JPH05508552A - ヒトＧＭ―ＣＳＦレセプターのβ―鎖およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆレセプターのβ−鎖およびその使用発明の分野 本発明は一般にヒト顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ８Ｆ ）レセプター、より詳細にはヒトＧＭ−Ｃ３Ｆレセプター構成部分の合成、なら びにこのレセプター構成部分をヒトＧＭ−Ｃ３Ｆのアゴニストおよびアンタゴニ ストのスクリーニングに使用することに関するものである。

背景 循環する血球は新たに形成される血球により絶えず置換されている。置換する血 球は造血と呼ばれる過程で形成される。これは下記の主要な２系統内の少なくと も８種類の成熟血球タイプの産生を伴うものである＝（１）骨髄系統、これには 赤血球、マクロファージ（単球）、好酸性顆粒球、巨核球（血小板）、好酸性顆 粒球、好酸性顆粒球（マスト細＃ｌ）が含まれる：および（２）リンパ系統、こ れにはＴリンパ球および８９２３球が含まれる［バーゲスおよびニコラ（Ｂｕｒ ｇｅｓｓ、Ｎ１ｃｏｌａ）、Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（アカデミツク・プレス、ニューヨーク、１９８３）］。血球形成の 制御は大部分がコロニー刺激因子（ＣＳ　Ｆ）と呼ばれる一部の相互作用性糖蛋 白質により仲介される。これらの蛋白質はそれらの存在を検出するために用いら れるインビボおよびインビトロアッセイ法のため、このように命名されている。

半固形培地における造血細胞のクローン培養技術は、インビトロアッセイ法の開 発に際して特に重要であった。このような培養においては、個々のプロジエニタ −（ｐｒｏｇｅｎｉ　ｔｏｒ）細胞（すなわち発生上は特定の系統に約束されて いるが、なお増殖しうる細胞）が、それに匹敵するインビボでの過程と本貫的に 等しいと考えられる様式で増殖して、成熟した子孫のコロニーを形成しうる。造 血におけるＣ３Ｆの役割は多くの総説の主題であり、血液の疾患または欠乏を処 置しなければならない臨床研究者にとって大きな関心事である：たとえばメトカ ーフ（Ｍｅｔｃａｌｆ）、　Ｔｈｅ　Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃｏ１ｏｎｙ　 Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒｓ（エルゼビル、ニューヨーク、１９８ ４）；クラークおよびカーメン（Ｃ１ａｒｋ、Ｋａｍｅｎ）、５ｃｉｅｎｃｅ、 Ｖｏｌ。

２３６、ｐ、１２２９−４２３７　（１９８７）；ザクス（Ｓａｃｈｓ）、Ｓｃ 　１ｅｎｃｅ、Ｍｏ１．２３８．　ｐ、１３７４−１３７９　（１９８７）；デ クスター（Ｄｅｘｔｅｒ）　ら！１．Ｃｏ１ｏｎｙ　Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　 ＦａｃｔｏｒＳ（デツカ−、：−ユ　Ｅ−り、１９９０）；ならびにモースタイ ン（Ｍｏｒｓｔｙｎ）　ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、■ｏ １．７．ｐ、４４３−４５６　（１９８９）。

Ｃ８Ｆは骨髄性白血病の発生および進行に関与すると考えられる：たとえばメト カーフ（Ｍｅｔｃａｌｆ）、Ｈａｍａｔｏｌ、Ｂｌｕｔｔｒａｎｓｆｕｓ、。

Ｖｏ　１．　３１．　ｐ、１６−２５　（１９８７）　、　骨髄性白ＩＶＭｉ； ｔＱ粒球−マクｏ７ｙ−ジ前駆細胞のクローン新生物であり、これらは主要な２ 群：慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に属する。

ＣＭＬは、骨髄内で成熟のあらゆる段階の顕粒球−単球集団が増大し、膵臓およ び血液中の造血細胞集団の著しい拡大を伴うことを特色とする。化学療法は白血 病細胞集団の過度のサイズを縮小するのには成功したが、通常の方式は末端の急 性トランスフｔ−メーク３ン（未成熟または異常な形態になる細胞集団が漸増す る）の予防または罹患患者の延命には成功していない（メトカーフ（Ｍｅｔｃａ ｌｆ）、前掲、１９８４）。ＡＭＬは、しばしば顆粒球−単球細胞の成熟の兆候 をほとんど、または全く伴わない未成熟の顆粒球−単球芽細胞の蓄積を特色とす る。この疾患は主として骨髄において起こり、膵臓の肥大は通常は中程度にすぎ ない。全血液有核細胞は増加する場合、または増加しない場合があるが、高い割 合の未成熟芽細胞があり、成熟細胞が相対的に少ない。通常は貧血、血小板減少 症を伴い、相対的に骨髄および抹消血中に成熟したＩｌｉ粒球および単球が存在 しなくなる。通常は制御し得ない出血または抗し難い感染症のため死亡する（メ トカーフ（Ｍｅ　ｔ　ｃ　ａ　Ｉ　ｆ）。

前掲、１９８４）。

両形態の白血病とも、コロニー刺激因子、特にＧＭ−Ｃ８Ｆの異常な産生、また はその関与により駆動されると考えられる。特に若干のＡＭＬ患者からの白血病 細胞はＧＭ−Ｃ５Ｆを構成的に発現するのでインビトロで自律増殖しうろこと、 およびこの自律増殖はＧＭ−Ｃ５Ｆ中和性抗血清の添加により阻止しうろことが 示された［ヤング（Ｙｏｕｎｇ）ら、ＢＩｏｏｄ、Ｖｏｌ、６８．ｐ、１１７８ −１１８１　（１９８６）］。骨髄性白血病、特にＡＭＬは、ＧＭ−Ｃ３Ｆが細 胞増殖を刺激する能力をブロックすることにより処置しうると考えられる。

最近、ヒトＧＭ−Ｃ５Ｆの低親和性レセプター（ここではα−鎖と呼ぶ）がクロ ーン化され、解明された［ギアリング（Ｇｅａｒｉｎｇ）ら、ＥＭＢＯＪ、。

Ｍｏ１．８．ｐ、３６６７−３６７６　（１９８９）］、高親和性のヒトＧＭ− ＣＳＦレセプターが得られれば、候補となるＧＭ−Ｃ５Ｆアゴニストおよびアン タゴニストをスクリーニングするための有用な道具となるであろう。

発明の概要 本発明は、高い親和性においてヒトＧＭ−Ｃ３Ｆと結合するヒトＧＭ−Ｃ３Ｆレ セプター構成部分（ここではヒトＧＭ−Ｃ３Ｆレセプターのβ−鎖と呼ぶ）およ びその組成物に関するものである。本発明は、β−鎖レセプターの対立遺伝子的 および遺伝子工学的に形成された変異体を包含し、かつβ−鎖レセプターならび にその対立遺伝子的および遺伝子工学的に形成された変異体をコードする核酸を 包含する。好ましくは本発明のレセプター構成部分は、配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ Ｎ０．）２に示されるアミノ酸配列により定められるオーブンリーディングフレ ームのポリペプチド群から選ばれる。

極めて好ましくは、本発明のレセプター構成部分は配列番号（ＳＥＱ　ＩＤＮ０ ．）２に示され、ただしシグナル配列を欠如するアミノ酸配列により定められる 。

配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、）２に示される式（リーダー配列を含むもの、 または含まないもの）にはレセプターのβ−鎖の細胞内ドメインが含まれるが、 その細胞外およびトランスメンブランドメインを保持し、かつそれがα−鎖と作 動的に結合する能力を保持するトランケートした配列（リーダー配列を含むもの 、または含まないもの）が本発明の概念に包含されることは明らかである。

本発明は一部は、高いＵ相性においてヒトＧＭ−Ｃ５Ｆに結合する蛋白質を発現 しうるｃＤＮＡを見出してクローニングしたことに基づく。ｐＫＨ９７と表示さ れるこのような１クローンがアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ ＡＴＣＣ）（マリーランド州ロックビル）に１９９０年７月１７日に受託番号４ ０８４７で寄託された。本発明は核酸、すなわち（ｉ）ｐＫＨ９７のｃＤＮＡ挿 入配列に作用的に相同であるもの（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｈｏｍｏｌｏｇｏ ｕｓＬおよび（ｉ　ｉ）低親和性α−鎖レセプター蛋白質と結合した高親和性Ｇ Ｍ−Ｃ５Ｆレセプターを形成する蛋白質、たとえばｐＫＨ１２５（同様にＡＴＣ Ｃに１９９０年７月１７日に受託番号４０８４８で寄託された）によりコードさ れる蛋白質をコードするものを包含する。ここで用いる、ＧＭ−Ｃ３Ｆレセプタ ー結合に関する高親和性とは、ＧＭ−Ｃ３Ｆがレセプターの結合したα−鎖およ びβ−鎖に少なくともいずれかの単独構成部分への結合に関するものより低いオ ーダの結合定数で結合することを意味する。より好ましくは高親和性とは、ＧＭ −ＣＳＦがレセプターの結合したα−鎖およびβ−鎖に１ｎＭ以下、極めて好ま しくは２００ｐＭ以下の結合定数、Ｎ４、で結合することを意味する。

図面の簡単な説明 図ＩＡは、ｐＫＨ９７およびｐＫＨ１２５で一時的に（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ ）同時トランス７４クトされた（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）ＣＯＳ　７細 胞への＋ｚｓ　■−標識ヒヒトＭ−Ｃ８Ｆの結合を示す。

図ＩＢは、ｐＫＨ９７およびｐＫＨ１２５で安定に同時トランスフェクトされた Ｎ［Ｈ３Ｔ３細胞ヘノ”Ｓ　Ｉ　ｌ！！ｌ　トＧＭ−ＣＳ　Ｆ（７）結合ヲ示ス 。

図２Ａは、ＮＩＨ３Ｔ３安定トランスフェクト体に対する＋ｔＪ−標識ヒトＧＭ −Ｃ３Ｆの結合速度を示す。

図２Ｂは、ＮＩＨ３Ｔ３安定トランスフェクト体に対するｌ！Ｊ−標識ヒトＧＭ −Ｃ３Ｆの解離速度を示す。

図３はベクターｐＭＥ１８の制限地図である。

発明の詳細な説明 発明のｃＤＮＡクローンから誘導されたハイブリダイゼーションプローブにより 検出可能であることを意味する。レセプターβ−鎖をコードする核酸を検出する のに必要な相同性の厳密な数値的尺度は、下記を含めた数種の因子に依存する。

（１）ターゲット核酸と結合した非β−鎖コード配列に対するプローブの相同性 、（２）ハイブリダイゼーシラン条件のストリンジエンシー、（３）−水路また は二本鎖のいずれのプローブを用いるか、（４）ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれの プローブを用いるか、（５）プローブへの非特異的結合を減少させるために採用 する手段、（６）プローブを＆ｌするのに用いる方法の性質、（７）プローブ中 のグアニジンおよびシトシン塩基の割合、（８）プローブとターゲットの間の誤 対含の分布、（９）プローブのサイズなど。好ましくは、作用的に相同な核酸配 列は本発明のｃＤＮＡに少なくとも７０％相同である。より好ましくは、作用的 に相同な核酸配列は本発明のｃＤＮＡに少なくとも９０％相同である。より詳細 には作用的に相同な核酸配列は、わずかな、たとえば百以下の擬陽性シグナルに おいて、標準ハイブリダイゼーションプローブールを用いて配列番号（ＳＥＱ　 ＩＤＮ０．）１の核酸配列に基づくプローブによりそのｃＤＮＡを単離すること ができるものである。このようなハイブリダイゼーシヨンの条件を選択する際の 指針を与える多数の文献がある：たとえば数例を挙げるとヘイメス（Ｈａｍｅｓ ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ　Ｐｒａｃ ｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　（ＩＲＬブレス、ワシントンＤ、Ｃ，，１９８ ５）；グレイ　（Ｇｒａｙ）　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、 、Ｍｏ１．８０、ｐ、５８４２−５８４６　（１９８３）；カファトス（Ｋａｆ ａｔｏｓ）ら。

えば配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、）１の核酸をヘントンおよびディビス（Ｂ ｅｎｔｏｎ、Ｄａｖｉｓ）、５ｃｉｅｎｃｅ、Ｙｏｕ、１９６．ｐ、１８０　（ １９７７）ｌこよるｇ己載（こ従ってコロニーハイブリダイゼーシランにおける プローブとして用いることができる。用いるプローブにつき低いストリンジエン シー条件を採用することが好ましい。（解離温度はプローブの長さに依存する。

）たとえば約２０−４０塩基のプローブについて一般的なプレハイブリダイゼー ンラン、ハイブリダイゼーシヨンおよび洗浄のプロトコールは以下のとおりであ る：　（１）プレハイブリダイゼーシラン：変性したターゲットＤＮＡを含むニ トロセルロースフィルターを５５℃で３−４時間、５Ｘデノハルツ液、５ＸＳＳ ＰＥ　（２０ＸＳＳＰＥは、８００ｍ１の８２０中、１７４ｇのＮａＣ１，２７ ，６ｇのＮａＨｚＰＯｓ”ＨｚＯおよび７，４ｇのＥＤＴＡからなる；ＩＯＮ　 ＮａＯＨでｐＨ７゜４に調整）、０．１％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌの変 性サケ精子ＤＮＡ中においてインキュベートする、（２）　ハイブリダイゼーシ ラン：フィルターをプレハイブリダイゼーシシン溶液＋プローブ中において５５ ℃で２時間インキュベートする、（３）洗浄：３００−５００ｍｌ容量の６ＸＳ ＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中において室温で１５分間の洗浄３回、次いで３００ −５００ｍｌのｌＸ５ＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中において５５℃で１−１．５ 分間の最終洗浄。他の均等な方法、たとえば有機溶剤、たとえばホルムアルデヒ ドを用いるものが当技術分野で周知である。

ここで用いる相同性という語は、２種類のヌクレオチド（またはアミノ酸）配列 間の類似性の尺度である。相同性は２種類の配列（恐ら（等しくない長さの）を 並べたのちの対合塩基（またはアミノ酸）の割合または％として表わされる。

並べるという語は、サンコツおよびクルスカル（Ｓａｎｋｏ　ｆ　ｆ、Ｋｒｕｓ ｋａｌ）によりＴｉｍｅ　Ｗａｒｐｓ、Ｓｔｒｉｎｇ　Ｅｄｉｔｓ、ａｎｄ　Ｍ ａｋｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｔｈｅ　Ｔｈｅｏｒｙ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃ ｅｏｆ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ（アデイソンーウエスレイ、 マサチュセブツ州しディング、１９８３）の第１章に定義された意味で用いられ る。

おおまかには、最大のオーバーラツプが得られるようにいずれかの配列に最小数 の″ブランク″または′ゼロ゛塩基を挿入して、２つの配列間の対合塩基（また はアミノ酸）の数が最大となるように２つの塩基を並べる。２配列が与えられた 場合、それらの相同性を計算するためのアルゴリズムが得られる。たとえばニー ドルハムおよびブンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｈａｍ、Ｗｕｎｓｃｈ）、Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、、Ｖｏｌ、４８．ｌ）、４４３−４５３　（１９７０）　サンコツお よびクルスカル（Ｓａｎｋｏｆｆ、Ｋｒｕｓｋａｌ）（ｉｉ’ｉｉ掲）、ｐ、２ ３−２９゜またこのような比較を行うための商業サービスおよびソフトウェアパ ンケージを人手しうる　たとえばインテリシエネテイブクス社（カリフォルニア 州マウンテン・ビュー）およびライスコンシン大学ンエネティックス・コンピュ ーター・グループ（ウィスコンシン州マシソン）。　配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　 Ｎｏ、）３の核酸配列に基づいたプローブを市販のＤＮＡ合成装置、たとえばア プライド・バイオシステムズ、モデル３８１Ａにより、標準法、たとえばゲイト （Ｇａｉｔ）。

０１℃ｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａ Ｉ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、（ＩＲＬブレス、ワシントンＤ、Ｃ，，１９８４）を採 用して合成することができる。プローブは少なくとも１８−３０塩基の長さであ るこたが好ましい。より好ましくは、プローブは少な（とも１００−２００塩基 の長さである本発明のプローブは当技術分野において標準的な種々の方法で、た とえば放射性標！［ベレント（Ｂｅｒｅｎｔ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ 。

ｐ、２０８−２２０　（１９８５年５／６月）：メインコス（Ｍｅｉｎｋｏｔｈ ）ら、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、ｖｏｌ、１３８．　ｐ、２６７−２８４　 （１９８４）、ジスタフ（Ｓｚｏｓｔａｋ）ら、　Ｍｅ　ｔ　ｈ、Ｅｎ　ｚ　ｙ ｍｏ　１．　、Ｖｏ　ｌ。

６８、ｐ、４１９−４２９　（１９７９）；など］、または非放射性ｔＭｍ　［ チ、Ｚ（Ｃｈｕ）　ら、ＤＮＡ、Ｖｏｌ、４．ｐ、３２７−３３１　（１９８５ ）；ジャブロンスキーＤａｂｌｏｎｓｋｉ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　 Ｒｅ５ｅａｒａｈ、Ｖｏｌ、１４．ｐ、６１１５−６１２８　（１９８６）：な ど］を用いて標識することができる。

ハイブリダイゼーションプローブを用いてたとえばＲＮＡブロッティングにより 、ライブラリー作成前にβ−鎖ｍＲＮＡの候補源をスクリーニングすることもで きる：マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ ｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、ｐ、２０２−２０３　（：Ｊ− ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニューヨーク、１９８２）；また はヘイメスおよびヒギンス編、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚ ａｔ　ｉｏｎ、り、１３９−１４３　（［ＲＬプレス、ワシントンＤ、Ｃ，，１ ９８５）。

目的とするポリペプチドをコードするｍＲＮＡの供給源には、それらの表面に多 数の、たとえば３０００−５０００以上のＧＭ−Ｃ３Ｆレセプターを発現するか 、または発現すべく誘導しうる細胞集団または細胞系が含まれる。

好ましくはＧＭ−Ｃ３Ｆのα−鎖およびβ−鎖を哺乳動物発現系内へ同時トラン スフェクトする（すなわち宿主−発現ベクターの組み合わせ）。特異的な哺乳動 物発現系の選択および／または修飾を行うための指針を提供する多数の総説があ る　たとえば（数例を挙げると）クーヘルラ、＜チ（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ ）ら、Ｃｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 Ｖｏｌ、１６．ｌ５ｓｕｅ　４．ｐ、３４９−３７９　（１９８４）；ノくネル ジ（Ｂａｎｅ　ｒ　ｊ　ｉ）　ら、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、 Ｍｏ１．　５．　ｐ。

ＬＬ−３１（１９８３）　は嘩乳動物細胞をトランスフェクトおよび形質転換す るための方法を概説し：レツニコフおよびゴールド編、Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ　 Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ｚくターワース、ボストン、１９８６０ま大 腸菌（ｌｉ：、ｃｏｌｉ）、酵母および哺乳動物細胞における遺伝子発現の選ば れたトピックスにつき概説し：チリ（Ｔｈｉｌｌｙ）、Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃ ｅ１ｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（バターワース、ボストン、１９８６）は哺乳 動物発現系を概説する。同様に本発明に用いるのに適した発現ベクターを形成お よび／または修飾するための特異的ｃＤＮＡおよび発現制御配列を結合および／ または操作するための方法および条件を記載した多数の総説がある：数例のみを 挙げると、たとえばマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 Ｃｌｏｎｉｎｇ’：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（コールド・ス プリング＋＋／％−／（−・ラボラトリ−、ニューヨーク、１９８２）；グｏ− ／（−（Ｇｌｏｖｅｒ）。

ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｖｏｌ 。

■およびＩＩ（ＩＲＬプレス、オックスフォード、１９８５）、およびｄ　／＜ ル（Ｐｅｒｂａｌ）、Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　（シラン・ワイリイ・アンド・サンズ、ニューヨー ク、１９８４）。

数種類のＤＮＡ腫瘍ウィルスが哺乳動物発現宿主のためのベクターとして用いら れている。特に重要なものは、細菌の復製′Ｍ御配列に結合したＳＶ４０の複製 、転写および／または翻訳制御配列からなる多数のベクターである。たとえばオ カヤマおよびバーブ（Ｏｋａｙａｍａ、Ｂｅｒｇ）により開発されたｐｃＤベク ター：Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、Ｖｏｌ、２．　ｐ、１６１−１７０　（ １９８２）およびＭｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、　ｖｏｌ、３．１）−２８０ −２８９（１９８３）に記載、これら双方をここに参考として引用する。ＳＶ４ ０ベクターヘイ７−（Ｈａｒｎｅｒ）、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ ｇ、Ｖｏｌ。

２、ｐ、８３−１００　（１９８０）および米国特許第４．５９９．３０８号明 細書に記載、これら双方をここに参考として引用する：ならびにさらにアデノウ ィルス調節要素を含むベクター：カウフマンおよびシャープ（Ｋａｕｆｍａｎ、 ５ｈａｒｐ）、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、　ｖｏｌ　２．　ｐ、１３０４ −１３１９　（１９８２）およびクラークら、米国特許第４，６７５．２８５号 明細書に記載、これら双方をここに参考として引用する。グルラマン（Ｇｌｕｚ ｍａｎ）。

Ｃｅ１１．Ｖｏｌ、２３．ｐ、１７５−１８２　（１９８１）に記載され、ＡＴ ＣＣ（受託番号ＣＲＬ　１６５１）から人手されるＣ０８７サル細胞が通常は上 記ベクターに好ましい宿主である。鴫乳動物レセプター発現に適したＳＶ４０を 基礎とするベクターはアルフォおよびシード（Ａｒｕｆ　ｆｏ、５ｅｅｄ）　［ Ｐｒ。

ｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｍｏ１．８４．Ｉ）、３３６５−３３６ ９および８５７３−８５７７　（１９８７）］により開発された。

ＩＴ、Ｍ合アγセイ 結合アッセイは、未知の特異性またはアフィニティーをもつリガンドを既知の量 まｔ、−ハｍｒｌノｅＪ１ヒトＧＭ−ＣＳ　Ｆ　ト、ｐＫＨ９７およびｐＫＨ１ ２５ｔたはそれらの均等物によりトランスフェクトまたは形質転換した細胞試料 のレセプター結合部位に対して競合させることにより行われる。好ましくはＧＭ −Ｃ５Ｆを標準プロトコールによる放射性ヨウ素化、たとえば１．　３．　４． 　６−テトラクロロ−３α、６α−ジフエニルグリコウリルとの反応により！３ １する：フレーカー（Ｆｒａｋｅｒ）　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、Ｃｏｍｒｎｕｎ、。

Ｖｏ　１．８０．ｐ、８４９−８５７　（１９７８）に記載（またバース−ケミ カル社からアイオドゲンとして人手されるン。一般に結合アッセイはローラエン タール（Ｌｏｗｅ　ｎ　ｔ　ｈａ　ｌ）　ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｖａｔ、１ ４０．　ｐ、４５６−４６４　（１９８８）の記載に従って実施され、これをこ こに参考として引用する。要約すると、アリコートの細胞をＩＨＩ　ｍ識ヒトＧ Ｍ−Ｃ３Ｆの存在下にミクロ遠心管中において最終容量２００μｍの培地中、４ ℃でインキュベートする。細胞に結合した１１６　［−標識ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆを 結合していないＩＩＳ［−標識ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆから油濃度勾配による遠心分離 により分離した（１０．　０００ＸＧ％２分間）。非特異的結合は１００倍過剰 の部分精製した非標識ヒトＧＭ−ＣＳＦの存在下で測定される。

以下の実施例は本発明を説明するためのものであって、本発明を何らかの形で限 定するためのものではない。

およびｐＫＨ１２５の単離 ＴＦ−１細胞（キタムラ（Ｋ　ｉ　ｔ　ａｍｕ　ｒ　ａ）ら、Ｊ、Ｃｅ　Ｉ　１ ．　Ｐｈｙｓ　ｉｏｌ、、Ｍｏ１．１４０．Ｉ）、３２３−３３４　（１９８９ ））からグアニジウムインチオシアネート法（シルギン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）ら 、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ工ｒｙ、Ｍｏ１．１８．ｐ、５２９４−５２９９　（１９ ７８））により単離されたポリ（Ａ）”ＲＮＡを、オリゴ−（ｄＴ）プライマー により二本鎖ｃＤＮＡに変換した。このｃＤＮＡの両端にＢｓ　ｔＸＩリンカ− をリゲートさせたのち、ＣＤＮＡをＸｂａＩで消化しく３′側領域に偶然にＸｂ ａｌ特有部位が含まれる）、ＢｓｔＸＩ／Ｘｂａｌ−消化したｐＭＥ１８、すな わちＳＶ４０を基礎とする哺乳動物発現ベクター（図３参照）内へ再クローン化 した。ｐＫＨ９７は最初に単離されたトランケートしたｃＤＮＡから作成された プローブを用いて単離された。

トランケートしたｃＤＮＡは、３２ｐ−標識マウスインターロイキン−３レセプ ターｃＤＮＡフラグメント（イト−（Ｉｔｏｈ）　ら、５ｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ 、２４７、ｐ、３２４−３３４　（１９９０）によりｌ２戯）をＩ＼イブリダイ ゼーションブローブとして用いて低いストリンジエンシー条件下でＱｌ離された （４２℃で６ＸＳＳＰＥを用いて２０％ホルムアミドの存在下にハイブリダイゼ ーション、および５０℃で２ＸＳＳＰＥを用いて洗浄）。ｐＫＨ９７をＣＯ８７ 細胞内へ標準プロトコールにより、たとえばヨコタ（Ｙｏｋｏｔａ）ら、Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｍｏ１．８４．ｐ、７３８８−７３９２　 （１９８７）による記載に従ってトランスフェクトした（５μｇのプラスミドＤ ＮＡを準コンフルエントＣＯ５７細胞内へＤＥＡＥ−デキストラン法によりトラ ンスフェクトした：トランスフェクションの７２時間後に細胞を後記のヨウ素化 サイトカイン類を用いる結合アッセイ用に採取した）。下記の濃度においては下 記のヒトサイトカイン類のいずれによっても特異的結合は示されなかった：ＩＬ −２（ｉｎＭ）、ＩＬ−３（２０ｎＭ）、ＩＬ−４（１ｎＭ）　、ＩＬ−５（５ ｎＭ）　、ＧＭ−Ｃ３Ｆ　（２０ｎＭ）およびＥＰＯ（１０ｎＭ）。

ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆレセプターのα−鎖をコードするｃＤＮＡが同じライブラリー から、このｃＤＮＡの５′−非翻訳領域および３′−非翻訳領域に対応する特異 的オリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応により単離され た：ギアリング（Ｇｅ　ａ　ｒ　ｉ　ｎｇ）ら、ＥＭＢＯＪ、、Ｖｏｌ、８．ｐ 、３６６７−３６７６　（１９８９）により記載。単離されたｃＤＮＡをｐＭＥ １８内へ挿入することによりｐＫＨ１２５を得た。

合計５μｇの等量のｐＫＨ９７およびｐＫＨ１２５プラスミドＤＮＡを準コンフ ルエントＣＯ５７細胞内へＤＥＡＥ−デキストラン法によりトランスフェクトし た。トランスフェクションの７２時間後に細胞を採取し、ＧＭ−Ｃ３Ｆ結合アッ セイ法により分析した。１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０２％ナ トリウムアシドおよび２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　（ｐＨ７，４）を含有する０゜１ ｍｌのＲＰＭｒ　１６４０中の２ｘｌＯ’　ＣＯＳ　７細胞ヲ二重試験法テ４℃ において３時間、種々の濃度のｌ！Ｊ−ＷＡ：（ｌヒト０Ｍ−Ｃ５Ｆと共に、過 剰量の非標識ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆを用いて、または用いずに、インキュベートした 。細胞を油層による遠心分離により遊１１１ｔｌＪガントから分離することによ って細胞結合放射能を測定した：シュロイアズ（Ｓｃｈｒｅｕｒｓ）ら、Ｇｒｏ ｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ、Ｍｏ１．２゜ｐ、２２１−２３３　（１９９０）によ りＪ己戯。ＧＭ−Ｃ３Ｆは標準プロトコールによりヨウ素化された［チバ（Ｃｈ ｉｂａ）　ら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、Ｍｏ１．４．ｐ、２２−３６　（１９９０） ］、要約すると、大腸菌により産生されたＧＭ−Ｃ８Ｆ　５μｇを３０−５０μ ｌの５０ｍＭ硼酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，０）中で１ｍＣ１の乾燥ポルトン −ハンター（Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎ　ｔ　ｅ　ｒ）試薬と共に４℃で１２−１６ 時間インキュベートした。グリシンを２．５ｍｇ／ｒｎｌになるまで添加して反 応を停止させ、ヨウ素化ＧＭ−Ｃ５Ｆをポルトン−ハンター試薬からＰＤ−１０ カラムにより分離した。このヨウ素化ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆは比放射能（４−８）ｘ ｌＯ’ｃｐｍ／μｇを有し、０゜１％ゼラチン、０．　１％ウシ血清アルブミン および０．０２％ナトリウムアジドを含有する）（ｅｐｅｓ緩衝ハンクス液中で 約２カ月間安定であった。

１ｍ１Ａはレセプター結合データを示す。白丸はｐＫＨ１２５およびｐＭＥ１８ （ｐＫＨ９７と同じベクターであるが、上記ｃＤＮＡ挿入配列を含まない）でト ランスフェクトしたＣＯ３７細胞（対照）に対応する。黒丸はｐＫＨＬ２５およ びｐＫＨ９７でトランスフェクトしたＣＯ８７細胞に対応する。結合データのス カッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）プロットを示す。挿入されたグラフは平衡 結合プロフィルを示す。これらのデータがら分かるように、高いアフィニティー 結合部位（Ｋ、−１２０ｐＭ）および低いアフィニティー結合部位（Ｋ、−６゜ ６ｎＭ）が共に示される（Ｋ、値はりガント（ＬＩＧＡＮＤ）プログラムにより 計算された：デ・リーン（Ｄｅ　Ｌｅａｎ）ら、Ｍｏ１．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、 。

Ｍｏ１．２１．　ｐ、５−１６　（１９８２））。

ネオマイシン耐性遺伝子、ｎｅｏ、を含むＤＮＡフラグメントをｐＫＨ９７内へ 挿入して、ｐＫＨ９７ｎｅｏを形成した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞は１）ＫＨ９７ｎｅ ＯおよびＥ）ＫＨ１２５により、チェンおよびオヵヤＴ　（Ｃｈｅｎ、Ｏｋａｙ ａｍａ）　Ｍｏ　ｌ、　（ｌ　Ｃ２−↓−１，１」」ｌ、、Ｖｏ　１．　７．　 ｐ、２７４５−２７５２　（１９８７）に記載のリン酸カルシウム法によって安 定にトランスフェクトされＩユこの文献を参考きして引用する。安定なトランス フェクト体はｉ、ｍｇ／ｍｌのＧ４１８により選択された。、ＥＥＩＩｉＢはト ランスフェクトしたＮ［Ｈ３Ｔ３細胞の結合データを示す。白丸はｐＫＨ９７ｎ ｅｏおよびｐＭＥ１８でトランスフェクトした対照ＮＨＨ３Ｔ３細胞に対応する 。黒丸はｐＫＨ９７ｎｅｏおよびｐ、ＫＨＩ２５でトランスフェクトシたＮ［Ｈ ３Ｔ３細胞に対応する。後者は１７０ｐＭのに４を有する高いアフィニディー結 合を示した。トランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３１＋１胞において、漂識ＧＭ− Ｃ５Ｆ’の結合速度および解！ＩＩｔ速グをも調べた６図２人および２Ｂはこれ らのデータを示す。白丸はα−鎖のみを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞に対応する。

黒丸はＧＭ−Ｃ８Ｆレセプターのα−鎖およびβ−鎖双方を発現するＮ　ｒ　Ｈ ３Ｔ　３細胞に対応する。後者の方がはるかに緩慢な解離速度を示（７た（Ｔ１ ．’２＝２分一対−Ｔｗｚ＝　３６０分）。

前記に従ってｐＫＨ９７およびｐＫＨ１２５で同時トランスフェクトしたＣ０Ｓ 　７細胞のアリコートをミクロタイタープレートのウェルに、ｌ！Ｓ　１−標識 ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆを１１００ｐ、５００ｐＭおよび１ｎＭの濃度で含有する培地 ２００μｌ中において分配する。細胞を含まない微生物上澄液試料１００μｌを 、トランスフェクトしたＣＯ８７細胞に種々の濃度の１２６　［−標１１Ｇ　Ｍ −ＣＳ　Ｆそれぞれにおいて添加する。３時間インキュベートしたのち、ＣＯ８ ７細胞を採取し、結合放射能につきアッセイする。結合放射能のカウントが低い Ｃ０８７細胞は、ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆのアンタゴニストまたはアゴニスト候補に相 当する。

ベクターｐＭＥ１８の′スタッフ７−（ｓｔｕｆｆｅｒ）’領域については、シ ード（Ｓ　ｅ　ｅ　ｄ）　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｍ ｏ１．８４　（１９８７）、ｐ、３３６５−３３６９により記載されている。

１９９０年６月１７日に本出願人らは、ｐＫＨ９７およびｐＫＨ１２５をアメリ カン・タイプ・カルチャー・コレクション（マリーランド州口γクビル）（ＡＴ ＣＣ）にそれぞれ受託番号４０８４７および４０８４８で寄託した。これらの寄 託はブグベスＩ−条約−臼こ国際的な便宜上、かつ特許を目的とする培養物寄託 （Ｃｕ　ｌ　口ｘｒｅ　Ｄｅｐｏｓｉｔ　ｆｏｒ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｐｕｒｐｏ　 Ｓ　ｅｓ）！こ対するＡＴＣＩ定下にイ」与される条件の下で米国内での便宜上 行われた。後者は寄託物を３５　ＵＳＣ１２２および３７　ＣＦＲ１，１４に従 って米国特許および商標局長官が入手しうろこと、ｆＪらびに米国特許の交付に 際Ｌ２て国民が入手（、うろことを保証し、寄託物か維持されることを要求する ものである。寄託されたプラスミドを人手しうることは、いずれかの政府の権威 の下でその特許法に従）で付与された権利に違反して本発明を実施するライセン スと解すべきではない。

以上の本発明の形態に一ついての記載は具体的説明および記述のために提示され たものである。それらは徹底的に追及すること、または本発明を記述された実際 の形態に限定することを意図したものではなく、明らかに上記の教示を考慮して 多様な修正および変更が可能である。これらの形態は本発明の原理を最も良く説 明し、これにより当業者が本発明を意図する個々の用途に適した種々の形態で、 および種々に変更して最も良く利用しうるために選択および記述された。本発明 の範囲はここに記載する請求の範囲により定められるものとする。

配烈嚢 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）＋１ 配列の型：ＤＮＡ配列 配列の長さ：３４７５塩基 鎖の数ニー木調 トポロジー二直鎖状 配列の種類・ＤＮＡ分子 起源・ 生物名・ヒト 配列の特徴： ヒトＧＭ−Ｃ３ＦレセプターをコードするＤＮＡ配列配列： 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：２ 配列の型　アミノ酸 配列の長さ二８９７アミノ酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー・直鎖状 配列の種類：蛋白ｔ／ポリペプチド 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴。

ヒトＧＭ−ＣＳＦレセプター 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：ｌによりコードされるシグナル配列ニー１７ 　ｔｏ　−１ トランスメンブランドメイン：４２２　ｔｏ　４４８細胞外ドメイン内のＮ−結 合グリコシル化可能部位：　４１−４３．１７４−１７６　：　３２９−３３１ 配列： ＭｅセＶａｌ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｓｅｘ　Ｍ ｅｔ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ａｌａ　ＬａｕＣｙｓ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ａｒ ｇ　Ｓ＠ｒ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌ ｅ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕｌ　５　１０ Ｌｅｕ　工ｉｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　人ｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　 Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　ＣｙｓＡｓｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａ ｓｐ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｈ ｉｓ　ｐｒｏ　ＡｒｇＣｙｓ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｖａ ｌＡｌａ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｈａ　Ｖａｌ　Ｖａ１Ｔｈ！− Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌｐ　Ｔｙｒ　Ｐｈａ　５ｅｒ　Ｐｈａ　Ｇｉｎ　！’ｒｏ 　Ａｓｐ　ｋｒｑ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　ＧｌｙＰｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌｙｇ　５ａｒ　 ！！ｉｓ　Ｌａｕ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　λｓｎ　Ｇｌｙ　Ｓｉｒ　入ユａ　Ｇｌｕ 　Ｌａｕ　ＴｒｐＰｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　！；ａｘ　Ａｌａ 　Ｐｈａ　Ｔｈｒ　Ｂａｒ　Ｇｌｙ　Ｓｍｇ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｉｒ１ｓＧｉｎ 　Ｇｌｙ　Ｐｒｏτｒｐ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　ＪＬｒｇ　Ｐｈａ　Ｐｙ：ｏ　Ｇｌ ｕ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　ｌ’ｈａ４９５　５００　５Ｏ５ Ｌ”ｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｐｈａ　Ｇｌｙ　ＡＪｐ　Ｓａｒ　に工ｕ　Ｖａｌ ｓｉｒ　Ｐｒ５　！ａｕτｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ人ｓｐ　Ｐｒｏ　ムｙ３　Ｂｕ ｓ　Ｖａｌ　Ｃｙｌｌ　ＪｉＪｐ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　５８！　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　 Ａｓｐ　丁ｈｒ　〒ｈｒＰｒｏ　Ａｌｍ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　ｋｓｐ　Ｌａｕ　Ｐ ｒｏ　丁ｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　アｔｏ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　１ｌｒｏ　Ｇ１ｎＰ ｒｏ　ＧＩＹ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓａｒ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　’ ！？ｍ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　ＧｉｎにＬａ　５ｅｒ５５５　５６０　５（ａ５ ５ｅｒ　Ｐｈａ　ＪＬｓｐ　Ｐｈ會λｓｎ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　 Ｇｌｙ　１？ｔｏ　Ｐｒｏ　箆１ｓ　Ｓａｗ　入ｚ９Ｓａｒ　Ｌａｕ　ｆ’ｒｏ 　Ａｓｐ　Ｘ１＊　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　ｄｉｎ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ 　Ｇｌｓ　Ｇｌｕ　ＧｌｙＧｌｙ　Ｓａｔ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｓａｒ　Ｐｒｏ　 １ｈｘｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｘ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ｃｙｓ Ｌａｕ　ｉ’ｒｏλｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　 Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｅｔｉに−Ｇｌｓに１ｇ１５　ｇ２０　６２５ Ｍａｔ　Ｇｌｙ　ｐｒｏ　ａｚｙ　ａニーにＬａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　ＶａｌＧｌ ｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　５ｅｒ　Ｇ１ｎＰｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ 　Ｐｒｏ　Ｊｕａ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ 　Ｇｉｎ　Ｐｒ。

Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｌｅｈｕ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ 　Ｇｌｙ　Ａｓｐτｙｒ　Ｃｙｓ　ｔｈｅ　ＬｅｕＰｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌ＠ｕ　Ｇ ｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｓ＠ｒ　Ｌ ｙｓ　Ｐｒｏ　５ｅｒＢ１０　１１１５　８２０ Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　 ｋｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ＾ＩＪＩ　Ｐｈ＠Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌ ｙｓ　Ｉ’ｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　入１ａ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　 Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｖａ１５４Ｑ　８４５　８５０ １１ａ　Ｇｉｎ　Ｉ、ａｕ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　入１ａ　Ｌ＠ｕ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ 　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　？ｙｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　ＬａｕＰｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　 Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ勅 令　ｐＭ 鮭！　ｐＭ Ｂ　ＦＩＧＵＲＥ　２ 分　η閘 要約書 ヒト顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）レセプターの β−鎖をコードする核酸、およびβ−鎖自体が提供される。β−鎖をα−鎖と共 に細胞性宿主中において発現させて、ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆのアゴニストおよびアン タゴニストのスクリーニングに有用な組成物を調製することができる。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８）

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト顆拉球−マクロファージーコロニー刺激因子レセプターのβ−鎖であっ て、実質的にヒト非レセプター蛋白質を含まないもの。
2. ２．β−鎖が配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．）２に示したアミノ酸配列により 定められるポリペプチドである、請求の範囲第１項に記載の蛋白質。
3. ３．β−鎖が配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．）２中のアミノ酸残基１−８８０ につき示したアミノ酸配列により定められるポリペプチドである、請求の範囲第 １項に記載の蛋白質。
4. ４．配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．）２に示したアミノ酸配列により定められ るポリペプチドをコードしうる核酸。
5. ５．ポリペプチドが配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．）２中のアミノ酸残基１− ８８０につき示したアミノ酸配列により定められる、請求の範囲第４項に記載の 核酸。
6. ６．配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．）１のヌクレオチド配列に対して作用的に 相同であり、ヒト顆粒球−マクロファージーコロニー刺激因子に対する高アフィ ニティーレセプターを形成しうるポリペプチドをコードし、該ポリペプチドがヒ ト顆粒球−マクロファージーコロニー刺激因子のα−鎖と作動的に結合して高ア フィニティーレセプターを形成するものである核酸。
7. ７．高アフィニティーレセプターがヒト顆粒球−マクロファージーコロニー刺激 因子との結合定数（Ｋｄ）１ｎＭ以下を有する、請求の範囲第６項に記載の核酸 。
8. ８．ポリペプチドが、該核酸、およびα−鎖に対する遺伝子を保有するベクター で同時トランスフェクトした哺乳動物性発現宿主中においてα−鎖と作動的に結 合する、請求の範囲第７項に記載の核酸。
9. ９．ヒト顆粒球−マクロファージーコロニー刺激因子のアンタゴニストまたはア ゴニストを検出するための、下記の工程を含む方法：ヒト顆位球−マクロファー ジーコロニー刺激因子レセプターのα−鎖およびβ−鎖に対する遺伝子をα−鎖 およびβ−鎖が細胞性宿主の膜中において作動的に結合した状態で発現する細胞 性宿主を供給し；該細胞性宿主を、既知濃度のヒト顆粒球−マクロファージーコ ロニ−刺激因子、およびヒト顆粒球−マクロファージーコロニー刺激因子のアン タゴニストまたはアゴニストを含有すると推測される試料に暴露し、その際ヒト 顆位球−マクロファージーコロニー刺激因子は標識されており；細胞性宿主を試 料および標識されたヒト顆粒球−マクロファージーコロニー刺激因子から分離し ；そして 細胞性宿主に結合した標識ヒト顆粒球−マクロファージーコロニー刺激因子の量 を測定する。
10. １０．細胞性宿主が、α−鎖に対する遺伝子を保有する第１ベクターおよびβ− 鎖こ対する遺伝子を保有する第２ベクターで安定に形質転換された哺乳動物細胞 である、請求の範囲第９項に記載の方法。
11. １１．第１ベクターがｐＫＨ１２５であり、第２ベクターがｐＫＨ９７である、 請求の範囲第１０項に記載の方法。
12. １２．ヒト顆粒球−マクロファージーコロニ−刺激因子レセプターのα−鎖およ びβ−鎖からなり、これらのα−鎖およびβ−鎖が非ヒト細胞性宿主中において 作動的に結合している組成物。
13. １３．α−鎖がｐＫＨ１２５のｃＤＮＡ挿入配列によりコードされ、β−鎖がｐ ＫＨ９７のｃＤＮＡ挿入配列によりコードされる、請求の範囲第１２項に記載の 組成物。