JPH03500925A - タンパク質のグリコシル化のアツセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質のグリコジル化のアッセイ 本発明は、グリコジル化されたタンパク質のアッセイに関し、さらに詳しくはタ ンパク質の末端のグリコジル化のパターン検出検出および／または測定すること に関する。

ある病理学的条件において、グリコジル化されたタンパク質の末端糖残基は変更 される。例えば、慢性関節リウマチにおいて、血清ＩｇＧは末端のガラクトース 残基の含量の減少および末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の対応する増加を 示すことが示された［Ｐａｒｅｋｈ　ｅｔａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３上６　ｐｐ 　４５２−４５７．１９８５、および欧州特許発行（ＥＰ−Ｐ）１８９３８８号 ］。タンノ（り質中の後者の含量は増加しないが、ガラクトース残基の不存在は Ｎ−アセチルグルコサミン残基を末端糖残基とさせる。また、乳癌に悩まされる 患者の予後は、癌細胞がＮ−アセチルグルコサミン残基に対して特異的なレクチ ンに結合する能力関係づけることができることが示された（Ｌｅａｔｈｅｍ　ｅ ｔ　ａｌ、、Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ　ｏｆ　Ｍａ３’　９ｔｈ。

１９８７　ｐｐ　１０５４−１０５７）。このレクチンと結合する癌細胞は、局 所的リンパ節へ転移する傾向と関連づけられることが発見された。逆に、このレ クチンと結合しない癌細胞は転移を形成する傾向が非常に低かった。レクチンで 検出可能な他の重要な炭水化物の変更は、二分を椎、嚢胞性線維症および前立腺 癌において起こる。このような変更は、また、（時々希な）血液星群の検出にお いて有意であることができ、そして炎症において急性タンパク質において変化す る。

したがって、簡単な、安価なかつ急速な方法で、タンパク質、例えば、ｒｇＧお よび細胞表面のタンパク質のグリコジル化パターンを決定することができること は重要である。実際には、多くの場合において重要であると思われる末端糖残基 は、すでに認められているもの、例えば、ガラクトース（またはＮ−アセチル− ガラクトサミン）およびＮ−アセチルグルコサミン（Ｇ　ｌ　ｃＮａ　ｃ）であ る。前者は多くの場合において通常の末端糖残基を提供するが、後者は、問題の タンパク質のグリコジル化タンパク質が異常であるとき、末端残基となる。嚢胞 性線維症におし＼て、末端フコース残基は末端のＮ−アセチルグルコサミン残基 の対応する増加とともに減少する。

末端のグリコジル化のパターンの検出および測定について従来記載された方法は 、とくに複雑でありかつ操業が高価であるので、完全には満足すべきものではな い。こうして、パレク（Ｐａｒｅｋｈ）らは、リシヌス・コムニス（Ｒ４ｃｉｎ ｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ）からのレクチンを結合したアガロースカラム上で慢性 関節リウマチの患者のＩｇＧから分離したオリゴ糖のクロマトグラフィーに基づ く方法、あるｌ／λは酵素の方法を使用した。レテム（Ｌｅａｔｈｅｍ）らの方 法は、癌組織の切片をマキガイＨｅ１ｉｘ　ｐｏｍａｔｉａからのレクチン（こ れはＮ−アセチルガラクトサミン残基に結合する）とともにインキュベーション し、そしてウサギ抗血清をレクチンに添加し、次いでビオチニル化ブタ抗ウサギ 免疫グロブリンおよびアビジン−ペルオキダーゼを添加することを包含した。次 いで、ペルオキシダーゼ活性は、過酸化水素およびジアミノベンジジンを使用し て明らかにされた。これらの方法は簡単ではない。

今回、タンパク質のオリゴ糖の末端糖残基のグリコモル化タンパク質検出および ／または測定する方法を案出した。新規な方法は操業が急速および簡単であり、 そして入手容易な試薬を使用する。それは、本質的に、要求されるものはとくに 可能な末端糖残基の含量の絶対的測定ではなく、むしろ潜在的に存在しうる異な る末端糖の相対的比率の推定であるという考えに基づく。

タンパク質の末端のグリコジル化のパターン検出および／または測定する本発明 の方法は、既知の適合性のタンパク質の試料を対応する数の標識した試薬で処理 し、前記タンパク質の試料は必要に応じて処理して末端糖残基を露出されており 、前記標識した試薬の各々は前記タンパク質中に存在しうる特定の末端糖残基に 対する特異的結合の親和性を有し、このような試薬各々は過剰量で使用し、結合 しない標識した試薬を前記試料から除去し、次いで結合した試薬または結合しな い試薬の各々により提供されるシグナルを観測および／または測定することから なる。既知の適合性のタンパク質の試料、例えば、それらの希釈比のみが異なる 試料、についてこの方法を実施することによって、観測されるものは、特定の決 定すべき糖残基に対して特異的であると選択された、標識した試薬に結合する試 料の能力の差である。原理的には、まず標識した試薬で、次いで（最初のものの 除去後）第２標識した試薬で処理した、タンパク質の試料について新規な方法を 実施することができる。しかしながら、実際には、２つの試料を同時に使用する ことが好ましい。

末端糖残基に対する特異的結合の親和性を有する好ましい試薬は、レクチン類で ある。これらは、特定の糖残基に対して特異的結合の親和性を有する、植物また は動物由来のタンパク質である。多数のレクチン類は知られており、そして商業 的に入手可能である。それらは、特異的結合の親和性に基づくアッセイ技術にお いて使用されるタンパク質の標識に普通に使用される方法、例えば、放射性原子 の組み込み、または酵素への直接または間接の結合、のいずれによっても標識す ることができる。

酵素の標識つけは、通常、放射性物質の使用に関連する特別の装置の必要性を回 避するので、好ましい。

新規な方法は原理的にはタンパク質の末端グリコジル化パターンの研究に使用す ることができるが、通常の末端糖残基の比率を欠くタンパク質の研究にことに有 用である。こうして、ＩｇＧの場合において、新規な方法は、正常の末端のガラ クトース残基を欠きそして、その結果、末端のＮ−アセチルグルコサミン残基を 有する分子の比率の測定に、ことに有用である。上に記載したように、末端のガ ラクトース残基の相対的不存在は慢性関節リウマチに悩まされる患者のＩｇＧの 特性であり、そして乳癌組織の細胞表面のタンパク質中の末端のガラクトース残 基の存在は癌の転移の傾向に関連づけられることが発見された。

新規な方法は、タンパク質、例えば、ＩｇＧがある種の固体の基質、ことにニト ロセルロースへ結合する能力を使用することによって、便利に実施される。他の 固体の基質はナイロン（ことにナイロン−６６、Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能 である）および特別に処理された紙、ことにアミノ−チオ７エロール処理した紙 （Ｔｒａｎｓｂｉｎｄ　ＡＰＴ紙として入手可能である）に基づくことができる 。検査すべきタンパク質の適当な試料は、適当な精製処理後、固体の基質に結合 する。時には、固体の基質への結合後、沸騰させるか、あるいは固体の基質への 結合前に、ジサルファイド結合の還元および８Ｍ尿素を使用する処理によって、 タンパク質を変性することが必要であることがある。ヒトＩｇＧについて、変性 は必須であるように思われる。

次いで、結合した試料を、その存在または不存在を検出すべき末端糖残基に対す る、それらの特異性について選択した標識したレクチンで処理する。次いで、標 識により提供されるシグナルを、通常適当な顕色後、例えば、標識として使用す る酵素により活性化される色形成試薬で顕色後、観測または測定しそして、それ ぞれ、正常の末端糖残基および異常の末端糖残基と反応する標識した試薬により 提供されるシグナルの比は、後者の測度を直接を与える。これに関して、特定の 末端糖残基の含量の絶対的決定は不必要であることに注意すべきである。必要で あるすべてのことは、使用する試薬を既知の標準に対する目盛り定めし、そして 固体の支持体に結合したタンパク質の試料はすべて同一であるか、あるいはタン パク質の量において互いに既知の関係を有するということである。

新規の方法において使用する標識したレクチンは、商業的に入手可能なレクチン および商業的に入手可能な標識試薬から容易に調製することができる。適当な試 薬は下の新規な方法の詳細な説明において述べられているが、これらの試薬は同 一機能を満足する他の試薬と置換することができる。

本発明の実施に現在好ましい方法において、ＩｇＧを血液試料から既知の方法で 分離し、そして既知のＩｇＧ含量の溶液にする。次いで、この溶液をニトロセル ロースシート上に注意して調節した量でドツトプロットする。ＩｇＧはニトロセ ルロースに緊密に結合する。試料のドツトブロッティングのため、商用ドツトブ ロック−を使用することができる。

このアッセイは、また、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で展開しそしてニトロセルロー ス紙上にウェスタンブロッティングしたパターンの混合物について使用すること ができる。次いで、プロットをここに記載する方法で処理することができる。そ の方法において、ある範囲のタンパク質を同時に検査することができる。しかし ながら、この方法は、糖の検査に、レクチンまたは抗体を使用して、液状媒質ま たは任意のタイプの固相の支持体、例えば、プラスチックのマイクロタイタープ レート、例えば、ポリスチレンのＥＬＩＳＡプレート、例えば、ヌンク（Ｎｕｎ ｃ）またはダイナチク（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）により販売されているものにおいて 任意のタイプの反応を使用して、適用することができる。

好ましい方法において、ドツトブロッティングしたＩｇＧを、湿潤剤および不活 性タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミンを含有する結合で処理して、タンパ ク質のニトロセルロースへのそれ以上の非特異的結合を防止する。次いで、ドツ トを標識したレクチンで処理する。レクチンハ、例ｘ−ば、Ｎ−ヒドロキシスク シンイミドビオチンとの反応によりビオチニル化することができる。洗浄して結 合しないレクチンを除去しＩ；後、ドツトをそれに結合したペルオキシダーゼ（ または他の適当な酵素）を有するアビジンで処理する。それ以上の洗浄後、ペル オキシダーゼ、または他の酵素の標識を、適当な色形成試薬、例えば、クロロ− ナフトールおよび過酸化水素の組み合わせとの反応により検出する。生成する色 を、既知の酵素結合イムノアッセイ分析において使用される種類の光学的デンシ トメーターで測定する。あるいは、アビジンは放射性同位元素、例えば、１２５ ■−ストレプトアビジンで標識する。次いで、結合した放射能を直接測定するこ とができる。

アブルス・プレカトリウス（Ａｂｒｕｓ　ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓ）（アブリン ）およびリシヌス・コムニス（Ｒ４ｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（リシン、 ＲＣＡＩ　Ｂ　鎖）からのレクチンは末端のガラクトース残基への結合に適当で あるが、パンディレア・シンプリシ７オリア（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ　ｓｉｍｐ ｌｉｃｉｆｏｌｉａ）ＩＴ　（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ　ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉ ａ　ＩＩ）、ダツラ・スタモニウム（Ｄａｔｕｒａ　ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）、 またはりコペリスコン・エスクレンツム（Ｌｙｃｏｐｅｒｉｓｃｏｎ　ｅｓｃｕ ｌｅｎｔｕｍ）またはスクシニル化コムギ胚アグリチニンからのレクチンは末端 Ｎ−アセチルグルコサミン残基への結合に適当である。パンディレア・シンプリ シフオリア（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ　ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）ＩＩ（Ｇｒ ｉｆｆｏｎｉａ　ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ　ＩＩ）のレクチンは、末端の非 還元性−および−Ｎ−アセチルグルコサミン残基とのみ相互作用することが知ら れている唯一のレクチンであるので、とくに重要である。ロツス・テトラゴノロ ブス（Ｌｏｔｕｓ　ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ）、グリッ７オニア・シンプ リシ７オリア（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ　ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ）ＩＶおよび ウレツクス・エウロベウス（Ｕｌｅｘ　ｅｕｒｏｐａｅｓ）Ｉは末端フコース残 基に結合する。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。

夾寒ガ土 ＴｇＧの精製 血液試料を３７°Ｃにおいて１時間インキュベーションして凝固させた。

次いで、試料を３００Ｏｒｐｍにおいて２５分間遠心し、そして血清を取り出し 、そして−２０°Ｃにおいて貯蔵した。ＩｇＧを血清（０，５〜２ｍ（２）から 次の方法で分離した。すべての作業は室温において実施した。飽和硫酸アンミニ ラム溶液の半分の体積を１体積の血清に撹拌しながら滴々添加し、そしてこの混 合物を２５分間放置し、次いで３０００ｒｐｍで２５分間遠心した。沈澱したタ ンパク質のペレットを４０％の硫酸アンモニウム溶液のもとの血清体積中に懸濁 し、次いで３０００ｒｐｒｒｉにおいて２５分間再遠心した。得られるタンパク 質のペレットを２０ミリモルのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７，２（ＫＰ　ｉ）の もとの血清体積中に再び懸濁した。得られる溶液を２０ミリモルのＫＰｉに対し て透析し、次いでＤＥＡＥアニオン交換セルロースのカラムで精製した（ＤＥ５ ２、Ｎ　２０ミリモルのＫＰｉ　ｐＨ７，２と平衡化した５ｒ＋Ｊの注射器中の 約８ｇのゲル；２〜５ｇのＤＥＡＥセルロース／ｍＱ血清）。

透析したＩｇＧ溶液（０，５〜２ｍｆｆ）を前記カラムに添加し、そしてＫＰｉ で溶離した。次の分画を集めた：ＩｇＧは分画（２）および（３）において溶離 する。ＩｇＧを含有する分画をプールし、そして０．０１％のアジ化ナトリウム の存在下に０〜４℃において貯蔵する。タンパク質の濃度をプラト７オード（Ｂ 　ｒ　ａ　ｄｆｏｒｄ）試薬（Ｂｉｏｒａｄから）を使用して推定する。各試料 を１０％の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル、クーマツシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉ ｅ）ブルーで染色した、の電気泳動により純度について検査した。

アッセイの手順 上の方法で精製したＩｇＧの試料を、リン酸塩緩衝生理的塩類溶液（以後、ＰＢ Ｓ、ｐＨ７，２，８ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣＩ、０．２ｇ／Ｑのオルトリ ン酸二水素カリウムおよび１．１．５ｇ１２のオルトリン酸水素二カリウムを含 有する）で１００μＱ当たり２０層ｇのＩｇＧ８よび４０層ｇのｒｇＧの濃度に 希釈した。ニトロセルロース膜（ＳｃｈＩｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌ ｌｓ０．１μｍの孔）をベンンルグリッド（ｐｅｎｃｉｌ　ｇｒｉｄ）（０，ｓ ｘｏ、８ｃｍの四角）および取り扱いのため適当な枠で準備し、次いで１２層の 吸収ティッシュ組織上に配置した。ＩｇＧの試料をニトロセルロース上にドツト ブロッティングした。各１ｇＧ試料の５μａをｌＯμＱのハミルトン（ｈａｍｉ ｌｔｏｎ）注射器およびチャネイ（Ｃｈａｎｅｙ）アダプターを使用して適用し た。注射器の針がニトロセルロースと接触しないように、適用を配置した。この 溶液を注意して適用して膜に沿った溶液の横方向の動きを減少して、溶液がニト ロセルロースを通過して吸収ティッシュ中に行かせた。各試料（比較のために使 用した標準を包含する）を三重反復実験において、アブリンまたはりシンを使用 するとき、１ｐｇのＩｇＧ１５ｐ（ｌを使用し、そしてパンディレア（Ｂａｎｄ ｅ　ｉ　ｒａｅａ）レクチンを使用するとき、２ｐｇのＩｇＧ１５μａで使用し た。次いで、ドツトプロットを室温において１時間乾燥し、次いでそれらをＰＢ Ｓ中で５分間瀦騰させて、ＩｇＧ分子を変性し、そして糖残基を露出させた。

次いで、ニトロセルロース膜を、室温において１時間（または０〜４°Ｃにおい て一夜）、０．０５％のツイーン湿潤剤を含有するＰＢＳ中の１％のウシ血清ア ルブミン（ＢＳＡ）で処理した。（ウシ血清アルブミンじゃ非特異的タンパク質 ：タンパク質の相互作用を減少し、そしてツイーン湿潤剤はニトロセルロースへ の非特異的バックグラウンドの結合を減少する。） レクチンのグローブは、各レクチンをＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチンと 反応させて調製した。蒸留水中の１ｍｇ／ｍｆｆの濃度のレクチンを、ビオチニ ル化剤でジメチルスルホキシド中の１ｍｇ／ｍｆｆの強度で１：１０のビオチン ：レクチンの比で処理し、そして室温において一夜放置した。得られるビオチニ ル化レクチンを、０．０１％のアジ化ナトリウムの存在下に０〜４℃において貯 蔵した。

ドツトプロットを有するニトロセルロース膜をビオチニル化レクチンとともに２ ．５時間インキュベーションした。［リシンに基づく試薬、ＲＣＡＩＩ　Ｂ鎖は ｌ／２５０の希釈で使用し、アブリンに基づく試薬は１／１２５で使用し、そし てパンディレア（Ｂａｎｄｅ　ｉ　ｒａｅａ）レクチンに基づく試薬はｌ／１０ ０で使用し、すべてはＢ５Ａ３よびツイーンを含有するＰＢＳで希釈した。］次 いで、プロットを、１０分の間隔で、ツイーンおよびＢＳＡを含有するＰＢＳで ５回洗浄した。次いで、それらを、回転震源器上で、ＰＢＳ−ツイーン−ＢＳＡ 中の１／１００Ｑでセイヨウワサビペルオキシダーゼで標識したストレプトアビ ジンとともに２時間インキュベーションした。プロットを１０分の間隔でツイー ンのみを含有するＰＢＳで５回洗浄し、次いで４−クロロ−ナフトールおよび過 酸化水素で顕色した。１体積のメタノールに０．３ｍｇ／ｍＱの４−クロロ−１ −す７トールを添加し、次いで５体積のトリス緩衝液（ｐＨ７，６）および０． ０１％の過酸化水素［パンディレア（Ｂａｎｄｅ　ｉ　ｒａｅａ）レクチン処理 したプロットについて０．１％）を添加した。この混合物を使用直前に調製した 。色が形成した後、膜を蒸留水で洗浄し、そしてプロットよく乾燥した。次いで 、それらのデンシティをフォトメーターで読んだ。

第１図は、フォトメーターで測定した吸収とガラクトース欠くオリゴ糖の鎖の百 分率との間の関係を示す。後者は、ドウエフ（Ｄｗｅｋ）ら（］ｏｃ、ｃｉｔ、 ）が記載する方法を使用する定量的生化学的分析により得た。新規な方法とドウ エフらの方法との間の相関関係は明らかである。第２図はパンディレア（Ｂａｎ ｄｅ　ｉ　ｒａｅａ）レクチンを使用して測定したドツト対リシンを使用して測 定したドツトの吸収比のプロット、すなわち、末端Ｎ−アセチルグルコサミン残 基対末端ガラクトース残基の比の測定を示す。新規な方法は、２０〜６０％のガ ラクトースを欠くオリゴ糖の鎖の百分率の非常に感受性の測定を提供することが 認められるであろう。

ドツトプロットアッセイは、実施例２に８いて例示するように、変更しそしてポ リスチレンＥＬ　Ｉ　ＳＡプレート上で実施することができる。

夾鳳蚤λ 分析すべきヒトＩｇＧの精製した試料を、０．５モルのメルカプトエタノールを 含有する８ＭＭ素で処理しく試料／尿素の比＝２ｍｇ／２ｍＱ）モして３７°Ｃ において一夜インキユベーションした。次いで、処理した試料を０．０２モルの ヨードアセタミドに対して一夜透析し、次いでＰＢＳに対して２時間透析した。

試料の尿素による処理の第１工程は、炭水化物の露出に試料の変性が必要である 場合にのみ、必要である。ヒトＩｇＧ試料は変性を必要とすると信じられるが、 これはマウスＩｇＧ試料について必要であると思われない。

タンパク質の推定は、変性したヒトＩｇＧ試料および非変性マウスＩｇＧ試料に ついて実施した。ＥＬＩＳＡプレートを試料（１００μＱの試料／ウェル）で、 炭酸塩／重炭酸塩の緩衝液ｐＨ９，６中の１０層ｇ／ｍＱのタンパク質濃度で被 覆した。プレートを４°Ｃにおいて一夜または室温において３時間放置し、次い でそれらをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ−ライ−／（０，０５％）−ＢＳＡ　（ １％）で室温において１時間ブロッキングした。ＰＢＳで３回洗浄した後、実施 例１のドツトプロットアッセイにおいて使用したビオチニル化試薬（１００μＱ ／ウエル）を添加し、そしてプレートを４°Ｃにおいて一夜インキユベーション した。

試薬の希釈はＰＢＳ−ツイーン−ＢＳＡＯ，１％であった。

プレートを再びＰＢＳ−ツイーンで３回洗浄し、そしてストレプトアビジン−Ｈ ＲＰ　（１００μａ／ウエル）を添加した。プレートを室温において２時間イン キュベーションし、次いでＰＢＳ−ツイーンで３回洗浄した。

次いで、基質をウェルに添加し、そして色を暗所で１０〜３０分間発現させた。

反応を７フ化ナトリウム（９６ｍｇ１５０ｍＱＨｓＯ）で停止させ、そしてプレ ートと４０５ｎｍにおいて読んだ。

使用した基質は、０．０５モルのクエン酸塩リン酸塩緩衝液ｐＨ４゜１中の２′ 　２′アジノージ（３，エチルベンズチアゾリンスルホン酸）であった。５ｐｍ ｇの基質は１００ｍＱのクエン酸塩リン酸塩緩衝液＋３５ｐＱのＨ２Ｏ２ｖ　ｏ 　Ｉ　２０中に存在した。

ヒトおよびマウスのＩｇＧ試料について得られた結果を表１に記載する。

ａ）ＥＬＩＳＡアッセイを使用するヒトＩｇＧグリコジル化の分析Ｇｏ％　ガラ クトース　Ｇ　Ｉ　ｃＮａ　ｃ　ガラクトースの結合／への結合　への結合　Ｇ ｌｃＮａｃの結合の比２１　０．６７７　０．３９２　０．７８３２　０．５０ ９　（Ｌ６４３　１．１８３８　０．４３０　０．７５０　２．２５６１　０、 ＋０７　０．４７２　６．２７ガラクトースの欠損（Ｇｏ）の程度は最後の欄に おける比に関係づけらることが示され、そして末端グリコジル化パターンを測定 するこの方法はとくに感受性でありかつ融通性があると信じられる。

ｂ）マウスのＩｇＧ 未処理１ｇＧ試料（マウスの系統）　Ｇ　Ｉ　ｃＮａ　ｃへの結合ＳＪＬ　０． ０７４ Ｂａ　Ｉｂ／　ｃ　Ｏ，２６８ ＭＲＬ＋÷　０．３８６ ＭＲＬ　Ｉｐ　０．５１５ プラスチツクの固相へ結合したマウスＩｇＧ上のＧＩｃＮａｃ残基Ｎａ前の変性 を必要とせずに、抗ＧＩｃＮａｃに対して本質的に露出される。

補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）／Ｘ 平成２年５月１０日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 ■、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＧＢ　８８１００９７８ ２、発明の名称 タンパク質のグリコジル化のアッセイ ３、特許出願人 名称　ユニバーシティ・カレンダ・ロンドン４、代理人　〒１０７ 電話　５８５−２２５６ ５、補正書の提出年月日 １９９０年２月２８日 ６、添付書類の目♀ （１）　補正書の写しく翻訳文）　１通（２）補正の説明　１通 補正の説明 補正書目訳文の第１頁は明細書翻訳文の第２頁第１９行〜第３頁第１４行の補正 であります。

補正書目訳文の第２頁は明細書翻訳文の第４頁第９行〜第５頁第４行の補正であ ります。

補正書目訳文の第３頁〜第４頁は請求の範囲の全文補正であります。

そしてウサギ抗血清をレクチンに添加し、次いでビオチニル化ブタ抗ウサギ免疫 グロブリンおよびアビジン−ペルオキダーゼを添加することを包含シタ。次いで 、ペルオキシダーゼ活性は、過酸化水素およびジアミノベンジジンを使用して明 らかにされた。これらの方法は簡単ではない。

今回、タンパク質のオリゴ糖の末端糖残基のグリコジル化タンパク質検出および ／または測定する方法を案出した。新規な方法は操業が急速および簡単であり、 そして入手容易な試薬を使用す゛る。それは、本質的に、要求されるものはとく に可能な末端糖残基の含量の絶対的測定ではなく、むしろ潜在的に存在しうる異 なる末端糖の相対的比率の推定であるという考えに基づく。

タンパク質の末端のグリコジル化のパターン検出および／または測定する本発明 の方法は、既知の適合性のタンパク質の試料を複数の標識した試薬で処理し、前 記タンパク質の試料は処理して末端糖残基を露出されており、前記標識した試薬 の各々は前記タンパク質中に存在しうる特定の末端糖残基に対する特異的結合の 親和性を有し、このような試薬各々は過剰量で使用し、結合しない標識した試薬 を前記試料から除去し、次いで結合した試薬または結合しない試薬の各々により 提供されるシグナルを観測および／または測定することからなる。既知の適合性 のタンパク質の試料、例えば、それらの希釈比のみが異なる試料、についてこの 方法を実施することによって、観測されるものは、端のＮ−アセチルグルコサミ ン残基を有する分子の比率の測定に、ことに有用である。上に記載したように、 末端のガラクトース残基の相対的不存在は慢性関節リウマチに悩まされる患者の ＩｇＧの特性であり、そして乳癌組織の細胞表面のタンパク質中の末端のガラク トース残基の存在は癌の転移の傾向に関連づけられることが発見された。

新規な方法は、タンパク質、例えば、ＩｇＧがある種の固体の基質、ことにニト ロセルロースへ結合する能力を使用することによって、便利に実施される。他の 固体の基質はナイロン（ことにナイロン−６６、Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能 である）および特別に処理された紙、ことにアミノ−チオフェロール処理しｔ； 紙（Ｔｒａｎｓｂｉｎｄ　ＡＰＴ紙として入手可能である）に基づくことができ る。検査すべきタンパク質の適当な試料は、適当な精製処理後、固体の基質に結 合する。タンパク質は、固相への結合後、沸騰させるか、あるいは固相への結合 前に、ジサルファイド結合の還元および８Ｍｙ、素を使用する処理によって、タ ンパク質を変性することが必要であることがある。ヒトＩｇＧについて、変性は 必須であるように思われる。

次いで、結合した試料を、その存在または不存在を検出すべき末端糖残基に対す る、それらの特異性について選択した標識したレクチンで処理する。次いで、標 識により提供されるシグナルを、通常適当な顕色後、例えば、標識として使用す る酵素により活性化される色形成試薬で顕色請求の範囲 ｌ、既知の適合性のタンパク質の試料を対応する数の標識した試薬で処理し、前 記タンパク質の試料は処理されて末端糖残基が露出されており、前記標識した試 薬の各々は前記タンパク質中に存在しうる特定の末端糖残基に対する特異的結合 の親和性を有し、このような試薬各々は過剰量で使用し、結合しない標識した試 薬を前記試料から除去し、次いで結合した試薬または結合しない試薬の各々によ り提供されるシグナルを観測および／まｔ；は測定することからなることを特徴 とする、タンパク質の末端のグリコジル化パターンを検出および／または測定す る方法。

２、各々が末端糖残基に対する特異的結合の親和性を有する試薬はレクチン類で あることを特徴とする、上記第１項記載の方法。

３、レクチン類は、アブルス・プレカトリウス（Ａｂｒｕｓ　ｐｒｅｃａｔｏｒ ｉｕｓ）、リシヌスψコムニス（Ｒ４ｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎ＋３）、パンデ ィレア・シンプリシフォリア（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ　ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌ ｉａ）、ダツラ・スタモニウム（Ｄａｔｕｒａ　ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）または りコベリスコン・エスクレンッム（Ｌｙｃｏｐｅｒｉｓｃｏｎ　ｅｓｃｕｌｅｎ ｔｕｍ）からのものであるを含有する、上記第２項記載の方法。

４、末端糖残基はガラクトースまたはＮ−アセチルグルコサミンであることを特 徴とする、上記第１項記載の方法。

５、各々が末端糖残基に対する特異的結合の親和性を有する試薬は各標識した酵 素である、上記第１項記載の方法。

６、検査すべきタンパク質はＩｇＧであることを特徴とする、上記第１項記載の 方法。

７、前記検査すべきタンパク質の試料を、標識した試薬で処理前に、固体の基質 に結合することを特徴とする、上記第１項記載の方法。

８、固体の基質はニトロセルロースであることを特徴とする、上記第７項記載の 方法。

９、固体の基質はポリスチレンであることを特徴とする、上記第７項記載の方法 。

゛ｌＯ１上記第Ｌ　２または３項記載の方法を実施するために適当であり、そし てタンパク質を結合することができる固体の基質、およびある数のバイアルから なり、前記バイアルの各々は特定の末端糖残基に対する特異的結合の親和性を有 する標識した試薬を含有することを特徴とするキット。

国際調査報告 １１１１１１１′１ｌＩＩＩＩＩＩＩＩＪＩ＾ａｍｗｈ＋ｍｓ　Ｈａ、　ｐＣτ ／ＧＢ　８８１００９’／８Ｓ＾　２５３８７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、既知の適合性のタンパク質の試料を対応する数の標識した試薬で処理し、前 記タンパク質の試料は必要に応じて処理して末端糖残基を露出されており、前記 標識した試薬の各々は前記タンパク質中に存在しうる特定の末端糖残基に対する 特異的結合の親和性を有し、このような試薬各々は過剰量で使用し、結合しない 標識した試薬を前記試料から除去し、次いで結合した試薬または結合しない試薬 の各々により提供されるシグナルを観測および／または測定することからなる、 タンパク質の末端のグリコシル化パターンを検出および／または測定する方法。 ２、各々が末端糖残基に対する特異的結合の親和性を有する試薬はレクチン類で ある、上記第１項記載の方法。 ３、レクチン類は、アブルス・ブレカトリウス（Ａｂｒｕｓ　ｐｒｅｃａｔｏｒ ｉｕｓ）、リシヌス・コムニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、バンデ イレア・シンプリシフォリア（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ　ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌ ｌａ）、ダツラ・スタモニウム（Ｄａｔｕｒａ　ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）または リコベリスコン・エスクレンツム（Ｌｙｃｏｐｅｒｉｓｃｏｎ　ｅｓｃｕｌｅｎ ｔｕｍ）からのものである、上記節２項記載の方法。 ４、末端糖残基はガラクトースまたはＮ−アセチルグルコサミンである、上記第 １〜３項のいずれかに記載の方法。 ５、各々が末端糖残基に対する特異的結合の親和性を有する試薬は各標識した酵 素である、上記第１〜４項のいずれかに記載の方法。 ６、検査すべきタンパク質はＩｇＧである、上記第１〜５項のいずれかに記載の 方法。 ７、前記検査すべきタンパク質の試料を、標識した試薬で処理前に、固体の基質 に結合する、上記第１〜６項のいずれかに記載の方法。 ８、固体の基質はニトロセルロースである、上記第７項記載の方法。 ９、固体の基質はポリスチレンである、上記第７項記載の方法。 １０、タンパク質を結合することができる固体の基質、およびある数のバイアル からなり、前記バイアルの各々は特定の末端糖残基に対する特異的結合の親和性 を有する標識した試薬を含有する、上記第１〜９項のいずれかに記載の方法を実 施するために適当なキット。