JPH1132768A - 新規な好酸球セリンプロテアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒト好酸球が産生する３１４アミノ酸からな
るセリンプロテアーゼ及びその製造法、そのセリンプロ
テアーゼをコードするｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡ配列に選
択的にハイブリダイズするフラグメント、そのｃＤＮＡ
を組み込まれた複製又は発現プラスミド、そのプラスミ
ドで形質転換された宿主細胞、そのポリペプチドの抗
体、そのペプチドまたは抗体を含有する薬学的組成物、
セリンプロテアーゼ阻害剤のスクリーニング方法、及び
そのセリンプロテアーゼの抗体を用いたアレルギー疾患
の診断方法。 【効果】 本発明のセリンプローテアーゼは、アレルギ
ー性疾患、感染症、腫瘍性疾患、肉芽腫性疾患、膠原
病、血管炎などに関与し、そのセリンプロテアーゼの阻
害剤のスクリーニングに有用である。また本発明セリン
プローテアーゼの抗体は上記疾患の診断に用いることが
できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規なセリンプロテ
アーゼに関する。更に詳細に述べると、ヒト好酸球が産
生する新規なセリンプロテアーゼ、その製造方法、その
セリンプロテアーゼをコードするｃＤＮＡ、そのｃＤＮ
Ａからなるベクター、そのベクターで形質転換された宿
主細胞、そのセリンプロテアーゼの抗体、およびそのセ
リンプロテアーゼまたは抗体を含有する薬学的組成物、
セリンプロテアーゼ阻害剤のスクリーニング方法、セリ
ンプロテアーゼの酵素活性を測定することを特徴とする
アレルギー疾患の診断法、そのセリンプロテアーゼの抗
体を用いたアレルギー疾患の診断方法に関する。

【０００２】

【発明の背景】好酸球は白血球の一種であり、エオジン
で染色されることからその名前が付けられている。好酸
球は、好中球とその形態、発生源、貪食作用の点におい
て似ているが、染色性、病原微生物、化学物質、ホルモ
ンなどに対する反応性に違いがある。好酸球は健常人の
末梢血白血球の約１〜５％を占めている。好酸球増多症
を伴う疾患としては、アレルギー性疾患、感染症、腫瘍
性疾患、肉芽腫性疾患、膠原病、血管炎などが知られて
いる。さらに末梢血のみならず、喘息患者の気道内や喘
息に合併するアレルギー性肉芽種性血管炎や好酸球性肺
炎の組織に好酸球が浸潤していること、寄生虫感染患者
の中で肺浸潤、胸水を合併する例で活性化された状態に
ある低比重好酸球がそれらの局所に多く出現しているこ
と、アレルギー性鼻炎や皮膚炎患者の末梢血中の好酸球
は活性化された状態にあることが報告されており、病態
発症と好酸球の活性化あるいは組織への浸潤が深く関わ
っていると考えられている（治療学，Vol.25, No.4, p
p.384-387, 1991）。

【０００３】好酸球は、寄生虫感染において寄生虫を攻
撃する働きを担っているが、アレルギー反応において
は、自己組織を傷害し、アレルギー性炎症を助長してし
まうと考えられている。好酸球のメディエータとして
は、顆粒蛋白（好エオジン性カチオン蛋白（eosinophil
ic cationic protein）、主要塩基性蛋白（major basic
protein）等の塩基性蛋白、各種酵素）、細胞膜リン脂
質代謝物（プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロ
ンボキサン、血小板活性化因子等）、活性酸素、サイト
カイン等が報告されており、好酸球はこれらのメディエ
ータを介して機能を発揮しているものと考えられる。し
かしながら、これまでに確認されたメディエータのみで
は好酸球の役割を完全に説明できず、まだ単離されてい
ないメディエータが存在することを示唆している。

【０００４】アレルギー反応においては、初期段階で肥
満細胞が関与していると考えられているが、慢性期にお
いては好酸球の関与が強く示唆されている。好酸球は、
脱顆粒を起こすことによって自己組織を攻撃すると考え
られ、この脱顆粒には、プロテアーゼ、特にセリンプロ
テアーゼが関わっていることが分かってきた（Archives
of Biochemistry and Biophysics Vol.312, No.1, Jul
y, pp.67-74, 1994)

【０００５】

【発明の目的】本発明者らは、この点に注目し、ヒト好
酸球が産生している新規な因子（ポリペプチド）、特に
セリンプロテアーゼに着目してそれを見出すべく、鋭意
検討を行なった。

【０００６】従来、ある特定のポリペプチドまたはそれ
をコードするｃＤＮＡを得ようとする場合、組織や細胞
培養液中に目的とする生物活性を確認し、次いでポリペ
プチドの単離精製を経て、遺伝子をクローニングする方
法、あるいは、その生物活性を指標として遺伝子を発現
クローニングする方法が一般的に用いられていた。しか
し、生体内生理活性ポリペプチドは、多様な生物活性を
有している場合が多いので、あるひとつの活性を指標に
して遺伝子をクローニングした結果、それが既知のポリ
ペプチドと同一であることが後になって判明するという
事例が増えている。また、特定の細胞が産生する因子は
ほとんどのものが微量しか産生されず、そのことが単
離、精製および生物活性の確認を困難なものとしてい
る。

【０００７】近年、ｃＤＮＡの作製技術やシークエンス
技術は急速に発展し、大量のｃＤＮＡのシークエンスを
迅速に行なうことができるようになった。そこでこれら
の技術を利用して、様々な細胞や組織からｃＤＮＡライ
ブラリーを作製し、ランダムにｃＤＮＡをクローニング
して塩基配列を決定し、相当するポリペプチドを発現さ
せた後、その生理機能を解析していくという方法が発展
しつつある。そのような技術の一環として、特徴的な部
分配列を有するＲＮＡに対してセンスおよびアンチセン
スプライマーを用いたＰＣＲ（Polymerase chain react
ion）により、特徴的な部分配列を有する未知なポリペ
プチドを見いだすことができるようになった。本発明者
らは、この方法を用いて、好酸球が産生している新規な
因子（ポリペプチド）およびそれをコードするｃＤＮＡ
を見出すことに成功し、本発明を完成した。

【０００８】本発明の配列が新規であることは、ホモロ
ジー検索により確認した。後に詳述する本発明の配列の
製造方法で得られたいくつかのクローンのうち、本発明
配列のみが新規であった。本発明の推定アミノ酸配列
は、セリンプロテアーゼのプロファイルを有し、Ｃ末端
には疎水性アミノ酸配列を有していた。また、ＧＰＩ
（グリコシルホスファチジルイノシトール）アンカード
膜蛋白に対するω、ω１、ω２サイトを有しており、膜
蛋白としての特徴と分泌型蛋白としての特徴を合わせ持
っている。既知配列との比較により、本セリンプロテア
ーゼは、プロフォームの形で産生されると考えられ、上
流部分が切れて成熟蛋白になると考えられる。

【０００９】

【発明の構成】本発明は、（１）配列番号１で示される
アミノ酸配列からなるセリンプロテアーゼ、（２）前記
（１）に記載したセリンプロテアーゼをコードするｃＤ
ＮＡ、（３）配列番号２で示される塩基配列を有するｃ
ＤＮＡ、（４）配列番号３で示される塩基配列を有する
ｃＤＮＡ、に関する。

【００１０】さらに詳しく述べると、本発明は、実質的
に純粋な形である配列番号１で示されるアミノ酸配列か
らなるセリンプロテアーゼであるポリペプチド、そのホ
モローグ、その配列のフラグメントおよびそのホモロー
グに関する。本発明はさらにそれらのセリンプロテアー
ゼをコードするｃＤＮＡに関する。より具体的には、配
列番号２または３で示される塩基配列を有するｃＤＮ
Ａ、および配列番号２または３で示される塩基配列に選
択的にハイブリダイズするフラグメントを有するｃＤＮ
Ａに関する。

【００１１】実質的に純粋な形である配列番号１で示さ
れるアミノ酸配列を有する本発明のセリンプロテアーゼ
とは、一般に生産時のポリペプチドの９０％以上、例え
ば、９５、９８または９９％が配列番号１で示されるア
ミノ酸配列を有するセリンプロテアーゼであることを意
味する。

【００１２】配列番号１で示されるアミノ酸配列からな
る本発明のセリンプロテアーゼのホモローグとは、一般
に少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例
えば４０、６０または１００個の連続したアミノ酸領域
で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０また
は９０％、より好ましくは９５％以上相同性であるもの
であり、そのようなホモローグは、以後本発明のセリン
プロテアーゼとして記載される。

【００１３】さらに、配列番号１で示されるアミノ酸配
列からなる本発明のセリンプロテアーゼのフラグメン
ト、またはそれらのホモローグのフラグメントとは、少
なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１５アミ
ノ酸、例えば２０、２５、３０、４０、５０または６０
アミノ酸部分を意味する。

【００１４】配列番号２または３で示される塩基配列を
有するｃＤＮＡに選択的にハイブリダイズするｃＤＮＡ
とは、一般に、少なくとも２０個、好ましくは少なくと
も３０個、例えば４０、６０または１００個の連続した
塩基配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なく
とも８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同
性であるものであり、そのようなｃＤＮＡは、以後本発
明のｃＤＮＡとして記載される。

【００１５】配列番号２または３で示される塩基配列を
有するｃＤＮＡのフラグメントとは、少なくとも１０塩
基、好ましくは少なくとも１５塩基、例えば２０、２
５、３０または４０塩基部分を意味し、そのようなフラ
グメントも本発明のｃＤＮＡに含まれる。

【００１６】さらに、本発明には、本発明のｃＤＮＡが
組み込まれた複製または発現ベクターが含まれる。ベク
ターとしては、例えば、ｏｒｉ領域と、必要により上記
ｃＤＮＡの発現のためのプロモーター、プロモーターの
制御因子などからなるプラスミド、ウィルスまたはファ
ージベクターが挙げられる。ベクターはひとつまたはそ
れ以上の選択的マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐
性遺伝子を含んでいてもよい。ベクターは、イン・ビト
ロ（in vitro）において、例えばｃＤＮＡに対応するＲ
ＮＡの製造、宿主細胞の形質転換に用いることができ
る。

【００１７】さらに、本発明には、配列番号２または３
で示される塩基配列、またはそれらのオープンリーディ
ングフレームを有するｃＤＮＡを含む本発明のｃＤＮＡ
を複製または発現させるためのベクターで形質転換され
た宿主細胞も含まれる。細胞としては、例えば細菌、酵
母、昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げられる。

【００１８】さらに、本発明には、本発明のセリンプロ
テアーゼを発現させるための条件下で、本発明の宿主細
胞を培養することからなる本発明のセリンプロテアーゼ
の製造方法も含まれる。培養は、本発明のセリンプロテ
アーゼが発現し、宿主細胞より製造される条件下で行な
われることが好ましい。

【００１９】本発明のｃＤＮＡは、上記のようなベクタ
ーのアンチセンス領域に挿入する等の方法によりアンチ
センスを製造することもできる。このようなアンチセン
スは、細胞中の本発明のポリペプチドのレベルを制御す
ることに用いることもできる。

【００２０】本発明は、本発明におけるセリンプロテア
ーゼのモノクローナルまたはポリクローナル抗体を含
む。さらに本発明におけるセリンプロテアーゼのモノク
ローナルまたはポリクローナル抗体の製造方法をも含
む。モノクローナル抗体は、本発明のセリンプロテアー
ゼ、またはその断片を抗原として用い、通常のハイブリ
ドーマの技術により製造することができる。ポリクロー
ナル抗体は、宿主動物（例えば、ラットやウサギ等）に
本発明のセリンプロテアーゼを接種し、免疫血清を回収
する、通常の方法により製造することができる。

【００２１】本発明には、本発明のセリンプロテアー
ゼ、その抗体と薬学的に許容される賦形剤および／また
は担体を含有する薬学的組成物も含まれる。本発明に
は、さらに、本発明セリンプロテアーゼを用いたセリン
プロテアーゼ阻害剤のスクリーニング方法も含まれる。
スクリーニングは、例えば、バッファー中に本発明のセ
リンプロテアーゼとスクリーニングしようとする化合物
を共存させ、合成基質に発色剤をつけたもの等を用い
て、吸光度等から酵素活性を測定することにより行なわ
れる。また、この方法を応用することにより、アレルギ
ー疾患等の診断に用いることもできる。さらに、本発明
には本願セリンプロテアーゼの抗体を用いたアレルギー
疾患等の診断方法も含まれる。抗体を用いた診断は、種
々公知であるが、例えば、抗原抗体反応を用いて酵素量
をエンザイム・イムノアッセイ（ＥＩＡ）法等で測定す
る事により行なわれる。

【００２２】（１）の本発明のセリンプロテアーゼとし
ては、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するもの
以外に、その一部が欠損したもの（例えば、配列番号１
中、生物活性の発現に必須な部分だけからなるポリペプ
チド等）、その一部が他のアミノ酸と置換したもの（例
えば、物性の類似したアミノ酸に置換したもの）、およ
びその一部に他のアミノ酸が付加または挿入されたもの
も含まれる。ひとつのアミノ酸をコードするコドンは１
〜６種類（例えば、Ｍｅｔは１種類、Ｌｅｕは６種類）
あり、ポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくｃ
ＤＮＡの塩基配列を変えることができる。

【００２３】（２）で特定される本発明のｃＤＮＡに
は、（１）の配列番号１で示されるセリンプロテアーゼ
をコードするすべての塩基配列群が含まれる。塩基配列
を変えることによって、セリンプロテアーゼの生産性が
向上することがある。（３）で特定されるｃＤＮＡは、
（２）で示されるｃＤＮＡの一態様であり、天然型配列
を表わす。（４）に示されるｃＤＮＡは、（３）で特定
されるｃＤＮＡに天然の非翻訳部分を加えた配列を示
す。

【００２４】配列番号３で示される塩基配列を有するｃ
ＤＮＡの作製は、以下の方法に従って行なわれる。 １）全ＲＮＡ（Total ＲＮＡ）の抽出 好酸球増多症の患者血液を遠心分離し、好酸球の画分を
分離する。好酸球の純度については、ＦＡＣＳ解析など
の方法によって確認を行なうことが好ましい。得られた
分画から、公知の方法、グアニジン・フェノール法（Cu
rrent Protocolin Molecular Biology, WILEY inter sc
ience社）等により、全ＲＮＡの抽出を行なう。 ２）ｃＤＮＡの合成 得られた全ＲＮＡを鋳型にプライマーと逆転写酵素を用
いて、ｃＤＮＡを合成する。用いられるプライマーとし
ては、オリゴ（Oligo）ＮｏｔＩ（ｄＴ１８）Ｖ、オリ
ゴ（ｄＴ１８）等が挙げられる。逆転写酵素としては、
スーパースクリプトII（Super Script II）、ＭＭＬＶ
逆転写酵素（MMLV reverse transcriptase）、ＡＭＶ逆
転写酵素（AMV reverse transcriptase）等を用いるこ
とができる。

【００２５】３）ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーの合成 セリンプロテアーゼのアクティブサイトをモチーフとし
てセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーをそ
れぞれ化学合成する。これらをそれぞれ組み合わせ、プ
ライマーミックスを作成する。センスプライマー、アン
チセンスプライマーについては、目的とするアミノ酸を
コードするものであれば何でもよいが、ハイブリダイズ
のし易さを考慮して作成、組み合わせる必要がある。 ４）選択的ＰＣＲ ２）で得たｃＤＮＡを鋳型とし、３）で得たプライマー
ミックスを用いて、ＰＣＲを行なう。ＰＣＲにより、ア
クティブサイトを有するセリンプロテアーゼの部分配列
が増幅される。得られた生成物を電気泳動にかけ、今ま
で知られているセリンプロテアーゼの長さを勘案してバ
ンドを切り出し、ｃＤＮＡ断片を回収する。今回は、４
００〜６００ｂｐのものを選んだ。

【００２６】５）大腸菌への形質転換 ４）で得られたｃＤＮＡ断片をＴベクターに連結し、得
られたプラスミドを菌体に形質転換を行なう。好ましい
菌体としては、ＸＬ−２Ｂｌｕｅ、ＤＨ５α、ＨＢ１０
１、ＨＢ１０９、ＸＬ−１等が挙げられる。菌体を培養
し、プラスミドを抽出する。プラスミドを制限酵素（Ｅ
ｃｏＲＩ等）で切断し、電気泳動により、４００〜６０
０ｂｐのバンドを切り出し、回収し、インサートを確認
する。 ６）シーケンシング ５）で得られたクローンについて、公知の方法により、
シーケンシングを行ない、それぞれのクローンの配列を
決定する。得られた部分配列のうち、セリンプロテアー
ゼのアクティブサイトの配列を有し、しかも新規である
ものを探すためにホモロジー検索を行なう。

【００２７】７）５′末端の同定 ６）で得られた配列の全長を得るために、５′ＲＡＣＥ
法により同定する。例えば、キャップファインダー（CA
P finder）変法（Clontec社）、５′ＲＡＣＥシステム
（Gibco BRL 社）等を用いて、６）で得られた部分配列
の５′末端の同定を行なう。そのための鋳型として、Ｒ
ＡＣＥ用のｃＤＮＡを作成する。詳しくは、 ｉ） ２）で得られた全ＲＮＡを用いて、プライマーお
よび逆転写酵素によりｃＤＮＡを作成する。プライマー
としては、キャップスイッチ（CAP switch）プライマ
ー、オリゴＮｏｔＩ（ｄＴ１８）Ｖプライマー等が用い
られる。逆転写酵素は前記と同じものを用いることがで
きる。 ii） ｉ）で得られたｃＤＮＡを鋳型として、プライマ
ーおよび６）で得られた部分配列の部分をプライマーに
用いて、ＰＣＲを行なう。 iii） 確かさおよびＰＣＲ生成物の量を増すために、
同じプライマーおよび６）で得られた部分配列の別の部
分配列を用いてネステッドＰＣＲ（nested PCR）を行な
う。 iv） このようにして得られたＰＣＲ生成物を電気泳動
にかけ、バンドを切り出し、ｃＤＮＡを回収する。 ｖ） 回収されたｃＤＮＡをＴベクターにサブクローニ
ングし、得られたプラスミドを菌体に形質転換し、培養
する。菌体よりプラスミドを回収し、制限酵素により切
断し、電気泳動により、インサートを確認する。 vi） クローンのシーケンシングを行ない、５′末端の
配列を同定する。

【００２８】８）３′末端の同定 ３′ＲＡＣＥ法を用いて、６）で得られた配列の３′末
端の配列を得る。方法は、５′ＲＡＣＥ法と同様である
が、６）の部分配列については、より下流側の配列を用
いる。鋳型は、５′ＲＡＣＥ法で用いたものと同じｃＤ
ＮＡを用いる。 ９）全長の確認 ６）、７）および８）の操作により得られた全長の配列
が、本当に存在することを確認するために、得られた配
列の３′末端および５′末端の部分配列を用いて、ＰＣ
Ｒを行ない、生成物を電気泳動にかけ、バンドを切り出
し、回収し、Ｔベクターに接合してプラスミドを得、得
られたプラスミドを菌体に形質転換し、菌体を培養後、
プラスミドを回収し、シーケンシングを行なう。 １０）好中球における本配列の確認 好中球画分に対して、部分配列を用いたＰＣＲにより、
本発明配列が存在しないことを確認した。

【００２９】このようにして得られたｃＤＮＡは、その
ものが全長またはほぼ全長であることを確認する必要が
ある。公知のシグナルシークエンスの長さおよび配列と
の比較により、本願ポリペプチドは、ほぼ全長であるこ
とを確認した。配列番号２および３で示される塩基配列
が一旦確定されると、その後は、化学合成によって、あ
るいは本発明の塩基配列の断片を化学合成し、これをプ
ローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明
のｃＤＮＡを得ることができる。さらに、本ｃＤＮＡを
含有するベクターｃＤＮＡを適当な宿主に導入し、これ
を増殖させることによって、目的とするｃＤＮＡを必要
量得ることができる。

【００３０】本発明のポリペプチドを取得する方法とし
ては、（１） 生体または培養細胞から精製単離する方
法、（２） ペプチド合成する方法、または（３） 遺
伝子組み換え技術を用いて生産する方法、などが挙げら
れるが、工業的には（３）に記載した方法が好ましい。

【００３１】遺伝子組み換え技術を用いてポリペプチド
を生産するための発現系（宿主−ベクター系）として
は、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞
の発現系が挙げられる。例えば、大腸菌で発現させる場
合には、成熟蛋白部分またはプロフォーム蛋白部分をコ
ードするｃＤＮＡの５′末端に開始コドン（ＡＴＧ）を
付加し、得られたｃＤＮＡを、適当なプロモーター（例
えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰ
Ｌプロモーター、Ｔ７プロモーター等）の下流に接続
し、大腸菌内で機能するベクター（例えば、ｐＢＲ３２
２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）に挿入して発現ベクタ
ーを作製する。

【００３２】次に、この発現ベクターで形質転換した大
腸菌（例えば、E.Coli ＤＨ５α、E.Coli ＪＭ１０
９、E.Coli ＨＢ１０１株等）を適当な培地で培養し
て、その菌体より目的とするポリペプチドを得ることが
できる。また、バクテリアのシグナルペプチド（例え
ば、ｐｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれば、ペリ
プラズム中に目的とするポリペプチドを分泌することも
できる。さらに、他のポリペプチドとのフュージョン・
プロテイン（fusion protein）を生産することもでき
る。

【００３３】また、哺乳動物細胞で発現させる場合に
は、例えば、配列番号３で示される塩基配列をコードす
るｃＤＮＡを適当なベクター（例えば、レトロウイルス
ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウ
イルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプ
ロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＳＲαプ
ロモーター、ＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプ
ロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを作製す
る。次に、得られた発現ベクターで適当な哺乳動物細胞
（例えば、ヒト未分化好酸球白血病ＥＯＬ細胞、ＣＯＳ
−７細胞、ＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞等）を形質転換
し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、
その培養液中に目的とするポリペプチドが分泌される。
以上のようにして得られたポリペプチドは、一般的な生
化学的方法によって単離精製することができる。

【００３４】

【発明の効果】本発明のポリペプチドは、好酸球が産生
するセリンプローテアーゼであり、脱顆粒に関与し、好
酸球の増多は、前述したように、アレルギー性疾患、感
染症、腫瘍性疾患、肉芽腫性疾患、膠原病、血管炎など
に伴って起こるため、これらの疾患に関与していると考
えられる。従って、本発明のセリンプロテアーゼを阻害
することは、上記の疾患の予防および／または治療に有
用であると考えられる。本発明のセリンプロテアーゼ
は、その阻害剤を得るためのスクリーニングにとって、
必須のものである。また、この方法を応用することによ
り、アレルギー疾患の診断に用いることもできる。

【００３５】本発明のセリンプロテアーゼの抗体は、上
記疾患の診断のために用いることができる。すなわち、
本発明のセリンプロテアーゼのポリクローナル抗体また
はモノクローナル抗体を用いて、生体における本発明セ
リンプロテアーゼの定量が行なえ、これによって本発明
のセリンプロテアーゼと疾患との関係の研究あるいは疾
患の診断等に利用することができる。ポリクローナル抗
体およびモノクローナル抗体は本発明のポリペプチドあ
るいはその断片を抗原として用いて常法により作製する
ことができる。さらに、本発明のセリンプロテアーゼを
用いることにより本発明のポリペプチドと結合する蛋白
（受容体）の精製あるいは遺伝子クローニングをするこ
とができる。また本発明のセリンプロテアーゼのアゴニ
スト、アンタゴニストの検索に用いることもできる。

【００３６】本発明のｃＤＮＡは、多大な有用性が期待
される本発明セリンプロテアーゼを生産する際の重要か
つ必須の鋳型となるだけでなく、遺伝病の診断や治療
（遺伝子欠損症の治療またはアンチセンスＤＮＡ（ＲＮ
Ａ）によって、セリンプロテアーゼの発現を停止させる
ことによる治療等）に利用できる。また、本発明のｃＤ
ＮＡをプローブとしてジェノミック（genomic）ＤＮＡ
を分離できる。同様にして、本発明ｃＤＮＡと相同性の
高いヒトの関連ポリペプチドの遺伝子、またヒト以外の
生物における本発明セリンプロテアーゼと相同性の高い
ポリペプチドの遺伝子を分離することも可能である。

【００３７】

【医薬品への適用】本発明のセリンプローテアーゼは、
アレルギー性疾患、感染症、腫瘍性疾患、肉芽腫性疾
患、膠原病、血管炎等の予防および／または治療のため
に、に有用である。また、上記疾患の診断にも有用であ
る。本発明のセリンプローテアーゼ、あるいは本発明の
セリンプローテアーゼに対する抗体は通常、全身的また
は局所的に、一般的には経口または非経口の形で投与さ
れる。好ましくは、経口投与および静脈内投与である。

【００３８】本発明化合物、抗体またはアンチセンスを
投与する際には、経口投与のための固体組成物、液体組
成物およびその他の組成物、非経口投与のための注射
剤、外用剤、坐剤等として用いられる。経口投与のため
の固体組成物には、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆
粒剤等が含まれる。カプセルには、ソフトカプセルおよ
びハードカプセルが含まれる。

【００３９】投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、
投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人一人
あたり、一回につき、１００μｇから１００ｍｇの範囲
で、一日一回から数回経口投与されるかまたは、成人一
人当り、一回につき、１０μｇから１００ｍｇの範囲
で、一日一回から数回非経口投与される。もちろん前記
したように、投与量は、種々の条件により変動するの
で、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、ま
た範囲を超えて必要な場合もある。

【００４０】

【実施例】以下に実施例および参考例を挙げて本発明を
より具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限
するものではない。

【００４１】実施例１：全ＲＮＡの抽出 好酸球増多症の患者の血液をパーコール（Sigma社）密
度遠心分離により、顆粒球分画を分離し、抗ＣＤ１６抗
体にて、ネガティブセレクションを行なった。この分画
が好酸球の純度が９８％以上であることをＦＡＣＳ解析
（Becton Dickinson社）により確認した。好酸球分画か
らグアニジン・フェノール法（CurrentProtocol in Mol
ecular Biology, WILEY inter science社）を用いて、
全ＲＮＡを抽出した。

【００４２】実施例２：一本鎖ｃＤＮＡの合成 オリゴＮｏｔＩ（ｄＴ１８）Ｖプライマー：５′−ＡＡ
ＣＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＡ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶ−３′（配列
番号５）を合成した。実施例１で得た全ＲＮＡ（１μｌ
（１μｇ／１μｌ））および上記で合成したバイファン
クショナルプライマー（１μｌ、１００μＭ）を混合
し、0.5ｍｌのRNAase・フリーチューブ（RNAase free t
ube）内で、７２℃で２分間、氷中で５分間反応させ
た。前記チューブにRNAsin（１μｌ）、スーパースクリ
プトII（Super Script II（１μｌ、Gibco BRL社））、
ジチオスレイトール（ＤＴＴ，１μｌ）、５×スーパー
スクリプトIIバッファー（Super Script II Buffer）
（４μｌ）、ＤＥＰＥＣ処理水（１１μｌ）を加え、４
２℃で６０分間、９４℃で５分間反応させた。

【００４３】実施例３：ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーの
合成 プラスミンのアクティブサイトをモチーフとした以下の
センスプライマーおよびアンチセンスプライマー各４種
を化学合成し、これらを組み合わせて、１６種類のプラ
イマーミックスを得た。

【００４４】

【化１】

【００４５】

【化２】

【００４６】

【表１】

【００４７】実施例４：選択的ＰＣＲ １０×ＥＸタックバッファー（EX Taq Buffer，４０μ
ｌ、宝酒造）、ｄＮＴＰミクスチャー（dNTP Mix，３２
μｌ、宝酒造社）、ＥＸタックポリメラーゼ（EX Taq p
olymerase ，２μｌ、宝酒造社）、実施例２で得られた
ｃＤＮＡ（１０μｌ）およびｄＨ₂Ｏ（２９６μｌ）を
混合し、ＰＣＲミックスを作成した。実施例３で得た１
６種類のプライマーミックス（１μｌ）およびＰＣＲミ
ックス（１９μｌずつ）をＰＣＲチューブに分注し、遺
伝子増幅ＰＣＲシステム2400（Gene Amp PCR system 24
00，Perkin Elmer社）を用いてＰＣＲを３５サイクル行
なった。ＰＣＲは、９４℃で1.5分おいた後、９４℃で
0.5分、６６℃で1.0分７２℃で2.0分を３５サイクルし
た後、７２℃で7.0分おいた。反応後、各チューブの生
成物をアガロースゲル（１×ＴＡＥ）を用いた電気泳動
にかけたのち、エチジウムブロマイド（Ethidium bromi
de）溶液処理を行ない、４００〜６００ｂｐのバンドを
回収した。この長さのバンドが得られた組み合わせは、
Ｎｏ．３，９，１１および１３であった。

【００４８】実施例５：大腸菌への形質転換 実施例４で回収したｃＤＮＡ（１μｌ）をＴベクターＰ
ＣＲ2.1（１μｌ、Invitrogen社）にリガーゼＩ（Ligas
eＩ，２μｌ、宝酒造社）を用いて連結した。得られた
プラスミドをＸＬ−２Ｂｌｕｅ（Stratagen社）に形質
転換し、クローンを得た。２４個のクローンをランダム
に選び、アンピシリン含有のＬＢ培養液（Difco社）中
で、３７℃で一昼夜振とうした。ウィザード・ミニプレ
ップキット（Wizard miniprep kit，Promega社）を用い
て、プラスミドを抽出した。プラスミドをＥｃｏＲＩ制
限酵素（New England Biolab社）を用いて切断し、アガ
ロース電気泳動にかけ、エチジウムブロマイド溶液で処
理した結果、５個のクローンに４００〜６００ｂｐのバ
ンドを得た。

【００４９】実施例６：シーケンシング 実施例５で得られた５つのクローンをサイクルシーケン
スキット（Cycle Sequence kit，Applied Biosystems
社）を用いてシーケンシングを行ない、各々の核酸配列
を得た。ホモロジー検索（BLASTX，NCBI）の結果、３ク
ローンがセリンプロテアーゼの配列を有していた。その
うち１クローンは新規な配列であった。

【００５０】実施例７：５′末端の同定 実施例６で得られたクローンの全長を得るために、まず
一本鎖ｃＤＮＡをキャップファインダー（Cap finder）
法を用いて作成し、これを鋳型として５′ＲＡＣＥ変法
を行なった。すなわち、実施例１で得た全ＲＮＡ（１μ
ｌ）を鋳型に、キャップスイッチII（Cap Switch II）
オリゴヌクレオチド（１μｌ、５μＭ）：５′−ＡＡＧ
ＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＧＣＧ
ＧＧ−３′（配列番号６）および実施例３で合成したオ
リゴＮｏｔＩ（ｄＴ１８）Ｖプライマー（１μｌ、１０
μＭ）、ｄＨ₂Ｏ（２μｌ）をRNAase・フリーチューブ
に入れ、７２℃で２分間反応させ、氷中に５分間放置
後、５×スーパースクリプトIIバッファー（Super Scri
pt II Buffer）（２μｌ）、ＤＴＴ（１μｌ，２０ｍ
Ｍ）、ｄＮＴＰ（１μｌ、１０ｍＭ）およびスーパース
クリプトII（Super Script II） （１μｌ）を加え
て、４２℃で１時間反応後９５℃で２分間変性した。得
られた一本鎖ｃＤＮＡは、ＱＩＡクイックＰＣＲピュリ
フィケーションキット（QIA quick PCR Purification K
it，QIAGEN社）を用いて精製し、３０μｌのトリス（Tr
is，１０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）に再懸濁（resusp
end）た。

【００５１】これを鋳型に用いて、キャップ（ＣＡＰ）
ＰＣＲプライマー：５′−ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣ
ＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ−３′（配列番号７）および実施
例６で得られた配列の部分配列ＥＳＰ−１（６８）：
５′−ＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＣＣＡＴＣＣＡＣＣ−３′
（配列番号８）を用いてＰＣＲ（First PCR）を３５サ
イクル行ない、精製後さらに、上記のＣＡＰ ＰＣＲプ
ライマーおよび実施例６で得られた配列の部分配列ＥＳ
Ｐ−１（４９）：５′−ＣＧＧＡＧＧＧＡＴＣＡＣＴＡ
ＡＧＧＴＣＡＣ−３′（配列番号９）を用いてＰＣＲ
（Second PCR）を２０サイクル行なった。生成物をアガ
ロース電気泳動にかけ、エチジウムブロマイド溶液で処
理し、約３００ｂｐのバンドを得た。得られたバンドを
切り出し、回収したｃＤＮＡを実施例５と同様の操作に
より、Ｔベクターにサブクローニングし、ＸＬ−２Ｂｌ
ｕｅに形質転換した。アンピシリン含有のＬＢ培養液
（Difco社）中で、３７℃で一昼夜振とうした。ウィザ
ード・ミニプレップキット（Wizard miniprep kit，Pro
mega社）を用いて、プラスミドを抽出した。プラスミド
をＥｃｏＲＩ制限酵素（New England Biolab社）を用い
て切断し、アガロース電気泳動にかけ、エチジウムブロ
マイド溶液で処理し３００ｂｐのインサートを確認し
た。得られた５クローンについて、実施例６と同様の方
法によりシーケンシングを行なったところ、２つのクロ
ーンにおいて、実施例６で得られた配列の一部と一致し
た。

【００５２】実施例８：３′末端の同定 実施例７で得られたｃＤＮＡを鋳型として実施例７と同
様の方法（３′ＲＡＣＥ変法）により、ＮｏｔＩ（ｄ
Ｔ）プライマー：５′−ＣＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣ
ＧＧＣＣＧＣＡＧＧ−３′（配列番号１０）および実施
例６で得られた配列の部分配列ＥＳＰ−１（４２４）：
５′−ＧＧＡＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＧＴＧＣＴＧＧＣ−
３′（配列番号１１）を用いてＰＣＲ（First PCR）を
３５サイクル行ない、精製後さらに、上記のＮｏｔＩ
（ｄＴ）プライマーおよび実施例６で得られた配列の部
分配列ＥＳＰ−１（４５６）：５′−ＣＧＧＧＡＡＧＧ
ＡＴＧＣＣＴＧＣＴＴＣＧ−３′（配列番号１２）を用
いてＰＣＲ（Second PCR）を２０サイクル行なった。生
成物をアガロース電気泳動にかけ、エチジウムブロマイ
ド溶液で処理し、約４００ｂｐのバンドを得た。得られ
たバンドを切り出し、回収したｃＤＮＡを実施例５と同
様の操作により、Ｔベクターにサブクローニングし、Ｘ
Ｌ−２Ｂｌｕｅに形質転換した。アンピシリン含有のＬ
Ｂ培養液中で、３７℃で一昼夜振とうした。ウィザード
・ミニプレップキット（Wizard miniprepkit， Promega
社）を用いて、プラスミドを抽出した。プラスミドをＥ
ｃｏＲＩ制限酵素を用いて切断し、アガロース電気泳動
にかけ、エチジウムブロマイド溶液で処理し、４００ｂ
ｐのインサートを確認した。得られた２クローンについ
て、実施例６と同様の方法によりシーケンシングを行な
ったところ、２つのクローンにおいて、実施例６で得ら
れた配列の一部と一致した。

【００５３】実施例９：全長の確認 実施例６、７および８より得られた配列の部分配列ＥＳ
Ｐ−１（−９）：５′−ＧＡＧＧＡＧＧＣＣＡＴＧＧＧ
ＣＧＣＧＣ−３′（配列番号１３）および部分配列ＥＳ
Ｐ−１（１０５８）：５′−ＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＡＴ
ＣＡＡＣＴＧＧＡＡＴＧＴＧ−３′（配列番号１４）を
プライマーとして、実施例２で得られたｃＤＮＡを鋳型
として、実施例７と同様の操作を行ない、８クローン
中、３クローンにおいて全長が１０５８ｂｐの配列が得
られた。欠失（deletion）を持つ１クローンを含む４ク
ローンの配列を参照し、配列番号３に示される配列を得
た。この核酸配列から推定されるアミノ酸配列を配列番
号１に、翻訳部分の配列を配列番号２に、アミノ酸と核
酸を併記したものを配列番号４にそれぞれ示す。

【００５４】本発明の推定アミノ酸配列は、シグナルペ
プチド（Ｍｅｔ^-26〜Ａｌａ^-1）を含む、全長３１５ア
ミノ酸からなっており、セリンプロテアーゼのプロファ
イル（活性中心、Ｈｉｓ⁵⁶、Ａｓｐ¹¹¹、Ｓｅｒ²¹³）を
有し、Ｃ末端に１８個の疎水性領域（Ｔｒｐ²⁷²〜Ｖａ
ｌ²⁸⁹）を有していた。一方、Ａｌａ²⁶¹〜Ｓｅｒ²⁶³あ
るいはＧｌｙ²⁶⁴〜Ｓｅｒ²⁶⁶にはＧＰＩアンカード膜蛋
白に対するω、ω１、ω２サイトを有しており、膜蛋白
としての特徴と分泌型蛋白としての特徴を合わせ持って
いる。既知配列との比較により、本セリンプロテアーゼ
は、プロフォームの形で産生されると考えられ（Ａｌａ
¹〜Ｖａｌ²⁸⁹）、成熟蛋白としては、Ｉｌｅ¹⁶からであ
ると考えられる。

【００５５】実施例１０：好中球において本発明配列が
発現していないことの確認 実施例１と同様の操作により、抗ＣＤ１６抗体にてポジ
ティブセレクションを行なって得た好中球分画に対し
て、実施例２と同様の操作を行ない、ｃＤＮＡを得、こ
れにＰＣＲプライマーとして、実施例７で用いた部分配
列ＥＳＰ−１（６８）および実施例９で用いた部分配列
ＥＳＰ−１（−９）を用いたＰＣＲを行ない、実施例６
と同様の操作を行なった結果、約３００ｂｐのバンドは
得られず、好中球には、本発明のアミノ酸配列をコード
するＲＮＡを発現していないことが確認された。

【００５６】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Gly Ala Arg Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu Leu Ala Arg Ala -26 -25 -20 -15 Gly Leu Arg Lys Pro Glu Ser Gln Glu Ala Ala Pro Leu Ser Gly Pro -10 -5 1 5 Cys Gly Arg Arg Val Ile Thr Ser Arg Ile Val Gly Gly Glu Asp Ala 10 15 20 Glu Leu Gly Arg Trp Pro Trp Gln Gly Ser Leu Arg Leu Trp Asp Ser 25 30 35 His Val Cys Gly Val Ser Leu Leu Ser His Arg Trp Ala Leu Thr Ala 40 45 50 Ala His Cys Phe Glu Thr Tyr Ser Asp Leu Ser Asp Pro Ser Gly Trp 55 60 65 70 Met Val Gln Phe Gly Gln Leu Thr Ser Met Pro Ser Phe Trp Ser Leu 75 80 85 Gln Ala Tyr Tyr Thr Arg Tyr Phe Val Ser Asn Ile Tyr Leu Ser Pro 90 95 100 Arg Tyr Leu Gly Asn Ser Pro Tyr Asp Ile Ala Leu Val Lys Leu Ser 105 110 115 Ala Pro Val Thr Tyr Thr Thr Lys His Ile Gln Pro Ile Cys Leu Gln 120 125 130 Ala Ser Thr Phe Glu Phe Glu Asn Arg Thr Asp Cys Trp Val Thr Gly 135 140 145 150 Trp Gly Tyr Ile Lys Glu Asp Glu Ala Leu Pro Ser Pro His Thr Leu 155 160 165 Gln Glu Val Gln Val Ala Ile Ile Asn Asn Ser Met Cys Asn His Leu 170 175 180 Phe Leu Lys Tyr Ser Phe Arg Lys Asp Ile Phe Gly Asp Met Val Cys 185 190 195 Ala Gly Asn Ala Gln Gly Gly Lys Asp Ala Cys Phe Gly Asp Ser Gly 200 205 210 Gly Pro Leu Ala Cys Asn Lys Asn Gly Leu Trp Tyr Gln Ile Gly Val 215 220 225 230 Val Ser Trp Gly Val Gly Cys Gly Arg Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr 235 240 245 Thr Asn Ile Ser His His Phe Glu Trp Ile Gln Lys Leu Met Ala Gln 250 255 260 Ser Gly Met Ser Gln Pro Asp Pro Ser Trp Pro Leu Leu Phe Phe Pro 265 270 275 Leu Leu Trp Ala Leu Pro Leu Leu Gly Pro Val 280 285

【００５７】配列番号：２ 配列の長さ：９４５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 ATGGGCGCGC GCGGGGCGCT GCTGCTGGCG CTGCTGCTGG CTCGGGCTGG ACTCAGGAAG 60 CCGGAGTCGC AGGAGGCGGC GCCGTTATCA GGACCATGCG GCCGACGGGT CATCACGTCG 120 CGCATCGTGG GTGGAGAGGA CGCCGAACTC GGGCGTTGGC CGTGGCAGGG GAGCCTGCGC 180 CTGTGGGATT CCCACGTATG CGGAGTGAGC CTGCTCAGCC ACCGCTGGGC ACTCACGGCG 240 GCGCACTGCT TTGAAACCTA TAGTGACCTT AGTGATCCCT CCGGGTGGAT GGTCCAGTTT 300 GGCCAGCTGA CTTCCATGCC ATCCTTCTGG AGCCTGCAGG CCTACTACAC CCGTTACTTC 360 GTATCGAATA TCTATCTGAG CCCTCGCTAC CTGGGGAATT CACCCTATGA CATTGCCTTG 420 GTGAAGCTGT CTGCACCTGT CACCTACACT ACTAAACACA TCCAGCCCAT CTGTCTCCAG 480 GCCTCCACAT TTGAGTTTGA GAACCGGACA GACTGCTGGG TGACTGGCTG GGGGTACATC 540 AAAGAGGATG AGGCACTGCC ATCTCCCCAC ACCCTCCAGG AAGTTCAGGT CGCCATCATA 600 AACAACTCTA TGTGCAACCA CCTCTTCCTC AAGTACAGTT TCCGCAAGGA CATCTTTGGA 660 GACATGGTTT GTGCTGGCAA TGCCCAAGGC GGGAAGGATG CCTGCTTCGG TGACTCAGGT 720 GGACCCTTGG CCTGTAACAA GAATGGACTG TGGTATCAGA TTGGAGTCGT GAGCTGGGGA 780 GTGGGCTGTG GTCGGCCCAA TCGGCCCGGT GTCTACACCA ATATCAGCCA CCACTTTGAG 840 TGGATCCAGA AGCTGATGGC CCAGAGTGGC ATGTCCCAGC CAGACCCCTC CTGGCCACTA 900 CTCTTTTTCC CTCTTCTCTG GGCTCTCCCA CTCCTGGGGC CGGTC 945

【００５８】配列番号：３ 配列の長さ：１０８５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 GAGGAGGCCA TGGGCGCGCG CGGGGCGCTG CTGCTGGCGC TGCTGCTGGC TCGGGCTGGA 60 CTCAGGAAGC CGGAGTCGCA GGAGGCGGCG CCGTTATCAG GACCATGCGG CCGACGGGTC 120 ATCACGTCGC GCATCGTGGG TGGAGAGGAC GCCGAACTCG GGCGTTGGCC GTGGCAGGGG 180 AGCCTGCGCC TGTGGGATTC CCACGTATGC GGAGTGAGCC TGCTCAGCCA CCGCTGGGCA 240 CTCACGGCGG CGCACTGCTT TGAAACCTAT AGTGACCTTA GTGATCCCTC CGGGTGGATG 300 GTCCAGTTTG GCCAGCTGAC TTCCATGCCA TCCTTCTGGA GCCTGCAGGC CTACTACACC 360 CGTTACTTCG TATCGAATAT CTATCTGAGC CCTCGCTACC TGGGGAATTC ACCCTATGAC 420 ATTGCCTTGG TGAAGCTGTC TGCACCTGTC ACCTACACTA CTAAACACAT CCAGCCCATC 480 TGTCTCCAGG CCTCCACATT TGAGTTTGAG AACCGGACAG ACTGCTGGGT GACTGGCTGG 540 GGGTACATCA AAGAGGATGA GGCACTGCCA TCTCCCCACA CCCTCCAGGA AGTTCAGGTC 600 GCCATCATAA ACAACTCTAT GTGCAACCAC CTCTTCCTCA AGTACAGTTT CCGCAAGGAC 660 ATCTTTGGAG ACATGGTTTG TGCTGGCAAT GCCCAAGGCG GGAAGGATGC CTGCTTCGGT 720 GACTCAGGTG GACCCTTGGC CTGTAACAAG AATGGACTGT GGTATCAGAT TGGAGTCGTG 780 AGCTGGGGAG TGGGCTGTGG TCGGCCCAAT CGGCCCGGTG TCTACACCAA TATCAGCCAC 840 CACTTTGAGT GGATCCAGAA GCTGATGGCC CAGAGTGGCA TGTCCCAGCC AGACCCCTCC 900 TGGCCACTAC TCTTTTTCCC TCTTCTCTGG GCTCTCCCAC TCCTGGGGCC GGTCTGAGCC 960 TACCTGAGCC CATGCAGCCT GGGGCCACTG CCAAGTCAGG CCCTGGTTCT CTTCTGTCTT 1020 GTTTGGTAAT AAACACATTC CAGTTGATGC CTTGCAGGGC ATTCTTCAAA AAAAAAAAAA 1080 AAAAA 1085

【００５９】配列番号：４ 配列の長さ：１０８５ トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：Homo Sapiens 細胞：好酸球 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：10..954 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表わす記号：sig peptide 存在位置：10..87 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表わす記号：proform peptide 存在位置：88..954 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表わす記号：mat. peptide 存在位置：133..954 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表わす記号：活性中心（Ｈｉｓ） 存在位置：253..255 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表わす記号：活性中心（Ａｓｐ） 存在位置：418..420 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表わす記号：活性中心（Ｓｅｒ） 存在位置：724..726 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表わす記号：ω、ω１、ω２サイト 存在位置：868..876 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表わす記号：ω、ω１、ω２サイト 存在位置：877..885 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表わす記号：親水性領域 存在位置：883..900 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表わす記号：疎水性領域 存在位置：901..954 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GAGGAGGCC ATG GGC GCG CGC GGG GCG CTG CTG CTG GCG CTG CTG CTG 48 Met Gly Ala Arg Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu Leu -26 -25 -20 -15 GCT CGG GCT GGA CTC AGG AAG CCG GAG TCG CAG GAG GCG GCG CCG TTA 96 Ala Arg Ala Gly Leu Arg Lys Pro Glu Ser Gln Glu Ala Ala Pro Leu -10 -5 1 TCA GGA CCA TGC GGC CGA CGG GTC ATC ACG TCG CGC ATC GTG GGT GGA 144 Ser Gly Pro Cys Gly Arg Arg Val Ile Thr Ser Arg Ile Val Gly Gly 5 10 15 GAG GAC GCC GAA CTC GGG CGT TGG CCG TGG CAG GGG AGC CTG CGC CTG 192 Glu Asp Ala Glu Leu Gly Arg Trp Pro Trp Gln Gly Ser Leu Arg Leu 20 25 30 35 TGG GAT TCC CAC GTA TGC GGA GTG AGC CTG CTC AGC CAC CGC TGG GCA 240 Trp Asp Ser His Val Cys Gly Val Ser Leu Leu Ser His Arg Trp Ala 40 45 50 CTC ACG GCG GCG CAC TGC TTT GAA ACC TAT AGT GAC CTT AGT GAT CCC 288 Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Glu Thr Tyr Ser Asp Leu Ser Asp Pro 55 60 65 TCC GGG TGG ATG GTC CAG TTT GGC CAG CTG ACT TCC ATG CCA TCC TTC 336 Ser Gly Trp Met Val Gln Phe Gly Gln Leu Thr Ser Met Pro Ser Phe 70 75 80 TGG AGC CTG CAG GCC TAC TAC ACC CGT TAC TTC GTA TCG AAT ATC TAT 384 Trp Ser Leu Gln Ala Tyr Tyr Thr Arg Tyr Phe Val Ser Asn Ile Tyr 85 90 95 CTG AGC CCT CGC TAC CTG GGG AAT TCA CCC TAT GAC ATT GCC TTG GTG 432 Leu Ser Pro Arg Tyr Leu Gly Asn Ser Pro Tyr Asp Ile Ala Leu Val 100 105 110 115 AAG CTG TCT GCA CCT GTC ACC TAC ACT ACT AAA CAC ATC CAG CCC ATC 480 Lys Leu Ser Ala Pro Val Thr Tyr Thr Thr Lys His Ile Gln Pro Ile 120 125 130 TGT CTC CAG GCC TCC ACA TTT GAG TTT GAG AAC CGG ACA GAC TGC TGG 528 Cys Leu Gln Ala Ser Thr Phe Glu Phe Glu Asn Arg Thr Asp Cys Trp 135 140 145 GTG ACT GGC TGG GGG TAC ATC AAA GAG GAT GAG GCA CTG CCA TCT CCC 576 Val Thr Gly Trp Gly Tyr Ile Lys Glu Asp Glu Ala Leu Pro Ser Pro 150 155 160 CAC ACC CTC CAG GAA GTT CAG GTC GCC ATC ATA AAC AAC TCT ATG TGC 624 His Thr Leu Gln Glu Val Gln Val Ala Ile Ile Asn Asn Ser Met Cys 165 170 175 AAC CAC CTC TTC CTC AAG TAC AGT TTC CGC AAG GAC ATC TTT GGA GAC 672 Asn His Leu Phe Leu Lys Tyr Ser Phe Arg Lys Asp Ile Phe Gly Asp 180 185 190 195 ATG GTT TGT GCT GGC AAT GCC CAA GGC GGG AAG GAT GCC TGC TTC GGT 720 Met Val Cys Ala Gly Asn Ala Gln Gly Gly Lys Asp Ala Cys Phe Gly 200 205 210 GAC TCA GGT GGA CCC TTG GCC TGT AAC AAG AAT GGA CTG TGG TAT CAG 768 Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ala Cys Asn Lys Asn Gly Leu Trp Tyr Gln 215 220 225 ATT GGA GTC GTG AGC TGG GGA GTG GGC TGT GGT CGG CCC AAT CGG CCC 816 Ile Gly Val Val Ser Trp Gly Val Gly Cys Gly Arg Pro Asn Arg Pro 230 235 240 GGT GTC TAC ACC AAT ATC AGC CAC CAC TTT GAG TGG ATC CAG AAG CTG 864 Gly Val Tyr Thr Asn Ile Ser His His Phe Glu Trp Ile Gln Lys Leu 245 250 255 ATG GCC CAG AGT GGC ATG TCC CAG CCA GAC CCC TCC TGG CCA CTA CTC 912 Met Ala Gln Ser Gly Met Ser Gln Pro Asp Pro Ser Trp Pro Leu Leu 260 265 270 275 TTT TTC CCT CTT CTC TGG GCT CTC CCA CTC CTG GGG CCG GTC 954 Phe Phe Pro Leu Leu Trp Ala Leu Pro Leu Leu Gly Pro Val 280 285 TGAGCCTACC TGAGCCCATG CAGCCTGGGG CCACTGCCAA GTCAGGCCCT GGTTCTCTTC 1014 TGTCTTGTTT GGTAATAAAC ACATTCCAGT TGATGCCTTG CAGGGCATTC TTCAAAAAAA 1074 AAAAAAAAAA A 1085

【００６０】配列番号：５ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本 トポロジー：直鎖状 配列 AACTGGAAGA ATTCGCGGCC GCAGGAATTT TTTTTTTTTT TTTTTV

【００６１】配列番号：６ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本 トポロジー：直鎖状 配列 AAGCAGTGGT ATCAACGCAG AGTACGCGGG

【００６２】配列番号：７ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本 トポロジー：直鎖状 配列 AAGCAGTGGT ATCAACGCAG AGT

【００６３】配列番号：８ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本 トポロジー：直鎖状 配列 CCAAACTGGA CCATCCACC

【００６４】配列番号：９ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本 トポロジー：直鎖状 配列 CGGAGGGATC ACTAAGGTCA C

【００６５】配列番号：１０ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本 トポロジー：直鎖状 配列 CTGGAAGAAT TCGCGGCCGC AGG

【００６６】配列番号：１１ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本 トポロジー：直鎖状 配列 GGAGACATGG TTTGTGCTGG C

【００６７】配列番号：１２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本 トポロジー：直鎖状 配列 CGGGAAGGAT GCCTGCTTCG

【００６８】配列番号：１３ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本 トポロジー：直鎖状 配列 GAGGAGGCCA TGGGCGCGC

【００６９】配列番号：１４ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本 トポロジー：直鎖状 配列 CCTGCAAGGC ATCAACTGGA ATGTG

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成９年８月７日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３７】

【医薬品への適用】本発明のセリンプローテアーゼは、
アレルギー性疾患、感染症、腫瘍性疾患、肉芽腫性疾
患、膠原病、血管炎等の予防および／または治療のため
に有用である。また、上記疾患の診断にも有用である。
本発明のセリンプローテアーゼ、あるいは本発明のセリ
ンプローテアーゼに対する抗体は通常、全身的または局
所的に、一般的には経口または非経口の形で投与され
る。好ましくは、経口投与および静脈内投与である。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５２】実施例８：３′末端の同定 実施例７で得られたｃＤＮＡを鋳型として実施例７と同
様の方法（３′ＲＡＣＥ変法）により、ＮｏｔＩ（ｄ
Ｔ）プライマー：５′−ＣＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣ
ＧＧＣＣＧＣＡＧＧ−３′（配列番号１０）および実施
例６で得られた配列の部分配列ＥＳＰ−１（４２４）：
５′−ＧＧＡＧＡＣＡＴＧＧＴＴＴＧＴＧＣＴＧＧＣ−
３′（配列番号１１）を用いてＰＣＲ（First PCR）を
３５サイクル行ない、精製後さらに、上記のＮｏｔＩ
（ｄＴ）プライマーおよび実施例６で得られた配列の部
分配列ＥＳＰ−１（４５６）：５′−ＣＧＧＧＡＡＧＧ
ＡＴＧＣＣＴＧＣＴＴＣＧ−３′（配列番号１２）を用
いてＰＣＲ（Second PCR）を２０サイクル行なった。生
成物をアガロース電気泳動にかけ、エチジウムブロマイ
ド溶液で処理し、約４００ｂｐのバンドを得た。得られ
たバンドを切り出し、回収したｃＤＮＡを実施例５と同
様の操作により、Ｔベクターにサブクローニングし、Ｘ
Ｌ−２Ｂｌｕｅに形質転換した。アンピシリン含有のＬ
Ｂ培養液中で、３７℃で一昼夜振とうした。ウィザード
・ミニプレップキット（Wizard miniprepkit， Promega
社）を用いて、プラスミドを抽出した。プラスミドをＥ
ｃｏＲＩ制限酵素を用いて切断し、アガロース電気泳動
にかけ、エチジウムブロマイド溶液で処理し、約４００
ｂｐのインサートを確認した。得られた２クローンにつ
いて、実施例６と同様の方法によりシーケンシングを行
なったところ、２つのクローンにおいて、実施例６で得
られた配列の一部と一致した。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５３】実施例９：全長の確認 実施例６、７および８より得られた配列の部分配列ＥＳ
Ｐ−１（−９）：５′−ＧＡＧＧＡＧＧＣＣＡＴＧＧＧ
ＣＧＣＧＣ−３′（配列番号１３）および部分配列ＥＳ
Ｐ−１（１０８２）：５′−ＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＡＴ
ＣＡＡＣＴＧＧＡＡＴＧＴＧ−３′（配列番号１４）を
プライマーとして、実施例２で得られたｃＤＮＡを鋳型
として、実施例７と同様の操作を行ない、８クローン
中、３クローンにおいて全長が１０８２ｂｐの配列が得
られた。欠失（deletion）を持つ１クローンを含む４ク
ローンの配列を参照し、配列番号３に示される配列を得
た。この核酸配列から推定されるアミノ酸配列を配列番
号１に、翻訳部分の配列を配列番号２に、アミノ酸と核
酸を併記したものを配列番号４にそれぞれ示す。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５４】本発明の推定アミノ酸配列は、シグナルペ
プチド（Ｍｅｔ^-26〜Ａｌａ^-1）を含む、全長３１４ア
ミノ酸からなっており、セリンプロテアーゼのプロファ
イル（活性中心、Ｈｉｓ⁵⁶、Ａｓｐ¹¹¹、Ｓｅｒ²¹²）を
有し、Ｃ末端に１８個の疎水性領域（Ｔｒｐ²⁷¹〜Ｖａ
ｌ²⁸⁸）を有していた。一方、Ａｌａ²⁶⁰〜Ｓｅｒ²⁶²あ
るいはＧｌｙ²⁶³〜Ｓｅｒ²⁶⁵にはＧＰＩアンカード膜蛋
白に対するω、ω１、ω２サイトを有しており、膜蛋白
としての特徴と分泌型蛋白としての特徴を合わせ持って
いる。既知配列との比較により、本セリンプロテアーゼ
は、プロフォームの形で産生されると考えられ（Ａｌａ
¹〜Ｖａｌ²⁸⁸）、成熟蛋白としては、Ｉｌｅ¹⁶からであ
ると考えられる。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５６】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：３１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Gly Ala Arg Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu Leu Ala Arg Ala -26 -25 -20 -15 Gly Leu Arg Lys Pro Glu Ser Gln Glu Ala Ala Pro Leu Ser Gly Pro -10 -5 1 5 Cys Gly Arg Arg Val Ile Thr Ser Arg Ile Val Gly Gly Glu Asp Ala 10 15 20 Glu Leu Gly Arg Trp Pro Trp Gln Gly Ser Leu Arg Leu Trp Asp Ser 25 30 35 His Val Cys Gly Val Ser Leu Leu Ser His Arg Trp Ala Leu Thr Ala 40 45 50 Ala His Cys Phe Glu Thr Tyr Ser Asp Leu Ser Asp Pro Ser Gly Trp 55 60 65 70 Met Val Gln Phe Gly Gln Leu Thr Ser Met Pro Ser Phe Trp Ser Leu 75 80 85 Gln Ala Tyr Tyr Thr Arg Tyr Phe Val Ser Asn Ile Tyr Leu Ser Pro 90 95 100 Arg Tyr Leu Gly Asn Ser Pro Tyr Asp Ile Ala Leu Val Lys Leu Ser 105 110 115 Ala Pro Val Thr Tyr Thr Lys His Ile Gln Pro Ile Cys Leu Gln Ala 120 125 130 Ser Thr Phe Glu Phe Glu Asn Arg Thr Asp Cys Trp Val Thr Gly Trp 135 140 145 150 Gly Tyr Ile Lys Glu Asp Glu Ala Leu Pro Ser Pro His Thr Leu Gln 155 160 165 Glu Val Gln Val Ala Ile Ile Asn Asn Ser Met Cys Asn His Leu Phe 170 175 180 Leu Lys Tyr Ser Phe Arg Lys Asp Ile Phe Gly Asp Met Val Cys Ala 185 190 195 Gly Asn Ala Gln Gly Gly Lys Asp Ala Cys Phe Gly Asp Ser Gly Gly 200 205 210 Pro Leu Ala Cys Asn Lys Asn Gly Leu Trp Tyr Gln Ile Gly Val Val 215 220 225 230 Ser Trp Gly Val Gly Cys Gly Arg Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Thr 235 240 245 Asn Ile Ser His His Phe Glu Trp Ile Gln Lys Leu Met Ala Gln Ser 250 255 260 Gly Met Ser Gln Pro Asp Pro Ser Trp Pro Leu Leu Phe Phe Pro Leu 265 270 275 Leu Trp Ala Leu Pro Leu Leu Gly Pro Val 280 285

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５７】配列番号：２ 配列の長さ：９４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 ATGGGCGCGC GCGGGGCGCT GCTGCTGGCG CTGCTGCTGG CTCGGGCTGG ACTCAGGAAG 60 CCGGAGTCGC AGGAGGCGGC GCCGTTATCA GGACCATGCG GCCGACGGGT CATCACGTCG 120 CGCATCGTGG GTGGAGAGGA CGCCGAACTC GGGCGTTGGC CGTGGCAGGG GAGCCTGCGC 180 CTGTGGGATT CCCACGTATG CGGAGTGAGC CTGCTCAGCC ACCGCTGGGC ACTCACGGCG 240 GCGCACTGCT TTGAAACCTA TAGTGACCTT AGTGATCCCT CCGGGTGGAT GGTCCAGTTT 300 GGCCAGCTGA CTTCCATGCC ATCCTTCTGG AGCCTGCAGG CCTACTACAC CCGTTACTTC 360 GTATCGAATA TCTATCTGAG CCCTCGCTAC CTGGGGAATT CACCCTATGA CATTGCCTTG 420 GTGAAGCTGT CTGCACCTGT CACCTACACT AAACACATCC AGCCCATCTG CCTCCAGGCC 480 TCCACATTTG AGTTTGAGAA CCGGACAGAC TGCTGGGTGA CTGGCTGGGG GTACATCAAA 540 GAGGATGAGG CACTGCCATC TCCCCACACC CTCCAGGAAG TTCAGGTCGC CATCATAAAC 600 AACTCTATGT GCAACCACCT CTTCCTCAAG TACAGTTTCC GCAAGGACAT CTTTGGAGAC 660 ATGGTTTGTG CTGGCAATGC CCAAGGCGGG AAGGATGCCT GCTTCGGTGA CTCAGGTGGA 720 CCCTTGGCCT GTAACAAGAA TGGACTGTGG TATCAGATTG GAGTCGTGAG CTGGGGAGTG 780 GGCTGTGGTC GGCCCAATCG GCCCGGTGTC TACACCAATA TCAGCCACCA CTTTGAGTGG 840 ATCCAGAAGC TGATGGCCCA GAGTGGCATG TCCCAGCCAG ACCCCTCCTG GCCACTACTC 900 TTTTTCCCTC TTCTCTGGGC TCTCCCACTC CTGGGGCCGG TC 942

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５８】配列番号：３ 配列の長さ：１０８２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 GAGGAGGCCA TGGGCGCGCG CGGGGCGCTG CTGCTGGCGC TGCTGCTGGC TCGGGCTGGA 60 CTCAGGAAGC CGGAGTCGCA GGAGGCGGCG CCGTTATCAG GACCATGCGG CCGACGGGTC 120 ATCACGTCGC GCATCGTGGG TGGAGAGGAC GCCGAACTCG GGCGTTGGCC GTGGCAGGGG 180 AGCCTGCGCC TGTGGGATTC CCACGTATGC GGAGTGAGCC TGCTCAGCCA CCGCTGGGCA 240 CTCACGGCGG CGCACTGCTT TGAAACCTAT AGTGACCTTA GTGATCCCTC CGGGTGGATG 300 GTCCAGTTTG GCCAGCTGAC TTCCATGCCA TCCTTCTGGA GCCTGCAGGC CTACTACACC 360 CGTTACTTCG TATCGAATAT CTATCTGAGC CCTCGCTACC TGGGGAATTC ACCCTATGAC 420 ATTGCCTTGG TGAAGCTGTC TGCACCTGTC ACCTACACTA AACACATCCA GCCCATCTGC 480 CTCCAGGCCT CCACATTTGA GTTTGAGAAC CGGACAGACT GCTGGGTGAC TGGCTGGGGG 540 TACATCAAAG AGGATGAGGC ACTGCCATCT CCCCACACCC TCCAGGAAGT TCAGGTCGCC 600 ATCATAAACA ACTCTATGTG CAACCACCTC TTCCTCAAGT ACAGTTTCCG CAAGGACATC 660 TTTGGAGACA TGGTTTGTGC TGGCAATGCC CAAGGCGGGA AGGATGCCTG CTTCGGTGAC 720 TCAGGTGGAC CCTTGGCCTG TAACAAGAAT GGACTGTGGT ATCAGATTGG AGTCGTGAGC 780 TGGGGAGTGG GCTGTGGTCG GCCCAATCGG CCCGGTGTCT ACACCAATAT CAGCCACCAC 840 TTTGAGTGGA TCCAGAAGCT GATGGCCCAG AGTGGCATGT CCCAGCCAGA CCCCTCCTGG 900 CCACTACTCT TTTTCCCTCT TCTCTGGGCT CTCCCACTCC TGGGGCCGGT CTGAGCCTAC 960 CTGAGCCCAT GCAGCCTGGG GCCACTGCCA AGTCAGGCCC TGGTTCTCTT CTGTCTTGTT 1020 TGGTAATAAA CACATTCCAG TTGATGCCTT GCAGGGCATT CTTCAAAAAA AAAAAAAAAA 1080 AA 1082

【手続補正８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５９】配列番号：４ 配列の長さ：１０８２ トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：Homo Sapiens 細胞：好酸球 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：10..951 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表わす記号：sig peptide 存在位置：10..87 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表わす記号：proform peptide 存在位置：88..951 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表わす記号：mat. peptide 存在位置：133..951 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表わす記号：活性中心（Ｈｉｓ） 存在位置：253..255 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表わす記号：活性中心（Ａｓｐ） 存在位置：418..420 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表わす記号：活性中心（Ｓｅｒ） 存在位置：721..723 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表わす記号：ω、ω１、ω２サイト 存在位置：865..873 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表わす記号：ω、ω１、ω２サイト 存在位置：874..882 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表わす記号：親水性領域 存在位置：880..897 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表わす記号：疎水性領域 存在位置：898..951 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GAGGAGGCC ATG GGC GCG CGC GGG GCG CTG CTG CTG GCG CTG CTG CTG 48 Met Gly Ala Arg Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu Leu -26 -25 -20 -15 GCT CGG GCT GGA CTC AGG AAG CCG GAG TCG CAG GAG GCG GCG CCG TTA 96 Ala Arg Ala Gly Leu Arg Lys Pro Glu Ser Gln Glu Ala Ala Pro Leu -10 -5 1 TCA GGA CCA TGC GGC CGA CGG GTC ATC ACG TCG CGC ATC GTG GGT GGA 144 Ser Gly Pro Cys Gly Arg Arg Val Ile Thr Ser Arg Ile Val Gly Gly 5 10 15 GAG GAC GCC GAA CTC GGG CGT TGG CCG TGG CAG GGG AGC CTG CGC CTG 192 Glu Asp Ala Glu Leu Gly Arg Trp Pro Trp Gln Gly Ser Leu Arg Leu 20 25 30 35 TGG GAT TCC CAC GTA TGC GGA GTG AGC CTG CTC AGC CAC CGC TGG GCA 240 Trp Asp Ser His Val Cys Gly Val Ser Leu Leu Ser His Arg Trp Ala 40 45 50 CTC ACG GCG GCG CAC TGC TTT GAA ACC TAT AGT GAC CTT AGT GAT CCC 288 Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Glu Thr Tyr Ser Asp Leu Ser Asp Pro 55 60 65 TCC GGG TGG ATG GTC CAG TTT GGC CAG CTG ACT TCC ATG CCA TCC TTC 336 Ser Gly Trp Met Val Gln Phe Gly Gln Leu Thr Ser Met Pro Ser Phe 70 75 80 TGG AGC CTG CAG GCC TAC TAC ACC CGT TAC TTC GTA TCG AAT ATC TAT 384 Trp Ser Leu Gln Ala Tyr Tyr Thr Arg Tyr Phe Val Ser Asn Ile Tyr 85 90 95 CTG AGC CCT CGC TAC CTG GGG AAT TCA CCC TAT GAC ATT GCC TTG GTG 432 Leu Ser Pro Arg Tyr Leu Gly Asn Ser Pro Tyr Asp Ile Ala Leu Val 100 105 110 115 AAG CTG TCT GCA CCT GTC ACC TAC ACT AAA CAC ATC CAG CCC ATC TGC 480 Lys Leu Ser Ala Pro Val Thr Tyr Thr Lys His Ile Gln Pro Ile Cys 120 125 130 CTC CAG GCC TCC ACA TTT GAG TTT GAG AAC CGG ACA GAC TGC TGG GTG 528 Leu Gln Ala Ser Thr Phe Glu Phe Glu Asn Arg Thr Asp Cys Trp Val 135 140 145 ACT GGC TGG GGG TAC ATC AAA GAG GAT GAG GCA CTG CCA TCT CCC CAC 576 Thr Gly Trp Gly Tyr Ile Lys Glu Asp Glu Ala Leu Pro Ser Pro His 150 155 160 ACC CTC CAG GAA GTT CAG GTC GCC ATC ATA AAC AAC TCT ATG TGC AAC 624 Thr Leu Gln Glu Val Gln Val Ala Ile Ile Asn Asn Ser Met Cys Asn 165 170 175 CAC CTC TTC CTC AAG TAC AGT TTC CGC AAG GAC ATC TTT GGA GAC ATG 672 His Leu Phe Leu Lys Tyr Ser Phe Arg Lys Asp Ile Phe Gly Asp Met 180 185 190 195 GTT TGT GCT GGC AAT GCC CAA GGC GGG AAG GAT GCC TGC TTC GGT GAC 720 Val Cys Ala Gly Asn Ala Gln Gly Gly Lys Asp Ala Cys Phe Gly Asp 200 205 210 TCA GGT GGA CCC TTG GCC TGT AAC AAG AAT GGA CTG TGG TAT CAG ATT 768 Ser Gly Gly Pro Leu Ala Cys Asn Lys Asn Gly Leu Trp Tyr Gln Ile 215 220 225 GGA GTC GTG AGC TGG GGA GTG GGC TGT GGT CGG CCC AAT CGG CCC GGT 816 Gly Val Val Ser Trp Gly Val Gly Cys Gly Arg Pro Asn Arg Pro Gly 230 235 240 GTC TAC ACC AAT ATC AGC CAC CAC TTT GAG TGG ATC CAG AAG CTG ATG 864 Val Tyr Thr Asn Ile Ser His His Phe Glu Trp Ile Gln Lys Leu Met 245 250 255 GCC CAG AGT GGC ATG TCC CAG CCA GAC CCC TCC TGG CCA CTA CTC TTT 912 Ala Gln Ser Gly Met Ser Gln Pro Asp Pro Ser Trp Pro Leu Leu Phe 260 265 270 275 TTC CCT CTT CTC TGG GCT CTC CCA CTC CTG GGG CCG GTC 951 Phe Pro Leu Leu Trp Ala Leu Pro Leu Leu Gly Pro Val 280 285 TGAGCCTACC TGAGCCCATG CAGCCTGGGG CCACTGCCAA GTCAGGCCCT GGTTCTCTTC 1011 TGTCTTGTTT GGTAATAAAC ACATTCCAGT TGATGCCTTG CAGGGCATTC TTCAAAAAAA 1071 AAAAAAAAAA A 1082

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 7/00 Ｃ１２Ｎ 9/64 16/40 Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＢＮ Ｃ１２Ｎ 9/64 ＡＤＺ

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 実質的に純粋な形である配列番号１で示
   されるアミノ酸配列からなる好酸球セリンプロテアー
   ゼ、そのホモローグ、そのフラグメントまたはそのフラ
   グメントのホモローグであるポリペプチド。
2. 【請求項２】 配列番号１で示されるアミノ酸配列から
   なる請求項１記載のポリペプチド。
3. 【請求項３】 請求項２に記載されたポリペプチドをコ
   ードするｃＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列番号２で示される塩基配列を有する
   請求項３記載のｃＤＮＡ、またはその配列に選択的にハ
   イブリダイズするフラグメント。
5. 【請求項５】 配列番号３で示される塩基配列を有する
   請求項３記載のｃＤＮＡ、またはその配列に選択的にハ
   イブリダイズするフラグメント。
6. 【請求項６】 請求項３から５のいずれかの項に記載の
   ｃＤＮＡが組み込まれた複製または発現ベクター。
7. 【請求項７】 請求項６記載の複製または発現ベクター
   で形質転換された宿主細胞。
8. 【請求項８】 請求項１または２に記載のポリペプチド
   を発現させるための条件下で、請求項７記載の宿主細胞
   を培養することからなる請求項１または２に記載のポリ
   ペプチドの製造方法。
9. 【請求項９】 請求項１または２に記載されたポリペプ
   チドのモノクローナルまたはポリクローナル抗体。
10. 【請求項１０】 請求項１または２に記載されたポリペ
    プチドまたは請求項９記載の抗体またはアンチセンス、
    および薬学的に許容される賦形剤および／または担体を
    含有することを特徴とする薬学的組成物。
11. 【請求項１１】 請求項１または２記載のセリンプロテ
    アーゼを用いることを特徴とするセリンプロテアーゼ阻
    害剤のスクリーニング方法。
12. 【請求項１２】 請求項１または２記載のセリンプロテ
    アーゼ活性を測定することを特徴とするアレルギー疾患
    の診断方法。
13. 【請求項１３】 請求項９記載の抗体を用いることを特
    徴とするアレルギー疾患の診断方法。