JPH05507298A

JPH05507298A - 非トロンボゲン性グリコサミノグリカン共重合体

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Publication number: JPH05507298A
Application number: JP91506427A
Authority: JP
Inventors: マジッド，エム．　アブドゥール; アンガー，フランク　エム．
Original assignee: ケムバイオメッド，リミテッド
Priority date: 1990-04-10
Filing date: 1991-04-10
Publication date: 1993-10-21
Also published as: WO1991015252A1; CA2080241A1; EP0524209A1; AU7563791A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】トロンボゲン　グリコサミノグリカン　ム改五丘互本発明は、生体適合性でかつインビトロで非トロンボゲン性であり、従って生物医学的な装置に用いることができるグリコサミノグリカン共重合体の合成に関する。

１１至且五血液に接触する装置もしくは材料を臨床に利用することは、現代医学を実施するのに重要であるということはよく知られている。一般的に述べれば、生物医学的装置に用いられる材料は全て生体適合性であることが必要である。生物医学的装置を使用することは、異物の表面と、血液の１種以上の成分との間の副反応のため制限される場合が多いが、主な制約条件は、異物の表面が血栓症を助長する傾向があることである。

抗凝血薬の使用により、体外装置での血栓症の問題が最小になったが、全身的に使用すると、出血傾向などの合併症を起こすことが多い（Ｐｏｒｔｅｒ，　Ｊ．およびＴｉｃｋ，　Ｈ．ｊ　Ａｍ　ＭｅｄＡｘ匹２３７巻．　８７９−１１８１頁．　１９７７年）。このような問題があるのでヘパリンの置換体および類似体の研究が盛んに行われているが、これらの化合物は一様に、ヘパリンより低い抗凝血活性を示した（Ｃａｓｕ．　Ｂ．　ｄｖ　Ｃａ　ｂ　ｄ　ａｔｅ　Ｃ　ａｍ　Ｂｆｏｃｈｅｍ　４３巻，　５１−１３４頁，　１９８５年）。

その材料により装置が調製できる血液適合性材料を開発するために相当な努力がなされてきた。材料の表面血栓形成を妨害する方法には、ポリマーの面を、相互作用が最小になるかまたは不動態化性アルブミン層を選択的に吸着するように作ることが含まれる。さらに、薬理学的に活性な薬剤を、バルク分散によってポリマーに混和させたり、または抗凝血剤を表面に固定化する努力がなされている。

その外の方法としては、血管内プロテーゼのために生物学的コーティングもしくは凝性新円膜（ｐｓｅｕｄｏｎａｏｉｎｔｉ■ａｌ）ライニングを作る方法がある。しかし永久的に血栓形成に抵抗する合成表面はいままで調製されたことはない。

近年、生体適合性が改良されたポリマーの合成に払われた努力について多数の報告がなされている。ポリウレタン類の血液適合性が最近概説されている（Ｉｔｏ、　Ｙ、およびＩｍａｎｉｓｈｉ、　Ｙ、、　Ｃｒｔｔｉｃ　ｖ’ｅｖ　ｉ　Ｂｉｏｃｏｍａｔ’ｂ”　ｔ　ＣＲＣＰｒａｓｓ。

５巻、　４５−１０４頁、　１９８９年）。合成ポリマーの各種物理特性が生体組織に接触する補てつ用物質（バイオマテリアル）の血栓生成の可能性にいかに関連しているかを決定するために試験されてきたが、今までのところ、これらの特性の１つもしくは組み合わせから生体適合性の予測は全くできない（Ａｄｄａｍｓ。

Ｇ、Ａ、、　Ｔｒａｎｓ　１ａｎｔａｔｉｏｎ　ｍ　ａ　ｔａｔｉｏ　Ｔｏ　ａ　３巻、　４５−５６頁、１９８６年）。

ヘパリンをその抗凝血作用を利用しながら全身に使用する際に付随する危険を回避する試みがなされている。バイオマテリアルの表面をヘパリン化すると、そのマテリアルを非トロンボゲン性にすることができる。ヘパリンをゆっくり放出させると確実に抗凝血性を保護するがその供給量には自ずと限界がある［Ｉｍａｎｉｓｈｉ、　Ｙｌ、ＣｕｒｅｎｔＴＯｏａｓ　’ｎ　Ｐａ　ｍｅｒ　５ｃｆｅｎｃｅ　（Ｒ，Ｍ、　０ｔｔｅｎｂｒｉｔｅら編集＞、１巻、　５８−７１１頁、　１９８７年、　Ｈａｎｓｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ミュンヘン］。

ヘパリンを表面に結合させる方法も限られた成功しか得られなかった。ポリマーのポリカチオン性表面へのヘパリンのイオン結合が行われた［Ｔａｎｚｉ、　Ｍ、Ｃ，ら、　ｌ　ｍａｒｓ　’ｎ　Ｍｅｄ’ｃｉｎｅ　ＩＩ　（Ｅ、　Ｃｈｉｅｌｌｉｎｔら編集）、６７−８５頁および９１−９９頁、１９８６年、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、二ニーヨーク］。またヘパリンは各種の表面に共有結合もしくは架橋結合で結合することができる［Ｊｏｚｅｆｏｗｉｃｚ、　Ｍ、およびＪｏｚｅｆｏｗｉｃｚ、　Ｊ、、ｏｌ　ｒａｅ　ｓ　’　Ｍｅｄ’ｃＬＬＩＬＬ　（Ｅ、　Ｃｈｉｅｌｌｔｎｉら編集）、　４１−６５頁、　１９８６年、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、米国、ニューヨーク］。各種の表面をコートするのに用いたヘパリン−ポリビニルアルコールのヒドロゲルについて、改良された生体適合性が報告されている（ｉｐ、　Ｗ、Ｆ、ら、　Ｊ　Ｂｉ。

引起ＪＬｔＬｕ二ｌ■１１９巻、　１ｌｉ１−１７８頁、　１９８５年）。これらの材料は、短期間用いる装置に使用するのに適しているだけである。不十分な効力、混合の制限、血漿ヘパリナーゼによる劣化、ヘパリンを中和する種による分離、および血小板阻害作用の欠除に起因する問題がある。

全（異なる方法として、ヘパリンを化学的もしくは放射線化学的に処理する方法があり、この方法によれば、モノマーと結合して、共有結合で組み込まれたヘパリン共重合体を生成するマクロラジカルが生成する。しかし、これらのものには抗凝血活性をもっているものと、もっていないものがあり、ヘパリンそのものと比べてむしろ劣っている［Ｂｏｆｆａ、　Ｍ、Ｃ，ら、　Ｔ　ｒｏｍｂ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ　４１巻、３４６頁、　１９７９年；　Ｓａｌｚｍａｎ、　Ｅ、ら、劫見Ｉ創工　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏ　ｏｆ　Ｈｅ　ａｒｔ　（Ｒ，Ｌｕｎｄｂｌａｄら編集）、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　−１−ｘ−ヨーク、４３５頁、　１９１１０年］。

より優れた非トロンボゲン性表面を調製しようとした試みでヘパリン化されたその他の合成ポリマーも、限られた成功しか収められなかった。メト牛シポリエチレングリコールメタクリレートとジメチルアミノエチルメタクリレートを光グラフト共重合させてポリアクリルニトリルとし、次いで、得られたグラフトコポリマーをヘパリン化することによって、新しい抗血栓性ポリマーが合成された（Ｍｉｙａｍａ、　Ｈ，ら、ｌｕ」剋」■区」■２０巻、　８９５−９０２頁、　１９８６年）。長期間の生物医学的用途に使うために、市販のポリウレタンの表面にポリエチレンオキシドをグラフトさせ、次にヘパリンを固定化させる修飾が行われた（Ｈａｎ、　Ｄ、に、ら、　Ｊ　Ｂ’ｏｍｅｄ　、ａｔｅ　ｅ　１肛坦■ 肛２３（ＡＩ＞巻、　８７−１０４頁、１９８９年：　Ｐａｒｋ、　！［−Ｄ、ら、ｎ」ｎｓ、５ｔｈ　ｕａｌ　Ｓａｃ、’ｏｍａｔｅｒ、　１２巻、２６頁、　１９８９年）Ｏ同様に、２−ヒドロキシエチルメタクリレート−スチレンのランダム共重合体（Ｌｅａ、　Ｓ、ら、Ｔａｎ　５ｔ　ｎｕ　Ｓｏｃ　ｆｏｍａｔｅ　１２巻、２５頁、　１９８９年）、およびヘパリンを含有するポリジメチルシロキサンとポリエチレンオキシドの両染性プロ・ツク共重合体（Ｇｒａｉｎｇｅｒ、　Ｄ、Ｗ、ら、　Ｊ　ＢｉｏＩｌｅｄ　Ｍａｔｅｒ　Ｒｅｓ　２２巻、　２３１−２５０頁、　１９８８年；　Ｐｉａｏ、　Ａ、、Ｚ、ら、ｒａｎｓ　１５ｔｈ　Ａｎｎｕａｌ　Ｓａｃ　ｉｏｍａｔｅｒ　１２Ｌ　２８Ｌ　１９８９年）が、官能基化されたプレポリマー、ジイソシアナートおよび誘導体化されたヘパリンを用い、一連のカップリング反応によって調製された。これらのいくつかは、調製するのに一連の誘導体化反応に付随するかなりの難しさがあり、またヘパリンの抗トロンビン■補因子活性が犠牲にされる。

抗凝血活性を示す他の化合物が文献に記載されている。ポリマーに対する血小板の付着の阻害もしくは防止が、ポリマーとプロスタグランジン−ヘパリン抱合体とを結合させることによって試みられた（Ｋｉｌ、　Ｓ、ｆ、、　Ａｒｔ’ｆ　Ｏｒ　ａｎｓ　１１巻、２２８〜２３６頁、　１９１１７年）。あいに（、プロスタサイクリンは、非常に高価で調製が難しいことはいうまでもないが、血漿中で極めて不安定である。いくらかの抗血栓性活性を有する多数のポリマー材料が、スルホナート基、カルボン酸基、アミノ酸スルファミド基またはアミド基を、架橋ポリスチレン、多糖類もしくはポリスチレン−ポリエチレングラフトコポリマーに結合させることによって調製された（Ｊｏｚｅｆｏｖｉｃｚ、　Ｍ、ら。

Ｐ　１　ｍｅ　ｓ　ｉ　Ｍｅｄ’ｃ’　ｅ　ＩＩ、　４１−６５頁、１９０年）。コレらの物質の抗凝血活性は置換基の量と性質に依存していることが見い出されたが、これらの物質は一般に、ヘパリンより著しく効力が低かった（Ｍａｕｚａｃ、　Ｍ、およびＪｏｚｅｆｏｖｉｃｚ、　Ｊ、、Ｌｙμロム１Ｂ５巻、３０１頁、　１９８４年）。

最近、天然産の生体膜の脂質マドＩＪクスの外表面（）Ｉａｙｖａｒｄ、　Ｊ、Ａ、およびＣｈａｐｍａｎ、　Ｄ、、　Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　５巻、　１３５−１４２頁、　１９８４年）に似せて、ホスファチジルコリンもしくはその同族体を含有するペンダント基を有するポリウレタン構造の骨格を特にもつ新しいポリマーが報告された（Ｃｈａｐｍａｎ、　Ｄ、およびＶａｌｅｎｃｉａ、　Ｇ、Ｐ、、米国特許東４．５８９．３８６号、　１９１１７年）。ホスホリルコリンを、放射線の方法によって酢酸セルロースの膜にグラフトもしくは付着させる方法（Ｊａｙａｓｒｅｅ、　Ｇ、およびＳｈａｒｍａ、　Ｃ，Ｐ、、　Ｔｒａｎｓ　１５ｔｈ　ｎｎｕａｌ　Ｓａｃ　Ｂｉｏｍａｔｅｒ　１２巻、１８５頁。

１９８９年）およびホスホリルコリンとメチルメタクリレートの共重合体も報告されている（Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ、　Ｎ、ら、−姐し■ユＡ　ｎｕａ　Ｓａｃ　Ｂｆｏｍａｔｅ　１２巻１ｇ頁、　１９１１９年）。しかし、血小板のリン脂質すなわちアルキルアシルホスファチジルコリンは、極めて強力な血小板刺激因子である血小板活性化因子に、酵素によって転化されることはよく知られていることである。

修飾された還元性末端残基によりヘパリン断片を共有結合もしくはグラフト結合させることによって（還元的アミノ化反応）：ｌｉｌ製された非トロンボゲン性表面が報告されている（Ｌａｒｍ、　Ｏ，ら、　Ｂｉｏｍａｔｅｒ　Ｍｅｄ　Ｄｅｖ　Ａｒｔｔｆ　Ｏｒ　ａｎｓ　１１巻、１６１頁。

１９８３年）。しかしヘパリンから誘導されたオリゴ糖をポリマーの骨格鎖に組み込むことは、まだ試みられていない。

有意なヘパリンの抗凝血活性に必要な構造上の必要条件は、抗トロンビンに対して最小の結合部位を構成するヘパリンの特異的な三糖配列であるということを示す重要な証拠が文献に見られる（Ｃａｓｕ、　Ｂ、、■Ｌｌ田狙り虹彰立工■Ｌ坦ｌ汰蜂４３巻、　５ｌ−１３４Ｊｉ、　１９８５年）。この特異的なヘパリンのセグメントは、Ｘａ因子の抗トロンビン媒介性阻害に対しては充分であるが、トロンビンの有効な阻害および充分な抗凝血活性の発現に対しては不充分である。実際には、トロンビンの抗トロンビン媒介性阻害には、トロンビンに対する活性部位の三糖配列に加えて少なくとも４つの（三硫酸化）三糖ユニ・ノドのセグメントが必要である（Ｌａｎｅ、　Ｄ、Ａ、ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ　２１ａ巻、　７２５−７３２頁、１９８４年）。しかし、これらのヘパリンフラグメントの大きさは、高分子量の画分をかなりの比率で含有する通常のヘパリンにははるかに及ばないので、上記画分は、血小板の付着／＃集および他の血漿成分との結合を引き起こす原因である◎それ故に、抗Ｘａ活性を有するより小さいヘパリンセグメントをポリマー骨格に組み込めば、永久的に抗血栓性で長期にわたって、非トロンボゲン性（血栓抵抗性）の、または抗トロンビン性のバイオマテリアルが提供されるであろう。

ヘパリンセグメントの使用量が少ない場合の利点は、通常のヘパリンの高い抗凝血活性に付随する出血の危険を少なくするか、または排除しながら血栓症を防止することである。

このようなヘパリンフラグメントをポリマーの骨格鎖に組み込んでいるバイオマテリアルはより有効な方式で表面の血栓症を防止するのに有用であろう。その理由は、表面が、リポタンパク質、フィブリノーゲンなどくこれらの成分は、血漿中には、抗トロンビンよりもはるかに大量に含有されている）を含む各種のヘパリン中和性もしくはヘパリン分解性の種との競合相互作用に対する感受性が小さいからである。またこの表面は、血小板の付着および血小板の凝集の促進、またはフィブロネクチンとラミニンのような細胞表面成分との相互作用を行う頭註が少ないであろう。その上に、その物質は、血管内皮のものといくぶん類似の負の電荷を有する非トロンボゲン性表面、および抗トロンビンに対する結合部位には必須であるがフィブリノーゲンもしくは血小板とトロンボゲンとの相互作用に対しては不適切な硫酸基の配列に似せることによって、抗トロンビンに対する擬似親和性を提供するであろう。

及朋ヱ８１丞血液と接触することになり、血栓抵抗性で抗血栓性である、生物医薬装置に有用な材料に対する要望が続いており、また多数の研究がある。２つの基本的方法が採用されている。一方の方法は、医療装置の表面に血栓形成が開始されるのを防止するため、ヘパリンのような抗凝血剤を同時にもしくは同期間に投与する方法である。他の方法は、ヘパリンなどの抗凝血剤を、血液と接触することになる装置の部分に直接誘導体化する方法である。後者の方法は、かなり複雑な誘導体化方法を用いる場合が多い。さらに上記の方法はともに、生理的条件下ではヘパリンが長期間の安定性を欠いているので制限される。

本発明は、抗凝血性でかつ抗血栓性のグリコサミノグリカンのフラグメントをモノマーユニットとして、装置をＸｌｉ製するのに必要な物理特性を与える非グリコサミノグリカンのモノマーユニットとの共重合体中に含有させることによって、上記の問題点を解決する。従って本発明の装置は、血液と接触する部分を、それ自体が抗凝血性、非トロンボゲン性および抗血栓性を有する共重合体で調製することができる。その上に、これらの共重合体は、血液などと生体接触させる装置の表面をコートするのに使用することができる。最後に、水溶性の共重合体は、凝血障害またはある種の免疫疾患、心臓血管の疾患およびウィルス疾患を治療するのに用いる薬理学的薬剤として有用である。

また本発明の共重合体は、所望により、架橋剤の存在下で合成され、より硬質の物理特性を有する共重合体の形態を提供することができる。この共重合体は、さらに誘導体化することができるある種の官能基を有するモノマーユニットを利用することによって、さらに付加部分に誘導体化することができる。この誘導体化には、例えばアフィニティーリガンド、標識、または抗凝血作用を促進する付加グリコサミノグリカンユニットに対する誘導体化が含まれる。

したがって、１つの態様として、本発明は血液と接触する生物医学的装置を構成および／またはコートするのに適した生物学的に適合性の共重合体に関する。この共重合体は、所望の抗血栓性、非トロンボゲン性および抗凝血性を付与することができるグリコサジ／グリカンフラグメントである少なくとも１つのモノマーユニット、ならびに上記装置を構成もシ＜バコードするのに必要な適切な物理特性を与える少なくとも１つの付加される非グリコサミノグリカンモノマーユニフトとを共重合させることによって調製することができる。

もちろん、グリコサミノグリカンフラグメントの混合物および／または共重合するモノマーのユニットの混合物を共重合体の調製に使用することができる。得られる共重合体に要求される物理特性によって非グリコサミノグリカンのモノマーユニットを何にするかの選択が決定される。またこの物理特性は使用される架橋剤の種類と量によっても影響を受ける。

水溶性の形態の共重合体も、上記の共重合体の誘導体化された形態の場合、本発明に含まれる・別の態様として、本発明は、個々のモノマーユニットもしくはその成分を、共重合が起こる条件下で混合することを包含する、本発明の共重合体の調製方法に関する。

さらに別の態様として、本発明は、本発明の共重合体で調製および／またはコートされた医療装置に関する。

図−面ｆｌ巣３ＪＡ−咀図１は、ヘパリンの分解反応、および（Ａ）亜硝酸開裂反応および（Ｂ）ヘパリナーゼ消化による典型的な生成物を示す。

図２は、アクリルアミドと、典型的な（Ａ）ヘパリナーゼの消化で生成したヘパリンフラグメント（実施Ｎｌ）、（Ｂ）ヘバリナーゼ消化の生成物のアリルグリコシド誘導体および（Ｃ）亜硝酸開裂反応の生成物のアミノエチルメタクリレート誘導体（実施例２）との共重合図を示す。

図３は、アクリルアミドと、ヘパリナーゼ消化から得たヘパリン＋糖体との「推定共重合体」のＤ２０におけるプロトンＮＭＲスペクトルである（調製法Ａ）。

この共重合体（実施例１で調製されＣＨ３−１３９と命名）は、セファデックスＧ−２５のカラムで脱塩し、次に５０ｍＭ　ＥＤＴＡに対して透析し、最後にＩ堅氷に対して透析することによって精製した後、７．９重量％のヘパリンフラグメントを含有している。挿入図は対応するヘパリン士糖体のプロトンＮＭＲスペクトルを示す。

図４は、アクリルアミドと、亜硝酸による制限された脱アミノ開裂反応で生成したヘパリン十糖体のアミノエチルメタクリレート誘導体との共重合体のＤ２０における典型的なプロトンＮＭＲスペクトルを示すく調製法Ｂ）。この共重合体（実施例２で調製されたＣ１１１１−３２Ｂ）は、０．２Ｍ　ＮａＣ１で溶出するセファロース４Ｂカラムでの精製と純水に対する透析の後、２８重量％のヘパリンフラグメントを含有している。

図５は、トリレンジインシアナートおよびエチレングリコールと亜硝酸による開裂反応で生成した低分子量のヘパリンとを共重合させることによって調製されたポリウレタン型ポリマーの重水素化ＤＭＳＯにおけるプロトンＮＭＲスペクトルを示す。

この共重合体（実施例６で調製されたＣＦ３−２２Ｃ）は、クロロホルム、エタノールおよび最後に水で洗浄して、未反応のヘパリンおよび他のモノマーがなくなるまで、十分に洗浄を行った後、０．７重量％のヘパリンを含有している。

図６は、アクリロニトリルと、ヘパリン子穴糖体（ヘバリナーゼ消化による）との共重合体の重水素化ＤＭＳＯにおけるプロトンＮＭＲスペクトルを示す。この重合体は実施例１１で調製されたもので８重量％のヘパリンを含有している。

図７は、実施例１８で調製されたトリレン−２，４−ジイソシアナートとトリス −（ヒドロ牛ジメチル）アミノメタンで誘導体化された低分子量のヘパリン（４，０００〜６．０ＯＯＤａ）とのポリウレタン型共重合体の典型的なＦＴＩＲスペクトルを示す。

この共重合体は５．２４μｇヘパリン／ｍｇ固体を含有している。

図８は、低分子量のヘパリンフラグメントを有するコポリウレタン合成の共重合図を示す。

「を　るための２本発明は、血液と接触する医療装置を構成および／またはコートするのに有用な重合体に関する。これらの共重合体は、その生体適合性物性が、血液が非生体適合性の表面と接触したときに通常起こる血栓作用がなく、血液に接触させて使用できるような物性であるので有利である。

本願で用いる”非トロンボゲン性の”という用語は、その物質自体が血栓の生成および血液の凝固を起こさないことを意味する。′抗血栓性の”および”抗凝血性の”という用語は、その物質自体が血餅閉塞を起こさないのみならず他の刺激によって促進される血餅の生成を活発に防止することを意味する。本発明の共重合体は、抗血栓性でかつ非トロンボゲン性である。

これらの物性は、共重合体に、グリコサミノグリカンの抗血栓性かつ非トロンボゲン性のフラグメントを組込むことによって付与される。そのフラグメントは一般に、適切なグリコサミノグリカンを解重合することによって調製されるが、これらフラグメントを合成によって調製する可能性が全くないわけではない。現時点では解重合で調製する方が経済的である。

グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は、一般に硫酸化された生体ポリマーであり、ウロン酸−グリコサミン二糖の繰返し三糖ユニットである。ＧＡＧが分類される部門はこれらのサブユニットの種類に依存している。ヘパリンは恐ら（最もよ（知られているＧＡＧであり、有効ヒドロキシル位および有効アミノ位のいくつかが硫酸化されているイズロン酸グルコサミンの繰返しサブユニットでほとんどが構成されている。デルマタン硫酸は、ガラクトサミン残基にカブプリングされ、またいくつかのアミ７位とヒドロキシル位と硫酸化されているイズロン酸またはグルクロン酸である三糖ユニットで構成されている。

本発明に有用な他のＧＡＧとしては、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸およびコンドロイチン硫酸の特にＡ型とＣ型がある。

ＧＡＧは、その種類にかかわらず、適切な酵素もしくは化学的分解法を用いて、容易に解重合することができる。例えばヘパリンは、ヘパリナーゼによる消化によって簡便に分解され、一方フンドロイチン硫酸はコンドロイチナーゼで分解される。

化学的分解は、亜硝酸もしくは過ヨウ素酸塩を用いて最も一般的に行われる。分解生成物の種類は分解の態様によってきまる。さらに分解方式の種類は、生成物の低分子量ＧＡＧの別の重合反応に対する官能基の利用性を決定する。

一般に、還元性の末端アルデヒドが保持されている場合、分解後に誘導体化されて、不飽和の非ＧＡＧモノマーとの付加重合反応に関与できるアリル誘導体を得ることができる。付加されるカルボニル部分もある種の分解方式で生成させることができ、これらはさらに誘導体化して重合反応に直接利用することができる。

有効カルボニル基は、イソチオシアナートとの重合反応に関与できるアルコールに還元できる。い（つかの反応方式によって、糖残基中に炭素−炭素の不飽和結合が直接生成する。分解生成物の有効官能基も、所望によって、重合反応に適切な官能基に結合するリンカ−を備えていてもよい。

ＧＡＧの分解を例示するヘパリンについての図式を図１に示す。

図ＩＡに示すように、亜硝酸による分解反応によって、還元性グルコサミン末端残基の脱アミノ化と環縮小が起こって２゜５−アンヒドロマンノースが得られる。得られた還元性末端基における遊離のアルデヒドは、共重合体を形成することができる物質に誘導体化するための好都合な反応基である。過ヨウ素酸塩による分解反応もアルデヒド官能基を生成する０この遊離アルデヒドも還元して対応するアンヒドロマンニトールを得ることができる。

図ＩＢに示すように、ヘバリナーゼによる分解反応によって、非還元末端基に４．５−Ｄ−ウロナートが生成するがこれは付加重合に直接使用できる。

上記のことは、アルデヒドもしくはウロナートの官能性を、共重合体の形成に直接にもしくは間接に使用しなければならないということを意味しない。しかしこれらの官能性を使用すると、これらの部位に共重合を限定するが、例えば遊離のヒドロキシル基もしくはカルボキシル基を利用すると、ポリマーカップリングにフラグメントの内部糖残基が含まれる。

図２は、ＧＡＧフラグメントと付加モノマーユニットとの共重合の方式のいくつかを例示する。図２Ａに示すように、例えばヘバリナーゼ消化で得られる４、５ −ウロナートは、アクリルアミドと反応させて、生成共重合体に組込まれるヘパリンフラグメントを有する付加ポリマーを得ることができる。

図に示すように、複数のアクリルアミド残基は、グリコサミノグリカンフラグメントが共重合される”モノマーユニット”を形成することができる（および一般的には生成するであろう）。したがって本願に用いる”モノマーユニット”という用語は、一般的な共重合反応において勿論不均一な共重合体のグリコサミノグリカンと非グリコサミノグリカンのサブユニットそれぞれを意味する。したがって、ヘパリナーゼフラグメントが、非還元性末端における不飽和結合によって二量体化もしくは三量体化することは理論的に可能であるが、アクリルアミド成分のオリゴマーが生成することは極めて可能性が高い。したがって“成分”という用語は個々のモノマーを示すのに用いられ、“モノマーユニットという用語は共重合体中の個々のＧＡＧもしくは非ＧＡＧの領域を示すのに用１．％られる。

図ＩＢは、付加重合反応に関与させるためにＧＡＧフラグメント中に不飽和結合を与える異なる方法を示す。その還元性末端は、この図にアリルグリコシドの生成反応で示すよう（こ、不飽和化された部分で簡便に誘導体化することができる。アリル誘導体の生成反応は当該技術分野ではごく普通な反応である。この誘導体は、本願で例示した非ＧＡＧモノマーユニツトと、アクリルアミドによって共重合することができる。や（より、先に定義された”モノマーユニットとして、オリゴマーユニットがアクリルアミドから生成する。図にはポリマーにアリル基を入れて示しであるが、重合反応を、図２Ａｌご示したのと類似の方式で、同様に非還元末端で行うことも勿；烏可能である。

図２Ｃは、ヘパリンの亜硝酸による分解生成物に、アルデヒドのアミン化によって所望の不飽和結合を与える、こ〕場合アミノエチルメタクリレートにする誘導体化を行うさら１こ別の方法を示す。メタクリレート中の不飽和結合！±、アク１ノルアミドによって供給される付加モノマーユニ・ノド８１合するのに便利な部位である。

図２に示すように、付加共重合体内にＧＡＧフラグメントを含有させるのに適切な官能性は、このフラグメントの好都合な官能基を誘導体化することによって与えることができる。しタカって一般に、炭素−炭素二重結合は、アルデヒドもしくはへミアセタールの反応性によるフラグメントの還元性末端基に誘導体化され得る。アリル基は図に記載したように直接誘導体化することができる。あるいはアクリル酸もしくはその誘導体のような炭素間二重結合を有する残基は、還元性末端における遊離アルデヒドもしくは開環型とカップリングすることができる。

その上に、非還元性末端における分解反応の結果、ＧＡＧ自体に存在する炭素間二重結合も共重合反応に直接利用できる。

図２に示す実施例に加えて、付加ポリマーは図８に示すようにジインシアナートを用いて生成することができる。この例では適切な反応基はヒドロキシル基あるいはとアミノ基である。付加は、インシアナートのＮ−Ｃ二重結合に対して行われる。多くの場合、ＧＡＧフラグメントは多数のヒドロキシル基をもっているので、この方法は、フラグメント中の大部分の箪二級ヒドロキシル基と比べて選択的に反応する東−級アルコールが提供できると最も有利である。亜硝酸による解重合反応の生成物は、例えば水素化ホウ素を用いて第一級アルコールに容易に還元されるアルデヒドを提供する。ヘパリンの解重合反応では２．５−アンヒドロマンニトールが生成し、これは対応するアンヒドロマンニトールに簡便に還元することができる。デルマタン硫酸の解重合反応では、２，５−アンヒドロタロースが生成し、これは対応するアンヒドロタリトールに還元することができる。還元によって提供された東−ｍアルコールはイソシアナートとの反応に利用することができ、その結果そのフラグメントは付加重合反応に組込まれる。

また上記の共重合反応は、非ＧＡＧ　ｒモノマーユニット」に、最初にジインシアナートと重合するジオールを含有させることによって改変することができる。

したがって、共重合混合物中に例えばエチレングリコール、プロピレングリコール、１．３−プロパンジオールなどを含有させて、ジイソシアナートをＧＡＧフラグメントを有するジオールとの共重合体が得られる。

上記の考察から明らかなように、この共重合体に用いた非ＧＡＧの「モノマーユニット」は、各種のモノマー、タイナマー、トリマーおよびオリゴマーで構成されていてもよく、これらのモノマーユニットは、それを構成するモノマーについては均一であってもよく不均一であってもよい。本発明の共重合体中の非ＧＡＧのモノマーユニットを構成する成分の候補には、アクリル酸とメタリル酸およびそのカルボキシル誘導体、例えばそのアミドとエステルが含まれる。そのアミドは、図２に示すような第１級アミドもよく、または例えば１〜６Ｃのアルキルアミドでもよい。同様にそのエステルは１〜６Ｃのアルキルエステルでもよく、またはエステルのアルキル基は、好ましくはヒドロキシル基のような親水性の置換基で置換されていてもよい。したがって、非ＧＡＧのモノマーユニットの成分としての適切なのは、アクリル酸もしくはメタクリル酸のヒドロキシアルキルエステル、アミノアルキルエステルおよびグリセリルエステルである。また本発明では、ビニルアルコール、アリルアルコール、アクリロニトリルなどのエステルのような他の親水性アルキレンも有用である。ビニルアルコールエステルのエステル基は、重合後、所望により加水分解することができる。いくつかの例では、スチレン、スチレンスルホン酸またはポリプロピレンのような低親水性の非ＧＡＧ成分を利用できる。

一般に、非ＧＡＧのサブニットが不飽和のモノマーから生成される場合、そのモノマー成分は一般式：　ＣＥＩ２＝ＣＸＹで表される。

但し式中、Ｘは、ＨまたＣＨ３ｒあり；Ｙは、−ＣＯＯＲ，−ＣＯＮＨ２、−Ｃ０ＮＨＲ，−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）１．１ＯＨ−−ＣＯＮ［１（ＣＩ’１２）、、ＯＲ−−Ｃｏｏ（ＣＨ２）ｎ。

Ｈ，−Ｃｏｏ（ＣＨ２）、ＯＲ，−０ＣＯＲ，−ＯＲ，−Ｃｔ、−ＣＮ％−Ｃ６Ｈ５、置換された一層、　Ｈｓ、−０ＣＯ（ＣＨ２）、ＯＲ、−０ＣＯ（ＣＨ２）、、ＯＲ，−０ＣＯ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−〇Ｃｏ　（ＣＨ２）　ｎ　ＮＨＲ −および−０ＣＯ（ＣＨ２）ｎ　ＮＲ２からなる群から選択され、これらの基の中のｎは１〜４の整数でありかつＲは１〜４Ｃの直鎖もしくは分枝鎖のアルキル基である。重合が行われた後に、別の反応をＹについて行ってもよい。例えば− 〇ＣＯＲは加水分解して一〇旧こしてもよい。ｎの好ましい値は２であり、Ｒの好ましい態様はメチルとエチルである。

非ＧＡＧの「モノマーユニット」は、多数のこれらの成分の共重体を含有していてもよ（、シたがって、例えばヒドロキシエチルメタクリレ−とビニルアルコールエステルの共重体を利用できるであろう。本願で用いる「多数」という用語は、２種以上の異なるＧＡＧもしくは非ＧＡＧの成分が、モノマーユニット、全体としての共重合体またはその両者について用０られることを意味する。

上記のように、非ＧＡＧのフラグメントは、ウレタン型のモノマーユニットであってもよい。ウレタン型のユニ・ノド番よ、ジオールとジイソシアナートを縮合させることによって得られる。有用なジインシアナートには、トリレンジイソシアナート、および各種のアルキレンジアミンのジイソシアナート誘導体が含まれる。

ＧＡＧサブユニットと非ＧＡＧサブユニットの共重合反応は、選択された特定の成分に適した条件下で行われる。非ＧＡＧフラグメントは予めオリゴマー化してもよく、またはより典型的；こモして好ましくはフラグメントの成分は、共重合反応混合物中のモノマーとじて供給される。このような重合反応の一般的な条件は、当業者に既知である。

上記のように、単一のタイプのＧＡＧもしくは非ＧＡＧの成分、または多数のタイプのいずれか一方の成分もしくは両方の成分を用いてもよい。したがってＧＡＧ成分Ｇ１を非ＧＡＧ成分ＮＧＩと共重合させて、例えば以下の形態の共重合体を得ることができる。

−Ｇｌ−（ＮＧｌｈ−Ｇｌ−（ＮＧＩ）ｓ−Ｇｌ　、または−ＮＧＩ−Ｇｌ−ＮＧ１−Ｇｌ−ＮＧＩ−１または−Ｇｌ−（ＮＧＩ）＋５−（Ｇｌ）２−（ＮＧＩ）３−　である。

−Ｇｌ−（ＮＧｌｈ−０２−＜ＮＧＩ）＋　１ｌ−Ｇ２−を得ることができ、または２種の（多数の）非ＧＡＧ成分を用０て、例えば −Ｇｌ−＜ＮＧＩ）３−Ｇｌ−（ＮＧＩ−ＮＧ２−ＮＧＩ−ＮＧ２）−Ｇｌ、また（±−Ｇｌ−（ＮＧ２）ａ−Ｇｌ−（ＮＧＩ−ＮＧ２−ＮＧ２−ＮＧＩ）−Ｇｌ、またｌよＧｌ−（ＮＧ２−ＮＧＩ）−Ｇｌ−＜ＮＧ２−ＮＧ２−ＮＧＩ−ＮＧＩ）−Ｇｌなどを得ることができる。

得られた共重合体の典型的な分子量は充分に大きく、所望の医療装置の構成もしくはコートするのに容認される適切な物理特性が与えられる。このような装置にはカテーテル、体外処理用の輸送管路、内視同装置などが含まれる。また水溶性共重合体は特に、凝血障害もしくはある種の免疫疾患、’Ｌ”臓血管の疾患およびウィルス疾患の治療に用（する薬理学的薬剤としてしようできる。

１１ヱ本発明の共重合体はまた、架橋剤の存在下で調製して、目的とする特定の用途に対して一層望まい１物理特性を有する製品を得ることができる。付加型ポリマーに用ｔ１典型的な架橋剤は、不飽和結合の２つの中心を有するモノマー成分、例エバビス型のアクリルアミドもしくはヒドロキシアルキＪレアクリレートエステルを含有している。架橋を行う部分！±、重合混合物中に、非ＧＡＧモノマー成分の約５〜１５％、好ましくは約１０重量％の重量％で含有されている。

Ａの本発明の共重合体は、例えばアフィニティーリガンド、樟識もしくは特に付加低分子量ＧＡＧを含む他の有用な部分で誘導体化することができる。このような誘導体化を行うには、重合条件下では反応しないが、その後、共重合体で誘導体化される部分中の官能基と反応できる付加官能基を含有する共重合体を調製するためのモノマーを提供することが好都合である。例えば、非ＧＡＧ部分にアミノエチルメタクリレートを用いると遊離アミノ基を与え、このアミノ基は低分子量ヘパリンのアルデヒド基で誘導体化することができる。任意の簡便なカップリング法を、誘導体化すべき物質の種類および得られる共重合体の官能性によって、利用することができる。

最後に、いくつかの例では、骨格の共重合体は、非ＧＡＧ成分だけを含有し、完全な誘導体化されたリガンドとして低分子量のＧＡＧを含有している。この場合、重合化に対して不活性な官能基はモノマー成分に含まれていて、１つだけの官能基、例えばＧＡＧの還元性末端基に選択的に結合させるのに用いられる。本発明のこの形態は、下記の実施例１３〜１５．１７および１９〜２１に例示しである。

い　のｆ　山以下の実施例は、本発明を例示するのを目的とするもので本発明を限定するものではない。

−Ａ：フラボバクテリウム・ヘパＷナム　Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｈｅ　ａｒ’ｎｕｍ　のヘパ１ナーゼによるヘパ１ンのヘパリンフラグメントのアリルアルコールへのＡ、ヘパリンを、Ａ、　Ｇｒａｎｔらの方法（Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈ　ｒａ、　１３７巻、　２５−３２Ｌ　１９８４年）によってフラボバクテリウムのヘパ１ナーゼが消化する。１ｇの市販のブタ粘膜ヘパリン（Ｓｉｇｍａ社）を、２５＋＊Ｍ酢酸ナトリウム、０．２５＠Ｍカルシウム、ｐｌ！７．０の５．０ｍｌに溶解する。フラボバクテリウム・ヘパリナム由来の市販ヘパ１ナーゼ（これもＳｉｇｍａ社より入手）の１２５０ユニツトを、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐｎ’ｒ、　４の５．０ｍＬに溶解する。これら２つの溶液を合わせて充分混合し、−夜、　３０℃の湯浴内でインキュベートする。酵素による分解生成物を、２．０ｍＬの３ｈＭ　ＨＣＬ中の２０μｌの消化混合物の２３２ｎｍで吸光度を測定することによって定期的にモニターする。

約２０ル２４５Ｘ２ｍＬ部分（各々２００ｍｇのヘパリンを含有している）に分割する。各部分を別々に、直列の２つの１００ｃｍＸ　２．　５ｃｍセファテフクスＧ−５０スーパーファインカラムに注入する（Ｌｉｎｋｅｒ，　Ａ．　オよびＨｏｖｉｎｇｈ，　Ｐ．、’ｏｃ　競’ｓｔ　１１巻，　５５３　〜５７２頁，　１９７２年ｂ）。１５分間づつの画分を、０．２Ｍ　Ｎａｃｌ，　１０％エタノールを用い、０．４ｇＬ／分の流量で溶出する。全画分を、その２３２ｒｖにおける吸光度を測定することによってヘパリンについて検定し、溶出プロフィールにおける各種の大きさのヘパリンフラグメント（三糖〜＋ｐｔｔ＝＞に対応する明確なピークに分析した。

カラム画分中のヘパリンフラグメントを次に、■堅氷に対して別々に透析して凍結乾燥を行った。

Ｂ．ヘパリンフラグメントのアリルグリコシドへの誘導体化：　誘導体化すべきフラグメント４５０１１ｇを、管路に冷トラップを設けて減圧下２４時間にわたって完全に乾燥する。これを、水を含有しないアリルアルコールに溶解し、次に、水、メタノール、アリルアルコールおよび最後に水を含有しないアリルアルコールで５回洗浄して調整したカチオン性（酸性）アンバーライト樹脂（　ＩＲ− １２０１１）に添加する。この混合物を、激しく攪拌しながら室温で反応させる。９６時間後、反応混合物を濾過し、樹脂を５０＋５０のエタノール・水および９８％のエタノールで５回洗浄する。濾液と洗浄液をプールし、小容積に濃縮して、逆相シリカゲルカラム（　ＺＧｃ■ｘ　１．　５ｃ＋ｅ）に注入する。このカラムを、５０＋ｌＬの水、５０ａＬのメタノールで連続して洗浄し、次にヘパリンフラグメントのアリルグリコシドを含有する水面分を凍結乾燥する。

°　Ｂ：　による　アミノ　、によるヘパリ２旦股１皇ヘパリンの解重合を、Ｂ．　Ｃａ５ｕらの方法（　Ｌｚ加１」１９７巻。

５９９−６０９頁．１９８１年）によって実施する。１ｇの市販のブタ粘膜ヘパリンを１型の水４００＋ａＬに溶解して、０．２５％の溶液にする口この溶液に２．　１４ａＬの濃硫酸を添加することによって、Ｏ．　１Ｍ硫酸の濃度にする。この混合物を水浴中で１０℃に冷却し、混合物中に５．５５ｇのＮａＮＯ２を溶解することによって、０．２Ｍ　ＮａＮＯ２の濃度にする。これを１０℃で２分間反応させる。次に、ｐＨが７．０〜７．２に安定化するまでＩＯＭ　ＮａＯＨを添加することによって、上記溶液を中和する。混合物を濃縮し、５００分子量カットオフＡｍ１ｃｏｎ膜を用いて部分的に脱塩し、凍結乾燥する。この乾燥ヘパリンフラグメントを次に少量の■堅氷に再溶解し、次に調製法Ａで記載したようにして、セファデックスＧ−５０スーパーフアインカラムで分析する。Ｔ．　Ｂｆｔｔｅｒおよび８．Ｍ．　Ｍｕｉｒのウロン酸検定法（■■ユ泣吐■４巻，　３３０−３３４頁，　１９６２年）を用いて、画分をヘパリン含量について検定する。カラム画分中に存在する異なる大きさのヘパリンフラグメント（三糖〜子穴糖）を、別々にＩ型の水に対して透析し、次に凍結乾燥する。

（以下余白）裏１」ローアク１ルアミド　ヘパリン溶液　でした４５−＼　ウロニドを　るヘパ１ンフラグメント　の　ムＡ、典型的な重合混合物は、４．５−不飽和結合を有するヘノくリンフラグメント（六糖〜子穴糖）（調製法Ａ（こ〕くラグラフＡに記載したのと同様にして調製）　ＩＱｍｇ、アクリルアミド１１．６■ｇおよびＴＥＭＥＤ　（Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’　、　Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン）０．７２５μＬを、１８０ μＬの水中に含有してｔ′Ｉる。この混合物を３０分間脱ガスしてから、５μＬの水中０．１８μｇの過硫酸アンモニウムを添加する。重合反応を４℃で１８時間行う。セフアゾ・ノクスＧ−２５脱塩カラムおよび／または５０ｍＭ　ＥＤＴＡに対する広範囲の透析によって、未反応のへ／（リンフラグメントを含むモノマーから共重合体を分離する。ヘノくリン含有画分を、ウロン酸を分析する。カルバゾール法（ＢｉｔｔｅｒおよびＭｕｉｒ、　１９６２年）で検出する。画分をプールし、最終的に！型の水１こ対して透析し、凍結乾燥する。図３に示すように、ＮＭＲスベクトルカタ、生成物中にポリアクリルアミドとへノくりンの両方が存在することを確証している。

Ｂ：この実施例の、（ラグラフＡ（こ記載したのと同じ一般的な方法を用いて、下記の各種の大きさのへ〕くリンフラグメントで、いくつかの共重合体を調製した。

（以下余白）共重合体　ｙ　ｉｒ　ｉｙ　ト／用いた　共重合体　共重合体中のの　ｌ　ヘハ゛リンの　のつσン　２　へへ°鵞ンフー　゛メン　％ＣＨ６−１３１Ｄ　へ糖体　３．６　１３ＣＨ６−１３１Ｅ　＋糖体　７．３　２６ＣＢＳ−１３１Ｆ　十三糖体　１０．４　３９メＬ兇目四−１アクリルアミドと　によって犀　したヘパリンフラグメントのアミノエチルメ　り　リ　レート　の　ＡＡ、亜硝酸による脱アミノ開裂反応で得られる低分子量ヘパリン（ＬＭＷＩＩ）　（Ｓｉｇｍａ社の１１１５６４０．平均分子量４．０００〜６．００（＋ダルトン）の水溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）の１．２５ｉＬを水浴中で５０℃に加熱する。これに、６．２５ｍｇの２−アミノエチルメタクリレート（ＡＥＭ。

１［ｏｄａｋ社の１８５１３）を含有する水溶液１．２５■Ｌを添加する。ヘパリンの誘導体化を、攪拌しながら５０℃にて１時間行う。

Ｂ、アクリルアミドとの共重合は、２．５ＩＩＬのアクリルアミド（ＢｉｏＲａｄ社、１６１−０１００．５６分ｇ）の水溶液を添加し、脱ガスを行い、次いで、５０μＬのＮ、　Ｎ、　Ｎ’　、　Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ、　ＢｉｏＲａｄ社、　１６１−０８８０）および１０＋＊Ｌの過硫酸アンモニウム（ＢｉｏＲａｄ社、　１６１−０７００．０．５ｍｇ／μＬ）の保存溶液を添加することによって行う。重合を攪拌しながら５０℃で１０分間続ける。

ＡＥＭに対して２倍モル過剰のＮａＢＨ４を次に添加し、アルデヒド−イミン結合の還元を室温で３０分間実施する。セファロース４Ｂカラム（１，５ｃ＋ｍＸ　８０ｃｍ）を用い、０．２Ｍ　ＮａＣ１で０．２７ｓＬ／分の流量で溶離するクロマトグラフィーで、共重合体を未反応のモノマーから分離する。１５分ずつの画分を、ウロン酸についてカルバゾ−ル法（ＢｉｔｔｅｒおよびＭｕｉｒ、　１９６２年）で検定することによって、共重合体のピークを検出する。共重合体はカラムの全容積Ｖ、の近くで溶出する。ＮＭＲスペクトルは、共重合体がヘパリンとポリアクリルアミドの両方で構成されていることを確証しており、典型的な例を図４に示す。

Ｃ１上記のパラグラフＡとパラグラフＢの同じ方法に従い、さきに述べたパラグラフＢで得た異なるヘパリンフラグメントを用いて、以下の示すように、いくつかの共重合体を調製した。

共重合体　１５’）”ｌント／用いた　共重合体中　共重合体中のの　ヘパ１ンの　の　σン　駕　へへ°１ンブ　゛　ン　χＣＨ３−２３Ｄ　ＬＭＷＢ（Ｓｉｇｍａ社）　６．８　２２Ｃ■８−３２Ｂ　へ糖体　９．５　２８Ｃ１１８−３６Ａ　＋糖体　１０．０　３５１！Ｌｍスチレン　による　アミノのヘパ１ンフラグメントのアミノエチルメ　り　リ　レート　の　４低分子量ヘパリン（Ｓｔｇｇａ社Ｅ１５６４０．平均分子量４，０００〜６，０００ダルトン）をアミノエチルメタクリレート（ＡＥＭ）で誘導体化する。３６ｍｇのヘパリンを１．８■Ｌの水に溶解して２％の溶液を作り、５０℃に加熱する。５ｍｇ／ｍＬのＡＥＭ溶液１．８■Ｌを、上記の加熱ヘパリン溶液に添加する。この溶液を５０℃にて１時間反応させる。

ＡＥＭで誘導体化したヘパリン４２Ｂを、７０℃に加熱することによって、２４０ｗＬのホルムアミドに溶解する。得られたヘパリン溶液は、反応混合物に０．２７ｍｇのＳＤＳを添加することによって、ドデシル硫酸ナトリウムの濃度を０．１％にする。この溶液にＮ２を２０分間バブリングさせることによって脱ガスを行う。次に０．８１謙ｇのＡＩＢＮ（２，２’−７ゾービスーインブチロニトリル）と５ｍｇ／ＩＬの過硫酸カリウム溶液５μＬを添加する。抑制剤を含まないスチレン２４μＬを添加し、得られた混合物を６０℃で２４時間激しく攪拌する。得られた共重合体を水で数回洗浄し、凍結乾燥する。Ｐ、に、　Ｓｉ＋ｉｔｈらの異染性トルイジンブルー染料結合法（ΔＬＬＬＬｉ甜１東１０９巻、４６６〜４７３頁、　１９８０年）で検定した結果、１．３重量％のヘパリンが共重合体（ＣＲ２−３９と命名）に組み込まれていることが判明した。

皇１１」− ヒドロキシエ　ルメ　ル−ト　Ｍヘパリンのアリルグリフシト１３．５ｍｇ（３１製法ＡのＢ項に記載されているのと同様にして調製）を、４００μＬのメタノール：水（１：１）に溶解し、この溶液に１００μＬの抑制剤を含まないＨＥＭＡを添加する。この溶液にＮ２を２ｏ分間バブリングさせることによって混合物の脱ガスを行う。次に、１μＬのＴＥＭＥＤ（Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ゛−テトラメチルエチレンジアミン）と、１００ｍｇ／ｍＬの過硫酸アンモニウム溶液５μＬとを加え、反応混合物を室温で２４時間静置する。得られたゼリー上の共重合体を、Ｉ）Ｈｌｏ、Ｏの溶ｆｉ（１：１、インプロパツール：水）およびｐＨ３，０の溶液（水）で交互に３回３０分ずつ洗浄する（Ｍ、Ｒ，ｖａｎ　ｄｅ　Ｍａｒｋら、ｄｖａ　ｃｅｓ　ｉｎ　ｉｍ　’ｃａ　ｏ　ｍｅｒｓ、　Ｅ、Ａ、　Ｇｅｂｅｌｅｉｎｍｌｉ集、　Ｐｏｌｙｍｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　３５巻、３７３〜３８０頁、　１９１１７年、ニューヨーク、　ＰＩｅｎｕ＋ｅ　Ｐｒｅｓｓの方法に従って行う）。最後の洗浄を行ってから、共重合体を凍結乾燥し、ヘパリン含量を検定した結果、その共重合体（ＣＨ２−４２と命名）に０．１重量％のヘパリンが存在していた。

実Ｊ１１１アクリロニトリル　゛　で　したヘパリンフラグメント　の　Δ ４４ｍｇノヘパリンニ糖体二糖製法ＡのパラグラフＡに記載したのと同様にして調製）を５００μＬの水に溶解する。抑制剤を含まないアクリロニトリル５２μ Ｌを添加し、次に５．５μＬの試薬を添加することによって混合物のＴＥＭＥＤａ度を１％にする。Ｎ２を２０分間ゆっくりバブリングさせることによって、上記溶液の脱ガスを行う。１１０ｍｇ／ｍＬの過硫酸アンモニウムのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）溶液５μＬを脱ガス後に添加し、この共重合混合物を激しく攪拌しながら７０”Ｃまで加熱する。７０”Ｃで２時間経過した後、混合物を水浴から取り出し、沈澱を遠心分離して取り出し水で３回洗浄し、次いで乾燥する（ＣＨＩＩ−１１Ｐと命名）。

支五医エトリレンジイソシアナートおよエチレンジ１フール　による　アミノ −のヘパ１ンフラグメント　の　ムＡ、低分子量のヘパリン（Ｓｉｇｍａ社［５６４０，平均分子量４．０００〜ａ、　ｏｏｏダルトン）を水素化ホウ素ナトリウムで還元する。１１０＋ｍｇのヘパリンを２■Ｌの水に溶解し、その溶液に、１ｍＬ水冷水中７６■ｇのＮａＢＨ４溶液を添加する。ヘパリンのアンヒドロマンノシル部分の還元を一夜（約２０時間）室温で行う。得られた反応混合物を、ｐａが５．２に安定化するまで氷酢酸で酸性にする。

メタノールで蒸発を（３回）繰り返すことによって、過剰のホウ水素化物を除去し、最後に、還元されたヘパリンを凍結乾燥する。

８、　１０１ｍｇの還元ヘパリン（約１７〜２５■■ｏｌ）を、７０℃まで加熱することによって、５■Ｌのホルムアミドに溶解する。この溶液を１００μ乙のエチレングリコール（１８ｍｍｏｌ）と混合し、次に５■Ｌのジメチルスルホキシドで希釈する。この混合物を水浴中で冷却し、ポリヒトミ牛シ成分より過剰のＬｍＬのトリレン−２，４−ジイソシアナート（７ｍｍｏｌ　）を添加する。混合物を徐々に室温（２０℃）まで加熱しながら、攪拌しつつ約６４時間、共重合反応を続ける。生成した粘稠混合物をクロロホルムに注入することによって共重合体を単離する。上澄み液に未反応のヘパリンがなくなるまで、沈澱をクロロホルム、エタノールおよび最後に水で充分に洗浄する。なお未反応のヘパリンはウロン酸を測定するカルバゾール法で測定する。洗浄した共重合体を凍結乾燥し、ヘパリンを染料結合法（Ｓｎ＋ｉｔｈら、　１９１１０年）で検定する。検定は生成物が０．７重量％のヘパリンを含有していることを示している。その共重合体（ＣＦ３−２２Ｇと命名）は、水に不溶であるがジメチルスルホキシドには容易に溶解し、そノＮＭＲスペクトルは、図５に示すように、ポリウレタン構造中の芳香族残基およびヘパリンに帰属するいくつかの新しいバンドにＭ密に関連している。

Ｃ，３■Ｌのジメチルスルホキシド中９３ｍｇの還元ヘパリン（約１９ｉｍｏ１．　パラグラフＡで調製）を含有する溶液に４６．５μＬのエチレングリコール（０，８３ｍｍｏｌ）を添加し、さらに３＋＊Ｌのジメチルスルホキシドで希釈すること以外は上記のパラグラフＢに記載したのと同じ方法で溶液を調製する。

次いで溶液に１２１μＬのトリレン−２，４−ジインシアナート（０，８５ｍ＋ｓｏ１．還元ヘパリンとエチレングリコールの合計量に対して当モル）を添加し、水浴内で冷却し、混合物を室温（２１℃）に徐々に近づけながら、Ｎ２雰囲気下攪拌しながら２４時間反応を続けさせる。生成した共重合体（ＣＲ２−２ＩＣと命名）は、適切に洗浄し乾燥して検定した結果、１．９７重量％のヘパリン含量を示す。

実１ｕ先Ｌヘパリンフラグメントを　み゛んだい　つかの八　の　°　゛　と　゛共重合体を、抗凝血活性と抗血栓活性について、ＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間、　Ｓｉｇ＋ｅａ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　Ｎｏ、Ａ７６６ｇ）および抗Ｘａ因子（Ｓｉｇｍａ　Ｔｅｃｂｎｆｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ第８７０号、　Ｈｅｐａｒｆｎ　ｉｎ　Ｐｌａｓｍａ）検定法で評価する。後者の方法は、その血漿阻害剤（抗トロンビン■）によって、活性化Ｘ（Ｘａ）因子を中和することに基づいている。抗Ｘａ：　ＡＰＴＴの比率はこれらの試験結果から計算される。

抗Ｘａ活性：　ＡＰＴＴの比率は、物質の抗血栓力をその抗凝血活性に関して測定するのに重要である。高比率を存する物質は、より抗血栓性であり、しかも出血の危険が少ない。これは、抗Ｘａ検定法は、凝血カスケードの早期の段階でトロンビンの生成を遮断する物質の性能を測定し、一方ＡＰＴＴは、凝血・が進行する多くのステップで凝血を停止させる物質の性能を測定するからである。従って、抗Ｘａ活性は特異的に、局所的な抗血栓力に関連し、一方ＡＰＴＴは全体的な抗凝血活性の尺度である。市販のヘパリンは約１の抗Ｘａ／ＡＰＴＴ比を有し、Ｓｉｇｍａ社から入手した低分子量ヘパリンの同比率は約２である。

表Ｉから実施例１と２に記載したように調製した共重合体の分析結果を示す。これらの共重合体は水に可溶であるので、ＡＰＴＴ法と抗Ｘａ法で直接検定することができる。小さなヘパリンフラグメントで調製したこれらの共重合体の分析結果は、これらの共重合体が一般に、共重合体を調製するのに用いた短いオリゴ糖の特徴がある高い抗Ｘａ／ＡＰＴＴ比を保持していることを示している。例えば、調製法Ａによる大きさがへ糖体、十糖体および十三糖体のヘパリンフラグメントの抗Ｘａ／ＡＰＴＴ比は、それぞれ４Ｊ、７．４および６．５である。同様に、調製法Ｂによる大きさがへ糖体および十糖体のヘパリンフラグメントの抗Ｘａ／ＡＰＴＴ比は、それぞれ１０．４と１０．０である。共重合体中の１つ、すなわちＣＨ−３６Ａという名称のものは、対応するフラグメントと比べて高い抗Ｘ　ａ／Ａ　ＰＴＴ比を示すが、これは恐らく、異なる調製法に起因するフラグメントの固有の活性の変動が原因か、または互いに距離をおいてかつ共重合体骨格鎖へのペンダント部分としてランダムに組み込まれている活性フラグメントのより優れた利用が原因であろう。

（以下余白）永　工（１１也山１ン（曳悦例１）ｃＨ’−１３”　Ａ、／Ｘ’）ン　）９　１１．０　５５　５．０（父記イマリ］、）（γｌ−９２） αトコ２Ｂ　へ１．Ｆｌ）ンへオ停−２８１１９１２７１０，７（ｉｌ［を紐Ｌｉ）〔γｉｉ！例２−）裏Ｊｕ１１によって　れたヘパリンとアクリルアミドの　ムヘパリンのフラグメントを、調製法Ａ（パー）Ａ）に記載したようにして、エフ・ヘパリナム由来のヘバリナーゼで消化することによって調製する。一般的な共重合法では、モノマーの水溶液と有機相が調製される。モノマー相は、６０ｍｇのヘパリンフラグメント（大きさはへ糖体〜子穴糖体の範囲）、２４０ｍｇのアクリルアミド、６０ｍｇのポリビニルピロリドン、および２０ｍｇのＮ、Ｎ’　 −メチレン−ビス−アクリルアミド（Ｂｉｓ）を１．６ｍＬの■盟の水に溶解したものを含有し、一方育８！相は、１１ｍＬのトルエン、５ｍＬのクロロホルムおよび８０μＬの５ｐａｎ８５の混合物で構成されている。モノマー相を水浴内で約Ｏ℃に冷却し、次に１６０μＬの５０ｍｇ／ｍＬ過硫酸アンモニウム溶液および２０μＬのＴＥＭＥＤ　（Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’　、　Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン）と混合する。この溶液を、パドルスタラー（ｐａｄａｔｅ−ｓｔｔｒｒｅｒ）で迅速に攪拌されている三ロ丸底フラスコ内に入っている有機相に、ピペットで添加する。全モノマー相を添加し終わるまで、上記フラスコに窒素ガスをゆっ（りと通じた。混合物を、２５℃で３０分間、高速度で攪拌しながら反応させ、次に６５℃で６０分間、低速度で攪拌しながら反応させる。反応混合物をガラス漏斗に移し、■堅氷、アセトンおよび最後にメタノールで洗浄する。

得られた共重合体の粒子を懸濁させて５日間浸漬してポリビニルピロトンと未反応の成分を除く。共重合体の粒子を再びガラス漏斗上で、大量の■堅氷とメタノールで洗浄する。

得られた固体の共重合体を６０℃で４〜５時間減圧乾燥する。

これを、Ｓｍ１ｔｈら（１９８０年）のトルイジンブルー染料結合法を用いてヘパリン含量について検定した結果、２ｍｇのヘパリン誘導体粒子（０，２ｇ重量％のヘパリン）の含量を示す。

実」【列」− Ａ、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、から入手した低分子量のへバリア　（４，０００〜６，０ＯＯＤａ）を、実施例２（パラグラフＡ）と実施例３に記載の方法にしたがって、アミノエチルメタクリレート（ＡＥＭ）で誘導体化する。得られたヘパリン誘導体を、３，５００ＭＷＣＯ５ｐｅｃｔｒａｐｏｒｅ　ｔｕｂｌｎｇ内で透析することによってさらに精製しく過剰のアミノエチルメタクリレートを除くために行う）、内部透析物を凍結乾燥する。

Ｂ、一般的な共重合混合物は、３０ｍｇのアクリルアミド、３０ｍｇのＡＥＭ誘導体化低分子量へパリ／（ＡＥＭ−ＬＭ　、ＷＨ）および２．５ｍｇのビス−アクリルアミドを含有し、これらを１．０ｍＬの！型の水に溶解し次に水浴中で約０°Ｃに冷却する。これに１６０μＬの５０ｍｇ／ｍｌ過硫酸アンモニウム溶液と２０μＬのＴＥＭＥＤを添加する。得られた溶液を充分に混合し、窒素ガスを反応混合物中にゆっ（リバブリングさせる。反応混合物に、−夜室温で重合を続けさせる。得られた反応混合物を３，５００ＭＷＣＯチュービング・内に５０ｍＭ　ＥＤＴＡに対して透析させ、続いてＩ型の水に透析させる。内部の透析物を凍結乾燥し、次いでセファデックスＧ−１５０スーパーフアインゲルのカラムを通じて、０゜２Ｍ　ＮａＣ１をランニング緩衝液として用いて濾過する。

画分く１５分間づつ）を、約Ｑ、１ｍＬ／ｍｉｎの流速で集め、ウロン酸について検定して、共重合体を含有する画分を固定する。共重合体を含有するこれらの画分をプールし、脱塩し凍結乾燥する。ウロン酸、ＡＰＴＴおよび抗Ｘａ因子の検定を共重合体に対して実施してヘパリン含量と生物活性を測定する。試験結果は、共重合体の、ヘパリン含量が１７％、ＡＰＴＴ活性が２．９Ｕ／ｍｇおよび抗Ｘａ活性が６．６３Ｕ　／　ｍ　ｇであることを示している。

実ｉｆＩ上」− てビス−アク−ルアミド　るアリル−へパイン　アクｌルアミド　の　４調製法Ａ（パラグラフＢ）の記述通りに、酵素的消化で得られたヘパリンフラグメントのアリルグリコシドを調製するＯＡＥＭ−ヘパリンの代わりにアリル−ヘパリン（子穴糖体サツカライド）　３０ｍｇを使用すること以外は、共重合は、本質的に実施例９と同一の手順に従う。適当に精製し、凍結乾燥した共重合体のヘパリン含有量は１１％で、ＡＰＴＴ活性は僅か０．６２Ｕ／ｉｇであり、事実上、抗Ｘａ活性は皆無である。

１敷匠上エアリルーへバリン　アクリロニドデルとの　Ａ酵素的に生成したヘパリン子穴糖体は、前と同様、アリルグリコシドに誘導化する。インヒビターを含有しないアクリロニトリル２００μＬに、アリル−ヘパリンｚｏＢｔ−溶解り、、Ｉ　’！水１５０μＬ中で、ＡＩＢＮ　（２，２’−アゾ−ビス−イソブチルニトリル）　５ｍｇと混合する。この混合液を、７０℃のオイルバス中で４．５時間攪拌する。固体の共重合体を生じ、これを遠心分離で回収してＩ復水で徹底的に洗浄する。この共重合体を乾燥し、トルイジンブルー染料結合法を用いて、ヘパリン含有量を分析する。ＡＰＴＴ及び抗Ｘａ因子検定法で、生物学的活性を測定する。

以上の検定結果で、ヘパリン含有量は８％、ＡＰＴＴ及び抗Ｘａ活性は、それぞれ０．１５１１／ｍｇ固体及び１．　ＱＵ／ｍｇ固体を示す。図６に、共重合体の典型的なＮＭＲスペクトルを示す。このスペクトルは明らかに、アリル基に相当する特徴的なシグナルが存在しないことを示す。

裏立五工１ＡＥＭ−ヘパＴン　アク駅ロニト１ル　の　ム実施例９（パラグラフＡ）の記述通りに調製したＡＥＭ−ヘパリンを水に溶解する。１００ｍＬ丸底フラスコ内のＡＥＭ−ヘパリン溶液（１０ｍｇ／Ｌ）２５ａ＋Ｉ、を、サーモスタットで温度調節したオイルバスで７０℃まで温める。インヒビターを含有しないアクリロニトリルＳｍＬ中にＡＩＢＮｌ、７ｍｇの溶液をフラスコに加え、温度を７５℃まで上げる。この混合液を、攪拌しながら３時間反応させると、フラスコの内側に白色の析出物を生じる。この析出物を取り、ガラスロート内でＩ復水で徹底的に洗浄する。

これをＩ復水に再懸濁し、凍結乾燥する。ヘパリン含有量は０．５％で、共重合体は高い抗凝血活性を示す。

Ｌ監五上主アミノエチルメ　りｌレート　アクミロニトリル　の　４な゛　に　ヘパリン　いた　ム　の　Ｉジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１０ｍＬにＡＥＭ２．５ｇを溶解し、インヒビターを含有しないアクリロニトリル（ＡＥＭとアクリロニトリル１：１モル比）１ｉＬ及びＡＩＢＮｏ、　３ｇを、この溶液に加える。攪拌しながらこの溶液を７０℃まで温め、４時間反応させる。反応混合液は粘性の溶液に変わり、強く攪拌しながら、この反応混合液を塩化メチレン溶液ＩＬに滴下すると、共重合体が析出する。ガラスロートで、析出した共重合体を濾過し、塩化メチレンで充分に洗浄する。７０℃の減圧オーブンで、この共重合体を乾燥し、押しつぶして粉末にする。

ＡＥＭ−アクリロニトリル共重合体２５０■ｇを５％フフェノール１４ｍしに溶解し、そして５％フェノール１礼に溶解した低分子量ヘパリン（４，Ｇｏｏ〜６，０ＯＯＤａ）　６３■ｇをこれに加える。この混合液を室温で２４時間、穏やかに攪拌する。次に、ソジウムシアノポロヒドリドＬｏｎｇを加え（ｐ［Ｉ５）、反応をさらに４８時間続ける。誘導体化した共重合体を、ａ、　ｏｏｏ〜８．　ＯＯＯＭＷＣＯスペクトラボア・チューブ内で■堅氷に対して透析し、凍結乾燥する。

ウロン酸検定法を使用して測定すると、ヘパリン含有量は５゜５％である。ＡＰＴＴ及び抗Ｘａ因子検定法で生物学的活性を測定すると、それぞれ８．８Ｕ／Ｉ１ｇ及び１６．７０／＊ｇである。

爽五五上玉ヘパ嘗ン　いた　ζて′−゛　アミノエルメ　りｔレート　２−ヒドロキシエチルメ　りｉレートロカ人日ぼし友１金１００礼丸底フラスコ内で、ＡＥＭ２．　Ｓａｇ及びＨＥＭＡ２罵りを、ＤＭＳＯ２ｇ、５ｍＬｋ：溶解し、これニＩＺＯ−６７（２，２’−７ゾービスーメチルブチロニトリル）　１１５５ｍｇを加える。このフラスコを濁流コンデンサーに取り付けて、７０℃まで加熱したオイルバスに入れる。この混合液を、この温度で４時間反応させる。強く攪拌しながら、この反応溶液をジクロロメタン５０ＯｓＬに滴下すると共重合体が析出するので、次にガラスロートで濾過する。この共重合体をＤＭＳＯに再び溶解し、ジクロロメタンで再析出し、再度濾過する。この手順をもう一度繰り返し、６０℃の減圧オーブンで共重合体を乾燥する。

ＡＥＭ−ＨＥＭＡ共重合体１００曹ｇと低分子量ヘパリン（４，０００〜６，０００Ｄａ）　２５℃１ｇを、Ｉ復水９ｉ＋Ｌに溶解し、室温で一晩穏やかに混合する。この溶液が僅かに酸性（ｐＨ６）なので、ソジウムシアノボロヒドリドＩＯＢをこの溶液に加え、室温で一晩攪拌し続ける。反応混合液を６．　Ｇｏｏ〜８．０００１ｆｌＣＯチューブ内でＩ堅氷に対して透析し、内部の透析物を、凍結乾燥する。ウロン酸検定法は、ヘパリン含有量は５．１％を示し、ＡＰＴＴ及び抗Ｘａ活性は、それぞれ１７．６及び１１８Ｕ／ｉｇである。

Ｌ五五上エヘパリン　いた　が′　る　アミノエチルメ　り「レート　４−スチレンスルホン　の　４ＡＥＭＱ、　５ｇ及び４−スチレンスルホン酸０．５２　ｇをＩ覆水２５ｍＬに溶解する。Ｉ／ＡＺＯ−６７０，７５ｇを混合液に溶解し、反応開始剤３％を含有する溶液とする。この溶液を７０′Ｃまで加温し、この温度で４時間、攪拌しながら反応させる。黄色の析出物が得られるので、反応混合液から分離する。これをＯ，１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０，９）　５０ｍＬに再び溶解し、３．５ＯＯ１ｆｆＣＯチユーブ内でＩ堅氷に対して透析した後、この共重合体を凍結乾燥する。

ＡＥＭ−スチレンスルホン酸共重合体４Ｇ＋＊ｇと、低分子量ヘパリン（４，０００〜６．ＱＯＯＤａ）　１０ｍｇを、Ｉ型水３．　ＳｍＬに溶解し、室温で２４時間ゆっくり混合する。次に、僅かに酸性の溶液中にソジウムシ７ノボロヒドリド１０■ｇを溶解し、室温でさらに２４時間混合する。この混合液を、ａ、ｏｏｏ〜８，０ＯＯＩｆｌＣＯチユーブ内でＩ堅氷に対して透析しく非結合ヘパリンを除去するため）、内部の透析物を凍結乾燥した。ウロン酸検定法では、誘導体化した共重合体のヘパリン含有量は２２％である。ＡＰＴＴ及び抗Ｘａ活性は、それぞれ９．８及び１４０Ｕ／ａｇである。

Ｌ血勇上亙ヘパリンのアミノエチルメタクルード　と４−スチレンスルホン　との　Δ 実施例９（パラグラフＡ）の記述通りに、低分子量へバリア　（４，０００〜６，０ＯＯＤａ）　ノＡＥＭ誘導体を調製する。ＡＥＭ−ヘパリン水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）１０ｍＬに、４−スチレンスルボン酸溶液４ｏＯｍｇを溶解する。ＶＡＺＯ−６７３００ｍｇを加え、温度を７０　”Ｃまで上げる。攪拌しながら共重合反応を一晩行う。次に、この溶液を６．０００〜１１．ｏｏＯＭＷｃｏチューブ内で、５０ｍＭ　ＥＤＴＡに、続いて■復水に対して透析し、凍結乾燥する。ウロン酸検定法では、乾燥した共重合体のヘパリン含有１２．７％である。ＡＰＴＴおよび抗Ｘａ方法を用いた生物学的活性は、それぞれ１６Ｕ／ｍｇおよび１６０Ｕ／ｍｇである。

酢酸ヒニル（１，７５ｇ）およびＡＥＭ（０，２５ｇ）を、ＤＭＰ（２５ｍＬ）　ニ溶解し、チッ素雰囲気下で、この溶液にＶＡＺＯ−６７（２Ｇ＋＊ｇ）を加える。

この溶液を、７０℃の恒星オイルバスで２０時間加熱する。結果として生じた溶液を、減圧下で蒸留することにより濃縮し、さらに、強く攪拌しながら粘性溶液を水中に懸濁すると共重合体が析出する。この析出物を濾過し、水で素早く洗浄した後、凍結乾燥した。実施例１３〜１５の記述と同一の一般法に従って、ＤＭＦ溶液中のＬＭＷＨ（Ｓ　ｉｇｍａ＞を用いてこの共重合体を誘導体化する。このヘパリン含有量は０．２６％（重量）である。

支丘五上１トリレンジイソシアナート　び　ヘパリンＬＭＷＨと　トリス−ヒドロ牛ジメチル　アミ／メタン上９」Ｕ１含Ａ、亜硝酸解重合で生じた低分子量ヘパリン（４，０００〜６，０００　Ｄａ、）を、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｕ、Ｓ、Ａから得る。水素化ホウ素ナトリウムの存在下、２０〜２５倍モル過剰のホルムアミド溶液中のトリスを用いて、還元アミノ化により、これをプレ誘導体化する。一般に、トリス５０＋＊ｇ、　ＬＭＷＨ１０１，２ｍｇおよびＮａＢＨ４５，５ｍｇを、ホルムアミド５ｍＬ　（総量）に溶解し、この溶液を室温で一晩（１６〜２２時間）放置する。この混合物を、水浴中に立てた小さな丸底フラスコに移し、ゴム栓をして、その中にチッ素ガスを通す。約１５分後、注射器でトリレン−２，４−ジイソシアナート（大過剰）を加え、ジメチルスルホキシド５ＩＩＬでこの溶液を希釈する。４℃、Ｎ２雰囲気下で、攪拌しながら共重合を一晩続ける（約１８時間）。結果として生じた共重合体は、メタノールとクロロホルム（各１００ｍＬ）の混合液を加えて析出する。この析出物を濾過し、クロロホルム、メタ／−ル、メタノール−水、さらに最後に純水で徹底的に洗浄する。この共重合体を７０℃の減圧オープンで乾燥すると、５ｓｉｔｈらトルイジンブルー染料結合法（１９８０）による、ヘパリン含有量は５．２４μｇ／ｍｇ固体である。ＡＰＴＴおよび抗Ｘａ因子検定法で測定した生物学的活性は、それぞれ７．３ｍＵ／ｍｇ固体および８．３５１１ＩＵ／ｍｇ固体である。図７に、３４００ｃｍ−’の水酸基および１７００ｃｍ−’のウレタン結合の強い吸収バンドを示す、典型的なＦＴＩＲスペクトルを示す。

Ｂ、その後、Ｌ！ｆｆ［Ｔのプレ誘導体化のため、ＬＭＷＨＬ１４ｒｓｇ、ｆ− リス１２１．４ｍｇおよびＮａＢＩ（，１２，６１ｇを、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２ｍＬとホルムアミド６ｍＬの混合液に溶解すること以外は、上のパラグラフＡの記述と同一の手順を行う。触媒として使用するジブチルチン１００ＡＬＬおよびトリレン−２，４−ジインシアナート１４５μＬ（１−リスの量と当モル）が存在すること以外は、上述のものと正確に同一の条件下で共重合を行う。水浴中で５時間、次に室温で１６時間、この反応を続ける。クロロホルムで共重合体を析出させ、メタノールと水で充分に洗浄し、６０℃のオーブンで乾燥する。これで、ＡＰＴＴおよび抗Ｘａ活性が、それぞれ１３ＩＩＵ／＊ｇおよび１４蓮Ｕ／ｍ　ｇの、ヘパリン０．４μｇ／ｍｇ固体を生じる。

ＬＭＷＨ８１＋ｇｇ、Ｉ”リス４９．６ＢおよびＮａＢ１１ｇ　５．１ｍｇを、ホルムア　、ミド３ｍＬに溶解すること以外は、実施例１８の記述と同一の手順に従う。トリスを用いて、室温で一晩（１９時間）誘導体化を行う。次に、ハイボーアに０１ｙｐｏｌ）２０００　（１，６ｍｅｑ　ＮＣ０７ｇを含有するインシアナート−停止したプレ重合体）２．０４ｇと反応させ、ジメチルスルホキシド７ｍＬで希釈し、Ｎ２雰囲気下の丸底フラスコに移す。この反応を４℃で２２時間続け、６時間後にクロロホルム１８紅を加えて混合液の粘度を下げる。最後に半固体の塊・が得られ、これをクロロホルム２０ＯｍＬに拡散し、大量（約８００ｍＬ）のメタノールで析出させる。メタノールと水で徹底的に洗浄した析出物を、前と同様に乾燥する。この共重合体のヘパリン含有量はり、０５ｇｇ／＊ｇ固体、ＡＰＴＴ活性は８．４ｒａＵ／Ｈｇ、抗Ｘａ活性は７．２ｍＵ／ｍｇである。

Ｌ五五主立トリレンジイソシアナート　セ１ノール　の　４およ　ヘパ１ン　いた　Ａ　の塩酸セリノール１モル（１２７，４ｍｇ）を、ジメチルアセタミドに溶解し、トリレン−２，４−ジイソシアナート１４２μＬ（当モル）およびジブチルチンジラウレート（触媒）　５０μＬを加える。６５℃のロータリーエバポレーターで約３０分間、次に室温（２１℃）で１８時間、この混合液を反応させる。この混合液をクロロホルム２００ｍＬに懸濁して共重合体を析出させ、メタノールと水で充分に洗浄し、濾過した後、減圧オーブンで乾燥する。乾燥共重合体３５．６ｍｇをホルムアミドに溶解し、やはりホルムアミド中のＬＭＷＨ５１，３Ｂ、　ＮａＢＨｔ　８．ｈａｇと、この溶液を混合し、全量を４ｍＬとする。共重合体の誘導体化のため、この混合液を室温で一晩（約１７時間）放置した後、析出させ、水で洗浄する。

この析出物を減圧オープンで乾燥すると、トルイジンブルー染料法でヘパリン０．２６ｇｇ／■ｇ固体を示し、ＡＰＴＴおよび抗Ｘａ活性は、それぞれ３０ｍＵ／ｍｇおよび２４０ｍ■／ｒａｇを示す。

案Ｊｕ１ユ」− トルレンジイソシアナートとト１スー　ヒドロキシメチルアミツメ　ン　の　ムお　び　ヘパ富ンいた　Δ　のトリス１２０ｍｇ（１ミリモル）をジメチルホルムアミドに溶解すること以外は、実施例２０の記述と同一の手順を用いる。当モル量のトリレン−２，４−ジイソシアナート（１４２μＬ）を加え、ジブチルチンジラウレート５０μＬの存在下で共重合化を行う。前と同様に、この共重合体を析出させ、洗浄し、減圧オーブンで乾燥する。乾燥共重合体（３６１ｇ）を、低分子量ヘパリン（６１，３ｍｇ）およヒ水素化ホウ素ナトリウム（Ｉｆ　４ｍｇ）と−緒に、ホルムアルデヒド（４ｍＬ）に溶解する。共重合体の誘導体化を、室温で一晩続ける。結果として生じた生成物を、ｅ、　ｏｏｏ〜８．ＱＯＯ１ｆｌｃｏスペクトラポア透析チューブを使用して、純水に対して徹底的に透析する。Ｒｏｔｏｖａｐで透析した溶液を濃縮し、７０℃の減圧オープンで乾燥する。この生成物はヘパリン６４μ ｇ／ｍｇ固体を含有し、高い抗Ｘａ活性を示す。

つ０７２ｗ　−２，５−アンヒトに＋−Ｄ−７７ノー人〜６−石ｉＪｌ　４，５ −Ｄ−ラミナートＡ　Ｂ要約書抗血栓性および非トロンボゲン性の新しい生体適合性のグリコサミノグリカン共重合体が、抗凝血特性を長期間もしくは永久に維持することがめられる、需要性の高い生物医学的用途に対して提供される。本発明の新規な共重合体は、合成のモノマー成分と共重合させた、ヘパリンのようなグリコサミノグリカンの小さなフラグメントまたはセグメントを含有する。本発明は、ヘパリンなどのグリコサミノグリカンの小セグメントが、血栓症を阻害もしくは防止する抗血栓活性を有しおよび保持するという事実を利用するものである。抗凝血性フラグメントは酵素または化学的手段で簡便に生成され、合成のモノマーと共重合される。

国際調査報告　ＰＣＴ／ＣＡ　９１１００１２０＋ｍｅ増−−−＾−ｅｂｔａ＋ｖａｎ　ＰＣＴ／ＣＡ　９１１００１２０国際調査報告Ｃ＾９１００１２０Ｓ＾　４６２１７

Claims

【特許請求の範囲】

１．血液と接触する生物医学的装置を構成またはコートするのに適切な生体適合性共重合体であって、該共重合体が、抗血栓性および非トロンボゲン性であり、少なくとも１つの非グリコサミノグリカンのモノマーユニットと共重合させた少なくとも１つのグリコサミノグリカンフラグメントのモノマーユニットを含有する、生体適合性共重合体。
２．前記グリコサミノグリカンフラグメントが高分子量のグリコサミノグリカンの酵素的分解生成物または化学的分解生成物として調製され、そして該グリコサミノグリカンフラグメントが抗血栓性および非トロンボゲン性である、請求項１に記載の共重合体。
３．前記グリコサミノグリカンフラグメントがヘパリン、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸Ａ型、コンドロイチン硫酸Ｃ型またはヒアルロン酸から誘導される、請求項２に記載の共重合体。
４．前記グリコサミノグリカンフラグメントがへパリンから誘導される、請求項３に記載の共重合体。
５．前記グリコサミノグリカンフラグメントがヘパリンを解重合し、そして五糖体から十六糖体の大きさのフラグメントを回収することによって得られる、請求項４に記載の共重合体。
６．前記解重合が、へパリナーゼによる消化、亜硝酸による処理または過ヨウ素酸塩による開裂によって行われる、請求項５に記載の共重合体。
７．前記非グリコサミノグリカンのモノマーユニットが不飽和のモノマーまたはそのオリゴマーである、請求項１に記載の共重合体。
８．前記不飽和モノマーの少なくとも１つが式ＣＨ２＝ＣＸＹで表されるモノマーであって、式中、ＸがＨまたはＣＨ３であり、およびＹが、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＮＲ２、−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｎＯＨ、一ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−ＣＯＯ（ＣＨ２）ｎＯＨ、−ＣＯＯ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−ＯＣＯＲ、−ＯＲ、−Ｃｌ、−ＣＮ、−Ｃ６Ｈ５、置換された−Ｃ６Ｈ５、 −ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＯＨ、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＮＨＲ、および−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＮＲ２からなる群から選択され、これらの基の式中のｎが１から４の整数でありＲが１−４Ｃの直鎖または分枝鎖のアルキル基である、請求項７に記載の共重合体。
９．前記不飽和モノマーが、アクリルアミド、スチレン、４−スチレンスルホン酸ヒドロキシエチルメタクリレート、アクリロニトリル、またはアミノエチルメタクリレートである、請求項８に記載の共重合体。
１０．前記不飽和モノマーが、ジイソシアナートまたは該ジイソシアナートとジオールのオリゴマーである、請求項７に記載の共重合体。
１１．前記グリコサミノグリカンフラグメントが、非還元性末端で透導体化された低分子量のヘパリンである、請求項１に記載の共重合体。
１２．前記ヘパリン誘導体が、アリル誘導体または前記アミノエチルメタクリレートの誘導体である、請求項１１に記載の共重合体。
１３．さらに架橋を含有する、請求項１に記載の共重合体。
１４．前記架橋が二不飽和架橋剤によって提供される、請求項１３に記載の共重合体。
１５．前記グリコサミノグリカンフラグメントのモノマーユニットが、非グリコサミノグリカンのモノマー成分が重合した後に与えられる、請求項１に記載の共重合体。
１６．前記共重合体が多数の異なるグリコサミノグリカンのモノマーユニットから形成される、請求項１に記載の共重合体。
１７．前記共重合体が多数の異なる非グリコサミノグリカンのモノマーユニットから形成される、請求項１に記載の共重合体。
１８．請求項１に記載の共重合体を用いて構成またはコートされる、血液との接触を含む用途に適する、医療装置。
１９．血液に接触する生物医学的装置を構成またはコートするのに適した、抗血栓性および非トロンボゲン性である生体適合性共重合体を調製する方法であって、少なくとも１つのグリコサミノグリカンフラグメントおよび少なくとも１つの非グリコサミノグリカン成分を、共重合を行う条件下で反応させることを包含する、方法。
２０．前記反応が、少なくとも１つの架橋剤の存在下で行われる、請求項１９に記載の方法。
２１．前記グリコサミノグリカンフラグメントが、高分子量のグリコサミノグリカンの酵素的分解生成物または化学的分解生成物として調製され、および該グリコサミノグリカンフラグメントが抗血栓性および非トロンボゲン性である、請求項１９に記載の方法。
２２．前記グリコサミノグリカンフラグメントがへパリンを解重合し、そして五糖体から十六糖体の大きさのフラグメントを回収することによって得られる、請求項１９に記載の方法。
２３．前記非グリコサミノグリカンのモノマーユニットが不飽和のモノマーまたはそのオリゴマーである、請求項１９に記載の方法。
２４．前記不飽和モノマーが式ＣＨ２＝ＣＸＹで表されるモノマーであって、式中、ＸがＨまたはＣＨ３であり、およびＹが、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨＲ、−ＣＯＮＲ２、−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｎＯＨ、−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−ＣＯＯ（ＣＨ２）ｎＯＨ、−ＣＯＯ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−ＯＣＯＲ、 −ＯＲ、−Ｃｌ、−ＣＨ、−Ｃ６Ｈ５、置換された−Ｃ６Ｈ５、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＯＨ、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＮＨＲ、および′−ＯＣＯ（ＣＨ２）ｎＮＲ２からなる群から選択され、これらの基の式中のｎが１から４の整数でありＲが１−４Ｃの直鎖または分枝鎖のアルキル基である、請求項２３に記載の方法。
２５．血液と接触する生物医学的装置を構成もしくはコートするのに適した、抗血栓性および非トロンボゲン性の生体適合性共重合体を調製する方法であって、少なくとも１つの低分子量のグリコサミノグリカンおよびプレ重合された非グリコサミノグリカンのプレ重合体を、該グリコサミノグリカンの還元性末端を介して、該プレ重合体で該グリコサミノグリカンの誘導体化を行う条件下で反応させることを包含する、方法。
２６．薬理学的薬剤として有用な、抗血栓性および非トロンボゲン性である水溶性共重合体であって、該共重合体が、少なくとも１つの非グリコサミノグリカンフラグメントのモノマーユニットと共重合させた、少なくとも１つのグリコサミノグリカンフラグメントのモノマーユニットを有する、水溶性共重合体。