JPH10512369A

JPH10512369A - 癌診断薬としてのａ蛋白質

Info

Publication number: JPH10512369A
Application number: JP8521734A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．シュミット，ジェフリー; エル．ホフマン，ケネス
Original assignee: スキーペンズアイリサーチインスティテュート; サイトラコーポレーション
Priority date: 1995-01-10
Filing date: 1996-01-11
Publication date: 1998-11-24
Also published as: CN1168176A; CA2209823A1; WO1996021862A1; MX9705161A; EP0803065B1; AU4694096A; EP0803065A1; ATE208041T1; DE69616509D1

Abstract

(57)【要約】個体由来の血液等の試料中の異常に大量のＡ蛋白質の存在は、該個体における原発性または転移性癌の診断となる。Ａ蛋白質の存在は、特異的抗体を用いるその免疫学的反応により最も容易に検出される。試料中のＡ蛋白質の存在を検出する好ましい手段は、Ａ蛋白質に対する異なるエピトープ特異性を有する２つの抗体を使用するサンドイッチ検定法による。

Description

【発明の詳細な説明】癌診断薬としてのＡ蛋白質発明の背景個体中の癌の診断は今なお達成が困難な課題である。癌胚抗原（CEA ）、アルファフェトプロテイン（AFP ）または前立腺特異的抗原（PSA ）など、血液や組織試料から検査できるいくつかの診断マーカーを利用できるが、現在までのところ、これらのマーカーを用いる検査では、他の臨床診断法で確認されているほど顕著には、個体に癌が存在することを予測できていない。これらの検査法の感度と特異性は案外低い。時間がかかり労働集約的な臨床評価法（例えば触診法、X 線、乳房X 線、生検など）が今も、癌の診断法として一般に是認された方法となっている。したがって、個体に癌が存在することを予測させるマーカー、好ましくは個体から得られる血液などの生物学的試料中に存在するマーカーが必要とされている。具体的に述べると、初期段階の癌を持つ個体に関するマーカーの存在ならびにこのマーカーの存在と量を測定する検査法が必要とされている。このような診断的試験が利用できるなら、初期治療が有益な成果を挙げる可能性は現在より高くなるだろう。本発明の目的は、個体中の原発性または転移性癌の存在を検出する方法であって、癌診断蛋白質の検出を伴う方法を提供することである。また、個体中の原発性または転移性癌の存在を検出するために使用できる組成物を提供することも本発明の目的である。発明の要約本発明は、個体由来の血液試料などの生物学的試料の検査結果から、その個体中の癌を検出する方法に関する。この検査法では、その生物学的試料中に存在しうる癌診断蛋白質と免疫反応性である少なくとも1 種類の抗体と共に試料をインキュベートする。癌診断蛋白質：抗体反応で生成する免疫複合体を検出する。これらの免疫複合体が異常に高い濃度で存在することは、その試料を採取した個体が原発性または転移性癌を持つことを示す。本発明の好ましい態様では、癌診断蛋白質がＡ蛋白質であり、Ａ蛋白質のサンドイッチ検定法で試料をインキュベートする。Ａ蛋白質と免疫反応する抗体を固相支持体に結合する。試料を、結合したその抗体、およびＡ蛋白質のもう1 つの領域（すなわち固相支持体に結合した抗体と免疫反応する領域以外の領域）と免疫反応する第2 の抗体と免疫反応させる。その結果生じた2 抗体-A蛋白質複合体はサンドイッチを形成する。結合した第2 抗体の量を検出する。この第2 抗体の検出量は、結合したＡ蛋白質の量に正比例する。生物学的試料の検査によって検出される第2 抗体の検出量が異常に多ければ、それは原発性または転移性癌の存在の指標となる。本発明のもう1 つの態様は、癌診断蛋白質（例えばＡ蛋白質）の検査で使用する1 種類以上の抗体を含有する検査キットである。それら抗体の1 つは、その癌診断蛋白質の1 つのエピトープ領域と免疫反応し、第2 抗体が含まれる場合、その第２抗体は、上記癌診断蛋白質のエピトープ領域であって、第1 抗体と免疫反応するエピトープ領域とは異なる領域と免疫反応する。本検査キットの好ましい態様には、Ａ蛋白質の2 つのエピトープ領域と免疫反応する2種類の抗体が含まれる。それら抗体の 1つを、マイクロタイタープレートのウェルの壁や底などといった固相支持体に付着させる。もう1 つの抗体には検出標識が結合している。本発明のさらなる態様は、癌診断蛋白質、すなわちＡ蛋白質と免疫反応する1 種類以上の抗体である。これらの抗体は癌診断蛋白質の存在の検出または評価に使用される。その評価は血液などの生物学的試料を用いて行なうことができる。図面の簡単な説明図1 は可溶性Ａ蛋白質のクロマトグラフィーによる分離を表すグラフである。図1Aは高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）ゲルろ過カラムで精製したＡ_s型Ａ蛋白質の光学走査である。図1Bは、この精製操作の有効性を確認するため、直線的塩勾配（破線）を用いて、DEAE- セルロースアニオン交換カラムによる再クロマトグラフィーにかけた上記HPLC精製Ａ_sの光学走査である。図2はＡ_mおよびＡ_s型Ａ蛋白質のSDS-PAGEによる精製を表す写真である。ゲルを銀染色した。レーン1 は精製Ａ_m、レーン2 は精製Ａ_s、レーン３は分子量標準を表す。図3 は、アデノシンヌクレオチドの存在下における可溶型および膜結合型Ａ蛋白質によるGTP 類似体GMP-PNP の結合を表すグラフである。図4 は、GTP γS の存在下におけるＡ_sおよびＡ_mのATP アーゼ活性を表すグラフである。図5 は、対照個体および既に転移性乳癌を持つと診断されている個体の血中Ａ蛋白質濃度を表す散布図である。発明の詳細な説明本発明は、個体中の原発性または転移性癌の存在を診断するための方法および組成物に関する。原発性癌は身体の特定の解剖学的領域に制限された癌成長であり、または初期癌病巣を形成した細胞からなる。転移性癌は最初の原発性部位から血液もしくはリンパ系またはその両方を通して身体に広がった癌成長であり、原発性腫瘍から離れた部位で成長する。またこれは、原発性腫瘍の治療に続いて広がる再発性疾患でもある。本発明の方法と組成物を用いて診断できる原発性または転移性癌は極めて多様である。本発明の方法と組成物で検出できる癌の一覧には乳癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、結腸直腸癌、胃組織癌、膵臓癌、膀胱癌、頭頚部癌、子宮内膜癌、耳下腺癌、胆管癌、腎臓癌、子宮頸癌、甲状腺癌、脳腫瘍、口腔癌、子宮癌、腹部癌、舌癌、口唇癌、肛門癌、骨盤癌、鼠蹊部癌、陰茎癌、胸壁癌、ファロピーオ管癌、POEMS、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、黒色腫および種々の肉腫が含まれる。これらの癌は、おそらく他のタイプの癌も第1 期と第2 期を含む種々の進行段階で検出できる。これらの癌の存在の検出は、本発明の方法および組成物を用いることによって、個体中の良性腫瘍の存在や癌の不在から識別できる。本発明の方法は、癌診断蛋白質と免疫反応する抗体の使用を伴う。本発明の好ましい癌診断蛋白質はＡ蛋白質である。1 以上の抗体を個体から得た生物学的試料と共にインキュベートした後、抗体-A蛋白質免疫複合体が異常に多く存在することがその個体中の原発性または転移性癌の存在を示す。血液は、しばしば使用される好ましい生物学的試料である。血液が生物学的試料である場合、分析対象となる好ましい血液構成成分は血漿か血清であり、血清がより好ましい。血液や他の体液が好ましい生物学的試料であるから、免疫反応性癌診断蛋白質、例えばＡ蛋白質は液体媒体から検出される。血液が生物学的試料である場合、その液体媒体は身体中を循環している。したがって、本発明の方法は局所的な、例えば生検材料の分析に依存せず、血清や血漿のように容易に入手できる生物学的試料で使用できる。このような血液採取を使用した場合でさえ、検出できる癌の多様性は極めて大きい。本発明の特定の態様として、特定の個体から得た生物学的試料中のＡ蛋白質濃度が、癌を持たない個体から得られる同様の試料中に認められるＡ蛋白質濃度の 2 倍以上存在することが、その特定の個体中に癌が存在することの指標となる。言い換えれば、同じサイズの生物学的試料を癌を持たない個体から得て、それらの試料中の平均Ａ蛋白質量を決定した場合、ある個体から得た同じサイズの生物学的試料が、癌を持たない個体に関する平均Ａ蛋白質量であると決定された値の２倍以上のＡ蛋白質量を含むならば、その個体は癌を持つと予測される。これらの特定の態様では、2.0 という因子が閾値であると見なされる。個体から得た生物学的試料中のＡ蛋白質濃度が、癌を持たない個体に関する平均Ａ蛋白質濃度の 2.0 倍以上であれば、すなわち癌を持たない個体のＡ蛋白質濃度平均に対する被験者のＡ蛋白質濃度の比が2.0 より大きければ、その個体は癌を持つと予測される。癌を持たない個体のＡ蛋白質濃度平均に対する被験者のＡ蛋白質濃度の比が 2.0 未満であれば、その被験者は癌を持たないことが示される。2.0 という閾値は特に好ましい値である。個体中の癌の存在を予想するために他の閾値を設定することもできる。これらの閾値は、その特定の癌診断検査法の正確さと再現性ならびにその検査に要求される予測信頼性に依存するだろう。個体から得た生物学的試料中のＡ蛋白質の実際の量または濃度は、診断的または予後的価値を持ちうる。ある個体についてある期間にわたってＡ蛋白質の量を決定することによって、癌の進行（Ａ蛋白質量が増大）または（例えば治療的処置の結果としての）癌の緩解（Ａ蛋白質量が減少）を監視することができる。検出されるＡ蛋白質の量は、癌成長の存在および活発さの指標として意味を持ちうる。Ａ蛋白質量をその個体のベースライン値との関連で監視するか、癌を持たない個体から得られる同様の生物学的試料中のＡ蛋白質の平均量と比較して監視する。Ａ蛋白質量がその検査の測定によって確立された特定の値より大きければ、その個体は癌を持つと見なされる。この確立された値を超える実際のＡ蛋白質量はその癌の重篤度を示し、治療的処置に伴うかまたは治療的処置とは無関係なＡ蛋白質量の減少は癌重篤度の軽減を示す。本発明のその他の特定の態様として、血液1ml あたりに約10ng以上のＡ蛋白質が存在すれば、転移性癌が予想される。これらの方法における転移性癌の検査も、個体から得られる生物学的試料（例えば血漿、血清、尿などの液体試料）中のＡ蛋白質量の測定に基づく。ここでも、生物学的試料中のＡ蛋白質の量が、その試料を採取した個体中の転移性癌の有無の指標となる。異常に多量のＡ蛋白質は転移性癌の存在を示す。正常量のＡ蛋白質は、その個体が転移性癌を持たないことを示す。これらの検査の有用性は極めて明白である。比較的簡単な検査が原発性または転移性癌の有無の指標となる。生物学的試料中のＡ蛋白質の量を測定するための種々の技術は当業者に知られていて、当業者はそれらを利用できる。これらの技術には、溶媒和操作および遠心分離操作、カラムクロマトグラフィー分離操作もしくはゲル電気泳動分離操作、ろ過操作、酵素的認識操作、またはアフィニティークロマトグラフィーや免疫検定法などのＡ蛋白質を特異的に認識結合する分子を用いる結合操作による試料中のＡ蛋白質の単離および定量が含まれる。かかる特異的結合工程を用い、試料中の特異的結合分子の体積または面積分布を評価することによって、生物学的試料中のＡ- 蛋白質をin situ で検出および定量することもできる。生物学的試料中のＡ蛋白質の量を分析するための好ましい技術は、Ａ蛋白質またはＡ蛋白質の特定のエピトープを特異的に結合する抗体による免疫学的認識である。かかる抗体は本発明の組成物である。これらの抗体はＡ蛋白質決定基を選択的に認識し、これらの決定基に高い親和性で結合する。ウェスタンブロットや電気泳動パターン分析のような操作では、これらの抗体を単独でアフィニティー固定部分または標識結合部分として使用することができるし、サンドイッチ検定法などでは、異なるＡ蛋白質決定基またはエピトープに結合するために複数のこれら抗体を使用することができる。これらの抗体には、Ａ蛋白質に抗体が結合した後の同定を容易にするために、標識として作用する物質が結合していてもよい。本発明の抗体はＡ蛋白質に特異的に結合するので、Ａ蛋白質またはＡ蛋白質の特異的エピトープを特異的に検出することができる。本発明で使用できる抗体は、Ａ蛋白質と反応できる抗体である。抗体という用語はポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を包含するものとする。抗体という用語は、Ａ蛋白質と反応する複数の抗体の混合物（例えばタイプが異なるＡ蛋白質反応性モノクローナル抗体のカクテル）を包含するものとする。さらに抗体という用語は、完全な抗体、生物学的に機能的なその断片、Ａ蛋白質結合特性を持つ一本鎖または一本鎖断片、複数の種に由来する部分を含むキメラ抗体、二機能性抗体などを包含するものとする。使用可能な生物学的に機能的な断片は、Ａ蛋白質に結合できる抗体断片である。キメラ抗体は2 種類の種に由来する部分（例えばヒトの定常領域とネズミの可変または結合領域）を含むことができる。2 種類の種に由来する部分は、従来の技術で化学的に結合してもよいし、遺伝子工学的技術を用いて融合蛋白質として製造してもよい。さらに、キメラ抗体の軽鎖部分と重鎖部分の両方の蛋白質をコードするDNA を、融合蛋白質として一緒に発現させることもできる。Ａ蛋白質とよばれる特殊な細胞内分子はイノシトール関連シグナル伝達系の調節に密接に関係することが決定されている。この系においてＡ蛋白質は、ホスホリパーゼC（PL-C）を活性化して、第2 伝達物質イノシトール-1,4,5- 三リン酸（IP₃）とジアシルグリセロール（DG）を生成することによって機能する。膜結合受容体が刺激されると、Ａ蛋白質はGTP と結合して、PL-Cを活性化するように機能する中間体を形成する。その中間体のGTP がGDP に加水分解されると、PL-C の活性化が終結する。したがってＡ蛋白質は、細胞イノシトール代謝経路の適正な機能には欠かせない重要なG-型シグナル伝達分子である。これらのシグナル伝達分子は、上述の本発明方法で使用する抗体を生産する際に有用である。抗体の生産に使用するシグナル伝達分子は、単離精製されたＡ蛋白質とＡ蛋白質のエピトープ断片である。本発明の癌診断蛋白質、例えばＡ蛋白質は免疫療法にも有用でありうる。これらの蛋白質を血液またはリンパ系に導入すると、それらは、その宿主中の癌の存在に応答、すなわち癌の存在を認識してそれに応答するように、免疫系を刺激できる。したがって、個体の血流またはリンパ系に外部源からこれらの癌診断蛋白質を導入することによって、免疫抑制活性を生じて癌を根絶するように、免疫系を刺激することができる。さらに、本発明の抗体には治療的価値もある。本発明の抗体を個体に投与すると、癌診断蛋白質、例えばＡ蛋白質と免疫反応することによって、例えばT 細胞の産生を刺激するなどして、さらなる免疫系応答を開始し、その個体中に存在する癌を排除することができる。。「Ａ蛋白質」という用語は、元来、この蛋白質の還元条件下のゲルにおける電気泳動移動度に基づく約20キロダルトンの分子量を持つ棹状体光受容器蛋白質を言うものであった。公知のＡ蛋白質遺伝子の発現産物としてその蛋白質を分析すると、Ａ蛋白質の分子量は26キロダルトンである。改良された抽出および分離法と、分離された型の予備的な配列データを結びつけることにより、これまでＡ蛋白質と呼ばれていた存在が、少なくとも2 種類の構造および機能的に関連する蛋白質からなりうることが示される。一つは膜結合型で、もう1 つは可溶型である。これに基づき、使用される命名法は予想されるin vivo を反映する。すなわち、Ａ_m，膜結合型（20kD）およびＡ_s，可溶型（19kD）であり、分子量はやはり還元条件下における電気泳動移動度に基づく。これらのＡ蛋白質は、そのN-末端領域に、配列表に記載の次のようなアミノ酸配列を含む： GNSKSGALSKEILEELQ （配列番号１）（Ａ_m）；および MGNSKSGALSKEILEELQ（配列番号２）（Ａ_s）Ａ蛋白質関連分子のさらなる特徴は、それらがかなり疎水性の領域を持つ単一ポリペプチド鎖を含むということである。また、これらの分子はヌクレオチド、アデノシンおよびグアノシン三リン酸を結合し、それらを加水分解する能力と、 GTP の存在下にホスホリパーゼC 、ホスホリパーゼD およびおそらくはホスホリパーゼA2をも活性化する能力を持つ。Ａ蛋白質は、哺乳類（ウシ）と両生類（カエル）の目の光受容器細胞の棹状体外部セグメント（rod outer segment；ROS）から、抽出、遠心分離、クロマトグラフィーおよび当業者に公知の他の蛋白質精製技術によって単離できる。Ａ蛋白質と類似または同一の物理的および機能的特徴を持つ他の蛋白質が、脊椎動物と無脊椎動物の様々な他の組織から単離されている。これらの発見は、Ａ蛋白質の構造が進化の過程で保存されてきたことを示している。Ａ蛋白質は水溶液中で極めて不安定だが、非イオン界面活性剤を含有する水溶液に入れると、かなり安定化できる。これらの分子は、還元条件下での電気泳動分離中に分子量標準と比較して推測すると、19〜20kDの分子量を持つ。天然蛋白質の好ましい単離法を下記、詳細に開示する。10kDから30kDの範囲の分子量カットオフを持つフィルターを用いることによって、良好な精製結果が得られた。Ａ蛋白質、種々の先端欠失型もしくはムテイン型類似体、Ａ蛋白質ドメインと他の蛋白質ドメインを含む融合蛋白質は、種々の合成手段および生合成手段で製造できる。例えば、微生物、酵母または真核細胞培養物などの適当な宿主細胞を、Ａ蛋白質またはその一部もしくは類似体を発現するように遺伝子操作できる。これは、現在では十分に確立された当業者に公知の組換えDNA 技術で達成できる。組換え法には、Ａ蛋白質またはその一部もしくは類似体をコードする遺伝子の単離または合成、その遺伝子のプラスミドへの組込みが含まれるだろう。Ａ蛋白質のアミノ酸配列は容易に確立できる。配列表に、2 つの型のＡ蛋白質（Ａ_mとＡ_s）のN-末端アミノ酸配列を、それぞれ配列番号1 および配列番号2 として記載する。合成オリゴヌクレオチドからの遺伝子合成法と公知の突然変異誘発技術は、類似体、先端欠失型Ａ蛋白質およびＡ蛋白質またはその結合ドメインを含む融合蛋白質の配列を製造する技術を提供する。かかる物質の生産にはさらに、Ａ蛋白質またはその一部もしくは類似体をコードする遺伝子を含む組換えDNA を保持するベクターによる適当な宿主細胞の形質転換、該形質転換細胞の培養、および発現した蛋白質の単離が含まれる。本明細書に開示するように生産できる高Ａ蛋白質含有試料が利用できるなら、天然型ならびにその様々な一部および類似体の組換え生産は、当該分野の現在の技術水準に十分含まれる。別法として、その蛋白質の少なくとも一部を、アミノ酸を正しい配列で化学的に連結することによって、合成的に製造することもできる。単離されたＡ蛋白質またはその一部もしくは類似体を抗原として、個体から得た液体試料中のＡ蛋白質を検出し、それによって原発性または転移性癌の存在を検査するのに有用な抗体を作成することができる。抗体は、Ａ蛋白質に対して生じ、Ａ蛋白質またはその類似体、断片またはＡ_mもしくはＡ_s上の特定のエピトープに反応することが示されたポリクローナル抗血清の一部であってもよいし、これらの抗体の結合部分であってもよい。抗体は、それ自体は公知の方法で生産されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体でありうる。他の細胞成分と交差反応しないように抗体を選択することが好ましい。抗体はオクタロニー二重拡散試験で決定されるいずれのクラスおよびサブクラスであってもよい。IgG クラスの抗体が好ましい。別法として、Ａ蛋白質を認識する抗体の全部または一部を、生合成手段または組換え手段で合成することもできる。さらに、毒素、蛍光色素、吸収色素、酵素または放射活性マーカーなどの他の機能的分子に抗体を連結してもよい。好ましい態様として、アビジンまたはストレプトアビジンに対してとりわけ強い結合活性を持つビオチン分子に抗体を連結し、そのアビジンまたはストレプトアビジンに蛍光、吸収または放射活性マーカーを連結してもよい。この連結抗体を使用することによって、生物学的試料中のＡ蛋白質を検出し、それによって原発性または転移性癌を検査することができる。抗体- マーカー複合体は化学結合で製造することができるし、そのマーカーが蛋白質ならば組換えDNA 技術で製造することもできる。患者に抗体を投与した直後にその抗体を監視したり、撮像したりすることを可能にする試薬で、抗体を標識することもできる。その標識は、例えば、どちらもガンマシンチレーションカメラのような放射線検出手段で体外から撮像できる¹² ⁵ Iや^99mTcのような放射性同位体であってもよい。別法として、MRI 系で検出できる非放射活性常磁性造影剤で抗体を標識することもできる。かかる系では、強い磁場を用いて患者の体内にある原子の核スピンベクトルを整列させる。次にその場を乱し、その核が平衡整列状態に戻る時に患者の画像を読み取る。本発明では、抗体をガドリニウム、コバルト、ニッケル、マンガンまたは鉄錯体などの常磁性物質に連結することによって、MRI 系で体外から撮像される診断用複合体造影剤を形成させることができる。抗体を機能的マーカーに連結しない場合でも、例えば、遠心分離などの免疫沈降物を回収するための標準的な生化学的技術を用いることによって、抗体-A蛋白質の複合体を検出できる。抗Ａ蛋白質モノクローナル抗体は、例えばウシROS などから精製したＡ蛋白質で予め免疫しておいたマウスの脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞と融合して形成したハイブリドーマ細胞株から得ることができる。免疫原は、公知の装置または手動によるペプチド合成法に従ってin vitroで製造されたＡ蛋白質の誘導体またはその類似体もしくは一部であってもよい。別法として、免疫原（Ａ蛋白質）を当業者に公知の組換えDNA 技術を用いる生合成手段で合成してもよい。融合用の脾臓細胞を選択するマウスは、Balb/Cのように遺伝学的に明確な系統に由来することが好ましい。融合に使用する骨髄腫細胞は哺乳類抗体産生細胞株に由来するが、例えばNS-1のようなマウス細胞株に由来することが最も好ましい。モノクローナル抗体は、その融合産物を注射したマウスの腹水から得ることができる。本発明の好ましい態様において、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体生産用の免疫原は、Ａ蛋白質の既知のアミノ酸配列から取り出した約16アミノ酸のアミノ酸配列を持つペプチドである。この免疫原は10〜18アミノ酸長のペプチドである。特に好ましい態様における免疫原は、Ａ蛋白質の14アミノ酸もしくは16 アミノ酸カルボキシル末端、Ａ蛋白質のアミノ酸60〜71を含むペプチド、Ａ蛋白質のアミノ酸142〜158 を含むペプチド、またはＡ蛋白質のアミノ酸158〜170 を含むペプチドである。この免疫原を使用してサンドイッチ検定法に組込むための抗体を生産する場合は、第1 免疫原の約16アミノ酸ペプチド以外の第2 免疫原をＡ蛋白質から選択する。Ａ蛋白質の第2 免疫原と免疫反応する抗体を得るもう1 つの技術は、動物を無傷のＡ蛋白質で免疫し、第1 免疫原のエピトープ以外のＡ蛋白質エピトープと免疫反応する抗体を選択することである。異なるエピトープと免疫反応する特性を持つ2 組の抗体の生産は、これらの抗体を用いるサンドイッチ検定法が、同じ抗原部位に対する抗体の競合によって妨害されないことを保証する。この特徴は、試料中に存在するＡ蛋白質の実際量を検出するための検査法の感度を増大させる。公知の方法でこのように作成されたポリクローナルおよびモノクローナル抗体はＡ蛋白質特異的であるから、Ａ蛋白質の検査にはとりわけ有用である。本発明では、無傷のＡ蛋白質またはＡ蛋白質の検出できる断片を、本明細書に開示する方法で検査できる。無傷の蛋白質またはその検出できる断片に必須の特性は、これらの蛋白質またはペプチドが検出されうるということ、すなわち固定化または検出抗体と免疫反応できるということである。必要なことは、蛋白質や断片と抗体との複合体の形成と、それら複合体の検出だけである。かかる検出可能な複合体はＡ蛋白質断片でも形成されうる。本発明は、血清や血漿のような生物学的試料中のＡ蛋白質の量を検出する特殊な方法を包含する。この方法では、Ａ蛋白質の第1 エピトープに結合する第1 抗体を固相支持体に付着させる。付着した第1 抗体を、試験対象の生物学的試料と接触させる。それと同時に、あるいはそれに続いて、Ａ蛋白質の第2 エピトープを結合する標識した第2 抗体を第1 抗体- 生物学的試料混合物に加えることによって、上記固相支持体に結合した第1 抗体：Ａ蛋白質：第2 抗体免疫複合体を形成させる。いかなる未結合の第２の抗体も除去し、存在および所望ならば、次いで、マーカーの量を検出し、その存在および量は、試料中のＡ蛋白質の存在および量の指標となる。かかる検定法による異常に大量の検出Ａ蛋白質は、生物学的試料が得られた個体が原発性または転移性癌をもつ高い可能性を有することを示唆する。換言すれば、この検定法は、原発性または転移性癌のための診断である。検査キットも、本発明の態様である。これらの検査キットは、個体から得られた血液等の生物学的試料中に存在する可能性のある、例えば、Ａ蛋白質等の癌診断蛋白質のための検定法を行なうために必要な１以上のポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含む。また、これらの検査キットは、検定法を行なうためにマイクロタイタートレイ等の固相の支持体を有してもよい。Ａ蛋白質のための検定法を行なうための指示も、キットに含んでもよい。所望ならば、同定標識を、検査キットの抗体に付着させることが可能である。検査キットの好ましい態様において、抗原がＡ蛋白質である場合に行なうサンドイッチ検定法を可能にする抗体が提供される。本発明の特に好ましい態様において、サンドイッチ抗体の１つは、未標識であり、固相の支持体に付着させられる。他方の抗体は、検出目的のために結合される標識を有する。以下の実施例により、本発明の性質をさらに開示するが、本発明はこれらの範疇に限定されない。実施例１可溶性（Ａ_s）および膜結合（Ａ_m）Ａ蛋白質の精製Ａ蛋白質を、本質的にSchmidt ら(J．Biol．Chem，262:14333-14336(1987))により記載の方法に従って、カウの眼の網膜から単離した。ウシ科（カウまたはカーフ）の眼は、屠殺後2 時間以内に、地方の屠殺場から入手した。ウシ科の眼を、氷上で暗所で３０分〜６０分間保存した。網膜を解剖し、緩衝液Ａ（１３０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０；カーフ網膜当たり１ｍｌまたはカウ網膜当たり２ｍｌ）中に置いた。容器の緩やかな反復転倒により、緩衝液内に多量のＲＯＳが遊離した。混合物を、ブフナー漏斗に注いで通し、網膜を除去した。濾過物を、コニカル底チューブ中で、氷上５分間静置させ、大きな粒子状物質をＲＯＳ懸濁物が澄むように分離させた。血球計算盤を用いる顕微鏡実験により、９５％を越えるＲＯＳからなる上清が見出された。懸濁物をシリンジ内に吸引したり容器の壁に対して圧出させることを繰り返して起こす切断により、ＲＯＳを破壊した。粒子および水性画分を分離するために、上清を、４℃で２０分間、１０，０００〜１２，０００ｘｇで遠心分離した。ＲＯＳ膜を含むペレットを、除去した上清と等容量の緩衝液Ａで１回洗浄した。生じたペレットを、３〜６ｍｌの緩衝液Ｔ（再蒸留水中、（０．０５％）Ｔｗｅｅｎ２０／８０（１：１））中で再懸濁させ、４５分間１５，０００ｘｇで遠心分離した。前記操作は、暗赤光下で行なった。両Ａ蛋白質溶液（それぞれ、可溶性および膜結合性Ａ蛋白質を含む上清）を、冷却遠心分離機で５，０００ｘｇでの遠心分離により、Centricon ３０微量濃縮機（３０ｋＤの分子量カットオフ、Amicon Corporation）で濾過した。次いで、５，０００ｘｇで、Centricon 10's（１０ｋＤの分子量カットオフ）で限外濾過物を濃縮し、透析した。保持物は、可溶性Ａ蛋白質（Ａ_s）に対しては１００〜２００μｇ／ｍｌおよび膜結合型（Ａ_m）に対しては３０〜１００μｇ／ｍｌの平均濃度を有する１０ｋＤ〜３０ｋＤの蛋白質を含み、０．５〜１ｍｌの体積まで減少した。Ａ_sの精製により３２０倍の濃縮となり、Ａ_mは２０倍に精製された。可溶性Ａ蛋白質溶液を、濃縮および使用前に一晩保存する場合は、濃縮溶液中の蛋白質の凝集を最小にするために、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／８０（１：１）を有する緩衝液Ａを１：５に添加した。前記限外濾過により精製したＡ蛋白質を、緩衝液Ａ（Ａ_s）または緩衝液Ｔ（Ａ_m）でのＢｉｏ−ＳｉｌＳＥＣ−１２５カラムのＨＰＬＣにより、配列分析のためにさらに精製した。溶出は定組成であった。プールしたピークを濃縮し、水に対して透析して分析前に凍結乾燥した。実験に用いる可溶性Ａ蛋白質の純度を確認する目的のために、前記限外濾過により精製したＡ_sを、緩衝液ＡでのＨＰＬＣサイズ排除カラム（ＴＳＫ−２０００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にかけ（図１Ａ）、次いで、ＤＥＡＥアニオン交換カラムの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液中で再クロマトグラフを行なった。蛋白質を、０〜２００ｍＭＮａＣｌ勾配で溶出した（図１Ｂ）。Ａ_mおよびＡ_sの分子量の見積もりは、ＳＤＳゲルでの各相対移動度（実施例２および図２）および検量したゲル濾過カラムから行なった。カラムからの天然型およびゲル上の変性型間の分子量決定の一致は、Ａ蛋白質がin vivo でモノマーとして存在することを示唆する。前記Ａ_sの精製により、９５％の純度を越える調製物を生じた。精製Ａ_s調製物のいかなる蛋白質のコンタミも、試験したいかなる条件下でもグアノシンまたはアデノシンヌクレオチドと相互作用しないことが示された。抽出は連続的であるので、Ａ_mは以下の実施例２に記載のＳＤＳゲルで示し、図２のレーン１に描かれたように、コンタミの検出されない前記手法により本質的に均一に精製される。一旦精製されると、Ａ蛋白質の安定性は、水溶液中で顕著に異なる。Ａ_mは、精製状態で準安定であり、４℃で数日間その機能的特性のほとんどを保持する。また、Ａ_mは、その原活性の１５〜２０％以上を失うことなく、界面活性剤中で凍結融解に耐えることが可能である。それに比べ、Ａ_sは、様々な条件下で不安定であり、４℃の４８時間の期間中で８０％を越える活性損失を避ける満足な取扱い方法が見出されていない。可溶性Ａ蛋白質は、顕著に温度および低温不安定性である。精製Ａ_sは、室温で急速に活性を失い（半減期＝２時間）、凍結により、恐らく変性および／または凝集のため事実上すべての活性を失うという結果となる。精製可溶性型は、界面活性剤処理の非存在下では急速に凝集し、それらの条件下では冷凍庫中一晩で沈殿する。実施例２可溶性（Ａ_s）および膜結合性（Ａ_m）Ａ蛋白質のゲル電気泳動オファーレル（Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ）の方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５０：４００７（１９７５））の改変法に従って、細孔グラジエントゲル（１０〜２０％）中で０．１％ＳＤＳ存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった。試料を、０．３３ｍＭＤＴＴ、７％ＳＤＳ、１７％グリセロールおよび０．５Ｍトリス塩酸、ｐＨ６．８の試料緩衝液中に適用し、平衡化するまで泳動した。安定なポリマーの形成に起因する特別なバンドの出現を避けるために、試料を熱変性させなかった。蛋白質をバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）シルバー染色キットを用いて可視化した。バイオラッドから入手した予め染色した分子量標準物（１７〜９４ｋＤの範囲）を用いて、ゲルを目盛り付した。図２に示されるように、ゲルを還元条件下で泳動するときに、「Ａ蛋白質」は、約２０ｋＤの分子量を有する膜結合型であるＡ_mおよび約１９ｋＤの分子量を有する可溶性型であるＡ_sを含む。可溶性蛋白質は、ゲル上で２つの近接した間隔を有するバンドに分離する。膜結合型は、１つのバンドとして移動する。実施例３Ａ蛋白質に対するネズミポリクローナルおよびモノクローナル抗体の生産Ｂａｌｂ／ｃマウス（６〜８週齢；ジャクソン研究所、バーハーバー、ＭＥ）を、Ａ蛋白質の４回の注射により免疫した。注射を１週間おきに行ない、各機会ごとに５０μｇのＡ蛋白質（Ａ_s、Ａ_mまたは両方のどれか一つ）を注射した。始めの３回の注射を腹腔内に、４番目の注射を静脈内に打った。１回目にはＡ蛋白質を完全Ｆｒｅｕｎｄｓアジュバントと共に、２、３回目には不完全アジュバントと共に、そして最後の回にはアジュバントなしで注射した。最後の注射の前に回収された血清は、固相マイクロタイタープレート酵素結合免疫測定法を用いたところ、精製されたＡ蛋白質に顕著に結合することを示した。最良の免疫応答を有するマウスを最後の注射から３日後に殺した。この動物由来のリンパ球をＣｅｌｌｃｏバイオリアクター内で抗体生産性細胞としてサブクローニングすることにより、前記リンパ球をポリクローナルハイブリドーマとして維持した。それらの生産性細胞を液体窒素低温保存庫内で維持した。それらの生産性細胞由来のネズミポリクローナル抗体は、Ａ蛋白質に対して特異性を示した。ＮＳ−１（Ｐ３ＮＳ−１／１−Ａｇ４−１）骨髄腫細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ロックビレ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、ＭＤ；受入れ番号ＴＩＢ１８）と殺したマウス由来の脾臓細胞とを融合することで、モノクローナルハイブリドーマを生産した。ナダカブカレン（Ｎａｄａｋａｖｕｋａｒｅｎ）の方法（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、２７：２０９−２１２、（１９８４））を使用し、融合を形成した。結果として得られたクローンがＡ蛋白質と結合するか調べた。連続希釈溶液によるサブクローニングを一つのクローンに対して行なった。最も生産性のあるサブクローンをＢａｌｂ／ｃマウスの腹膜腔内に注射し、モノクローナル抗体を含む腹水液を生産した。得られた腹水液を遠心分離し、活性について調べ、その後必要になるまで−７０℃で保存した。結果として得られた１８個の抗Ａ蛋白質抗体を、抗ＩｇＭ、抗ＩｇＧ、抗ＩｇＧｌ、抗ＩｇＧ２ａ、抗ＩｇＧ２ｂおよび抗ＩｇＧ３抗体（カペル（Ｃａｐｐｅｌｌ））に対して寒天プレート中でオクタロニー二重免疫拡散法により抗体アイソタイプについてスクリーニングした。その結果を表１に示す。実施例４Ａ蛋白質によるＧＴＰおよびＡＴＰ結合ならびに加水分解の分析；蛋白質量；Ａ蛋白質の存在Ａ．ＧＴＰアーゼおよびＡＴＰアーゼ分析可溶性および膜結合性Ａ蛋白質の両方によるＧＴＰまたはＡＴＰの加水分解の速度を全量２００μＬ中で分析した。１．０〜１０．０μｇのＡ_sまたはＡ_m、５ ×１０^-5ＭＧＴＰまたはＡＴＰ、６７〜３３５ｎＭ〔γ−³²Ｐ〕ＧＴＰ（２．８Ｃｉ／ｍｍｏｌ）または８８．８〜１７７．５ｎＭ〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰ（２．８Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および２０μＬのＲＯＳ膜片（Ａ_mの場合）をＪ緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．０、０．１ｍＭＥＤＴＡ）中で混合した。ＲＯＳ膜をＣ緩衝液（１００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．０、１ｍＭＭｇＣｌ₂）で３回、０．０１％ポリオキシエチレン２３ラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３５非イオン性界面活性剤、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）を含む水で３回洗浄することにより、ＲＯＳ膜片（レセプターとしてロドプシンを含む）を調製した。膜片を使用前にＤ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．０、０．１ｍＭＥＧＴＡ）中に再懸濁した。光露光試験（各試料に存在する７０％以上のロドプシンを漂白するのに充分な１．８×１０³μＷｃｍ^-2ｓｅｃ^-1を発射する１０ｍｓｅｃキセノン閃光（ニコン（Ｎｉｋｏｎ））において２連でインキュベーションすることにより、ＧＴＰまたはＡＴＰの加水分解における光の効果を調査し、またはコントロールとして暗所中においた。試料を室温で５分間インキュベートし、２００μＬの氷冷冷却緩衝液（５０ｎＭＫＨ₂ＰＯ₄、６％ＮｏｒｉｔｅＡ、１０％ＴＣＡ）で急冷した。試料を氷中に３０分置いておき、微量遠心分離機で５分間遠心分離した。５０μＬの各上清の部分標本をバイアル内に５ｍＬのシンチレーション流体と共に入れ、放射能を分析した。〔γ−³²Ｐ〕−ＧＴＰの加水分解を、光分解されたロドプシンの存在下および非存在下で測定した。Ａ_mのＧＴＰアーゼ活性は、活性化レセプターの存在下で高められた。対照的に、光分解されないロドプシンを暗所中でインキュベーションに添加したとき、加水分解速度に効果は見られなかった。ロドプシンの非存在下または漂白されていないロドプシンの存在下で、Ａ_mはごくわずかなＧＴＰアーゼ活性しか持たなかった。光活性化ロドプシンの存在下で最大速度の半分で両者を測定した場合、モル／モル基準で、Ａ_mによるＧＴＰ加水分解の速度（０．４５８ＧＴＰｓｅｃ^-1／Ａ_m）は、トランスデューシンの速度（０．５１２ＧＴＰｓｅｃ^-1／Ｔα）に匹敵する。２つの精製蛋白質がほぼ等重量モル濃度で存在するとき、Ａ_mおよびトランスデューシンに対するＧＴＰアーゼ速度は相加的である。試験した全ての実験条件下において、精製Ａ_sによるＧＴＰ加水分解（ＧＴＰアーゼ活性）速度は、漂白または非漂白ロドプシンの存在に鈍感であった。基質濃度の１０００倍の範囲を越えるＧＴＰ加水分解速度を測定することにより、Ａ_sおよびＡ_mについて、見かけのミカエリス定数を決定した。二重逆数プロットおよび回帰分析を解釈することにより、Ｋ_mおよびＶ_maxを決定した。データを平均値±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）として示す。結果を表２に示す。ロドプシンの存在下で、Ａ_mおよびＡ_sに対するＫ_m値は似ており、そのことはＧＴＰに対する類似のアフィニティーを示唆する。Ａ_mおよびＡ_sは、結合したレセプターではないＡＴＰアーゼ活性を持つことがわかった。Ａ_mおよびＡ_s両方のＡＴＰアーゼに対するＫ_m値を上記表２に示す。Ａ_mの速度定数の比較により、ＡＴＰに対するそのアフィニティーがＡ_sのものよりほぼ一桁大きいことが示される。Ａ_mおよびＡ_s両方のＧＴＰアーゼ活性およびＡＴＰアーゼ活性に関する相対的なＫ_m値は、ＧＴＰが結合および加水分解に好ましい基質であることを示している。インキュベーションにロドプシンを添加することにより、どちらの蛋白質のＡＴＰ加水分解の速度も高められなかった。ＡＴＰアーゼ速度は、活性化レセプターの存在下でわずかに減退する。Ｂ．ＧＴＰ結合分析ノーザップら（Ｎｏｒｔｈｕｐｅｔａｌ．）の方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７：１１４１６−１１４２３（１９８２））に従って、Ａ_mおよびＡ_sの両方によるＧＴＰアナログＧｐｐ（ＮＨ）ｐおよびＧＴＰγＳ（ニューイングランドニュークレア（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ））の結合の分析を行なった。５〜１０μｇの精製されたＡ蛋白質、１５．３μＭ³Ｈ−Ｇｐｐ（ＮＨ）ｐ（１０μＣｉ）または１．３２μＭＧＴＰγＳ³⁵（１μＣｉ）および緩衝液（１００ｍＭＮａＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．０）を含む全量１００μＬの溶液中で、結合を行なった。試料をボルテックスし、２５℃で３０分間インキュベートし、２００μＬの氷冷緩衝液（０．５ＭＮａＣｌ、０．１Ｍトリス塩酸、０．１％ツイーン８０）で急冷し、氷中に３０分間放置した。前もって２ｍＬの同緩衝液で洗ったニトロセルロースフィルター上に試料を置いた。フィルターを２ｍＬの氷冷緩衝液で５回すすぎ、放射能について分析した。室温で短時間インキュベーションの間に、Ａ_mはＧＴＰγＳおよびＧｐｐ（ＮＨ）ｐの両方と自発的に結合した。その結果を下記表３に示す。この過程は明らかに補因子を必要としなかった。Ａ_mは用いた実験条件下で各ＧＴＰアナログより少ない化学量論的な量で結合した（表３）。補因子の非存在下で同じインキュベーションをしたのち、モル／モル基準でＡ_sはこれらのアナログとほとんど結合しなかった。ＧＴＰγＳは、Ａ_mおよびＡ_sの両方によってＧｐｐ（ＮＨ）ｐよりもより容易に結合された。Ｃ．ＡＴＰ／ＧＴＰ競合ＡＴＰに結合し、ＡＴＰを加水分解するＡ蛋白質の能力のため、Ａ_mおよびＡ_s の混合物に対するＧｐｐ（ＮＨ）ｐの結合におけるのアデノシンヌクレオチドの効果を試験した。精製Ａ_mおよびＡ_sを混合し（１：２）、ＡＴＰまたはＡＤＰとプレインキュベートし、短時間インキュベーション後に急速濾過法によりＧｐｐ（ＮＨ）ｐの結合について分析した。図３に示されるように、ＡＴＰは試験した全ての濃度において、効果的な結合阻害剤であった。ＡＤＰは、より高濃度で濃度依存方式で阻害する。Ｇｐｐ（ＮＨ）ｐの結合におけるアデノシンヌクレオチドの効果と対照的に、それらはＡ蛋白質によるＧＴＰの加水分解においては、ごくわずかな効果しか示さなかった。しかしながらμＭの濃度で、ＧＴＰγＳは、１時間インキュベーションの内にＡＴＰの加水分解をかなり阻害することを見出した（図４）。ＧＴＰには、ＡＴＰ加水分解について似ているがしかし明白でない効果があり、同じかまたは密接に関係するＡ蛋白質上の結合部位に関して、両方のヌクレオチドが競合していることを示している。また、これらの結果は、Ａ蛋白質結合について、ＧＴＰが、ＡＴＰよりさらに効果的な競合剤であるという発見も支持する。Ｄ．蛋白質分析蛋白質濃度は、バイオラッドミクロアッセイ（ｔｈｅＢｉｏ−ＲａｄＭｉｃｒｏａｓｓａｙ）（クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０）を用いて、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２：２４８（１９７６））に従って決定した。ウシ血清アルブミンを標準として用いた。精製物質について行なった蛋白質分析に基づいて、Ａ_sに対するＡ_mの定数（Ａ_m ／Ａ_s）は０．４７である。高圧カラム（２８０ｎｍの光学濃度により概算される）およびスラブゲル（濃度計により概算される）から回収される分離された可溶性物質の量比は、ほぼ均一である。これは、もし２つの可溶性型が異なる遺伝子の産物であれば、全ての型のＡ蛋白質は桿状体から同じ量で溶解されていることを示している。もしそうでないなら、膜結合型は、溶解型の濃度の半分で存在するだろう。Ｅ．Ａ蛋白質に対する検査法Ａ蛋白質に対して生産される本発明の抗体は、ヒトの血清中でその抗原の検出についての検査法を考案するために使用された。手法には酵素結合免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）を用いる。この分析の詳細な説明は下記実施例８にある。本実験に使用されているＥＬＩＳＡの種類は、「サンドイッチ」型のものであった。この検査法には、Ａ蛋白質に特異的な２つの異なる抗体が必要であり、そこにおいて各抗体は蛋白質上の異なるエピトープを認識し、結合する。抗体の一つは、「捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）」剤として役立ち、標準的な９６穴ウェルマイクロタイタープレート内の穴の底をコートするために、修飾しないで使用した。次いで、この抗体の未使用部分をウェルから取り外し、それからブロッキング剤（１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ））を底に置き、非特異的結合部位をブロックした。それから、発端者由来の血清を１から１２時間用意しておいたウェル中でインキュベートし、次いで取り除いた。ウェルを界面活性剤溶液で洗浄し、溶液中の第二抗体をウェルに添加した。この手法で使用した第二抗体は、物理的に酵素等の標識物質に結合している、即ち、例えば、酵素はセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にすることができる。このインキュベーションに続いて、第二抗体を取り除き、ウェルをもう一度洗浄した。最終段階は、適当な比色定量物質を添加することから構成された。捕捉および精製された抗原（Ａ蛋白質）に結合された酵素の様々な組み合わせを用いて、認識部位の重複部分の可能性を決定するためにＥＬＩＳＡを行なうことにより、Ａ蛋白質の異なるエピトープについてこれらの抗体の特異性をあらかじめ決定した。発色量は、ウェルに結合した酵素結合抗体の量と正比例し、「捕捉」抗体によりウェルに結合した抗原の量に比例する。あらかじめ決定した周期の時間（一般的に３０〜１２０分）の間に生産される色の量を分光光度法で決定することで、その結果を定量した。上記に述べたＥＬＩＳＡを用いて、正常の健康なボランティア由来および癌患者由来のヒト血清を、Ａ蛋白質抗原の存在について試験した。正常な個体群を用いて、この検査法における陽性の閾値を決定した。検査法の感度は、既知量の精製抗原を用いて、標準感度曲線を構成することにより決定される際に、少なくとも１ｎｇ／ｍＬの範囲にわたる。この検査法の予備試験的な使用において、試験された患者の個体群により以下の質的な結果が生じた。試験での陽性反応は、正常な患者と比べた際に、肺癌、リンパ腫癌、胃癌、結腸癌、直腸癌及び乳癌と診断された患者から得られた。実施例５Ａ蛋白質のカルボキシル末端領域に免疫反応するウサギポリクローナル抗体の調製以下の手順を用いて、Ａ蛋白質のカルボキシル末端部分に免疫反応するウサギポリクローナル抗体を作製した。１つの手順において、ヒトＡ蛋白質のカルボキシル末端にある１４個のアミノ酸の公開された配列、ＱＦＥＰＱＫＶＫＥＫＭＫＮＡ（配列番号３）を合成した。Ｆｒｅｕｎｄｓアジュバントにおけるこの合成ペプチドの混合物を各ウサギの３〜４の異なる部分に皮下注射した。各注射における合成ペプチドの量は、５０ μｇであった。２週間後、前もって接種された各動物の３〜４の異なる部分に、Ｆｒｅｕｎｄｓアジュバント中の５０μｇの合成ペプチドのブースト注射を打った。２週間後、試験採血を行ない、合成ペプチドを用いて血液中の抗体の力価を評価した。さらに、ブースト注射を、十分な血液中の抗体力価を維持するのに必要なだけ行なった。十分な血液中の抗体力価を有するウサギ由来の血清を集め、固体基質上に固定された合成カルボキシル末端ペプチドを用い、アフィニティークロマトグラフィー技術によって、所望の抗体を精製された画分として得た。精製された抗体を、水中で透析により沈殿させ、次に使用するまで乾燥粉末として保管した。それらのウサギポリクローナル抗体は、Ａ蛋白質のカルボキシル末端領域由来のペプチドに反応し、ＣＹ２Ａ抗体と称した。他の手続きにおいては、Ａ蛋白質のカルボキシル末端の約１６個のアミノ酸のペプチド配列が人工的に生産された。それから、このペプチドを強い免疫応答刺激性（アジュバント）分子：キーホールリンペットヘマシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔｈｅｍａｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）に結合させる。それから、ペプチド−ＫＬＨ結合物を抗体生産に用いられる標準的な手順により、ウサギ内に注射した。次にそのウサギを採血し、血清を試験したところ、血清が免疫原として用いたＡ蛋白質カルボキシル末端ペプチドに対して陽性であることが分かった。これらのウサギポリクローナル抗体をＣＰＤＤと称した。実施例６液体試料中のＡ蛋白質の存在の検査特定の試料中のＡ蛋白質の存在を検出するために、下記の手順の一つが行われた。：Ａ．実施例３のモノクローナル抗体（３Ｂ９Ｅ１抗体）の一つを含む一定分量の標準溶液を９６ウェル滴定トレーの各々のウェルに入れ、各々のウェルの底面層に残りの抗体が付着するように乾燥させた。一定分量の１％のウシ血清アルブミン溶液を、目的物をブロッキングするために、各々のウェルに添加した。残りの液体を取り除いた。各々の試料を試験するために、５０〜１００μＬの試料を特定のウェルに入れ、室温で１時間インキュベートした。液体部分を、デキャントし、各々のウェルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた、実施例５の抗体（ＣＹ２Ａ抗体）を含む一定分量の標準溶液を各々のウェルに注入し、室温で１時間インキュベートした。液体部分を取り除き、各々のウェルをＰＢＳで洗浄した。最後に、一定分量の西洋ワサビペルオキシダーゼの基質である、２，２’−アジノ−ジ−〔３−エチル− ベンズチアゾリンスルフォネート（６）〕ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）を添加し、３７℃で１時間で発色させた。各々のウェルの発色の程度を、４１０ｎｍで吸光度の示数を得ることにより定量した。これらの発色測定値を、標準曲線と比較することにより単位に変換した。Ｂ．もう一つの方法として、ビオチン／ストレプトアビジン検出系を利用した。実施例５のＣＰＤＤ抗体を、共有結合作用を用いて、ビオチンと結合させた。ビオチンの活性化Ｎ−ヒドロキシ−サクシニミドエステルを、精製した抗体とともに反応させ、ビオチン分子と抗体分子上の第一アミンとの共有結合を生じさせた。未反応のビオチンはクロマトグラフィーで取り除いた。次に、抗体を、最適の検査希釈を調べるために、免疫抗原を用いて力価を測定した。一般に、手順を下記のように行った：まず、ビオチン化抗体をその標的抗原と結合させた。同時に、同じ抗原を捕まえた固相支持体（マイクロタイタープレート）に第２抗体を固定した。結合していない抗体を洗浄で取り除いた後、抗体：抗原：ビオチン化抗体の複合体をレポーター分子として、通常西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素と結合させたストレプトアビジンと反応させた。非結合ストレプトアビジン：酵素を取り除くために、もう一度洗浄工程を行った。ストレプトアビジンでラベルした酵素に特異的な基質は、残りのストレプトアビジン：酵素複合体と共に反応した。色を生じる生成物に加水分解する基質量は、このように試料中に存在する抗原の量に正比例した。ビオチン／ストレプトアビジン検出系の利点は、抗体活性を失わずに多数のビオチン分子で穏やかに抗体をラベルすることができることである。一つ以上のビオチンが各々の抗体分子上に存在しているという事実により、多数のストレプトアビジン分子の二次結合を通じて、シグナルを増幅する。特に、ビオチン化抗体を用いた手順を下記のように行った：実施例３のモノクローナル抗体（３Ｂ９Ｅ１抗体）のうち一つを含む一定分量の標準溶液をマイクロタイタープレートの個々のウェルに入れた。抗体を各々のウェルの底および側面に吸着させた。残りの溶液をウェルから吸引し、一定分量の２０％シュークロースを含む１％ウシ血清アルブミン溶液を、目的物をブロックするために各々のウェルに添加した。残りの液体を取り除いた。次の試薬をあらかじめ室温に温めておいた。患者試料（ＥＤＴＡ血漿）を混ぜ、もし粒子状物質が観察されれば、試料を遠心分離で浄化した。患者の血漿５０ μ１分量と、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンを入れたｐＨ７．４の０．０５Ｍリン酸緩衝生理食塩水のビオチン化ＣＰＤＤウサギポリクローナル抗体２００μ Ｌを混ぜ、個々のウェルに添加した。これらの溶液は、ウェル中で２時間インキュベートさせた。それらを吸引し、アスピレーションを用いて３回洗浄した。本手順のこの点で、２００μＬのストレプトアビジン：西洋ワサビペルオキシーゼ酵素結合体を各々のウェルに添加し、周囲の温度で１時間インキュベートした。次にウェルを、上記のように３回洗浄し、吸引した。この工程の後、２００ μＬのテトラメチル−ベンジジン基質を各々のウェルにピペットでいれ、周囲の温度で２０分間インキュベートした。そして、１００μＬの停止溶液（０．０５Ｍ硫酸）を添加した。各々のウェルの吸光度は、２連波長マイクロタイタープレート分光光度計で４５０／６３０ｎｍを読み取った。各々の試料の平均吸光度を計算した。（もし２連が１０％以上一致していなければ、その試料を繰り返した。）スケールを外れた吸光度示数を有する試料を、希釈し、再検査した。各々の試料の平均値を陰性対照の平均値で割り、Ｐ／Ｎ値を出した。２．０以上のＰ／Ｎを有する試料は、陽性として記録した。陰性対照値（Ｎ）のベースラインを確立するために、最初に、４０の陰性試料を２連で検査し、陽性と陰性の試料間のカットオフを確立するのにふさわしい値を同定した。算術的平均を、最高と最低の二つの吸光度の試料を除き、残りの試料の平均値と標準偏差を再計算することにより算出した。確実なカットオフを、残りの試料の平均値を超える２つの標準偏差に任意に定めた。一致的に、平均と２つの標準偏差は平均値の２倍に非常に近い。これ故に、いくつかの検査には、未知の試料を陰性対照試料の平均値で割って、いわゆるＰ／Ｎ比を確立した、２．０のカットオフの確実性を使った。続いて、陰性のヒト血清のプールをコントロール／標準検査として扱うために得た。この材料は、前記陰性試料の算術的平均値と本質的に同一の平均の吸光度をもつ。このように、この陰性対照は、検査対照として扱う陰性血清に対して換算する。この検査対照プールを、各々の検査に対して２連で行い、平均の吸光度は、陰性対照の平均値の２倍として提示したカットオフの確実性として計算された。実施例７転移性のガンの存在を予測するためのスクリーニング手順何人かの個体由来の血液試料を集めた。転移性の乳ガンを持つと診断された人々、ガンの徴候が無い対照母集団、および以前にガンであると診断されていたが、血液サンプリングの時、彼らの乳ガンが緩解状態にあると診断された人々が、個体群に含まれる。各々の個体由来の血液試料の一部を、実施例６Ａの検査の試料として使用した。各々の個体由来の血液試料の検査の結果は、表４に示す。ＮＥＤとラベルした診断は、病気の再発の証拠が無いことを示す。この検査の結果を、図１に示す。対照として、および、ガンが緩解状態にある人として認められた個体の組み合わせについての平均検査結果は、４．５ｎｇＡ蛋白質／ｍｌ血液である。転移性の乳ガンをもつ個体の平均検査結果は、２３．４ｎｇＡ蛋白質／ｍｌ血液である。転移性のガンであるが、対照とＮＥＤの範囲内の検査結果をもつとして診断された一個体を除いて、全ての検査結果は明らかに二つの異なる群、つまり、ガンの兆候がない個体群と転移性の乳ガンにかかった個体群に分けることができた。このような区分は珍しい。これらの結果の統計的な有意性は、両側検定ｔ−試験で、ｐ＜０．００１であった。実施例８原発性ならびに転移性のガンの存在を予測するスクリーニング手順広いスクリーニング手順において、８００人以上の患者由来の血液血漿試料を、実施例６Ｂの検査プロトコールに付した。患者母集団はガンでない個体（対照）、いろいろな段階の原発性ガンをもつ個体、転移性のガンをもつ個体および良性の腫瘍をもつ個体を含む。スクリーニング手順は、機械的な仕方で行われ、Ａ蛋白質検査結果を、次に、検査証明の目的のために無関係な臨床診断と緊密に提携させた。このスクリーニング手順の結果を表５に示す。無関係な診断の結果（感受性）と比較した検査により、正しく評価したガンの種類、ガンのステージおよび個体の数を示す。さらに、検査は、正常の（ガンにかかっていないステージの）個体と良性の腫瘍の患者に対して行われた。その結果を、表６に示し、個体に対するＰ／Ｎ比が２．０以下である時、そこに「正しい」検査結果（個体がガンではないという正しい決定）が生じた。これらの検査の結果は、検査手順がガンにかかっていない個体の考慮を除く一方、ガンにかかっている個体を見分ける予測能力があることを示す。この検査により検出されるガンは、原発性ならびに転移性のガンを含む。ステージ１およびステージ２を含む様々なステージのガンを検出する。特に、乳ガン、前立腺ガン、原発性肝臓ガン、リンパ腫、肺ガン、結腸ガン、膀胱ガン、子宮内膜ガンおよび多発性骨髄腫が本発明の検査を用いて、たやすく検出できる。均等物本発明は、好ましい態様それ自体に関して特に示され、述べられたが、形態および詳細な説明において様々に変化したものが、付随のクレームにより定義されるような意図と範囲から離れることなく、実施されることが当業者によって理解されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者シュミット，ジェフリージェイ. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02061 ノーウェル，ティファニーロード 73 (72)発明者ホフマン，ケネスエル. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02093 レンダム，コンストックドライブ 95

Claims

【特許請求の範囲】１．下記工程からなる個体における癌の存在の検出方法：（ａ）該個体から生物学的試料を得る工程；（ｂ）該生物学的試料を、Ａ蛋白質と免疫反応性である少なくとも１つの抗体とインキュベートする工程；（ｃ）工程（ｂ）のインキュベーションの結果として生成する免疫複合体を検出する工程；および（ｄ）工程（ｃ）の免疫複合体の量と癌の存在を相関させる工程、該量が閾値よりも大きい場合癌が存在する。２．下記工程からなる個体における癌に罹った状態(cancerous state)の存在の検出方法：（ａ）該個体から液体試料を得る工程；（ｂ）２つの抗体のうちの１つがＡ蛋白質アミノ酸配列由来の約１６アミノ酸の特定の配列を有するペプチドと免疫反応性であり、他の抗体がＡ蛋白質配列の特定の約１６アミノ酸を有する該ペプチド以外のＡ蛋白質の一部と免疫反応性である、該液体試料を抗体サンドイッチ検定法に付す工程；（ｃ）工程（ｂ）で生成した抗体−Ａ蛋白質サンドイッチの量を検出する工程；および（ｄ）該個体において該量と癌に罹った状態を相関させる工程、該量が閾値よりも大きい場合該癌に罹った状態が存在する。３．該２つの抗体の少なくとも１つがモノクローナル抗体である請求項２記載の方法。４．Ａ蛋白質配列の特定の約１６アミノ酸を有する該ペプチド以外のＡ蛋白質の一部と免疫反応性である抗体が、モノクローナル抗体である請求項３記載の方法。５．Ａ蛋白質アミノ酸配列由来の約１６アミノ酸の特定の配列を有するペプチドと免疫反応性である抗体が、付着検出標識を有するポリクローナル抗体である請求項４記載の方法。６．該液体試料の液体が血液である請求項２記載の方法。７．（ｉ）Ａ蛋白質配列の特定の約１６アミノ酸を有する該ペプチド以外のＡ蛋白質の一部と免疫反応性である抗体が、固相表面に付着するモノクローナル抗体であり；および（ii）Ａ蛋白質アミノ酸配列由来の約１６アミノ酸の特定の配列を有するペプチドと免疫反応性である抗体が、付着検出標識を有するポリクローナル抗体である請求項６記載の方法。８．該付着検出標識がビオチンである請求項７記載の方法。９．該閾値が陰性対照値の平均の２．０倍である請求項７記載の方法。１０．該癌に罹った状態が、乳癌、前立腺癌、原発性肝臓癌、リンパ腫、膵臓癌、肺癌、結腸癌、膀胱癌、子宮内膜癌および多発性骨髄腫からなる群より選ばれたものである請求項９記載の方法。１１．Ａ蛋白質アミノ酸配列由来の約１６アミノ酸の該特定の配列が、Ａ蛋白質のアミノ酸１４２〜１５８またはＡ蛋白質のカルボキシ末端の１６アミノ酸のいずれかである請求項７記載の方法。１２．個体の血流中の上昇したレベルが個体が癌を有する予測となる、下記工程からなる癌診断蛋白質の検出方法：（ａ）該癌診断蛋白質のアミノ酸配列由来の約１６アミノ酸の特定の配列を有するペプチドと免疫反応する抗体および癌診断蛋白質配列の特定の約１６アミノ酸を有する該ペプチド以外の該癌診断蛋白質の一部と免疫反応する抗体とともに、該個体由来の液体試料をインキュベートする工程、そうすることによって、該癌診断蛋白質および２つの抗体間の免疫複合体が生成される；および（ｂ）工程（ａ）で生成した該免疫複合体の量を検出する工程。１３．該液体試料の液体が血液である請求項１２記載の方法。１４．該液体試料を両方の該抗体と同時にインキュベートする請求項１３記載の方法。１５．（ｉ）該癌診断蛋白質のアミノ酸配列由来の約１６アミノ酸の特定の配列を有するペプチドと免疫反応性である該抗体が、付着検出標識を有するポリクローナル抗体であり；および（ii）癌診断蛋白質配列の特定の約１６アミノ酸を有する該ペプチド以外の該癌診断蛋白質の一部と免疫反応性である該抗体が、固相表面に付着するモノクローナル抗体である請求項１４記載の方法。１６．該付着検出標識がビオチンである請求項１５記載の方法。１７．該液体試料を２つの該抗体と同時にインキュベートする請求項１３記載の方法。１８．第１に、癌診断蛋白質配列の特定の約１６アミノ酸を有する該ペプチド以外の該癌診断蛋白質の一部と免疫反応性である該抗体と、該液体試料をインキュベートし、次いで、該癌診断蛋白質のアミノ酸配列由来の約１６アミノ酸の特定の配列を有するペプチドと免疫反応性である該抗体とインキュベートする請求項１３記載の方法。１９．（ｉ）癌診断蛋白質配列の特定の約１６アミノ酸を有する該ペプチド以外の該癌診断蛋白質の一部と免疫反応性である該抗体が、固相表面に付着するモノクローナル抗体であり；および（ii）該癌診断蛋白質のアミノ酸配列由来の約１６アミノ酸の特定の配列を有するペプチドと免疫反応性である該抗体が、付着検出標識を有するポリクローナル抗体である請求項１８記載の方法。２０．該癌診断蛋白質が、Ａ蛋白質である請求項１５記載の方法。２１．陰性対照値の平均の２．０倍より大きい該免疫複合体の量が、該個体が癌を有する予測となる請求項２０記載の方法。２２．該癌診断蛋白質のアミノ酸配列由来の約１６アミノ酸の該特定の配列が、該癌診断蛋白質のアミノ酸１４２〜１５８または該癌診断蛋白質のカルボキシ末端の１６アミノ酸のいずれかである請求項２０記載の方法。２３．下記工程からなる個体における転移性癌の存在の検出方法：（ａ）該個体から生物学的試料を得る工程；（ｂ）該生物学的試料を、Ａ蛋白質と免疫反応性である少なくとも１つの抗体とインキュベートする工程；（ｃ）工程（ｂ）のインキュベーションの結果として生成する免疫複合体を検出する工程；工程（ｃ）で検出する異常に大量の該免疫複合体の量が、該個体における転移性癌の存在の指標となる。２４．該生物学的試料が血液である請求項２３記載の方法。２５．癌が乳癌である請求項２４記載の方法。２６．１つの抗体が３Ｂ９Ｅ１抗体であり、別の抗体がＣＹ２ａである請求項２３記載の方法。２７．Ａ蛋白質と結合して免疫複合体を生成する抗体であって、生物学的試料中に免疫複合体が異常に大量に存在することが、該生物学的試料が得られた個体において癌の存在の予測となる抗体。２８．該生物学的試料が血液である請求項２７記載の抗体。２９．該抗体が、３Ｂ９Ｅ１抗体、ＣＹ２ａ抗体およびＣＰＤＤ抗体からなる群より選ばれたものである請求項２８記載の抗体。３０．下記からなる個体における癌の存在の検出用検査キット：（ａ）癌診断蛋白質のアミノ酸配列由来の約１６アミノ酸の特定の配列を有するペプチドと免疫反応する第１の抗体；および（ｂ）癌診断蛋白質配列の特定の約１６アミノ酸を有する該ペプチド以外の該癌診断蛋白質の一部と免疫反応する第２の抗体。３１．該第１の抗体または該第２の抗体のいずれかが、付着同定用標識を有する請求項３０記載の検査キット。３２．該第１の抗体および該第２の抗体の少なくとも１つがモノクローナル抗体である請求項３０記載の検査キット。３３．該第１の抗体が付着同定用標識を有するポリクローナル抗体であり、該第２の抗体が固相表面に付着するモノクローナル抗体である請求項３２記載の検査キット。３４．該付着同定用標識がビオチンである請求項３３記載の検査キット。３５．該癌診断蛋白質がＡ蛋白質である請求項３０記載の検査キット。３６．該癌診断蛋白質のアミノ酸配列由来の約１６アミノ酸の該特定の配列が、該癌診断蛋白質のアミノ酸１４２〜１５８または該癌診断蛋白質のカルボキシ末端の１６アミノ酸のいずれかである請求項３５記載の検査キット。