製造 し、次いで（ｉｉ）この混合物を６０℃以上の温度を含む条件下でペレット化す ることを包含する請求項３５に記載の方法。
39. ３９．前記炭水化物源が大豆である請求項３５に記載の方法。
40. ４０．前記培養物が本質的に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物からなる請求 項３５に記載の方法。
41. ４１．（Ａ）単胃動物による前記ヘミセルロースのマンナン含有部分の使用を可 能にするように前記マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒する酵素であって 前記分解を触媒する活性に関して約ｐＨ４．５〜約ｐＨ１１の範囲のｐＨプロフ ィルを有する酵素を産生する微生物で本質的に構成された培養物を製造するステ ップと、（Ｂ）飼料のマンナン含有ヘミセルロース成分の有効エネルギー含量を 増加させるのに有効な量の前記培養物を単胃動物に投与するステップ とを含む栄養増強方法。
42. ４２．前記培養物が本質的に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物からなる請求 項４１に記載の方法。
43. ４３．（Ａ）栄養学的に単胃動物に適しているタンパク質、ビタミン及びミネラ ルを含むと共に、マンナン含有ヘミセルロースからなる炭水化物源を含む消費可 能組成物を製造するステップと、 （Ｂ）発酵ブロスが単胃動物による前記ヘミセルロースのマンナン含有部分の使 用を可能にするために、（ｉ）前記マンナン含有ヘミセルロースの分解を触媒す る酵素であって前記分解を触媒する活性に関して約ｐＨ４．５〜約ｐＨ１１の範 囲のｐＨプロフィルを有する酵素を産生する微生物で本質的に構成された培養物 と、（ｉｉ）前記酵素 とを含む前記発酵ブロスを前記組成物に配合するステップとを含む栄養増強方法 。
44. ４４．前記炭水化物源が、大豆、アルファルファ、グアー、ローカストビーンガ ム、カロブビーンガム、カッサバ、コブラ及びココナッツ残留物からなる群から 選択した植物性物質である請求項４３に記載の方法。
45. ４５．前記群か大豆及びアルファルファからなる請求項４４に記載の方法。
46. ４６．ステップ（Ｂ）が、（ｉ）前記発酵ブロスと前記組成物とを含む混合物を 製造し、次いで（ｉｉ）この混合物を６０℃以上の温度を含む条件下でペレット 化することを包含する請求項４３に記載の方法。
47. ４７．前記炭水化物源が大豆である請求項４３に記載の方法。
48. ４８．前記培養物が本質的に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物からなる請求 項４３に記載の方法。