JPH05507207A - 線虫ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 線虫ワクチン 技術分野 本発明は、寄生性線虫による感染に対し防衛的免疫を付与する抗原に関する。

本発明はまた、寄生性線虫による感染に対し防衛的免疫を付与するワクチンおよ び寄生性線虫による感染に対し受動免疫を付与する抗体に関する。

背景技術 線虫（ｎｅｗａ−細線；　ｏｉｄｅｓ−類似の）は、角度で覆われた細長い、紡 錘状のまたはサック様の胴体を有する分節を持たない回虫であり、自然界に実質 的に遍在しており、土壌、水および植物に生息しており、広範囲な動物および植 物の寄生虫病に大きな関わりを持っている。

哺乳類の回虫寄生虫は、線形動物門に属している。回虫には、鉤虫（例えば、Ｎ ｅｃａｔｏｒ　ａｆｆｌｅｒｉａａｎｕｓおよびＡｎｅｙｌｏｓｔｏｗａ、　ｄ ｕｏｄｅｎａｌｅ　）　、回虫（例えば、普通の回虫であるＡｓｃａｒｆｓ　ｌ ｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）　、鞭虫（例えば、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ　ｔｒｉｃｈ ｉｕｒａ　）　、および婉虫または線虫（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂｊｕｓ　ｖｅ ｒｍｉｃｕｌａｒｕｓ　）並びにＳｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓｓｔｅｒｃｏｒａ 、ｌｉｓ　、　Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ　５ｐｉｒａｌｉｓ　（ヒトおよびブタ に感染）、および糸状虫Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ　ｂａｎｃｒｏｆｔｉかある。

他の重要な回虫寄生虫には、Ａｎｅｙｌｏｓｔｏｗａ　ｃａｎｉｎｕｗ　（ヒト の感染症）　、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｌｓ　（ウマの感染症）、 Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒ＊ｉｓ　（ヒツジの 感染症）、Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ　（ヒツジおよびヤギの 感染症）・Ｏｓｔｅｒｔａｇｌａ　ｏｓｔｅｒｔａｇｉ　（ウシの感染症）　、 Ａｓｃａｒｊｓ　５ｕｕｓ（ブタの感染症）　、Ｔｏｘａｓｃａｒｆｓ　Ｉｅｏ ｎｆａまたはＬｌｎｃｉｎａｒｉａ　５ｔｅｎｏｃｅｐｈａｌａ　（イヌの感染 症）　、Ｔｏｘｏｃａｒａ種（ヒトの循環系感染症）およびＤｉｒｏｆｔｌａｒ ｉａ　ｔｍｍｉｔｉｓ（ネコおよびイヌの循環系感染症）がある。

症状がない場合でも、寄生虫感染症は宿主動物にとって多くの点で有害であり、 例えば宿主から食物を奪い、器官を傷付けたり導管を塞いだりし、宿主に有害な 物質を合成することがあり、他の生物の侵入路を設けることがある。他の場合に は、宿主が食物のために飼育された種であることがあり、寄生虫は食べられるこ とによって伝染して、接種動物に感染することがある。このような寄生虫は、そ れを見つけたならばできるだけ速やかに除去するのが極めて望ましい。

更に一般的には、このような感染症は無症状ではない。

哺乳類の蝙虫、特に寄生性線虫による感染症は、具体的には家畜やベット、例え ば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコおよびトリ、特に家禽の、大 きな経済的損失の一因である。これらの動物は、定期的に駆虫薬で処理してこれ らの感染症を抑制しておかなければならず、さもないとこの病気は貧血、下痢、 脱水、食欲の喪失を引き起こし、死に至らしめることさえある。

嬬虫感染症の蔓延を防止する現在利用可能な唯一の手段は駆虫薬を使用すること によるものであるが、これらの化合物は処理の時点で存在する寄生虫に対して有 効なだけである。それ故、動物は常に感染に暴露されているので、処理は継続的 でなければならず、例えばＤｉｒｏｆｉｌａｒｔａ　ｉ＋ａｍｉｔｉｓまタハイ ヌ糸状虫ノ増殖ヲ防止スるには、−年のほとんど毎日または一日おきにジエチル カルバマシンによる駆虫薬処理を行う必要がある。。これは経費が掛かりまた手 間の掛かるやり方である。駆虫薬を広範囲に亙って使用するため、寄生虫が耐性 を現わすことがあり、したがって新規で一層強力な種類の薬剤を開発しなければ ならない。別の方法が望ましいのは明らかである。

寄生性線虫に対するワクチンが開発されれば、嬬虫感染症の予防または治療のた めの化学的処理に固有の欠点の多くが解決されるであろう。この保護は確かに長 く継続するであろうし、予防接種を受けた動物だけに作用し、残留物の毒性およ び持続性の問題は極めて少なくなりまたは回避されるであろう。したがって、寄 生性線虫を用いてこのようなワクチンを開発する試みが従来技術に報告されてい るが、不運にもそれらの試みの成功は限定されたものであり、材料利用可能性お よびワクチン安定性のような要因によってその人規頃な使用は不可能となってい る。

これらの以前の試みは、国際特許出願第ＰＣＴ／＾ＩＪ８ｇ１００２３９　（Ｗ ０８９１００１６３）号及びＰＣＴ／ＡＵ１１９１００４ｉ１１１（ｖ０９０１ ０３４３３号明細書に記載されている。

バイオテクノロジー、特に組換えＤＮＡ技術の細菌の進歩により、ヒトおよび家 畜の経済的に重要な寄生虫の範囲に対して商業上実行可能なワクチンを生産する 機会が現実的に提供されている。この方法によれば、粗製の寄生虫製剤を用いて 死ワクチンの効力の欠如を説明するために提起された問題点の多くは解決するこ とになる。

例えば、組換えＤＮＡ技術によって生産されたワクチンは、寄生性線虫種の粗製 エキス中に見出される免疫抑制剤または免疫調節剤を含まないであろう。しかし ながら、最初に抗原を同定する必要がある。一旦同定され、特性決定がなされて しまえば、組換えＤＮＡ技術を用いて防御用エピトープを含むタンパク質または このタンパク質の一部を合成する微生物を構成し、組換え生物によって合成され る生成物をワクチンに用いて、動物を寄生虫による感染から保護することができ るであろう。

ＰＣＴ／ＡＵ８８７００２３９号明細書には、線虫トロポミオシンであることが しめされている組換えＤＮＡ由来の抗原は、Ｈａｅｖｒｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔ ｏｒｔｕｓによる攻撃に対してヒツジで５０％が保護されることが明らかにされ ている。

ＰＣＴ／ＡＵ８９１００４１Ｇ号明細書では、成虫のＴｒｉｃｈｓｔｒｏｎｇｙ ｌｕｓｃｏｌｕｂｒｉｒｏｒａ＋ｆｓからの排泄性／分泌性抗原は予防接種した モルモットに保護を与えることが示されている。この明細書で後で明らかにされ る理由により、これらの抗原は本明細書で同定された抗原とは異なるものである 。

本明細書で用いられる「アジュバント」という用語は、免疫組成物に対する免疫 された宿主の免疫応答を高めるのに用いられる薬剤を表わす。

本明細書で用いられる「非経口」という用語は、皮下注射、腹腔内または筋肉内 注射または輸液技法を包含する。

「相同体」という用語は、タンパク質同士の機能が関係していることが明らかな 程度に第一のタンパク質またはＤＮＡ配列に構造が関係しているタンパク質をコ ードするタンパク質またはＤＮＡ配列を表わす。本発明の文脈において、本発明 の抗原をコードするＨ、　ｃｏｎｔｏｒｔυＳ由来のＤＮＡをＤＮＡのハイブリ ダイゼーション実験に用いて寄生性線虫の他の種の特異的なりＮＡ配列を同定す ることができることが説明されている。ハイブリダイゼ−ション実験を行った条 件は、関連したＤＮＡ配列は６０塩基対に亙るヌクレオチド配列において少なく とも５０％がＩｌ、　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓから単離されたヌクレオチド配列と相 同であることを示している。これらの関連したＤＮＡセグメントは、アミノ酸配 列においてもＨ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓから単離された防御抗原に関連している寄 生性線虫の他の種における抗原をコードする。関連したタンパク質は、他の種の 寄生虫による寄生から動物を保護するのに有効な免疫原として作用すると主張さ れている。これらの関連したＤＮＡ配列は相同遺伝子と呼ばれ、関連したタンパ ク質は相同抗原と呼ばれる。また、本発明の文脈において、防御抗原は、遺伝子 類の一員であって、コード用ポリヌクレオチドおよび遺伝子生成物は、６０個の ヌクレオチドについては５０％または２０個のアミノ酸については７０％程度の 相同性をそれぞれ本発明のコード遺伝子および防御抗原と分担することが明らか にされている。これらの関連した遺伝子および遺伝子生成物も、本発明の相同体 である。

本発明の相同体は、以下に記載するようにイン・ヒト抗原を発現する寄生性線虫 の生活段階から単離によって得られる抗原並びに寄生性線虫の生活段階から調製 されるヌクレオチド配列、例えばゲノムＤＮＡＳｍＲＮＡ。

ｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡ、および抗原コード配列に対応する配列を有す るように作成された合成ヌクレオチドの複製および発現によって得られる抗原を 包含することを意味する。

これは、線虫または抗原の組換え形態を発現するセルラインによって発現される 抗原の既知のアミノ酸配列に基づいて作成される合成ペプチドを包含することも 意味可能ならば、［新規なＪまたは「隠された」抗原、すなわち有効であり且つ 防御用の免疫原として作用することができるが天然に存在する免疫には関与しな い寄生虫の成分を同定することが好ましい。どれらの成分を同定するには、宿主 を寄生虫からのエキスで予防接種し、幾らかの防御を示す画分を同定し、タンパ ク質化学の手法を用いてこの防御成分を再分画し、これらの小画分を動物に予防 接種し、これらの小画分を同定し、この方法で防御し、純粋な寄生虫成分を用い て動物に予防接種し防御するまで継続する必要がある。

可能なかぎり、天然の宿主をこのような実験に用いるべきである。実験室のモデ ル動物は寄生虫の天然の宿主ではないので、これらの動物は天然の宿主では不可 能な機構によって寄生虫を拒絶することができるものと思われる。したがって、 実験室動物を特定の寄生虫から保護する抗原でも寄生虫の天然の宿主では効果が ないことがある可能性がある。天然の宿主が寄生虫に対して非常にゆっくりと免 疫を現わす状況では、これは一層可能性が高い。

本研究において特性決定される抗原は、ＨａｅＩＩｌｏｎｃｈｕｓｃｏｎｔｏｒ ｔｕｓ由来のものであるが、ヒトや家畜に感染することが知られている他の種の 寄生性線虫由来の同様なまたは関連の抗原である「相同体」を同定することがで き、これらの関連抗原は線虫の種による寄生に対して有効なワクチンを提供する ことが認められている。寄生虫の種およびそれらが感染することがある宿主には 、例えばヒ症、ヤギのＨａｅ＋ｌ１ｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ感染症、 ウシのＯ８ｔｅｒｔａｇｉａ　ｏｓｔｅｒｔａｇｔ感染症、ブタの＾５ｃａｒｆ ｓ　５ｕｕＩ１１またはＴｒｉｃｈｆｎｅｌｌａ　５ｐｉｒａｌｉｓ感染症、ネ コのＴｏｘａｓｃａｒｉｓＩｅｏｎｉｎａまたはＵｎｃｊｎａｒｔａ　５ｔｅｎ ｏｃｅｐｈａｌａ感染症およびイヌのＡｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ　ｃａｎｔｎｕｍ またはＴｒｉｃｈｕｒｉｓ　ｖｕｌｐｔｓ感染症、並びにＴｏｘｏｃａｒａ種の 幼虫によるヒトの循環器系およびＤｉｒｏｆ’１ｌａｒｊａ　１ｍｍｆｔ１ｓに よるイヌの循環器系の感染症或いはこれらの動物および他の種の動物の循環器系 、尿生殖器系、呼吸器系、皮膚および皮下組織の感染症が挙げられる。このリス トは決して完全なものではないことに留意すべきである。

１１ａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓによる攻撃感染を防御する製剤を 記載する。画分中におけるこの防御成分は低濃度の両性イオン性界面活性剤を含 む緩衝液に可溶性であり且つ麦芽レクチンセファロースカラム上でのクロマトグ ラフィでは保持されないものとして同定される。このようにして作成される防御 用抗原は、例えばレンチルレクチン（Ｌ　Ｌ）りＯ？トグラフィまたはＨｅ１ｌ Ｘ　ｐｏｍａｔｉａレクチン（Ｈｐ　Ｌ）クロマトグラフィ、逆相ＨＰＬＣ，サ イズ排除クロマトグラフィまたは可溶化性界面活性剤の存在下での当該技術分野 に知られている他の精製法によって更に精製することができる。

本発明の第一の態様によれば、第一の種の寄生性線虫由来の実質的に精製された 抗原であって、宿主にこの抗原を予防接種することにより第一〇線虫種と同一で あってもまたは異なる物であってもよい第二の線虫種による寄生から宿主を防御 することができる抗原であって、この抗原がタンパク質性てあり、ｐ■が３．８ 〜４，４の範囲にあり、レンチルレクチンおよびＨｅ１ｉｘ　ｐｏｍａｔｉａレ クチンに結合し、還元性５ＤＳ−ＰＡＧＥによって測定した分子量が約４５ｋＤ であることを特徴とする抗原が提供される。典型的には、この抗原は少なくとも ９０％の純度のものである。この水準の純度は、アミノ酸配列に用いられる製剤 の清浄度に関連して説明される。

本発明は、グリコジル化および非グリコジル化の両方の型の抗原を包含する。

典型的には、第一の寄生性線虫様は、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ　。

Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ　ＳＳｔｒｏｎｇｙｌｕｓＳＴｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇ ｙｌｕｓ。

Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ、　Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ、　Ａｓｃａｒｌｓ　％　Ｔｏ ｘａｓｃａｒｉｓ。

Ｕｎｃｌｎａｒｌａ　５Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ　、　Ｄｉｒｏ「１ｌａｒｉａ　５ Ｔｏｘｏｃａｒａ。

Ｎｅｃａｔｏｒ　、　Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ、　Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ及 びＷｕｃｈｅｒｅｒｉａ属の種から選択される。このような種の例には、Ｔｒｉ ｃｈｆｎｅｌｌａ　５ｐｉｒａｌｌｓ、　Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ　ｃａｎｉｕ ｍ。

Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｆｓ　ＳＴｒｌｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕ ｓｃｏｌｕｂｒｌｆｏｒｍｉｓ　ＳＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ 、　Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａｏｓｔｅｒｔａｇｉ　、Ａｓｃａｒｉｓ　ｓｕｕｍＳ Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓ　ＩｅｏｎｉｎａｓＵｎｃｉｎａｒｉａ　５ｔｅｎｏｃｅ ｐｈａｌａＳＴｒｉｃｈｕｒｉｓ　ｖｕｌｐｉｓ。

Ｄｌｒｏｆｉｌａｒｉａ　１ｍｍ１ｔｉｓ　５Ｔｏｘｏｃａｒａ種、Ｎｅｃａｔ ｏｒａｍｅｒｉｃａｎｕｓ％Ａｎｃｙｌｏｓｔｏ１１ａ　ｄｕｏｄｅｎａｌｅ　 、＾ｓｃａｒｊｓｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓＳＴｒｉｃｈｕｒｉｓ　ｔｒｉｃｈ ｉｕｒａ　５Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓｖｅｒｏ＋１ｅｕｌａｒｕｓ　、　Ｓｔｒｏ ｎｇｙｌｏｉｄｅｓ　５ｔｅｒｃｏｒａｌｉｓおよびＷｕｃｈｅｒｅｒｉａ　ｂ ａｎｃｒｏｆｔｉがある。

典型的には、宿主に与えられる防御は、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ　。

Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ　ＳＳｔｒｏｎｇｙｌｕｓＳＴｒｉｅｈｏｓｔｒｏｎｇ ｙｌｕｓ。

）１ａｅｍｏｎｃｈｕｓ、　ＯｓｔｅｒｔａｇｆａＳＡｓｃａｒｉｓ　、　Ｔｏ ｘａｓｃａｒｉｓｓＬｌｎｃｆｎａｒｆａ　、　ＴｒｉｃｔｒＬｔｒｉｓ　５Ｄ ｉｒｏｆｉｌａｒｉａ　、、　Ｔｏｘｏｃａｒａ。

Ｎｅｃａｔｏｒ　５Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ、　Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ及び Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ属の種から選択される寄生性線虫様に対する防御である。

このような種の例には、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ　５ｐｉｒａｌｉｓ。

Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ　ｃａｎｉｕｍ、　Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｖｕｌｇａ ｒｉｓ　。

Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　Ｃ０１ｕｂｒｉｆＯｒ＋＋＋ｉＳ、　Ｈａ ｅｆｆｉＯｎＣｈｕＳｃｏｎｔｏｒｔｕｓ、　Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ　ｏｓｔｅ ｒｔａｇｉ、Ａｓｃａｒｉｓ　５ｕｕｉ＋％Ｔｏｘａｓｃａｒｌｓ　Ｉｅｏｎｌ ｎａ、　１Ｊｎｃｌｎａｒｉａ　５ｔｅｎｏｃｅｐｈａｌａ。

Ｔｒｌｃｈｕｒｉｓ　ｖｕｌｐｉｓＳＤ！ｒｏｒｌｌａｒｊａ　１ｍｍ１Ｈｓ　 、　Ｔｏｘｏｃａｒａ種、Ｎｅｃａｔｏｒ　ａｍｅｒＬｃａｎｕｓＳＡｎｃｙｌ ｏｓｔｏＩＩｌａ　ｄｕｏｄｅｎａｌｅ　。

Ａｓｃａｒｉｓ　ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ、　Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ　ｔｒｉｃ ｈｉｕｒａ　。

Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ　ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｕｓ　、　Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｔ ｄｅｓｓｔｅｒｃｏｒａ＋　ｔｓおよびＷｕｃｈｅｒｅｒｉａ　ｂａｎｃｒｏｆ ｔｆがある。

好ましくは、第一および第二の線虫種はＨａｅｅ＋ｏｎｃｈｕｓ。

ＴｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓおよびＯｓｔｅｒｔａｇｉａ属から選択され る。

更に好ましくは、第一および第二の線虫種はＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ属から選択さ れる。

好ましい第一および第二の線虫種は、Ｈａｅｓｏｎｃｈｕｓｃｏｎｔｏｒｔｕｓ ＳＴｒｆｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｃａＩｕｂｒｉｆｏｒｍｕｓおよびＯｓ ｔｅｒｔａｇｉａ　ｃｉｒｃｕｉｃｉｎｃｔａである。

更に好ましくは、第一および第二の線虫種は、Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔ ｏｒｔｕｓである。

本発明者らは、第一の態様の抗原は高分子量線虫の糖タンパク質のタンパク分解 性開裂生成物と思われると決定した。

線虫の糖タンパク質は、クローニングした遺伝子の発現生成物に対して生じた抗 体を用いる抗体アフイニテイクロマトグラフイによって天然の源から調製するこ とができる。

グリコジル化および非グリコジル化した型の高分子全糖タンパク質も本発明に包 含され、以後「抗原前駆体」と呼ぶ。

実質的に精製された型の抗原前駆体も、本発明の第一の態様の一部である。

典型的には、抗原前駆体は、図８に示されるアミノ酸配列を有する。

本発明の第二の態様によれば、第一の態様の抗原または抗原前駆体の相同体が提 供される。

典型的には、この相同体は、図８に示されるアミノ酸配列に対して２０アミノ酸 について少なくとも７０％相同である。

本発明の第三の態様によれば、第一の態様の抗原または抗原前駆体、または第二 の態様の相同体をコードする天然に存在するままのポリヌクレオチド分子を除外 するポリヌクレオチド分子が提供される。

典型的には、このポリヌクレオチド分子は、ＤＮＡ分子である。

好ましくは、このポリヌクレオチド分子はｃＤＮＡ分子である。

本発明の好ましいポリヌクレオチド分子は、実質的に図７または８に示される配 列を有するｃＤＮＡ分子である。

本発明は、その範囲内に、図８に示される配列を有する６０個のヌクレオチドに ついて少なくとも５０％の相同性を有し且つ寄生性線虫の感染に対して免疫を与 えることができる防御的分子をコードするＤＮＡ分子を包含する。

本発明の第四の態様によれば、第三の態様のＤＮＡ分子とベクターＤＮＡとを有 して成る組換えＤＮＡ分子が提供される。

典型的には、ベクターＤＮＡ分子は、プラスミド、ファージまたはウィルスＤＮ Ａから成っている。

好ましいベクターには、λｇｔｌｌ、ｐＵＲ２９０゜ｐＵＲ２９１、ｐＵＲ２８ ２、ｐＵＫ２７０、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＺｉｐＮｅｏＳＳＶ４０を基材とす るベクター、λｇｔｌＯ１ＥＭＢＬベクター、ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２９、ま たはｐａｒ遺伝子座を含むｐＢＲ３２９、バキュロウィルスまたはワクシニアウ ィルスがある。

本発明の第五の態様によれば、第四の態様による少なくとも一つの組換えＤＮＡ 分子を有する形質転換した宿主が提供される。

典型的には、この宿主は、細菌、酵母、他の黴類、昆虫、植物および哺乳類の細 胞ラインから選択される。

好ましい宿主細胞は、大腸菌Ｋ　１．２誘導体である。

本発明の第六の態様によれば、耐−の態様の抗原または抗原前駆体または第二の 態様の相同体を有する第四の態様の形質転換した宿主の発現生成物が提供される 。

この発現生成物は、融合発現生成物であってもよい。

本発明の第七の態様によれば、本発明の抗原、前駆体、相同体または発現生成物 の総てまたは部分に対応する合　゛成ポリペプチドであって、宿主動物に投与す るとき、寄生性線虫による宿生動物の侵入に対して防御免疫を誘導することがで きる合成ポリペプチドが提供される。

本発明の第への態様によれば、　第一の態様の少なくとも１種類の抗原および／ または抗原前駆体、および／または第二の態様の相同体、および／または第六の 態様の発現生成物、および／または第七の態様の合成ポリペプチドの有効量を製 薬上および／または獣医学上許容可能な担体、希釈剤、賦形剤および／またはア ジュバントと共に含んで成るワクチンが提供される。本発明のワクチンはまた、 抗原、抗原前駆体、相同体、発現生成物および／または合成ポリペプチドを模造 することによ、て寄生性線虫による感染から宿主を防御することができる少なく とも１種類の抗−イディオタイプ抗体を含むこともできる。この活性成分に、製 薬上および／または獣医学上許容可能な担体、希釈剤、賦形剤および／またはア ジュバントを添加してもよい。

或いはまた、このワクチンは、第五の態様の形質転換した宿主を製薬上および／ または獣医学上許容可能な担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントと 共に含む全細胞ワクチンであってもよい。この細胞は、生細胞であっても、死細 胞であってもよい。

形質転換した細胞には、予防接種を行う宿主の粘膜に投与する発現生成物を発現 することができるもの、例えば細胞表面融合生成物がある。

本発明の第九の態様によれば、第一の態様の抗原の調製法であって、 （ａ）寄生性線虫種の若い成虫をホモゲナイズしてホモゲネートを生成させ、 （ｂ）このホモゲネートから膜質物質を得て、（Ｃ）この膜質物質を低濃度の両 性イオン性洗浄剤を含む緩衝液で抽出して洗浄剤抽出物を得゛て、（ｄ）この洗 浄剤抽出物を小麦麦芽レクチンセファロースカラム上でクロマトグラフィを行い 、（ｅ）カラムからの流出物を集める、 ことから成る方法が提供される。

好ましくは、この方法は、 Ｒ）等電点電気泳動法による分画およびｐｒが３．８〜４．４、更に好ましくは ４．０〜４．３の範囲の両分の収集、 軸）ゲル濾過クロマトグラフィにより分画し、分子量が］０〜６０ｋＤの範囲の 画分を収集、および（ｈ）レンチルレクチンおよび／またはｌ１ｅｌｉｘ　ｐｏ ｎ＋ａｔｉａレクチンクロマトグラフィによる分画および結合した物質の収集、 も含む。

本発明の第十の態様によれば、第への態様のワクチンの調製法であって、第７の 態様の少なくとも１種類の抗原および／または抗原前駆体、および／または第二 の態様の相同体、および／または第六の態様の発現生成物、および／または第七 の態様の合成ポリペプチド、および／または第九の態様の形質転換した宿主、お よび／またはアンチイディオタイプ抗体の有効量を、製薬上および／または獣医 学上許容可能な担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントと混合するこ とがら成る方法が提供される。

本発明の第十−の態様によれば、宿主を少なくとも１種類の寄生性線虫種による 感染から防御する方法であって、第一の態様の抗原および／または抗原前駆体、 および／または第二の態様の相同体、および／または第六の態様の発現生成物、 および／または第七の態様の合成ポリペプチド、および／または第への態様のワ クチンの有効量を宿主に投与することから成る方法が提供される。

本発明の第十二の態様によれば、第一の態様の抗原および／または抗原前駆体、 および／または第二の態様の相同体、および／または第六の態様の発現生成物、 および／または第七の態様の合成ポリペプチド、および／または第への態様のワ クチンに対して生じる抗体が提供される。本発明の抗体は、単クローン性であっ てもまたは多クローン性であってもよい。本発明はまた、第十二の態様の抗体と 同様な挙動を行う他の化合物を、第一の態様の抗原および／または抗原前駆体、 および／または第二の態様の相同体、および／または第六の態様の発現生成物、 および／または第七の態様の合成ポリペプチドに結合させ且つ構造および／また は機能を変化させることによって提供する。

本発明の第十三の態様によれば、第十三の態様の抗体と、製薬上および／または 獣医学上許容可能な担体、希釈剤および／または賦形剤とから成る抗体組成物が 提供される。

本発明の土日の態様によれば、第十三の態様の抗体の調製法であって、免疫応答 性の宿主に第一の態様の抗原および／または抗原前駆体、および／または第二の 態様の相同体、および／または第六の態様の発現生成物、および／または第七の 態様の合成ポリペプチド、および／または第への態様のワクチンを予防接種する ことから成る方法が提供される。

本発明の第十三の態様によれば、第十三の態様の抗体組成物の調製法てあって、 第十三の態様の抗体の有効量を製薬上および／または獣医学上許容可能な担体、 希釈剤および／または賦形剤と混合することから成る方法が提供される。

本発明の第十六の態様によれば、寄生性線虫に対する治療を必要とする宿主に受 動的に予防接種する方法てあって、第十三の態様の抗体および／または第十三の 態様の抗体組成物の有効量を宿主に投与することがら成る方法が提供される。

本発明の第十七の態様によれば、第四の態様の組換えＤＮＡ分子の調製法であっ て、第三の態様のＤＮＡ分子をベクターＤＮＡに挿入することから成る方法が提 供される。

本発明の第十への態様によれば、第九の態様の形質転換した宿主の製造法であっ て、宿主を形質転換に適合させ、コンピテント宿主を提供し、このコンピテント 宿主を第四の態様の組換えＤＮＡ分子で形質転換することがら成る方法が提供さ れる。

本発明の第十九の態様によれば、本発明の抗原、抗原前駆体、相同体、発現生成 物または合成ポリペプチドの試料、および／または本発明の抗体とから成る診断 用キットが提供される。

本発明の第二十の態様によれば、第六の態様の発現生成物の生合成法であって、 第五の態様の形質転換した宿主を提供し、適当な条件下で宿主を培養して発現生 成物を発現させ、形質転換した宿主から発現生成物を収集することから成る方法 が提供される。

本発明の第二十−の態様によれば、本発明の抗原の一部分に対応し且つアンチイ ディオタイプ抗体で免疫した宿主を寄生性線虫種による侵襲から防御することが てきるアンチイディオタイプ抗体が提供される。

アミノ酸およびヌクレオチド配列の変化は、特定のタンパク質およびこのタンパ ク質をコードする遺伝子（類）の異なる対立型の間で起こることができることが 認められている。更に、一旦特定の遺伝子またはタンパク質の配列が知られると 、熟練した当事者であれば、利用可能な手法を用いてこれらの配列を操作して、 それらを得られた特異的な配列から変化させて、関連している遺伝子またはタン パク質と同様に機能し続ける遺伝子またはタンパク質を提供することができるで あろう。これらの分子を本明細書では「相同体」と呼び、これも本発明に包含さ れるものとする。

これに関して、「相同体」は、基本的な機能的属性、すなわち本発明の抗原の防 御活性を保持するポリペプチドであり、これは本発明の抗原と相同である。この 説明のために、２つの配列の間の「相同性」は、第一の配列の誘導を第二の配列 から示唆している同一性には及ばない類似性を内包する。特に、ポリペプチドと 抗原の間のアミノ酸配列を比較することにより、２０個のアミノ酸に亙って約７ ０％を上回る同一性を示すときには、このポリペプチドは本発明の抗原に「相同 」である。このような配列の比較は既知のアルゴリズム、例えばリップマン（Ｌ ｉｐｍａｎ）とピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）　、５ｃｉｅｎｃｅ、　２２７．１ ４３５（１９８５）に記載のアルゴリズムであって、コンピューターによって容 易に実現されるものによって行うことができる。

相同体は、本発明によれば、従来の特定部位の突然変異誘発によって生産するこ とができ、この方法は、生成するポリペプチドを生物学的に不活性にすることな く修飾することができる分子の残基を日常的に同定する一つの方法である。［１ ］所望なヌクレオチド置換（突然変異）を含む配列を有するオリゴヌクレオチド の合成、［ｆＤこのオリゴヌクレオチドの、本発明の抗原をコードする構造配列 を有する鋳型へのハイブリダイゼーション、および［ｉｉＤ　Ｔ４ＤＮＡポリメ ラーゼを使用するオリゴヌクレオチドのプライマーとしての拡張から成るオリゴ ヌクレオチドの突然変異誘発は、特定の変化の抗原構造配列への影響を決定する のに容易に利用できるので好ましい。

本発明の抗原相同体のもう一つの例は、抗原の一部に対応するまたは天然の分子 と一致することはない抗原の一部からなり且つ本発明の抗原の防御活性を示す分 子である。

本発明の他の相同体は、防御活性を保持する抗原の断片である。同様に、本発明 の範囲内には、＜ｉ＞抗原のアミノ酸配列の一部に対応し、（ｆｉ）抗原の活性 を保持する合成ポリペプチドがある。このような合成ポリペプチドは、好ましく は長さが６〜３０アミノ残基である。

基準（１）に適合する合成ポリペプチドが基準（１１）も満足するかどうかは、 適当な宿主で防御活性を測定することによって日常的に決定することができる。

単一のワクチン投与形態を生成するために担体、希釈剤、賦形剤および／または アジュバントと結合する抗原、抗原前駆体、相同体、発現生成物および／または 合成ポリペプチドの量は、治療を行う宿主に対して予防接種を行う感染症および 投与の特定の様式によって変化するであろう。

任意の特定の宿主に対する特異的な投与量水準は、用いられる特異的な抗原、抗 原前駆体、相同体、発現生成物および／または合成ポリペプチド、年齢、体重、 全般的な健康、性別、食餌、投与回数、投与経路、排出速度、薬物の併用および 防止される特定の感染症の状態のような各種の要因によって変化する。

本発明のワクチンは、非経口的にまたは粘膜経路により潜在的に、所望により通 常の毒性のない製薬上および／または獣医学上許容可能な担体、希釈剤、アジュ バントおよび／または賦形剤を含む投与単位処方で投与することができる。

注射可能な製剤、例えば無菌の注射可能な水性または油性懸濁疫は、既知の技術 にしたがって、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて配合することが できる。無菌の注射可能な製剤は、毒性のない非経口投与可能な希釈剤または溶 媒の無菌の注射可能な溶液または懸濁液、例えば１，３−ブタンジオールの溶液 であっテモよい。用いることができる許容可能なビヒクルおよび溶媒には、水、 リンゲル溶液および等張塩化ナトリウム溶液がある。更に、無菌の不揮発性油は 、溶媒または懸濁い不揮発性油を用いることができる。更に、オレイン酸のよう な脂肪酸も、注射用製剤に用いられる。

現在のところ、ミョウバンは、ヒトでの使用に唯一登録されているアジュバント であるが、ヒトでの使用の他のアジュバントについて実験研究が行われており、 これらの他のアジュバントが本発明によるヒト予防接種用の組成物の調製に用い るのに好適であることが期待されている。

動物の予防接種に好適なアジュバントには、フロイントの完全または不完全アジ ュバント（家畜への使用は不適）、マルコール（Ｍａｒｃｏｌ）　５２　：モン タニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）８８８（マルコールはエツゾ（Ｅｓｓｏ）の商標 である。モンタニドは５ＥＰＰＩＣ，パリの商標である）、スクアランまたはス クアレン、アジュバント（Ａｄｊｕｖａｎｔ）６５　（ビーナツツ油、マンニド モノオレエートおよびモノステアリン酸アルミニウムを含有）のような油性エマ ルジョン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウムおよび ミョウバンのような鉱質ゲル、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リソ レシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムプロミド、Ｎ、Ｎ−ジオクタデ シル−Ｎ’　、Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミン、メトキ シヘキサデシルグリセロールおよびプルロニックポリオールのような洗浄剤、ピ ラン、デキストランスルフェート、ポリアクリル酸およびカーボボールのような ポリアニオン、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシンおよび゛ト レノ１０−スジミコレートのようなペプチドおよびアミノ酸が挙げられるが、こ れらに限定されない。本発明の抗原、前駆体、発現生成物および／または合成ポ リペプチドは、リポソームまたは他の微小担体中に組み入れた後または多糖類、 タンパク質またはポリマーに結合させた後またはフィール（Ｑｕｉｔ）−Ａと配 合して「イスコムス（Ｉｓｃｏｆｆｌｓ）Ｊ　（免疫刺激錯体（Ｉｍｆｆｌｕｎ ｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）　）を形成して、投与するこ ともできる。本発明における使用に好適な他のアジュバントには、免疫源とＴｒ ａＴのような原核性の一体的な膜タンパク質とから成る抱合体がある。（ＰＣＴ ／Ａ、Ｕ３７１００１０７を参照されたい）。　投与経路、投与量並びに注射の 頻度は総て、当該技術分野における通常の技術を用いて最適にすることができる 因子である。典型的には、最初の予防接種から数週間後に１回以上の「ブースタ ー」予防接種を行い、その真の効果図１は、銀で染色したＳＤＳポリアクリルア ミド上でのＩ　ＥＦ５および６についてのゲル濾過ＨＰＬＣの結果を示している 。レーン１〜６はＧＦＩ〜ＧＦ６を含み、レーン７はサイズをキロダルトンで示 したパイオーラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）製の低および高分子量標準を含み、レーン ８はＩＥＦ５および６を含む（予＊ＧＦ　ＨＰＬ、Ｃ）。

図２は、銀で染色したＳＤＳポリアクリルアミド上でのＩ　ＥＦ５および６につ いてのレクチンアフィニティクロマトグラフィの結果を示す。レーン１は分子量 標準を含む。レーン２および３はレンチルレクチンセファ０−ス（Ｌ　Ｌ　Ｓ） に結合し、これから溶出する物質を含み、レーン４は初期のＬＬＳへの結合と溶 出の後にＨｅｌｉｘｐｏｍａｔｉａレクチンセファロース（ＨｐＬＳ）と結合し 、溶出する物質を含み、レーン５は初期のＬＬＳとの結合およびそこからの溶出 の後にＨｐＬＳに結合しない物質を含んでいる。

図３は、コンカナバリン（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌ　Ｉｎ）　Ａ　−ＨＲＰと酵素 反応によって可視化した反応性物質を重層したウェスターンプロットとしてのＩ ＥＦ５および６についてのレクチンアフィニティクロマトグラフイの結果を示す 。

レーン１はＩ　ＥＦ５および６を含み、レーン２はＬＬＳに結合しない物質を、 レーン３は結合してＬＬＳから溶出した物質を、レーン４は初期の結合およびＬ ＬＳからの溶出の後に、結合し）ＩｐＬＳから溶出した物質を、レーン５は初期 の結合およびＬＬＳから溶出の後にＨｐＬＳに結合しない物質を、レーン６はＬ ＬＳまたはＨｐＬＳに結合しない物質を、レーン７はＢＲＬの高分子量標準を含 んでいる。

図４は、Ｈｅ１ｉｘ　ｐｏｍａｔｉａレクチン−ＨＲＰおよび酵素反応によって 可視化した反応性物質を重奏したウェスターンプロットとしてのＩＥＦ５および ６についてのレクチンアフィニティクロマトグラフィの結果を示す。レーンの内 容物は図３に記載した通りである。

図５は、ＰＬＲＰ−Ｓカラム上でのＩＥＦ５および６についての逆相ＨＰＬＣの 結果を示す。溶出に用いたグラディエンドは、０．１％ＴＦＡを有する水中３０ ％アセトニトリルから０．１％ＴＦＡを有する水中６０％アセトニトリルまでか ら成っていた。流速は１１／分であり、吸光度は２２０　ｎｍて観察した。数字 によって示されるピーク画分を手動で集めた。

図６（ａ）および図６（ｂ）は、銀で染色したＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ ９〜２２％グラディエンド）としてのＩ　ＥＦ５および６についての逆相ＨＰＬ Ｃの結果を示す。番号は、図５に示したピーク画分を表わす。レーンＳは、バイ オ−ラッド製低および高分子量標準であり、大きさをキロダルトンで示しである 。

図７は、ｐＢＴＡ８７９のクローン化したＤＮＡ配列および防御光源の相同体を コードするクローン化した遺伝子の誘導アミノ酸配列を示す。

図８は、ｐＢＴＡ９６３のクローン化したＤＮＡ配列および防御光源の相同体を コードするクローン化した遺伝子の誘導アミノ酸配列を示す。

図９は、寄生虫のゲノム内の相同遺伝子の存在を示すｐＢＴＡ８７９およびｐＢ ＴＡ９６３からのｃＤＮＡにハイブリダイゼーションしたＨ、　ｅｏｎｔｏｒｔ ｕｓ由来のＤＮＡのサザンブロッティングを示す。レーン１は、Ｈａｅｍｏｎｃ ｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓＤ　Ｎ　ＡＳｐ　Ｂ　Ｔ　Ａ　９６３でプローブし たＨｉｎｆＩ消化物であり、レーン２は、Ｈａｅｎ＋ｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏ ｒｔｕｓＤ　Ｎ　Ａ、　ｐ　Ｂ　Ｔ　Ａ　８７９でプローブしたＨｉｎｆｌ消化 物である。

図１０は、４５ｋＤの抗原プローブを有するＴ、　ｃｏｌｕｂｒｉｒｏｒｍｉｓ 、　Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ　ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａおよびＯｓｔｅｒｔａｇ ｉａ　ｏｓｔｅｒｔａｇｉ由来のＤＮＡのサザンブロ１．ティングを示し、他の 種の線虫の関連遺伝子の存在を示している。レーン１は、Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ 　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓｐ　Ｎ　ＡおよびＨｉｎｆＩ消化物である。レーン２はＴ ｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓＣｏｌｕｂｒｉｒｏｒｍｉｓＤ　Ｎ　Ａおよび ＨｉｎｆＩ消化物である。

レーン３は、Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ　ｏｓｔｅｒｔａｇｉＤ　Ｎ　Ａ及びＨｉｎ ｆ■消化物である。レーン４は、ｏｓｔｅｒｔａｇｉａｃｌ　ｒｃｔ＋ｍｃｉｎ ｃｔａ　Ｄ　Ｎ　Ａ及びＨｔｎｆＩ消化物である。レーン５は、プラスミドｐＢ ＴＡ９６３、Ｈｉｎｆｌ消化物、陽性コントロールである。

図１１　（ａ）及び図１１　（ｂ）は、大腸菌で発現した組換え４５ｋＤの抗原 の５ＤＳＰＡＧＥゲル及びウェスターンプロットを示す。図１１　（ａ）は、大 腸菌中における４５ｋＤａの抗原の発現であり、試料は１２．５％ＳＤＳポリア クリルアミドゲル上で電気泳動した。次に、このゲルをコマジブリリアントブル ーで染色した。レーン１は、未誘導コントロールであり、レーン２は１時間後誘 導であり、レーン３は３時間後誘導であり、レーン４は、予備染色した５ＤＳＰ ＡＧＥ標準である。図１１　（ｂ）は発現した４５ｋＤａの抗原のウェスターン プロットであり、試料を図１１　（ａ）と同様に電気泳動し、対で、ニトロセル ロースフィルター上に電気泳動的にプロットした。このフィルターを４５ｋＤａ のタンパク質の切り詰められたＮ末端に対応するペプチドに対して生じたウサギ 血清をプローブした。プロメガ・プロトプロット（Ｐｒｏｍｅｇａ’Ｐｒｏｔｏ ｂｌｏｔ）アルカリ性ホスファターゼシステム（製品番号Ｗ３９３０）を用いて 発色した。

図１２は、Ｉｌ、　ｃｏｎｅｏｒｔｕｓ及びイヌの心糸状虫からの抽出物のウェ スターンプロットであり、本発明の抗原に免疫学的に関連した抗原は他の種の規 制製線虫で発現することを示している。レーン１はり、　＋ａｕｎｆｔｆｓの抽 出物を、レーン２はＨ，ｅｏｎｔｏｒｔｕｓ抽出物を、レーン３はＢＲＬの高分 子量標準である。

発明を実施する最良の方法 ）１ａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓの若い成虫をリン酸塩で緩衝した 食塩水（ＰＢＳ）中でホモゲナイズし、ホモゲネートを遠心分離して線虫からの 膜性物質を沈降させた。このペレットは、２回の予防接種の後ではヒツジを感染 がら防御することを見出だした。次に、防御画分を多数の異なる洗浄剤で抽出し た。ツヴイッタージェント（Ｚｗｔｔｔｅｒｇｅｎｔ）３−１４　（カルビオヶ ム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｌｌ））が好適であることが判ったが、他の洗浄剤も有 効であった。抽出効率は、用いた洗浄剤が、（防御を与えるのに要する可溶化し た物質のマイクログラム数によって計算した）最高の特異活性を有する防御抗原 を可溶化する能力によって判定しく予防接種／攻撃実験によって判定）、用いた 予防接種／攻撃プロトコールの後に有意な防御を示さなかった不溶性残渣はその ままにした（４２％、表３を参照）。ツヴイッタージエント３−１４による抽出 処理は完全に効率的なものではなく、防御抗原の幾らかは洗浄剤不溶性画分中に 見出だされることがあるということが認められる。

本発明の組換えＤＮＡ分子および形質転換宿主細胞は、分子生物学の標準的手法 を用いて調製する。

本発明の発現生成物は、特定の宿主細胞に好適な標準的条件下で本発明の形質転 換宿主細胞を培養し、標準的手法により培養物から発現生成物を分離することに よって得られる。この発現生成物は、不純な形態で用いてもよく、または発現生 成物を生産するのに好適な標準的手法によって精製してもよい。

好適な場合には、全細胞をワクチンに用いてもよい。

本発明の合成ポリペプチドは、本発明の抗原、抗原前駆体、相同体及び発現生成 物の既知の配列に基づいてペプチド合成の標準的手法によって調製される。

相同体、発現生成物及び合成ポリペプチドは、下記の例に記載の方法で防御活性 について試験することができる。

組換えＤＮＡ手法を用いて、本明細書に記載の防御抗原または相同体を多量に提 供することができる。防御抗原またはこの防御抗原の前駆体または相同体をコー ドするＤＮＡセグメントを任意の数の組換えプラスミド系に挿入して、この分子 を多量に合成できるようにすることができる。組換え系には、大腸菌、酵母及び バキュロウィルス系及びワクシニアのようなウィルスがある。組換え生物は、醗 酵槽中で多量に成長させることかでき、組換え抗原は標準的方法、例えば、 尿素及びＤＴＴまたはメルカプトエタノールのような還元剤を含む溶液中ての可 溶化、還元し、酸化し、　ｔ：　ｒ　ｊｋｇ　ｆａｔ　＞母″″′Ｅ　＠　（７ ）舵ビ０９敷４オン交換、濾過および／またはゲル浸透クロマトグラフィによる 精製、最後に濾過によって殺菌し、油状物のような多数のアジュバントの任意の ものでアによフて精製することができる。

、　”）’）ｆ＞は・″４″肪″ｔ″”゛■龍４・相離・′現生成物および／ま たは合成ポリペプチドおよび／または形質転換宿主および／またはアンチイディ オタイプ抗体を、製薬上および／または獣医学上許容可能な担体、賦形剤および ／またはアジュバントと、製薬および／または獣医学的調製の標準的方法を用い て混合、好ましく、　Ｊ！＃！ｌ″知１６１に１°１對篩・、　ト投与形ｔ′付 成′ｔ″。に要す６抗”・抗原前５体・相同体、発現生成物および／または合成 ポリペプチドおよび／または形質転換宿主および／またはアンチイディオタイプ 抗体の量は、予防接種を行う感染症、治療する宿主、及び投与の特定の様式によ って変化する。任意の特定の宿主に対する特異的な投与量水準は、宿主の年齢、 体重、全般的な健康、性別及び食餌、投与回数、投与量［ 路、排泄速度及び薬物の配合のような各種の因子によって変化する。

ワクチンは、通常の毒性のない製薬上および／または獣医学上許容可能な担体、 希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントを所望により含む単位投与配合物で 非経口的に投与してもよい。

アンチイディオタイプは、本発明の抗原、前駆体、発現生成物、相同体および／ または合成ポリペプチドを適当な宿主に予防接種し、生成する抗体を用いて第一 の予防接種において生じた抗体の抗原結合領域に対して抗体を生じさせることに よって生成される。

抗体は、好適な宿主における標準的な予防接種様式を用いて生じさせる。宿主に 、本発明の抗原、抗原前駆体、相同体、発現生成物、合成ポリペブチ下および／ またはワクチンを予防接種する。免疫応答が、予防接種の結果として生じる。こ の免疫応答を、例えば生成する抗体の濃度を測定することによって観察すること ができる。　、抗体組成物は、抗体を、製薬上および／または獣医学上許容可能 な担体、希釈剤および／または賦形剤と、製薬および／または獣医学的調製の標 準的方法を用いて混合、好ましくは均質に混合することによって調製される。

単一投与形態を生成するのに要する抗体の量は、予防接種を行う感染症、治療す る宿主、及び投与の特定の様式によって変化する。任意の特定の宿主に対する特 異的な投与量水準は、宿主の年齢、体重、全般的な健康、性別及び食餌、投与回 数、投与経路、排泄速度、薬物の配合及び治療を行う感染症の重さのような各種 の因子によって変化する。

抗体組成物は、通常の毒性のない製薬上および／または獣医学上許容可能な集体 、希釈剤および／または賦形剤を所望により含む単位投与配合物で非経口的に投 与して、宿主を線虫の感染から受動的に防御することができる。

診断キットは、発現生成物、抗体、抗原、抗原前駆体、相同体または合成ポリペ プチドを、検出を行う物質（類）に対して好適な濃度で、製薬上および／または 獣医学上許容可能な担体、希釈剤および／または賦形剤と配合することによって 調製される。検出を行う物質の既知の濃度の陽性のコントロール標準も同様に調 製される。陰性の標準は、担体、希釈剤および／または賦形剤のみから成ってい る。

本発明を下記の例に関して更に説明するが、これらの例は本発明の範囲を制限す るものではない。

剋１ 若イＨ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ線虫を、感染したヒツジがら回収した。線虫をＰＢ Ｓで３回洗浄し、ＰＢＳ中でホモゲカイズした。このホモゲネートを５００Ｘｇ で１０分間遠心分離して、大きい破壊されていない生物質を除去した。

次に、上澄液を平均１２０．０００Ｘｇで、４℃で２時間遠心分離した。ベレッ ト化した物質をＰＢＳに懸濁した後、アジュバントの不在下にて４週間の間隔を 置いて２回、ヒツジに予防接種し、それぞれの予防接種にはヒツジの体重１ｋｇ 当たり約５０ｍｇの生温重量に相当するものを含んでいた。第二回目の予防接種 から３週間目に、このヒツジと５頭の予防接種を行っていない感染コントロール に１０，０００匹のＨａｅａｏｎｃｈｕｓ　ｅｏｎｔｏｒｔｕｓの感染性の幼虫 で攻撃させた。感染から２３．２７．２８．３３．３６及び４００回目、糞便中 の卵の数を総てのヒツジについて数えた。結果（卵の数／糞便１ｇ）を表１に示 す。表１ 糞便中の卵の数　卵／ｇｊｔ便 動物　日数２３　２７　２９　３３　３６　４０１　Ｌ、４３３　４．３００　 ２，８００　８，４６７　４，２６７　５，９００２　７００　３．６３３　３ ．４００　７．３６７　７，２６７　８，６００８　６（１０４，４６７４，７ ８７４，０３３４，３８７７，８００４８６７１０，２００１１，４００１８， ３３３１６，５３３８，１００５３，２００５，３３３５，１３３７，３６７４ ，４３３６，７００予防接種を行ったもの ８　３３　３００　２６７　５［１７２，１３３１，３５０７６，１１１１７１ ４，４３４８，０００２２，４３４１ｆ、１３３　１８．５５Ｑ８　３３　３３ 　０　３３　１．３３３　８５０９　０　０　６７　８７　７６７　１．３５０ ５頭の予防接種を行った動物は感染から良好に防御されたことは明らかである（ 予防接種群対コントロール群についてｐ　＜　０．　０２）。

例２ 一連の実験を行い、雌のモルモットに、Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓの成虫のホモゲ ネート、及びこのホモゲネート（本質的に例１に記載した通りに調製）から誘導 される１２０．０００Ｘｇベレット及び上澄液を予防接種した。

モルモットは、アジュバントなしで３または４週間置きに２回予防接種を腹腔内 に行い、２回目の予防接種から３〜４週間後に１，０００匹のＨ，ｃｏｎｔｏｒ ｔｕｓの感染性の幼虫で攻撃させた。感染から５〜６日後に、動物を屠殺して、 虫の数を数えた。

表２にこれらの実験の結果を纏めており、予防接種を行ったものから回収される 虫の数を、同じ攻撃感染を受けている予防接種を行っていないコントロールから 回収されるものの百分率として示している。

表２ 両分　防御％　実験番号 ホモゲネート　８１　１８３ ホモゲネート（３群）　４５，５５．４５　１Ｂ５１２０．０００　ｘ　ｇベレ ット　５９　１９６１２０．０００　ｘ、　ｇペレット　３４＊１７１１２０． ０００　Ｘ　ｇ上澄液　２９　１９６１２０．０００　ｘ　ｇ上澄液　１５’　 １４９Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓの成虫のホモゲネートから誘導される画分は、モ ルモットに対して有意な防御を与えることができ、特に１２０，０００ｘｇベレ ットに見出だされる粒状物質ではそうであることが明らかである。

例３ ｔ（、ｃｏｎｔｏｒｔｕｓの若い成虫をトリス緩衝食塩水中でホモゲナイズし、 例２に記載の方法で１２０．０００Ｘｇペレットを調製した。このベレットを１ ％（Ｗ／Ｖ）ツヴイッタージエント５Ｂ−１４（、シグマ（Ｓｉｇｍａ）　）を 含むトリス緩衝食塩水（ＴＥＳ）に４℃で１時間超音波処理及び振盪することに よって再懸濁した。抽出液を平均５ｏ、０００Ｘｇで３０分間遠心分離して、洗 浄剤に不溶性の物質をベレット化した。上澄液画分を小麦麦芽レクチン−セファ ０−ス６ＭＢ　（シグマ）のアフィニティカラム上を２回通過させて、末端Ｎ− アセタール−グルコ環から誘導される５個の画分を用いて、例２と同様にモルモ ットを予防接種した。結果（表３）は、防御性物質のかなりの部分が洗浄剤に可 溶化しているが、防御抗原（類）の大半は小麦麦芽レクチンに結合しないことを 明らかに示している。

画分　μｇ／動物　保護％ ５Ｂ−１４不溶性物質　８００Ｈｇ　４２％５Ｂ−１４可溶性物質　７００Ｈｇ 　７１％＋ ５Ｂ−１４可溶性ＷＧＡ　１０μｇ　２２％５Ｂ−１４可溶性ＷＧＡ−７００Ｈ ｇ　７７％ＷＧＡ−は小麦麦芽アグルチニン非結合性物質である。

５Ｂ−１４はツヴイッタージエント（カルビオケム）である。

Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓのホモゲネートから誘導される粒状の製剤に含まれる物 質を、モルモットまたはヒツジの予防接種に用いると、この予防接種を行った動 物の免疫応答を促進し、これらの動物に寄生虫が感染したときにこれらの動物に おける寄生を減少させることができる。防御抗原はツヴイッタージエント５Ｂ− １４のような洗浄剤にかなり可溶性であり、前記の例で用いた条件下では小麦麦 芽アグルチニンに結合しない。

氾 ツヴイッタージエント５Ｂ−１４抽出液を、例３に記載したのと同様にＨ，ｃｏ ｎｔｏｒｔｕｓの若い成虫の１０〜１５ｇ湿重量から調製し、２つの実験におい てヒツジを予防接種するのに用いた。

動物は、３週間の間隔を置いて２回予防接種を行い、最初はフロイントの完全ア ジュバント中で、二回目はフロイントの不完全アジュバント中で行った。二回目 の予防接種から３週間後に、ヒツジに、Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓの１０．０００ 個の幼虫で経口で投与した。糞便中の卵の数を、感染から２１日から始めて１週 間毎に２回数え、次の４週間毎に動物を屠殺して、虫の数を数えた（表４ａ及び ４ｂ）。ツヴイッタージエント５Ｂ−１４抽出液は、糞便中の卵の数または虫の 数によって測定したところ、実験においてそれぞれの動物を予防接種するのに用 いたタンパク質の量は極めて少量であったにも拘らず（１０±２．５＋＋＋ｇ　 ）　、ヒツジを感染から有意に防御し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動 によって判定したところ、抽出液は多数の成分を含んでいたことは明らかである 。

裏４ａ 表４ｂ 例３と同様の実験に就いて、前記の例で用いた量の５倍の物質を調製した。ツヴ イッタージエント５Ｂ−１４抽出液（タンパク質的６３ｍｇ）をファーマライト （ＰｈａｒＩＩｌａｌｊｔｅ＞　３−１０アンフ７ライン及び０，５％ＣＨＡＰ Ｓ洗浄剤（カルビオケム）を含む４％ウルトロデックス（Ｕ　ｌ　ｔ　ｒｏｄｅ ｘ　）樹脂（ＬＫＢ）中で調製用等電点電気泳動法によって分画した。１０００ ０Ｖｈの電気泳動の後、ベッドを３０個の画分に分け、それぞれの画分中の物質 を０，１％ＣＨＡＰＳに溶出した。それぞれの両分のｐＨを測定した情、それぞ れの画分をＹＭｌＯ膜上で１１に濃縮した。それぞれ画分の一部をＳＤＳポリア クリルアミドゲル電気泳動によって分析し、コマシブリリアントブルーで染色し た。それぞれの画分の一部（約１／８）をＳＤＳゲル上で可視化した成分に基づ いてプールして、５画分の総量を得て、これを用いて例２に記載したのと同様に モルモットを予防接種した。虫の数（表５）は、防御抗原（類）の大半がｐＩ範 囲３．３〜４．６をカバーするＩＥＦゲルの画分１〜１０に含まれていることを 示している。他の画分ち物質を含んでいるが、虫の数は減少しており、これらは この用途において興味深いものである。

表５Ａ 実験番号２２９ 画分　ｐｒ　虫の数　防御％ コントロール　４６７±１９０− ３Ｂ−１４抽出物　２２Ｂ±６２５２％ＩＥＦＩ−１０　３Ｊ−４，１３２３３ ±１５５　５０％ＩＥＦ　１１−１４　ｔｙ−５，３３４１±１１２　３７％Ｉ ＥＦ　１５−１８　５．４−６．２　８２３±１０７　３１％ＩＥＦ　１９−２ ２　６．８−７．５　５２８±３３　０％ＩＥＦ　２３−３０　７．７−９．３ 　３４７±２４７　２６％コントロール　６６４±１５２− ９Ｒ−１４抽出物　２５４±１１１　６２％ＩＥＦＬ−ＩＱ　１３−４．６　２ ３８±６７６４％ＩＥＦ　１１−１４　４．７−５．３　２７４±２８７　５９ ％ＩＥＦ　１５−１８　５．４−８．２　４５５±２５１　３１％ＩＥＦ　１９ −２２　１Ｂ−７，５４７４±４２７　２８％ＩＥＦ　２３−３０　７．７−９ ．３　３５６±１００　４６％例４における第二の実験であって結果を表４ｂに 示したものについて、ヒツジの群を前記の例と同様に広い範囲のＩＥＦ画分で予 防接種した。結果を表５０に示す。

表５０ ：＝：＝！−−−−−−−−−−−−−一−−−−−−−−−−−−−−−−一 群平均　アジュバントコン トロールの防御％ 糞便中の　虫の数　卵の数　虫の数 卵の数 コントロール　７５６００　２１１７’　−−３Ｂ−１４抽出物　９１１４　５ ３３　８８　７５ＩＥＦ　１−１０　２６３１４　１４４０　６５　３２１ＥＦ 　１１−１４　２７８１４　３９５　６３　８１１ＥＦ　１５−１８　２４２７ １　５０３　８８　７６１ＥＦ　１９−２２　１６９１７　５８１　７８　７３ １ＥＦ　２３−３０　２７３２９　９５８　６４　５５モルモットの予防接種及 び攻撃実験において得られたこのデーターは、ＩＥＦ画分１〜コ０には、Ｈ，ｃ ｏｎｔｏｒｔｕｓ攻撃感染からヒツジを有意の程度に防御することができ乞抗原 があることは明らかであることを裏付けている。これらのデーターから、本実験 で検討した他のＩＥＦ画分にも追加の防御成分があることも明らかであり、これ らはこの用途並びにＩＥＦ画分１〜１０に含まれるものに興味深いものである。

例６ 例５において用いた最初のｌｏＩＥＦ画分の半分を対にしてプールし、モルモッ トの予防接種に用いた。

虫の数（表６）は、防御物質の大半は、ｐＩが３．８〜４．４である物質を含む 元のＩＥＦゲルから画分５及び６に含まれていることを示している。

コントロール　５８９±１９４− ＩＥＦ　ｌ−１，０３，３−４，８ｉ８３±８５６９％ＩＥＦ　ｌ　＆　２　３ ．３−８．５　５０９±１２２　１３％ＩＥＦ　３　＆　４　３．７−３．８　 ３７３±１４３　３７％ＩＥＦ　５　＆　８　４．０−４４　２２５±１０３　 ６２％ＩＥＦ　７　＆　８　’　４．４−４．５　３２１±１１５　４５％ＩＥ Ｆ画分の一部をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動を行い、銀で染色す ると、多数の成分が可視化され、それらはｐＩ３．８〜４．４の画分に集中する ものと思われる。それらの幾つかはシャープなバンドではなく、糖タンパク質と 考えられる。ＢＲＬ高分高分子量タンパク準標準較したこれらの化合物の見掛け の分子量は、１００〜１２０ｋＤ、、４０〜５５ｋＤであり、１４〜２０ｋＤの 範囲における恐らく５成分のクラスター、及びゲルによって分割されない分子量 が１５ｋＤ未満の物質があった。更に、見掛けの分子量が３２〜３６ｋＤのタン パク質のンヤーブな：重ビークがあり、隣接の防御性の余り高くない画分よりも 高濃度であるので、防御免疫応答に関与する抗原とは考えられない。ＩＥＦ画分 を、例４において予防接種したヒツジからの血清をインジケーター血清として用 いて、「ウェスターンプロット」にも用いた。銀で染色されたゲルに観察される ｐＩ３．８〜４．４の範囲の成分は総て、ヒツジ血清と反応するので、この実験 で行った予防接種の方式ではヒツジに免疫応答を引き出すことができる。

これら結果は、潜在的に防御性の抗原を、粒状のＨ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓの若い 成虫から単離し、少なくとも部分的に１％ツヴイッタージエント５Ｂ−１４で可 溶化することができ、ｐＩは３．８〜４．４の範囲であり、ＳＤＳゲル電気泳動 法によって計算し、ＢＲＬ高分子量マーカーと比較した見掛けの分子量は１００ 〜１２０ｋＤ。

４０〜５５ｋＤ、１４〜２０ｋＤまたは１５ｋＤ未満であることができることを 示している。

例７ ＩＥＦ画分５及び６を０．６％ＣＨＡＰＳを含む５０Ｉｌ１Ｍリン酸ナトリウム 緩衝液ｐＨ５，６に対して透析し、ＹＭ−１０膜上で６倍まで濃縮した。０．　 ２＋ａｌをバイオ−シル（Ｂｔｏ−３ｔｌ）　Ｔ　Ｓ　Ｋ　−４００カラム（３ ０Ｘ０、　７５ｃｍ）　（パイオーラド）を用いて流速が０．２１／分の同じ緩 衝液中で、溶出液の吸光度を２８０　ｎｍで観察して、ＨＰＬＣゲル濾過によっ て分画した。画分を集めて、溶出液の吸光度曲線に基づいてプールした。最後に 溶出するピークに含まれる画分をプールし、前記の条件を用いてＴＳＫ−８Ｗ３ ０００Ｇゲル濾過カラム（トーヨーソーダ）上で再クロマトグラフィを行った。

送料で６個のプールを用いて、例２に記載したのと同じモルモットを予防接種し た。それぞれのプールは、４１のＩ　ＥＦ５及び６に同等のものを含んでいた。

虫の数（表７）は、防御抗原の大半はＧＦ５及びＧＦ６に含まれ、これは抗原の 近似的分子量節回が＜１０ｋＤ〜６０ｋＤであることを示している。

画分　分子量範囲　虫の数　保護％ （ｋＤ） コントロール　−一　４３６　±１２３　−−ＩＥＰ　５　＆　６　＜１０−　 ＞２５０　２２４±１２５　４９ＧＦ　ｌ　＞２５０　３６９±１０４　１５Ｇ Ｆ　２　１００　−　＞２５０　３４４　±１５８　２１ＧＦ　３　５５−　） ２５０　３４１±１６８　２２ＣＦ４．　５５　３８７±１０５　１１ＧＦ　５ 　＜１０−６０　２３３±１．４１　４７ＧＦ　６　（１０−４４２３７±１７ ０　４．にのゲル濾過プールの一部をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳 動し、銀で染色したところ、多数の成分が可視化され、これらはＧＦ５及びＧＦ ６　（図１）に集中しているように思われた。パイオーラドの低分子量標準と比 較したこれらの見掛けの分子量は、４５ｋＤであり、恐らく４個の異なる成分は ２５〜３０ｋＤの範囲にあり、恐らく５個のタンパク質は１４〜２０ｋＤの範囲 にあると思われる。このゲル上で分割されず、緩衝液のフロントまで同時移行す る他の成分もある。

ＧＦ５及びＧＦ６に滞留する成分は、数種類の手段によって更に高度に分割する ことができた。例８及び９に記載した方法は、単に例示のためのものである。

例８ Ｉ　ＥＦ５及び６　（６ｍりを、１００＋ａＭ）リス／２５０ｄ塩化ナトリウム 、ｐＨ７の等容量で希釈し、レンチルレクチン−セファ０−ス４Ｂ（ファルマシ ア（Ｐｈａｒａａｃｉａ）　）０．５１と共に１６時間４℃で撹拌した。セファ ロース抱合体を３，０００Ｘｇで１分間遠心分離して除去し、０．１％ツヴイッ タージェント５Ｂ−１４（ＴＳＺ緩衝液）を含む５０ｍＭ）リス−食塩緩衝液で ４回洗浄し、次に同じ緩衝液で溶出して、これに３０Ｍメチル−α−Ｄ−マンノ ピラノシドを加えた。レンチルレクチンに結合した画分の半分を、Ｈｅ１ｉｘ　 ｐｏｍａｔ１ａレクチン−セファ０−ス６ＭＢ　（ファルマシア）と、４℃で１ ６時間撹拌し、抱合体をＴＳＺ緩衝液で４回洗浄した後、０．２ＭＮ−アセター ル−Ｄ−ガラクトサミンを含むＴＳＺ緩衝液て溶出した。総ての画分の一部をＳ ＤＳポリアクリルアミドゲル上で３回実験した後、１）銀で染色（図１）または ウェスターン移行、及び２）コンカナバリンＡセイヨウワサビペルオキシダーゼ （ＨＰＲ）抱合体（シグマ）（図３）、または３）Ｈｅｔｉｘ　ｐｏｒＡａｔ１ ａレクチン−ＨＲＰ　（シグマ）（図４）を用いる染色を行った。銀で染色した ゲルは、主要なタンパク質は４５ｋＤのものであり、これはレンチル及びＨｅ１ ｉｘ　ｐｏｍａｔｌａの両方に結合するが、後者は少量の混入物タンパク質と結 合しない。これらの観察は、２つのレクチンプロットによって確認されている（ コンカナバリンＡはレンチルレクチンと同じ糖特異性を有する）。

モルモットを、ＩＥＰ５及び６の画分の試料を用いて、例２に記載したのと同様 の方法で予防接種した後、前記のようにレクチンアフィニティクロマトグラフィ によって分画した。屠殺時の虫の数（表８）は、レクチン結合画分によって防御 されることを示していた。この実験では、他の両分も幾分か防御された。これは 、レクチンによるＩ　ＥＦ５及び６からの４５ｋＤの成分の除去が不完全である ことによるものと考えられ、抗原は様々な程度のグリコジル化を有する各種の形 態で存在することができるからである（しかしながら、この分子量の物質は、Ｈ ｅ１ｆｘ　ｐｏｍａｔｉａレクチン未結合画分のＳＤＳゲルプロフィールではほ とんど見ることができない）。他の画分て得られた防御も、これらの画分におけ る他の防御抗原の存在によるものとも考、えられる。これらの他の抗原は、本明 細書において興味があるものである。

両分　虫の数　保護％ コントロール　４６２　±３２０　０ ＩＥＦ　５　及び６　２７３　±２３８　４ルンチルレクチン結合　（ＬＬ　＞ 　３１５　±１２７　８２レンチルレクチン未結合（ＬＬ−）　２０７　±２８ ８　５５ＬＬ”　、　Ｈｅ１ｉｘ　ｐｏａ＋ａｔｉａ　レクチンＰａ合２２１　 ±１５０　５２ＬＬ”　、　Ｈｅ１ｌｘ　ｐｏｌｌ＋ａｔｉａ　レクチン未結合 　２１８　±１１４　５３例９ Ｉ　ＥＦ５及び６を２０ｗ１Ｍトリス／ＩＩＩＩＭＥＤＴＡＳｐＨ７，５に対し て透析した後、ＹＭ−１０膜を用いて１０倍に濃縮した。０．３１の分量を、ト リフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）を０．１％の濃度まで加えることによって酸性に した後、遠心分離を行って沈澱を除去した。上澄液を、３０％アセトニトリル１ ０．１％ＴＦＡで平衡にしたＰＬＲＰ−Ｓ逆相ＨＰＬＣカラム（ポリマーラボラ トリーズ（ＰｏｌｙＩＩｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））に注入し、３０分 を要して６０％アセトニトリル１０．１％ＴＦＡに達するまで線形グラディエン ドで展開した。溶出液の吸光度を２２ＯｎＩｌ（図５）で観察し、グラディエン ドに亙り画分を収集した。選択された画分をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で 処理し、銀で染色したところ（図６）、出発物質中に含まれるタンパク質のほと んどが回収され高度に分割されることを示した。

これらのデーターは、防御画分における抗原は、逆相ＨＰＬＣによって良好に分 割することができることを示していたが、更に検討を行ったところ、この物質は 予防接種を行ってもモルモットに対して最早防御性でないことが判った。恐らく 、抗原画分を逆相ＨＰＬＣで用いた溶媒で処理することにより、この抗原が変性 して、元の抗原の構造とは最早類似しなくなったものと思われる。

例１Ｏ 洗浄剤を除去し、試料を濃縮し、塩を除去し、抗原をアミノ酸配列分析に好適な 緩衝液中に交換するために、約４５ｋＤのレンチルレクチン結合、Ｈｅ１Ｌｘ　 ｐｏｍａｔｉａ結合抗原をポリポア（Ｐｏｌｙｐｏｒｅ）フェニルＲＰ　（３０ Ｘ２、　１ｍｍ）カラム上で逆相ＨＰＬＣによって分画し、２０分間を要して０ ．１％ＴＦＡ／１０％アセトニトリルから０．０７％ＴＦＡ／７０％アセトニト リルのグラディエンド（流速２００μｍ／分）で分割を行った。

４５ｋＤの抗原をグラディエンドの中心に向かって溶出したところ、小さな肩を 有する主ピークとして得られた。

２ａの両分を別個に収集したが、得られたＮ−末端アミノ酸配列データーに基づ いて同じポリペプチドから成るものと思われた。

これらの画分のＮ−末端アミノ酸配列を、アプライド・バイオシステニス（Ａｐ ｐｌｉｅｄ　Ｂｔｏｓｙｓｔｅｓｓ）４７０　Ａ型アミノ酸配列分析装置で気相 配列決定することによって決定した。下記の配列が傳られた。

ＡＦ　ＸＰＧ　ＳＮＮＧＭ（Ｔ）ＤＢＩＲＱＩＦ（Ｖ）（Ｄ）（Ｋ）（Ｙ）（） Ｉ）　（Ｄ）（Ｎ）　（Ｓ）　（の（Ｇ）（Ｐ）　（Ｐ）　（Ｐ） （Ｄ） 更に、４５ｋＤ抗原の試料をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動法によ って精製し、ニトロセルロースに移し、ボンシュー・ニス（Ｐｏｎｃｅａｕ　Ｓ ）で染色し、４５ｋＤの抗原を含むニトロセルロースの部分を切断してエンドプ ロテイナーゼＬｙｓ−Ｃと共にインキュベーションを行った。消化によって生成 したペプチドを逆相ＨＰＬＣによって分離し、前記と同じ方法によって配列決定 した。下記の配列が得られた。

（Ｋ）Ｘ　Ｘ（Ｐ）（Ｄ）ＸＥＶＥＡＮ（Ｔ）Ａ　Ａ　ＹＡ（Ｎ）Ｅ（Ｅ）（Ｙ ）　（Ｓ） （Ｋ）　Ｄ　ＮＥＹＲ３ＬＩＡＸＸ（ω　（Ｑ）　化）Ｘ（Ｓ）　（Ｅ） （Ｈ） （Ｇ） （Ｋ）　（Ｌ）　（Ｄ）　（Ｃ）　Ｆ　Ａ　Ｐ　Ｋ　Ｘ（Ｄ）　（Ｇ）　（Ｄ） （Ｇ）　（Ａ） （Ａ） （Ｋ）　（Ｈ）　ＮＥＹ　Ｒ（Ｓ）　Ｉ　化）（＾）　（Ｋ）　（Ｐ）　Ｘ　（ Ｌ）　（Ｎ）　Ｘ（Ｋ）　Ｘ　（Ｐ）　Ｙ　（Ｄ）　Ｘ　（Ｄ）　Ｖ　Ｘ　Ａ　 （Ｄ）　Ｘ　Ｘ　Ｘ　（Ｔ）　（Ｐ）　（Ｐ）　Ｘ（Ｇ）（Ｋ）（Ｐ）　（Ｔ） 　（Ｔ） （Ｄ）　（Ｅ） Ｘは、アミノ酸を特定の位置に特定することが出来ないことを表わしている。括 弧内の残基は、他の残基よりも特定に自信がない。幾つかの場合に、特定のサイ クルにおける２または３個の残基を特定することが不可能であったので、その場 合にはそれらを互いの下に示している。それぞれのペプチドの最初の残基は、エ ンドブロチると仮定している。

これらの配列は、Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓＲＮＡ　（相補性ＤＮＡライブラリー ）またはＤＮＡ　（ゲノムライブラリー）、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ Ｒ）のプライマーとして用いて生成した遺伝子ライブラリーに抗原をコードする 遺伝子を同定するためのハイブリダイゼーションプａ−ブとして用いるのに好適 なオリゴヌクレオチド配列の設計に好適である。

例１０に記載のアミノ酸配列から、４５ｋＤの抗原をコードする遺伝子（類）を 同定するためのｃＤＮＡ及びゲノムライブラリーのスクリーニングに用いること ができるオリゴヌクレオチドを調製した。更に、このオリゴヌクレオチドはＰＣ Ｒ（サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、１９８８年）におけるオリゴ（ｄＴ）と共に用い て、４５ｋＤタンパク質をコードするＤＮＡを増幅することができた。

下記の多縮重プライマー（ＩＩｌｕｌｔｉｐｌｙ−ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｐｒｉ ｍｅｒｓ）を、アプライド・バイオシステム・モデル（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ ｓｙｓｔｅａ　Ｍｏｄｅｌ）　３８０　Ａ自動化ＤＮＡ合成装置で設計して合成 した。必要なアミノ酸配列をコードするのに必要なヌクレオチドに追加のヌクレ オチドは、オリゴヌクレオチドの５′末端上に含まれた。これらの配列は、制限 酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｍａｌの部位をコードして、ＰＣＲで増幅したＤＮＡの適 当なベクターへのクローニングたすける。ＰＣＲで用いられるオリゴ（ｄＴ）プ ライマーも合成した。このプライマーも、ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩ制限部位を含 んでいた。

Ａｌ１２／３０１ ＧＣＧＡＡ下ＣＣＧＧＧ、ＧＣＡ　、ｍ、ＣＡＴ　、ＣＣＧ、ＧＧＧ、ＡＡＣ、 ＡＡＣ，ＡＡＣ，ＧＧＧ、ＡＴＧ　、ＡＣＧ、ＧＡＣ，ＧＴＣＣＡＡＴＴＴＡ　 ＡＴ ＧＣＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧ、ＯＣＡ　、Ｔ口’、ＣＡＴ、ＣＣＧ、ＧＧＧ、Ｔ ＣＣ，ＡＡＣ，ＡＡＣ，ＧＧＧ、ＡＴＧ、ＡＣＧ、ＧＡＣ，f Ｔ　ＣＣＡ　ＡＡＧＡ　Ｔ　Ｔ　Ａ　Ａ　ＴＡ１１２／３０２は、５′末端から ６番目のコドンを除いてはＡ、１１２／３０１と同一である。これをＡＡＣ／Ｔ からＴ／ＡＣ／ＧＧ／Ａ／Ｔ／Ｃに変更して、アミノ末端配列に見られる混合シ グナル、すなわちアスパラギン（Ａ、　１１２／３０１）またはセリン（Ａ１１ ２／３０２）を説明した。

（ｂ）　ＲＮＡ単離及びｃＤＮＡライブラリーの構築総ＲＮＡを、ファルマンア から購入したＲＮＡ抽出キット（カタログ番号ＸＹ−０１６−００−０１）を用 いて１．　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓｌ　ｇ　（湿重量）から単離した。脱硝した（ｅ ｘｓｈｅａｔｈｅｄ）　Ｌ　３ステージの寄生虫を感染させてから１５日後に、 ヒツジの皺胃から幼虫を得て、液体窒素中で手早く凍結した後−７０℃で保存し た。ＲＮＡを抽出するため、凍結した虫を液体窒素下で微粉砕し、７ｍｌの抽出 溶液（グアニジンチオシアネート、Ｎ−ラウリルザルコシン及びＥＤＴＡを含む 緩衝した水性溶液；２５℃における密度−１，１５ｇ／ＩＩ）に加え、１３Ｘ５ １ｓ■のポリアロマ−チューブ中２Ｘ１．２５ｓ＋ＩのＣ５ＴＦＡ（ＣｓＴＦＡ を含む緩衝した水性溶液；２５℃における密度−１，５１ｇ／ｇｌ）のクッショ ンに重層した。このグラディエンドを、Ｌ８−７０ベツクマン（Ｂｅｃｌｖａｎ ）超遠心機で５Ｗ５０．１０−ターを用いて３１．００Ｏｒｐｍで、１５℃で１ ６時間遠心分離した。遠心分離の後、ＲＮＡのペレットをＴＥ緩衝液（１０１１ Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解し、−２５℃でエタノ ールから再沈澱した。次に、沈降したＲＮＡを再度ＴＥに溶解し、オリゴ−（ｄ Ｔ）−セルロースカラム（ファルマシアｍＲＮＡ精製キット、カタログ番号ＸＹ −０１２−００−０２）中で、製造業者によって記載された方法で遠心分離する ことによって更に精製した。

得られる精製したポリ（Ａ）　＋ＲＮＡを、ファルマシアｃＤＮＡ合成キット（ カタログ番号ＸＹ−００３−００−０３）を用いてｃＤＮＡライブラリーを構築 するのに用いた。簡単に説明すれば、３２５μｇの総ＲＮＡから精製したポリア デニル化ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）　の存在下にて、モロニーのネズミ白血病ウ ィルス逆転写酵素（Ｍｏｌｏｎｅｙ　Ｍｕｒｌｎｅ　ＬｅｕｋａｅｍｉａＶＩｒ ｕｓ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｌｐｔａｓｅ）で処理した。第二の鎖の 合成は、ＲＮアーゼＨおよび大腸菌ＤＮＡポリメラーゼｌを用いて行った。２水 路ｃＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメントで処理し、ＥｃｏＲＩ ／Ｎｏｔｌアダプターに連結した。次いで、ｃＤＮＡをＴ４ポリヌクレオチドキ ナーゼで処理して、これをホスホリル化して、ＥｃｏＲＩで消化して脱ホスホリ ル化したラムダｇｔｌＯアームに連結し、イン・ビトロで感染性のバクテリオフ ァージ粒子（フロトクローン・ラムダｇｔ　１０システム及びバッカジーン・シ ステム、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）　）中に製造業者の記載にしたがって包装 した。包装されたｃＤＮＡを大腸菌Ｃ６００Ｈｆｌに移し、１０ｍＭＭｇＳＯ４ を含むルリア（Ｌｕｒｉａ）　）ツブ寒天を用いてルリア寒天プレート上で培養 した。総数で６×１０７ｐｒｕが得られ、その内の９８％が組換体であった。平 均インサートの大きさは２．０ｋｂｐであった。

（Ｃ）　組換えライブラリーのスクリーニング用のＤＮＡプローブの調製 ４５ｋＤの抗原特異性の二本鎖ＤＮＡプローブを、ＰＣＲを用いて調製した。用 いた方法はサイキ（Ｓａｉｋｊ）ら（１９８５年）によって記載された方法に基 づいており、クローン化した形態のＴａｑポリメラーゼ（バーキシークス ン昏エルマー・キ＋）云（Ｐａｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）を用いた。

２μｇの総ＲＮＡを、６μｌの水中で１１００ｎのオリゴ（ｄＴ）ＰＣＲプライ マーに、７０℃で５分間加熱した後、室温まで放冷することによってアニールし た。アニールしたＲＮＡ−オリゴ（ｄＴ）を、次に５０ＩＩＭトリスーＨＣｌ　 （ｐＨ８，３）　、７５ａ＋ＭＫＣＬ　１．０ｍＭＭ　ｇ　Ｃｌ　２．５ｍＭス ペルミジン、１０ｄＤＴＴ、１単位のＲＮアシンの存在下にて、２００単位の逆 転写酵素（ＢＲＬ）と共に、最終容積が２５μｌで３７℃で１時間インキュベー ションした。逆転写酵素を省いた同様な反応を、ＰＣＲ反応のネガティブコント ロールとして用いた。

ＰＣＲは、前記のようにして製造したｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ上で行った。反応混合物は 、１μｇの総ＲＮＡ、Ａ１１２／３０１またはＡ１１２／３０２の一方をそれぞ れ１μＭ及び１μＭオリゴ（ｄＴ）ＰＣＲプライマー、それぞれのｄＮＴＰを２ ００μＭ、　５０ｍＭＫＣＩ、　１０ｍＭｌ−リス−ＨＣ１（ｐＨ９，０）　、 ２ｍＭＭｇＣｌ　２．０．０１％ゼラチン、０．０１％トライトンＸ−１００及 びＴａｑポリメラーゼ２単位として総容量を１００μｍとしてものから合成され た第一の鎖状ｃＤＮＡを含んでいた。増９４℃での１分間の変性、４０”Ｃでの ２分間のアニーリング、及び７２℃での３分間の拡張から成っていた。

それぞれＰＣＲ反応の試料を、反応終了時に０．８％アガロースゲル上で分析し た。

プライマーＡ１１２／３０１とオリゴ（ｄＴ）を含む反応では、約６５０ｂｐの 独特なバンドが観察された。

数個の他のバンドが存在したが、これらのバンドはオリゴ（ｄＴ）のみを用いた 反応でも見られた。プライマーＡ　１　ｉ　２／３０２ヲｍＬ１だトキニハ、約 ６５０ｂｐのバンドは見られなかった。逆転写酵素を省いたネガティブコントロ ール反応では、バンドは見られなかった。

約６５０ｂｐＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル上で電気泳動 によって精製し、通常の手法（マニアチス（Ｍａｎｊａｔｉｓ）ら、１９８２年 ）を用いてビー・ブルースクリプト・ニスケイ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｊｐｔ　５Ｋ ））　（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に連結し、ジテオキシ連鎖 停止法（アメルシャム・マイクロタイター・プレート・シーフェンシング・キッ ト（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ　ＰｌａｔｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎ ｇ　Ｋｉｔ）、カタログ番号ＲＰＮ１５９０）を用いて配列決定した。クローン の両端の配列分析から、　゛５′末端にはプライマーＡ１１２／３０１及び３′ 末端にはポリ（Ａ）ストレッチの配列か含まれていることが確かめられた。更に 、プライマーＡ１１２／３０１に対応する領域の３′末端から直ぐ下流の１８個 のヌクレオチドの１４は、精製したタンパク質のアミノ酸配列から予言されたも のに対応した。これはアミノ酸水準で８６％の相同性である（Ｎ末端配列決定か ら生じた２１の内の１８個のアミノ酸）。精製抗原から得られたアミノ酸配列と ＰＣＲクローンのＤＮＡ配列から予言されたアミノ酸配列との間の差異は、精製 タンパク質のアミノ末端配列分析における不明確さおよび／またはＰＣＲ取り込 ろ誤差によって説明されるが、これは多数の差異を仮定すれば疑わしい説明であ る。ＰＣＲクローンを成長させ、ＤＮＡを単離し、Ｅ　Ｃｏ　ＲＩで消化し、イ ンサートをを精製してハイブリダイゼーションプローブとして用い、この例の（ ｂ）に記載されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。

約１０ｐｆ’ｕを、２　Ｘ　１０　”ｃｐｍ　／ａｌｌのプローブ、５ＸＳＳＰ Ｅ、５×デンハート溶液、０．５％（重ｌＩ／容量）ＳＤＳ及び２０μｇ／ｌｌ １１の剪断し、変性したサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で５５℃でライブラリーの ニトロセルロースフィルター複製のハイブリダイゼーションによってスクリーニ ングした。フィルターを６０℃で０．５ＸＳＳＣで洗浄した後、０．１％ＳＤＳ 及びオートラジオグラフィ処理を行ったところ、１６個の陽性プラークが同定さ れた。これらのうち、８個を次の精製及び分析に用いた。ＥｃｏＲＩインサート を精製したファージＤＮＡから単離し、ピー・ブルースクリプトＳＫ−にサブク ローンして更に分析を行った。これらのクローンの一つｐＢＴＡ８７９の配列を 、図７に示す。

１３３６（！ｌのヌクレオチドから成り、その後に翻訳終止コドンＴＧＡが続い た単一の長い転写読み取り枠がある。このクローンの転写読み取り枠は、クロー ンの５′末端から伸びている。配列のこの領域に含まれるメチオニン開始コドン はないので、このクローンは完全なコード領域を表わしてはいないと思われる。

ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列（図７）から誘導されるアミノ酸配列を詳細に検討すると、 精製した４５ｋＤのタンパク質のアミノ酸配列と相同性の領域はｃＤＮＡクロー ンの５′末端からヌクレオチド６５で始まり、予言されたアミノ酸の１１は次の １６個の残基に亙って生じていることが判る。更に、配列のヌクレオチド７７３ で始まるＮ−末端配列との相同性を有する第二の領域がある。１９個のアミノ酸 のうち、１４個の残基は、タンパク質配列から決定されたものと同一である。ア ミノ酸水準での相同性の水準は７３．７％であった。分子内には、反復ドメイン がある可能性があると思われる。相同なこれらの領域の両方を二重下線によって 図７に示す。

精製タンパク質から誘導されるエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃペプチド配列と 相同性を分けあっている予言されたアミノ酸配列内の他の領域は、図７に（−重 下線によって）示されている。これらの領域は総て、分子のカルボキシ−末端の 半分内にあり、総てはアミノ酸２５３に対してカルボキシ末端である部分にある 。

更に、プロテイナーゼ消化を極めて受けやすいと仮定されていたペプチド配列と 同様なヌクレオチド７７３で始まる配列の直ぐ前の領域がある。

ヌクレオチド６５で始まるものに対するアミノ酸配列Ｎ−末端は疎水性が高く、 シグナルペプチダーゼによって認識されるものと同じアミノ酸を含んでいる。

これらの分析の最も可能性のある説明は、図７に記載されているｃＤＮＡクロー ンが、Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓから単離された元の糖タンパク質に関連している が同一ではない糖タンパク質をコードすることである。ｃＤＮＡクローンは完全 な長さのタンパク質をコードせず、少なくとも１個の完全なシグナルペプチドは 、図７に示されている物に優先し、完全な長さの元の分子には更にアミノ酸が存 在することができるということが可能である。

完全な長さの元の４５ｋＤの抗原をコードするｃＤＮＡクローンを単離するため に、ｃＤＮＡライブラリーをｐＢＴＡ８７９から単離したフラグメントでスクリ ーニングした。この例の（ｂ）に記載のｃＤＮＡライブラリーも、ハイブリダイ ゼーションプローブとしてのｐＢＴＡ８７９のＥｃｏＲＩバンドを用いてスクリ ーニングした。約１０５ｐｆｕを前記と同じ条件を用いてスＳＳＣで洗浄した後 、０，１％ＳＤＳ及びオートラジオグラフィ処理を行ったところ、１６個の陽性 プラークが同定された。これらのうち、１１個のＥｃｏＲＩインサートを精製し 、ビー・ブルースクリプトＳＫ−にサブクローンして更に分析を行った。これら のクローンの一つｐＢＴＡ９６３の配列を、図８に示す。これは、１３２０個の ヌクレオチドとその後に翻訳終止コドンＴＡＡが続いた転写読み取り枠を含んで いる。

また、このクローンは開始メチオニンを含まないが、このクローンの５′配列に よってコードされる１８アミノ酸の１６個は元のＮ−末端アミノ酸配列と同一で ある。

この相同性の領域は塩基５０またはアミノ酸１２で始まり、第二の反復は塩基７ ２２で始まることを見出だすことができる。両領域を二重下線で示す。他のペプ チド配列もｐＢＴＡ９６３からの翻訳されたアミノ酸配列に位置することができ る。これらはｐＢＴＡ８７９で見られるよりもペプチド配列に関して遥かに高い 相同性を有する。はとんどの場合に、この相同性は１００％である。

２つのタンパク質配列の他の特徴は極めて類似している。両者共に疎水性のリー ダー配列セグメントを有し、両者とも分子の中央に向かうペプチダーゼ感受性領 域を有し、且つこれらは分子量及び全般的荷電が類似している。しかしながら、 両者は、相同性は場所によっては、特にペプチド配列が誘導される場所ではかな り高いが、全般的なアミノ酸配列では相同性は約５４％でしかない。

クローン化した遺伝子が精製抗原のコードを確保するため、ＥｃｏＲＩフラグメ ントを元のＰＣＲクローンがら単離して、Ｉ　ＰＴＧによって誘導される細菌性 発現ベクターに挿入した。遺伝子生成物を単離し、精製し、ヒツジを予防接種す るのに用いた。これらのヒツジから得られた血清を用いて、Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔ ｕｓの４５ｋＤ糖タンパク質及びホモゲネートのウェスターンプロットをプロー ブした。いずれの場合にも、ＩＥＦ画分１〜１０中の見掛けの分子量が４５ｋＤ の抗原は、抗血清と特異的に反応することを見出した。ＤＮＡ配列から予言され た配列を有する２４個のアミノ酸の長さのペプチドに対して生じた抗体も、ＩＥ Ｆ画分１〜１０中の４５ｋＤの抗原と反応した。

全寄生虫ホモゲネート及び組換え抗原を予防接種したヒツジ由来の血清で分割し たそれぞれの広範囲のＩＥＦ画分のウェスターンプロットを詳細に検討すること により、実際に予防接種後血清と特異的に反応する更に高分子量の寄生虫成分が あることを見出した。これらの更に高分子量成分は、単離した抗原と同じ遺伝子 類の生成物であると思われる。それらは特にｒＥＦ画分２．３及び４に配置し、 等電点電気泳動を不鮮明にするものと思われる。ＩＥＦによる分画時にシャープ なバンドとして集束しないこの現象は糖タンパク質に特徴的なものであり、可変 の炭水化物残基が分子上の荷電を不均一にし、分子の数のｐｌを不均一にするの である。

それ故、寄生虫から単離された元の４５ｋＤの抗原は、分子の殻部分に亙って同 様なアミノ酸配列を分は合うタンパク質のクラスの一員である。これは、両Ｅｃ ｏＲＩインサート（図９）を用いてＨ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓゲノムＤＮＡのサザ ンブロツティング分析によって更に支持される。

これらは、ｐＢＴＡ９６３が様々な強度で多くのバンドとハイブリダイゼーショ ンしていることを示している。

１４８０．８９０及び７４０塩基対のバンドは、最も強くハイブリダイゼーショ ンしている。しかしながら、ｐＢＴＡ８７９でスクリーニングした同じプロット は、１３５０塩基対のバンドと共にこのプローブと弱く結合している８９０及び ７４０のバンドを照らし出すのである。

ウェスターンプロットからは、タンパク質類の幾つかの物は６５ｋＤを超過する 分子量を有することがあるものと思われる。本明細書の例４及び５のＩＥＦ画分 ２．３及び４を予防接種したヒツジ及びモルモットに与えられる防御は、ここに 記載した防御抗原の一層高分子量の形態が存在することによる可能性もある。

このクローンのものに対する有意な相同性を有するＤＮＡまたはタンパク質配列 は、シーンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）、ＥＭＢＬまたはＰＩＲコンビニ−ターデ ーターベースを検索した後にも見出すことは出来なかった。

例１２ 防御抗原の遺伝子に関連した相同遺伝子は、他の種の寄生性線虫に存在する ＤＮＡハイブリダイゼーション（またはサザンプロット分析）を標準的手法（マ ニアチスら、１９８２年）を用いて行い、寄生性線虫の他の種がＨ，Ｃ０ｎｔＯ ｒｔｕＳの防御抗原をコードするものと「相同なＪ遺伝子を有するかどうかを決 定した。例１１（図８）に記載のｃＤＮＡクローン１ＢＴＡ９６３のＥｃｏＲＩ インサートを、寄生性線虫の他の種の一員から単離されるＤＮＡに対するハイブ リダイゼーションプローブとして用いた。このプローブは、相同な種、すなわち Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓから単離されたＤＮＡ中の数個の制限フラグメントに協 力にハイブリダイゼーションすると同時に、予測されるように、Ｏｓｔｅｒｔａ ｇｉａ　ｃｉｒｃｕＩＩｌｃｆｎｃｔａ　、　Ｏｓｔｅｒｔａｇｆａ　ｏｓｔｅ ｒｔａｇｉ及びＴｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒＩＩ ｌｉｓから単離されたＤＮＡの特異的な制限フラグメントにもハイブリダイゼー ションした。これらのプロットを十分に洗浄したところ、相同性の水準は約７０ ％であることが示された（図１０）。

これは明らかに、他の種の寄生性線虫及び拡張すれば、総ての種の寄生性線虫の 防御抗原をコードする遺伝子に密接な関連を有する遺伝子があることを示してい る。

単離することができ、他の種の寄生性線虫から関連したまたは相同の抗原を合成 する組換え生物を作成することができた。本発明者らは、これらの関連した抗原 は他の種の寄生虫による感染から予防接種した動物を防御する有効な免疫原とし ての働きをするものと考えている。更に、広範囲の寄生性線虫から単離された関 連抗原を単離し、広範罪名これらの寄生虫による感染から動物を防御する有効な 防御性免疫原を提供することができた。

この方法がうまくゆくことは既に示されている（国際出願節ＰＣＴ／Ａ０８８１ ００２３９号明細書）。この特許出願明細書には、モルモットをＴ、　ｃｏｌｕ ｂｒｉｒｏｒｍｉｓによる攻撃感染から防御する抗原の能力に基づいてＴ、　ｃ ｏｌｕｂｒｉｒｏｒｍｉｓのホモゲネートからこの抗原を精製する方法が記載さ れている。この抗原に就いてのアミノ酸配列情報が決定され、この遺伝子により 組換えＤＮＡライブラリーから単離される抗原をコードすることができる。次に 、Ｔ、　ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓをコードするＤＮＡをハイブリダイゼーシ ョンプローブとして用いて、Ｈ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓからの「相同」遺伝子をコ ードする紹換え生物を同定した。次に、Ｉｌ、　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ抗原を合成 する組換え生物を構築し、この抗原を用いてヒツジ及びモルモットの予防接種及 び攻撃試験を行った。ｔ（、ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ組換え抗原はＨ，Ｃｏｎｔｏｒ ｔｕｓによる感染から予防接種したヒツジを防御し、Ｔ、　ｃｏｌｕｂｒｉｒｏ ｒｍｉｓによる攻撃感染からモルモットを防御した。

このことは、前記のハイブリダイゼーション実験において示されたＤＮＡ配列の 相同性を仮定すると、ある種の寄生性線虫由来の防御抗原をコードするクローン 化したＤＮＡ配列を用いて、他の種の寄生性線虫由来の相同遺伝子生成物をコー ドするクローンを同定し、相同遺伝子を発現する組換え生物を設計し、これをワ クチンに使用して、寄生性線虫の他の種から防御することが可能であることを示 している。ここに提供された結果の自然な拡張は本発明のＤＮＡ配列でこれを行 うことであると考えられる。

相同遺伝子のヌクレオチド配列及び相同抗原のアミノ酸配列は、第一の標的種の 物と同一でないことがあるが、少なくとも６０塩基対の長さに亙って少なくとも ５０％だけ関連付けられ、好ましくはこの関係はこの同じ領域に亙って７０％以 上であり、アミノ酸水準では２０個のアミノ酸に亙って少なくとも７０％が相同 であることを理解すべきである。大抵の場合には、この相同性の程度は、２つの 遺伝子またはタンパク質の関連性を明確に同定するのに十分である。

例１３ 大腸菌における４５ｋＤの発現 多数の系を用いて組換え４５ｋＤ抗原、例えば補乳類の細胞、ウィルスに感染し た昆虫細胞、酵母または細菌を発現させることができる。例えば、遺伝子は大Ｍ Ｉｈ菌で発現した。ｐＢＴＡ９６３由来の完全なｃＤＮＡフラグメントを１３８ ６塩基対のＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　１フラグメントとして単離し、大腸菌 発現ベクターｐＢＴＡ９５４中にサブクローニングした。

ｐＢＴＡ９５４はｌａｃプロモーター、β−ガラクトシダーゼ遺伝子に対する開 始アミノ酸及び多重クローニング部位を有するｐＵＲを基材とするベクターであ る。１ｍＭＩＰＴＧを添加して発現を誘導すると、これは４５ｋＤのタンパク質 に融合したベクターによってコードされる１１個のＮ−末端アミノ酸を有する融 合タンパク質を精製した。この融合タンパク質の見掛けの分子量は約６１ｋＤで あった（図１１ａ）。融合タンパク質は、４５ｋＤのタンパク質の切断されたＮ −末端に対応するペプチドに対して生じるウサギ血清によって認識された（図１ １ｂ）。この血清は、以前に、元の抽出物ＩＥＦ画分１における°支配的タンパ ク質を認識することが示されている。

融合タンパク質は、当該技術分野に知られている標準的手法によって精製し、適 当なアジュバントと配合し、ヒツジのような宿主の予防接種に用い、寄生虫の感 染から防御することができた。

例１４ ４５ｋＤ抗原及びＤｌｒｏｒｉｌａｒｊａ　ｉａｍｉｔｉｓタンパク質に対する 抗体の間の免疫学的交差反応性 ウサギを、４５ｋＤ抗原のＮ末端領域の配列から誘導される合成ペプチドで予防 接種した。これらのウサギからの抗血清を用いて、Ｄ、　Ｉａａｌｔｌｇ及びＨ ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓの成虫からの抽出物のウェスターンプロットをプローブし た。

アルカリホスファターゼに抱合した第二の抗体で展開した後、それぞれの種由来 の２種類の抗原は反応性であることを示した。４５ｋＤ及び２７ｋＤの性分をＨ ，ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ抽出物で検出し、５２及び３２ｋＤはり、　１ａｕａｉｔ ｉｓ抽出物で検出した（図１２）。この結果は１、ＤＮＡハイブリダイゼーショ ン手法を用いて、４５ｋＤ抗原に関連したタンパク質はり、　１ｍ５ｉｔｉｓ中 に存在し、発現するという他の観察を支持する。

これまでに記載された製造及び精製技法は、実験室規模で行われる。本発明の抗 原の商業的生産のために、形質転換宿主の大規模な醗酵が必要である。

大規模醗酵は標準的な手法によって行われ、選択される特定の手法は、抗原の生 産に用いられる形質転換宿主に好適である。

微生物の寄託 プラスミドｐＢＴＡ８７９を含む大腸菌Ｊ　Ｍ　１０　］、のＢＴＡ２０３３株 を、１９９２年１月２９日にブダペスト条約の規定によりオーストラリアン・ガ バメント・アナリティカル・ラボラトリーズ（Ａｕｓｔｒａｌ　ｊａｎＧｏｖｅ ｒｎｍｅｎｔ　Ａｎａｌｙｔｌｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　１、スア キン・ストリート、ビンプル２０７３、二ニー・サウス・ウェールズ、オースト ラリアに、登録番号Ｎ９２／４３８７で寄託した。

大腸菌ＪＭＩＯＩの遺伝子型は、Δ（ｐｒｏ−１ａｃ）である。Ｆ’　１ａｃｌ ｑΔＭ１５．ｔｒａＤ１．　λ−０ｐＢＴＡ８７９は、胃腸の線虫Ｈａｅｍｏｎ ｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓからの抗原タンパク質の一部をコードする１４０ ０塩基対のＥｃｏＲＩインサートを含むｐＢＬＵＥＳＣＲＩ　ＰＴ−５Ｋ−マイ ナス（ストラタジーン、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）である。

プラスミドｐＢＴＡ９６３を含む大腸菌５ＵＲＥ株であるＢＴＡ２１２５株を、 １９９２年１月２９日にブダペスト条約の規定によりオーストラリアン・ガバメ ント・アナリティカル・ラボラトリーズ（Ａｕｓ　ｔ　ｒａ　Ｉ　ｔａｎＧｏｖ ｅｒｎｍｅｎｔ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｔｅｓ）　１、ス アキンーストリート、ビンプル２０７３、ニュー・サウス・ウェールズ、オース トラリアに、登録番号Ｎ９２／４３８８で寄託した。

大腸菌５ＵＲＥＳＢＴＡ２１２５株の遺伝子型は、大腸菌ＳＵＲＥＴＭ株（スト ラタジーン、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）、遺伝子型＋ｍｃｒＡ。

Δ　（ｍｒｒ、ｈｓｄ　ＲＭＳ　ｍｃｒＢＣ）。

ｅｎｄＡｌ、５ｕｐＥ４４．　ｔｈｉ−１，λ−１ｇｙｒＡ９６．　ｒｅｌＡｌ 、Ｉａｃ、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＪ、５ｂｃＣ，ｕｍｕＣ：　：Ｔｎｒ　（ｋａｎＲ ）。

ｕｖｒＣ，ＩＦ’　、ｐｒｏＡＢ、１ａｃＩｑＺΔＭ１５゜ＴｎｌＯ（ｔｅｔＲ ））。

ブ、ラスミドｐＢＴＡ９６３は、胃腸の線虫Ｈａｅｉｏｎｃｈｕｓｃｏｎｔｏｒ ｔｕｓからの抗原タンパク質の一部をコードする１３８６塩基対のＥｃｏＲＩイ ンサートを含むｐＢＬＵＥｓｃＲＩＰＴ−ＳＫ−マイナス（ストラタジーン、サ ンディエゴ、カリフォルニア、米国）である。

産業上の利用 本発明は寄生性線虫による感染から動物を防御するのに好適な抗原、ワクチン及 び抗体を提供するのに有用である。

文献 マニアチス、ティー（Ｍａｎｌａｔｌｓ、　Ｔ）　、フリッチ、イーエフ（Ｆｒ ｌｔｓｃｈ、　ＥＦ）及びサンプルツク、ジエイ（ＳａＩＩｌｂｒｏｏｋ、　Ｊ ）　（監修）（１９８２年）分子クローニングニア拳ラボラトリ−・マニュアル ・シーエスエイチ◆ラボラトリ−（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｔｏｎｉｎｇ：　Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌＣ８＋Ｉ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コー ルド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）。

サイキ、アールケイ（Ｓａｉｋｉ、　ＲＫ）　、ゲルファント、ディーエイチ（ Ｇｅｌｆａｎｄ、　ＤＨ）　、ストッフェルス（Ｓｔｏｒｆｅｌｓ）、シャーフ ・エスジエイ（Ｓｃｈａｒｆ、　ＳＪ）、ヒグチ、アール（）ｔｉｇｕｃｈｉ、 　Ｒ）、ホーン、ジ−ティー　（Ｈｏｒｎ、’　ＧＴ）、ムリス、ケイビー（Ｍ ｕｆｔｉｓ　ＫＢ）及びエールリッヒ、エイチェイ（Ｅｒｌｉｃｈ　ＨＡ）　（ １９８８年）、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼによる特定プライマーのＤＮＡの 増幅（Ｐｒｉｍｅｒｄｆｒｅｃｔｅｄ　ａｎ＋ｐｒｉｒｔｃａｔｉｏｎ　ｏｒＤ ＮＡ　ｖｔｔｈ　ａ　ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅＤＮＡ　ｐｏｌｙＩＩｌｅｒａ ｓｅ）　、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３９．４８７−４９１゜旦二二 １２３４５６Ｓ Ｆｉｇ　４゜ ｒｉｇ引１７゜ 賀Ｚ応肩１芯（：Ｒで刀Ｚジ万扉でご１濤（訝りぼ双Ｉ…箸Ｉ７蟇Ｔｒｐ　Ｔｈ ｅ　工１ａ　Ａユｈ　Ｇｌｙ　（ｙｍ　入ｓｎ　ＴＹｔ　八ｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌ ｙ　Ｇｌｙ　Ｍｐ　Ａｉｎ　Ａユａ　ｔｙｒ　嘯窒吹@ｌ／ａ↓ 、６１１４　５１３　６２２　５３１　６４０　６４９乙でジＺ　ＨＸＥ　市部 仄り１でゴπに怠双テびＺ釦てつＺ賀で凋ズＲ汗ばテ次ぽ−Ｖａｌ　ｉｒｃ上ｕ ｌＥτ　ＧよＹ　Ａｌｐ　ｐｒｏ　ＬＪ露　Ｔｈｅ　丁ｈ【　＾ｓｐ　＾１轟　 入ｓｐ　ｃｙｓ　ｈｙｓ　ｃｙｓ　人↓＝@Ｇｉｙ Ｃ口ｎζ／、。

・・・・／Ｆ＋　５７　ｃ　ｍ−ｔｓ−ｇ　Ｊｇｓｇ　！！７　６］ｇ　６８５ 　５９４　フａ３−２瀝〒賀＝で工ζ；り２ヌでま〒七＝でζゴζズ臥トダ」ご で＝でツＣｙｓＶＡＬＣｙｓＳａｔＧｉｎＧｌｕＧｌｕ入上１ムｔｕＣｙｓ！１ ｓＰｅａデｔｏＧＬｕｒｙｅτｈｅデｔｏＬａｕ云だ譚双″５５５コ雇＝４２双 了でテてゴ富君テ仄力２ビ；云２錦Ｚ疋凋ＺＫだＣｙｓτｂ：　Ｐｂｅ、Ｇ↓Ｙ Ｌａｕ　Ａｊｎτｈｒ　ｋＬｈ厄ｘ　ＭＥＴ　Ｌｅａ　Ｌ、ｙｓ　ｋＫｑτｒｐ 　Ｇｌｙ　Ｍｎ　ＡＪｎ　Ｍw’： で２て罵酉菫で巧モ仄双汗フズジＺ双■αＦうａ田πＬ工番ＣτｈｒＭＥフ入ｓ ｎ　Ｍａｌ　’ニアτ丁ｈｒ　τｈ；ルａｕ　Ｓａｔ　Ｌｙｓ　Ｑτ　Ｓｅｒ　 Ｇｉｎ　ムａｕ＾工１τｔｐＧ工ｎ　Ｓａ■ ｌｘｓｇ　工２Ｑフ　エ２工６　１スユ５　１２３４　１２４コ双だζＺぶに可 Ｗ番＊剪天賠可引仄で万賀テ云Ｚ双Ｚ釈１面で茗テ茗てｓａｒ　）Ｊｐ　ＡＥｑ 　工１ｅ　ＧＬｙ　Ｃｙｓ　Ｖａｉ　Ｖａｎ　Ｖａｌ　Ｐｒａ　Ｃｙｓ　丁：ｐ 　５ｅｅ−５ｅｒ　ｒｒｐ　Ｔｈｅ@Ｖａｌ　Ｙａｌ ＝；１≠番示店斥夏巨Ｊｚ番疋響画π）＝寥Ｉ切で胃パ＝ｃｚｙＡＪＰｐｒｏａ ｙｓ丁ＭＬｙｓλｓｐ入上１＾５ｐｃｙ寞Ｃ１ｎＣｙｌｔｗｏａニアＣｙｘＴｈ ｅＬ：’ｆｓＳ＠ｔ二！だＬま・ ６４　７３　８２　９１．　１００　１０９ｘｉｚ１ａ１１９０１９９２０１１ ｚ。

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一７Ｆ＋５１艦ｍａｒ−ｍ−ａａｂＪ ＣλＧτＧＡＡＡＣ＾＾入＾Ｇ（ＧＧ（ｅＣ（Ｇλ＾丁丁Ｃ１３ｇ６Ｄ旦二ｍ 要約書 第−の種の寄生性線虫由来の実質的に精製された抗原であって、宿主にこの抗原 を予防接種することにより第一の線虫種と同一であってもまたは異なる物であっ てもよい第二の線虫種による寄生から宿主を防御することができる抗原であって 、この抗原がタンパク質性であり、ｐｌが３，８〜４，４の範囲にあり、レンチ ルレクチンおよｎｅｌｉｘ　ｐｏａ＋ａｔｉａレクチンに結合し、還元性５ＤＳ −ＰＡＧＥによって測定した分子量が約４５ｋＤであることを特徴とする特許 補正書の写しく翻訳文）提出書慢許錦１８４Ｍ０７１１１１劃

Claims (51)

【特許請求の範囲】
1. １．第一の種の寄生性線虫由来の実質的に精製された抗原であって、宿主にこの 抗原を予防接種することにより第一の線虫種と同一であってもまたは異なる物で あってもよい第二の線虫種による寄生から宿主を防御することができる抗原であ って、この抗原がタンパク質性であり、ｐＩが３．８〜４．４の範囲にあり、レ ンチルレクチンおよびＨｅｌｉｘ　ｐｏｍａｔｉａレクチンに結合し、還元性Ｓ ＤＳ−ＰＡＧＥによって測定した分子量が約４５ｋＤであることを特徴とする抗 原。
2. ２．抗原が少なくとも９０％の純度である、請求の範囲第１項に記載の抗原。
3. ３．非グリコシル化した形の請求の範囲第１項に記載の抗原。
4. ４．第一の寄生性線虫種が、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ 、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｎｃ ｈｕｓ、Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ、Ａｓｃａｒｉｓ、Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓ、Ｕｎ ｃｉｎａｒｉａ、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ、Ｔｏｘｏｃａ ｒａ、Ｎｅｃａｔｏｒ、Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ及 びＷｕｃｈｅｒｅｒｉａ属の種から選択される、請求の範囲第１〜３項のいずれ か１項に記載の抗原。
5. ５．第一の寄生性線虫種が、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ　ｓｐｉｒａｌｉｓ、Ａｎ ｃｙｌｏｓｔｏｍａ、ｃａｎｉｕｍ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ 、Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ、Ｈａｅｍ ｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ、Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ　ｏｓｔｅｒｔａｇ ｉ、Ａｓｃａｒｉｓ　ｓｕｕｍ、Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓ　ｌｅｏｎｉｎａ、Ｕｎ ｃｉｎａｒｉａｓｔｅｎｏｃｅｐｈａｌａ、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ　ｖｕｌｐｉｓ 、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａｉｍｍｉｔｉｓ、Ｔｏｘｏｃａｒａ種、Ｎｅｃａｔｏ ｒ　ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ　ｄｕｏｄｅｎａｌｅ、Ａ ｓｃａｒｉｓ　ｉｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ　ｔｒｉｃｈｉ ｕｒａ、Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ　ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｕｓ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌ ｏｉｄｅｓ　ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ、Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ　ｂａｎｃｒｏｆ ｔｉ及びＯｓｔｅｒｔａｇｉａ　ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｔａから選択される、請求 の範囲第４項に記載の抗原。
6. ６．第二の線虫種が、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ、Ａｎｃｙｌｏｓｔｍａ、Ｓｔｒ ｏｎｇｙｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ、 Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ、Ａｓｃａｒｉｓ、Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓ、Ｕｎｃｉｎａ ｒｉａ、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ、Ｔｏｘｏｃａｒａ、Ｎ ｅｃａｔｏｒ、Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ及びＷｕｃ ｈｅｒｅｒｉａ属の種から選択される、請求の範囲第１項に記載の抗原。
7. ７．第二の線虫種が、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ　ｓｐｉｒａｌｉｓ、Ａｎｃｙｌ ｏｓｔｏｍａ　ｃａｎｉｕｍ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｔｒ ｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ、Ｈａｅｍｏｎｃ ｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ、Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ　ｏｓｔｅｒｔａｇｉ、Ａ ｓｃａｒｉｓ　ｓｕｕｍ、Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓ　ｌｅｏｎｉｎａ、Ｕｎｃｉｎ ａｒｉａｓｔｅｎｏｃｅｐｈａｌａ、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ　ｖｕｌｐｉｓ、Ｄｉ ｒｏｆｉｌａｒｉａｉｍｍｉｔｉｓ、Ｔｏｘｏｃａｒａ種、Ｎｅｃａｔｏｒ　ａ ｍｅｒｉｃａｎｕｓ、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ　ｄｕｏｄｅｎａｌｅ、Ａｓｃａ ｒｉｓ　ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ　ｔｒｉｃｈｉｕｒａ 、Ｅｎｔｅｒｏｂｌｕｓ　ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｕｓ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄ ｅｓ　ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ、Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａｂａｎｃｒｏｆｔｉ　及 びＯｓｔｅｒｔａｇｉａ　Ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａから選択される、請求の範 囲第６項に記載の抗原。
8. ８．第一及び第二の線虫種がＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ属から選択される、請求の範 囲第１項に記載の抗原。
9. ９．第一及び第二の線虫種がＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓである 、請求の範囲第８項に記載の抗原。
10. １０．実質的に精製された形の、請求の範囲第１〜９項のいずれか１項に記載の 抗原の抗原前駆体。
11. １１．純度が少なくとも９０％である、請求の範囲第１０項に記載の抗原前駆体 。
12. １２．グリコシル化されていない形の請求の範囲第１０または１１項に記載の抗 原前駆体。
13. １３．実質的に図８に示されたアミノ酸配列を有し、グリコシル化されたまたは グリコシル化されていない形の抗原前駆体であって、天然に存在するままの抗原 前駆体を除外するもの。
14. １４．実質的に図８に示されたアミノ酸配列のアミノ酸１２〜４４０から成るア ミノ酸配列を有し、グリコシル化されたまたはグリコシル化されていない形の抗 原であって、天然に存在するままの抗原を除外するもの。
15. １５．請求の範囲第１〜１４項のいずれか１項に記載の抗原または抗原前駆体の 相同体。
16. １６．図８に示されるアミノ酸配列に対して２０個のアミノ酸に亙って少なくと も７０％相同である請求の範囲第１５項に記載の相同体。
17. １７．実質的に図７に示されるアミノ酸配列または図７に示されるアミノ酸配列 のアミノ酸１７〜４５４から成る、請求の範囲第１５項に記載の相同体。
18. １８．天然に存在するままのポリヌクレオチド分子を除外するポリヌクレオチド 分子であって、請求の範囲第１〜１７項のいずれか１項に記載の抗原、抗原前駆 体または相同体をコードするポリヌクレオチド分子。
19. １９．ＤＮＡ分子である、請求の範囲第１８項に記載のポリヌクレオチド分子。
20. ２０．ｃＤＮＡ分子である、請求の範囲第１９項に記載のポリヌクレオチド分子 。
21. ２１．実質的に図７または図８に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレ オチド分子、及び実質的に図７のヌクレオチド６５〜１３８１または図８のヌク レオチド５０〜１３３９に対応するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド から選択される、請求の範囲第１８項に記載のポリヌクレオチド分子。
22. ２２．天然に存在するままのＤＮＡ分子を除外し、図８に示される配列と少なく とも５０％の相同性を有し、寄生性線虫の感染に対して免疫を与えることができ る防御分子をコードする、ＤＮＡ分子。
23. ２３．ポリヌクレオチド分子がＤＮＡ分子及びベクターＤＮＡである、請求の範 囲第１８〜２２項のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ分子。
24. ２４．ベクターＤＮＡがプラスミド、ファージまたはウイルスＤＮＡから成る、 請求の範囲第２３項に記載の組換えＤＮＡ分子。
25. ２５．ベクターＤＮＡがλｇｔ１１、ｐＵＲ２９０、ｐＵＲ２９１、ｐＵＲ２８ ２、ｐＵＫ２７０、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＺｉｐＮｅｏ、ＳＶ４０を基材とす るベクター、λｇｔ１０、ＥＭＢＬベクター、ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２９、ま たはｐａｒ遺伝子座を含むｐＢＲ３２９、バキュロウイルスまたはワクシニアウ イルスから選択される、請求の範囲第２４項に記載の組換えＤＮＡ分子。
26. ２６．前記に定義した通りのｐＢＴＡ８７９及びｐＢＴＡ９６３。
27. ２７．請求の範囲第２３〜２６項のいずれか１項に記載の少なくとも１個の組換 えＤＮＡ分子を有する形質転換宿主。
28. ２８．宿主が、細菌、酵母、他の微類、昆虫、植物及び哺乳類細胞ラインから選 択される、請求の範囲第２７項に記載の形質転換宿主。
29. ２９．宿主が大腸菌Ｋ１２誘導体である、請求の範囲第２８項に記載の形質転換 宿主。
30. ３０．前記に定義した通りのＢＴＡ２０３３及びＢＴＡ２１２５。
31. ３１．請求の範囲第１〜１７項のいずれか１項に記載の抗原、抗原前駆体または 相同体から成る、請求の範囲第２７項に記載の形質転換宿主の発現生成物。
32. ３２．発現生成物が融合した発現生成物である、請求の範囲第３１項に記載の発 現生成物。
33. ３３．請求の範囲第１〜１７項のいずれか１項に記載の抗原、前駆体または相同 体、または請求の範囲第３１または３２項のいずれか１項に記載の発現生成物の 総てまたは一部に対応する合成ポリペプチドであって、宿主動物に投与したとき 、寄生性線虫による宿主動物の感染に対して防御免疫を誘導することができる、 合成ポリペプチド。
34. ３４．少なくとも１種類の請求の範囲第１〜１７項のいずれか１項に記載の抗原 、前駆体または相同体、または請求の範囲第３１または３２項のいずれか１項に 記載の発現生成物、および／または請求の範囲第３３項に記載の合成ポリペプチ ドの有効量と、製薬上および／または獣医学上許容可能な担体、希釈剤および／ またはアジュバントと共に含んで成るワクチン。
35. ３５．製薬上および／または獣医学上許容可能な担体、希釈剤賦形剤および／ま たはアジュバントと共に、請求の範囲第２７〜３０項のいずれか１項に記載の形 質転換宿主を含んで成る、生きているまたは死んだ形の全細胞ワクチン。
36. ３６．形質転換宿主が、予防接種を行う宿主の粘膜に投与するための請求の範囲 第１〜１７項のいずれか１項に記載の抗原、前駆体または相同体を発現すること ができる、請求の範囲第３５項に記載の全細胞ワクチン。
37. ３７．請求の範囲第１項に記載の抗原の調製法であって、 （ａ）寄生性線虫種の若い成虫をホモゲナイズしてホモゲネートを生成させ、 （ｂ）このホモゲネートから膜質物質を得て、（ｃ）この膜質物質を低濃度の両 性イオン性洗浄剤を含む緩衝液で抽出して洗浄剤抽出物を得て、（ｄ）この洗浄 剤抽出物を小麦麦芽レクチンセファロースカラム上でクロマトグラフィを行い、 （ｅ）カラムからの流出物を集める、 ことから成る方法。
38. ３８．調製用等電点電気泳動法による分画およびｐＩが３．８〜４．４、更に好 ましくは４．０〜４．３の範囲の画分の収集、 ゲル濾過クロマトグラフィにより分画し、分子量が１０〜６０ｋＤの範囲の画分 を収集、およびレンチルレクチンまたはＨｅｌｉｘ　ｐｏｍａｔｉａレクチンク ロマトグラフィによる分画および結合した物質の収集、も含む、請求の範囲第３ ７項に記載の方法。
39. ３９．請求の範囲第１〜１７項のいずれか１項に記載の少なくとも１種類の抗原 、抗原前駆体または相同体、請求の範囲第３１または３２項に記載の発現生成物 および／または請求の範囲第３３項に記載の合成ポリペプチドの有効量を、製薬 上および／または獣医学上許容可能な担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジ ュバントと混合することから成る、請求の範囲第３４項に記載のワクチンの調製 法。
40. ４０．少なくとも１種類の寄生性線虫種による感染から宿主を防御する方法であ って、請求の範囲第１〜１７項のいずれか１項に記載の少なくとも１種類の抗原 、抗原前駆体または相同体、請求の範囲第３１または３２項に記載の発現生成物 、請求の範囲第３３項に記載の合成ポリペプチド、および／または請求の範囲第 ３４または３５項に記載のワクチンの有効量を、宿主に投与することから成る方 法。
41. ４１．請求の範囲第１〜１７項のいずれか１項に記載の抗原、抗原前駆体または 棺同体、請求の範囲第３１または３２項に記載の発現生成物、請求の範囲第３３ 項に記載の合成ポリペプチドまたは請求の範囲第３４または３５項に記載のワク チンに対して生じる抗体。
42. ４２．請求の範囲第４１項に記載の少なくとも１種類の抗体を、製薬上および／ または獣医学上許容可能な担体、希釈剤および／または賦形剤と共に含んで成る 、抗体組成物。
43. ４３．請求の範囲第１〜１７項のいずれか１項に記載の抗原、抗原前駆体または 相同体、請求の範囲第３１または３２項に記載の発現生成物、請求の範囲第３３ 項に記載の合成ポリペプチドおよび／または請求の範囲第３４または３５項に記 載のワクチンで免疫応答性の宿主を予防接種することから成る、請求の範囲第４ １項に記載の抗体の調製法。
44. ４４．請求の範囲第４１項に記載の抗体の有効量を、製薬上および／または獣医 学上許容可能な担体、希釈材および／または賦形剤と混合することから成る、請 求の範囲第４２項に記載の抗体組成物の調製法。
45. ４５．請求の範囲第１９または２０項に記載のＤＮＡ分子をベクターＤＮＡに挿 入することから成る、請求の範囲第２３項に記載の組換えＤＮＡ分子の調製法。
46. ４６．宿主を形質転換に適合させ、コンピテント宿主を提供し、このコンピテン ト宿主を請求の範囲第２３項に記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換することから 成る、請求の範囲第２７項に記載の形質転換宿主の調製法。
47. ４７．請求の範囲第１〜１７項のいずれか１項に記載の抗原、抗原前駆体または 相同体、請求の範囲第３１または３２項に記載の発現生成物または請求の範囲第 ３３項に記載の合成ポリペプチド、および／または請求の範囲第４１項に記載の 抗体の試料を含んで成る、診断用キット。
48. ４８．請求の範囲第２７項に記載の形質転換宿主を提供し、この宿主を、発現生 成物を発現させるのに好適な条件下で培養し、形質転換宿主から発現生成物を収 集することから成る、請求の範囲第３１または３２項に記載の発現生成物の生合 成法。
49. ４９．請求の範囲第１項に記載の抗原の一部分に対応し且つアンチイディオタイ プ抗体で免疫した宿主を寄生性線虫種による侵入から防御することができるアン チイディオタイプ抗体。
50. ５０．請求の範囲第４９項に記載のアンチイディオタイプ抗体を製薬上および／ または獣医学上許容可能な担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントと 共に含んで成るワクチン。
51. ５１．寄生性線虫種による侵入から宿主を受動的に防御する方法であって、請求 の範囲第４１項に記載の少なくとも１種類の抗体または請求の範囲第４２項に記 載の抗体組成物の有効量を宿主に投与することから成る、方法。