JPH05507498A - 改良されたアジュバントおよびワクチン - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 改良されたアジュバントおよびワクチン技術の分野 本発明は、ワクチンアジュバントおよびワクチンアジュバントを使用する改良さ れたワクチンに関する。アジュバントは、免疫応答が主として所望のアイソタイ プ、例えば、マウスにおいて１ｇＧ２またはＩｇＧ３アイソタイプまたはヒトお よび他の動物において対応するアイソタイプの抗体であり、これによりワクチン による保護を改良するように、設計することができる。さらに、本発明の改良さ れたワクチンおよびアジュバントは長く持続する保護を提供する。

背景の技術 用語「抗原」は、免疫応答のための標的として働くすることができるものとして 定義される。免疫応答は細胞または体液であることができる。

用語「ワクチン」は、通常感染性因子または感染性因子のある部分から成る、抗 原性懸濁液または溶液としてここにおいて定義され、それは体の中に注射されて 活性な免疫性を生成する。ワクチンを構成する抗原性部分は、微生物または微生 物から精製された自然の産生物、合成生成物または遺伝子操作したタンパク質、 ペプチド、多糖または同様な産生物であることができる。用語「細胞仲介免疫性 」は、抗体よりむしろ細胞により仲介される免疫応答として定義される。それは 遅延された型の過敏性および細胞障害性Ｔ細胞を包含するが、これらに限定され ない。用語「アジュバント」は、ここで使用するとき、注射された免疫原と混合 するとき、免疫応答を増加するか、あるいはそうでなければ変更する物質である 。「ハプテン」は、ここにおいて、適当な抗体またはＴ細胞を選択的に反応する 物質として定義されるが、ハプテンそれ自体は通常免疫原性ではない。はとんど のハブテンは小さい分子または大きい分子の小さい部分であるが、いくつかの高 分子はまたハブテンとして機能することができる。用語「接合」は、ここにおい て、２またはそれ以上の分子の共有結合または他の形態の結合として定義される 。それは化学約手１によるか、あるいは生体内で生物学的手段、例えば、遺伝子 操作により達成することができる。用語「アイソタイプ」は抗体のサブタイプで ある。用語「リポ多糖Ｊ　（ＬＰＳ）は、脂質Ａと呼ばれる親水性部分と糖部分 （多糖またはオリゴＷ）を有する、グラム陰性バクテリアの外膜から得られた両 親媒性グリコホスホ脂質である。用語「無毒のＬＰＳＪは、動物における５０％ の致死的投与量（ＬＤｉ。）、５０％のヒヨコ胚致死的投与量（ＣＥＬＤｓ。） 、ウサギにおける発熱性、または真皮シュワラマン（Ｓｈｗａ　ｔ　ｚｍａｎ、 ）反応の測定に基づいて、非常に低い毒性をもつＬＰＳとして定義される。マク ロファージによる組織の壊死因子およびＩＬ−１の一方／双方の誘発の生体内測 定を、また、使用してＬＰＳの毒性を決定することができる。用語「無毒化され たＬＰＳＪは、脂質Ａ部分の構造の化学的修飾、すなわち、１つのホスフェート 基の除去、１〜３つの脂肪酸アンル基の除去、官能基（例えば、メチル、アセチ ル、アルコールなど）の導入、または部分的還元または酸化のために、毒性が減 少したＬＰＳであるとして定義される。

有効なワクチンは正しい１または２以上の抗原に対して適当な応答を誘発しなく てはならない。特定の病気に対する保護を与える能力が変化する免疫応答のいく つかの明確な型が存在する。例えば、抗体はバクテリアの感染に対する保護を与 えることができるが、細胞仲介免疫性は体から多数のウィルスの感染および腫瘍 を排除するために要求される。抗体および細胞仲介免疫応答の多数の明確な型が 存在する。細胞仲介応答は２つの基本的群に分割される：１）Ｔ細胞がマクロフ ァージおよび他の細胞または細胞産生物を経て間接的に作用する、遅延型過敏性 、および２）特殊化したＴ細胞が感染した細胞を特異的にかつ直接攻撃しかつ殺 す、細胞障害性。

抗体の５つの主要なりラスが存在する：　ＩｇＭ、Ｉ　ｇＧ、Ｉ　ｇＥ、１ｇＡ およびＩｇＤ、これらのクラスは免疫応答において明確な機能を有する。ＩｇＧ は血液の中の優性の細胞であり、いくつかの異なるサブクラスまたはアイソタイ プに再分割される。マウスにおいて、これらのアイソタイプはＩｇＧ１、ＩｇＧ ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩ　ｇＧ３である。

ヒトにおいて、アイソタイプはＩｇＧ１．１ｇＧ２、Ｉ　ｇＧ３および１ｇＧ４ である。１　同様なアイソタイプはほとんどの他の哺乳動物種において定義され 、ここでそれらは研究されてきている。ＩｇＧの命名は異なる種において異なる 。なぜなら、抗体のアイソタイプの構造または機能が理解される前に、名前は造 り出されているからである。学ぶべきことがなお多く残っているが、ＩｇＧのア イソタイプは哺乳動物種の間で高度に保存されているように思われる。

ＩｇＧアイソタイプは、特定の感染に対する保護を与える能力である異なる。マ ウスにおけるＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂは補体を活性化し、抗体仲介細胞仲介 細胞障害性および他の機能を仲介する。それらは多数のバクテリア、ウィルスお よび寄生生物の感染に対する保護を与えるとき、とくに有効である。ヒトにおけ る相手はＩｇＧ１およびＩ　ｇＧ３であると思われる。対照的に、ネズミＩ　ｇ Ｇ３は多糖の被膜をもつバクテリア、例えば、肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃ ｕｓ）に対する保護を与えるとき、とくに有効である。ヒトの相手はＩ　ｇＧ４ であるように思われる。マウスにおけるアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１は補体 を固定せず、毒性を効果的に中和するが、多数のバクテリアおよびウィルスの感 染に対する有効性が顕著に低い。異なるＩｇＧアイソタイプは免疫性を与える能 力において顕著に異なるので、ワクチンが特定の感染のために最も適当なアイソ タイプを誘発することが重要である。命名は異なるが、入手可能なかつ現代の理 論が示すように、産生された抗体のアイソタイプを決定する免疫原の性質は哺乳 動物種を通じて類似する。換言すると、１つの種において遅延型過敏性または補 体固定性ＩｇＧ抗体を刺激する免疫原は一般に他の種において同様な応答を刺激 するであろう。

生合成および組み換えＤＮＡ技術は、従来産生が不可能であった、抗。

原性エピトープを有するワクチンの開発を可能とする。現在のワクチンの候補は 、事実上すべての感染因子、アレルゲンおよびなお宿主の成分、例えば、ホルモ ンおよび自己免疫病、癌および他の病気に関係する分子を包含する。感染因子は 、ウィルス、バクテリア、寄生生物、リケッチアおよび真菌を包含するが、これ らに限定されない。ホルモンは多様な目的、例えば、妊娠の防止および病気の処 置のためのワクチンとして評価されている。癌、例えば、黒色腫の処置のための ワクチンは、動物およびヒトにおいて評価されている。各場合において、ワクチ ンの最適な効果は、免疫応答の適当な型、強度および期間を刺激するこに依存す る。

寄生生物の病気のマラリアについての研究はことに重要である。この病気は世界 中の２００Ｘ１０’人／年を越える人々に影響を与え、そして世界において不健 全および仕事の損失により最も重要である。遺伝子操作の技術を使用して、マラ リアの寄生生物に関連するいくつかのペプチドおよびタンパク質を同定し、そし て現在実質的な量で産生されてきている。とくに、スポロゾイト段階からの１２ ７．ミノ酸のペプチドは重要な抗原性部位である。この特定のペプチドに対する 抗体は、それが注射された直後に、寄生生物を殺すことができる。不都合□なこ とには、このペプチドは、それ自体、適切な免疫応答を生成しない。マラリアの 各種は異なるペプチドを有するが、特徴ある構造および反復単位はそれらのすべ てにおいて見いだされる。

スポロゾイトのペプチドに対する有効な免疫応答を誘発する努力において、ペプ チドは担体と接合され、そしてアジュバントとともに投与されてきている。しか しながら、今日まで、ペプチドまたはペプチド接合体とともに使用されたアジュ バントは満足すべき結果を生成してきていない。同様に、重要な抗原がマラリア 寄生生物の血液段階において同定されたが、入手可能なワクチン配合物は保護的 免疫性を誘発することができなかった。

ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）はエイズを引き起こす。多数の組み換えおよび ペプチド抗原がＨＩＶから調製されてきている。これらの抗原に対する抗体はウ ィルスを中和することができ、そして体の免疫応答は感染を予防または抑制する ことができるという証拠が存在する。しかしながら、ＨＩＶに対する保護的免疫 応答を誘発するために一般に有効なワクチンははっきりしないゴールを残してい る。インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）およ び肺炎球菌性肺炎（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａ］　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）は他の例 を提供する。これらのバクテリアの重要な抗原は、乳児およびこれらの感染に対 して最も危険である大人において保護的免疫応答の誘発が劣る多糖である。同様 な立場は、多数の他のウィルス、バクテリアおよび寄生生物の感染ならびに免疫 性により変調されつる腫瘍および他の病気について存在する。現代の科学は、免 疫応答により影響を受けるほとんどの状態からの抗原を同定しかつ産生ずる手段 を提供する。多数の抗原が最適な保護の誘発が不可能ごとは、ワクチンにより産 生された免疫応答の型、強度および期間に影響を及ぼす手段の必要性の増加を強 調している。

こうして、ハプテンのエピトープの免疫原性を増強し、そして多分より重要なこ とには、変調する、効力のある、無毒のアジュバントの開発に興味がもたれるよ うになった。さらに、アジュバントは普通のワクチンとともに使用して、適当な 型のより早い、より効力のある、あるいはより延長した応答を誘発するために要 求される。このようなアジュバントは、また、抗原の供給が限定されるか、ある いは産主にコストがからる場合において有用であろう。

アジュバントの開発は、最近まで、実験的であった。多数の化合物が免疫応答を 変調することが発見された。これらの化合物は物質および機能の両者において顕 著に多様性、アジュバントの作用の統合メカニズムを発見する試みを複雑にした 事実、であった。これらのメカニズムの解明は、免疫系の理解において最近の進 歩を遅らせた。

アジュバントのこの多様性はそれらの分類を困難にした。アジュバントはそれら の由来に従い、鉱物、バクテリア、植物、合成または宿主の産生物に場合に応じ て分類される。この分類の第１群は、鉱物のアジュバント、例えば、アルミニウ ム化合物である。アジュバントとしてアルミニウム化合物の最初の使用は１９２ ６年に記載された。その時以来、アルミニウム化合物とともに沈澱させた抗原あ るいは前辺て形成されたアルミニウム化合物と混合されまたはそれに吸着された 抗原が、動物およびヒトにおける免疫応答の増強するために使用されてきている 。アルミニウム化合物および同様なアジュバントは次のメカニズムを通して働く ように思われる。アルミニウムは抗原に物理的に結合して粒子を形成する。これ らは注射後組織の中に抗原の貯蔵所を形成する。抗原の分泌を遅くさせ、こうし て抗原と抗原を表す細胞、例えば、マクロファージまたは濾胞−樹状細胞との間 の相互作用の時間を延長する。さらに、免疫能力細胞を注射区域に取り付け、そ して活性化する。アルミニウム粒子はウサギの領域的リンパ節において免疫化後 ７日に実証され、そして他の有意の機能が節それら自体におけるＴｌｌ１ｌ胞含 有領域に抗原を向けることがありうる。アジュバントの効力は排出するリンパ節 の情報と相関関係を有することが示された。多数の研究はアルミニウムとともに 投与された抗原が体液の免疫性の増加に導くことを確証したが、細胞仲介免疫性 は、遅延型過敏性により測定して、わずかに増加するだけあるように思われる。

アルミニウムは、また、補体の経路を活性化するとして記載された。このメカニ ズムは局所的炎症性の応答ならびに免疫グロブリンの多糖および毛細胆管のメモ リーにおいである役割を演することがある。

主として安全性のきわめてすぐれた記録をもつために、アルミニウム化合物は現 在ヒトにおいて使用されている唯一のアジュバントである。

しかしながら、それらは問題がないわＩすではない。アルミニウムを含有するワ クチンは時々局所的反応を引き起こす。アレルギーの発現は通常臨床的問題でな いが、アルミニウム化合物は、また、エオンノフィルをＴ細胞依存性メカニズム を経て注射領域に引き付けて、注射した場合抗原のプライミング後１ｇＥの応答 を誘発し、そしてＩｇＥの応答についてヘルパー機能をもつ担体特異的細胞の集 団を誘発すると言われた。さらに、アルミニウムを含有するワクチンは凍結乾燥 することができず、こうして冷蔵した輸送および貯蔵を必要とし、汚染の危険を 生ずる。

最後に、および最も重要なことには、アルミニウム化合物は病気からの持続した 保護を誘発するとき常に成功するというわけではない。これは、一部分、抗体の 最も適当なアイソタイプまたは細胞仲介免疫性の最適な型を誘発することができ ないためである。こうして、アルミニウム塩類は保護の誘発に抗体の応答のみを 要求する、強い免疫原のための十分なアジュバントであったが、マラリアの弱い 免疫原様合成ペプチドとともに使用するとき、あるいは細胞仲介免疫応答または 感染と戦うために要求される型のＩｇＧアイソタイプを導入ために、それらは有 効ではない。

アジュバントの他の大きい群はバクテリア由来の群である。バクテリア由来のア ジュバントは最近精製されそして合成され（例えば、ムラニルジペプチド、脂質 Ａ）および宿主仲介因子はクローニングされ（インターリューキン１および２） 、研究のために化学的に特性決定された産生物が提供された。最後の１０年間に 、バクテリア由来の活性化合物の３つのアジュバントの化学的精製において有意 な成功がもたされた：ボルデテラ・ベルッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒ ｔｕｓｓｉｓ）、リポ多糖およびフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）。

ボルデテラ・ベルツシス（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）は、Ｔ−リンパ球集団への 作用を通して細胞仲介免疫性を変調する能力をもつために興味がもたれる。リボ 多糖およびフロイント完全アジュバントのために、構造−機能の関係の研究を可 能とする、アジュバントの活性部分が同定されそして合成された。

リポ多糖および脂質Ａを包含するその種々の誘導体は、リポソームまたは他の脂 質乳濁液と組み合わせて強力であることが発見された。ヒトにおける一般的使用 のために十分に低い毒性をもつ誘導体を産生ずることができるかどうかは、まだ 、確かではない。７０インド完全アジユバントは大部分の実験の研究における標 準である。しかしながら、それは重大な局所的および全身的炎症性反応を生成し 、これらは宿主を不興にするか、あるいは殺すために十分にきびしいことがある 。それはヒトにおいて使用することができないことがあり、そして動物における 使用を禁止されることがある。

多数の他の物質はアジュバントとして種々の時に使用されてきている。

それらは植物産生物、例えば、サポニン、動物産生物、例えば、キチンおよび多 数の合成化学物質を包含する。これらのカテゴリーの間のアジュバント源は、そ の生物学的性質の予測においてとくに有用であるとは証明されていない。

アジュバントはそれらの提案された作用のメカニズムによりカテゴリー化された 。この型の分類は必然的に多少任意である。なぜなら、はとんどのアジュバント は１より多いメカニズムで機能するようにからである。アジュバントは抗原の局 在化および供給を通すか、あるいは免疫系を構成する細胞への直接の作用、例え ば、マクロファージおよびリンパ球により作用することができる。アジュバント が免疫応答を増強する他のメカニズムは、抗原の貯蔵所の発生による。これはア ルミニウム化合物、油孔濁液、リポソームおよび合成ポリマーのアジュバント活 性に寄与する。リボ多糖類およびムラミルジペプチドのアジュバント活性はマー クロファージの活性化を通して仲介されるように思われるが、ボルデテラ°ペル ツシス（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）はマクロファージおよびリンパ球の両者に影 響を与える。免疫増強、例えば、モノカインおよびリンホカインの利用に対する 最近の魅力的なアプローチ、および免疫応答を増大するための抗原、担体および アジュバントの操作は現在ファッション化された。

小さい免疫原、例えば、マラリアの合成ペプチドを、より大きいタンパク質また は他の担体に取り付けて、免疫応答を増加することができる。

免疫原性に関する抗原の分子の大きさおよび複合体化の間の関係は、分子上の抗 原決定基の利用可能性を反映する。この関係は、最初に、ランドステイナー（Ｌ ａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ）により認められ、このとき彼は小さい基をより大きい（ 担体）分子に複合化して免疫応答を刺激することが必要であることを実証した。

しかしながら、この要件についてのメカニズムの基礎は、免疫原性を発現するた めに担体の作用および分子上に最小２つの抗原決定基の必要性を実証する実験を 待つことであった。

これらの決定基は、それぞれ、ＴおよびＢリンパ球と相互作用する担体およびハ ブテンの決定基を表した。しかしながら、担体の影響はＴ依存性体液の応答にお けるＴ細胞の活性化を通して、簡単な抗原性を越えて拡張する。

抗原分子上の決定基の組み合わせは、種々の型のヘルパーおよびサプレッサーｔ ｅｌの示差的活性化により、免疫応答に影響を及ぼすことがある。この作用を実 証するモデルの系は、合成ターポリマー１−グルタミオン酸６０　Ｌ−アラニン ３Ｇ−Ｌ−チロシン１０（ＧＡＴ）へのレスポンダー（Ｃ５７Ｂ１／６）および 非レスボンダー（ＤＢＡ／１）マウスの体液の応答を遺伝的にコントロールした 。Ｃ５７Ｂ１／６マウスはこのポリペプチドに応答するが、Ｄ　Ｂ　Ａ　／　１ マウスは、ＧＡＴがメチル化ウシ血清アルブミン（ＭＢＳＡ）にカップリングし た場合にのみ応答するであろう。しかしながら、マウスにＧＡＴ−ＭＢＳＡで免 疫化前にＧＡＴを注射する場合、ＧＡＴに対する検出可能な抗体の応答は起こら ない。

これらの観察の説明は、ＧＡＴがヘルパー反応をレスポンダ−マウスにおいて刺 激するが、非レスポンダ−マウスにおいてサプレッサーＴ細胞を優先的に活性化 するということである。このサプレッサー細胞の優勢は、ＭＢＳＡにカップリン グしたときでさえ、ＧＡＴに対する応答を防止する。しかしながら、−次免疫化 がＧＡＴ−ＭＢＳＡによる場合、担体部分によるＴ細胞の活性化は、ＧＡＴによ り活性化されたサプレッサー細胞の作用を打ち消す助けを提供する。

自然タンパク質分子に関連する決定基は、また、異なるように助けおよび抑制に 寄与することが実証される。抗原への免疫原性担体の接合は、その抗原に対して 応答して産生された抗体のアイソタイプを変化させることがある。多数のエンカ プスレーシゴンされたバクテリアから精製した多糖類は、多数の反復する抗原決 定基をもつポリマーの性質をもつために、胸腺独立の抗原である。それらはこれ らのバクテリアの保護的抗体を表すが、産生されたＩｇＭ抗体は病気の予防にお いて制限された効能を有する。これは、大部分、感染に対して高い危険性をもつ 非常に若いまたは老いた個体において、免疫学的メモリーまたは適切な免疫応答 を刺激することができないことにある。したがって、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒ ｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）およびインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉ ｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型からの多糖類はタン４ぐり質、例えば、破 傷風トキソイドに接合されてきている。これらの接合された調製物は胸腺依存性 抗原として作用し、そして多糖部分に対するＩｇＧの応答ならびに免疫学的メモ リーを誘発する。それらは、また、若いおよび老いた個体における応答を誘発す る。同様に、胸腺独立的多糖の担体は、ペプチド、例えば、胸腺依存性ＩｇＧ免 疫応答を必要とする、マラリアに関係するペプチドの免疫原性の増強のための効 力をほとんどもたない。

フェルトマン（Ｆ　ｅ　１　ｄｍａ　ｎ　ｎ）およびり−（Ｌｅｅ）らによる刊 行物は、サルモネラ属（Ｓａ　１ｍｏｎｅ　Ｉ　ｌａ）の有機体の抗原が、強い ＩｇＭ抗体の応答を刺激する、典型的な胸腺独立の抗原であることを述べている 。′、３　それらは乳児には存在しない後期の成熟Ｂ細胞のみを刺激する。この ような免疫原は、また、乳児において許容を誘発し、そして大人において胸腺依 存性抗原により誘発された複合免疫応答のメモリーまたは他の面を誘発しない。

この発表されたデータは、それらがマラリアのペプチドまたは胸腺依存性１ｇＧ 抗原応答を必要とする他の小さい抗原のためのアジュバントまたは担体としての 効力をほとんどもたないことを信じさせる。

多分、担体をアジュバントと区別させる正確な転移点は存在しない。

担体部分は、固有のアジュバント性と呼ばれた抗原の性質に寄与する。

アロゲンを免疫原に転化するある種の物質の能力は、外部のアジュバント性と呼 ばれてきている。アジュバント性は、調製の凝集を通して抗原の大きさまたは免 疫原性または不活性の担体への吸着を増加することによって増強されることがで きる。こうして、抗原を吸着しそして免疫応答を増強する物質、例えば、水酸化 アルミニウム、ラテックス粒子、ベントナイトまたはリポソームはアジュバント と呼ばれる。しかしながら、抗原のこの凝集の観察された作用は、現在極端に複 雑であると２謙されている、アジュバントの作用の制限された面のみを表す。

小さいペプチドおよび他のハブテンは、アジュバントを使用しないで強い免疫応 答を発生することができない。現在入手可能である最もアジュバントは、毒性で あるおよび／または感染因子による感染に対して動物またはヒトを保護するとき 有効である免疫応答を発生しない。こうして、必要であるものは、動物またはヒ トに投与することができかつ免疫系が適当な抗原に対する正しい型の延長された 効力のある免疫応答を開始するようにさせるワクチンである。

大きい疎水性の非イオン性のブロックコポリマーの界面活性剤は、ヒトにおいて 潜在的に有用である、有効な免疫学的アジュバントであることが知られてきてい る。４．　Ｓ、　８　それらは、抗原の提示を促進する方法で、油滴および／ま たは細胞の表面へタンパク質の抗原を結合する付着因子として作用するように思 われる。従来の研究は、これらのコポリマーが高い力価の、長く持続する抗体の 応答を誘発することができることを実証した。興味あることには、密接に関係す るコポリマーは弱い活性のみを有し、アジュバントではないか、あるいは不適切 な応答または許容度を誘発する。これはアジュバントの活性の予測を複雑にかつ 不正確にする。

主要な活性が細胞の刺激または免疫変調であったアジュバントは、付着性コポリ マーのアジュバントと組み合わせてよく働くであろうこと予測することができる 。コポリマーのプルロニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣ１ｌＬ１２１とＭＤＰのスレオ ニル誘導体との組み合わせは、Ｌ１２１それ自体よりすぐれた応答、とくに細胞 仲介免疫応答を誘発することが報告された。フ リボ多Ｗ類はマクロファージに対して顕著な作用をもっＢｍ＃のミトゲンとして よく知られている。８　そのアジュバントの活性は多年にわたって知られている が、その使用は毒性および変動する効能により制限されてきている。いくつかの 論文および概観において、リポ多糖類の生物学的活性はリボ多糖分子の脂質Ａ部 分にあることが報告された。′ＬＰＳ調製物の毒性を減少すると同時にアジュバ ントの活性を維持する、いくつかの方法が開発されてきている。それらは脂質Ａ がらホスフェート基を除去してモノホスホリル脂質Ａ　（ＭＰＬ）を生成するこ と、あるいは脂質Ａ部分から１または２以上の脂肪酸鎖を除去することを包含す る。ＬＰＳのある型、とくにロドシュードモナス・スユフェロイデス（Ｒｈｏｄ ｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　５ｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）からのＬＰＳは変更され た脂質Ａを有し、そして固有に無毒である。

抗体のアイソタイプは多数の感染に対する抵抗性において非常に重要であるが、 どのようにして特定のアイソタイプの応答を生成するかについてほとんど知られ ていない。ＩｇＧ２ａは、トリバノソマ・クルジ（ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｃ ｒｕｚｉ）、”、目、Ｔ、ムスクリ（ｍｕｓｃｕｌｉ）１２およびプラスモジウ ム・エリイ（Ｙｏｅ　Ｉ　Ｉ　１）（７ラリア）およびバクテリアのプルセラ（ Ｂｒｕｃｅｌｌａ）を包含する、種々の病原体のための保護的アイソタイプであ ることに関連づけられた。

ＩｇＥ抗体はマウスにおける寄生生物に対してとくに毒性である。寄生虫、住血 吸虫および線虫の幼虫を包含する多数の寄生生物は、主としてＩｇＧ１およびＩ ｇＥ抗体を自然に刺激する。ＩｇＧ１およびＴｇＥの産生は連鎖するように思わ れる。各アイソタイプは、特定の感染因子を中和するための適当である、機能的 利点を有する。ＩｇＧ２ａは、抗体依存性細胞仲介細胞障害性およびファゴサイ トーシスに影響を及ぼしつる、マクロファージに最も寅欲に結合し、そして補体 を活性化することができる。ネズミＩｇＧ３は、エンカブスレージョンされたバ クテリア、例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓ、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染に対 する保護においてとくに有効である。

最後に１肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍ。

ｎ１ａｅ）により引き起こされる病気は、乳児および子供の最も重要なバクテリ アの感染の例である。肺炎球菌（ｐｎｅｕｍｏｎ　ｉ　ａｅ）の２３型からの莢 膜多糖類を含有する多価ワクチンは現在広く使用されている。いくつかの研究が 示すように、菌血病の予防におけるワクチンの効能は２〜１０才の子供において ０％でありそして１０才以上のヒトにおいて４９％であった。ワクチンが慢性の 病気に対する有効であるという説得力のある証拠は存在せずそして、研究におい て、中年すぎの壷金および施設に収容された患者について利益が存在しない。

それら自体、莢膜の多糖類は、非常に若いまたは非常に年取った人において免疫 性が劣った、胸腺独立の２型（ＴＬ−２）抗原である。ＴＬ−２抗原は制限され た番号のアイソタイプ、主としてＩｇＭのみを誘発する。それらは弱いメモリー の応答のみを誘発するか、あるいはメモリーを誘発せず、そして許容性は容易に 誘発されない。

こうして、ワクチンの分野において必要であるものは、最も有効ながつ保護的抗 体のアイソタイプが誘発されるような、ワクチンの組成および投与方法である。

ワクチンは、また、長く持続する高い力価の抗体を誘発することができるべきで ある。

発明の要約 本発明は、抗原と混合しかつヒトまたは動物の中に投与するとき、抗原を単独で 投与したときより強い抗原に対する免疫応答を誘発するワクチンアジュバントか らなる。多くの場合において、本発明として記載するアジュバントはワクチンの 抗原に対して特異的な抗体の全体の力価を増加するであろう。例えば、本発明を 普通の抗原を使用して実施するとき、誘発されるアイソタイプは主要なＩ、ｇＧ １アイソタイプからより保護的１ｇＧ２アイソタイプに変化しそして、ある場合 において、他の種において７ｇＧ３アイソタイプまたは対応するアイソタイプに 変化する。

こうして、本発明を実施することによって、普通のワクチンの全体の保護的作用 を改良することができる。

さらに、本発明はペプチドの抗原に対する保護的抗体を誘発するときとくに有効 であり、これらの抗原は（アスパラギン−アラニン−グリシン）−５−チロシン ［（ＮＡＧＧ）ｓ〕マラリア抗原を包含するが、これらに限定されない。それは 広い範囲の抗原および型の抗原に有効である。これは多糖類、例えば、肺炎球菌 の多糖、オリゴ環、タンパク質、ペプチド、およびこれらの物質の自然または合 成のハブテンまたは組み合わせを包含する。

本発明は、アジュバントおよび抗原および改良されたアジュバントから構成され たワクチンからなる。本発明の１つの実施態様において、抗原は有効量の次の一 般式： ％式％） 武生、疎水性物質（Ｃ３Ｈ，Ｏ）の分子量はほぼ４５−００〜９０００であり、 そして親水性物質（Ｃ２Ｈ，Ｏ）の百分率はほぼ３〜１５重量％である、 をもつ表面活性コポリマーと混合する。

本発明の改良されたワクチンは、また、抗原およびアジュバントからなり、ここ でアジュバントは、次の一般式：％式％） 式中、疎水性物質（Ｃ５Ｈ１０）の分子量はほぼ３０００〜９０００であり、そ して親水性物質（Ｃ２Ｈ＋　Ｏ）の百分率はほぼ３〜１５重量％である、 をもつ表面活性コポリマーからなり、これは油中水乳濁液として配合される。コ ポリマーは普通に使用される油中水乳濁液を不安定化するが、驚くべきことには 、通常の乳化剤を省略する場合、効能を増加しそして安定性を増加する。

また、本発明の部分として、無毒のリポ多糖からなるアジュ／くントが考えられ る。無毒のリポ多糖は天然に存在するリポ多糖、例えば、ロドンユードモナス・ スユフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　５ｐｈａｅｒｏｉｄｅ ｓ）から誘導されたリポ多糖、または無毒化リポ多糖であることがてきる。アジ ュバントは毒性のリポ多糖から調製し、ここでこの分子の糖部分は完全であり、 そしてこの分子の脂質Ａ部分は修飾され、これによりリポ多糖を毒性に劣るよう にする、ことが考えられる。

本発明の改良されたワクチンは、また、抗原およびアジュバントからなり、ここ でアジュバントは、次の一般式：％式％） 式中、疎水性物質（ＣｓＨａＯ）の分子量はほぼ３０００〜９０００であり、そ して親水性物質（ＣｚＨ４０）の百分率はほぼ３〜１５重量％である、 をもつ表面活性コポリマーおよびリポ多糖（ＬＰＳ）誘導体からなる。

ＬＰＳおよび表面活性コポリマーからなるアジュバントは、ピークの力価、ピー クの力価に到達する時間および応答の時間の長さにより表して、効果の相乗性を 生成する。さらに、組み合わせは保護的１　ｇＧ２アイソタイプを増加する傾向 がある。

脂質接合した多糖とコポリマーおよび免疫変調剤、例えば、モノホスホリル脂質 Ａとの組み合わせは強いＩｇＧの応答の生成を誘発し、ここでＩｇＧのサブクラ スのすべては存在する。とくに、肺炎球菌の感染に対して保護的である１ｇＧ２ およびＩ　ｇＧ３サブクラスは優勢である。

これは予期せざる発見である。なぜなら、免疫原の調製物の中にはタンパク質ま たはペプチドが存在しないからである。ペプチド部分はこれらのアイソタイプの 産生に要求されるＴ細胞を刺激するために必須であると信じられる。多糖類はＴ 細胞を刺激することができなおことが報告された。それにもかかわらず、コポリ マー、親油性接合および免疫変調因子の組み合わせはこのような応答を産生ずる ことができる。

本発明は、また、タンパク質、小さいペプチド、多糖またはノλブテンに対して 動物またはヒトを免疫化するためにとくに有用である。本発明によれば、タンパ ク質、小さいペプチド、多糖またはノーブテンを、微生物から誘導された鞭毛に 接合する。鞭毛は鞭毛をもつ微生物から誘導することができる：しかしながら、 サルモネラ７４　（Ｓａ　１ｍｏｎｅ　ｌ　］　ａ）の種からのものは好ましい 。

さらに、鞭毛は遺伝子操作することができる。したがって、本発明の目的は、小 さい免疫原性決定基に対する延長した効力のある免疫応答を与えるとき、とくに 有効であるワクチンを提供することである。接合した鞭毛＋抗原は、次の一般式 ： ％式％） 式中、疎水性物質（Ｃ，ＨａＯ）の分子量はほぼ３０００〜９０００であり、そ して親水性物質（Ｃ２Ｈ，Ｏ）の百分率はほぼ３〜１５重量％である、 をもつコポリマーおよびリポ多糖（ＬＰＳ）誘導体と混合したとき、なおいっそ う有効である。ＬＰＳおよび表面活性コポリマーからなるアジュバントは、ピー クの力価およびピークの力価に到達する時間の両者により表して相乗性を生成す る。さらに、この組み合わせは保護的ＩｇＧ２アイソタイプを増加する傾向があ る。

したがって、本発明の目的は、抗原に対していっそう強い免疫応答を誘発するこ とができるアジュバントからなる抗原と一緒に投与するための改良されたアジュ バントを提供することである。

本発明の他の目的は、乳児および若い子供および普通のワクチンに対する応答が 劣った老齢の人々において、より強い抗体の応答を誘発するワクチンを提供する ことである。

本発明の他の目的は、抗原の所望のアイソタイプを誘発するアジュバントを提供 することである。

本発明の他の目的は、非常に若い個体および普通のワクチンに対する応答が劣っ た老齢の個体において保護的免疫応答を誘発するアジュバントおよびワクチンを 提供することである。

本発明の他の目的は、抗体および細胞仲介免疫性の適当なバランスを誘発し、こ れにより特定の病気に対して最大の保護を提供する、アジュバントおよびワクチ ンを提供することである。

本発明の他の目的は、より長く持続する抗体の集団を誘発する、アジュバントお よびワクチンを提供することである。

本発明の他の目的は、組み換えタンパク質および合成ペプチドを利用して、マラ リア寄生生物による感染から個体を保護できる持続した免疫応答を生成すること ができる、有効なワクチンを提供することである。

本発明の他の目的は、エイズウィルスの合成ペプチドを利用して、−気の予防に おいて有効である免疫応答を生成することができる、有効なワクチンを提供する ことである。

本発明のなお他の目的は、動物またはヒトの免疫系を刺激して、小さい免疫原性 決定基、例えば、ペプチド、ハブテンまたは多糖または大きい分子、例えば、タ ンパク質または多糖に対して、効力のある延長したＩｇＧの応答を生成すること ができるワクチンを提供することである。

本発明の他の目的は、ヒトまたは動物に対する毒性が非常に低いワクチンを提供 することである。

本発明のなお他の目的は、局所的アレルギー反応をほとんどまたはまったく引き 起こさないワクチンを提供することである。

本発明の他の目的は、凍結乾燥することができるワクチンを提供下ることである 。

本発明の他の目的は、動物における抗体の産生のためのフロイント完全アジュバ ントの代替物を提供することである。

本発明のなお他の目的は、所望の抗体のアイソタイプを提供すること　、である 。

本発明の他の目的は、普通のワクチン調製物とともに使用することができるアジ ュバントを提供することである。

本発明のこれらおよび他の目的、特徴および利点は、開示する実施態様の次の詳 細な説明および添付する請求の範囲の概観すると、明らかになるであろう。

図面の簡単な説明 第１図は、サルモネラ属（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　Ｉ　Ｉａ）からの鞭毛タンパク質 に接合したトリニトロフェノール（Ｔ　Ｎ　Ｐ　）で免疫化したマウスにおける 抗体の力価を例示するグラフである。

第２図は、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）からの鞭毛タンパク質に接合 したＴＮＰで免疫化したマウスの投与量の応答を例示するグラフである。

第３図は、ニワトリの卵アルブミン（ＨＥＡ）に接合したＴＮＰおよびサルモネ ラｉＥ　（Ｓａ　１ｍｏｎ　ｅ　ｌ　１　ａ）からの鞭毛タンパク質に接合した ＴＮＰで免疫化したマウスの免疫応答を比較するグラフである。

このグラフは、また、アジュバントＴ　１．５　ＯＲ，１を使用するおよび使用 しない２つの化合物の使用を比較する。

第４図は、ＴＮＰ、。−ＨＥＡおよび種々のアジュバントによる免疫化に応答す る、マウスにおけるＩｇＧ抗体の応答の産生を例示するグラフである。

第５図は、２％のスクアレンの水中油乳濁液の中の凍結乾燥したＴＮＰ、。−Ｈ ＥＡ抗原を使用するコポリマーのアジュバントの作用を例示するグラフである。

第６図は、選択したコポリマーを使用しおよび使用しないシリカの油孔濁液ノア ′シュバントの作用を例示するグラフである。

第７図は、可溶性抗原、ＴＮＰ、。ＨＥＡとともに投与したコポリマーのアジュ バントを比較するグラフである。

第８図は、Ｔ　Ｎ　Ｐ　ｒ　ｏ　ＨＥ　Ａに対する抗体の力価へのＰＯＰの分子 量の影響を示す。

第９図は、脂質Ｘ、脂質ＩＸＡ、モノホスホリル脂質Ａおよび（ヘキサンルＭＰ Ｌ）を包含する、脂質入誘導体の化学構造を示す。

第１０図は、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）（ＳＲまた はＲｅ）の粗いケモタイブ（ｃｈｅｍｏｔｙｐｅ）のリボ多糖類の構造を示す。

略号：Ｓ、塘；Ｇｌｃ、グルコース二Ｎ−アセチルグルコサミン；Ｇａｌ、ガラ クトース：Ｈｅｐ、Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノヘプトース：Ｐ、ホスフェート； ＥｔＮ、エタノールアミン：ＫＤＯ，２−ケト−３−デオキシオクトネート：Ｇ ］ｃｎ、グルコサミン。

ＲおよびＲ２、ホスホエタノールアミンまたはアミノアラビノース（Ｅｃｏｌｉ の中に存在しない）。５Ｒ−ＲｅはＬＰＳの不完全な形態または粗いケモタイプ を示す。ＲｃおよびＲｄ、のケモタイブはＨｅｐに取り付けられたホスフェート を欠如する。

第１１図は、ロドシュードモナス・スユフエロイデス（Ｒ，５ｐｈａｅｒｏｉｄ ｅｓ）の構造のＬＰＳを示す。

第１２図は、無毒化ＲａＬＰＳの構造を示す。

第１３図は、無毒化ＲａＬＰＳおよび／またはＬ１４１コポリマーを使用しおよ び使用しないでＴ　Ｎ　Ｐ　−ＨＥ　Ａを投与したとき、第２８日におけるＴｇ Ｇの応答を示す。

東１４図は、コポリマーを存在させおよび存在させないで、全毒性リボ多Ｗｔ類 および無毒化ＲａＬＰＳにより誘発されたＴ　Ｎ　Ｐ　＋　ｏ　ＨＥ　Ａに対す るアイソタイプの応答を示す。

第１５図は、ＭＰＬと組み合わせたＬ１４１および／またはＴＤＭにより誘発さ れたＴ　Ｎ　Ｐ　＋　ｏ　ＨＥ　Ａに対するＩｇＧの濃度を示す。

第１６図は、ＴＮＰ＋ｏＨＥＡに対する応答への小さいＬＰＳ誘導体のアジュバ ントの効果を示す。

第１７図は、化合物Ｌ１４１と組み合わせた規定された長さのより大きいＬＰＳ 突然変異体のＴＮＰ、。ＨＥＡについてのアジュバントの効果を示す。

第１８図は、コポリマーＬ１４１と組み合わせた変化する量の〇−多糖を含有す る最大のＬＰＳの分画のＴ　Ｎ　Ｐ　ｌｏ　ＨＥ　Ａについてのアジュバントの 効果を示す。

第１９図は、鞭毛に接合したペプチドの異なるモル比に対する強度およびＩｇＧ アイソタイプの分布の変化を示す。

藁２０図は、本発明によるアジュバント調製物といくつかの商業的に入手可能な アジュバント調製物との間の比較を示す。

第２１図は、免疫応答への無毒化ＬＰＳの効果を示す。

第２２図は、無毒化ＬＰＳの投与量の応答を示す。

第２３図は、免疫応答へのＬＰＳ＋Ｌ１４１の効果を示す。

第２４図は、免疫応答へのロドシュードモナス・ゲラチノサ（Ｒ，ｇｅｌａ　ｔ 　１ｎｏｓａ）から分離したＬＰＳとＬ１４１との組み合わせの効果を示す。

詳細な説明 本発明は改良されたアジュバントからなる。本発明の１つの実施態様において、 アジュバントは、次の一般式：％式％） 式中、疎水性物質（ＣｓＨａＯ）の分子量はほぼ４５００〜９０００であり、そ して親水性物質（Ｃ２Ｈａ　Ｏ）の百分率はほぼ３〜１５重量％である、 をもつ表面活性コポリマーからなる。これらのコポリマーは、ＢＡＳＦコーポレ ーションにュージャージイ州パルンバニー）またはＣｙｔＲｘ：Ｉ−ポレーショ ン（ジョーシア州アトランタ）から入手することができる。

好ましい表面活性コポリマーは、次の一般式・ＨＯ（Ｃ２Ｈ４０）、（Ｃ，Ｈ６ ０）、（Ｃ！Ｈ，Ｏ）、８式中、疎水性物質（Ｃ，Ｈ６０）の分子量はほぼ４６ ００であり、そして親水性物質（Ｃ２Ｈ，○）の百分率はほぼ１０重量％である 、を有するＰＬｔ７ＲＯＮ　Ｉ　ＣＲＬｌ　４１と表示されるコポリマーである 。

他の好ましい表面活性コポリマーは、次の一般式：ＨＯ（Ｃ２Ｈ１０）、（Ｃ３ ８６０）、（Ｃ２Ｈ４０）、Ｈ式中、疎水性物質（Ｃ３Ｈ，○）の分子量はほぼ ５２００であり、そして親水性物質（Ｃ２Ｈ，○）の百分率はほぼ５重量％であ る、を有するＰＬＵＲＯＮＩＣＲＬ１８０．５と表示されるコポリマーである。

、　他の好ましい表面活性コポリマーは、次の一般式：％式％） 式中、疎水性物質（Ｃ３Ｈ６０）の分子量はほぼ５２００であり、そして親水性 物質ｃ　Ｃ２Ｈ４０）の百分率はほぼ１５重１％である、を有するＰＬＵＲＯＮ ＩＣＩＬＬ１８１．５と表示されるコポリマーである。

他の好ましい表面活性コポリマーは、次の一般式：％式％） 式中、疎水性物質（Ｃ３Ｈ，０）の分子量はほぼ８６００であり、そして親水性 物質（Ｃ２Ｈ，Ｏ）の百分率はほぼ１５重量％である、を有するＰＬＵＲＯＮＩ ＣＲＬ１９１．５と表示されるコポリマーである。

本発明の一部分として考えられるアジュバント配合物は、油、例えば、動物油、 例えば、スクアランまたはスクアレン、例えば、植物油または鉱油、油中水乳濁 液の形成に適当な非イオン性表面活性剤、例えば、Ｓｐａ、ｎ８０（ソルビタン モノオレエート）、濁液を形成するために適当な非イオン性表面活性剤、シリカ および次の一般式：％式％） 式中、疎水性物質（Ｃｓ　Ｈｓ　Ｏ）の分子量はほぼ３０００〜９０００であり 、そして親水性物質（Ｃ２Ｈ４０）の百分率はほぼ３〜１５重量％である、 をもつ表面活性コポリマーから構成される。さらに、表面活性コポリマーは次の 一般式 式中、 （Ｃ，Ｈ６０）から成るオクタブロックコポリマーの疎水性部分の分子量はほぼ ５０００〜７０００ダルトンであり、ａは（ＣｔＨ，Ｏ）により表される親水性 部分が化合物の合計の分子量のほぼ１０〜４５％を構成するような数であり、ｂ はオクタブロックコポリマーの（Ｃｓ　Ｈｓ　Ｏ）部分が化合物およびリポ多糖 誘導体のほぼ６０〜９５％を構成するような数である、をもつオクタブロックコ ポリマーであることができる。

成分の好ましい量は、はぼ４０〜９０重量％のスクアレン、２〜５０重量％のソ ルビタンモノオレエート、はぼ０．　５〜１０重量％のシリカおよびほぼ２〜１ ０重量％の表面活性コポリマーである。好ましい表面活性コポリマーはＰＬＵＲ ＯＮＩＣ’Ｌ１４１である。シリカ粒子は好ましくはほぼ０．５〜２０μの直径 である。

本発明の一部分として考えられる他のアジュノくントは、無毒のリポ多Ｗ類およ び無毒化されたリポ多糖類である。これらは、固有に無毒であるリポ多糖類であ るか、あるいは化学的に修飾して毒性を減少させたリポ多糖類である。これは脂 肪酸の適度なアルカリ加水分解物質を包含する。

天然に存在する無毒のリポ多糖類は次のものを包含するが、これらに限定されな い二口ドンユードモナス（Ｐｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、例えば、ロ ドシュードモナス・スユフェロイデス（Ｒ，５ｐｈａｅｒ、ｏｉｄｅｓ）、ロド シュードモナス・アシドフィリア（Ｒ，ａｃｄｏｐｉｌｉａ）、ロドシュードモ ナス・ブラスチカ（Ｒ，ｂｌａｓｔｉｃａ）、ロドシュードモナス・ゲラチノサ （Ｒ，ｇｅｌａｔｉｎｏｓａＬロドンユードモナス・カプスラタ（Ｒ，ｃａｐｓ ｕｌａｔａ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒ，ｐａ　ｌｕｓ　ｔ　ｒ 　ｉ　ｓ）およびロドシュードモナス・ビリディス（Ｒ，ｖｔｒｉｄｉｓ）に関 連するリポ多糖類である。これらの方法は、一般に、分子の脂質Ａ部分の化学的 修飾を包含する。無毒化されたリポ多糖は、その分子の糖部分が完全でありそし てその分子の脂質Ａ部分が脂肪酸の除去により修飾され、これによりリポ多糖が 非常に毒性が低いようにされている毒性のリポ多糖であることに注意することは 重要である。

本発明の改良されたアジュバントは、また、リポ多糖誘導体および次の一般式： ％式％） 式中、疎水性物質（Ｃｓ　Ｈａ　Ｏ）の分子量はほぼ３０００〜９０００であり 、そして親水性物質（Ｃ２Ｈ，Ｏ）の百分率はほぼ３〜１５重量％である、 をもつ表面活性コポリマーの組み合わせからなる。本発明は、また、リポ多糖誘 導体および次の一般式 式中、 （Ｃ３Ｈ６０）から成るオクタブロックコポリマーの疎水性部分の分子量はほぼ ４０００〜９０００ダルトン、好ましくは５０００〜７０００ダルトンであり、 ａは（Ｃ２Ｈ４０）により表される親水性部分が化合物の合計の分子量のほぼ１ ０〜４０％を構成するような数であり、ｂはオクタブロックコポリマーの（Ｃｓ ＨｓＯ）部分が化合物のほぼ６０〜９５％を構成するような数である、をもつオ クタブロックコポリマーの組み合わせからなる。

コポリマーの（Ｃａ　Ｈｓ　Ｏ）部分は化合物の９５％までを構成することがで きる。コポリマーの（Ｃ２Ｈ４０）部分は化合物の５％程度に少なくを構成する ことができる。

ＬＰＳおよび表面活性コポリマーの組み合わせからなるアジュバントは、ピーク の力価およびピークの力価に到達する時間の両者により表わされる効果の相乗性 を生成する。ある場合において、ことに低分子量のリポ多糖類を使用するとき、 初期の力価はより高く、次いで経時的にわずかに減少する。より高い分子量のリ ポ多糖類では、初期の力価はより高く、そして応答は時間が経過しても高く止ま る。リポ多糖類のすべてでは、組み合わせは保護的１ｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ アイソタイプを増加する。これは予期せざることである。なぜなら、ＬＰＳそれ 自体はアジュバントとして作用して、主としてＩｇＧ１免疫応答を誘発すると報 告されていたからである。

改良されたアジュバントは、また、次の式：％式％） 式中、疎水性物質（ＣｓＨ６０）の分子量はほぼ３０００〜９０００であり、そ して親水性物質＜　ｃ　！Ｈ４０）の百分率はほぼ３〜１５重量％である、 をもつ表面活性コポリマーおよび次の一般式式中、 （Ｃｓ　Ｈａ　Ｏ）から成るオクタブロックコポリマーの疎水性部分の分子量は ほぼ５０００〜７０００ダルトンであり、ａは（ＣｆＨ４０）により表される親 水性部分が化合物の合計の分子量のほぼ１０〜４０％を構成するような数であり 、ｂはオクタブロックコポリマーの（Ｃ，Ｈ＠Ｏ）部分が化合物のほぼ６０〜９ ０％を構成するような数である、をもつ逆オクタブロックコポリマーからなる。

コポリマーの（Ｃ３Ｈ，０）部分は化合物の９５％までを構成することができる 。コポリマーの（Ｃ２Ｈ，Ｏ）部分は化合物の５％程度に少なくを構成すること ができる。

ａは（Ｃ，Ｈ４０）により表される親水性部分が化合物の合計の分子量のほぼ５ 〜４０％を構成するような数である：ポリオキンプロピレン（Ｃｓ　Ｈａ　Ｏ） から成るオクタブロックコポリマーの疎水性部分の平均の凝集分子量はほぼ４０ ００〜８０００ダルトンである：そしてｂはオクタブロックコポリマーの合計の 分子量の（ＣｓＨ，Ｏ）部分が化合物のほぼ６０〜９０％を構成するような数で ある。

コポリマーの（Ｃｓ　Ｈａ　Ｏ）部分は化合物の９５％までを構成することがで きる。コポリマーの（Ｃ２Ｈ４０）部分は化合物の５％程度に少なくを構成する ことができる。

改良されたアジュバントは、また、次の式：％式％） 式中、疎水性物質（Ｃｓ　Ｈｓ　Ｏ）の分子量はほぼ３０００〜９０ｏＯであり 、そして親水性物質（Ｃ２Ｈ４０）の百分率はほぼ３〜１５重量％である、 をもつ表面活性コポリマーおよび次の一般式式中、 （Ｃ３Ｈ，Ｏ）から成るオクタブロックコポリマーの疎水性部分の分子量はほぼ ５０００〜７０００ダルトンであり、ａは（Ｃ２Ｈａ　Ｏ）により表される親水 性部分が化合物の合計の分子量のほぼ１０〜４０％を構成するような数であり、 ｂはオクタブロックコポリマーの（Ｃ３Ｈａ○）部分が化合物のほぼ６０〜９０ ％を構成するような数である、をもつオクタブロックコポリマーからなる。

コポリマーの（Ｃ３Ｈ６０）部分は化合物の９５％までを構成することができる 。コポリマーの（ＣｆＨ４０）部分は化合物の５％程度に少なくを構成すること ができる。

本発明は、また、抗原および府述のアジ、ユバントからなるワクチンを包含する 。

本発明は、また、多糖、タンパク質、小さいペプチドまたは他のハプテンに対し て動物またはヒトを免疫化するためにことに有用であるワクチンからなる。本発 明によれば、小さいペプチドまたはハブテンは微生物から誘導された鞭毛に接合 される。鞭毛は任意の有鞭毛微生物から誘導することができる：しかしながら、 サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種から誘導されたものは好ましい。任意 の特定の応用のために鞭毛が誘導される好ましいバクテリア種は、応用の特定の 抗原の要件に依存し、そして本発明について臨界的ではない。

あるバクテリアは単一の鞭毛を有するが、他のものは鞭毛の房を有し、そしてな お他のものは全細胞表面上に分布した鞭毛を有する。バクテリアの鞭毛は直径が １０〜３５ｎｍであり、そして時々長さが１０〜１５μｍを越えることがあるか 、あるいは細胞の直径の多数倍である。大部分のバクテリアの鞭毛は約２．５μ ｍの波長をもつ規則的な均一なカールを示す。

バクテリアの鞭毛は、性質が調製であり、ｐＨ＝３に酸性化されるとき、それら はフラゲリンと呼ばれる同一のモノマーのサブユニットに解離し、これらのフラ ゲリンはほとんどの種においてほぼ４０．０００の分子量を有する。ｐＨおよび 塩濃変の適当な条件下に、フラゲリンのモノマーは自発的に再凝集して、自然の 鞭毛と同一の波長の周期的カールを有する完全な鞭毛と同一であるように思われ る構造を形成する。

自然の形態または固定剤で固定した完全なバクテリアの鞭毛は、本発明において 使用することができる。さらに、再重合した鞭毛は本発明の実施において満足す べきものである。本発明の必須成分は、幾何学的パターンで規則的に間隔を置い て位置して、特定の有機体に典型的な細長い鞭毛構造を生成する鞭毛分子から構 成されたポリマーから成ると信じられる。

バクテリアの培養から鞭毛を調製するある数の手順は開発され、そして当業者に よく知られている。好ましい手順は、ここに記載するコバヤシ、の手順の変更で ある。１３ 菌株ＴＹ２のチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｆ）有機体を移動性寒 天の中で成長させる。高度に移動性の有機体は、最も鞭毛を産生ずるので、選択 すべきである。次いで、有機体を２０リツトルのトリブチカーゼダイズブロスの 中に接種し、そして成長の対数期の終わりまで、３７℃においてほぼ３０時間イ ンキュベーションする。有機体をこの時ホルムアルデヒドの添加により殺して、 ０４３％の懸濁液を生成することができる。有機体は好ましくは遠心により集め る：しかしながら、過剰の剪断力の発生を回避するように注意すべきである。次 いで、農産器内で２０分間激しく農産することによって鞭毛を有機体から除去す る。有機体を崩壊しないで鞭毛を破壊する剪断力を生成する他の混合装置は等し く満足すべきものである。

次いで、鞭毛を細胞本体から示差的遠心により分離する。細胞本体を標準の実験 室の遠心機によりほぼ２００Ｏｒｐｍで遠心することによって除去する。次いで 鞭毛を３０．０００ｒｐｍの超遠心により集める。

次いで鞭毛を再懸濁し、そして超遠心機で再遠心し、そして可溶性の汚染物質を 注ぎ出す。大きい汚染物質は透明な鞭毛の沈澱の底に黒色のスポットを形成する であろう。この物質を物理的に除去しそして廃棄する。

２０リツトルの培養物から誘導された最終生成物はほぼ１００ｍｇの精製した鞭 毛であろう。

フラゲリンは固定しない鞭毛をｐＨはぼ２で一夜酸性化することによって生成す ることができる。この処理は鞭毛を解離させて３０，０００の分子量を有するフ ラゲリンのモノマーを生成する。モノマーは、中性のｐＨにおいて少なくとも２ ４時間放置すると、再アセンブリングして重合した鞭毛となる。再重合したフラ ゲリンは、小さい抗原部分のためのアジュバントおよび担体として、自然の鞭毛 とほぼ同一の有効性を有する。七ツマ−のフラゲリンまたは鞭毛のタンパク質分 解的切断の断片は、有効性が非常に低い。

抗原、すなわち、タンパク質、多糖、ノ１ブテンまたはペプチドの部分は、当業 者によく知られている標準の手段の任意の１つにより鞭毛に化学的に接合するこ とができる。最も間車かつ最も有効な手段はグルタルアルデヒドを使用すること による。グルタルアルデヒドは、ペプチドを鞭毛に共有結合的に取り付けそして さらに鞭毛調製物を固定する、２価の架橋化合物である。池の化学的架橋試薬ま たは化学的抗原誘導体、例えば、ノニトロフルオロベンゼンは有効である。抗原 、ノ＼ブテンまたはペプチドの部分を接合する方法は当業者によく知られている 。

抗原を鞭毛に取り付ける量は特定の用途とともに変化し、そして本発明の臨界的 成分ではない。好ましくは、鞭毛調製物中の２〜１０のペプチドまたはハブテン の単位／フラゲリンモノマーは十分である。より小さい多重物はより大きいタン パク質または多糖の抗原のために必要である。

接合した鞭毛調製物は透析、遠心、あるいは任意の他の標準の方法により精製さ れる。次いで、この物質を生理的塩類溶液の中にほぼ１００ｍｇ／ｍｌの量で再 懸濁する。

この調製物は１〜１００μｇ／注射の低い投与量で有効である。１０μｇの投与 量は多数の場合において満足すべき応答を生成する。この物質は普通のルートに より、静脈内、皮下、筋肉内または腹腔内に注射することができる。

例として、ジニトロフェノールと接合したチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌ　１ａ　 ｔｙｐｈｉ）の鞭毛の２０μｇの注射はノ＼ブテンＤＮＰに対して特異的なＩｇ Ｇ抗体の力価を生じ１、これは注射後第１週の終わりに上昇し、そして１年以上 の間持続した。

鞭毛および鞭毛に接合した抗原部分に対する免疫応答の持続は異常でありかつ予 期せざることである。この物質は注射部位において抗原の局所的貯蔵所を形成し ない。鞭毛の注射した投与量のほぼ９０〜９５％は２４時間以内に破壊しそして 分泌される。この物質の一部分は局所的リンパ節内の発芽中心で延長した時間の 間保持される。発芽中心内のこの抗原の存在は延長した抗原の産生の原因となる と信じられる。

本発明は池の入手可能な調製物を越えた多数の利点を有する。それは注射部位に おいて非常にわずかの炎症を生成し、そして完全に生物分解性である。これは油 孔濁液または鉱物の塩類、例えば、アルミニウムと鋭い対照をなす。延長した免 疫応答を生成するために非常に小さい投与量が要求される。抗原の有意の部分は 補体固定性ＩｇＧであり、これはマラリア、スポロシイ）・および他の重要な感 染に対する保護のために要求される型である。それは凍結乾燥しそして室温にお いて無限に貯蔵することができる。生理的塩類溶液で再構成するとき、それは冷 蔵で数週間そして室温において数日間安定である。

感受性の宿主において感染を生成しうる生の弱毒化ワクチンと異なり、このワク チン調製物は微量の多糖とともに重合したタンパク質のみから成る。

本発明に従い調製したワクチンの好ましい投与量は５μｇ〜５００μｇである。

任意のワクチンのための最適な投与量は鞭毛タンパク質と接合した抗原およびワ クチン接種されている動物またはヒトの免疫学的状態に依存する。

本発明のワクチンは、また、免疫応答をさらに増強するためにアジュバントと一 緒のワクチンの投与を包含する。本発明のワクチンとともに使用することができ る好ましいアジュバントは、エチレンジアミンの開始剤上に構築された親水性ポ リオキシエチレンのポリマーからなるブロックコポリマーである。次いで、疎水 性ポリオキシプロピレンのポリマーを親水性のポリオキシエチレンのブロックに 付加する。これは次の一般式 式中、 （Ｃ３Ｈ，Ｏ）から成るオクタブロックコポリマーの疎水性部分の分子量はほぼ ５０００〜７０００ダルトンであり、ａは（Ｃ２Ｈ４０）により表される親水性 部分が化合物の合計の分子量のほぼ１０〜４０％を構成するような数であり、− ｂはオクタブロックコポリマーの（Ｃ３Ｈ６４０）部分が化合物のほぼ６０〜９ ０％を構成するような数である、をもつオクタブロックコポリマーを生ずる。

コポリマーの（Ｃ３Ｈ，Ｏ）部分は化合物の９５％までを構成することができる 。コポリマーの（Ｃ，Ｈ，Ｏ）部分は化合物の５％程度に少なくを構成すること ができる。

好ましいアジュバントは、次の式を有する・式中、ａはほぼ５に等しくモしてｂ はほぼ３２である。

本発明を構成するワクチンとともに使用することができる他のコポリマーは、次 の式を有する： ＨＯ（Ｃ２Ｈ４０）−（Ｃ３Ｈ６０）−（ＣｚＨｎＯ）−Ｈ式中、疎水性物質（ ＣｓＨａＯ）の分子量はほぼ２０００〜５５００であり、そしてこの合計の分子 量はほぼ２３００〜５５００である。

好ましいアジュバントは、次の式を有する：ＨＯ（Ｃ２Ｈ，Ｏ）、（Ｃ，ＨａＯ ）、（Ｃ，Ｈ４０）、Ｈ式中、疎水性物質（Ｃ，Ｈ，Ｏ）の分子量はほぼ４６０ ０であり、そして親水性物質（Ｃ，Ｈ，○）の百分率はほぼ１０重量％である。

他の好ましいアジュバントは、次の式を有する。

ＨＯ（ＣｚＨ４０）−（Ｃ３Ｈ６０）−（ＣｚＨ４０）−Ｈ式中、疎水性物質（ Ｃ，Ｈ，Ｏ）の分子量はほぼ５２００であり、そして親水性物質（ＣｚＨ４０） の百分率はほぼ１０重量％である。

ポリマーのブロックは、高温および高圧において塩基性触媒の存在下に、４官能 性ジアミン開始剤上にエチレンオキシドおよびプロピレンオキシドを凝縮するこ とによって形成される。結合して各コポリマーの中にポリマー鎖を形成するモノ マー単位の数に多少の統計学的変動は存在する。所定の分子量は各調製物におけ るコポリマーの平均分子量の概算である。これらのブロックコポリマーの調製物 のそれ以上の説明は、米国特許案２．６７４，６１９号および米国特許第２．９ ７９．５２８号であり、これらをここに引用によって加える。１４ポロキサマー およびボロキサミンの発表された分子量はヒドロキシル法により普通に決定され る。ポリエーテル鎖の末端基はヒドロキシル基である。数平均分子量は分析的に 決定されたｒＯＨ価」であり、ＫＯＨ／ｇ試料で表される。ポリ分散化合物の分 子量の絶対値は、分子量の決定に使用する方法に依存して異なることがあること を理解すべきである。

こうして、コポリマーの分子量をどの方法で決定したかを知ることは重要である 。ここで使用するとき、すべてのコポリマーの分子量はヒドロキシル法により決 定した。分子量を他の方法、例えば、高性能液体クロマトグラフィーにより決定 するとき、わずかに異なる数が得られる。

本発明を構成するワクチンはオクタブロックコポリマーと混合し、そしてヒトま たは動物に投与する。本発明のワクチンとともに投与されるアジュバントの好ま しい量は、はぼ０．　１〜５．０ｍｇであり、最も好ましい量はほぼ０５〜２ｍ ｇである。

本発明のアジュバントの他の実施態様は脂質Ａの種々の誘導体である。

脂質への種々の種の構造は、タカヤマ、Ｋ、ｅｔａｌ、およびレツ（Ｒａｅ　ｔ 　ｚ）　、Ｃ，Ｒ，Ｈ，の論文に記載されており、それの両者をここに引用によ って加える。Ｉ５．１６　モノホスホリル脂質Ａは完全な脂質Ａ分子より低い毒 性を有するが、動物に対する毒性が完全な脂質Ａより低い。脂質ＩＸＡおよび脂 ｙｘは脂質Ａの生合成の前駆体である。本発明の一部分として考えられる脂質Ａ 誘導体は第１０図〜第１３図に示されている。

何件かの最近の報告は、ＩｇＧ２ａ抗体をいくつかのウィルスおよびバクテリア の感染に対する保護を与えると関係づけた。ＩｇＧ２ｂ抗体はよく研究されてい ないが、また、保護的であると報告された。ＩｇＧ１サブクラスの抗体は補体を 固定せず、そして多数の場合においてかなり低い保護的効能をもつ考えられる。

結局、ことにコポリマーと混合したとき、抗体の応答をＩｇＧ２アイソタイプに シフトするＬＰＳ検出の能力はワクチンの効能を増加することを期待することが できる。

本発明において使用することができる抗原は、動物の中に導入したとき、抗体の 形成を生ずる。本発明に従い使用することができる代表的な抗原は、次のものを 包含するが、これらに限定されなしＸ：ウイルス、ノくクチリア、真菌、寄生生 物および他の感染因子から誘導された自然、組み換えまたは合成の産生物ならび に予防または治療学的ワクチン１こおＬ＼で使用されることがある自己免疫病、 ホルモンまたは腫瘍の抗原。ウィルスまたはバクテリアの産生物は、酵素的切断 により産生された有機体の成分であるか、あるいは当業者によ（知られている組 み換えＤＮＡ技術により産生された有機体の成分であることができる。代表的な 抗原の部分的リストは次の通りである ウイ、ルス ＩＶ ロタウィルス 足および口の病気 ヘルペス種、単純ヘルペスウィルス、エプスタインーノ＜−一ウイルス、水痘ウ ィルス、仮性狂犬病ウィルス 狂犬病 ポリオ Ａ型肝炎 Ｂ型肝炎 Ｃ型肝炎 麻疹 システンバー ベネズエラウマ脳を髄炎 ロタウィルス ネコ白血病ウィルス レオウィルス ＲＳウイルス ラサ熱ウイルス ポリオーマウィルス イヌバルボウイルス ウシ乳頭腫ウィルス ダニ媒介性脳炎ウィルス 牛疫ウィルス ヒトライノウィルス種 エンテロウィルス種、メンゴウイルス バラミクソウイルス 鳥伝染性気管支炎ウィルス バクテリア 百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）プルセラ・アボルチス （Ｂｒｕｃｅｌｌａ　ａｂｏｒｔｉｓ）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃａ ｌ　ｉ）サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅ　１１　ａ）種、チフス菌（Ｓａｌｍｏ ｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ） 連鎖法菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）コレラ 赤痢菌属（Ｓｈｊｇｅｌｌａ） ンユードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）結核菌 らい菌 リケッチアの感染 ロッキー山紅班熱 チフス 寄生生物 マラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍｕ、Ｐ、ｖｉｖａｘ、 Ｐ、ｍａｌａｒｉａｅ） 住血吸虫 トリソーマ属 真菌 クリプトコツカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒ ｍａｎｓ） サブユニットの組み換えタンパク質 単純ヘルペス ニスバインバールウィルス Ｂ型肝炎 仮性狂犬病 ワラビウイルス属、デンゾ、黄熱 淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈａｅａｅ）マラリア：サーカムスポ ロゾイトタンパク質、メロシイトタンバク質トリバノソーム表面抗原タンパク質 百日咳 アデノウィルス タンパク質 ジフテリアトキソイド 破傷風トキソイド 髄膜炎菌外膜タンパク質（ＯＭＰ） 連鎖球菌Ｍタンパク質 Ｂ型肝炎 インフルエンザへマグルチニン 合成ペプチド マラリア 足および口の病気のウィルス Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎 多糖 肺炎球菌性肺炎（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）インフルエ ンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ポリリボシルーシビ トホスフエート（ＰＲＰ）ｍ膜炎ｍ（Ｎｅｉｓｓｅｒｒａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉ ｄｉｓ）緑ＨＩｍＣＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）肺炎杆菌 （Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）オリゴ糖 ハプテンは、免疫原性担体に結合しそしてを推動物の中に導入したとき、ハブテ ンに対して特異的な抗体の形成を誘発するであろう。ハブテンの代表例は、ステ ロイド、例えば、エストロゲンおよびコルチゾン、低分子量のペプチド、他の低 分子量の生物学的化合物、薬物、例えば、抗生物質および化学療法の化合物、工 業的汚染物質、香味剤、食物添加剤、および食物汚染物質、および／またはそれ らの代謝物または誘導体である。

本発明の前の実施態様に加えて、シリカの懸濁液へのある種のコポリマーの添加 は組成物のアジュバント活性の予期せざる増加を提供した。

シリカは既知のアジュバントであるが、その使用は毒性、ことに線維症により制 限されてきている。シリカを他のアジュバント部分、例えば、表面活性コポリマ ーまたはＬＰＳを含むか、あるいは含まない油状賦形剤の中に混入することによ って、この毒性は減少しそして有効性は増加する。シリカの投与量および毒性は 、本発明により、減少すると同時に有効性は増加する。好ましくは、油孔濁液は 油およびシリカ粒子からなり、この乳濁液は４０％〜９９％の油からなる。好ま しい油はスクアラン（ングマ・ケミカル・カンパニー、ミゾリー州セントルイス ）。油に加えて、洗浄剤または洗浄剤の混合物を必要に応じて油に添加すること ができる。本発明において使用できる洗浄剤の例はポリオキンエチレンソルビタ ン（ツイーン）およびソルビタン（スパン）（ングマ・ケミカル・カンパニー、 ミゾリー州セントルイス）である。しかしながら、コポリマー、例えば、ＰＬＵ ＲＯＮＩＣ’Ｌ１２１はしばしば好ましい。

ワクチンアジュバントのある種の成分は酸化されやすいので、酸化防止剤が保存 剤として含められてきている。油賦形剤のスクアレンはとくに酸化されやすい。

ブロックコポリマーは、また、影響を受けることがある。ワクチン成分の酸化的 分解を防止するために譜在的に許容されつる、多数の酸化防止剤は入手可能であ る。これらの例、トコフェロール（ビタミンＥ）またはトコフェロール誘導体は 、酸化を防止することに加えて、アジ二バント活性を増強する能力を有すること が発見された。

酸化防止剤は、ブロックコポリマーまたはシリカ乳濁液と組み合わせて使用する とき、酸化防止剤としてはたらくことに加えて、免疫応答を増加しそして局所的 炎症を減少するときとくに有効であることが発見された。こうして、本発明の一 部分として、酸化防止剤、例えば、トコフェロールまたはトコフェロール誘導体 とここに記載するアジュバントおよびワクチンとの混合物が考えられる。

小さいハプテンに対する有機体の免疫応答を増大するために本発明を適用する本 発明を、次の特定の実施例により説明する。他の実施例は当業者に明らかであり 、そして本発明はこれらの特定の例示的実施例に限定されないことが理解される であろう。

実施例１ 菌株ＴＹ２のチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）の有機体を移動性 寒天の中で成長させる。次いで、有機体を２０リツトルのトリブチカーゼダイズ ブロスの中に接種し、そして３７℃において、成長の対数期の終わりまで、３０ 時間インキュベーションする。有機体を、この時、ホルムアルデヒドの添加によ る殺して０３％の懸濁液を生成する。有機体を遠心により集める。過剰の剪断力 の発生を回避するように注意すべきである。次いで、農産器内で２０分間激しく 農産することによって鞭毛を有機体から除去する。有機体を崩壊しないで鞭毛を 破壊する剪断力を生成する他の混合装置は等しく満足すべきものである。

次いで、鞭毛を細胞本体から示差的遠心により分離する。細胞本体を標準の実験 室の遠心機によりほぼ２００Ｏｒｐｍで遠心することによって除去する。次いで 鞭毛を３０，０００ｒｐｍの超遠心により集める。

超遠心後、鞭毛を再懸濁し、そして超遠心機で再遠心し、そして可溶性の汚染物 質を注ぎ出す。大きい汚染物質は透明な鞭毛の沈澱の底に黒色のスポットを形成 する。この物質を物理的に除去しそして廃棄する。２０リツトルの培養物から誘 導された最終生成物はほぼ１００ｍｇの精製した鞭毛である。

実施例２ フラゲリンは固定しない鞭毛をｐＨはぼ２で一夜酸性化することによって生成す る。この処理は鞭毛を解離させて３０．０００の分子量を有するフラゲリンのモ ノマーを生成する。モノマーは、中性のｐＨにおいて少なくとも２４時間放置す ると、再アセンブリングして重合した鞭毛となる。

実施例３ グルタルアルデヒドは、ペプチドを鞭毛に共有結合的に取り付けそしてさらに鞭 毛調製物を固定する、２価の架橋化合物である。官能基をペプチドに接合するこ れらの方法は当業者によく知られている。他の化学的架橋性の抗原または化学的 抗原誘導体、例えば、ジニトロフルオロベンゼンは有効である。

実施例４ 接合した鞭毛調製物を透析、遠心、あるいは任意の他の標準の方法により精製す る。次いで、この物質を生理的塩類溶液の中にほぼ１００ｍｇ／ｍＩの量で再懸 濁する。この調製物は１〜１００μｇ／注射の低い投与量で有効である。１０μ ｇの投与量は多数の場合において満足すべき応答を生成する。この物質は普通の ルートにより、静脈内、皮下、筋肉内または腹腔内に注射することができる。皮 下または筋肉内のルートは通常多数のワクチンの目的に最も便利である。

実施例５ Ｒａ−ＬＰＳ　（Ｒａ−無毒化）の無毒化は次のようにして実施する：Ｅ、ｃｏ ｌｉ　ＥＨ−１００（１０，０ｍｇ）から得られたＲａ−ＬＰＳを５．０ｍｌの 水の中に懸濁し、１５分間超音波処理し、そして１００℃において５分間インキ ュベーションする。インキュベーションから取り出し後、１／３０の体積のトリ エチルアミンを試料に添加し、そしてよく混合する。この試料を室温（２２℃） において４日間放置する。

次いで試料を凍結乾燥し、そしてこの処理により遊離した遊離脂肪酸をヘキサン で抽出する。残留する残留物はＲａ−無毒化を構成する。０゜１モルのＨＣＩ′ ７中で加水分解した試料の分析用ＴＬＣにおいて、ＭＰＬのパターンはヘキサア ンルーペンタアシルからペンタアンルーテトラアシルの形態ヘンフトしたことが 明らかにされた。脂質Ａの３位置における単一の３−ヒドロキシメリスチン酸は 解放されて、内毒素活性が減少した主としてペンタアシルＲａ、　−Ｌ　Ｐ　Ｓ の形成を生ずると考えられる。

ｉｓ　無毒化されたＬＰＳは種々のＬＰＳの形態から調製することができ、これ らの形態は次のものを包含するが１．これらに限定されない　サルモネラ・ミネ ソタ（Ｓ、ｍ１ｎｎｅｓｏｔａ）Ｒ６０またはネズミチフス菌（Ｓ、ｔｙｐｈｉ ｍｕｒｉｕｍ）ＴＶ１１９からのＲａ−ＬＰＳならびにネズミチフス菌（Ｓ、ｔ ｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＳＦｉ５１２からの５Ｒ−ＬＰＳそしてこれらはアジュ バントとして使用される。

実施例６ ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、トリニトロフェノールのハプテ〉・に対して向 けられた抗体を決定する。それは本来サランダース（Ｓａｕｎｄｅｒｓ）により 発表された方法の変更である。１９　このアッセイはタンパク質、ウシ血清アル ブミン、ヒドロゲルを使用して、プラスチック支持体へ付着するタンパク質の変 性を減少し、そしてタンパク質および界面活性剤を使用して、バックグラウンド を増加しそして感度を減少する傾向があるタンパク質の非特異的吸着を減少する 。グルタルアルデヒドを使用して抗原をＢＳＡコーティングした９６ウエルのマ イクロタイタープレートに取り付ける。結合しないグルタルアルデヒドを洗浄除 去する。プレートに添加した抗原は、プレートにグルタルアルデヒドの遊離アル デヒド基を経て共有結合的に結合する。

残留するアルデヒド基をリジンでブロンキングし、そしてプレートはすぐに使用 できる状態である。プレートを種々の抗血清の希釈剤物とインキュベーションし 、次いで第２抗体、例えば、ペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウスＩｇＧまたはサ ブクラスの１つとインキュベーションする。

プレートを洗浄し、そして基Ｗ（例えば、オルトフエニレンジミンおよび過酸化 物）を添加する。４９２ｎｍにおける生ずる吸収をタイターテク−フルチスキ＋ ン、（Ｔｉｔ、ｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ）フォトメーターにより読む。

抗体の力価あを、バックグラウンドの１／３〜１／３最大光学密度を生成するた めに要求される抗血清の希釈として計算する。これは試料と同時に参照抗血清と の比較により正規化する。これは異なる日に実施した力任の比較を促進する。互 いにに関する抗体の相対的結合活性っを、光学密度／血清希釈の曲線の傾斜の分 析により推定する。

同様なＥＬＩＳＡアッセイは、当業者により、タンパク質、ペプチドおよび多糖 類を包含する多数の抗原について開発されることができる。

さらに、１〜４モルのチオシアン酸アルミニウムを最初の抗体後にＥＬＩＳＡの ウェルに添加して、低い結合活性の抗体の剥離を促進し、これにより結合活性の より定量的な測定を得る。

実施例７ 以下の実験において、平均４ＴＮＰ分子／鞭毛と接合した鞭毛の２５μｇを後足 を経てマウスに投与する。ＴＮＰ接合鞭毛は０．５ｍｌの生理的塩類溶液の体積 で投与する。ＴＮＰに対して特異的な抗体はＴＮＰ接合鞭毛の投与後の次の時間 において測定する１８日、１９日、３０日、５０日および９０日。この実験の結 果を第１図に示す。理解できるように、ＴＮＰ接合鞭毛に対する免疫応答は９０ 日後なお有意に高い。普通の丁ＮＰ接合体、例えば、ＴＮＰ接合ニワトリ卵アル ブミンに対する応答は期間が非常に短（、そして抗体の力価は非常に低い。動物 は、単一の注射後、可溶性タンパク質の担体上のハプテンに対する検出可能な抗 体で全（応答しない。

実施例８ 変化する投与量のＴＮＰ接合鞭毛を投与することによって、マウスの投与量の応 答を測定する。事項４ＴＮＰ分子／鞭毛分子（分子量はぼ４０．０００）と接合 した鞭毛を後足を経てマウスに投与する。ＴＮＰ接合鞭毛は０．５ｍｌの生理的 塩類溶液の体積で投与する。次の濃度のＴＮＰ接合鞭毛をマウスに投与する：４ μｇ、１０μｇ、２５μｇおよび５０μｇｏ　ＴＮＰ接合鞭毛に応答して産生さ れた抗体は、ＴＮＰ接合鞭毛の投与後８日および１９日に測定する。この実験の 結果を第２図に示す。

実施例９ ニワトリ卵アルブミン（ＨＥＡ）に接合したＴＮＰおよびバクテリアの鞭毛タン パク質に接合したＴＮＰに対するマウスの免疫学的応答の比較を第３図に示す。

この実験において、鞭毛と同一の方法で反応性誘導体のトリニトロベゼンスルホ ン酸（ＴＮＢＳ）を使用して、ＴＮＰをＨＥＡに接合する。１００μｇのＴＮＰ 接合ＨＥ　Ａまたは２５μｇのＴＮＰ接合鞭毛を、後足を経てマウスに投与する 。ＴＮＰ接合タンパク質の投与後１０日に、抗体の力価を実施例６に従い測定す る。第３図に示すように、ＴＮＰ接合鞭毛は、抗体の力価により測定して、ＴＮ Ｐ接合ＨＥＡより有意に大きい免疫応答を誘発する。この実験において投与した ＴＮＰ−ＨＥＡの量はＴＮＰ接合鞭毛の量の４倍であることを注意すべきである （１００μｇのＴＮＰ−ＨＥＡ／２５μｇのＴＮＰ接合鞭毛）。

実施例１０ 実施例９において使用した同一の調製物を、１．ＱｍｇのＴ１５０Ｒ１アジユバ ントを添加してマウスに投与する。１００μｇのＴＮＰ接合ＨＥＡまたは２５μ ｇのＴＮＰ接合鞭毛を、後足を経てマウスに投与する。ＴＮＰ接合タンパク質お よびアジュバントの投与後１０日に、抗体の力価を実施例６に従い測定する。こ れらの測定結果を第３図に要約する。示すように、アジュバントはＴＮＰ接合Ｈ ＥＡおよびＴＮＰ接合鞭毛の両者に対する応答を上昇した。しかしながら、ＴＮ Ｐ接合鞭毛はＴＮＰ接合ＨＥＡより有意に大きい免疫応答を誘発した。ＨＥＡの 代わりにキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を使用して、同様な実験 を実施して、同様な結果を得た。ＫＬＨはＨＥＡより有効であるが、担体として 鞭毛より有効性に劣る。

実施例１１ ブロックコポリマーのアジュバントは明確なメカニズムを経て作用するように思 われるので、それらをより複雑な配合物の中に混入して特定の応用のための活性 を最適化する可能性が存在する。ＴＮＰ、。−ＨＥＡを１．０ｍｇの表面活性コ ポリマーは、次の式。

Ｈｅ（Ｃ２Ｈ，○）−（ＣｓＨｅＯ）　、（ＣｚＨ４０）。Ｈ式中、疎水性物質 （ｃ、Ｈ，Ｏ）の分子量はほぼ４６００であり、そして親水性物質（Ｃ２Ｈ４０ ）の百分率はほぼ１０重量％である、を有する表面活性コポリマーを使用して水 中油乳濁液の中で調製する。

表面活性コポリマーは、水中油乳濁液の中で、ＴＮＰ、。−ＨＥ　ＡおよびＲｅ −ＬＰＳおよび２つの源からのモノホスホリル脂質Ａを包含する、種々の脂質、 へ誘導体を使用して調製する。さらに、脂質Ａ、脂質ｒＸＡおよび脂質Ｘの２つ の前駆体を評価する。ＬＰＳおよび両者の脂質Ａは、トリブロックコポリマー単 独のそれを越えた抗体の力価の顕著な増加を生成した。油（２％のスクアラン） およびコポリマーを乾燥したトリニトロフェニル接合ニワトリ卵アルブミン（Ｔ ＮＰ＋ｏ　ＨＥＡ）と混合し、引き続いてＰＢＳ、ｐＨ７，４および０．２のツ イーン−８０の中で均質化する。マウスに両方の後足の間で分割して５０μ】を 与える。投与量／動物は５０μｇの抗原、０．６ｍｇのＬ１４１および０．１ｍ ｇのＴ１５０Ｒ１である。接着剤およびイオノフオアのコポリマーの組み合わせ は、それらのいずれかの単独のそれを越えた抗体の応答の顕著な増加を生成した 。この実験の結果を第４図および第５図に示す。

バー標識したＭＰＬ−ＴＤＭおよびＴＤＭはリビ・イムノケミカル（Ｒｉｂｉ　 Ｔｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ）（モンタナ州ハミルトン）から商業的に入手可 能な調製物である。これらのアジュバントはアジュバントとともに供給されたイ ンストラクションに従い調製する。

理解できるように、商用アジュバントＭＰＬ−ＴＤＭおよびＴＤＭは、マウスに おいて、他の調製物と比較して最小の応答を発生した。しかしながら、コポリマ ーおよび脂質Ａ誘導体の種々の組み合わせは予期せざる高い抗体の力価を引き起 こした。

実施例１２ ２％のスクアランの水中油乳濁液の中で凍結乾燥した抗原を使用してコポリマー のアジュバントの効果を評価する。油およびコポリマーを乾燥ＴＮＰ、。−ＨＥ Ａと混合し、引き続いてＰＢＳ、ｐ）（７，４中で０゜２、％のツイーン−８０ で均質化する。マウスに両方の後足の間に分割した５０μ］を与える。投与量／ 動物は５０μｇの抗原、０．６ｍｇのＬ１４１と表示するトリブロックコポリマ ーおよび１ｍｇのＴ１５０Ｒ１と表示するコポリマーである。

Ｌ１４１と表示するコポリマーは、次の式を有する：ＨＯ（ＣｚＨ４０）−（Ｃ ｓＨａＯ）−（ＣｚＨ４０）−Ｈ式中、疎水性物質（Ｃ３ＨｅＯ）の分子量はほ ぼ４６００であり、そして親水性物質（Ｃ２Ｈ４０）の百分率はほぼ１０重量％ である。

Ｔ１５０Ｒ１と表示するコポリマーはイオノフオアであり、そして次の式を有す る： 式中、ａはほぼ５に等しくモしてｂはアルコキシ３２に等しい。

この実験の結果を第５図に示す。理解できるように、トリブロックコポリマーお よび逆オクタブロックコポリマーの組み合わせは相乗的アジュバント効果を与え る。

実施例１３ この実験において、５０μｇの凍結乾燥したＴ　Ｎ　Ｐ　＋　ｏ　ＨＥ　Ａ　（ １０。

４ＴＮＰ１モル）をマウスに両方の後足の間に５０ｍ１の投与量の分割で投与す る。乾燥抗原を油と混合し、次いで生理的塩類溶液で乳化する。

フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）（グランド・アイランド・バイオロジカ ル）を６０％の油として添加剤なしで構成する。すべての他の調製物は１．６ｍ ｌの乳濁液の投与量で５０μｍのスパン−８０，１０μｍのツイーン−８０およ び１５ｍ、ｇのシリカ（５μｍのＭｉｎｕｓ　ｉＩ）を有する６０％の油である 。使用する場合、トリブロックコポリマーを０．６ｍｇの濃度で含め、モして逆 オクタブロックコポリマーは０゜１ｍ、ｇ／マウスの濃度である。データは５〜 １５マウス／群を使用する２つの実験からの複合である。（参照、第６図）。

Ｌ１２１と表示するトリブロックコポリマーは次の通りである二ＨＯ（Ｃｚ　Ｈ ４０）−（ＣｓＨａＯ）−（ＣｓＨａＯ）、Ｈ式中、疎水性物質（Ｃ，Ｈ６０） の分子量はほぼ４０００であり、そして親水性物質（Ｃ，Ｈ，Ｏ）の百分率はほ ぼ１０重量％である。

Ｌ１４１と表示するコポリマーは次の通りである：ＨＯ（ＣｚＨ＋（））−（Ｃ ｓＨｓＯ）−（ＣｚＨ＜０）−Ｈ式中、疎水性物質（Ｃ３８６０）の分子量はほ ぼ４６００であり、そして親水性物質（Ｃ１Ｈ４０）の百分率はほぼ１０重量％ である、およびＯ，１ｍｇの次のように表示される逆コポリマーとのオクタブロ ックコポリマー 式中、ａはほぼ５に等しくモしてｂはアルコキシ３２に等しい。

すべての配合物は、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）を除外して、ベース としてシリカを有した。理解できるように、コポリマーを有するすべての組成物 は増加したアジュバント活性を有し、そしてＦＣＡより有効である（参照、第６ 図）。

油およびシリカの組み合わせはそれらのいずれの単独より効果がある。

６０％の油それ自体は１００の平均力価を生成し、そしてシリカそれ自体は２０ より小さい平均力価を生成するが、組み合わせは単一の注射後３０日に３００を 越える力価を生成する。シリカの乳濁液は、それ自体で、あるいはコポリマーと ともに、ニワトリを嚢の病気のウィルスについて免疫化するか、あるいはウサギ を種々のタンパク質の抗原で免疫化するために、油孔濁液単独より有効であるこ とが発見された。最後に、スパンまたはツイーンの代わりに、他の界面活性剤を それらが安定な乳濁液を生成するかぎり、使用できることが発見された。シリカ の乳濁液は、フロイント完全アジュバントにより誘発される、強い、慢性の炎症 反応と比較して、はんど温和な局所的反応を生成する。さらに、シリカの混合物 は自己免疫アジュバントの関節炎を引き起こすことができない。

これは抗血清の産生について最も普通に使用されるアジュバント、フロイント完 全アジュバントを越えた利点を有する。

実施例１４ １ｍｇの第７図に示すコポリマーの各々を含有する２％のスクアランの水中乳濁 液中のＴＮＰ−ＨＥＡで、５〜１０匹のマウスの群を免疫化した。抗体の応答の 時間経過は、Ｌ８１が一時的応答を誘発する以外、群の各々において同様である 。力価は注射後はぼ１月でピークとなり、そして３力月にわたって持続した。動 物を免疫化後９０日に促進した。

促進後１週に再び採血する。１０％またはそｎより少ないポリオキシエチレン（ ＰＯＥ）を有するコポリマーのすべては強い免疫応答を誘発した。コポリマーＬ １２２は劣ったアジュバントである。ある範囲のＰＯＥＭの長さおよびポリオキ シプロピレン（ＰＯＰ）鎖をもつ分子量５２００のコポリマー（Ｌ１８０．５、 Ｌ１８１．５およびＬ１８２．５）のアジュバントの活性は、より小さいＬ１２ １ＳＬ１２２およびＬ１２３の系列について従来確立されたパターンに従う。１ ０％より多いＰＯＥをもつコポリマーは、再び、効果のないアジュバントである ことが発見された。

各長さのＰＯＰの１０％またはそれより少ないＰＯＥをもつコポリマーにより刺 激された平均力価は、第７図に示すように、ＰＯＰ疎水性物質の分子量の増加と ともに増加する。群の間に変動は存在するが、疎水性物質の分子量の増加に伴い 増加する力価の一般のパターンは反復して観察される。

抗体のアイソタイプは、目盛り定めしたクラス種抗血清を使用するＥＩｊＳＡア ッセイにより、多数の時点において測定する。篤８図に示すように、抗体の誘発 に有効なアジュバントであるコポリマーの調製物は顕著に異なるアイソタイプの パターンを誘発した。

より低い分子量の調製物のし１０１は、より少ない量のＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ ２ｂで主要なＩｇＧ１の応答を誘発する。疎水性物質の分子量が増加すると、１ ｇＧ２、ことにＩｇＧ２ｂの産生は増加する。興味あることには、１ｇＧ３アイ ソタイプの産生は反対のパターンに従い、最高の力価はより低い分子量の調製物 のＬ１２１およびＬｌｏｌにより産生された。１　ｇＧ１／Ｉ　ｇＧ２ｂの比は 、第８図に示すように、疎水性物質の分子量とともにほぼ直線で増加する。アイ ソタイプの分布は第２８日の決定後多数の間隔で測定する。各コポリマーにより 産生されるアイソタイプのパターンは引き続くアッセイの間に持続する傾向があ る。

実施例１５ １ｍｇのコポリマー１４１および／または１００μｇの無毒化ＲａＬＰＳを含有 する水中スクアラン乳濁液中の５０μｇのＴＮＰ−ＨＥＡで、マウスの群を免疫 化した。第１３図は、無毒化ＲａＬＰＳおよびＬ１４１をＴＮＰ−ＨＥＡと混合 し、そしてマウスに投与したときの相乗的応答を示す。第１４図は、アジュバン トの組み合わせの各々により誘発されたＩｇＧのアイソタイプおよび毒性ＬＰＳ との比較を示す。３０日後、抗体のアイソタイプをいくつかの内毒素誘導体およ び毒性が減少した分画について決定する。コポリマー１４１それ自体は主要なＩ ｇＧ１アイソタイプの抗体の応答を生成し、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂの量は 少なく、そしてＩｇＧ３は微量である。無毒化ＲａＬＰＳはＴＮＰ−ＨＥＡに対 するｒｇＧ１抗体の量を減少したが、ＩｇＧ２ａおよびＩ　ｇＧ２ｂの抗体を顕 著に増加する。同様な実験において、無毒のＳ、５ｐｈａｅｒｏｉｄｅｓのＬＰ Ｓは合計のＩｇＧの力価を増加しないが、ＩｇＧ１の量を事実減少させ、そして ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂの量を増加した。他の無毒および無毒化ＬＰＳ誘導 体の両者は力価を増加し、そしてアイソタイプのバランスをＩｇＧ２ａおよびＩ ｇＧ２ｂに向けてラントした。アジュバントを使用しないで注射した抗原は検出 可能な抗体を産生じなかった。

実施例１６ モノホスホリル脂質Ａと組み合わせてトレハロースジンミコレートおよびＬ１４ １コポリマーの間で比較を行う。示すアジュバントを有する水中油乳濁液中の５ ０μｇのＴＮＰ−ＨＥＡでマウスを免疫化した。乳濁液は５０μｇのＭＰＬおよ び／またはＴＤＭ／投与量を含有した。

Ｌ１４１とＭＰＬとの組み合わせはＴＤＭ−ＭＰＬの組み合わせより高い力価を 産生じた。力価は主としてＩｇＧ２ａサブクラスである。第１５図に示すように 、すべての３つの物質の組み合わせはすべてＩｇＧ３の有意の添加で最高の１ｇ Ｇ２の力価を生成した。

実施例１７ グラム陰性バクテリアからのリボ多糖類は有効な免疫変調因子および免疫学的ア ジュバントであることが、長い間認識されてきている。しかしながら、これらの 物質の毒性はアジュバントとしてそれらの開発を妨害した。量近、それらの毒性 を減少すると同時に実質的なアジュバント活性を保持する手段が報告された。こ の方法は脂質Ａからホスフェート基を除去して、モノホスホリル脂質Ａ　（ＭＰ Ｌ）を生成することを包含した。さらに、脂質Ａ部分からの１または２以上の脂 肪酸鎖の除去は、また、毒性を減少する。ＬＰＳのいくつかの型、とくにロドシ ュードモナス・スユフエロイデス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　５ｐｈ ａｅｒｏｊｄｅｓ）からの型（構造について第１１図参照）は固有に無毒である 。その構造は毒性脂質Ａのそれに非常に類似する。リエチセル（Ｒｉ　ｅ　ｔ　 ｃｈｓ　ｅ　ｌ）は、脂質Ａの全体の構造が毒性のために要求されることを提案 し、そして多数の修飾はその毒性を減少することを実証　−した。２０ この実験は、１系列のＬＰＳ誘導体が非イオン性ブロックコポリマーの界面活性 剤と組み合わせてアジュバントとして作用する効力を評価するように設計する。

ＬＰＳ誘導体を構造の修飾のスペクトルの評価に選択し、これらの修飾は毒性を 減少するいくつかの手段を評価しそしてアイソタイプおよび免疫応答の強度で構 造を評価するように選択する。これらの因子はそれら自体でおよびブロックコポ リマーのアジュバントＬ１４１と組み合わせて使用して、明確なメカニズムを経 て作用するように思われる因子の間の相乗性を評価する。

最後に、トレハロース６．６゛　シミコレート（ＴＤＭ）は、抗原を油滴の表面 に結合する付着性アジュバントであると報告された。ＴＤＭのアジュバント活性 をブロックコポリマーとＬＰＳｆＷ導体との組み合わせのアジュバント活性を比 較する研究を示す。

動物・ 千ャールス・リバー・ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ　ＲｉｖｅｒＬａｂｏｒ ａｔｏｒ　１ｅｓ）（ノースカロライナ州うレイ）カら入手した７〜１０週齢の 雌のＩＣＲ，（異系交配）マウスの群を使用する。

抗原調製物 トリニトロフェニル（Ｔ　Ｎ　Ｐ　）ハプテンを再結晶化したニワトリ卵アルブ ミン（ＨＥＡ、）に結合する。ＴＮＰをホウ酸塩緩衝液ｐＨ８，２中の５ミリモ ルのトリニトロベンゼンスルホネートでＨＥＡに接合させる。

トリ；トロフェニル化の程Ｉは、３５０ｎｍにおいて１５，４．００の消光係数 を使用して分光光度測定的に決定する。８〜９ＴＮＰ単位１モルのＨＥＡが結合 される。

アジュバント・ Ｓ、ｍ１ｎｎｅｓｏｔａ　Ｒ７からのＲｄ、−ＬＰＳ、ネズミチフス菌（Ｓ、ｔ ｙｐｈｉｒｎｕｒｉｕｍ）ＳＬ６８４からのＲｅ−ＬＰＳ、およびＥ、ｃｏｌｉ 　ＥＨ−１００からのＲａ−ＬＰＳをング？−ケミカルーカンパニー（Ｓｉｇｍ ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、ミゾリー州セントルイス）から購入する。Ｓ、 ｍ１ｎｎｅｓｏｔａ　Ｒ５９５からのＭＰＬをリビ・イムノケム・リサーチ・イ ンコーホレーテッド（Ｒｉｂｉ　ＩｒｎｍｕｎｏＣｈｅｍ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 Ｉｎｃ、　、モンタナ州ハミルトン）から購入する。Ｓ、ｍ１ｎｎｅｓｏｔａ　 Ｐ３４５、Ｓ。

ｍ１ｎｎｅｓｏｔａ　Ｒ６０、およびネズミチフス菌５Ｆ１５１２からの培養物 をインスチチュート・ヒュール・エクスベリメンテレ・バイオロジー・ラント・ メディンン（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｕｒ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｅｌｌｅ　Ｂ ｉｏｌｏｇｉｅ　ｕｎｄ　Ｍｅｄｉｚｉ、西ドイツ国ホルステル）から入手する 。Ｅ、ｃｏｌｉ０９および０５８は、スタテンス・セムミンスチット（Ｓｔａｔ ｅｎｓ　Ｓｅｒｕｍｉｎｓｔｊｔｕｔ、デンマーク国コペンハーゲンＤＫ−２３ ００）から入手スル。Ｅ、ｃｏｌｉ　０３１ｍ４の培養物は、エール・ユニバー ンティ・スクール・オブ・メディンンのデパートメント・オブ・ヒユーマンのジ エネティソクス・ゼネティック・ストック・センター（ＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃ ｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、Ｄｅｐａｒｔｍ、ｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｕｍａｒｒ　Ｇｅｎｅｔ ｉｃｓ、Ｙａｌｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　５ｃｈｏ。

Ｉ　ｏｆ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ、コネチカット州ニューヘブン）から入手する。

Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＮ７およびネズミチフス菌ｉ５０の温度感受性突然変異体の成 長ならびに脂質Ｘおよび前駆体脂質ＩＸＡの調製のすべては、タカヤマ、Ｋ、ら およびラエツ（Ｒａ　ｅ　ｔ　ｚ）　、ＣＲ，Ｈら、これらの開示をここに引用 によって加える、に従来記載されている。２２．　ＨＥｃｏｌｉ　Ｄ３１ｍ４の 成長および精製したＲｅ−ＬＰＳの調製は、クレシ（Ｑｕｒｅｓｈｉ）ら、開示 をここに引用によって加える、に記載されている。”　ＭＰＬはＤ３１ｍ４およ びＲｅ−ＬＰＳから、クレシ（Ｑｕｒｅｓｈｉ）ら、開示をここに引用によって 加える、に従い調製する。″　この産生物はヘキサアシルおよび少量のペンタア シルＭＰＬの混合物を含有した。

Ｓ、ｍ１ｎｎｅｓｏｔａ　Ｒ３４５、Ｓ、ｍ１ｎｎｅｓｏｔａ　Ｒ６０、ネズミ チフス菌（Ｓ、ｔｙｐｈｊｍｕｒｉｕｍ）ＳＦ１５１２およびロドシュードモナ ス・スユフェロイデス（Ｒ，５ｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ１７０２３から の粗いケモタイプのリポ多糖は、ガラノス（Ｇａｌａｎｏｓ）らの方法により変 更を加えて調製する。２６．０この系列の構造は最小（Ｒｅ−ＬＰＳ）から最大 （ＳＲ−ＬＰＳ）の構造を第１０図に示す。ロドシュードモナス・スユフェロイ デス（Ｒ，５ｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）のＬＰＳの構造を第１１図に示す。

Ｅ、ｃｏｌｊ　０９および０５８をＬＢブロスの中で成長させ、そして滑らかな ケモタイプのリポ多糖類をウエストファル（Ｗｅｓｔｐｈａｌ）およびジャン（ Ｊａｎｎ）熱フェノール−水抽出法により調製する。

２８　収率は、−それぞれ、Ｅ、ｃｏｌｉ　０９および０５８からのＬＰＳにつ いて８．０および１４．９％（乾燥重量）である。Ｅ、ｃｏｌｉ０５８のＬＰＳ の〇−抗原領域の構造は、次の通りであると決定される： 式中Ｒｈ、ａＬＡは３−〇−（Ｒ−１’　−カルボキシエチル）−Ｌ−ラムノー ス（マムノラクチル酸）である。

０９のＬＰＳ　（１００，７ｍｇ）を２．０ｍｌの０．　６％のデオキシコール 酸を含有する０、２モルのトリスＨＣＩ、ｐＨ７，８中に溶解し、そして２．８ ｘ５４ｃｍのパイオーゲル（Ｂ　ｊ　ｏ−Ｇｅ　Ｉ）　Ｐ−１００カラム（バイ オ−ラド（Ｂ　１ｏ−Ｒａｄ）　、カリフォルニア州すッチモンド）で３７℃に おいて同一緩衝液を使用して分画する。この手順はブカジロビチ（Ｖｕｋ　ｊ　 ｌ　ｏｖ　ｉ　ａｈ）ら、開示をここに引用によって加える、の手順に類似する 。２９２ｍ１の分画を集め、モしてＫＤＯおよびマンノースの両者についてアッ セイする。これらの分析に基づいて、分画２７−３５　（１）　、３６−４３　 （Ｉ　Ｉ）および４４−５１　（Ｉ　Ｉ　Ｉ）をプールし、そして流れる水に対 する広範に透析する。これらの試料を最終的にバイオ−ゲルＰ−４カラムで脱塩 して、４３．５ｍｇの■、２７．２ｍｇのＩＩおよび６．６ｍｇのＩ　１．　Ｉ を得た。これらの３つの試料をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ ルの電気泳動により分析する。この電気泳動により、分画Ｉは主として滑らかな ケモタイブのＬＰＳを含有し、ＩＩは滑らかなおよび粗いケモタイブのＬＰＳの 混合物を含有し、そしてｆＩＩは粗いケモタイプのＬＰＳを含有することを示し た。これらの結果はマンノ−又と、■について９．２：１．０；ＩＩについて５ ．３：１．０：およびＩＩＩについて２．９：１．０である、合計のリンのモル 比に対して一致する。０９のＬＰＳの外側のコアのヘキソース領域Ｅ、ｃｏｌｉ Ｒ１型を有するように思われるが、内側のコアはサルモネラ属（Ｓａ　１ｍｏｎ ｅ　ｌ　１　ａ）およびＥ、’　ｃ　ｏ　１１と同一である。０９のＬＰＳの〇 −抗原領域の構造は、次の通りであると決定される： ［−３）−３１ａｎ−ａ（１−３）−Ｍａｎ−σ（１→２）−Ｍａｎ　ａ（１− ２）−１１ａｎ　σ（１−２）−Ｍａｎ−ｔ（１−コ１２−P４ 脂質入の前駆体および誘導体（ＭＰＬを包含する）は、クニ・タカヤマ博士（Ｖ Ａ病院、ウィスコンシン州マディソン）から入手する。ＭＰＬおよびＭＰＬ−Ｔ ＤＭの調製物はリビ・イムノケム・リサーチ・インコーホレーテッド（Ｒｉｂｉ 　ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ、　、モンタナ州ハミルト ン）から購入する。非イオン性ブロックコポリマーの界面活性剤Ｌ１４１はＣｙ ｔＲｘコーポレーション（ジョーシア州アトランタ）から入手する。それは分子 量４６００ダルトンのポリオキンプロピレン（ＰＯＰ）の中央のポリマーおよび 合計の分子量５００ダルトンの各末端におけるポリオキシエチレン（ＰＯＥ）の 親水性鎖から成る。

免疫応答の刺１１ｔ： 前述の添加剤の単独または組み合わせを凍結乾燥し、そして２％のスクアラン（ ヘキサメチルテトラコサン）を含有する水中油乳濁液の中に混入する。最終の１ 度は５０μｇＴＮＰ−ＨＥＡ、１００μｇのＬＰＳ、５０ｕｇのＭＰＬお７よび ＭＰＬ−ＴＤＭ、および１ｍｇの：＋ポリ？＝Ｌ１４１／マウスを生じた。動物 に試験する特定の群に従い前述の投与量の抗原およびアジュバントを含有する皮 下注射（４０〜５０μｍ）を後足を経て与える。マウスはへパリ添加したネイテ ルソン（Ｎａｔｅｌｓｏｎ）毛管を使用して眼窩後の叢を経て研究過程を通して 種々の時点において採血し、そして血漿を一７０℃において貯蔵する。

抗体検出手順： 各調製物により誘発された免疫応答の評価は、酵素結合免疫収着アッセイ（ＥＬ 　Ｉ　ＳＡ）を使用して実施する。抗原はビクリルスルホン酸とＢＳＡ分画■と の反応により調製する。マイクロタイタープレートを１００μｍ／ウェルのＴＮ Ｐ−ＢＳＡ　（２５ＴＮＰ単位１モルのＢＳＡ）で０，５μｇ／ｍｌのＰＥＳ、 ｐＨ８゜４で４℃において一夜処理する。

抗原溶液をＰＢＳ、　ｐＨ７，４中の１％のＢＳＡで置換し、そしてプレートを 室温において１時間インキュベーションして、抗体の非特異的結合に利用可能な 残留する部位をブロッキングする。プレートを４ｘＰＢＳＳＤＨ７，４中の領　 ０５％のポロフサマー１８８で洗浄する。次に、１００μｌのＰＢＳ、ｐＨ７， ４中の０．１％のＢＳＡおよび０１％のポロフサマ−１８８を使用する試験血清 の系統的希釈物を添加し、そして軌道貫盪器（２０Ｏｒｐｍ）で室温において１ 時間インキュベーションする。次いでプレートを３×洗浄し、そして３７℃にお いてマウスのＩｇＧまたは特定のＩｇＧサブクラスに対して向けられた親和性精 製したセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗体と９０分間インキュベーシ ョンする。ＩｇＧ３について１　：　１００希釈を使用した以外、すべてについ て接合体の１　：　２０００希釈物を使用する。この工程後、プレートを３×洗 浄し、そして発色をクエン酸塩／ホスフェート緩衝液、ｐＨ５，０中のオルトフ ェニレンジアミン（ＯＰＤ）ＨＣＩ、０．４ｍｇ／ｍｌて達成する。この反応を ＯＰＤの添加後１５分に２．５Ｎ硫酸（Ｈ２ＳＯ４）　で停止させ、＋ＬｒＢＩ ＯＲＡＤ３５５０型マイクロプレートのリーダーで４９０ｎｍにおいて読む。力 価は１．０の吸収を生成するために要求される抗血清の希釈として定義される。

相乗性は次の式を使用して計算する：　ＬＰＳの力価＋Ｌ１４１／ＬＰＳまたは Ｌｉ２の力価 結果： 雌の異系交配したＩＣＲマウスの愚を後足において、１ｍｇのコポリマーＬ１４ １＋１１００ｕの第１６図に示すような１系列の脂質Ａ誘導体の１つを含有する ２％の水中スクアラン中の５０μｇのＴＮＰ−ＨＥＡで免疫化する。最小の誘導 体脂質Ｘは測定したすべての時点において免疫応答を抑制した。他の誘導体の各 々は、免疫化後１０日により高い力価で加速された応答を生成したが、次いで第 ３０日および第６０日に適度に抑制された応答を生成した。

コアのＬＰＳの大きさが異なる突然変異の有機体からのＬＰＳＥＩＩ製物を使用 して、同様な実験を実施する、第１７図。これらのＬＰＳ：ｌ！導体は、注射後 １０日に抗体の応答を増加した。最小の調製物Ｒｅ−ＬＰＳは箪６０日に抑制さ れた応答を生じた。他の誘導体は適度の増強を生成した。最後に、変化する量の 〇−多糖を含有するＬＰＳの分画のアジュバント効果をコポリマーＬ１４１と組 み合わせて評価する、第１８図。

これらの調製物の各々は急速に増加する免疫応答を生成し、この免疫応答は測定 の全体の期間を通じて持続する。　−ＬＰＳの分画および誘導体の各々を単独で およびコポリマーＬ１４１と組み合わせてを使用する、いくつかの観測を表１に 要約する。

表Ｉ Ｓ＝滑らか：Ｒ−粗い 力価はこの表について正規化して、実験の間の結果の比較を促進する。

相乗性の比を計算して、因子のいずれかをアジュバント単独として使用するとき 期待されるＩｇＧ抗体の応答を越えてそれを増加する、ＬＰＳ調製物および誘導 体の相対的能力を評価する。ＬＰＳを含有する免疫原の毒性は生存により判定し て顕著に変化する。１００％より小さい生存の調製物は、一般に乱れた毛および 内毒素誘発の困難の他の徴候を生成した。しかしながら、調製物のいくつかは死 亡を生成せず、そして毒性の臨床的徴候をほとんど生成しなかった。これらはモ ノホスホリル脂質Ａ、脂質Ａ、脂質Ａ誘導体、脂質Ｘ１脂質ＩＸＡ、無毒化Ｒａ およびロドシュードモナス・スユフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎ ａｓ　５ｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）のＬＰＳを包含した。コポリ７−Ｌ１４１また はＬＰＳ調製物の単独により生成されるものを越えて抗体の応答を増加するこれ らの調製物の能力は、使用したＬＰＳ調製物の間で顕著に変化した。調製物のい くつかは免疫応答を抑制し、そして他のものはほとんど効果をもたなかった。し かしながら、抗体の力価を事実増加したものは、観測の３力月の期間にわたって 持続する増加を生成した。

とくに有望な調製物は無毒化Ｒａ−ＬＰＳであり、これはそれ自体弱いアジュバ ントであるが、コポリマーＬ１４１と組み合って力価を顕著に増加した。（第１ ３図）。

抗体のアイソタイプ゛ 抗体のアイソタイプをいくつかの内毒素誘導体および活性が減少した分画につい て決定する。（第１３図および第１４図）。期待するようにコポリマーＬ１４１ それ自体は主要なＩｇＧ１アイソタイプの抗体の応答を生成し、ＩｇＧ２ａおよ び２ｂの量はより少なく、モしてＩｇＧ３は微量である。アジュバントを含まな い抗原の注射は検出可能な抗体を産生しなかった。ＬＰＳ誘導体はＩｇＧ１抗体 の産生に変動する効果を有した。正味の結果は主要なＩ　ｇＧ２の応答の生成で ある。抗体の力価の増大を生成しなかった調製物を使用するときでさえ、ＩｇＧ １から１、ｇＧ２ａおよびｂに向かうアイソタイプのシフ上が存在する。

実施例１８ 動物・ ６週齢の雌の異系交配したＩＣＲ白マウマウスャールス・リバー・ブリーディン グ・ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ノースカロライナ州うレイ）から入手し、そして免疫化 前に動物の設備に１週間順応させる。食物および水は任意に与える。

コポリマーおよび他の試薬： 合成ブロックコポリマーＬ１２１、Ｌ１４１およびＬｉ２Ｏ，５をＣｙｔＲｘコ ーポレーション（ジョーシア州ノークロス）から入手し、そしてムラミルジペプ チド（ＭＤＰ）のスレオニル誘導体をシンテックス・コーポレーション（Ｓｙｎ ｔｅｘ　Ｃｏｒｐ、）（カリフォルニア州バロアルト）から入手し、そしてロド シュードモナス・スユフエロイデス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　５ｐ ｈａｅｒｏｉｄｅｓ）のＬＰＳをクニ・タカヤマ博士（ＶＡ病院、ウィスコンシ ン州マディソン）から入手する。

マラリアのペプチドおよびペプチドの接合；ペプチド（ＮＡＧＧ）５をエモリイ 大学のマイクロケミストリー・ファシリティ（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　 Ｆａｃｉｌｉｔｙ　ｏｆＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）（ジョーシア州アトランタ）で ４３０Ａ型ペプチド合成装置（アプライ、ド・バイオシステムス・インコーホレ ーテッド（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ、）を使用して合成し 、そして純度をアミノ酸分析およびＨＰＬＣにより評価する。（ＮＡＧＧ）ｓは 三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｃｙｎｏｍ。

Ｉｇｉ）ＮＩＨ菌株のスポロゾイトのサーカムスポロゾイトタンパク質からの縦 列反復である。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはニワトリ卵アルブミン（Ｈ ＥＡ）（シグマ・ケミカル・カンパニー（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、 ）、ミゾリー州セントルイス）へのペプチド（Ｐ）の接合は、ロウボン（Ｒｏｕ ｇｏｎ）ら、１９８４の１工程のグルタルアルデヒドのカップリング法の変更を 使用して実施する。簡単に述べると、０．８ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ８，７中に溶解 した４、Ｘ１０−’モルのペプチドを１．２ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ８，７中の１． ５Ｘ１０−’モルのＢ　Ｓ　ＡまたはＨＥＡと混合する。この混合物に、２ｍｌ のグルタルアルデヒド（シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓ　ｉ　ｇｍａ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）、ミゾリー州セントルイス）の０．０２モルの溶液を室 温において１５分かけて０．０５ｍ１のアリコートで添加の間に渦撹拌しながら 添加する。この混合物を室温において軌道農産器（１５０ｒｐｍ）で−夜回転す る。この混合物をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラムに通過さ せ、ＰＢＳ、ｐ）（７，３を使用して、結合しないグルタルアルデヒドおよびペ プチドを除去する。Ｐ−ＢＳＡまたはＰ−ＨＥＡをボイド体積の中に婁め、そし て−２０℃において貯蔵する。

抗体の力価についてのＥＬＩ　ＳＡアッセイおよびアイソタイプの定量：ペプチ ドに対して向けられた抗体の力価は、サラダニス（Ｓａｕｄｅｒｓ）の方法の変 更を使用して得る。３０９６ウエルのマイクロタイタープレート（フロー・ラボ ラトリーズ（Ｆｌｏｗ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＬバージニア州マクリーン） を、ＰＢＳ、ｐ）Ｉ’ｉ’、３中のニワトリ卵アルブミンに接合したペプチド（ Ｐ−ＨＥＡ）の０．００２ｍｇ／ｍｌの溶液の０．１ｍｌ／ウェルで４℃におい て一夜コーティングする。すべてのそれ以上のインキュベーションは室温におい て実施する。

抗原をコーティングしたウェルをＰＢＳＳｐＨ７，３中の１％のヒトアルブミン （シグマ・ケミカル−カンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）、 ミゾリー州セントルイス）の溶液のＯ，１ｍｌで１時間ブロッキングする。ＰＢ Ｓ、ｐＨ７，３および０．０５％の界面活性剤ＰＬＵＲＯＮＩＣ”Ｆ６ｇ　（ポ ロキサマー１８８）で洗浄後、免疫化したマウスからの血漿の系統的３倍希釈物 の０．１ｍ、ｌを溶離に二重反復実験において添加する。免疫化しないマウスか らのマウス血漿の３倍希釈物およびペプチド（ＮＡＧＧ）ｓに対して向けられた モノクローナル抗体を、それぞれ、ＥＬＩＳＡの陰性および陽性の対照として二 重反復実験においてまた添加する。プレートを軌道農産器で２００ｒｐｍで１時 間インキュベーションする。洗浄後、０１ｍ１のベルオキシダーセ接合ヤキ抗マ ウスＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂの１：２０００希釈物また は抗１ｇＧ３（フィッシャー・バイオチク（Ｆｉｓｈｅｒ　Ｂｉｏｔｅｃ）、＝ ニーヨーク州オレンジバーグ）の１：１０００希釈物を各ウェルに添加し、そし て２０Ｏｒｐｍにおいて１゜５時間インキュベーションする。再び洗浄後、クエ ン酸塩緩衝液、ｐＨ５０中の０．１ｍｌの２．５ｍｇ／ｍｌのオルトフェニレン ジアミン（ジグ７−ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ ｏ、）、ミゾリー州セントルイス）および０．０３％の過酸化水素（ジグ７−ケ ミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）、ミゾリー州で ントルイス）を各ウェルに添加し、１５分間インキュベーションし、そして色の 反応を２．５モルの硫酸で停止させる。４９０ｎｍにおける吸収をバイオラドマ イクロプレートのリーダーで決定し、そして力価を回帰分析により、ｌの吸収値 を生ずる希釈物を使用して決定する。アイソタイプの定量は、ＥＬＩ　ＳＡの力 価を標準曲線を参照してナノグラム／ｍｌの各サブクラスの血漿に変換すること によって実施する。ＰＢＳ、ｐＨ７，３中で希釈した１０μｇ／ｍｌのポリクロ ーナルヤギ抗方法１ｇＧ（フィッシャー・バイオチク（Ｆｉｓｈｅｒ　Ｂｉ。

ｔｅｃ）、ニューヨーク州オレンジバーグ）を使用して９６ウエルのマイクロタ イタープレートのウェルをコーティングする。弱い、プＯ−７キングおよびイン キュベーション時間は上のＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイにおけるものと同一である。

各アイソタイプのマウス骨髄腫タンパク質の希釈物（シグマ・ケミカル・カンパ ニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ００）、ミゾリー州セントルイス）を 標準として使用する。ヤギ抗マウスアイソタイプ特異的セイヨウワサビペルオキ シダーゼ接合体（フィッノヤー・バイオチク（Ｆｉｓｈｅｒ　Ｂｉｏｔｅｃ）、 ＝ニー：ｌ−り州オレンジバーグ）を使用して１１９〜ｎｇ〜０．０３ｎｇの濃 度における標準の吸収を決定する。１の吸収値を生ずる、アイソタイプ特異的標 準の濃度を吸収（４９０ｎｍ）／濃度の標準曲線から、回帰分析によりにより決 定する。吸収１におけるペプチド特異的アイソタイプの濃度に、吸収１における ＥＬＩ　ＳＡの力価を掛けて、濃度ｎｇ／ｍｌを得る。

鞭毛の調製ニ チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉＬ菌株ＴＹ２（２９型）をアメリ カン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅ　ｒ　ｉ　ｃａｎ　Ｔｙｐｅ 　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）から入手する。凍結したストックの 培養物をトリブチツク・ソイ・アガー（Ｔｒｙｐｔｉｃ　Ｓｏｙ　Ａｇａｒ）プ レート（ディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ） 、ミシガン州デトロイト）上で成長させ、そして０．３％のトリブチツク・ソイ ・モーティリティ・アガー（Ｔｒｙｐｔｉｃ　Ｓｏｙ　Ｍｏｔｉｌｉｔｙ　Ａｇ ａｒ）を通して４〜５回継代培養する。高度に移動性のバクテリアは、はとんど の鞭毛を産生ずるので、選択する。有機体をトリブチイック・ソイ・ブロスの中 に接種し、そして３７℃において６時間インキュベーションする。

バクテリアのブロス懸濁液のアリコートをムエラーヒントン（Ｍｕｅｌｌｅｒ　 Ｈｉｎｔｏｎ）寒天プレート（カールースカルボロウ（Ｃａｒｒ　Ｓｃａｒｌｂ ｏｒｏｕｇｈ）上に接種し、３７℃において１６時間インキュベーションする。

細胞を０．　１％のチメロサル（シグマ・ケミカル・カンバー１−−（Ｓｉｇｍ ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）、ミゾリー州セントルイス）を含有するＰＢＳ でプレートから収穫する。鞭毛を細胞から機械的農産器（レッド・デビル・バイ ンド・ノエイ力−（Ｒｅｄ　Ｄｅｖｉｌ　Ｐａ１ｎｔ　５ｈａｋｅｒ）中で２０ 分間激しく貫通することによって除去し、そして次のようにして示差的遠心によ り細胞本体から分離する。細胞本体をソーパル（Ｓｏｒｖａ　Ｉ　Ｉ）ＲＣ−５ Ｂ冷却ス一パースピード遠心機（デュポン・インスツルメンツ（ＤｕＰ。

ｎｔ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）でＧ　Ｓ　Ａ、Ｏ−ターを使用して６０００Ｘ ９で３０分間遠心し、１６．０ＯＯＸ９で１０分間遠心して、破壊した細胞およ び他の小さい破片を沈澱させる。次いで鞭毛をベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）Ｌ ８−７０Ｍ超遠心装置で５Ｗ２７スイングパケツトローターを使用して沈澱させ 、そしてチメロサルーＰＢＳの中に再懸濁させ、再沈澱させ、そしてチメロサル ーＰＢＳの中に再懸濁させる。タンパク質濃度はロウリイ（Ｌｏｗｒｙ）のタン パク質決定により決定する。

”　５．２ｍｇ／ｍｌの鞭毛のアリコートを一７０℃において凍結させる。

鞭毛の接合： サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の鞭毛へのペプチドの接合（Ｐ−鞭毛） は、リアング（Ｌｉａｎｇ）らの２工程のグルタルアルデヒドのカップリング手 順の適応により実施する。３２１．２ｍｇのＰＢＳ、ｐｔ−ｒｓ、７中に溶解し たペプチド（１，５Ｘ１０〜７モル）を等しい体積の００２モルのグルタルアル デヒドで処理し、ここでグルタルアルデヒドは０．０５ｍ１のアリコートで添加 の間に渦撹拌しながら添加し、そして軌道農産器（１５０ｒｐｍ）で室温におい て一夜回転する。

４℃においてＰＢＳに対する一夜透析して未反応のグルタルアルデヒドを除去し た後、０．８ｍｇのＰＢＳ、、ｐＨ８，７中の４Ｘ１０−’、２×１０−６また はｌＸｌ０−’モルのペプチド、それぞれ、２６：１．１３１および６５：１の ペプチド／鞭毛のモル比を表す、を透析した鞭毛に添加する。この混合物を室温 において一夜回転する。結合しないペプチドを鞭毛からベックマン（Ｂｅｃｋｍ ａｎ）Ｌ８−７０Ｍ超遠心装置で５Ｗ２７スイングパケツトローターを使用して 分離する。この鞭毛の沈澱をＰＢＳ、ｐＨ７，３の中に再懸濁させ、再遠心し、 ＰＢＳの中に再懸濁させ、次いで０．０２モルのリジン（シグマ・ケミカル・カ ンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）、ミゾリー州セントルイス ）を添加する。これを４℃において一夜反応させ、次いで再遠心し、そして２ｍ ｇのＰＢＳの中に再懸濁させる。

乳濁液および免疫化のモード： ５〜８匹のマウスの群を０．　２％のツイーン−８０（シグマ・ケミカル・カン パニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）、ミゾリー州マントルイス） を含む２％のスクアラン（シグマ・ケミカル・カンバ＝−（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ ｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）、ミゾリー州セントルイス）およびＰＢＳ、ｐＨ７，２の 混合物を含有する水中油乳濁液で免疫化した。存在するとき、コポリマーのアジ ュバントＬ１２１は１ｍｇ１０．０４ｍ１の濃度であり、ロドシュードモナス・ スユフエロイデス（Ｒ，５ｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）のＬＰＳはＯ，１ｍｇ１０． ０４ｍ１であり、そして凍結乾燥したペプチド油乳濁液ＰＢＳはＯ，１ｍｇ１０ ゜０４ｍ１であるか、あるいはＰ−鞭毛は領０５ｍｇ１０．０５ｍ１である。す べての乳濁液は、Ｐ−ＰＢＳが０．００５ｍ１で存在する場合を除外して、同一 濃度で存在する。凍結乾燥した抗原を２ｍ、ｌのガラス均質化装置でモーターで 動く乳棒を使用してスクアランおよびコポリマーと２分間混合する。水性相およ び追加のアジュバントを油相に添加し、１つを除外するすべての実験においてさ らに２分間乳化し、１つの実験において、Ｐ−ＰＢＳまたはＰ−鞭毛を凍結乾燥 せず、ＰＢＳ中で水性相に添加する。０．１．ｍｇのＰ−ＰＢＳを含有する０、 ０４ｍ１の乳濁液を単一の後足に注射するか、あるいは０．０２５ｍ１のＰ−Ｐ ＢＳまたはＰ−鞭毛（０，０５ｍｇ／ｍｌ）を各後足に注射する。免疫化のルー トを比較する実験において、０．１ｍｇのＰＢＳをＬ１２１またはＬ１４１を含 むか、あるいは含まないＯ，Ｑ４ｍｌの水中スクアラン中の０．１ｍｇのＰ−Ｐ ＢＳ、あるいは乳濁液ＩＰまたはＳＣ中の０゜１ｍｇのＰ−ＰＢＳを単一の後足 （ＦＰ）に注射する。すべてのマウスに同一量の同一の配合物、水中油乳濁液中 の抗原およびＬ１２１、またはＰＢＳ中の抗原で第２９日に第２回目の免疫化を 行う。単一の実験において、マウスの３つの群にＬ１２１を含有する水中油乳濁 液中のＰ−ＰＢＳで第３回目の免疫化を行う。マウスのほとんどの群を眼窩後の 叢からヘパリン添加した管の中に免疫化後第０１１０．２８および３６日に採血 する。実験の時間経過において、血漿を免疫化後第１０．２８．６０．９０．９ ７．１１１．１４１．１７１．２０１．２０７および２１４日に集める。各マウ スからの血漿をＥＬＩＳＡにより個々にアッセイし、そして平均および標準偏差 を各群について決定する。

実施例１９ ８マウス／群をＯ，１ｍｇ／マウスでコポリマーおよび／またはロドシュードモ ナス・スユフエロイデス（Ｒ，５ｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）のＬＰＳを含むか、あ るいは含まない、水中２％のスクアラン中で乳化されたＯ、１ｍｇのペプチドま たはペプチド゛ＰＢＳで免疫化する。すべてのマウスを第１月に第２回目に免疫 化し、そして１週後に血漿を集める。ペプチド特異的の合計のＩｇＧおよびＩｇ Ｇアイソタイプについて−のアッセイを前述したように実施する。合計のＴｇＧ 抗体の力価を各の平均±ＳＥＭとして示す。結果を表２に要約する。

マラリアのペプチド単独は、１００％のＩｇＧ１である、わずかに検出可能な応 答を生成した。ＢＳＡに接合したペプチドはほとんど２１゜ｇ高いＩｇＧの応答 を生成し、それらのすべてはＩｇＧ１であり、ＩｇＧ２ｂは１％である。ペプチ ド−ＢＳＡへのＬＰＳの添加は合計のＩｇＧを３．４倍増加し、それらの大部分 はＩｇＧ１であり、ＩｇＧ２ｂは２．５％であり、そしてＩｇＧ２ａおよびＩｇ Ｇ３はわずかに検出可能なレベルである。ペプチド−ＢＳＡへのいずれかのコポ リマーの添加は合計のＩｇＧの７倍の増加および有意の量のＩｇＧ２ｂおよびＩ ｇＧ２ａを生成した。Ｌ１２１では、少量のＩｇＧ３はまた存在する。

ＬＰＳをＬ１２１およびペプチド−ＢＳＡとともに添加するとき、ｒｇＧ２ｂの 比率はほぼ２倍でありそしてＩｇＧ２ａは合計のＩｇＧの８％に増加するが、合 計のＩｇＧの力価はＬＰＳを含まない場合よりわずかに少ない。Ｌ１４１および ＬＰＳは、合計の力価のほぼ３倍の増加を生成することおよびサブクラスの分布 に影響を与えるという両者の面において、相乗性を示した。ＩｇＧ２ｂの比率は Ｌ１４１単独を使用するときより８倍以上増加しい合計のＩｇＧの３９％以上に 上昇した。有意な量のＩｇＧ２ａが存在し、そしてこのアジュバントの組み合わ せは２゜８％の１ｇＧ３の比率を生成した。

実施例２０ ＩｇＧアイソタイプの分布へのハプテンの密度の効果Ｌ１２１を有する乾燥調製 物を使用して、ペプチド／フラグリンの異なるモル比の効果を検査する。マウス の群を両方の後足の中に分布した２６．１．１３：１および６．５：１のモル比 で０．０５ｍｇのペプチド−鞭毛を含有する乳濁液で免疫化する。マウスを第１ 月に生理的塩類溶液中に溶解した同一ハブテン密度のペプチド−鞭毛で促進する 。血漿を１週後集め、そしてペプチド特異的１ｇＧアイソタイプの濃度について アッセイする。

ペプチド／鞭毛のモル比の変化は、ＩｇＧ抗体の応答の強度およびアイソタイプ の分布の両者に影響を及ぼした（第１９図）。モル比の増加は５６二〜２６１の 間で合計のＩｇＧの濃度を６倍増加し、そしてアイソタイプのパターンを有意に 変化させた。２６．１のペプチド比をもつ鞭毛は１１％のＩｇＧ１．４３％のＩ ｇＧ２ａ、１７％のＩ　ｇＧ２ｂおよび２９％の１ｇＧ３を誘発した。ペプチド 比を１３：１に減少すると、はとんどもっばら１ｇＧ３に影響を与え、その比率 を４％に減少した。この比を６．５：１に低下させると、ＩｇＧ１および１ｇＧ ３は排除され、そしてＩｇＧ２ａの濃度を減少させた。

実施例２１ 動物：チャールス・リバー・ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ、Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からの７〜ｌｏ週齢の雌のＩＣＲ（異系交配した）マ ウスを試験動物として使用する。すべてのコポリマーはＣｙｔＲｘコーポレーシ ョン、ジョーシア州アトランタから入手する。ＴＮＰ−ＨＥＡ　（ジグ７−ケミ カル・カンバー−−（Ｓ　ｉ　ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）、ミゾリー 州セントルイス）は、メソッズ・イン・イムノロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　＋ｎ　 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）に記載される手順に従い調製する。３３乳濁液の調製： 乳濁液は１ｍｌの最終体積および０．０４ｍ１の注射体積である。示した量のＴ ＮＰ−ＨＥＡ　（凍結乾燥したＬｏ、０５ｍｇ／マウスを添加する。生理的塩類 溶液中の２％のスクアランを添加する。示した量のコポリマーを１．０ｍｇ／マ ウスの量で添加する。この混合物を均質化する。ＰＢＳ／ツイーン−８０（０， ２％）を使用して１ｍｌするために十分な量。室温においてほぼ２分間均質化す る。

注射：マウスに初期の皮下注射（０，０４ｍ１）を後足に与える。促進を第９０ 日にある場合において一一抗原＋コポリマーーーを与える。

足の測定二基線の測定を注射前に実施する。注射後、測定は炎症が止むまで特定 の時間に実施する。

血液の収集：血漿抗体検出のための血液を研究を通じて特定の時間に集める。こ れは眼窩後の叢を経てヘパリン化ナイテルソン（Ｎａｔｅｌｓｏｎ）管を使用し て実施する。試料を２５００ｒｐｍで１５分間遠心する。血清を一７０℃におい て貯蔵する。

５〜１０匹のマウスの群を、表３に示す１ｍｇのコポリマーの各々を含有する水 中２％のスクアラン中のＴＮＰ−ＨＥＡで免疫化する。抗体の応答の時間経過は 各群において同様である。力価は注射後はぼ１月でピークとなり、そして数カ月 間持続する。動物を３月後促進する。１週後再び採血する。１０％のポリオキシ エチレンおよび４６００に等しいか、あるいはそれより低いポリオキシプロピレ ンの分子量をもつコポリマーは強い免疫応答を誘発した。５２００のポリオキシ プロピレンの分子量をもつこれより大きい調製物は、ポリオキシエチレンの比率 がより小さいときにのみ、有効なアジュバントである。ポリオキシエチレンの大 きい部分をもつ調製物は効果に非常に劣る。

実施例２２ 以下の実施例は、本発明の一部分と考えられる配合物の１つを先行技術のアジュ バントと比較する。この配合物は次の一般処方を有するニジリカおよびコポリマ ーをまず組み合わせ、そしてシリカがコポリマーで完全にコーティングされるま でよく混合する。次いでスパン８ｏおよびスクアレンを添加し、そ、して磁気撹 拌機でほぼ４５分間混合する。

５０％の水および抗原を有する油中水乳濁液を水中で調製する。

この実施例において使用する他のアジュバントは、次のものを包含する：ＲＡＳ 、（Ｒｉｂｉ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。

Ｉｎｃ、）リビ・イムノヶム・リサーチ・インコーホレーテッド、モンタナ州ハ ミルトン、から、アジュバクラス（ＡＤＪＵＶＡＸ”）　、アルファーベータ・ テクノロジー・インコーホレーテッド（Ａｌｐｈａ−Ｂｅｔａ　Ｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ、Ｉｎｃ、）、マサチュセッッ州つォルセスター、およびフロイント完全 アジュバント（シグマ・ケミカル・カンパニー−Ｃ５ｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ　Ｃｏ、）、ミゾリー州セントルイス）、すべてのアジュバントは製造業者の 指示に従い調製し、そして示すように投与する。

雌のニューシーラント白ウサギ（Ｎ＝１）の群を、次のようにしてペプチドタン パク質接合体（黄体化ホルモン放出ホルモン、ＬＨＲＨ−ＢＳＡ）で免疫化した ： アジュバントの各々についての第１４．２８．４２および５６日における抗ＢＳ Ａ抗体の力価を第２０図に示す。第２０図において見ることができるように、だ い５６日に、本発明による配合物はフロイント完全アジュバントのそれの３〜４ 倍の力価を生成した。本発明による配合物の体積はフロインドアジュバントの注 射した体積の１１５のみである。

本発明による配合物はフロイント完全アジュバントより有意に毒性が低い。他の 種において、本発明による配合物を使用して見られる免疫応答はフロイント完全 アジュバントを使用して見られるものに少なくとも等しいか、あるいはそれより 大きい。

実施例２３ コポリマーＬ１８０．５は、油を使用しないでそれを有効なアジュバントとする 、驚Ｘべき物理的性質を有する。このコポリマーは室温において不溶性であるが 、冷蔵庫の温度（約４℃）において可溶性である。

より小さいアジュバント分子、例えば、Ｌｌｏｌ、Ｌ１２１およびＬ１４１と異 なり、室温において不溶性の形態は小さい粒子の安定な懸濁液である。より小さ いコポリマーのすべては不安定な懸濁液であり、大きいアモルファスの塊に凝集 する。このような調製物はワクチンのアジュバントのための劣った候補である。

以下の実施例は、コポリマー１８０゜５がそれ自体で、あるいは油を使用しない で無毒化Ｒａ−ＬＰＳと組み合わせて、アジュバントとして働く能力を実証する 。０．１ｍｌのＴＮＰｌｏ−ＨＥＡ　（２５ｍｇ／ｍｌ）を０．４ｍｌのコポリ ｖ−Ｌ１８０゜５　（１２５ｍｇ／ｍｌ）と混合する。この混合物を、コポリマ ーが溶解するまで、冷蔵庫の中に入れる。次いで、それを取り出し、そして室温 にゆっくり加温して、抗原のコポリマー粒子への結合を促進する。適当な量の無 毒化Ｒａ−ＬＰＳを添加した以外、同様な調製物を同じように調製する。６匹の マウスの群を後足において５０μｇのＴＮＰ、、−ＨＥＡ、いｍｇのコポリマー １８０．５および１０μｇのＬＰＳで免疫化する。群のいくつかを同様な注射で 第１８日に促進する。抗体の決定のために第２４および７２日に採血する。結果 を表４に要約する。

表４ このコポリマーは油を使用しないで持続性の適度に強い一次および二次の抗体の 応答を生成した。ＬＰＳの存在下に、コポリマーは動物を非常に強い二次応答に ついてブライミングする。アジュバントを使用しない抗原の同様な注射は、検出 可能な一次応答およびわずかに非常に弱い二次応答を誘発した。

実施例２４ 他の実験において、ＩｍｇのコポリマーＬ１８０．５それ自体またはそれと１０ μｇの無毒化Ｒａ−ＬＰＳを含有するアジュバント中で、あるいは１ｍｇのコポ リマーＬ１８０．５それ自体またはそれと１０μｇの無毒化Ｒａ−ＬＰＳの水中 スクアラン中で、１０’の全体の殺した血液段階のマウスマラリアの寄生生物（ プラスモデイウム・エリイイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｙｏｅｌｉｉ））で動物 を免疫化した。スクアラン、コポリマー、Ｌ　Ｐ　Ｓおよび抗原をホモジナイザ ー中で組み合わせた後、０５％のツイーン−８０の生理的塩顕溶液を添加して水 中油乳濁液を形成する。動物を第３５日に促進し、そして第７０日に１０４のヴ イルレントの血液段階のプラスモジウム有機体で促進する。対照動物およびフロ イント完全アジュバント中の抗原で免疫化した動物は漸進的マラリアの感染を発 生した。ＬＰＳを含むか、あるいは含まないＬ１８０゜５を含有す−る４つのア ジュバントのいずれの中の抗原で免疫化した動物は保護された。保護は赤血球の １０％より小さくかつ感染後１４日に入る寄生生血として定義される。

保護は寄生生物の表面上のエピトープに対するＩｇＧ２ａアイソタイプと相関関 係をもった。この研究は、油またはＬＰＳを含むか、あるいは含まないコポリマ ーを含有するアジュバントがマラリアに対する保護的免疫応答を誘発することが でき、そしてフロイント完全アジュバントより効果があることを実証する。それ らは、また、高い抗体の力価を誘発する。

実施例２５ 実験はヒト免疫不全ウィルス（Ｇｐ１２０または［Ｖ）の組み換えタンパク質を 使用して実施した。１０μｇの無毒化ＲａＬＰＳを含むか、あるいは含まない１ ｍｇのコポリマーＬ１８０．５の水中スクアランまたは油不含配合物中の２５μ ｇのＧｐ１２Ｑで、動物を免疫化したした。

スクアラン、コポリマー、ＬＰＳおよび抗原をホモジナイザー中で組み合わせた 後、０５％のツイーン−８０生理的塩類溶液を添加して水中油乳濁液を形成する 。すべての群を第２８日に１回促進する。第４２日におけるＨＩＶタンパク質に 対する力価を下表５に示す：表５ 実施例２６ ＲａＬＰＳの２つの調製物を調製した。１つはポレートで３０分間処理すること によって無毒化した。第２はボレートで７時間処理することによって無毒化した 。６匹のＩＣＲマウスの群を５０μｇのＴＮＰ、０ＨＥＡ、１ｍｇのＬ１４１， ０．５％のツイーン−８０生理的塩類溶液の中に懸濁させた５ｍｇのスクアラン の油および水の乳濁液中の５０μｇの各ＲａＬＰＳで免疫化した。スクアラン、 コポリマー、ＬＰＳおよび抗原をホモジナイザー中で組み合わせた後、０．５％ のツイーン−８０生理的塩類溶液を添加して水中油乳濁液を形成する。注射の体 積は５０μｌ／動物であった。動物を間隔を置いて採血し、ＩｇＧ抗体力価につ いてＥＬＩＳＡにより測定した。第２１図に示すように、ＬＰＳの中程度に無毒 化した調製物はより高い初期の応答を生成したが、より広範に無毒化した調製物 は、適度な初期の増加を生成したが、部分的に無毒化したＬＰＳ調製物または完 全に無毒化したＬＰＳ調製物に匹敵する、持続する産生を示した。これはＭＰＬ およびコア多糖類をもたない他のＬＰＳ調製物を使用する前の研究と強く対照的 であり、後者の調製物は初期に力価の増加を生成したが、ＬＰＳを含まない乳濁 液と比較して後期に抑制された力価をした。

実施例２７ ０．１．０．０５．０．０２５および０．０１μｇの適度にまたは広範に無毒化 したＲａＬＰＳの投与量を使用して、実施例２６に記載するものと同一の配合物 で、動物を免疫化した。動物を第２８日にＩｇＧアイソタイプの決定のために採 血した。第２２図に示すように、両者の調製物のすべての投与量はすべてのアイ ソタイプの増加を生成した。ＩｇＧ２ａの増加は適度に無毒化したＲａＬＰＳに ついて投与量依存性であった。ＩｇＧ２ｂの増加は部分的に投与量依存性であっ たが、ＩｇＧ１゜において試験した範囲内で比較的依存性独立であった。驚くべ きことには、広範に無毒化された高い投与量は部分的無毒化されたＲａＬＰＳの 最低の投与量のそれに匹敵するアイソタイプの変化のパターンを生成した。これ が実証するように、アイソタイプの変調は特定の適用のためにＬＰＳの投与量ま たは無毒化の程度によりコントロールまたは最適化することができる。

実施例２８ 固有に低い毒性を有するシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）からのＬ ＰＳのアジュバント活性を試験する実験を実施した。この低い毒性は、シュード モナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）からのＬＰＳが１０の炭素鎖の長さを有す る５つの脂肪酸のみを有すると報告されているという事実のためでであろう。Ｌ ＰＳを標準の手順により緑贋菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓ ａ）から分離した。ＬＰＳの試料を前述したようにＴＥＡで処理して無毒化した 。６匹のＩＣＲ雌のマウスの群を、第２３図に示すように、５０１１ｇのＴ　Ｎ 　Ｐ　ｌｏ　ＨＥ　Ａ　。

１ｍｇのＬ１４１．０．５％のツイーン−８０生理的塩類溶液の中に懸濁させた ５ｍｇのスクアランで、あるいはＬ１４１を含まないか、あるいはＬＰＳを含ま ない同様な乳濁液で免疫化した。スクアラン、コポリマー、ＬＰＳおよび抗原を ホモジナイザー中で組み合わせた後、０．５％のツイーン−８０生理的塩頚溶液 を添加して水中油乳濁液を形成する。

ＬＰＳはそれ自体弱いアジュバントであるが、Ｌ１４１と組み合わせるとき、こ とにＩｇＧ２ａアイソタイプおよび１ｇＧ２ｂアイソタイプについて、顕著な相 乗性を生成した。それは実施例２７における適度に無毒化したＲａＬＰＳと同様 に機能する。無毒化されたシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のＬＰ Ｓは実施例２７にお（ブる広範に無毒化されたＲａＬＰＳと同様に機能する。

実施例２９ ＬＰＳを固有に毒性が中程度であるロドシュードモナス・ゲラチノサ（Ｒ，ｇｅ 　］　ａ　ｔ　１ｎｏｓａ）から精製した。６匹のＩＣＲ雌のマウスの群を、５ ０ｍｇのＬＰＳ、５０ｕｇのＴＮＰ＋ｅＨＥＡ、１ｍｇｃＱＬ１２１、Ｌ１４１ 、Ｌｉ２Ｏ，５，０５％のツイーン−８０生理的塩類溶液の中に懸濁させた５ｍ ｇのスクアランでで免疫化した。スクアラン、コポリマー、ＬＰＳおよび抗原を ホモジナイザー中で組み合わせた後、０．５％のツイーン−８０生理的塩類溶液 を添加して水中油乳濁液を形成する。第２４図に示すように、コポリマーＬ１２ １およびＬｉ２Ｏ。

５はＬ１４１について示した応答に類似する応答を誘発する。ロドン二一ドモナ ス−ゲラチノサ（Ｒ，ｇｅｌａｔｉｎａｓａ）のＬＰＳとこれらのコポリマーの 各々との組み合わせは、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂの大きい増加を生成したが 、ＩｇＧ１の増加は小さいか、あるいはなかった。さらに、コポリマーし１８０ ．５は最も有効であった。

実施例３０ ５頭のアカゲザルの群をジフテリアトキソイドに接合した合成ペプチド（ＮＡＧ Ｇ）ｓ、コポリ７−１８０．５および無毒化されたＲａＬＰＳから成る抗スポロ ゾイトマラリアワクチンで免疫化した。スクアラン、コポリマー、ＬＰＳおよび 抗原をホモジナイザー中で組み合わせた後、領　５％のツイーン−８０生理的塩 類溶液を添加して水中油乳濁液を形成する。動物に２週の間隔で３回皮下注射し 、各注射は水中２％のスクアランの乳濁液中の１００μｇのペプチド接合体、１ ００μｇのＲａＬｐｓ、５ｍｇのコポリマー１８０．５から成っていた。すべて の動物は高いＩｇＧ抗体の力価を実証した（ＯＤはぼ３．１　：　５００の希釈 、ＥＬＩＳＡによる）。スポロゾイトの表面エピトープに対する免疫蛍光による 抗体の力価は、１０．００００の平均のＩｇＧ抗体の力価を実証した。免疫化部 位における局所的反応は免疫化後２週に検出可能ではなく、そして全身の毒性の 証拠は存在しなかった。

以上は本発明の好ましい実施態様のみに関係し、そして多数の変更または変化は 添付する請求の範囲に記載する本発明の精神および範囲を逸脱しないでなすこと ができる。

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９　例えば、Ｇａ１ａｎｏｓ、Ｃ，ｅｔ　ａｌ、　、ｒ脂質Ａの生物学的活性お よび免疫学的性質」、マイクロバイオロジー（Ｍｔｃｒｏｂｉ。

１ｏｇｙ）　、ｐ、’　２６９−２７６　（１９７７）。

”　５ｃｏｔｔ、Ｍ、Ｔ、、ｅｔ　ａｌ、　、ｒＴ、ｃｒｕｚｉｇ染マウスおよ びチャガ病患者における制限されたＩｇＧアイソタイプのプロフィル」、クリニ カル・アンド・イクスペリメンタル・イムノロジー（ＣＩ　ｉｎ、Ｅｘｐ、Ｉｍ ｍｕｎｏ　］、）　、Ｖｏ　１．５８、ｐ、３７２−３７９　（１９８４）。

”　ＴａｋｅｈａｒａＳ　ｅｔ　ａｌ、、ｒＴｒｙｐａｎｓｏｍａ　ｃｒｕｚｉ ・マウスにおける感染に対する保護における異なる抗体のクラスの役割」、イク スペリメンタル・バラントロジー（Ｅｘｐ、Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ）、Ｖｏ ｌ、５２、ｐ、１３７−１４６　（１９８１）。

１２、Ｗｅｃｈｓｌｅｒ、ｅｔ　ａｌ、　、ｒ熱不安定性１ｇＧ２ａ抗体はＣ５ ７ＢＬ／６炭酸マグネシウムにおけるＴｒｙｐａｎｓｏｍａ　ｍｕｃｕｌｉの感 染の治癒に影響を与える」、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎ ｏｌ）、Ｖｏｌ、１３７、ｐ、２９６ｇ−２９７２（１９８６）。

Ｉ３　Ｋｏｂａｙａｓ　ｉ、ｅ　ｔ　ａ　１．　、アーチーブス・オブ・ノクイ オケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、）８４、ｐ、３４２−３６２　（１９５９）。

】４　また、参照、Ｓｃｈｍｏｌｋａ、１．Ｒ，、ｒブｏ、ｙクポリマーの界面 活性剤の概観」、Ｊ、Ａｍ、Ｏｉｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’　Ｓｏｃ、、５４　： １１０−１１６　（１９７７）およびプロ・ツクおよびグラフト共重合（Ｂｌｏ ｃｋ　ａｎｄ　Ｇｒａｆｔ　Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉ（Ｈ）　、Ｖｏｌ、 ２、Ｒ，Ｊ、Ｃｅｒｅｓａ、、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ　 Ｗｉｅｌｙ　＆　５ｏｎｓ）、ニューヨーク（１９７６）。

Ｉｓ　Ｔａｋ、ａｙａｍａ、Ｋ１、ｅｔａｌ　、ｒ大腸菌におけるグルコサミン １ホスフェートの脂肪酸アシル誘導体および脂質Ａに対するそれらの関係」、ジ ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ＪＢｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、 Ｖｏｌ、２５６、ｐ、７３７９−７３８５　（１９８３）。

”　Ｒａｅｔｚ、Ｃ，Ｒ，Ｈ，、ｒ大腸菌およびネズミチフス菌における脂質Ａ の構造および生合成」、セルラー・アンド・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｅ ｌｌｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ。

１ｏｇｙ）　、Ｖｏ　ｉ、ｌ、Ｎ１ｄｈａｒｄｔ、Ｆ、Ｃ，編、Ａｍｅｒｉｃａ ｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｇｙ。

Ｉ７　Ｑｕｒｅｓｈｉ、Ｎ、ｅｔ　ａｔ、、ｒネズミチフス菌のリボ多糖類から 得られた無毒の脂質Ａの精製および構造の決定」、ジャーナル・オブ・バイオロ ジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、Ｖｏｌ、２５７、ｐ、１ １８０８−１１８０５　（１９８２）。

”　Ｌｏｕｓ、ｅｔ　ａｌ、　、５ｕｐｒａ。

”　５ａｕｎｃｉｅｒｓＳＧ、Ｃ，、ｒ選択したプロトコルを包含する固相酵素 イムノアッセイの技術」、臨床的実験室におけるイムノアッセイ（Ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｙ）、Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、ニューヨーク、ｐ、１１１−１１２ 　（１９７９）。

”　Ｒｉｅｔｃｈｓｅｌ、Ｅ　Ｓｅｔ　ａｌ、、ｒバクテリアの内毒素化学的構 造と生物学的活性との間の関係」、免疫学的アジュバントおよびワクチン（Ｉｍ ｍｕｎｏｌｏｇｙｃ　Ａｄｊｕｖａｎｔｓ　ａｎｄＶａｃｃｉｎｅｓ）、Ｖｏｌ 、１７９、Ｇｒｅｇｒｉａｄｉｓ、Ｇ、、ｅｔ　ａ、１．＆ｉ、Ｐｌｅｎｕｍ　 Ｐｒｅｓｓ、ｐ、６１−７４゜”　Ｊｕｓｔｉｎｅ　Ｓ　Ｓｅｔ　ａｌ　、メソ ツズ・イン・イムノロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＬ第 ３版、第１８章、ｐ、１５３−１５８　（１９７７）。

”　Ｔａｋ、ａｙａｍａ、に、　、ｅｔ　ａ、１．　、ｒ大腸菌におけるグルコ サミン１−ホスフェートの脂肪酸アシル誘導体および脂質Ａに対するそれらの関 係。フォスファチンルグリセロール欠乏突然変異体の中に見いだされるジアシル ＧｌｃＮ−１−Ｐの完全な構造」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス トリー（Ｊ、Ｂ　ｉｏ　１．Ｃｈｅｍ、）　、Ｖｏ　１２５８、ｐ、７３７９− ７３８５　（１９８３）。

”　Ｒａｅｔｚ、Ｃ，Ｒ，Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、　、ｒネズミチフス菌の３−デオ キシ−ＤＦ−マンノーオクチロシン酸欠乏突然変異体からの８つの脂質Ａ罰駆体 の分離および特性決定」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、Ｖｏｌ、２６０、ｐ、１６０８０−１６０８８　 （１９８５）。

”　Ｑｕｒｅｓｉ、ｅｔａｌ、、ｒ大腸菌の深い粗い突然変異体からの得られた リポ多糖の完全な構造の決定。高性能液体クロマトグラフィーによる精製および 血漿脱着質量スペクトルにより直接の分析」、ジャーナル・オブ・バイオロジカ ル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　、Ｖｏ　１．２６３、ｐ、１ １９７１−１１９７６　（１９８８）。

”　、Ｑｕｒｅｓ　ｉＳＮ、　、ｅｔ　ａｌ　、ｒネズミチフス菌から得られた 無毒の脂質、への精製および構造の決定」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル ・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　、Ｖｏｌ、２５７、ｐ、１１８ ０８−１１８１５　（１９８２）。

”　Ｇａ１ａｎｏｓＳＣ，、ｅｔ　ａｌ、　、ｒリポ多糖類の抽出の新規な方法 」、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、）、Ｖｏｌ、９、ｐ、２４５−２４９　（１９６９）。

”　Ｑｕｒｅｓｉ、Ｎ、ｅｔａｌ、、ｒネズミチフス菌から得られたリポ多糖類 の脂質Ａの主鎖の中のエステル基の位置」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル ・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　、Ｖｏｌ、２５８、ｐ、１２９ ４７−１２９５１　（１９８３）。

”　Ｗｅｓｔｐｈａ、ｌ、ｅｔ　ａｌ、　、ｒ７ｚ／　−ル　＊’Ｆ：使用スル 抽出およびこの手順の他の応用」、メソソズ・カーポハイドレート・ケミストリ ー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｈｅｍ、）、＼’ｏ１．５ 、ｐ、８３−９１　（１９６５）。

”　Ｖｙｋａｊｌｏｏｖｉｃｈ、ｅｔ　ａｌ、　、ｒ減少したサブユニットの異 種性をもつ分子集合体へのリポ多糖類の転化　「内毒素非応答性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ Ｎ細胞」におけるＬＰＳ応答性の実証」、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ 、Ｉｍｍｕｎｏｌ）　、Ｖｏｌ、１３０、ｐ、２８０４−２８０８．（１９８３ ）。

”　５ａｙｄｅｒｓ、５ｕｐｒａ。

”　Ｌｏｗｒｙ、Ｏ，Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、　、ｒ７オリ：／７エ／　−ル試藁を 使用するタンパク質の測定」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ ー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、Ｖｏｌ、１９３、ｐ、２６５−２７５　（１ ９５１，）。

”　Ｌｉａｇ　ｅｔ　ａｌ、、ｒコレラ毒素−セダイウィルス接合体の経口的投 与はセダイウイルスに対する腸および呼吸器の免疫性を強化する」、ジャーナル ・オブ・イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ）　、Ｖ。

１．１４．１、Ｎ００５、ｐ、１４９５−１５０１　（１９８８）。

３３　Ｊｕｓｔｉｎｅ　Ｓ　ＳＧ、ｅｔ　ａｌ、、５ｕｐｒａ。

免疫化後の日数 投与量争９） Ｆｉｇ、　２ Ｆｉｇ、　３ 平均の力価 Ｆｉｇ、４ 群 Ｆｉｇ、　５ 正規化した力価 Ｆｉｇ、　６ ＭＷＰＯＰ（疎水性物質） Ｆｉｇ、　７ Ｌ１８０．５　Ｌ１４１　Ｌ１２１　ＬｌｏｌＦｉｇ、　８ Ｆｉｇ１４ Ｆｉｇ、　１６ 時間（日） Ｆｉｇ、　１７ 時間（日） Ｆｉｇ、　１８ 鞭毛に接合したペプチドのモル比 Ｆｉｇ、　１９ 時間（日） Ｆｉｇ、　２０ 口数 Ｆｉｇ、　２１ 自然および無毒化シュードモナス属 ＬＰＳおよびＬ１４１ ＋Ｌ１４１　ＬＰＳ　ＬＰＳ ＋Ｌ１４１ 群 ＦＩＧ、　２３ ＦＩＧ、　２４ 要　約　書 本発明は、抗原と混合し、そしてヒトまたは動物（二投与したとき、抗原を単独 で投与するときより、抗原に対してより強Ｌ）免疫応答を誘発するアジュバント からなる。多くの場合にお（１て、本発明として記載するアジュバントは抗原に 対して特異的である特定のアイ゛ツタイブの抗体の全体の力価を増加する。例え ば、マウスにおしＸで、本発明のアジュノくントを普通の抗原と混合するとき、 マウスにおＬＸて誘発されたアイ゛ツタイブは主としてＩｇＧアイソタイプから より保護的な１ｇＧ２アイソタイプに変化しそして、ある場合において、ＩｇＧ ３アイ゛ツタイブ１こ変イヒする。こうして、本発明を実施することによって、 普通のワクチンの全体の保護的効果を改良することができる。

国際調査報告 ＰＣＴ／ＵＳ９１１０４７１６ １頁の続き 国先権主張　［相］１９９１年６月２１８９米国（ＵＳ）［相］７１６，８０７ 発　明　者　タカヤマ、クニ・ケイ　アメリカ合衆国ライイブ６５１７ 特長平５−５０７４９８　（３２） 「スコンシン州５３７０５マデイソン・インナードラ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の式： ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ａ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂＨ式中、疎水性物質（ Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量はほぼ４５００〜９０００であり、そして親水性物質（Ｃ ２Ｈ４Ｏ）の百分率はほぼ３〜１５重量％である、 をもつ裏面活性コポリマーからなるワクチンアジュバント。 ２、表面活性コポリマーは、次の式： ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ａ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂＨ式中、疎水性物質（ Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量はほぼ５２００であり、そして親水性物質（Ｃ２Ｈ４Ｏ） の百分率はほぼ５重量％である、を有する、請求の範囲第１項記載のワクチンア ジュバント。 ３、表面活性コポリマーは、次の式： ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ａ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂＨ式中、疎水性物質（ Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量はほぼ５２００であり、そして親水性物質（Ｃ２Ｈ４Ｏ） の百分率はほぼ１５重量％である、を有する、請求の範囲第１項記載のワクチン アジュバント。 ４、表面活性コポリマーは、次の式： ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ａ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂＨ式中、疎水性物質（ Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量はほぼ４６００であり、そして親水性物質（Ｃ２Ｈ４Ｏ） の百分率はほぼ１０重量％である、を脅する、請求の範囲第１項記載のワクチン アジュバント。 ５、無毒のリポ多糖からなるワクチンアジュバント。 ６、無毒のリポ多糖は、その分子の糖部分が完全でありそしてその分子の脂質Ａ 部分が修飾され、これによりリポ多糖が非常に毒性が低いようにされているリポ 多糖である、請求の範囲第５項記載のワクチンアジュバント。 ７、リポ多糖はロドシュードモナス（Ｐｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種か ら分離されたものである、請求の範囲第５項記載のワクチンアジュバント。 ８、ロドシュードモナス（Ｐｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種は、ロドシュ ードモナス・スユフェロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドシュード モナス・アシドフィリア（Ｒ．ａｃｄｏｐｉｌｉａ）、ロドシュードモナス・プ ラスチカ（Ｒ．ｂｌａｓｔｉｃａ）、ロドシュードモナス・ゲラチノサ（Ｒ．ｇ ｅＩａｔｉｎｏｓａ）、ロドシュードモナス・カブスラタ（Ｒ．ｃａｐｓｕｌａ ｔａ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒ．ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）および ロドシュードモナス・ビリディス（Ｒ．ｖｉｒｉｄｉｓ）から成る群より選択さ れる、請求の範囲第７項記載のワクチンアジュバント。 ９、無毒のリポ多糖は無毒化されたリポ多糖である、請求の範囲第５項記載のワ クチンアジュバント。 １０、有効量のリポ多糖および有効量の表面活性コポリマーからなり、前記表面 活性コポリマーは、次の式： ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ａ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂＨ式中、疎水性物質（ Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量はほぼ３０００〜９０００であり、そして親水性物質（Ｃ ２Ｈ４Ｏ）の百分率はほぼ３〜１５重量％である、 をもつワクチンアジュバント。 １１、リポ多糖は無毒のリポ多糖である、請求の範囲第１０項記載のワクチンア ジュバント。 １２、無毒のリポ多糖は、その分子の糖部分が完全でありそしてその分子の脂質 Ａ部分が修飾され、これによりリポ多糖が非常に毒性が低いようにされているリ ポ多糖である、請求の範囲第１１項記載のワクチンアジュバント。 １３、リポ多糖はロドシュードモナス（Ｐｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種 から分離されたものである、請求の範囲第１１項記載のワクチンアジュバント。 １４、ロドシュードモナス（Ｐｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種は、ロドシ ュードモナス・スユフェロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドシュー ドモナス・アシドフィリア（Ｒ．ａｃｄｏｐｉｌｉａ）、ロドシュードモナス・ プラスチカ（Ｒ．ｂＩａｓｔｉｃａ）、ロドシュードモナス・ゲラチノサ（Ｒ． ｇｅｌａｔｉｎｏｓａ）、ロドシュードモナス・カブスラタ（Ｒ．ｃａｐｓｕｌ ａｔａ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒ．ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）およ びロドシュードモナス・ビリディス（Ｒ．ｖｉｒｉｄｉｓ）から成る群より選択 される、請求の範囲第１３項記載のワクチンアジュバント。 １５、無毒のリポ多糖は無毒化されたリポ多糖である、請求の範囲第１１項記載 のワクチンアジュバント。 １６、表面活性コポリマーは、次の式：ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ａ （Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂＨ式中、疎水性物質（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量はほぼ５２００で あり、　そして親水性物質（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の百分率はほぼ５重量％である、を有 する、請求の範囲第１０項記載のワクチンアジュバント。 １７、表面活性コポリマーは・次の式：ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ａ （Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂＨ式中、疎水性物質（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量はほぼ５２００で あり、そして親水性物質（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の百分率はほぼ１５重量％である、を有 する、請求の範囲第１０項記載のワクチンアジュバンド。 １８、表面活性コポリマーは、次の式：ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ａ （Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂＨ式中、疎水性物質（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量はほぼ４６００で あり、そして親水性物質（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の百分率はほぼ１０重量％である、を有 する、請求の範囲第１０項記載のワクチンアジュバント。 １９、表面活性コポリマーは、次の式：ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ａ （Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂＨ式中、疎水性物質（（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量はほぼ４０００ であり、そして親水性物質（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の百分率はほぼ１０重量％である、を 有する、請求の範囲第１０項記載のワクチンアジュバント。 ２０、表面活性コポリマーは、次の式：ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ａ （Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂＨ式中、疎水性物質（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量はほぼ３２５０で あり、そして親水性物質（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の百分率はほぼ１０重量％である、を有 する、請求の範囲第１０項記載のワクチンアジュバント。 ２１、ａ、油、 ｂ、油中水乳濁液を形成するために適当な非イオン性表面活性剤、ｃ、シリカ、 ｄ、次の式： ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ａ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂＨ式中、疎水性物質（ Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量はほぼ３０００〜９０００であり、そして親水性物質（（ Ｃ２Ｈ４Ｏ）の百分率はほぼ３〜１５重量％である、 からなる表面活性コポリマー、 からなるアジュバント。 ２２、油は動物油である、請求の範囲第２１項記載のアジュバント。 ２３、動物油はスタアレンである、請求の範囲第２２項記載のアジュバント。２ ４、非イオン性表面活性剤はソルビタンモノオレエートである、請求の範囲第２ １項記載のアジュバント。 ２５、表面活性コポリマーは、次の式：ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ａ （Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂＨ式中、疎水性物質（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量はほぼ４６００で あり、そして親水性物質（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の百分率はほぼ１０重量％である、を有 する、請求の範囲第２１項記載のアジュバント。 ２６、工程： ａ、抗原をアジュバントと混合し、アジュバントは、ｉ、油、 ｉｉ、油中水乳濁液を形成するために適当な非イオン性表面活性剤、ｉｉｉ、シ リカ、 ｉｖ、次の式： ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ａ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂＨ式中、疎水性物質（ Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量はほぼ３０００〜９０００であり、そして親水性物質（Ｃ ２Ｈ４Ｏ）の百分率はほぼ３〜１５重量％である、 からなる表面活性コポリマー、 からなり、 ｂ、抗原とアジュバントとの混合物をヒトまたは動物に投与する、からなる、ヒ トまたは動物において抗原に対する免疫応答を増加する方法。 ２７、油は動物油である、請求の範囲第２６項記載の方法。 ２８、動物油はスタアレンである、請求の範囲第２７項記載の方法。 ２９、非イオン性表面活性剤はソルビタンモノオレエートである、請求の範囲第 ２６項記載の方法。 ３０、表面活性コポリマーは、次の式：ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ａ （Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂＨ式中、疎水性物質（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量はほぼ４６００で あり、そして親水性物質（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の百分率はほぼ１０重量％である、を有 する、請求の範囲第２６項記載の方法。