JPH05507268A - 合成の抗体の誘導体の製造方法およびその中間体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 合成の抗体の誘導体の製造方法およびその中間体同時係続中の特許出願、ＰＣＴ ／ＧＢ８９１０１２６９号（Ｗｏ　９０１０４４１３号として公開されている） は、２またはそれ以上のＦｃ領域を有する抗体の誘導体およびこのような誘導体 の製造方法及びその中間体に関するものである。本発明は、上記の先の出願にお いて記載された方法及び中間体に比べて数点について長所をＨする他の方法およ び中間体に関するものである。

複数のＦｃ領域を有する抗体の誘導体は、特にＦｃ領域がＦａｂ領域または機能 的に同様の部分に結合することによって「キメラの」性質を有する化合物を形成 する際に、様々な治療に適用できる。

制御された方法において上記の化合物を構築するためには、他の部分の補足的な 官能基（ｃｏｍｐｌｅａ＋ｅｎｔａｒｙ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｇｒｏｕｐ） と反応する多くの制御された化学的な官能基を有するＦｃ領域を中間体として使 用することが好ましい。

本発明は、このようなタイプの中間体、このような中間体の製造方法および合成 の抗体の誘導体の製造におけるこれらの使用方法を提供するものである。

したがって、本発明は、以下の一般式を有する中間体である、抗体のＦｃ領域の 誘導体の調製において使用される中間体を提供するものである： Ｆｃ−８−３−Ｘ 但し、Ｆｃは、タンパク質−タンパク質中にジスルフィド結合を導入することに よってまたはアルキル化することによって外部のスルフヒドリル基が実質的に不 活性化されるＦｃ領域であり、 さらに、Ｘは、ジスルフィド結合がかなり低いｐＨて還元を受けやすくなる（つ まり、非常に電子性になる）ようなプロトン化された基である。

「外部の」とは、鏡開のジスルフィド結合の還元によって放出されたスルフヒド リル基を意味している。我々は、鎖中のジスルフィド結合の還元によって生じる スルフヒドリル基と区別している二上記の鎖中の結合は、タンパク質の内部に埋 め込まれており、タンパク質の折りたたみを実質的に開かない限り還元しにくく 、本出願に関するすべての操作では完全にそのままである。

「不活性化」は完全に絶対的な言葉ではないことは、当業者によって理解される ものである。本明細書においては、中間体が受ける工程の条件および使用条件に おいて安定であるということを意味し、したがって、一時的に基をマスクする等 と区別する。スルフヒドリル基は、例えば、アルキル化によって不活性化される 。

基Ｘは、他のジスルフィド結合、例えば、鏡開のジスルフィド結合等が還元され ないｐＨが４の低い領域で還元できる、ピリジルが好ましい。

ｒＦｃ領域」は、例えば、２つのペプチド鎖からなる典型的な免疫グロブリンの Ｆｃ構造物のみでなく、部分的な構造物、活性断片および例えば、リクルートエ フェクター能若しくはＩｇの輸送及び代謝に関連するもの等のＦｃ活性を有する ものをも意味するものである。

Ｆｃ領域は、どの免疫グロブリンクラスの若しくはどの動物の種類の免疫グロブ リン由来でもよいが、ヒトに使用するならば、ＩｇＧやＩｇＧ１等のヒトの免疫 グロブリン由来であることが好ましい。多クローン性または単クローン性の源も 使用できる。

一般的には、本発明の中間体は、以下の工程段階によって製造される： ａ）Ｆｃ領域を「サクリフィシアルな」基（”５ａｃｒｉｆｉｃｉａｌ　”　− ｇｒｏｕｐ）と結合する； ｂ）このようにして形成された化合物をジスルフィド結合置換し、潜在的な反応 部位を不活性化する；Ｃ）サクリフィシアルな基（ｓａｃｒｉｆｉｃｉａｌ　ｇ ｒｏｕｐ）をＦｃ領域から分離し、Ｆｃ領域上の反応部位を切り離す；さらに、 ｄ）プロトン化された基を反応部位に結合させる。

サクリフィシアルな基（ｓａｃｒｉｆｉｃｉａｌ　ｇｒｏｕｐ）は・クロマトグ ラフィーによる分画等によって他の反応生成物から１置換されたＦｃ領域が分離 できるのに十分な分子量の基より選ばれることが好ましい。一つの適当な基とし ては、例えば、羊の免疫グロブリンのＦａｂ−領域がある。この羊の免疫グロブ リンのＦａｂ−領域は、切断することによつてＦａｂ−−３Ｈさらにはピリジル ジスルフィドを１つ有するＦａｂ−−５Ｓ−Ｐｙを産生できる踏量のガンマジス ルフィド結合（ｆｆｉｎｔｅｒ−ｇａｍｍａ　ｄｊｓｕｌｐＭｄｅ　ｂｏｎｄ） を１つ有するＦ　’ａ　ｂ　−２断片を提供する安価でかつ使用しやすい免疫グ ロブリンの源であるという長所を有する。他の適当な基としては、ヒトの血清ア ルブミンが挙げられる。

好ましくは、プロトン化された基は、ジピリジルジスルフィドと反応することに よって反応性のＳＨ基に結合するピリジルである。

本発明の方法をさらに詳細に説明すると、Ｆｃγのヒンジ部のシスティン残基か ら突出している１つのピリジル基を有するヒトの正常なＩｇＧ１の安定な誘導体 である、Ｆｃγ−ジチオピリジン（ピリジルーＦｃ５Ｆｃ−３Ｓ−Ｐｙ）を調製 する。使用するために必要であれば、Ｆｃ−５Ｓ−Ｐｙを、ヒンジ部のシスティ ンが準安定なマレイミジル基を有する、活性化された形態であるＦｃγ−モノマ レイミド（Ｆｃ−ｍａｔ）に素早く変換する。この基によって、Ｆｃγは結合し ゃすいＳＨ基を有するタンパク質に結合でき、チオエーテル結合によって結合さ れたキメラの誘導体を産生ずる。

上記調製は、ヒトの正常なＩｇＧ１のパパインによる消化で開始し、Ｆｃγを産 生ずる。Ｆｃγのヒンジ部の初めの還元によって、２つの平行な踏量のγ　（ｉ ｎｔｅｒ−γ）のＳＳ結合から４つのＳＨ基が放出される。これらの基の一つは 、ＳＳ結合中に使い捨てのタンパク質（ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ ）　（サクリフィシアルな基（ｓａｃｒｉｆｉｃｉａｌ　ｇｒｏｕｐ）　）　（ ヒトのアルブミンまたは羊のＦａｂ＝γ）を一時的に導入することによって保護 される。さらに、残りの３つのＳＨ基は、４．４′−ジピリジルジスルフィド（ Ｐｙ−５Ｓ−Ｐｙ）によってジスルフィド結合に置換され、対のＳＨ基から踏量 のγ　（ｆｎｔｅｒ−γ）のＳＳ結合を再構築し、対になっていないＳＨ基から は混合されたジスルフィドタンパク質−５ｓ−ｐｙを形成する。このタンパク質 の生成物は、踏量のγ　（ｉｎｔｅｒ−γ）およびＦｃγ−アルブミン（または ＦＣγ−Ｆａｂ−γ）のＳＳ結合は還元されにくいが、タンパク質−５ｓ−ｐｙ 内の結合（ピリジルＮがプロトン化されるため、非常に電子性である）は還元さ れやすいｐＨ４，０でジチオトレイトールに暴露される。ヒンジ部のＳＨ基が一 つ生成し、さらに、Ｎ−エチルマレイミドによるアルキル化によって永久にブロ ックされる。Ｆｃγ−アルブミンのキメラをクロマトグラフィーによって精製し 、すべての踏量のＳＳ結合を還元することによって切断し、アルブミンを捨てる 。３つのヒンジ部のＳＨ基を有するＦｃγに、二回目のｐｙ−ｓｓ−ｐｙによる ジスルフィド結合の置換を行い、再構築されたヒンジ部のＳＳ結合及び対になっ ていないＳＨ基から形成された混合されたジスルフィド結合（タンパク質−３Ｓ −Ｐｙ）を有する、最終のＦｃ−５ｓ−ｐｙ生成物を形成する。

一回目のｐｙ−ｓｓ−ｐｙによるジスルフィド結合の置換を行わなず、その代わ りに、Ｆｃγ−アルブミンのキメラを形成した後に３つのヒンジ部のＳＨ基をす べてアルキル化することによって、調製を簡単にすることができる。

さらに、最終のＦｃ−８Ｓ−Ｐｙ生成物は、ある条件下では（例えば、活性化し ない補体においては）好ましい、オープンヒンジを有している。

使用するに当たって必要であれば、Ｆｃ−８Ｓ−ＰｙをｐＨ４，０でジチオトレ イオールを用いて還元し、１モル余分なビスマレイミド　Ｒ（ｍ　ａ　１　）　 、２と反応するとＦＣγ−８−スクシンイミジル−Ｒ−マレイミド、Ｆｃ−ｍａ ｌを形成する、１つのタンパク質ＳＨ基を切り離す。

本発明によって、様々な中間体及び最終生産物の構造物の製造および様々な方法 段階及び組み合わせが可能になる。

上記のさらなる可能性は当業者によって容易に理解されるところであり、新規な 化合物を製造する個々の特徴またはそれぞれの若しくはさらなる複数の特徴の組 み合わせであっても、本発明由来の新規な方法、中間体および生成物は本発明の 概念において含まれるものである。

以下の図を参照にしながら、本発明の様々な概念をさらに詳細に説明する： 図１は、サクリフイシアルなＦ　ａ　ｂ　（ｓａｃｒ４ｆｉｃ１ａｌ　Ｆａｂ） がアルキル化（Ｓ・の記号によって図に表される）によって不活性化されるスル フヒドリル基を有するＦｃ領域と結合しているＦａｂ−８’５−Ｆｃの形態の、 本発明の中間体図２は、Ｆｃ領域がサクリフィシアルなＦ　ａ　ｂ　（ｓａｃｒ ｉｆｉｃｉａｌ　Ｆａｂ）より分離される次の段階を示すものである；図３は、 本発明によって提供される中間体（ａ）および他の部分とさらに反応した形態（ Ｃ）に変換する次の工程段階を示すものである； 図４は、図３（Ｃ）において記載された形態より構築されたタイプのＦａｂ　Ｆ Ｃ２生成物を示すものである。

１、一般的なＩｇＧのサブクラスであるＩｇＧ１の、ヒトの正常なＦｃガンマ（ 図１の右上部を参照）を、２つのヒンジ部のＳＳ結合が４つのＳＨ基を産生ずる ように、還元する。

２、ＦｃのＳＨ基の１つを、羊のＦａｂ−ガンマ（図１の左部を参照）を有する ＳＳ結合を形成するために用い、一時的にＦａｂ−８５−Ｆｃを産生ずる。残り のＦｃのＳＨ基のうち、２つはＳＳ結合置換を行い、もとのヒンジ部のＳＳ結合 の１つを再形成し、１つは、ＦａｂのＳＳ結合において使用されているものとは まったく逆ではあるが、アルキル化によって永久にブロックする（図１の右下部 を参照）。ブロックのために使用できる可能性のある他の反応は、セシル　アン ド　マクフィー　（Ｃｅｃｉｌ　ａｎｄ　ＭｃＰｈｅｅ）、アドバンセス　イン 　プロティン　ケミストリー（Ａｄｖａｎｃｅｓｉｎ　Ｐｒｏｔｅｆｎ　Ｃｈｅ ｍｆｓｔｒｙ）　、１４巻、ページ２５５．１９５９年によって討論されている 。

３、Ｆａｂ−５Ｓ−Ｆｃを、ゲルクロマトグラフィーによって（Ｆａｂ＋Ｆｃ） の反応混合物における他の生成物及び過剰の試薬より分離する。

４、Ｆａｂ−５Ｓ−Ｆｃ中のすべての鏡開のＳＳ結合を還元し、図２の構造物を 産生じ、放出されたＦａｂ−ガンマを捨て−４つのヒンジ部のＳＨ基のうちの１ つがアルキル化によってブロックされたＦＣを分離する目的に使用する。

５、さらに、ＳＳ結合置換を再度行い、利用できるヒンジ部のＳＳ結合を再形成 するが、対になっていないヒンジ部のＳＨ基は、ジチオ（４−）ピリジン基を形 成するために使用する＝　（図３（ａ）を参照）。

６、Ｆｃ−８Ｓ−Ｐｙをこの形態で貯蔵する。使用する際必要であれば、５−ｓ ｐｙ結合は、ｐ）（，４，０〜４．５で緩やかに還元することによって切断でき 、さらに、遊離マレイミド基（Ｒ）は、非常にモル過剰のビスマレイミドのリン カ−（例えば、Ｏ−フェニレンジマレイミド）を用いた反応によって導入できる （図３（ｂ）及び３（Ｃ）を参照）。ｐＨ４，０〜４．５での還元ではヒンジ部 のＳＳ結合は切断されない。−３Ｓ−Ｐｙによって示される酸性のｐＨでの還元 に対する感受性は、２−ピリジルまたは４−ピリジルの誘導体のいずれか（後者 のほうが感受性が高い）を用いて達成され、ピリジルＮが低いｐＨでプロトン化 されるように結合の電子性の増加によるものである（プロツケルハースチト（Ｂ ｌｏｃｋｅｌｈｕｒｓｔ））　、インド　ジエー　バイオケム（Ｉｎｔ、　Ｊ、 　Ｂｉｏｃｈｅｔ）、１０巻、ページ２５９．１９７９年を参照）。

ヒトの正常なＩｇＧ自身はスティヴンワン（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ）ら（アンチー カンサー　ドラッグ　デザイン（ＡｎＢ−ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇ ｎ）　、３巻、ページ２１９．１９８９年）によって記載されているように、血 液銀行の要求（ｂｌｏｏｄ　ｂａｎｋ　ｒｅｑｕｉ　ｒｅｍｅｎｔｓ）に対して 過剰な血漿より得られる。

羊のＩｇＧは、硫酸アンモニウムによる連続沈殿およびＤＥＡＥ−セルロースク ロマトグラフィーによって血清よを標準的なペプシンによる消化によって調製す るにソノフ（Ｎｉｓｏｎｏｆｆ）ら、アーチ　バイオケム　バイオフィズ（Ａｒ ｃｈ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、）　、８９巻、ページ２３０．１ ９６ミド（ＮＥＭ）は、両方ともシグマ　ケミカル　カンパニー（Ｓｉｇｍａ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）製のものであるが、さらに精製は行わずに用いる。

アルドリッヒ　ケミカル　コーポレーション（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ　Ｃｏ、）製の４，４′−ジピリジル　ジスルフィド（ｐｙ−ｓｓ−ｐｙ）は 、ジメチルホルムアミド／水で再結晶化される。

−の媒質はファルマシアーエルケービー（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ　ａ−ＬＫＢ）製 であり、ホスホーウルトロゲル（Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　）はアイ ビーエフ　バイオテクニックス（ＩＢＦ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ）製で調製を 以下のフローチャートに概略する。このチャートにおいて、「十」はそれぞれ化 学反応を示し、矢印はそれぞれクロマトグラフィーカラムにのせたりのせなかっ たりすることを示す。四角で囲まれた生成物は以下のような適当な小見出しで記 載されている。

Ｇ−２５−ｍ−−Ｐ−Ｕ　Ｇ−２５ ｒｏｔ　Ａ ＋ＤＴＴ 羊のＦ（ａｂ−ガン７　）　、５　ｍ　ｇ　／　ｍ　１を、１ｍＭのＤＴＴを用 いて、ｐＨ８，０１２５℃で３０分分間光する。

次に、冷却し、ＤＴＴ濃度に対して０．５ｍＭを加えた濃度のｐｙ−ｓｓ−ｐｙ を用いて５℃、１５分間ＳＳ粘結置換を行った。この置換を行っている間、ガン マ−還元ＳＳ結合は再形成するが、１つの鏡開のγ　（ｉｎｔｅｒ−γ）のＳＳ 結合由来のＳＨ基は混合されたジスルフィドＦａｂ−３Ｓ−ｐｙとして現れる。

セファデックスＧ−２５を通すことによって、低い分子量（５０００）の物質は すべて除去され、ｐＨ４，５の０．０３Ｍ酢酸塩にタンパク質を移す。

このタンパク質を、さらに、同様のバッファーで平衡化されたホスホーウルトロ ゲル（Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｕｌｔｒｏｇｅｌ）Ａ　６　Ｒにのせ、コンパクトゾー ン（ｃｏｎ＋ｐａｃｔ　ｚｏｎｅ）　（約５０ｍｇ／ｃｎ＋３）における媒質に 結合させる。最終的には、同様の酢酸塩バッファーの０．５Ｍ塩化ナトリウムを 用いて約３０ｍｇ／ｍ１の濃度でゲルから溶出させる。

２０±２ｍｇ／ｍｌのヒトのＦｃガンマを３ｍＭのＤＴＴを用いてｐＨ８，０， ２５℃で３０分分間光する。次に、ｐＨ４，０の０．１Ｍ酢酸塩に移し、同時に 、セファデックスＧ−２５に通すことによって、ＤＴＴを除去する。

ｃ、Ｆａｂ−８Ｓ−Ｆｃ Ｆａｂ及びＦｃの誘導体を混合し、２５℃で３０分間培養する。この間、以下の 原理の反応が起こっている：Ｆａｂ（ＳＳＰｙ）　＋　Ｆｃ（Ｓ）Ｉ）４−４　 Ｆａｂ−８８−Ｆｃ　＋　４−チオピリドンまた、Ｆａｂ　Ｆｃ及びＦ　ａ　ｂ 　ｓ　Ｆ　ｃも形成されることがある。

培養終了後、この混合物を２．８倍容の冷水で希釈し、ｐｙ−ｓｓ−ｐｙを０． １７ｍＭになるまで加える。ジスルフィド結合の置換によって、２つのシスティ ンのＳＨ基が遊離したままであるＦｃヒンジ部の中でＳＳ結合が再構築されるが 、対になっていないＳＨ基は混合されたジスルフィドタンパク質−５ｓ−ｐｙと なる。後者は、ｐＨ４゜５で０．４ｍＭのＤＴＴを用いて処理されることによっ てタンパク質−８Ｈに再変換される。次に、さらに起こるべきすべての置換は、 ２．９ｍＭまでＮＥＭを加えて遊離したＳＨ基をアルキル化することによって、 停止される。

Ｆ　ａ　ｂ　（Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｖ　）　１で記載したのと同様にして、ホスホーウ ルトロゲル（Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｕｌｔｒｏｇｅｌ）で吸収／脱着することによっ て、タンパク質の溶液を濃縮し、ｐＨ５，８の、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０ ．１Ｍの酢酸塩で平衡化されたセファクリル　５２００にこの濃縮溶液をのせる 。Ｆａｂ−８Ｓ−Ｆｃを他のタンパク質から分離し、同様のバッファーで平衡化 されたプロティン　ニー−セファロース（Ｐｒｉｔｅｆｎ　Ａ−８ｅｐｈａｒｏ ｓｅ）にのせ、結合させる。

ｄ、Ｆｃ−８Ｓ−Ｐｙ ｐＨ８，０で１ｍＭのＤＴＴをプロティン−ニー−セファ０−ス（Ｐｒｉｔｅｉ ｎ−Ａ−８ｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムにのせることによって、このカラムに結合 しないＦａｂ′ガンマを放出する。

Ｆａｂ”ガンマを洗い流した後、Ｆｃ（ＳＨ）３の形態であるＦｃをｐＨ３，０ ，０，１Ｍのグリシン塩酸塩で溶出し、直ちにセファデックスＧ−２５に通すこ とによってｐＨ４，５，０，０３Ｍの酢酸塩に移す。最終的には、ＳＳ−置換に よってヒンジ部のＳＳ結合が回復し、残りのアルキル化されないシスティンを混 合されたピリジルジスルフィドとして切断できる（図３（ａ）参照）ように、ｐ ｙ−ｓｓ−ｐｙを０．２５ｍＭの濃度になるまで加える。この中間体は、５℃で ３ケ月間貯蔵しても安定であった。図３（ｂ）及び（Ｃ）に記載されているよう に、この貯蔵された中間体を還元し、マレイミド化することによってＦｃ−ｍａ ｌを得、このＦｃ−ｍａｌを遊離ＳＨ基を有する物質、例えば、Ｆａｂ（ＳＨ） ５に結合することによって、図４に記載されたようなＦａｂＦＣ２を得る。

上記したピリジルＦｃの調製において、羊のＦａｂ−γを用いて一時的にＦａｂ −５Ｓ−Ｆｃを形成し、これによってＦｃのヒンジ部の１つのＳＨ基をマスクし た。同時に、Ｆａｂ−８Ｓ−Ｆｃは、特有の分子量（約１００．０００）を有し 、この分子量によってクロマトグラフィーによって他の反応物からＦａｂ−８Ｓ −Ｆｃを分離することができる。羊のＦａｂ−γのこれらの機能はヒトの血清ア ルブミン（ＨＳ　Ａ）にとって代わることができることから、羊のタンパク質の 導入によって必要となるさらなる安全の予防措置を講じなくて済む。ＨＳＡは、 マスク機能を果たせる１つのシスティン残基を有し、また、分子量（６４，５０ ０）によってもまた、クロマトグラフィーによる分離ができる特有の分子量を有 する一時的な物質（ＨＳＡ−３Ｓ−Ｆｃ）が得られる。

１つのシスティン残基及び１つのＳＨ基を有するｌ５Ａ（以降、ＨＳＡ　（ＳＨ ）、とする）を示す。さらに、必要な全体の反応は以下の通りである： （１）　ｌ５Ａ（ＳＨ）　＋　Ｐｙ−３Ｓ−Ｐｙ　−’　ＨＳＡ（ＳＳ−ｐＹ） １　＋　チオピリドン（２）　ＨＳＡ（ＳＳ−Ｐｙ）　”　Ｆｃ（ＳＨ）４　＝ 　ＨＳＡ−８Ｓ−Ｆｃ　＋　チオピリドンしかしながら、ＨＳＡのＳＨ基が他の タンパク質とかなり反応せず、明らかにタンパク質の表面に受け入れられにくい （セシル　アンド　マクフィー　（Ｃｅｃｊｌ　＆　ＭｃＰｈｅｅ）、アトパン セス　イン　プロティン　ケミストリー（Ａｄｖａｎｃｅｓｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉ ｎ　Ｃｈｅｍｔｓｔｒｙ）　、１４巻、ページ２５６．１９５９年参照）ことか ら、反応（１）が進行する前にシスティン残基のＳＨ基内で終結する延長アーム （ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ａｒａｂ）を添加する必要があることが分かった。さら に、反応（１）および（２）は羊のＦａｂ−γで上記記載したのと同様にして行 われる。

ＨＳＡで必要な予備段階は以下の通りである：１、ＨＳＡ　（シグマ　ケミカル 　カンパニー（Ｓｆｇｍａ　ｃｈｅｔｘｉｃａｌ　ｃｏｍｐａｎｙ）製）をまず ジチオトレイトール（２ｍＭ）を用いてｐＨ７，０で還元し、システィン残基が 十分還元された（ＳＨ）形態であることを確認する。次ぎに、ｐＨ５゜０．０． ０２Ｍの酢酸塩で平衡化し、５℃で行われた、セファデックスＧ−２５（ファル マシア（ＰｈａｒｒＩＪａｃｉａ）製）に通す。

２、このタンパク質を０−フ二二レンジマレイミド（１゜２ｒｎＭ、ｐＨ５，０ 、ジメチルホルムアミド　１６％Ｖ／■）と５℃で６０分間反応させ、活性化マ レイミジル基を有するＨＳＡ　（ｍａ　１）１を得、セファデックスに通すこと によって低分子量の反応物から再度分離する。

３、最終的には、このタンパク質を再度ジチオトレイトール（１ｍＭ）と反応さ せ、約１５オングストローム長のアームの末端に位置するＳＨ基を有するＨＳＡ 　（ＳＨ）、を産生ずる。

本発明の方法を過去の報告のものと比較した際の長所を以下に示す： （１）中間生産物は、容易に次の反応を行え、より簡単でかつより顕著な最終調 製方法を提供し、さらに、さらなる応用をより容易に示唆できる。

（２）Ｆｃ　（ｍａ　１）＋Ｆａｂ　（ＳＨ）５の反応を、立体障害の原因にな るＦｃ上に存在する羊のＦｂａを用いずにより容易に行える。

Ｆｃ−８Ｓ−ＰＹの使用可能性 本発明の中間体を貯蔵し、必要であれば、遊離したＳＨ基を有する物質にヒトの Ｆｃ領域を結合するのに用いる。

この物質は、異常な組織、例えば、癌細胞またはウィルス感染細胞等上にいき、 これによってＦｃに対する結合性を有するエフェクター（補体、マクロファージ 、ＮＫ細胞）の破壊力を誘導するようにしてＦｃで組織を被覆するものが選択さ れる。

ヒトのＦｃに結合するのに適している物質の例を以下に示すニー （１）モノクローナル抗体のＦａｂ−ガンマ領域。はとんどの抗体はペプシンの 消化によってこの断片を産生じやすい。このようにして得られたキメラの抗体産 物は以下を目的として使用されるニー ａ、癌細胞を殺す。

ｂ、移植の受容体における宿主のＴリンパ球を抑制する。

Ｃ１移植一対一宿主の病気における移植のＴ　ＩＪリンパ球抑制する。

ｄ、ウィルスが感染した細胞を殺す。

ｅ、自己免疫のリンパ球（クラスに特異的な抗原等の表面のイディオタイプに特 異的な抗体を有する）を殺す。

（２）ＨＩＶが感染した細胞の表面にあるウィルス性のタンパク質ｇＰ１２０に 結合する、ＣＤ４等の、好まし、くない細胞の表面に対する他のリガンド。この ようなリガンドは、ＳＨ基の機能を発揮する出すことができなければならず、ま た、遺伝子技術または化学技術によって導入されな要約 抗体のＦｃ領域の誘導体の調製において使用される中間体、上記中間体の製造方 法、合成された抗体の誘導体の製造における上記中間体の使用および上記使用に よって製造される抗体の誘導体。

国際調査報告 ・−・−−一・−ｍ−・−・−・・−−〜−ＰＣＴ／ＧＢ　９１１００６３３ｌ ｍ＋ｈ内−−−角優１五ｅ−軸（＋＋＋＊勇師拳Ｍ〒＃Ｊ１０１／ｌ１１Ｍ：１ １

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下の一般式を有する中間体である、抗体のＦｃ領域の誘導体の調製におい て使用される中間体：Ｆｃ−Ｓ−Ｓ−Ｘ 但し、Ｆｃは、タンパク質−タンパク質中にジスルフィド結合を導入するまたは アルキル化することによって外部のスルフヒドリル基が実質的に不活性化される Ｆｃ領域であり、 さらに、Ｘは、ジスルフィド結合がかなり低いｐＨで還元されやすくなるような プロトン化された基である。２．該基ＸがｐＨが４の領域で還元できるようなも のであることを特徴とする請求の範囲１に記載の中間体。 ３．該基Ｘがピリジルであることを特徴とする請求の範囲２に記載の中間体。 ４．該Ｆｃ領域がヒトの免疫グロブリン由来のものであることを特徴とする請求 の範囲１から３のいずれかに記載の中間体。 ５．以下の工程段階を有する請求の範囲１から４のいずれかに記載の中間体の製 造方法： ａ）Ｆｃ領域を「サクリフィシァルな」基（“ｓａｃｒｉｆｉｃｉａｌ”ｇｒｏ ｕｐ）と結合する； ｂ）このようにして形成された化合物にジスルフィド結合置換を行い、潜在的な 反応部位を不活性化する；ｃ）サクリフィシァルな基（ｓａｃｒｉｆｉｃｉａｌ 　ｇｒｏｕｐ）をＦｃ領域から分離し、Ｆｃ領域上の反応部位を切り離す；さら に、ｄ）プロトン化された基を反応部位に結合させる。 ６．該サクリフィシァルな基（ｓａｃｒｉｆｉｃｉａｌ　ｇｒｏｕｐ）が、分画 等によって他の反応生成物から１置換されたＦｃ領域を分離できるのに十分な分 子量の基より選ばれることを特徴とする請求の範囲５に記載の方法。 ７．該サクリフィシァルな基（ｓａｃｒｉｆｉｃｉａｌ　ｇｒｏｕｐ）が羊の免 疫グロブリンのＦａｂ′領域であることを特徴とする請求の範囲６に記載の方法 。 ８．該サクリフィシァルな基（ｓａｃｒｉｆｉｃｉａｌ　ｇｒｏｕｐ）がヒトの 血清アルブミンであることを特徴とする請求の範囲６に記載の方法。 ９．該プロトン化された基がピリジルであることを特徴とする請求の範囲６から ８のいずれかに記載の方法。 １０．該ピリジル基が、ジピリジルジスルフィドと反応することによって反応部 位に結合することを特徴とする請求の範囲９に記載の方法。 １１．抗体のＦｃ領域の誘導体の調製方法における請求の範囲１から４のいずれ かに記載の中間体の使用。 １２．ヒトのＦｃ領域を遊離したＳＨ基を有する物質に結合する方法における請 求の範囲１から４のいずれかに記載の中間体の使用。 １３．該物質が異常な組織に行くように選択されることを特徴とする請求の範囲 １２に記載の使用。 １４．該物質がモノクローナル抗体のＦａｂ′ガンマ領域であることを特徴とす る請求の範囲１２または請求の範囲１３に記載の使用。 １５．該物質が好ましくない細胞の表面に対するリガンドであることを特徴とす る請求の範囲１２または請求の範囲１３に記載の使用。 １６．中間体が還元される段階を含む方法における請求の範囲１２から１５のい ずれかに記載の使用。 １７．請求の範囲１から４のいずれかに記載の中間体の使用によって得られる抗 体の誘導体。 １８．２以上のＦｃ領域を有する請求の範囲１７に記載の抗体の誘導体。