JPH05508019A

JPH05508019A - 非―ジストロフィン蛋白質の測定及び筋ジストロフィーの診断

Info

Publication number: JPH05508019A
Application number: JP91511453A
Authority: JP
Inventors: キヤンベル，ケビン・ピー; アーバステイ，ジエイムズ・エム; オーレンデイーク，ケイ; ゲイバー，ミツチエル・ジー; カール，ステイーブン・デイ
Original assignee: ユニバーシテイ・オブ・アイオワ・リサーチ・フアウンデーシヨン
Priority date: 1990-05-23
Filing date: 1991-05-23
Publication date: 1993-11-11
Also published as: CA2083598A1; US5187063A; EP0533830A1; US5413910A; AU8053291A; WO1991018107A1; AU653536B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】非−ジストロフィン蛋白質の測定及び筋ジストロフィーの診断発明の背景筋ジストロフィーは、個々の筋細胞の多くの進行性萎縮又は変性を特徴とする、遺伝的に決定されるミオパシーの群を言う。組織学的に観察される構造変化は、種々の種類の筋ジストロフィーにおいて基本的に同一である。これはおそらく共通の病因を示唆しているだろう。しかし冒される筋肉の分布は極めて特色がある。これは遺伝の型と共にこれらの病気の分類の基礎を形成する。筋ジストロフィーは従来初期にかかわる筋肉のパターンにより細分され、それは遺伝伝達の型と非常に良く相関している。筋ジストロフィーの主な３種類の形態は、以下の通りである：１）はとんどの骨格筋群を冒し、Ｘ染色体性劣性遺伝子により伝達されるデュシエンヌ筋ジストロフィー；２）主に骨盤及び肩胛帯筋を冒し、常染色体性劣性遺伝子により伝達される肢体型筋ジストロフィー：及び３）顔及び肩胛帯の筋肉を含み、常染色体優性遺伝子により伝達される顔面肩胛上腕筋ジストロフィー。

最近、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）に対応する欠陥遺伝子のＸ染色体上の位置が決定された。ＤＭＤ遺伝子は、シストロフィンと呼ばれる高分子量蛋白質生成物をコードする。この蛋白質は正常な骨格筋の筋細胞膜に存在するが、ＤＭＤの患者ならびにジストロフィー筋を持つ犬及びマウスの骨格筋には存在しない。このＸ染色体性劣性病のより穏やかな型はベラカー筋ジストロフィーであり、これは異常なシストロフィン蛋白質をコードする異常なりＭＤ遺伝子により起こる。シストロフィンの正確な機能、及びそれがないか、又は構造が異常であることによりジストロフィー筋繊維の壊死が起こる理由は、決定されていない。しかしシストロフィンのアミノ酸配列は、それが膜細胞骨格蛋白質であることを示唆している。

デュシエンヌ及びベラカー筋ジストロフィーの初期の検出及び診断の現在の技術は、免疫学的プローブを用いて人間の筋肉の試験切除試料におけるシストロフィンの存在、シストロフィンの不在、又はシストロフィンの異常な分子量あるいは含有量を同定することに頼っている。遺伝病が１種類より多くの成分又は蛋白質の欠失又は異常な合成を含むことはめずらしくない。筋ジストロフィーの場合、異なる染色体（Ｘ染色体及び／又は常染色体）上に位置する遺伝子から伝達されるシストロフィン以外の蛋白質が含まれ、異なる形態の筋ジストロフィーを生ずるのであろう。筋ジストロフィーに含まれる可能性のある他の蛋白質の同定、及びこれらの蛋白質の定量法は、医師がデュシエンヌ及びベラカー筋ジストロフィーの診断を確認するのに非常に有用であり、又おそらく他の形態の筋ジストロフィーの初期診断を与える。さらにこれらの蛋白質の機能に関する知識は、病気の進行の予後の予測、及びおそらく種々の形態のすべての筋ジストロフィーの患者の治療的処置の方法を与えること本発明は、哺乳類骨格筋のシストロフィン−糖蛋白質複合体、及び該複合体の単離法に関する。本発明は又、哺乳類骨格筋のシストロフィン−糖蛋白質の非−ジストロフィン成分、及び該成分の分離ならびに単離法に関する。成分は１５６ｋＤａの糖蛋白質、分子量が５９ｋＤａの蛋白質のトリブレット、５ＱｋＤａの糖蛋白質、４３ｋＤａの糖蛋白質及び３５ｋＤａの糖蛋白質を含む。

本発明はさらに、筋ジストロフィーの兆候である、哺乳類の骨格筋のシストロフィン−糖蛋白質複合体の非−ジストロフィン成分の欠失の検出及び定量による筋ジストロフィーの診断法に関する。

シストロフィン−糖蛋白質複合体の非−ジストロフィン成分に特異的な単クローン性及び多クローン性抗体は、本発明の診断法に特に有用である。例えばこれらの抗体を標識して非−ジストロフィン成分の結合に用い、それによって該成分を検出することができる。この検出は、成分が単離された状態で、又は正常な骨格筋においてシストロフィンに結合した自然の状態である場合に行うことができる。

シストロフィンは、ジストロフィー筋肉において非常に減少することが知られている。本発明は、シストロフィン−糖蛋白質複合体の非−ジストロフィン成分も非常に減少するという新しく発見した情報を利用する。本発明は、シストロフィン−糖蛋白質複合体の非−ジストロフィン成分の欠失を検出することによりデュジェンヌ及びベラカー筋ジストロフィーの新規及び代替診断法を提示し、他の形態の筋ジストロフィーの診断法を与えることができる。

図面の簡単な説明図１は、哺乳類骨格筋からのシストロフィン−糖蛋白質複合体の調製を構成する段階のフロー図である。

図２は、シストロフィン−糖蛋白質複合体に対する多クローン性抗体の生成を構成する段階のフロー図である。

図３は、シストロフィン−糖蛋白質複合体の非−ジストロフィン成分に対する多クローン性抗体の生成を構成する段階のフロー図である。

発明の詳細な説明シストロフィンは、デュシェンヌ筋ジストロフィーに対応する欠陥遺伝子の高分子量蛋白質生成物である。部分的に本発明は、シストロフィンが正常な骨格筋の筋細胞膜中の大オリゴマー複合体の成分として存在するという発見に基づいている。蛋白質及び糖蛋白質が、本文でシストロフィン−糖蛋白質複合体と呼ぶこの複合体の他の成分を構成する。特に他の成分は、１５６ｋＤａの糖蛋白質、５０ｋＤａの糖蛋白質、４３ｋＤａの糖蛋白質、３５ｋＤａの糖蛋白質及び分子量が５９ｋＤａの蛋白質のトリプレットを含む。これらの成分は、シストロフィン− 糖蛋白質複合体の非−ジストロフィン成分と呼ばれる。複合体を可溶化するのに１．０％のディジトニン（洗剤）が必要なので、シストロフィン−糖蛋白質複合体の少なくともひとつの成分は、膜内在住蛋白質である。

シストロフィン−糖蛋白質複合体は、洗剤により可溶化した骨格筋膜から、図１に示す通りアフィニティークロマトグラフィー及び濃度勾配超遠心を用いて単離することができる。レクチンは、ある種の糖又はオリゴ糖と結合する蛋白質又は糖蛋白質である。この性質を利用して複合体混合物からある種の糖蛋白質を単離することができ、その多くがグリコジル化されている膜蛋白質の精製のための一般的方法として非常に有用である。本発明の場合、シストロフィン−糖蛋白質複合体の結合成分は、複合体の糖蛋白質成分と結合するレクチンとの緊密な複合体として単離することができる。レクチンは典型的にクロマトグラフィーゲル（すなわちセファロース、アガロースなど）のような固体担体とカップリングさせ、レクチンを結合したゲルを含むクロマトグラフィーカラムに膜成分の複合体混合物を通過させる。膜成分の糖蛋白質はレクチンと結合し、一方混合物の他の成分はカラムを通過する。下記により詳細に記載する通り、多様なレクチンをシストロフィン−糖蛋白質複合体の単離のためのアフィニティーに基づく方法に使用することができる。

シストロフィン−糖蛋白質複合体は、濃度勾配超遠心を用いてさらに精製することができる。上記のアフィニティーカラムからの溶離物を遠心管中の溶液の上部に幅の狭いバンドとしてのせる。溶離物の沈降成分を対流混合に対して安定化するために、バンドの下の溶液はスクロースなどの不活性で溶解度の高い物質の、徐々に濃度を増加させた溶液を含む（濃度勾配）。このような条件下で溶離物中の異なる留分は異なる速度で沈降し、区別できるバンドを形成し、それを別々に集めることができる。各成分が沈降する速度は、その大きさ及び形に依存し、通常その沈降係数又はＳ値と表される。

今日の超遠心機は、最高約８０．ＯＯＯｒｐｍの速度で回転し、最高約５００．０ＯＯｘ重力の力を出す。このような大きな力で、ｔＲＮＡ及び簡単な酵素などの比較的小さい部類の巨大分子でさえその大きさに基づいて互いに分離する。この方法を用いてその移動を種々の大きさの標準試料の移動と比較することにより、シストロフィン−糖蛋白質複合体の大きさは約１８８であると算出された。

シストロフィン−糖蛋白質複合体の単離に用いることができる他の形態のアフィニティークロマトグラフィーは、イムノアフィニティー精製として周知である。

この方法は、多クローン性及び単クローン性抗体、ならびに選ばれたレクチンの独特の高い特異性を利用する。そのような高度に特異的な分子は、迅速で選択的な抗原の精製のための非常に有用な道具である。原則的に抗原をカラムの担体上にカップリングさせ（固定化し）、他の多くの抗原を含む混合物から抗原を選択的に吸着するのに用いる。抗体が親和力を持たない抗原を洗い出し、その後精製された抗原を溶離緩衝液を用いて結合抗体又はレクチンから溶離することかできる。シストロフィン複合体成分のイムノ精製に有用な抗体及びレクチン分子の例は、下記に詳細に記載する。

シストロフィン−糖蛋白質複合体の成分の分離及び単離は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により行うことができる。この方法では、蛋白質をアニオン性洗剤、ナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ又はナトリウムラウリルサルフェート）と反応させ、負に帯電した複合体を形成する。蛋白質に結合するＳＤＳの量、及び結果的に複合体の電荷は、その大きさと大体比例する。通常１グラムの蛋白質当たり約１．４グラムのＳＤＳが結合するが、この原則には例外がある。蛋白質は一般にＳＤＳとの結合により変性し、可溶化され、複合体は蛋白質の分子量と大体比例する長さの扁長の楕円体又は棒を形成する。従って酸性又は塩基性等電点の蛋白質は、負に帯電した複合体を形成し、ポリアクリルアミドゲルのふるい一様マトリックスを通る電気泳動により電荷及び大きさの差に基づいて分離される。５ＤＳ−ＰＡＧＥの熟練者はこの方法を用いて、例えばスクロース濃度勾配超遠心又はイムノアフィニティークロマトグラフィーにより単離したシストロフィン−糖蛋白質複合体を日常的操作で分離することができる。

シストロフィン−糖蛋白質複合体の成分の単離の別の方法は、ゲル濾過高圧液体クロマトグラフィーである。この方法は、ＳＤＳゲル電気泳動より時間がかからない上に、分離蛋白質を容易に定量及び回収することができ、分解能が従来の材料を用いたゲル濾過による場合より優れている。

ゲル濾過の担体中に蛋白質を受け入れることができる体積は、その大きさ及び形に依存する。従って分子量の決定のために、試料蛋白質はキャリブレーションに使用する蛋白質と同一の形を有していなければならない。ＳＤＳなどの変性剤の存在下で、還元状態の蛋白質はすべて直鎖ランダムコイルの構造をとり、その分子半径は分子量と比例する。このような条件下で蛋白質の分子量はカラムからの溶離体積により表すことができる。

変性は蛋白質の極限粘度数を増加させ、従って分子寸法を増加させる。

従って変性条件下でゲル濾過マトリックスの分子量排除限界は、変性剤の不在下の場合より低い。変性条件下のＨＰＬＣゲル濾過に使用するカラム担体の中でＴＳＫ−Ｇ−３０００ＳＷ型のものが分子量が７０゜０００以下の蛋白質に適し” ｃ−オリ、ＴＳＫ−Ｇ−４０００ＳＷ型を分子量が最高１６０，０００の蛋白質に使用することができる。ゲル濾過高圧液体クロマトグラフィーの熟練者は、スクロース濃度勾配超遠心又はイムノアフィニティークロマトグラフィーにょる単離の後に容易にシストロフィン−糖蛋白質複合体の成分を分離することができる。

シストロフィン−糖蛋白質複合体の非−ジストロフィン成分に特異的な単クローン性及び多クローン性抗体は、本発明の単離及び診断法に特に有用である。本発明で有用な単クローン性抗体は、周知のハイブリドーマ法によって得る。動物をシストロフィン−糖蛋白質複合体で免疫する。その後免疫動物からの抗体生産細胞と骨髄腫などの不滅化細胞の間の融合細胞ハイブリッドを形成する。

好ましい具体化の場合、本発明の抗−非−シストロフィン成分率クローン性抗体は、ａ）抗体を分泌しないマウス骨髄腫又はハイブリドーマとｂ）シストロフィン−糖蛋白質複合体に対して免疫したマウスから得た抗体を分泌するマウス膵臓細胞の融合により形成したマウスハイブリドーマにより製造する。

典型的にマウスは、シストロフィン−糖蛋白質複合体の一次注射、及びそれに続く何回ものシストロフィン−糖蛋白質複合体の追加刺激注射により免疫する。免疫法の間又は後にマウスの血清をスクリーニングし、複合体に応答する実質的免疫が誘発されたマウスを同定することができる。選ばれたマウスから膵臓細胞を得、融合を行う。適した融合法は、センダイウィルス法（Ｋｏｈｌｅｒ、Ｇ、　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ。

Ｃ，、Ｎａｔｕｒｅ、’ｌ旦６　：　４９５　（１９７５））又はポリエチレングリコール法（Ｋｅｎｎｅｔ、Ｒ，Ｈ，、、”ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ−−Ａ　Ｎｅｗ　Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ、”Ｅｄｓ、Ｒ，Ｈ，Ｋｅｎｎｅｔ、Ｔ、Ｊ、ＭｃＫｅｒｎ　ａｎｄ　Ｋ、Ｂ。

Ｂｅｃｈｔｏｌ、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８０））である。

その後ハイブリドーマを抗−非−シストロフィン成分抗体の生産に関してスクリーニングする。適したスクリーニング法は、固相ラジオイムノアッセイである。

固相免疫吸着剤は、シストロフィン−糖蛋白質複合体又は非−ジストロフィン成分を不溶性マトリックスにカップリングさせることにより調製する。免疫吸着剤をハイブリドーマの培養上澄み液と接触させる。インキュベーション期間の後、固相を上澄み液から分離し、マウス免疫グロブリンに対する標識抗体と接触させる。免疫吸着剤と会合した標識がシストロフィン−糖蛋白質複合体又は非−ジストロフィン成分と反応性のハイブリドーマ生産物の存在を示す。その後ハイブリドーマ生産物を、天然及び合成のシストロフィン−糖蛋白質複合体の成分と反応する能力に関して調べる。

単りローン性抗−非−ジストロフィン成分抗体は、抗−非一ジストロフィン成分抗体生産ハイブリドーマ細胞をマウスの腹膜腔中に注入し、適した時間の後に高力価の均質抗体を与える液体をマウスから収穫することにより大量に生成することができる。単クローン性抗体をそれから単離する。別法として、抗−非一ジストロフィン成分抗体生産細胞を試験管内で培養し、分泌された抗−非一ジストロフィン成分抗体を細胞培養培地から直接単離することにより、抗体を生成することができる。

抗体生産細胞を形成する別の方法は、ウィルス又は腫瘍形質転換である。例えば非−ジストロフィン成分特異的抗体を生産した８９２８球は、エプスタイン−パールウィルスなどのウィルスに感染し、形質転換を起こし、不滅の抗体−生産細胞を与える。Ｋｏｚｂｏｎ　ａｎｄ　Ｒｏｄｅｒ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ、４　（３）ニア２−７９　（１９８３）参照。

多クローン性抗体は、それぞれ図２及び３に示す通りシトロフィン−糖蛋白質複合体の粗試料又は精製した複合体の非−ジストロフィン成分で動物を免疫することにより生成することができる。動物を、複合体の成分と反応性の抗体が生産される条件下に保つ。抗体の所望の力価に達したら動物から血液を集める。多クローン性抗体を含む血清（抗血清）を他の血液成分から分離する。多クローン性抗体−含有血清は、任意に特定の種類の抗体（例えばＩｇＧ又はＩｇＭ）を含む留分にさらに分離することができる。

本発明の基礎となる観察は、シストロフィン−糖蛋白質複合体の非−ジストロフィン成分の不在又は量の減少と筋ジストロフィーへの罹患の間に強い相関関係があるという観察である。下記の実施例に記載する通り単クローン性又は多クローン性抗体を用いて複合体の特定の非−ジストロフィン成分の不在又は減少を検出することができる。マウス及びヒトの両方のジストロフィー組織の試料において、複合体の非−ジストロフィン成分の減少を検出することにより筋ジストロフィーを診断することができる。

本発明の診断法の好ましい具体化の場合、非−ジトロフィン成分に対する抗体と複合体を形成するのに使用できる該成分を得られるように筋肉試験切除試料を処理する。筋肉試料は、外科手術的試験切除により患者から得る。試験切除部位は、シトロフィーではないかと思われるいずれの骨格筋であることもできる。しかし肩胛及び骨盤帯の回りの筋肉群が最も冒され、最も普通の試験切除部位のようである。得る筋肉の量は、筋膜からシストロフィン−糖蛋白質複合体の成分を抽出し、本出願内に記載の診断法によりその存在を検出するのに十分な量でなければならない。抽出の他の方法も使用することができる。

５００ｍｇ以上の試験切除試料の場合、手動又はモーター駆動のガラスホモジナイザー、ワーリングブレードブレンダ−ホモジナイザー又は超音波プローブなどの装置を用いて機械的撹拌により筋肉組織を均質化することができる。均質化は、２０ｍＭのビロリン酸塩、２０ｍＭのすン酸ナトリウムー水和物、１ｍＭの塩化マグネシウム、０．３０３Ｍのスクロース、０．５ｍＭのＥＤＴＡを種々のプロテアーゼ阻害剤、例えばアプロチニン（０，５μｇ／ｍｌ）、ベンズアミジン（１００μｇ／ｍｌ）、ヨードアセトアミド（１８５μｇ／ｍｌ）　、ロイペプチン（０゜５μｇ／ｍｌ）、ペプスタチンＡ　（０，５μｇ／ｍｌ）及びＰＭＳ　Ｆ（４０μｇ／ｍｌ）と共に含む、ｐＨが７．　０の緩衝液中で行う。均質ミクロソームを調製することができる。その後ミクロソームを生理食塩水で洗浄し、洗剤及びプロテアーゼ阻害剤を含む塩水中で可溶化する。

ミクロソームの可溶化の後、試料をナトリウムＳＤＳで処理する。本発明の場合ＳＤＳは、シストロフィン−糖蛋白質複合体の結合成分を解離させ、その分離ができるように働（。

５００ｍｇ以下の筋肉試験切除試料の場合、別の抽出法を用いることができる。

試料を液体窒素中で凍結し、乳鉢と乳棒を用いて砕き、ここに参照として挿入するＨｏｆｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、（Ｎ、Ｅｎ、ｇ。

Ｊ、ｏｆ　Ｍｅｄ、３１８：１３６３−１３６８　（１９８８））により記載の通りＳＤＳで処理することにより電気泳動の準備をする。

その後ＳＤＳ処理試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により電気泳動させる。試料を電気泳動系の堆積ゲルに導入する。電場をかけるとイオンが電極に向かって動くが、堆積ゲル中を支配するｐＨでは蛋白質−８ＤＳ複合体の移動度は、塩化物イオン（系全体に存在）とグリシネートイオン（溜緩衝液中に存在）の中間である。塩化物イオンの移動度が最も大きい。次に大きなイオンが堆積ゲル中の狭い領域に濃縮されるが、そこでは有効に分離されない。移動イオンが分離ゲルに達すると、その各々の移動度がそこを支配するｐＨにより変化し、グリシネートイオンの前面が蛋白質−３ＤＳ複合体領域に追い付き、それを均一に緩衝された電場中に大きさと電化に従って互いに分離させて残す。

蛋白質（又はむしろそのＳＤＳとの複合体）は、大部分その大きさの差に基づいて分離されるので、ＳＤＳゲル中の電気泳動移動度を用いて周知の大きさの蛋白質との比較により蛋白質の分子量の算出をすることができる。

５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分離に続いて、シストロフィン−糖蛋白質複合体の分離成分をゲルマトリックスから他の担体に移す。成分は、もとの蛋白質分離の正確な複製を形成してゲルからフィルター又は膜上に移されるが、移された蛋白質はさらに研究することができる。この移動は、蛋白質プロットとして周知である。

プロットには電気プロット及び受動拡散プロットの２種類の普通の方法がある。

移動に使用することができる担体マトリックスには、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、ジアゾペーパー、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）　、アニオン交換紙及び膜が含まれる。移された蛋白質の検出は、アミドブラック又はクーマシーブリリアントブルーなどの一般的蛋白質染料を用いて行うことができる。別の場合、シストロフィン−糖蛋白質複合体の周知の非−ジストロフィン成分に特異的な抗体を検出可能なレポーター基で標識し、種々の成分と結合させるのに使用する。この方法の例は、周知のウェスターン法である。

別法として、組織試料（例えばヒト試験切除試料）を、イムノペルオキシダーゼ染色法などの免疫組織化学的方法で単クローン性又は多クローン性抗体によりシストロフィン−糖蛋白質複合体の成分の存在を調べることができる。さらに蛍光抗体法を用いてヒト組織試料を調べることができる。典型的案の場合、凍結非固定組織試験切除試料のクリオスタットセクションを含むスライドを空気乾燥し、室温で加湿した室内で抗−非−シストロフィン成分抗体調剤と共にインキュベートする。スライドを単クローン性抗体に対する蛍光標識抗体の調剤と共に層にする。試料中の染色パターン及び強度を蛍光顕微鏡により決定する。

本発明の抗体を、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）に使用してシストロフィン−糖蛋白質複合体の非−ジストロフィン成分の不在又は存在を決定することができる。測定するべき非−ジストロフィン成分に対する抗体を固体担体、はとんどの場合ポリスチレンミクロタイタープレートに吸着させる。担体への抗体の塗布及び洗浄の後、可溶化した試料を加える。抗体に特異的な非−ジストロフィン成分が存在する場合、それらは吸着抗体と結合する。次に、やはり非−ジストロフィン成分と結合する共役体を加える。共役体は酵素が共有結合した二次抗体分子である。酵素に関する発色性物質の添加の後、生成した着色反応生成物の強度は、共役酵素の量に比例し、従って間接的に結合非−ジストロフィン成分の量と比例する。発色の強度が非−ジストロフィン成分の存在量と比例するので、一連の非−ジストロフィン成分濃度を標準として発色する色の強度を決定することにより、未知試料中の非−ジストロフィン成分の量を算出することができる。Ｖｏｌ　ｌｅｒ、　Ａ、　、Ｂｉｄｗｅｌｌ、Ｄ、Ｅ、ａｎｄ　Ｂａｒｔｌｅｔｔ、Ａ、、Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ（ＥＬＩＳＡ）：Ａ　ｇｕｉｄｅ　ｗｉｔｈ　ａｂｓｔｒａｃｔｓ　。

ｆ　ｍ１ｃｒｏｐｌａｔｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｄｙｎａｔｅａｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ　（１９７９）に記載されここに参照として挿入する通り、このアッセイの種々の変法が存在する。

ここで以下の実施例により本発明をさらに及び特定して例示する。他に特定しなければ部及びパーセントはすべて重量による。

格筋から重いミクロソームを調製した。ミクロソームを５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７゜４．０．１６５Ｍのスクロース、０．１ｍＭのＰＭＳＦ及び０．７５ｍＭのベンズアミジン中の０．６ＭのＫＣｌで２回洗浄し、収縮蛋白質を除去した。Ｃａｍｐｂｅｌｌ、に、Ｐ、ａｎｄＫａｈｌ、Ｓ、Ｄ、、Ｎａｔｕｒｅ、３３８：２５９−２６２　（１９８９）中に以前に記載されている通り、１ｇのＫＣｌ−洗浄膜を１．０％ディジトニン、０．５ＭのＮａＣ１及びプロテアーゼ阻害剤中で可溶化した。Ｉｍａｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ、、（Ｊ、ｏｆ　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６２　：１６６３６−１６６４３　（１９８７））に記載の通り、イムノアフィニティークロマトグラフィーによりリアノジンレセブターを除去した後、ディジトニンー可溶化膜を４０ｍＬのＷＧＡセファロースカラム中で終夜循環し、強力に洗浄し、その後カラム体積の３倍の０゜３Ｍ　Ｎ−アセチルグルコサミンで溶離した。

シストロフィンを含む溶離留分を３ｍｌのＤＥＡＥセルロースカラムに適用し、緩衝液Ａ（０，１％ディジトニン、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ。

ｐＨ７，４，０，７５ｍＭベンズアミジン、０．１ｍＭ　ＰＭＳＦ）中、以下のＮａＣ１濃度で順に溶離した：　ＯｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、１１０ｍＭ及び１７５ｍＭ０緩衝液Ａ中に０，５Ｍ　ＮａＣ１及び０．０１％　ＮａＮ３を含むスクロース濃度勾配（１２，５ｍｌ、５％から２０％まで直線的スクロース）を、Ｂ　ｅ　ｃ　ｋｍａｎｆｉ度勾配形成器を用いて調製した。ＤＥＡＥ−カラムの１７５ｍＭＮａＣ］洗浄から留分２　（３ｍｌ）として溶離したシストロフィン−糖蛋白質複合体をｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１００（Ａｍｉｃｏｎ）中で０゜５ｍｌに濃縮し、スクロース勾配上で層とし、１７５ｍＭのＮ　ａ　Ｃ】及び０．０１％のＮａＮ３を含む緩衝液Ａ０．５ｍｌと重ねた。

勾配を４℃にてＢｅｃｋｍａｎ　ＶＴｉ　６５．１　垂直ローター中、２００゜０００ＸＧで９０分間遠心した。ｌ５ＣＯＭｏｄｅｌ　６４０濃度勾配フラクショネーターを用いて勾配の上部から留分（０，６ｍ１）を集勾配留分を５ＤＳ− ＰＡＧＥ　（３％から１２％の勾配ゲル）により分離し、クーマシーブルーで染色するか（ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１００を用いて３００μｌの留分を５０μｌに濃縮）、又はニトロセルロースに移し、種々の抗体で染色した。ゲルの列をＨｏｅｆｅｒ　Ｇ５３００走査デンシトメーターで走査し、Ｇ５−３６０デ一タ分析ソフトウェアで分析した。

シストロフィンのＣ−末端を示す化学合成デカペプチドに対する多クローン性抗血清を、５ｔｒｙｎａｄｋａ、Ｎ、Ｃ，Ｊ、、ｅｔ　ａｔ、。

前に記載された通りニューシーラント白うさぎ中に誘発した。Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ、Ａ、○、、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　Ｍｏｔｉｌｉｔｙａｎｄ　Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ、９：１６４−１７４（１９８８）に記載の通り、うさぎの骨格筋膜で免疫し、ＷＧＡ溶離物で追加刺激した雌のｂａｌｂ／ｃマウスからハイブリドーマを得た。

順次勾配留分のクーマシープルーー染色ゲルから、シストロフィン−糖蛋白質複合体が明らかに電圧−感応性ナトリウムチャンネル及びジヒドロピリジンレセプターから分離されたことが証明された。その移動を標準Ｂ−ガラクトシダーゼ（１５，９３）、チログロブリン（１９，２８）及びジヒドロピリジンレセプター（２ＯＳ）の移動と比較することによりシストロフィン−糖蛋白質複合体の大きさが約１８８であると算出された。極大シストロフィン−糖蛋白質含有勾配留分のデンシトメトリー走査により、シストロフィンと共に精製された数種の蛋白質が明らかになった：見掛けのＭ、が１５５ｋＤａの、幅広く散漫に染色される成分、８８ｋＤａの蛋白質、５９ｋＤａを中心とする蛋白質のトリブレット、５０ｋＤａの蛋白質、４３ｋＤａにおける蛋白質ダブレット、３５ｋＤａの蛋白質及び２５ｋＤａの蛋白質。

シストロフィン−糖蛋白質複合体の糖蛋白質成分を同定するために、スクロース勾配留分を電気泳動により分離し、ニトロセルロースに移し、ペルオキシダーゼ −共役ＷＧＡで染色した。見掛けのＭ、が１５６ｋ、５０ｋ、４３ｋ及び３５にの４種類のＷＧＡ−結合蛋白質がシストロフィンと緊密に共精製されることが見いだされた。４種類のＥＧＡ−結合蛋白質はすべてペルオキシダーゼ−共役コンカナバリンＡによっても染色される。さらにクーマシーブルー染色により明らかな４３ｋＤａの蛋白質ダフレットのＭ、が低い方の成分もコンカナバリンＡによって染色される。

複合体の種々の成分に対して誘発した抗体を用いてシストロフィン−糖蛋白質複合体をさらに特性化した。ヒトのシストロフィンの予想Ｃ−末端アミノ酸配列を示す化学合成デカペプチドで免疫したうさぎからの血清は、１種類のＭ、の蛋白質を染色することがわかった。この蛋白質は、年子りローン性抗−ジストロフィン抗体で染色したシストロフィンの主要イソフオームと共移動した。

ＷＧＡ−セファロースから溶離した筋肉蛋白質に対する単クローン性抗体のライブラリも、シストロフィン−糖蛋白質複合体の成分に対する反応性に関してスクリーニングした。筋細胞膜単クローン性抗体上にのみ蛍光抗体染色を示す６個のハイブリドーマ中、ＸｌＸＣ２及びＶＩＡ４□がイムノプロット上のシストロフィンを染色することが見いだされた。シストロフィン単クローン性抗体は両方ともＩｇＭサブタイプであり、本来の、及び変性シストロフィンの両方を認識した。単クローン性抗体ＸｌＸＣ２は、より豊富なイソフオームと共精製されるらしいシストロフィンのＭ、が低い方の少量のイソフオームも認識した。

他の筋細胞膜特異的単クローン性抗体の２つは、シストロフィン−糖蛋白質複合体の成分に特異的である。５０ｋＤａ糖蛋白質を単クローン性抗体ＩＶＤ３＋で染色した。単クローン性Ｉ　Ｖ　Ｄ　３　＋は、５０ｋＤａ糖蛋白質の非還元型のみを認識し、交差反応性は高くない。単クローン性抗体Ｖ　Ｉ　Ａ　４　＋は、シストロフィンと共精製される１、５５ｋＤａ糖蛋白質を染色した。単クローン性抗体Ｖ　Ｉ　Ａ　４　＋は、１５６ｋＤａ糖蛋白質の変性型を認識し、交差反応性が高い。

うさぎ筋肉中のシストロフィン−糖蛋白質複合体の成分の免疫極在化うさぎの胃からの固定８μｍ横クリりスタットセクションの間接蛍光抗体標識を、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ、Ａ、Ｏ，ｅｔ　ａｌ、、同上に記載の通りに行った。セクションは、リン酸塩緩衝塩水中の５％の正常な羊の抗血清と共に２０分間予備インキュベートし、その後−次抗体（ハイブリドーマ上澄み液又は１　：　１０００希釈抗血清）と共に３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、セクションをＦ　Ｉ　ＴＣ−標識率Ｆ　（ａｂ’　）２抗−マウスＩｇＧ又は抗−うさぎＩｇＧの１＝５０希釈液を含むＰＢＳ中で３７℃にて３０分間さらにインキュベートし、その後Ｌｅｉｔｚ蛍光顕微鏡で調べた。非−免疫血清によるクリオスタットセクションの染色は観察されず、蛍光−標識二次抗体による組織への非特異的結合もなかった。

ヒトのシストロフィンのＣ−末端アミノ酸配列に対する抗血清は、細胞の円周上のみに蛍光抗体染色を示し、シストロフィンがうさぎ骨格筋の筋細胞膜に局在していることを示している。この観察は、うさぎ骨格筋をシストロフィンに対する単クローン性抗体ＸｌＸＣ２で染色することにより確認され、再びうさぎ骨格筋の筋細胞膜中で局在化が観察された。単クローン性ＩＶＤ３＋で染色した５０ｋＤａ糖蛋白質は、うさぎ骨格筋の筋細胞膜のみに局在していた。単クローン性抗体ＶＩＡ４　ｌは、弱いが特異的な筋細胞膜の蛍光抗体染色を示し、本来の１５６ｋＤａ糖蛋白質への低い親和性と一致している。蛍光抗体法の結果と一致して、筋細胞膜蛋白質の非常に豊富なうさぎの膜試料は、シストロフィン、１５６ｋＤａ及び５０ｋＤａ糖蛋白質も実質的に豊富である。シストロフィン、５０ｋＤａ糖蛋白質又は１５５ｋＤａ糖蛋白質の場合の蛍光抗体染色は、速筋繊維及び遅筋繊維に同様に分布した。

シストロフィン−糖蛋白質複合体の免疫吸着Ｃａｍｐｂｅ１１．に、Ｐ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、ｏｆ　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、２６２：６４６０−６４６３　（１９８７）に記載の要領で調製したイムノアフィニティービーズを０．５ＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ａを用いて平衡化し、その後上記のＤＥＡＥ−セファロースカラムの１．７５ｍＭ　ＮａＣ１洗浄からの留分２０．７５ｍ１と共に終夜（１２時間）インキュベートした。ベレット化した後、上澄み液をデカンテーションしく排液）、アフィニティービーズを０．５ＭのＮａＣ１を含む緩衝液Ａの０．７ｍｌのアリコートで５回洗浄した。各アフィニティーカラムからの排液及び５回の洗浄液を集め、ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　１００　（Ａｍｉ　ｃｏｎ）中で３　’７５　ｕ　ｌに濃縮した。さらに０．７５ｍ１の留分２を緩衝液Ａで４．２ｍｌに希釈し、３７５μｍに濃縮して標準試料として用いた。カラム排液を、上記の通りに５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、イムノプロットした。

ＸｌＸＣ２（抗−ジストロフィン）及びＩＶＤ３＋　（抗−５ＱｋＤａ糖蛋白質）イムノアフィニティービーズからの排液は、クーマシーブルー染色により検出された通り、シストロフィン、５９ｋＤａ　トリプレット、５０ｋＤａ糖蛋白質、４３ｋＤａダブレツト又は３５ｋＤａ糖蛋白質を含まなかった。ＸｌＸＣ２（抗−ジストロフィン）及びＩＶＤ３゜（抗−５０ｋＤａ糖蛋白質）イムノアフィニティービーズの両方が出発材料からシストロフィンを定量的に除去したことが明らかであった。１５６ｋＤａ糖蛋白質及び５０ｋＤａ糖蛋白質の場合の排液の分析により、ＸｌＸＣ２及びＩＶＤ３＋イムノアフィニティービーズの両方が微量を除いてすべてのこれらの各糖蛋白質を排液から選択的に吸着し、一方で電圧 −感応性ナトリウムチャンネル及びジヒドロピリジンレセプターのアルファ１と及びアルファ２サブユニットを排液中に残したことが明らかになった。ペルオキシダーゼ−共役ＷＧＡにより検出された通り、４３ｋＤａ及び３５ｋＤａ糖蛋白質もこの排液から吸着された。ゲル上で分離したイムノアフィニティービーズのイムノプロットは、シストロフィン、１５６ｋＤａ及び５０ｋＤａ糖蛋白質がビーズにより保持され、選択的に蛋白質分解されないことを示した。単クローン性ＶＩＡ４＋（抗１５６ｋＤａ糖蛋白質）を用いた初期の実験は、この種の実験に成功するには本来の１５６ｋＤａ糖蛋白質に対するその親和性が低すぎるこ上記の通り筋肉ホモジネートを１４，０ＯＯＸＧにて１５分間遠心し、その後上澄み液を１２５．ＯＯＯｘｇにて３０分間ペレット化し、続いてＫＣＩ洗浄することにより、標準試料及びジストロフィーマウス（ｍｄｘ）からの膜を１０％スクロース、７６．８ｍＭアプロチニン、０．８３ｍＭベンズアミジン、１ｍＭヨードアセトアミド、１．１ＭＭロイペプチン、０．７μＭペプスタチンＡ、０．２３ｍＭ　ＰＭＳＦ。

２０ｍＭトリス−マレート、ｐＨ７，０中で調製した。標準試料及びジストロフィーマウスの筋膜を上記の通り５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムツブロフトにより分析した。名試料中の１．５５　ｋ　Ｄ　ａ糖蛋白質の量は、＋２５■−標識羊抗− マウス二次抗体と共にインキュベートした同一のプロットのオートラジオグラフからデンシトメトリーにより算出した。

シストロフィンのＣ−末端デカペプチドに対する多クローン性抗血清を用いた染色により、シストロフィンがジストロフィーマウスの膜には完全に存在しないことが明らかになった。さらに正常なマウスとジストロフィーマウスを、１５６ｋＤａ糖蛋白質に対する単クローン性抗体ＶＩ　Ａ　４　＋による免疫染色を用いて比較すると、ジストロフィーマウスの膜に１５６ｋＤａ糖蛋白質が存在しないか、又は非常に減少していることが明らかになった。同様のトランスファーをリアノジンレセブター又はジヒドロピリジンレセプターに対する年子クローン性抗血清で染色すると、標準試料及びジストロフィーマウスの筋膜の間に差はなかった。

５０ｋＤａ糖蛋白質に対する単クローン性抗体ＩＶＤ３＋は、正常なマウスの膜と交差反応せず、従って評価できなかった。１５６ｋＤａ糖蛋白質の不在は、標準及びジストロフィーマウスからの単離膜の代わりにＳＤＳ筋肉抽出物を用いても確認された。１２５１−標識二次抗体、及び４種類の標準ならびに４種類のジストロフィーマウスからの金膜試料を用いたジストロフィー筋膜中に残る１５６ｋＤａ糖蛋白質の算出により、ジストロフィー筋肉における平均８５％の減少が明らかになった。

正常及びジストロフィーのヒト筋肉試験切除のイムノプロット分析凍結した筋肉試験切除試料（５０ｍｇ）を液体窒素中で乳鉢と乳棒を用いて砕き、その後Ｈｏｆｆｍａｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ。

ｏｆ　Ｍｅｄ、、３１８：１３６３−１３６８　（１９８８）に記載の通りに電気泳動用に調製した。微粉砕筋肉試料を１０体積の５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（１０％ＳＤＳ、２Ｍスクロース、４％２−メルカプトエタノール、０．００２％ブロモフェニルブルー、２６０ｍＭトリス−ＨＣｌ５ｐＨ６，８）に移し、渦撹拌し、沈澱物質を落ち着かせた。５ＤＳ−抽出筋肉試料のアリコート（５０μ ｌ）を５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノプロットにより分析し、１５５ｋＤａ糖蛋白質の量を算出した。

ジストロフィー試料は、間接蛍光抗体鏡検法及びイムノプロットにより、シストロフィンに対する抗体による染色を示さなかった。正常な筋肉抽出物と対照的に、３個のＤＭＤ試料は１５６ｋＤａ糖蛋白質に関する染色が非常に減少していた。他方、Ｃａ”−依存性ＡＴＰアーゼに対する単クローン性抗体で染色した同一のイムノプロットにより、正常及びジストロフィー筋肉試料の間に染色強度の差は明らかにされなかった。

この場合も、１５６ｋＤａ糖蛋白質の量は、ＤＭＤ試料中で約９０％減少すると算出された。

シストロフィン−糖蛋白質複合体の種々の成分に特異的な多クローン性抗血清を２通りの方法で調製した。第１法では（Ｓｈａｒｐ、Ａ、Ｈ。

ａｎｄ　Ｃａｍｐｂｅｌ　Ｉ、に、Ｐ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６６：９１６１−９１６５　（１９８９）を参照）、シストロフィン−糖蛋白質複合体（約５００μｇ）の各成分を、１％の２−メルカプトエタノールの存在下で５ＤＳ− ＰＡＧＥにより分離した。ゲルを、１０％酢酸、２５％イソプロパツール中のクーマシーブルーで１０分間染色し、蒸留水中で脱色した。各バンドをゲルから切除し、モルモットの免疫に使用するまで１ｍｌのＰＢＳ中で凍結した。別法として、緩衝液Ａ（０，１％ディジトニン、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，４，０，７５ｍＭベンズアミジン、０．１ｍＭ　ＰＭＳＦ）中の５０μｇのシストロフィン−糖蛋白質複合体を免疫原として用いた。１４日、及びその後１カ月毎に５μｇの適した抗原を用いて動物を追加刺激した。十分な力価に達してから毎週抗血清を集めた。シストロフィン−糖蛋白質複合体の各成分に特異的な抗血清を、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した各蛋白質のイモピロン−Ｐトランスファーを用いてアフィニティー精製した。

Ｅｒｖａｓｔｉ　ｅｔ　ａｌ、（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６６：９１６１− ９１６５　（１９９１））により記載の通りに精製シストロフィン−糖蛋白質複合体を用いて免疫したモルモットからの抗血清は、５ＱｋＤａシストロフィン− 会合糖蛋白質を除いた複合体の成分すべてに対して免疫活性を示した。５ＤＳ− ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離したシストロフィン−糖蛋白質複合体の各成分を含むイモピロン−Ｐｈランスファーストリップを、１５６ｋＤａ、５９ｋＤａ、４３ｋＤａ及び３５ｋＤａシストロフィン−会合蛋白質に特異的な抗体のアフィニティー精製に用いた。５０ｋＤａシストロフィン−会合糖蛋白質に対する抗体は、還元５０ｋＤａシストロフィン−会合糖蛋白質を含むＳＤＳポリアクリルアミドゲルスライスを用いてモルモットを免疫することにより得た抗血清からアフィニティー精製した。骨格筋ミクロソーム、筋細胞膜及び精製シストロフィン−糖蛋白質複合体のイムノプロット染色は、アフィニティー精製抗体のそれぞれが、それらが誘発され、それに対してアフィニティー精製された蛋白質と同一の分子量の蛋白質のみを認識することを示した。これらのデータは、１５６ｋＤａ、５９ｋＤａ、５０ｋＤａ、４３ｋＤａ及び３５ｋＤａシストロフィン−会合蛋白質がより大きな蛋白質又はシストロフィンの蛋白質分解フラグメントではないことを示唆している。

複合体成分の間の化学量論的関係６種類のシストロフィン−糖蛋白質複合体の試料の電気泳動により分離した成分を含むクーマシープルーー染色５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルノデンシトメトリー分析は、５９ｋＤａ、５０ｋＤａ、４３ｋＤａ。

３５ｋＤａ及び２５ｋＤａシストロフィン−会合蛋白質がシストロフィンに対して１．６±０．２２．０．８２±０．１１．０．９５±０．１４．１．８±０，１９及び領　３６±０．１２の平均化学量論比で存在することを示した。しかし１５６ｋＤａシストロフィン−会合糖蛋白質は、クーマシーブルーによる染色が悪いので、シストロフィンに対するその化学量論を決定できなかった。従って［１２５）］−蛋白質Ａと共にインキュベーションした後イムノプロットのオートラジオグラムから抗体染色強度を定量し、筋細胞膜及び精製シストロフィン−糖蛋白質複合体中のシストロフィンのクーマシーブルー染色強度と比較した。これらの比較により、シストロフィン−糖蛋白質複合体のすべての成分が定量的に共濃縮されており、１５６ｋＤａシストロフィン−会合糖蛋白質がシストロフィンと化学量論的であることが示された。

シストロフィン−会合蛋白質の免疫極在化うさぎ骨格筋の横断クリオスタットセクションの間接的蛍光抗体標識により、シトロフィン−会合蛋白質の細胞内極在化を決定した。１５６ｋＤａ、５９ｋＤａ、５０ｋＤａ、４３ｋＤａ及び３５ｋＤａシストロフィン−会合蛋白質に特異的なアフィニティー−精製多クローン性抗体は、筋細胞膜を蛍光抗体染色し、これらの蛋白質と筋繊維原形質膜、又は表面膜の下の細胞内細胞骨格との独特の会合を示した。シストロフィン−会合蛋白質に対する５種類の多クローン性抗体はすべて速繊維及び遅繊維の間に等しく分布し、神経筋接合部において豊富な染色を示した。

それが細胞骨格蛋白質であるという予測と一致して、シストロフィンは骨格筋膜、及びトルベド力すホルニ力（Ｔｏｒｐｅｄ、ｏ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）の電気器官から単離した膜から、洗剤の不在下で簡単なアルカリ処理により抽出することができる。シストロフィン−糖蛋白質複合体のどの成分が内在性膜蛋白質かを評価するために、アルカリ−処理したうさぎ骨格筋膜をペレット化しく１００．ＯＯＯｘｇ）、可溶性上澄み液及び不溶性膜ベレットを５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びイムノプロットにより分析した。アルカリ−処理膜の上澄み液は全シストロフィンの９０％以上を含み、一方残りのベレット−付随シストロフィンは第２のアルカリ処理により抽出することができた。５９ｋＤａシストロフィン−会合蛋白質もアルカリ処理により抽出することができた。他方、ペレットに付随して膜中に残ったシストロフィン及び５９ｋＤａシストロフィン −会合蛋白質を、ｐＨ１１に滴定しなかった同一の緩衝液中に希釈した。１５６ｋＤａ、５ＱｋＤａ、４３ｋＤａ及び３５ｋＤａ糖蛋白質は、アルカリ処理後も膜ペレット中に保持された。

骨格筋膜から得、ｐ　Ｈ１１に滴定し、１００，０００ｘｇでペレット化した上澄み液も、カルセフェストリン、筋小抱体の５３−及び１６０ｋＤａ糖蛋白質及びアクチンなどの非−又は周辺膜蛋白質が豊富であり、一方内在性膜蛋白質である筋小胞体すアノジンレセブターはペレット中に保持された。シストロフィン及び５９ｋＤａシストロフィン−会合蛋白質を洗剤の不在下でアルカリ処理により骨格筋膜から抽出できることは、これらの蛋白質が内在性膜蛋白質でないことを示し、両方とも細胞骨格の要素であることを示唆している。これらのデータはさらに、１５６ｋＤａ、５０ｋＤａ、４３ｋＤａ及び３５ｋＤａシストロフィン− 会合糖蛋白質が内在性膜蛋白質であることを示している。

精製シストロフィン−糖蛋白質複合体中への［”Ｉ］ＴＩＤの挿入シストロフィン−糖蛋白質複合体の成分の疎水性をさらに評価するために、疎水性プローブ［＋２５Ｉ］ＴＩＤを精製シストロフィン−糖蛋白質複合体中に光挿入した。蛋白質の疎水性部分（おそらくトランスメンブランドメイン）は、［”Ｊ］ＴＩＤを用いて特異的に標識することができる。シストロフィン及び５９ｋＤａシストロフィン−会合蛋白質は［”５Ｉ］ＴＩＤにより標識されなかったが、５０ｋＤａ、４３ｋＤａ及び３５ｋＤａシストロフィン−会合糖蛋白質は、大体同程度のプローブ挿入を示した。２５ｋＤａシストロフィン−会合蛋白質中への大量の［Ｉ２５Ｉ］ＴＩＤの挿入は、それが複合体中で最も疎水性の成分であることを示しており、それに対する抗体を誘発するのに我々が成功しなかった理由を説明することができる。１５６ｋＤａシストロフィン−会合糖蛋白質が［”５Ｉ］ＴＩＤにより標識されなかった理由は明白でないが、説明のひとつは、複合体の他の疎水性成分によるそのトランスメンブランドメインの吸収であり得る。

シストロフィン−糖蛋白質複合体の免疫沈降へのアルカリ処理の影響精製シストロフィン−糖蛋白質の成分は、アルカリ解離後はもはやスクロース濃度勾配上に共−沈降しないことが示された。シストロフィン、１５５ｋＤａ及び５９ｋＤａシストロフィン−会合蛋白質はアルカリ解離後に別々の沈降ピークを示すが、５０ｋＤａ、４３ｋＤａ及び３５ｋＤａシストロフィン−会合糖蛋白質は、複合体として共沈降するようであつた。５０ｋＤａ、４３ｋＤａ及び３５ｋＤａシストロフィン−会合糖蛋白質がアルカリ解離後も複合体のままであるのかどうかを決定するために、未処理及びアルカリ−処理シストロフィン−糖蛋白質複合体の、ｍＡｂ　ＸｌＸＣ２（シストロフィン）−セファロース又はｍＡｂ　ＩＶＤ３＋　（５０ｋＤａ糖蛋白質）−セファロースにより免疫沈降した後の排液を、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びイムノプロットにより分析した。シストロフィン−及び５０ｋＤａシストロフィン−会合糖蛋白質−抗体マトリックスの両方が、未処理シストロフィン−糖蛋白質複合体からシストロフィンの９９％以上、及び５９ｋＤａ、５ＱｋＤａ、４３ｋＤａ及び３５ｋＤａシストロフィン −会合蛋白質の９６％を免疫沈降させるのに有効であった。シストロフィン−及び５０ｋＤａシストロフィン−会合糖蛋白質−抗体マトリックスは、１５６ｋＤａシストロフィン−会合糖蛋白質の６３％及び８５％を免疫沈降させた。

シストロフィン−抗体マトリックスは、アルカリ−処理シストロフィン−会合蛋白質からシストロフィンの９９％以上を免疫沈降させ、５９ｋＤａシストロフィン−会合蛋白質の５１％しか免疫沈降させず、シストロフィンと複合体の間の相互作用がアルカリ処理により崩壊したことを示している。５０ｋＤａシストロフィン−会合糖蛋白質−抗体マトリックスは、シストロフィン、１５６ｋＤａ及び５９ｋＤａシストロフィン−会合蛋白質の２５％、３２％及び４３％以下をアルカリ処理複合体から沈降させた。しかし５０ｋＤａ、４３ｋＤａ及び３５ｋＤａシストロフィン−会合糖蛋白質の９６％が、５０ｋＤａシストロフィン−会合糖蛋白質抗体マトリックスを用いてアルカリ−処理複合体から免疫沈降した。従ってこれらのデータは、５０ｋＤａ、４３ｋＤａ及び３５ｋＤａシストロフィン− 会合蛋白質のみが緊密に会合した複合体を形成していることを示す。５ＱｋＤａシストロフィン−会合糖蛋白質−抗体マトリックスは、シストロフィン−抗体マトリックスより多くの１５６ｋＤａシストロフィン−会合糖蛋白質を免疫沈降させるので、これらのデータはさらに１５６ｋＤａシストロフィン−会合糖蛋白質がシストロフィンよりむしろ５０ｋＤａ、４３ｋＤａ及び３５ｋＤａ糖蛋白質に直接結合していることを示唆している。

非−ジストロフィー及びジストロフィーマウス筋肉組織から前記の通りにイムノプロットを調製した。イムノプロットは、従来の方法でモルモット抗血清を用いて染色した。結果は、ジストロフィー筋肉組織において複合体のすべての糖蛋白質（すなわち１５６ｋＤａ、５０ｋＤａ。

４３ｋＤａ及び３５ｋＤａ片）、ならびに５９ｋＤａ非−糖蛋白質成分が不在であるか、又は非−ジストロフィー組織の結果と比較して非常に減少していることを示した。デュシエンヌ筋ジストロフィーに冒された数人の患者からのヒト筋肉試験切除試料において、この関連性を示す予備的結果も観察された。

骨格及び心臓筋膜の単離年令を合わせた正常な標準マウス及びシストロフィンの欠乏したｍｄＸマウスから、骨格及び心臓筋膜を調製した。単離法の際、異なるマウスからの膜試料は、比較のために合わせないで別々に保った。後肢及び背筋をできるだけ迅速に離断し、７．５体積の均質化緩衝液中、蛋白質の分解を最少にするためのプロテアーゼ阻害剤カクテルの存在下でポリトａン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ　ＧｍｂＨ，Ｌｕｚｅｒｎ、５ｗ１ｔｚｅを参照）。ホモジネートを３，０００ｘｇにて１５分間遠心し、上澄み液を４層のチーズクロスを通して濾過した。この最初の遠心段階からのペレットを再度ホモジナイズし、上記の通りに遠心し、４回繰り返した均質化サイクルの上澄み液を合わせた。合わせた上澄み液を１４０．０００ｘｇにて３５分間遠心することにより膜ベレットを得、最終的試料を、０ｈｌｅｎｄｉｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ。

１１２・１３５−１４８　（１９９１）に記載の要領でＫＣｌ−洗浄した。

標準及びｍｄｘ心臓からの心臓膜、ならびに標準及びジストロフィーｄｙ／ｄｙマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ｄｙ；Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）からの骨格筋膜を、標準及びｍｄｘマウス筋肉のに関する記載の通りに調製した。

新規に確立された麦芽凝集法を用いて精製骨格筋細胞膜を単離しく０ｈｌｅｎｄｉｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１１２　：１３５−１４８　（１９９１）を参照）、Ｅｒｖａｓｔｉ　ｅｔａｌ、、（Ｎａｔｕｒｅ　３４５：３１５−３１９（１９９０））に記載の要領でうさぎ骨格筋からシストロフィン−糖蛋白質複合体を調製した。Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈａｍ、８３：３４６−３５６　（１９７７）　）に記載の要領で牛血清アルブミンを標準として用い、蛋白質を決定した。

羊抗血清の調製本文に記載の要領で精製した本来のシストロフィン−糖蛋白質複合体を羊に注射することにより、シストロフィン−糖蛋白質複合体の種々の成分に対する単一特異性抗体を製造した。シストロフィン−糖蛋白質複合体に対する抗体の存在に関して粗羊抗血清を試験した後、３５ｋＤａ糖蛋白質、４３ｋＤａ糖蛋白質、５０ｋＤａ糖蛋白質及び５９ｋＤａ蛋白質に対する単一特異性抗体を、５ｈａｒｐ　ｅｔ　ａｌ、、（Ｊ、Ｂｉｏ　１．Ｃｈｅｍ、２６４　：　２８１６−２８２５　（１９８９））に記載の通りにシストロフィン−糖蛋白質複合体の種々の成分の各イモピロンストリップからアフィニティー精製した。続いてうさぎ筋細胞膜及びうさぎシストロフィン−糖蛋白質複合体を用いたイムノプロット分析によりアフィニテー精製抗体の特異性を決定した。

シストロフィンに対する単クローン性抗体ＸｌＸＣ２，１５６ｋＤａ糖蛋白質に対するＶ　Ｉ　Ａ　４１．５０ｋＤａ糖蛋白質に対するＩｖＤ３１、Ｎａ／に− ＡＴＰアーゼに対するＭｃＢ２（Ｕｒａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６４：８２７１−８２８０　（１９８９））及び心臓Ｃａ”−ＡＴＰアーゼに対するＩ　ＩＤ８　（Ｊｏｒｇｅｎａｌ、、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１１２：１３５−１４８（１９９１））。

ヒト　シストロフィン及びヒト　シストロフィン−関連蛋白質（ＤＲＰ）のＣ− 末端配列に対するうさぎ多クローン性抗体をアフィニティー精製し、記載の通りに特性化した（Ｅｒｖａｓｔｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉ　ｏ　１．Ｃｈｅｍ、２６６　：　９１６１−９１６５　（１９９１））、スペクツリンに対する単クローン性抗体５Ｂ−ＳＰ−１は、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ　（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。

ゲル電気泳動及びイムノプロット分析蛋白質を３−１２％の濃度勾配ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分別し、蛋白質バンドをクーマシーブルー染色により可視化し、５ｔａｉｎｓ−ａｌｌ染色によっても分析した。蛋白質をニトロセルロース上に移し、上記の要領で抗体を用いたイムノプロット染色及びデンシトメトリー走査を行った。蛋白質Ａ及び蛋白質Ｇの両方は、−吹竿抗体で十分に標識されなかった。従って羊抗体を用いた一次標識の後にマウス筋膜のイムノプロットをうさぎ抗−羊二次抗体と共にインキュベートし、その後１２５１−標識蛋白質Ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ。

ｎ）と共にインキュベートした。この方法によりオートラジオグラフィーに非常に強い信号が再現性良く得られ、標準及びｍｄｘマウス筋膜へのＤＡＰ抗体結合のデンシトメトリー走査が可能になった。

（Ｃａｍｐｂｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３３８：２５９適化条件下でイムノプロットのレクチン−染色を行った。プロットをペルオキシダーゼ−標識麦芽アグルチニンの１：１，０００希釈液、コンカナバリンＡ及びジャカリンｆｆｅｃｔｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅＳ、Ｂｕｒｌ　ｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）と共に１時間インキュベートし、４−クロロ−１−ナフトールを基質として２０ｍＭのトリス−ＣＩ、ｐＨ（１９９０））。

蛍光抗体鏡検法標準、ｍｄｘ及びｄ　ｙ　／　ｄ　ｙマウスの骨格筋からの８μｍの横断クリの要領で行った。ＰＢＳ　（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，４，０゜９％　ＮａＣ１）中で５％の正常羊抗血清と共に２０分間予備インキュベーションした後、クリオセクションを一次抗体（粗抗血清の１：１゜０００希釈液、又はハイブリドーマ上澄み液の１　：　１００希釈液、あるいはアフィニティー精製抗体の１＝５０希釈液）と共に３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ中で強力に洗浄した後、セクシヨンを１：１００に希釈したアフィニティー精製蛍光標識羊抗−マウスＩｇＧ又は羊抗−うさぎＩｇＧ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｈｅ　ｉｍ）で標識し、その後Ｚｅｉｓｓ　Ａｘｉｏｐｌａｎ蛍光顕微鏡で調べた。マウスクリオセクションにつきマウス単クローン性抗体を用いた場合、抗体検出にビオチンーストレブタビジン系を用いた。アフィニティー精製−次抗体を、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから商業的に入手できるビオチニル化キット中の指示に従ってビオチニル化した。クリオセクションを、非標識− 次抗体に関してすでに記載した要領でビオチニル化−次抗体と共にインキュベートし、その後ＰＢＳで強力に洗浄した。

最後に、１　：　１００に希釈したアフィニティー精製蛍光−共役アビジン（Ｓｉｇｒｎａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）と共にインキュベートすることにより、セクションを蛍光標識した。

骨格筋試料を麦芽アグルチニン（ＷＧＡ）で標識する場合、クリオセクションを０．３ＭのＮ−アセチルグルコサミンの存在下及び不在下で１：２．０００に希釈した蛍光−共役ＷＧＡ　（Ｓ　ｉ　ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｔ　Ｃｏｍｐａｎｙ）と共に３０分間インキュベートした。セクションをＰＢＳ中で強力に洗浄し、蛍光顕微鏡で特異的標識を調べた。標準、ｍｄｘ及びｄｙ／ｄｙマウス骨格筋クリオセりションの組織化学的検査を、Ｄｕｂｏｗｉｔｚ　（Ｍｕｓｃｌｅ　Ｂｉｏｐｓｙ−Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｌｏｎｄｏｎ：Ｂａ１ｌｌｉｅｒｅＴｉｎｄａ１１．１９８５．２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）に記載の通りにヘマトキシリン及びエオシン染色により行った。

神経筋疾患に冒された患者からの試験切除試料の蛍光抗体鏡検を、同様の条件下で行った。年令及び性別の異なる健康な正常の人間からのクリオセクション、及び多種類の神経筋疾患（デュシエンヌ筋ジストロフィー、ベラカー筋ジストロフィー、肢体型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー及びを日勤ジストロフィー）に冒された患者からのクリオセクションを同一の顕微鏡スライド上に置き、従ってすべてのインキュベーション及び洗浄段階の間、同一の方法で処理した。ヒト筋肉試験切除試料は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ　ａｎｄ　Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆＩｏｗａ　Ｃ１１ｎｉｃｓ　ａｎｄ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌｓから得た。

シストロフィン−会合蛋白質に対する抗体のイムノプロット分析本来のシストロフィン−糖蛋白質複合体に対して誘発した羊抗血清を用いて、緊密に会合したシストロフィン−糖蛋白質複合体の各成分に対する単一特異性抗体をアフィニティー精製した。イムノプロットにより、溶離アフィニティー精製抗体の高い特異性が示された。３５ｋＤａ糖蛋白質、４３ｋＤａｌｉ蛋白質、５０ｋＤａ糖蛋白質及び５９ｋＤａ蛋白質に対する羊抗体は、うさぎ骨格筋からの筋細胞膜及び単離シストロフィン−糖蛋白質複合体においてそれぞれの抗原を強く標識した。これらの結果は、シストロフィン−糖蛋白質複合体の異なる成分に対するアフィニティー精製抗体の単一特異性を示しており、これは標準、ｍｄｘ及びｄｙ／ｄｙマウス筋肉中の複合体の成分の特性化に欠くことのできない前提条件である。１５６ｋＤａ糖蛋白質に対する羊抗体は、イムノプロットにおいて強い標識を示さず、さらに１．５６　ｋ　Ｄ　ａ糖蛋白質に対する羊抗体のアフィニティー精製は、シストロフィン分解分子からの汚蛎フラグメントのために複雑になった。従って我々は１５６ｋＤａ糖蛋白質の分析に、非常に特異的なプローブでありイムノプロットにおいて強力な標識を示す、すでに以前に特性化した単クローン性抗体Ｖ　Ｉ　Ａ　４　＋を用いた。

ｍｄｘマウスからの骨格筋膜中のシストロフィン−会合蛋白質特性化の後にアフィニティー精製羊抗体を広範囲イムノプロット分析に用い、標準及びｍｄｘマウスからの骨格筋膜中のシストロフィン−糖蛋白質複合体の成分の発現を比較した。ｍｄｘマウスは、シストロフィン遺伝子における点変異によりシストロフィンを欠いており、デュシェンヌ筋ジストロフィーの有力な動物モデルである。ｍｄｘマウスからの骨格筋繊維は変性及び再生の循環を行い、従ってそれはシストロフィン−欠失ｍｄｘ骨格筋からの膜中のシストロフィン−会合蛋白質の状態を調べるのに非常に興味が持てる。クーマシーブルー及び“５ｔａｉｎｓ−ａｌｌ” 染色により、標準及びｍｄｘマウス骨格筋からの膜試料の組成が類似していることが明らかになった。ｍｄｘマウスからの粗骨格筋膜を、シストロフィンを含まないがすでに精製筋細胞膜に関して記載した正常な大きさ及び存在量のシストロフィン−関連蛋白質を含むとして特徴づけた。

ｍｄｘマウス中のシストロフィン−会合糖蛋白質の実験の前に、本研究に用いたｍｄｘマウスの膜試料中の糖蛋白質及び膜細胞成分の一般的状態を評価した。ｍｄｘ骨格筋繊維において分解及び再生サイクルを行うことにより起こり得る蛋白質への二次効果を考慮することが重要である。麦芽アグルチニン、コンカナバリンＡ及びジャカリンを用いたレクチン−染色により、これらの３種類のレクチンに関して標準及びｍｄｘマウス筋膜の糖蛋白質組成が非常に類似していることが示された。さらに両膜試料中で原形質膜マーカーＮａ／に−ＡＴＰアーゼが同等に分布していることがわかった。これらの結果は、一般的糖蛋白質及び筋細胞膜蛋白質組成がｍｄｘマウス筋肉中で重大な影響を受けていないことを示している。

標準及びｍｄｘマウスからの骨格筋膜中のシストロフィン−会合蛋白質の相対的発現に関して同様のイムノプロットを調べた。見掛けの３５−ｋＤａ、４３−ｋＤａ、５Ｏ−ｋＤａ、５９−ｋＤａ及び１５６−ｋＤａ蛋白質中のシストロフィン−会合蛋白質の相対的存在量が、ｍｄｘ筋肉膜において非常に減少している。

上記の要領で行った１２５Ｉ−蛋白質Ａ−標識イムノプロットのデンシトメトリー走査は、標準膜と比較してｍｄｘ筋膜における３５ｋＤａ糖蛋白質の場合８４％±３の減少、４３ｋＤａ糖蛋白質の場合８０％±５の減少、５０ｋＤａ糖蛋白質の場合８３！％±５の減少、５９ｋＤａ糖蛋白質の場合８６％±６の減少、及び１５６ｋＤａ糖蛋白質の場合約８０−９０％の減少を明らかにした。それぞれ５匹の１０−退会標準マウス及び５匹の５−退会ｍｄｘマウスから単離した膜につき同様のデンシトメトリー走査を行った。退会を合わせた標準マウスと比較して５．２０及び３〇−退会ｍｄｘマウスから単離した膜において同様にシストロフィン−会合蛋白質の発現の減少が観察された。０．６ＭのＫＣＩで洗浄していない粗骨格筋膜、及び０ｈｌｅｎｄｉｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１１２：１３５−１４８　（１９９１）に記載の要領で調製したミクロソーム膜の場合も同様の結果が得られた。これらの発見は、ｍｄｘマウス骨格筋がシストロフィンを失っていることばかりでなく、さらにｍｄｘマウス筋肉中でシストロフィン−会合糖蛋白質の濃度が非常に減少していることを示している。

ｄｙ／ｄｙマウスからの骨格筋膜中のシストロフィン−会合蛋白賀動物モデルｄｙ／ｄｙマウスからのジストロフィー骨格筋繊維は、ヒト筋ジストロフイー中の骨格筋繊維と組織化学的に類似の外観を有する。

しかし神経筋疾患ジストロフィー筋肉に関する遺伝子座は、マウス染色体１０に指定された。ｄｙ／ｄｙマウスからの筋膜は正常な大きさと存在量のシストロフィンを含み、この動物モデルを、壊死しているがシストロフィンを含む筋肉組織におけるシストロフィン−会合蛋白質の状態のための非常に優れた標準としている。クーマシーブルー染色により、標準及びｄ　ｙ　／　ｄ　ｙマウス骨格筋から単離した膜の間に見掛は上の差がなく、シストロフィン−関連蛋白質の濃度も両膜試料間で類似であることが明らかになった。最も重要なことに、異なるシストロフィン−会合蛋白質に対する抗体により、標準及びｄｙ／ｄｙマウスからの骨格筋膜中に大体同量のこれらの蛋白質が示された。これらの発見は、シストロフィン−会合蛋白質がシストロフィンを含む壊死ｄ　ｙ　／　ｄ　ｙ筋肉中で二次的結果に影響されないことを示している。従ってｍｄｘマウスからの骨格筋膜中のシストロフィン−会合蛋白質の発現の減少は、ｍｄｘ筋肉の膜細胞骨格中にシストロフィンがないことによる一次的結果である可能性が最も強い。

ｍｄｘマウスからの心臓筋におけるシストロフィン−会合蛋白質ｍｄｘマウスからの骨格筋膜中のシストロフィン−会合蛋白質の状態の評価の後、ｍｄｘ心臓組織中のこれらの蛋白質の発現を調べた。クーマシーブルー染色及びイムノプロット分析により、標準及びｍｄｘ心臓組織からの膜試料の蛋白質組成が類似であることが示された。両膜試料において等量の筋小胞体Ｃａ２ゝ−ＡＴＰアーゼ及びシストロフィン−関連蛋白質が見いだされた。明らかにｍｄｘ心臓筋中にシストロフィンは存在しないが、興味深いことに４種類のシストロフィン−会合糖蛋白質すべての濃度が両膜試料中で大体等しい。５．１０．３０及び５５−退会の標準及びｍｄｘマウスから単離した心臓膜は、すべて等量のシストロフィン−会合糖蛋白質を示した。しかし５９ｋＤａ蛋白質の発現は、ｍｄｘマウスからの心臓膜において非常に減少している。シストロフィン−会合糖蛋白質がｍｄｘ心臓膜において影響を受けないという発見は、ｍｄｘ心臓組織の壊死が非常に限られているという事実を考慮すると非常に興味深い結果である。おそらくシストロフィンの不在による心臓及び骨格筋の病的反応に基本的な差があり、それがｍｄｘマウスからの２つの異なる組織における、標準マウス組織と比較した場合のシストロフィン−会合蛋白質の相対的存在量の差の基礎であり得る。

シストロフィン−会合蛋白質に対するアフィニティー精製羊抗体は、イムノプロットにおいて非常に特異的であるが、間接蛍光抗体鏡検法において非常に弱い標識しか与えない。従ってこれらの抗体は標準、ｍｄＸ及びｄｙ／ｄｙマウスからの骨格筋クリオセクションにおけるシストロフィン−会合蛋白質の発現の実験に使用することができない。この時点で、我々が使用できる蛍光抗体法で強い標識を示す単クローン性抗体はたったひとつである。抗体ＩＶＤ３＋は５０ｋＤａ糖蛋白質を認識し、うさぎ骨格筋の広範囲細胞細分割研究及び蛍光抗体鏡検法により以前に特性化されている。５０ｋＤａ糖蛋白質に対するｍＡｂ　ＩＶＤ３１の完全な標識条件を確立した後、標準、ｍｄｘ及びｄｙ／ｄｙマウスからの骨格筋の横断クリオセクションを蛍光抗体鏡検法により調べた。

正常、ｍｄｘ及びｄｙ／ｄｙマウスからの骨格筋クリオセクションにつき、ヘマトキシリン及びエオシンを用いた組織化学的染色を行った。

正常なマウス骨格筋細胞は周辺核化を示したが、ｍｄｘマウスは中心に局在する多くの核を有し、これはｍｄｘ筋肉において起こる変性及び再生の進行の結果である。対照的に、ｄｙ／ｄｙマウス骨格筋からのクリオセクションは円い輪郭を持つ筋繊維、繊維の直径の顕著な変動、結合組織の増加及び中心核化を持つ多くの繊維を示す。蛍光−標識麦芽アグルチニンを用いたマウスクリオセクションの染色により、ｍｄＸ及びｄｙ／ｄｙマウスの筋肉が正常なマウスの筋肉と比較して同程度の細胞周辺における麦芽アグルチニン結合成分を示すことがわかった。

これらの結果は、標準及びｍｄｘマウスからの筋膜において等量のＷＧＡ−陽性糖蛋白質を示した比較蛍光抗体分析による発見と一致している。シストロフィン抗体は、標準及びｄｙ／ｄｙ骨格筋ク骨格筋グリオセクション辺全体を標識し、ｄ　ｙ／ｃｔ　ｙマウスからのジストロフィー筋肉におけるこの筋細胞膜細胞骨格蛋白質の正常な分布及び存在量を示している。これらの結果は、ｄｙ／ｄｙマウスからの骨格筋膜においてシストロフィンが正常な大きさ及び存在量で存在することを示したイムノプロット分析と一致する。対照的に、ｍｄｘ骨格筋繊維はシトロフィンを完全に欠いており、シストロフィン遺伝子における点変異の十分に確立された結果であり、イムノプロット分析からの結果を支持している。

この特性化に続いて、マウス骨格筋クリオセクションを５０ｋＤａ糖蛋白質に対するｍＡ　ｂ　Ｉ　ＶＤ　３　＋で標識した。蛍光抗体標識は筋肉細胞周辺に限られ、染色強度は正常及びｄｙ／ｄｙ骨格筋の間で同等であった。他方、５０ｋＤａ糖蛋白質の発現はｍｄｘマウスからの骨格筋繊維において非常に減少していた。筋肉細胞表面の蛍光抗体標識は顕著に減少しているばかりでなくパッチ状であり、５０ｋＤａ糖蛋白質の存在量及び分布がｍｄｘ骨格筋繊維において重大に影響を受けていることを示している。蛍光抗体鏡検法の結果はｍｄｘマウスからの骨格筋膜における５０ｋＤａ糖蛋白質の濃度の減少と一致しており、５０ｋＤａ糖蛋白質の発現の低下がｍｄｘ筋肉表面にシストロフィンがないことによる結果であることを示している。５０ｋＤａ糖蛋白質の量の減少がシストロフィンの状態に依存しておらず、骨格筋分解の二次的影響によるとすると、ジストロフィーｄｙ／ｄｙ骨格筋における５０ｋＤａ糖蛋白質の量の減少も予測される。これは、５ＱｋＤａ糖蛋白質抗体によるｄｙ／ａｙ骨格筋表面の強い標識により示される通り、事実でない。

動物モデルｍｄｘマウスからの骨格筋膜及びクリオセクションにおける５０ｋＤａ糖蛋白質の発現の減少が確立されたので、種々の神経筋肉疾患に冒された患者からの骨格筋試料におけるこのシストロフィン−会合糖蛋白質の状態を研究した。この時点でｍＡｂ　ＩＶＤ３＋が、蛍光抗体鏡検法によるヒト骨格筋におけるシストロフィン−会合糖蛋白質の発現の研究に使用できる唯一の交差反応性抗体である。シストロフィン−糖蛋白質複合体に対する単−特異性羊抗体は、ヒト骨格筋の蛍光抗体鏡検法に十分な強さでクリオセクションを標識せず、又正常な及びジストロフィーのヒト骨格筋から単離した膜のイムノプロット分析に十分な強さの染色を示さなかった。標準及びデュシェンヌ筋ジストロフィー患者からの粗骨格筋膜のｍＡｂ　ＶＩＡ４１ｒを用いた以前のイムノプロット分析により、このシストロフィン−会合糖蛋白質がデュシェンヌ筋ジストロフィー筋肉において非常に減少していることが確立されている。

しかしｍ　Ａ　ｂ　Ｖ　Ｉ　Ａ　４　＋は蛍光抗体鏡検法においてヒト骨格筋クリオセクションを標識しなかった。

５０　ｋ、Ｄ　ａ糖蛋白質抗体を用いた蛍光抗体標識の前に、スペクッリン及びシストロフィンに対する抗体を用いた標識ならびにＷＧＡ染色によりヒト骨格筋クリオセクションを特徴づけた。シストロフィンは骨格筋細胞表面の膜細胞骨格成分である。従って蛍光抗体診断法の標準としてシストロフィン以外の膜細胞骨格成分に対する信頼できる抗体を持つことが有利であろう。膜細胞骨格成分スペクツリンに対する商業的に入手可能ないくつかの抗体を調べ、スペクツリンに対する単クローン性抗体５Ｂ−８Ｐ−１が正常な、及び病気のヒト筋肉細胞を強く標識することが見いだされた。シストロフィンを欠くデュシェンヌ筋ジストロフィー患者からのクリオセクションは、スベクツリンに対する抗体で標識すると細胞周辺が標識される。この結果及びベラカー筋ジストロフィーならびに肢体型筋シイトロフィーに罹った患者からのクリオセクションのスペクツリン抗体による強い標識は、スペクツリンがこれらの神経筋疾病において影響を受けないことを強（示している。従ってスペクツリン抗体は、病的段階の骨格筋表面膜細胞骨格の蛍光抗体鏡検法における信頼できる標準として使用することができる。

骨格筋繊維中のＷＧＡ結合成分の標識は、正常なヒト筋肉及びデュシエンヌ、ベラカー及び肢体型筋ジストロフィーに冒された患者からの試料のクリオセクションすべてが筋肉細胞周辺においてＷＧＡに対して強く結合することを示している。ＷＧＡに強く結合するある種の筋肉表面成分は、これらのヒト筋ジストロフィーにおいて重大に影響を受けていないようである。これはデュシェンヌ筋ジストロフィーにおけるシストロフィン−会合糖蛋白質の状態に関する重要な発見であり、５０ｋＤａ糖蛋白質の蛍光抗体鏡検法と関連してさらに議論する。シストロフィン抗体は正常な骨格筋の細胞周辺全体を標識するが、デュシエンヌ筋ジストロフィー患者からの筋肉試料中にシストロフィン染色は存在しない。

対照的にベラカー及び肢体型筋ジストロフィーの患者からのクリオセクションは、細胞周辺のシストロフィン標識を示す。ベラカー筋ジストロフィーの患者からのクリオセクションは、強いが少し不連続のシストロフィンに関する抗体染色を示す。さらにヒト骨格筋クリオセクションは、アルブミン及び基底層マーカーラミニンに対するｍＡｂを用いて細胞周辺の強い標識を示した。蛍光抗体染色強度は、正常なヒト筋肉、デュシェンヌ筋ジストロフィー筋肉及び他の研究した神経筋疾患からの筋肉試料の間で等しかった。スベクツリン及びＷＧＡの他にこれらの抗体も蛍光抗体鏡検診断法において骨格筋繊維の場合の細胞周辺の輪郭を調べるための優れたプローブであるように見える。

デュシエンヌ筋ジストロフィーの虫者からの試験切除試料は、正常なヒトの標準筋肉と直接比較した場合に５０ｋＤａ糖蛋白質に関する蛍光抗体染色強度が非常に低かった。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｉｏｗａ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃｓからの一連のデュシエンヌ筋ジストロフィー患者の筋肉試料を日常的的操作でスクリーニングし、デュシエンヌ筋ジストロフィーにおける５０ｋＤａ糖蛋白質の発現の低下は再現性が非常に高く、これまで調べたすべてのデュシエンヌ筋ジストロフィー筋肉試料で見いだされた。最初の組織化学的診断の時点のデュシエンヌ筋ジストロフィー患者の年令は、３−６オである。従って健康な６オの男児からの筋肉クリオセクションにおけるシストロフィン抗体染色を、年令を合わせたヒト標準筋肉として用いた。正常な成人のヒト骨格筋からの多種類の筋肉試験切除試料を用いてｍＡｂ　ＸｌＸＣ２によるシストロフィン染色を行った。縦断及び横断セクションの両方において、ｍＡｂ　ＸｌＸＣ２は正常なヒト骨格筋繊維の細胞周辺全体を再現性良く強く標識した。ベラカー筋ジストロフィー及び肢体型筋ジストロフィーの患者からの筋肉試験切除試料の比較蛍光抗体鏡検法により、５ＱｋＤａ糖蛋白質が筋肉細胞周辺に大体正常な量で存在することが明らかにされた。を椎筋肉萎縮及び先天性筋ジストロフィーに冒された患者からの試験切除試料において、正常なヒト骨格筋と比較して正常な５０ｋＤａ糖蛋白質の分布が筋肉細胞周辺に見いだされた。標準、ｍｄｘ及びｄｙ／ｄｙ骨格筋ク骨格筋グリオセクション蛍光抗体鏡検法で得た結果と類似して、ヒト　デュシエンヌ筋ジストロフィー筋肉における５０ｋＤａ糖蛋白質の発現の減少は主にシストロフィンの不在と関連しているようである。多種類の重症ヒト神経筋疾患からの壊死筋繊維は、細胞周辺における正常な蛍光抗体染色を示し、５０ｋＤａ糖蛋白質が筋肉繊維分解における二次的結果により強い影響を受けていないことを示している。さらにＷＧＡによるデュシエンヌ筋ジストロフィー筋肉の強い標識は、５０ｋＤａ糖蛋白質と対照的に細胞周辺の他のＷＧＡ−結合成分のほとんどがデュシエンヌ筋ジストロフィー骨格筋において影響を受けていないことを示している。ジストロフィー動物モデルｍ、ｄｘ及びｄｙ／ｄｙマウスの蛍光抗体及びイムノプロット分析、ならびに多種類のヒト神経筋疾患における５０ｋＤａ糖蛋白質の比較蛍光抗体鏡検法から得たデータを合わせると、ｍｄｘ及びデュシエンヌ筋ジストロフィー骨格筋におけるシストロフィン−会合蛋白質の発現の非常な低下は、シストロフィンの不在のためであり、筋繊維分解における二次効果によって起こるものではないと思われる。

同等例同業者は単に日常的実験を用いて、本文に特に記載した本発明の特殊な具体化の多くの同等例を認識し、又は突き止めることができるであろう。そのような同等例は以下のフレイムの範囲内に含まれるものとする。

図３シストロフィン−糖蛋白質複合体に対する抗体の生成単離シストロフィン−糖蛋白質複合体 ↓ ５ＤＳ−ＰＡＧＥ＋３−１２％勾配ポリアクリルアミド１クーマシーブルー染色１０分間 ↓水中で脱色各ゲル蛋白質バンドの切り出し１テフロンガラス粉砕機による均質化 ↓完全フロインドアジュバントと混合モルモット、羊、うさぎ、マウス中に注射１不完全フロインドアジユバント中の ↓追加ゲルスライスにより追加刺激単離シストロフィン−糖蛋白質複合体のイムノプロット上の抗血清のスクリーニング１力価が十分な場合 ↓大量の抗血清を集めるシストロフィン−糖蛋白質複合体の各成分に対するアフィニティー生成抗体要　約　書本発明は哺乳類骨格筋のシストロフィン−糖タンパク質複合停及び該複合体を単離する方法に関する。上記複合体の成分及び該成分を分離及び単離する方法も本発明に関する。更に、本発明は筋ジストロフィーの兆候である、シストロフィン −糖タンパク質の非シストロフィン成分の損失を検出及び定量する方法にも関する。

宝器膿審鶴牛、Ａ＋ｉｍ＋Ｎ＋ＰＣＴ／ＵＳ９１１０３６３２国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．哺乳類ジストロフィン−糖蛋白質複合体の非−ジストロフィン成分に特異的に結合する抗体。
２．１５６ｋＤａ糖蛋白質、５９ｋＤａの蛋白質のトリプレット、５０ｋＤａ糖蛋白質、４３ｋＤａ槍蛋白質及び３５ｋＤａ糖蛋白質から成る群より選んだ、哺乳類ジストロフィンー糖蛋白質複合体の成分に特異的に結合する抗体。
３．多クローン性である、請求の範囲２に記載の抗体。
４．単クローン性である、請求の範囲２に記載の抗体。
５．１５６ｋＤａ糖蛋白質、５９ｋＤａの蛋白質のトリプレット、５０ｋＤａ糖蛋白質及び３５ｋＤａ糖蜜白質から成る群より選んだ哺乳類ジストロフィン−糖蛋白質複合体の成分に対する単クローン性抗体を生産するハイブリドーマ。
６．哺乳類骨格筋の単離ジストロフィン−糖蛋白質複合体。
７．ヒト骨格筋の単離ジストロフィン−糖蛋白質複合体。
８．うさぎ骨格筋の単離ジストロフィン−糖蛋白質複合体。
９．１５６ｋＤａ糖蛋白質、５９ｋＤａの蛋白質のトリプレット、５０ｋＤａ糖蛋白質、４３ｋＤａ糖蛋白質及び３５ｋＤａ糖蛋白質から成る群より選んだ、哺乳類ジストロフィン−糖蛋白質複合体の単離成分。
１０．減少又は不在が筋ジストロフィーの兆候である、哺乳類骨格筋の哺乳類ジストロフィン−糖蛋白質複合体の非−ジストロフィン成分の欠失を検出することによる、筋ジストロフィーの診断法。
１１．哺乳類骨格筋試料を１５６ｋＤａ糖蛋白質、５９ｋＤａの蛋白質のトリプレット、５０ｋＤａ糖蛋白質、４３ｋＤａ糖蛋白質及び３５ｋＤａ糖蛋白質から成る群より選んだ複合体の成分と特異的に反応する抗体と接触させる段階を含む、哺乳類骨格筋中の哺乳類ジストロフィンー糖蛋白質複合体の成分の減少又は不在を検出及び定量する方法。
１２．筋肉組織がデュシェンヌ筋ジストロフィーに冒されている、請求の範囲１１に記載の方法。
１３．筋肉組織がペツカー筋ジストロフィーに冒されている、請求の範囲１１に記載の方法。
１４．以下：ａ）非−ジストロフィン成分を抗体と結合できるようにあらかじめ処理した試料を、非−ジストロフィン成分と特異的に結合する抗体と合わせ、ｂ）該成分と該抗体の複合体を検出及び定量し、ｃ）検出した量を、非−ジストロフィ−組織中の検出量と比較し、非−ジストロフィ−組織の場合に得た量より少ない量を筋ジストロフィーの兆候であるとする段階を含む、哺乳類骨格筋試料中のジストロフィン−糖蛋白質複合体の非−ジストロフィン成分の欠失を試験管内で検出する方法。
１５．以下：ａ）筋肉試験切除試料を得、ｂ）筋肉試験切除試料を均質化し、ｃ）均質化した筋肉試験切除試料を変性溶液中で可溶化し、ｄ）段階ｃ）からの可溶化試料の成分を電気泳動により分離し、ｅ）電気泳動からの留分を担体に移し、ｆ）段階ｅ）からの担体結合材料を、非−ジストロフィン成分に特異的な単クローン性抗体と共にインキュベートし、ｇ）担体−結合非−ジストロフィン成分に対する抗体の特異的結合を検出及び定量し、ｈ）ニトロセルロース担体のオートラジオグラフをデンシトメトリー分析し、ｉ）担体−結合非−ジストロフィン成分に対する抗体結合の量を、同様に処理した正常な標準組織による抗体結合の量と比較し、抗体結合の量の減少を筋ジストロフィーの兆候とする段階を含む、哺乳類骨格筋試料におけるジストロフィン− 糖蛋白質複合体の非−ジストロフィン成分の欠失を検出する方法。
１６．以下：ａ）筋ジストロフィーに冒されていると思われる哺乳類からの骨格筋試料を、ジストロフィン−糖蛋白質複合体の非−ジストロフィン成分と特異的に結合する抗体と接触させ、ｂ）免疫組織化学的方法により抗体が筋肉試料の細胞と結合するかどうかを決定し、結合の不在を筋ジストロフィーの兆候とする段階を含む、哺乳類骨格筋試料におけるジストロフィン−糖蛋白質複合体の非−ジストロフィン成分の欠失を検出する方法。
１７．以下：ａ）可溶化筋肉試料、及びジストロフィン−糖蛋白質複合体の非−ジストロフィン成分に特異的な第１抗体を固定した固相免疫吸着剤を含む第１インキュベーション混合物を形成し、ｂ）混合物をインキュベートし、ｃ）その後第１インキュベーション混合物から免疫吸着剤を分離し、ｄ）該第１インキュベーション混合物から分離した免疫吸着剤、及びジストロフィン−糖蛋白質複合体の該非−ジストロフィン成分に特異的な酵素共役第２抗体を含む第２インキュベーション混合物を形成し、ｅ）混合物をインキュベートし、ｆ）第２インキュベーション混合物から免疫吸着剤を分離し、ｇ）第２インキュベーション混合物から分離した免疫吸着剤、及び共役酵素に関する発色基質を含む第３インキュベーション混合物を形成し、ｈ）第３インキュベーション混合物をインキュベートし、ｉ）筋ジストロフィーの不在又は存在の兆候として、酵素と発色基質の反応による発色の存在又は不在を検出する段階を含む、哺乳類骨格筋試料におけるジストロフィン−糖蛋白質複合体の非−ジストロフィン成分の不在又は減少を検出する方法。