JPH05508013A - サンプル中の分析対象の量を測定するための内部検量を用いる測定方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 サンプル中の分析対象の量を測定するための内部検量を用いる測定方法 発明の分野 本発明は内部検量を用いてサンプル中の分析対象の量を決定するための方法、及 びこの方法において使用するためのキットに関する。

発明の背景 固体支持体上に存在する試薬へのサンプル中の被験分析対象の結合を含む定ｆ測 定は、該測定において試験されるサンプルと比較するための検量体を用いる。幾 つかの測定系、例えばラジオイムノアンセイ（１？ＩＡ）又はエンザイムラベル ドイムノソルベントアノセイ（ＥＬＩＳＡ）においては、多数のサンプルの分析 が同時に行われ、適当な検量体を含むのが普通でありそして便利である。しかし ながら、医院における測定として典型的な、１時に１サンプルの測定が行われる 場合には、各サンプルに１セントの検量体を含めることは試験の実施をより困難 且つ高価なものにする。従って、この様なサンプルの測定結果は、最もしばしば 、繰り返し使用されるあらかしめ作った１セツトの検量体を用いて得た結果と比 較される。

この様な外部検量測定は、測定パラメーター、例えばインキュベーシゴン時間、 測定温度、サンプルの液体容量、並びに試薬及び試薬の濃度、の多様性を考慮す ることができない。

測定における外部検量の使用に内在する欠点を救済するため、ＥＰ２５３、４６ ４は測定において内部検量を提供する方法を開示しており、この方法においては 、サンプル中の分析対象に対する受容体及び分析対象受容体とラベル物質との結 合体に対する受容体が固体支持体の２つの異る領域に固定化される。この固体支 持体を分析対象を含有するサンプルと接触させ、該サンプル中のすべての分析対 象を前記分析対象受容体に結合させ、この後固体支持体を、サンプル中の分析対 象と結合する前記結合体、及び該結合体に対する受容体と接触させる。

この測定において提供される内部検量は、シグナルの発生に影響を与える幾つか の可能性ある変化を考慮するが、この測定はなお添加されるサンプルの体積に関 して注意深く行われなければならず、このことはこの系が外部からの影響に対し て比較的敏感なままであることを意味する。従って、誤まって２倍量のサンプル が加えられた場合、該サンプルについて決定される分析対象の濃度は実際の濃度 の２倍となるであろう。

本発明の目的は、サンプル中の被験分析対象の濃度を決定するための内部検量に 基く測定方法を提供することであり、この方法は上記の臨界パラメーターに関す る変化を示さない。

発明の概要 本発明は、異る分析対象のための測定を実質的に同様に進行するように調整する ことができ、それらが平行的である傾向がある点において匹敵する、異る測定の ための異る検量線が得られる、という観察に基いている。このことは、２つの測 定において得られる２つの検量線間の換算係数が知られれば、一方の分析のため の検量線を用いて他方の分析対象の測定の検量のために用いることができること を意味する。

従って、本発明はサンプル中の被験分析対象の量を決定するための方法に関し、 この方法は （ａ）既知量のサンプルを、該サンプルにとって外来性でありそして測定におけ るその挙動が同一測定条件下での被験分析対象のそれに匹敵するように選択され た所定量の検量分析対象と混合し、（ｂ）段階（ａ）において調製された混合物 を、固体支持体であってその第一の分離した領域に前記被験分析対象と選択的に 結合することができる試薬が結合しておりそして第二の分離した領域に前記検量 分析対象と選択的に結合することができる試薬が結合しているものと接触せしめ 、 （ｃ）次に、前記固体支持体を、前記被験分析対象と選択的に結合することがで きるラベルされた試薬と前記検量分析対象と選択的に結合することができる同様 にラベルされた試薬との混合物と接触ヒしめ、そして （ｄ）被験分析対象に結合したラベルされた試薬のレベルと検量分析対象に結合 したラベルされた試薬のレベルとを比較することによってサンプル中の被験分析 対象の量を決定する、ことを含んで成る。

他の観点において、本発明はサンプル中の被験分析対象の量を決定するための試 験ギノトに関し、このキントは別々の容器に（ａ）注目のサンプルにとって外来 性である所定量の検量分析対象、 （ｂ）固体支持体であって、第一の分離された領域に前記被験分析対象と選択的 に結合することができる試薬が結合しておりそして第二の分離された領域に前記 検量分析対象と選択的に結合することができる試験が結合しているもの、 （ｃ）前記被験分析対象に選択的に結合することができるラベルされた試薬、及 び （ｄ）前記検量分析対象に選択することができる同様にラベルされた試薬、 を含んで成り、そして 前記ラベルされた試薬（Ｃ）及び（ｄ）は場合によっては１つの容器中の混合物 として提供される。

この文脈において、用語「被験分析対象」とは、サンプル中のその濃度が測定さ れるべき物質を示すものと意図され、該被験分析対象はそれに対して特異的な受 容体が存在する物質である。用語「検量分析対象」とは、被験分析対象の分析に 目盛を与えるために使用される物質を示すものと意図され、これもまたそれに対 して特異的な受容体が存在する物質である（被験分析対象に対する受容体とは異 る）。この発明の目的のため、「受容体」とは、分析対象の特をの構造を認識し そしてそれと結合することができる物質として定義され、従って本発明の方法の 段階（ｂ）及び（ｃ）において使用される試験はそれぞれ、被験分析対象に対す る受容体及び検量分析対象に対する受容体として定義される。

ＥＰ２５３，４６４に記載されている測定における様に検量分析対象を次の段階 において添加するのではなく、所定量の検量分析対象をサンプルと混合すること により、被験分析対象及び検量分析対象について最初から同一の測定条件が保証 される。最初の混合がより大きなサンプル容量の使用を可能にし、今度はこれが 測定系を検量分析対象とサンプルとの正しい比率に合わせることを一層容易にし 、測定の次の段階においてこの比率についてアロワンスを作る必要がなくなるで あろう。従って、本発明の方法の段階（ｂ）におけるサンプル及び検晋体の混合 物から被験体積を取り出すとき、それを正確に測定する必要がないであろう。検 量分析対象は分析されるべきサンプル中に天然に存在しないものであるから、検 量分析対象の測定において得られる応答は検量分析対象のみの添加量に由来し、 これにより誤った結果が回避される。

「匹敵する」という用語は、同様な反応条件下で生成する被験分析対象測定の検 量線と検量分析対象測定の検量線との間に計算可能な一致が存在することを意味 する。この一致は、当業者に知られているようにして、適切な試薬（例えば適切 な親和性を有する抗体）の選択、試薬類の組成の変更、及びそれらの濃度の調整 により得られる。

本発明の方法の段階（ｃ）の実施のためにラベルされた試薬の混合物を調製する 場合、これは、段階（ｃ）における相違例えばラベルされた試薬の相対量、イン キュヘーション時間及び温度の相違とは関係なく測定法における分析対象の測定 を行うようにして行われる。試薬をラベルするために使用されるラベル物質は、 それ自体として、又は他の化合物（例えば基ｖ）との反応により検出可能なシグ ナルを発生することができる物質として定義される。

内部検量を用いる既知の測定法において、検量系は、分析対象受容体結合体と結 合することができる検量受容体から成る（ＥＰ２５３．４６４）　。

より大きなサンプル体積においては、より多量の被験分析対象が分析対象受容体 に結合するであろう。しかしながら、同じ量の結合体が検量受容体に結合するで あろうから、これは分析において分析対象の増加した濃度として誤って現われる であろう。

本発明の測定法は、パラメーター、例えば反応時間、サンプル及び試薬の液体体 積、並びに温度の相違に対して敏感ではないから、測定を実施するために要求さ れる厳格さが低い。このことが本発明の測定法を医院での試験のために特に適切 なものにしている。特に、既に知られている内部検量測定とは異り、測定を検量 する本発明の方法は、正確な測定結果を得るために必須の要素である試験体積の 補正を可能にする。

発明の詳細な説明 本発明の方法は、生物由来の被験分析対象（すなわち、生物により生産されるも の）を定量するために適当である、この様な被験分析対象の例はホルモン、例え ばインシュリン、成長ホルモン、絨毛性性腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、 卵胞刺激ホルモン、ステロイドホルモン；膵臓アミラーゼ；心臓構造蛋白質：Ｃ −反応性蛋白質１α−フェトプロティン；クレアチンキナーゼタイプ’ＭＢ又は 旧；血液成分、例えばファクター■、ファクター■、ファクター■、ファクター ＸもしくはファクターＸ■のごとき血液凝固因子、又はトロンビン、プロトロン ビン、プラスミン、プラスミノーゲンモジ＜は組織プラスミノーゲン活性化因子 のごとき蛋白質分解酵素もしくはその前駆体；成長因子、例えばインシュリン様 成長因子、血小板由来成長因子、上皮成長因子、コロニー刺激因子、形質転換成 長因子又は繊維芽細胞成長因子；微生物成分、例えば細菌又はウィルスの表面蛋 白質又はトキシン、例えばコレラトキシン、ジフテリアトキシン、サルモネラ（ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）　トキシン、シガ（計１註）トキシン、クロストリジウ ム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）　トキシン、 アフラトキシン、エンドトキシン又はクラミジア（他Ｄｌ彊圏）−特異抗原（例 えば、ＬＰＳ）　；あるいは抗体（例えば、病原体に対してヒト又は動物の体内 で生成する抗体）である。

本発明の方法により定量される特に好ましい被験分析対象はクレアチンキナーゼ タイプＭＢもしくは門、膵臓アミラーゼ、心臓構造蛋白質、Ｃ−反応性蛋白質、 α−フェトプロティン、又はクラミジア−特異抗原である。

サンプルは生物由来の溶解した又は分散した物質を含有する任意の流体であるこ とができる。すなわち、サンプルは体流体、例えば血液、血清、血漿、羊水、唾 液、尿、脳を髄液、リンパ、涙液、排漬物又は胃液、組織抽出物、細胞が培殖し た培養液又は食品（病原体又はその中にある毒素のごとき汚染物の存在を試験す るため）から選択され得る。サンプルがそれ自体では本発明の目的のために十分 に流体でない場合には、適当な流体と混合して、例えばホモシネ−ジョンにより 所望の流動性を与えることができる。

検量分析対象は注目のサンプル中に天然に存在しないものであるべきであり、そ して検量分析対象の測定は、同一の反応条件下で得られる被験分析対象について の検量線に匹敵する検量線を示すべきである。検量分析対象はさらに安定である べきであり、特に貯蔵安定性を有すべきである。適切な検量分析対象の例は、被 験分析対象と交叉反応しない蛋白質、例えば動物（＠乳類、鳥又は魚を含む）又 は植物蛋白質、合成ポリペプチド、高分子化合物に結合したハプテン、ポリサン カライド又は抗体である。

それぞれ被験分析対象及び検量分析対象に選択的に結合することができる試薬（ 以後、「捕捉」試薬と称する）は被験分析対象又は検量分析対象と反応する抗体 、細胞表面受容体もしくはそのリガンド結合部分、レクチン、抗原、又は抗イデ オタイプ抗体であることができる。

捕捉試薬として使用される抗体は好ましくはモノクローナル抗体又はその断片、 例えばＦ（ａｂ’）ｚ又はＦａｂ’断片であって、例えばＡ、　Ｊｏｈｎｓｔｏ ｎｅ及びＲ，Ｔｈｏｒｐｅ、　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　ｉｎ　Ｐｒａｃ ｔｉｃｅ、　２ｎｄＥｄ、、　Ｂｌａｃｋｉ＋ｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　 Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９８７．　３５　４３頁に記載されているように して製造されるものである。抗体はまた、ポリクローナル抗体又はその断片であ って、例えばＡ、　Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ及びＲ，Ｔｈｏｒｐｅ　、前掲、の３０ −３４頁及び４８−５５頁により記載されているようにして製造されるものであ ってもよい。

本発明の方法において捕捉試薬として使用される細胞表面受容体白質受容体の例 は（言うまでもなく測定されるべき被験分析対象に依存して）ホルモン又は成長 因子の受容体、例えばインシュリン、インシュリン様成長因子、上皮成長因子、 血小板由来成長因子、形質転換成長因子又はコロニー刺激因子の受容体である。

受容体のりガント結合部分は適当には、塘蛋白譬受容体の細胞外ドメイン又はそ のリガンド結合断片である。糖脂質受容体はウィルス又は細菌表面ペプチド又は 蛋白質と結合することができるものである。

それに対してレクチンが親和性を有する適当な炭水化物成分を被験分析対象が含 む場合、本発明の方法及び試験キットにおける捕捉試薬としてレクチンを用いる ことができる。レクチンは典型的には植物由来のものであり、そして例えばレン ズ豆レクチン、小麦胚芽レクチン、ピーナツレクチン、大豆レクチン及びコンカ ナバリンＡである。

被験分析対象及び検量分析対象の両者が抗体である場合、捕捉試薬は便利には天 然もしくは合成抗原又は抗−イデオタイプ抗体である。抗イデオタイブ抗体はモ ノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体又はそれらの断片であることがで き、そして前記のようにして製造することができる。

捕捉試薬は固体支持体に物理的吸着又は共有結合により直接に固定化されてもよ く、あるいは架橋分子、例えばプロティンＡ、ポリリジン又は抗体（被験分析対 象又は検量分析対象とは反応しないがしかし捕捉試薬とは反応するもの）を介し て固体支持体に固定化されてもよい。本発明の方法及び試験キットにおいて使用 される固体支持体は好ましくはポリマーを含んで成る。ポリマーは、プラスチッ ク（例えば、ラテックス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリ アクリルアミド、ポリビニルアルコール、ナイロン、ポリ酢酸ビニル、及びこれ らの任意の適当なコポリマー）、セルロース（例えば、種々のタイプの紙、例え ばニトロセルロースペーパー等）、シリコンポリマー（例えばシロキサン）、ポ リサッカライド（例えばアガロース又はデキストラン）、又はイオン交換樹脂（ 例えば、常用の陰イオン又は陽イオン交換樹脂）から成る群から選択することが できる。

固体支持体の物理的形状は、本発明の目的のためには幾つかの形状が他の形状よ り便利であるが、臨界的ではない。すなわち、固体支持体は、プレート、例えば マイクロタイタープレート、ペーパーストリンプ、ディノブステインク、膜（例 えば、ナイロン膜又はセルロースフィルター）、又は固体粒子（例えば、ラテッ クスビーズ）であることができる。

本発明の方法及び試験キットの好ましい態様において、固体支持体はさらに、第 三の分離された領域において、被験分析対象又は検量分析対象のいずれかと反応 しない結合した抗体を有する。この様な試薬を含める目的は、固体支持体への１ 又は複数のサンプル成分の非特異的結合例えば疎水性結合又は異姓性抗体により 惹起される測定におけるバンクグラウンドを制御するためである。

捕捉試薬と同様に、本発明の方法の段階（ｃ）において使用されるラベルされた 試薬は、それぞれ被験分析対象又は検量分析対象と反応する抗体、細胞表面受容 体又はそのリガンド結合部分、レクチン、抗原、又は抗−イデオタイプ抗体であ ることができる。本発明の方法の段階（ｂ）及び（ｃ）において異る試薬を使用 することもできるが、捕捉試薬として及びラベルされた試薬として同し試薬を用 いるのが一般に好ましい。

それぞれ被験分析対象及び検量分析対象への結合のために使用される試薬のため のラベル物質は、好ましくは、酵素、着色又は蛍光物質及びラジオアイソトープ から成る群から選択される。

ラベル物質として有用な酵素の例は、パーオキシダーゼ（例えば西洋ワサビパー オキシダーゼ）、ホスファターゼ（例えば酸性又はアルカリ性ホスファターゼ） 、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、カーボニック アンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム 、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、β−グルコシダー ゼ、プロテアーゼ、ピルビン酸脱酸酵素、エステラーゼ、ルシフェラーゼ等であ る。

酵素はそれ自体検出可能ではなく、検出可能な最終生成物をもたらす反応を触媒 するように基質と組合わされなければならない。すなわち、本発明の方法の段階 （ｃ）の後に基質を加えて着色物質又は蛍光物質の形成をもたらすことができる 。本発明に従って使用される基質の例には、過酸化水素／テトラメチルベンジジ ン又はクロロナフトール又は０−フェニレンジアミン又は３−　（ｐ−ヒドロキ シフェール）プロピオン酸又はルミノール、インドキシルホスフェート、ｐ−ニ トロフェニルホスフェート、ニトロフェニルガラクトピラノシド、４−メチルウ ンベリフェリル−Ｄ−ガラクトピラノシド、あるいはルシフェリンが含まれる。

あるいは、ラベル物質は、着色もしくは蛍光物質、例えば金粒子、着色もしくは 蛍光ラテックス粒子、染料粒子、フルオレッセイン、フィコエリスチン又はフィ コシアニンを含むことができる。

本発明の目的のために使用され得るラジオアイソトープはＩ　−１２５゜ｌ−１ ３１、Ｈ−３，Ｐ−３５及びＣ−１４から選択することができる。

２以上の被験分析対象が同時に定量されるべき場合に使用される本発明の試験キ ットの特定の態様においては、相互に分離されており且つ検量分析対象と結合す る試薬から分離された別々の領域に、異る被験分析対象と結合するための複数の 試薬が支持体に与えられる。この方法は、測定されるべき異る被験分析対象の検 量線に匹敵する検量線を示す検量分析対象の選択を必要とする。本発明の方法の この態様において使用するための試薬キットはまた、各被験分析対象のための複 数のラベルされた試薬を含んで成る。

好ましい態様の記載 本発明の方法の現在好ましい態様においては、（ａ）被験分析対象を含有するこ とが疑がわれる既知体積のサンプルを、検量分析対象としての所定量のウシアプ ロチニンと混合し、（ｂ）段階（ａ）の混合物を、第一の分離された領域に前記 被験分析対象と選択的に結合することができる抗体が結合しておりそして第二の 分離された領域に抗−アプロチニン抗体が結合している膜に注加し、 （ｃ）前記被験分析対象と選択的に結合することができる酵素ラベルされた抗体 と酵素ラベルされた抗−アプロチニン抗体との混合物を、膜表面にわたっての均 等な分散を保証するような態様で前記膜に注加し、そして （ｄ）被験分析対象に結合した酵素ラベルされた抗体により生ずるシグナルとア プロチニンに結合した酵素ラベルされた抗体により生ずるシグナルとを比較する ことにより、サンプル中の被験分析対象の量を決定する。

従って、この態様において使用される好ましい試験キットは、検量分析対象がア プロチニンであり、固体支持体が膜であり、被験分析対象と選択的に結合するこ とができる試薬が該被験分析対象と反応する抗体であり、検量分析対象と選択的 に結合することができる試薬が抗−アプロチニン抗体であり、そして各試薬のた めのラベルが酵素であるようなキットである。

本発明の方法のこの態様において、好ましくは、段階（ｂ）に続き、サンプルと アプロチニンとの混合物は膜から除去される。さらに、酵素ラベルされた抗体の 混合物は、好ましくは、段階（ｃ）に続き膜から除去される。この様な除去は例 えば吸引により行われ、この目的のために前記の膜はフィルターとして機能する ことができる。それとして、これは吸引漏斗上に１かれたナイロン製膜が適当で ある。

次の例において本発明をさらに具体的に説明するが、これにより本発明の範囲を 限定するものではない。

肛・　とじてミオグロビンを　いるＣに−ＭＢの゛蛋白質の共有結合のために前 活性化された微細孔膜（ＰａｉｌＩｍｍｕｎｏｄｙｎｅイムノアフィニティー膜 ）をＢｉｏｄａｔ微小濾過器（ＢｉｏＲａｄから入手可能）に入れ、そして１つ のウェル中でヒトフレアチンキら入手可能）でコートした。対照としての第三の ウェルに抗体を含有しないコート緩衝液を加えた。次に、膜をリン酸緩衝液（Ｐ ＢＳ。

ｐＨ７，２）中０．２％カゼイン溶液によりブロックした。

ヒトクレアチンキナーゼＭ及びＢサブユニット（Ｎｏｖｏ　ＮｏｒｄｉｓｋＡ／ Ｓから入手可能＞　（ＣＫ　−ＭＢ　）を含有するウシ血清サンプルにヒトミオ グロビンを加えた。５０μｍのこの混合物を各ウェルに加え、次に西洋ワサビパ ーオキシダーゼ（ＨＩ？Ｐ）−結合モツクローナル抗−ヒトクレアチンキナーゼ Ｍサブユニット（Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓから入手可能）とＨＲＰ− 結合モツクローナル抗−ヒトミオグロビン（Ｎｏｖ。

Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓから入手可能）との混合物５０μｍを加えた。これらの Ｈｌ？Ｐ−結合モツクローナル抗体は固定化された抗体に結合した分析対象と反 応性であるように選択された。結合体混合物を添加して１分間後、０，０５％の Ｔｗｅｅｎ　２０及び０．２５Ｍの（ＮＨ）４ＺＳＯ４を含有する３Ｘ３００μ ｍのＰＢＳ　（ｐＨ７，２）により膜を洗浄した。次に、過酸化水素及びテトラ メチルヘンジジンを含有するｉ！溶液５０μｍを加え、そして３分間後に０．０ ５％のＮａ−アジドを含有する蒸留水で膜を洗浄することにより反応を停止した 。最後に、反射計（島津製）により応答を読み取り、そして測定された反射をＫ ｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋ式に従って実体に／Ｓに変換した。

反応体の濃度及び組成を通してミオグロビン測定を調整してＣＫ−？ＩＢ検量線 と平行な検Ｎ線を得た。次に、２つの測定の検量線を比較することによりミオグ ロビン検量体をＧＫ　−！’１Ｂ値に帰属させた。ミオグロビン検量体の帰属さ れたＧＫ−門８４度値は、それが、クレオチンキナーゼ測定における同等濃度の ＣＫ　−ＭＢと同じ、ミオグロビン測定における応答を定量的に惹起することを 意味する。

この例において使用されたミオグロビン検量体は２５ｏｇ／ｍｌの帰属されたＫ Ｃ−ＭＡ値を有していた。さらに、対照はＯｎｇ／ｍｌのＧＫ−ＭＢｆｉ度値に 帰属された。

サンプル中のＧＫ−門Ｂｆｉ度を、ミオグロビン分析対象応答及びバンクグラウ ンド値により決定される勾配と交点からの直線回帰によりサンプル中のＣＫ　− ｒＩＢｆｉ度を計算した。

表１及び表２に示す結果は、ミオグロビン検量体のＣＫ　−ＭＢ測測定サンプル 中のＣＫ　−ＭＢ濃度を決定することができること、及びミオグロビン検量体に よる測定の値は、１セツトのＣＫ−ＭＢ積標準用いる常用の検量体により得られ る値によく匹敵することを示している。

例１に記載したのと実質的に同様にして測定を行ったが、このタイプの免疫測定 に強い影響を与えることが知られている２つのパラメーター（サンプル体積及び 発色時間）を変えた。後記の表３及び４から、これらのパラメーターの変化は測 定されたに／Ｓ値のかなりの変化をもたらすようである。しかしながら、測定さ れたＣＫ　−ＭＢの濃度はこれらの変化により実質的に影響されなかった。

支ユ ０．３６５　０．００３　０．４９１　１９ｏ、ｓ　Ｏ，（Ｘ）４　０．囲’２ ３ ２０　０．３０１　０．００３　０．３９４　２００．３７８　０．耕　０．４ １５　田 ０．３５２　０．００３　０．４５０　２０携±Ｓ、０．２１±２ （＊）ヒトα−出力翳り旧されたウシ血清ＧＫ　−ＭＢ２度（ｎｇ／ｍｌ） 真の値”’　ＣＫ−ＭＢ系による換算０１　ミオグロビン系による換算３００（ ＊）既知量のＣＫ　−ＭＢが添加されたもの、　ＣＫ−ＭＢの定量のために商業 的に入手可能な測定（Ｎｏｖｏ　Ｃ１ｏｎｅ　ＥＩＡ　Ｃに−ＭＢ）により証明 された濃度。

（寧傘）記載された測定法及びＣＫ　−ＭＢ標準０．１０．２５．５０及び１１ ００ｎ／ｍｌを用いて計算したもの、測定は２連で行った。

（傘＊傘）表１から。

支ユ ０．１９４　０．００４　０．１５７　３０２５　０．１８６　０．（Ｘ１８０ ．１？６　２６０．１６２　０．呵　０．１８３２２ ０．１９０　０．００７　０．１８４　２５平均土Ｓ、０．　２６±３ ０．４１２　０ｆｆ７　０．３８９　２７０．３；７８’　０．０！５　０．３ ５０　２７５０　０．４１０　０．０１０　０．３６７　２８０．４５５　０． ０１０　０．４２０　２７０．４３５　０．（Ｘ）８　０．４５８　２４平均± Ｓ、０．　２７±２ ０．８１２　０．００４　０．８５３　２４０．８１７　０．億　ｏ、８ｓ３　 冴 １０ｉ１）　０．９２６　０．ＯＣ６０，８８６２６０，８４２０，（Ｘ）Ｂ　 Ｏ，９４４２２０，９１４０，僚　０．９７４　２４ 平均±Ｓ、０．　２４±１ （＊）帰属されたＣＫ−筒面 （＊＊ｌ　Ｓ’１３財直 容韻契湘崎ヒ 発色開閉　α−旭系　バックグラウンド　ミオグロビン系　α−旧自文（す（Ｏ ｎｇ　ＣＫ−ＭＲ／ｍｌ）　”’　（２５ｎｇ　ＣＫ−ＭＢ／ｍｌ）　”０．１ ４３　０．（ＸＥ　０．１２１　２９１　０．１３２　０．０１１　０．１２１ １　２５０．１２１　０．０１２　０．１４１　２１０．１２３　０．００９　 ０．１６６　１９平均±Ｓ、０．　２２±５ ０．５３３　０．０１９　０．５４３　２５０．４９７　０．０１４　０．４８ ３　２５３０、ヌリ　０．０１６　０．４８６　２５０．５６９　０．０１９　 ０．４７４　３００．５４６　０．０１５　０．ｇ％　２５平均上Ｓ、０．　２ ６±２ ０．８１２　０．０２７　０．６５６　３１ｏ、８４ｓ　ｏ、αつ　０．７９７ 　２６５　０．８１２　０．０２３　０．Ｍ　２６０．８１７　０．０２０　０ ．８８０　２３０．８９７　０．０２２　０．９４４　２４平均±Ｓ、０．　２ ６±３ （＊）　燦されたα−躍イ直 （林）計算値 要約書 サンプル中の被験分析対象の量を決定するための方法であって、（ａ）既知量の サンプルを、該サンプルにとって外来性でありそして測定におけるその挙動が同 一測定条件下での被験分析対象のそれに匹敵するように選択された所定量の検量 分析対象と混合し、（ｂ）段階（ａ）において調製された混合物を、固体支持体 であってその第一の分離した領域に前記被験分析対象と選択的に結合することが できる試薬が結合しておりそして第二の分離した領域に前記検量分析対象と選択 的に結合することができる試薬が結合しているものと接触せしめ、（ｃ）前記固 体支持体を、前記被験分析対象と選択的に結合することができるラベルされた試 薬と前記検量分析対象と選択的に結合することができる同様にラベルされた試薬 との混合物と接触せしめ、そして（ｄ）被験分析対象に結合したラベルされた試 薬のレベルと検量分析対象に結合したラベルされた試薬のレベルとを比較するこ とによってサンプル中の被験分析対象の量を決定する、ことを含んで成る。

国際調査報告 ｌＭｌｅＭｊｌ自Ｍ曹１息−−１，、、、−、−ＰＣＴノ’ＩＸＱ＋／ｎ０＋Ｑ ＋国際調査報告 灯１０Ｋ　９１１００１５１

Claims (48)

【特許請求の範囲】
1. １．内部検量を用いてサンプル中の被験分析対象の量を決定する方法であって、 （ａ）既知量のサンプルを、該サンプルにとって外来性でありそして測定におけ るその挙動が同一測定条件下での被験分折対象のそれに匹敵するように選択され た所定量の検量分析対象と混合し、（ｂ）段階（ａ）において調製された混合物 を、固体支持体であってその第一の分離した領域に前記被験分析対象と選択的に 結合することができる試薬が結合しておりそして第二の分離した領域に前記検量 分折対象と選択的に結合することができる試薬が結合しているものと接触せしめ 、 （ｃ）次に、前記固体支持体を、前記被験分析対象と選択的に結合することかで きるラベルされた試薬と前記検量分折対象と選択的に結合することができる同様 にラベルされた試薬との混合物と接触せしめ、そして （ｄ）被験分析対象に結合したラベルされた試薬のレベルと検量分析対象に結合 したラベルされた試薬のレベルとを比較することによってサンプル中の被験分析 対象の量を決定する、ことを含んで成る方法。
2. ２．前記被験分析対象が、ホルモン、例えばインシュリン、成長ホルモン、絨毛 性性腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、ステロイドホルモ ン；膵臓アミラーゼ；心臓構造蛋白質；Ｃ−反応性蛋白質；α−フェトプロテイ ン；クレアチンキナーゼタイプＭＢ又はＭＭ；細菌又はウイルス表面蛋白質；血 液成分、例えばファクタ−ＶＩＩ、ファクタ−ＶＩＩＩ、ファクタ−ＩＸ、ファ クタ−Ｘもしくはファクタ−ＸＩＩＩのごとき血液凝固因子、又はトロンビン、 プロトロンビン、プラスミン、プラスミノーゲンもしくは組織プラスミノーゲン 活性化因子のごとき蛋白質分解酵素もしくはその前駆体；成長因子、例えばイン シュリン様成長因子、血小板由来成長因子、上皮成長因子、コロニー刺激因子、 形質転換成長因子又は繊維芽細胞成長因子；微生物成分、例えばトキシン、例え ばコレラトキシン、ジフテリアトキシン、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ） トキノン、シガ（Ｓｈｉｇａ）トキシン、クロストリソウム・ボツリヌム（Ｃｌ ｏｓｔｎｄｉｕｍｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）トキシン、アフラトキシン、エンドトキ シン又はクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）−特異抗原（例えば、ＬＰＳ）；あ るいは抗体（例えば、病原体に対してヒト又は動物の体内で生成する抗体）であ る、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記検量分析対象が、被験分折対象と交叉反応しない動物又は植物蛋白質、 例えばアプロチニン、又は合成蛋白質、高分子化合物に結合したハプテン、ポリ サッカライド又は抗体である、請求項１又は２に記載の方法。
4. ４．前記サンプルが、体流体、例えば血清、血清、血漿、羊水、唾液、尿、脳脊 髄液、リンパ、涙液、排泄物又は胃液、組織抽出物、細胞が増殖した培養液又は 食品である、請求項１又は２に記載の方法。
5. ５．前記被験分析対象と選択的に結合することができる試薬が、被験分折対象と 反応する抗体、細胞表面受容体又はそのリガンド結合部分、レクチン、抗原、又 は抗−イデオタイプ抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. ６．前記抗体がモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体又はその断片で ある、請求項５に記載の方法。
7. ７．前記細胞表面受容体が糖蛋白質又は糖脂質受容体である、請求項５に記載の 方法。
8. ８．前記レクチンが、レンズ豆レクチン、小麦胚芽レクチン、ピーナツレクチン 、大豆レクチン及びコンカナバリンＡから成る群から選択される、請求項５に記 載の方法。
9. ９．前記抗原が、被験分析対象抗体と反応する少なくとも１個かのエビトープを 含有する天然又は合成抗原である、請求項５に記載の方法。
10. １０．前記抗原が、被験分折対象抗体と反応する少なくとも１つのエピトープを 含む天然又は合成抗原である、請求項５に記載の方法。
11. １１．前記抗−イデオタイプ抗体がモノクローナル抗体もしくはポリクローナル 抗体、又はその断片である、請求項１０に記載の方法。
12. １２．前記検量分析対象に選択的に結合することができる試験が、該検量分析対 象と反応する抗体、細胞表面受容体もしくはそのリガンド結合部分、抗原、レク チン、又は抗−イデオタイプ抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の 方法。
13. １３．前記抗体がモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、又はその断 片である、請求項１２に記載の方法。
14. １４．前記細胞表面受容体が糖蛋白質受容体又は糖脂質受容体である、請求項１ ２に記載の方法。
15. １５．前記レクチンが、例えばレンズ豆レクチン、小麦胚芽レクチン、ピーナツ レクチン、大豆レクチン及びコンカナバリンＡである、請求項１２に記載の方法 。
16. １６．前記抗−イデオタイプ抗体が、検量分析対象抗体と反応するものである、 請求項１２に記載の方法。
17. １７．前記抗イデオタイプ抗体が、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル 抗体、又はその断片である、請求項１６に記載の方法。
18. １８．被験分折対象及び標準分析対象が結合される前記固体支持体がプレート、 例えばマイクロタイタープレート、ペーパーディスク、ディップスティック、膜 又は固体粒子の形である、請求項５に記載の方法。
19. １９．前記固体支持体が、ポリマー、例えばプラスチック、ポリサッカライド、 イオン交換樹脂、セルロース又はシリコンポリマー、又はセラミック材料、例え ば制御された孔のガラスのごときガラスである、請求項１８に記載の方法。
20. ２０．前記固体支持体が、第三の分離された領域に、結合した非特異的試薬を有 する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. ２１．前記非特異的試薬が、サンプルのいずれの成分とも反応しない抗体である 、請求項２０に記載の方法。
22. ２２．前記ラベル物質が、酵素、着色又は蛍光物質、及びラジオアイソトープか ら成る群から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
23. ２３．（ａ）被験分折対象を含有することが疑がわれる既知体積のサンプルを、 検量分析対象としての所定量のウシアプロチニンと混合し、 （ｂ）段階（ａ）の混合物を、第一の分離された領域に前記被験分析対象と選択 的に結合することができる抗体が結合しておりそして第二の分離された領域に抗 −アプロチニン抗体が結合している膜に注加し、 （ｃ）前記被験分析対象と選択的に結合することができる酵素ラベルされた抗体 と酵素ラベルされた抗−アプロチニン抗体との混合物を、膜表面にわたっての均 等な分散を保証するような態様で前記膜に注加し、そして （ｄ）被験分祈対象に結合した酵素ラベルされた抗体により生ずるシグナルとア プロチニンに結合した酵素ラベルされた抗体により生ずるシグナルとを比較する ことにより、サンプル中の被験分析対象の量を決定する、請求項１〜２２のいず れか１項に記載の方法。
24. ２４．前記被験分析対象が、クレアチニンキナーゼタイプＭＢ又はＭＭ、膵臓ア ミラーゼ、心臓構造蛋白質、Ｃ−反応性蛋白質、α−フェトプロテイン又はクラ ミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）特異抗原（例えばＬＰＳ）である、請求項２３に 記載の方法。
25. ２５．それぞれが被験分折対象に選択的に結合することができる多数の試薬が、 相互に分離されており、そして標準分析対象と選択的に結合することができる試 薬が結合している別の領域から分離されている別々の領域で固体支持体に結合し ている、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
26. ２６．サンプル中の被験分析対象の量を決定するための試験キットであって、そ れぞれの容器中に、 （ａ）注目のサンプルにとって外来性である所定量の検量分析対象、 （ｂ）固体支持体であって、第一の分離された領域に前記被験分折対象と選択的 に結合することができる試薬が結合しておりそして第二の分離された領域に前記 検量分析対象と選択的に結合することができる試薬が結合しているもの、 （ｃ）前記被験分析対象に選択的に結合することができるラベルされた試薬、及 び （ｄ）前記検量分析対象に選択することができる同様にラベルされた試薬、 を含んで成り、そして 前記ラベルされた試薬（ｃ）及び（ｄ）は場合によっては１つの容器中の混合物 として提供、 ことを特徴とする試験キット。
27. ２７．前記検量分折対象が、被験分折対象と交叉反応しない動物又は植物蛋白質 、例えばアプロチニン、又は合成蛋白質、高分子化合物に結合したハプテン、ポ リサッカライド又は抗体である、請求項２６に記載の試験キット。
28. ２８．前記被験分析対象と選択的に結合することができる試薬が、被験分析対象 と反応する抗体、細胞表面受容体又はそのリガンド結合部分、レクチン、抗原、 又は抗−イデオタイプ抗体である、請求項２６又は２７に記載の試験キット。
29. ２９．前記抗体がモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体又はその断片 である、請求項２８に記載の方法。
30. ３０．前記細胞表面受容体が糖蛋白質又は糖脂質受容体である、請求項２８に記 載の試験キツト。
31. ３１．前記レクチンが、レンズ豆レクチン、小麦胚芽レクチン、ピーナツレクチ ン、大豆レクチン及びコンカナバリンＡから成る群から選択される、請求項２８ に記載の試験キット。
32. ３２．前記抗原が被験分析対象抗原と反応する少なくとも１つのエビトープを含 有する天然又は合成抗原である請求項２８に記載の試験キット。
33. ３３．前記抗原が被験分折対象抗体と反応する少なくとも１つのエピトープを含 む天然又は合成抗原である、請求項２８に記載の試験キツト。
34. ３４．前記抗−イデオタイプ抗体がモノクローナル抗体もしくはポリクローナル 抗体、又はその断片である、請求項３３に記載の試験キット。
35. ３５．前記検量分析対象に選択的に結合することができる試験が、該検量分析対 象と反応する抗体、細胞表面受容体もしくはそのリガンド結合部分、抗原、レク チン、又は抗−抗体である、請求項２６に記載の試験キット。
36. ３６．前記抗体がモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、又はその断 片である、請求項３５に記載の試験キット。
37. ３７．前記細胞表面受容体が糖蛋白質受容体又は糖脂質受容体である、請求項３ ６に記載の試験キット。
38. ３８．前記レクチンが、レンズ豆レクチン、小麦胚芽レクチン、ピーナツレクチ ン、大豆レクチン及びコンカナバリンＡから成る群から選択される、請求項１２ に記載の方法。
39. ３９．前記抗−イデオタイプ抗体が、標準分析対象抗体と反応するものである、 請求項３６に記載の試験キット。
40. ４０．前記抗イデオタイプ抗体が、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル 抗体、又はその断片である、請求項３６に記載の試験キツト。
41. ４１．被験分析対象及び検量分析対象が結合される前記固体支持体がプレート、 例えばマイクロタイタープレート、ペーパーディスク、ディップスティック、膜 又は固体粒子の形である、請求項２６〜４１のいずれか１項に記載の試験キット 。
42. ４２．前記固体支持体が、ポリマー、例えばプラスチック、ポリサッカライド、 イオン交換樹脂、セルロース又はシリコンポリマー、又はセラミック材料、例え ば制御された孔のガラスのごときガラスである、請求項５１に記載の試験キット 。
43. ４３．前記固体支持体が、第三の分離された領域に、結合した非特異的試薬をさ らに有する、請求項２６〜４２のいずれか１項に記載の試験キット。
44. ４４．前記非特異的試薬が、サンプルのいずれの成分とも反応しない抗体である 、請求項４３に記載の試験キット。
45. ４５．前記ラベル物質が、酵素、着色又は蛍光物質、及びラジオアイソトープか ら成る群から選択される、請求項２６〜４４のいずれか１項に記載の試験キット 。
46. ４６．前記検量分析対象がアプロチニンであり、前記固体支持体が膜であり、前 記被験分析対象と選択的に反応する試薬が該被験分析対象と反応する抗体であり 、前記検量分析対象と選択的に結合することができる試薬が抗−イデオタイプ抗 体であり、そして各試薬のためのラベルが抗体である、請求項２６〜４５のいず れか１項に記載の試験キット。
47. ４７．それぞれが被験分析対象に選択的に結合することができる多数の試薬が、 相互に分離されており、そして検量分析対象と選択的に結合することができる試 薬が結合している別の領域から分離されている別々の領域で固体支持体に結合し ている、請求項２６〜４６のいずれか１項に記載の試験キット。
48. ４８．異る被験分析対象に結合する多数のラベルされた試験を含んで成る、請求 項２７に記載の試験キット。