JPH05508640A

JPH05508640A - 線維芽細胞成長因子を含む安定な医薬組成物

Info

Publication number: JPH05508640A
Application number: JP91511862A
Authority: JP
Inventors: アダミ，マルコ; ダラ・カサ，ロザンナ; ガンビニ，ルシアーノ; マグリーニ，ロベルト; マリアーニ，ロザリア; ペローネ，ジオバンニ
Original assignee: フアルミタリア・カルロ・エルバ・エツセ・エルレ・エルレ
Priority date: 1990-07-18
Filing date: 1991-07-16
Publication date: 1993-12-02
Anticipated expiration: 2015-10-16
Also published as: EP0539408B1; EP0539408A1; DE69101784T2; AU659997B2; GB9015824D0; JP3100058B2; DE69101784D1; WO1992001442A1; AU8109491A; ES2055607T3; CA2087430A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】線維　細　長因　を含む　を医　組成物本発明は、ヒトマイトジェン活性を有する繊維芽細胞成長因子（Ｆ　Ｇ　Ｆ　）、特にヒト塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む凍結乾燥組成物に係わる。ｂＦＧＦは天然のものまたは組換え手段によって製造されるものとし得る。

タンパク質は難しい安定性の問題を与える固有の化学的及び物理的特性を有するので、タンパク質薬剤を安全に取り扱ったり投与することが、医薬製剤製造業者に強くめられている。タンパク質には、化学的及び物理的の両方の不安定性に関与する種々の分解経路が存在する。かかる巨大分子は、精製または保存の間のその溶液の偶発的な汚染に起因する微生物分解の危険性にもさらされている。これら全てに配慮することは、経済的に好ましい保存寿命の期待のもとにかかる薬物を調製及びパッケージングする医薬製造業者にとっては特に重要である。起こり得る製剤の問題を解決するために、完璧な前調製プログラムはタンパク質薬剤に不可欠なステップである。更に、保存寿命が維持されることを保証するために、一連の安定性指標試験法が必要である。

凍結液中でさえ迅速に分解するタンパク質を含む多くの生物学的材料は、材料を凍結乾燥することにより長期間にわたって生存可能な状態に維持し得る。凍結乾燥（フリーズドライとしても公知である）は、凍結後に水分を組成物から昇華させる、組成物を乾燥する方法である。この方法の特に有利な点は、液体を処理することは比較的容易であることを利用して、水溶液中で比較的不安定な材料を液体の状態で処理して該材料を含宥させる容器中に充填し、温度を常温以上に高めずに乾燥し、従って、熱の悪影響を排除し、安定性の問題が比較的少ない乾燥状態で保存し得ることである。こうすると、生成物は生物学的活性の損失に対して安定化され、長い保存寿命が与えられる。

単に薬物塊を凍結乾燥することだけを考えて製剤を設計することは非実用的なことが多い、これは、製剤に使用される薬剤の量は通常は極めて少ないからである。これは、凍結乾燥過程で、薬剤が、該過程に使用される真空によって凍結乾燥容器から吸引除去され得るので問題である。更に、多くのポリペプチドは、低濃度で凍結乾燥すると比較的不安定である。それらは、生成物のパッケージ材料に吸収され、活性を失い得る。多くの凍結乾燥医薬組成物は、凍結乾燥過程に存在する固体の量を増大し、それによって少量の薬剤塊を凍結乾燥することに関係する問題を解消するために、希釈剤または増量剤の使用に頼っている。

欧州特許出願公開第０　３０８　２３８号は、ヒトマイトジェン活性を有するポリペプチド成長因子と、該組成物の再構成溶液に粘性を与え得る、水溶性または水膨潤性の医薬的に容認可能なポリマーとを含む安定な凍結乾燥組成物を記載している。成長因子として、上皮成長因子（Ｅ　Ｇ　Ｆ　）が特に述べられている。

本発明は、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と、医薬的に容認可能な増量剤（ｂｕｌｋｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）と、（ａ）カルボキシアルキルセルロースのアルカリ金属塩、または（ｂ）ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及びシスティンのいずれかとを含む凍結乾燥組成物を提供する。

本明細書において、ＦＧＦは、天然ヒトＦＧＦポリペプチドが示すのと類似の生物学的活性を有する種類のポリペプチドを含む、即ちＦＧＦは、組換えＤＮＡ技術によって産生されるまたは天然資源から誘導されるヒトＦ’ＧＦ、及び例えばウシ、ネズミまたは誓書動物のような近縁哺乳動物ＦＧＦのような酸性及び塩基性ＦＧＦを含む、ＦＧＦは更に、４つのシスティンアミノ酸残基のうち少なくとも１つが誘導体化されているＦＧＦのような化学的に修飾されたＦＧＦをも含む、従って本発明に使用されるＦＧＦは、１つ以上のシスティン残基の−ＳＨ基が −３−ＣＨ２−Ｃ００Ｈ基に変換されているカルボキシメチル化ＦＧＦであり得る６例えば国際公開Ｗ０　８６１０７５９５号；ＷＯ５７１０１７２８号；欧州特許出願公開第０２２６１８１号；Ａｂｒａｈａ、ｍ　ｅｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪ、旦、２５２３−２５２８，１９８６：またはＬｏｂｂ、Ｅｕｒ。

Ｊ、Ｃ１ｉｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、ｌ一旦、３２１−３３６．１９８８に記載のごとき任意のｂＦＧＦ分子を本発明に有効に使用し得る。

ｂＦＧＦの混合物を使用することもできる。これは、−Ａｂｒａｈａｍ　ｅｔ　ａｌ、によって報告されている配列番号１に示された１５５個のアミノ酸のうち、Ｎ末端Ｍｅｔ残基を除いた１５４個のアミノ酸配列を有するヒトｂＦＧＦ；及び一配列番号１に示されたアミノ酸配列のうち、Ｎ末端Ｍｅｔ及びＡｌａ残基を除いた１５３個のアミノ酸配列を有するヒトｂ　ＦＧＦのおおよそ５０　：　５０の混合物とし得る。

例えば組換えＤＮＡ技術によって生産されるヒト塩基性ＦＧＦが、本発明に使用するのに好ましい、特に本発明に使用し得るカルボキシメチル化ＦＧＦは、国際公＠ＷＯ３７１０１７２８号に記載のごとき、位置６９及び８７にある２つのシスティン残基がカルボキシメチル基、即ち−３−ＣＨ２−ＣＯＯＨ基によって個々にブロックされている１４６アミノ酸形のｂＦＧＦである。以降、この特定のカルボキシメチル化ＦＧＦをＣＭ−ＦＧＦと表記する。即ちＣＭ−ＦＧＦは、配列番号１に示した位置１０から位置１５５までのアミノ酸配列のうち、位置７８及び９６にあるＣｙｓ残基がカルボキシメチル化されている配列を有するｂＦＧＦである。

本発明の１つの実施態様においては、組成物は更に、本発明の組成物が例えば１〜３力月の長期間にわたって保存されたときにＦＧＦの酸化を十分に防ぐように選択される抗酸化剤を含む、抗酸化剤はジチオトレイトール（ＤＴＴ）であるのが好ましい、存在させるならば、抗酸化剤は典型的には増量剤の０．０１〜１００重量％、好ましくは０．１〜２５重量％の量で存在させる。

増量剤は、凍結乾燥に使用するのに適した任意の増量剤である。増量剤は通常は、凍結乾燥の間の製品の再溶解または圧潰を防ぐために、硬化剤（ｒｔｇｉｄｉｚｅｒ）として優れた特性を有する。適当な医薬的に容認可能な増量剤としては、マンニトール、ラクトース、ポリビニルピロリドン、ガラクチトール及びトレハロースを挙げることができる。このうち、マンニトールが好ましい０本発明の組成物におけるＦＧＦの量は典型的には増量剤の０．０１〜５重量％、好ましくは０．１〜１重量％である。

驚くべきことには、医薬的に容認可能な増量剤との混合物中のＦＧＦは、カルボキシアルキルセルロース、例えばカルボキシＣ３−４アルキルセルロースのアルカリ金属塩の存在下で安定化され得ることが判明した。アルカリ金属塩は例えばナトリウム塩またはカリウム塩とし得る。この成分は通常は増量剤の０．１〜５０重量％、好ましくは２．５〜１０重量％の量で存在させる。好ましいのはナトリウムカルボキシメチルセルロースである。驚くべきことには、セルロース塩を使用すると、天然アルキルセルロース、例えばメチルセルロースからは得ることができない安定性が本発明の組成物に付与される。

本発明の組成物は更に、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及びシスティンを使用することによっても安定化され得る。驚くべきことには、これら２つの成分が相乗作用して安定性を高めることが判明した。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの例としては、エチレンオキシドと共重合されたソルビトール並びにその−及び二無水物のＣｌ２−２゜部分飽和または不飽和脂肪酸エステルを挙げることができる。典型的には、ソルビトール及びその無水物各々１モルに対して１０〜４０モル、例えば約２０モルのエチレンオキシドを存在させる。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルは一般にポリソルベート（ｐ　。

ｏ　Ｉｙｓｏｒｂａｔｅ）として知られている。ポリソルベートの例としては、ソルビトール及びその無水物各々１モル当たり約２０モルのエチレンオキシドと共重合されたソルビトール並びにその−及び二無水物の部分ラウリン酸エステルの混合物であるポリソルベート２０（ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノラウレート、ＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒａｃｔｓ　整理番号９００５−６４−５）、ポリソルベート４０（ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノパルミテート、ＣＡＳ整理番号９００５−６６−７）、ポリソルベート６０（ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノステアレー）、ＣＡＳ整理番号９００５−６７−８）、ポリソルベート６５（ポリオキシエチレン２０ゾルビタントリステアレート、ＣＡＳ整理番号９００５−７１−４）、ポリソルベート８０（ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノオレエート、ＣＡＳ整理番号９００５−６５−６）及びポリソルベート８５（ポリオキシエチレン２０ソルビタントリオレエー）”＋　ＣＡＳ整理番号９００５−７０−３）を挙げることができる。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの量は好ましくは増量剤の０．０１〜２５重量％、最も好ましくは０，１〜１重１％である０本発明の組成物中のシスティンの量は好ましくは増量剤の０．００１〜１重量％、最も好ましくは０．０１〜０．１重量％である。

本発明の組成物は通常は、凍結乾燥前にバルク溶液中で調製する。バルク溶液は任意の量で凍結乾燥することができるが、５〜５００、例えば１０〜１００、好ましくは５０μｇのＦＧＦを含むアリコートに分割されるのが好ましい、アリコートは別個に、例えば別個のガラスバイアル中で凍結乾燥する。溶液を凍結乾燥する前に、例えばｒ遇することで殺菌することができる。このために、０．２μ ｍナイロン膜フィルターを使用することができる。このようなヂ過の後にＨＰＬＣ分析を行なって１本発明者らは、ＦＧＦが一貫して定量的に回収されることを見い出した。

凍結乾燥は実質的に以下のステップからなる。まず、凍結乾燥すべき溶液を、排気チャンバ内で共融点以下の温度で凍結する０次いでチャンバを通常は１３．３　Ｐ　ａ（０，ＩＴｏｒｒ）以下に排気する。生成物の温度以下の温度で冷たい凝結表面上で氷を昇華させるが、凝結表面は前記チャンバ内または結合チャンバ内にある０次いで、制御条件下に生成物に熱を導入し、それによって生成物をその共融温度以下に維持するように計画された速度で昇華するようなエネルギーを与える。典型的な凍結乾燥サイクルは次の通りである：（ａ＞−４５℃で凍結し、この温度に４時間維持する。

（ｂ）１３．３Ｐａ（０，ＩＴｏｒｒ）以下の真空レベル及び−６０℃の１１一温度で、−４５℃〜＋２５℃で約１２時約１１時間二次乾燥する。本発明者らは、上記凍結乾燥サイクルが、本発明に従って製造されたＦＧＦバッチの調製に適していることを見い出した。しかしながら、ＦＧＦの安定性を実質的に変えない上記方法の変形もあり得ることは当業者には明らかであろう。

本発明の組成物のアリコートは、無菌バイアル中に分配することができる。無菌ガラスバイアルが適当である。タンパク質はガラス表面に付着することが知られており、本発明者らは、本発明の凍結乾燥組成物をガラスバイアル内で再構成する場合、付着により幾分かのタンパク質が失われることを見い出した。しかしながら本発明者らは、付着を最小化するためにガラスバイアルをシリコーンエマルジョン（医薬用）で被覆すると、この問題がうまく解消されることを見い出した。

更に本発明者らは、ガラスバイアルを慣用のゴム栓で密封すると、ＦＧＦがゴム表面に吸収されることによりタンパク質が損失し得ることも見い出した。フッ素樹脂積層ブチルゴム栓を使用するとこの吸収は防止される。

本発明の凍結乾燥組成物は空気中または真空下に保存することができる。しかしながら、不活性ガス下、例えば窒素下に保存することが好ましい。

本発明の凍結乾燥組成物は実質的に、ＦＧＦと、医薬的に容認可能な増量剤と、（ａ）カルボキシアルキルセルロースのアルカリ金属塩または（ｂ）ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及びシスティンのいずれかとからなる。

本発明の凍結乾燥組成物は、任意の医薬的に容認可能な溶剤を使用して再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ）することができる、使用する溶剤は、ｐＨが５．０〜７．０の再構成溶液を与えるのが好ましい、再構成溶剤は０．９％塩化ナトリウム溶液（即ち生理食塩水）であるのが好ましい、必要によっては、溶液は有効量の抗菌性保存剤を含む、塩化ベンザルコニウムの効力は十分に報告されており、例えば眼科用保存剤として医薬製剤に一般に使用されているが故に、塩化ベンザルコニウムを約０．００５重量％の濃度で含むことは特に適している０本発明者らは、０．００５重量％の塩化ベンザルコニウムは、本発明の再構成溶液において微生物活性を有効に阻害することを見い出した。

ＦＧＦは、正常ヒト細胞の成長のｖＩＩＷＩにおいて役割を果たす成長因子である。ＦＧＦは、創傷治癒及び繊維芽細胞の成長を肩部することにおいて有用である。従って本発明は更に、無菌バイアルに入った上記凍結乾燥組成物と、凍結乾燥組成物を再構成するための無菌希釈液とを含むキットをも提供する８本発明は更に、本発明の凍結乾燥組成物を水性希釈液、例えば上述の医薬的に容認可能な溶剤を用いて再構成することからなる、ＦＧＦ水溶液を調製する方法をも含む０本発明の組成物またはキットは、人体または動物体の治療、例えば創傷治療の方法において有効である。

以下の実施例によって本発明の詳細な説明する。

以下の実施例において、使用したＦＧＦは、Ｆａｒｍｉｔａｌｉａ　Ｃａｒｌｏ　Ｅｒｂａ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ。

１ｏｇｙ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔから入手可能な組換えタンパク質薬剤である塩基性ＦＧＦ　ＦＣＥ　２６１８４、及びｂＦＧＦから得られる化学的修飾タンパク質であるＣＭ−ＦＧＦ（１４６アミノ酸形）である、これらの調製は調製例において後述する。ｂＦＧＦ及びＣＭ−ＦＧＦは、ｂＦＧＦについては約２．０ｍｇ／ｍｌ、またＣＭ−ＦＧＦについては約１　、１　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｉの活性物質濃度くこの濃度は、ビウレット反応（ｂｉｒｕｅｔｒｅａｃｔｉｏｎ）によって測定されたタンパク質濃度として表され、溶液は、１０μＭリン酸緩衝液を用いてｐＨ６，０で得られる）の凍結バルク溶液として入手可能である。

本発明者らは、上記バルク溶液を溶かし、２％マンニトール溶液を使用して濃度的５０μｇ　／　ｍ　１に希釈してもタンパク質の安定性に影響しないことを見い出した。希釈溶液のＨＰＬＣ分析は、活性薬物（ｂ　Ｆ　Ｇ　ＦまたはＣＭ− ＦＧＦ）が定量的に回収されることを示した。

＝　１：ｂＦＧＦ　ＦＣＥ　２６１８４　の−ｂＦＧＦに対する合成りＮＡ配列及びかかる配列を保有する発現プラスミドを、欧州特許出願公開第３６３６７５号に記載の方法に従って構築した０発酵及び精製プロセスは以下のごと〈実施した。

（ａ）［ユ土）Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｐａ５ｔｅｕｒ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎからのＥ、ｃｏｌｉＢ型細菌株を、ｂＦＧＦをコードするヒト遺伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝子の両方を保有するプラスミドで形質転換した。この形質転換株を、組換え非グリコジル化ｈ−ｂＦＧＦ（ヒトｂＦＧＦ）の製造に使用した。この株のＭａｓｔｅｒ　Ｃｅ１ｌ　Ｂａｎｋ（１５個の凍結乾燥バイアル）及びＷｏｒｋｉｎｇ　Ｃｅ１ｌ　Ｂａｎｋ（Ｗ、Ｃ，Ｂ、）（−１９０℃の液体窒素中に保存した７０個のバイアル）を調製した。Ｗ、Ｃ，Ｂ、のバイアルの１つの内容物を、発酵段階の接穫物として使用した。

発酵プロセスは、４１の培養培地を満たした１０１発酵器内で実施した１株選択条件を維持するために、テトラサイクリン塩酸塩を培地に加えた。３７℃で２０時間増殖させると、最終バイオマスは４２±２ｇ／ｌ乾燥重量であり、ｂＦＧＦの産生は、比較ゲル電気泳動によって測定したところ２５００±５００　ｍ　ｇ　／　ｌであった。

細菌を大量に増殖させるためには、発酵段階で純粋酸素に富むことが必要であった。

（ｂ）！ＬＣ１ＪＬＩ！細胞（微生物）を遠心することにより全発酵ブロスから分離した。得られたベレットを、塩化ナトリウムを含むリン酸ナトリウム＊Ｗ液中に再懸濁させた。細胞を十分に破壊するために、高圧ホモジナイザーに少なくとも３回通すことが必要であった。得られた細胞溶解物を遠心することにより清澄化し、更に処理するために上清を回収した。

（Ｃ’）Ｗ！ＬＭ清澄化した上清を５ｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＳＦａｓｔＦｌｏｗ（カチオン交換体）カラムに入れ、リン酸緩衝液中の塩化ナトリウム濃度増加勾配を使用してこのカラムから生成物を溶出した。生成物を、Ｈｅｐａｒｉｎ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６Ｂカラム上でリン酸［新液中の塩化ナトリウム濃度増加勾配によって溶出することにより更に精製した。最後に、５ｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ２５樹脂上で緩衝液交換して、大量の生成物Ｍ新液（リン酸ナトリウム−ＥＤＴＡ）中に生成物を得た。

５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｓ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗカラム及び５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５カラムは水酸化ナトリウム溶液で洗浄することにより清浄化した。Ｈｅｐａｒｉｎ　５ｅｐｈａｒｏｓｅは、３Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ＝８゜５及びＰ　Ｈ５，５いずれかの溶液を用いて洗浄した。

このようにして、ＦＣＥ２６１８４と命名されたｂＦＧＦを得た。これは、Ａｂｒａｈａｍ　ｅｔ　ａｔ、によって報告されている配列番号１に示された１５５個のアミノ酸のうち、Ｎ末端のＭｅｔ残基を除く１５４個のアミノ酸配列を有するヒトｂＦＧＦと。

配列番号１に示されたアミノ酸配列のうち、Ｎ末端のＭｅｔ及びＡｌａ残基を除く１５３個のアミノ酸配列を有するヒトｂＦＧＦとのおおよそ５０　：　５０の混合物である。

：ＣＭ−ＦＧＦ　ｉ１１０ｍｌの２５ｍＭリン酸ｗＷ液Ｐ）（８，０／ＳｍＭＥＤＴＡ中に、国際公開ＷＯ８７１０１７２８号に記載のごとく得られる組換えヒトｂＦＧＦ（１４６アミノ酸形）１００ｍｇを含む溶液に、１１０ｍ１の同じ緩衝液中のヨード酢酸４００ｍｇを加えた１反応混合物を暗所において室温で２時間放置した０次いで反応混合物を、２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，５で平衡化しておいたＭｏｎｏＳカラム（ＨＲＩ　Ｏ／１０．Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ　ａ）に直接入れた。

過剰な試薬を除去するために、カラムを平衡化緩衝液で十分に洗浄し、２５ｍＭリン酸Ｉ！衝液ｐ新液、５中の０〜ＩＭＮａＣ１直線濃度勾配を用いてカルボキシメチル化ｂＦＧＦ（ＣＭ−ＦＧＦ）を溶出した。ＣＭ−ＦＧＦ含有フラクションを、１０ｎＭリン酸緩衝液ｐ　Ｈ６，０１０，１ｍＭＥＤＴＡで平衡化しておいた５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ　ａ）上で脱塩した。

衷」１１１本発明者らは、溶液中のタンパク質を酸化から保護する上で、抗酸化剤、例えば１．４−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の存在が有効であることを見い出した。

しかしながら、溶液中でのその優れた保護作用にもかかわらず、凍結乾燥状態のタンパク質を長期間にわたって保存する場合、ＤＴＴはその分解を阻害しない。

実際、増量剤としてマンニトールを、抗酸化剤としてＤＴＴを含む５０μｇのｂＦＧＦ凍結乾燥製剤は、容認可能な安定性を示さない、３５℃及び２５℃で１週間保存した後、約１０％の効力損失（ＨＰ　Ｌ　Ｃ法）が検出された。従って、保護剤を製剤中に配合する必要性がある。

Ｐ、Ｐ、Ｄｅ　Ｌｕｃａ及びＭ、　Ｗ、　Ｔｏｗｎ　ｓ　ｅ　ｎ　ｄ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ、４２゜Ｎｏ、６．Ｎｏｖ、−Ｄｅｃ、１９８８．Ｐ１９０）によれば、リオプロテクタント（１ｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）またはクリオプロテクタント（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を使用することにより、凍結、乾燥または長期保存に起因するタンパク質の構造的変性を防止及び低減し得る。

リオプロテクタントは、凍結乾燥の間及びその後の保存の間タンパク質を安定化しその分解を防止する化合物と定義され、一方、クリオプロテクタントは凍結の際の損傷からのみ保護する。

上記理論的考察を踏まえ、リオプロテクタントとして作用し得る多数の化合物のＦＣＥ２６１８４及びＣＭ−ＦＧＦ保護能力を測定する実験を行なった。

ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰ　Ｍ　Ｃ）、ナトリウムカルボキシメチルセルロース（ＮａＣＭＣ）、メチルセルロース（Ｍ　Ｃ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥ　Ｃ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、塩化ナトリウム、グリシン、システィン及びアルブミンを、使用し得る保護剤として選択した。ｂＦＧＦ（５０ｕｇ／ｍ　１）と、増量剤としてのマンニトール（２０ｍｇ／ｍｌ＞と、抗酸化剤としてのＤＴＴ（０，５または０　、１　ｍ　ｇ　／　ｍ　１のいずれか）と、適当な濃度の使用可能な各安定剤とを含む溶液を無菌状態で調製し、バイアル（公称容積：１．０ｍｌ＞に入れ、凍結乾燥した。最終的な凍結乾燥製剤におけるタンパク質効力に及ぼす保存の影響を、加速安定性試験（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ　５ｔａｂｉｌｉｔｙ　５ｔｕｄｉｅｓ）（３５℃）によって検査した。

基本的な実験結果を表１にまとめて示す、既に述べたように、マンニトール及びＤＴＴを含む凍結乾燥製剤は、１週間保存すると１０％の効力損失が認められる。

ＤＴＴとの相乗効果を調査する目的でシスティンを加えても、同程度の損失が認められた。

ＮａＣＭＣのようなりオプロテクタントを存在させると、タンパク質の安定性は著しく向上する。他のセルロース誘導体（ＨＰＭＣ，ＨＥＣ，ＭＣ）は、安定剤として無効であることが判明したく表１にはＭＣに対するデータのみ表されているが、他の誘導体も同様の挙動を示した）。

ＰＶＡ、塩化ナトリウム、グリシン及びアルブミンは、ｂＦＧＦと極度に相入れないことが判明した。ポリソルベート８０またはシスティンは、単独で使用した場合には無効であることが判明した。しかしながら、ポリソルベート８０とシスティンを併用すると安定剤として驚異的によく作用した。更に、ポリソルベート８０またはシスティンのいずれもＮａＣＭＣと相乗作用した。

表１に示したデータは、凍結乾燥状態のタンパク質のための安定剤としてリオプロテクタントが果たす重要な役割を立証している。かかる化合物の保護能力における機構は、凍結乾燥調製物において水をタンパク質から分離するのを防ぐ能力にあると考え得る。試験した各凍結乾燥製剤において、薬物の水分ｋＮｉ、タンパク質を水和形態に維持するのに十分な程度の水分が（残留湿分として）存在する。タンパク質構造体によって緩やかに配位されている水の殻（Ｓｈｅ　１１）を破壊しようとするいかなる要因（高温または低温、溶剤）も、変性または凝集によるタンパク質の不活性化の原因となる。ＮａＣＭＣのような安定剤は、疎水構造または極性カルボキシル基のいずれかによって水分子にしっかりと配位し得る。その結果、安定剤はタンパク質の微小環境を水和状態に維持する。

保護剤として試験したＨＰＭＣ，ＭＣ及びＨＥＣような他のセルロース誘導体は、最も考えられるところではカルボキシル基がないために、無効であることが判明した。

ポリソルベート８０の安定化活性は、水分子に対する配位力が弱いために、低いことが推定され得る。これとは対照的に、ポリソルベート８０とシスティン及びＮａＣＭＣとの相乗効果は全く予想外であった。

表１−ＦＣＥ２６１８４前処方試験ｂＦＧＦ（５０ｍｃｇ）、マンニトール（２０ｍｇ）及びＤＴＴ（０，１ｍｇ）を含む種々の凍結乾燥製剤の加速安定性結果ＣＭ−ＦＧＦにおける実験結果を表２にまとめて示す。

表２において、ｎ、ｄ、は未測定であることを意味する。

ＣＭ−ＦＧＦ（５０μｇ／ｍｌ＞と、増量剤としてのマンニトール（２０ｍｇ／ｍｌ）と、ＤＴＴ（０，１ｍｇ）と、適当な濃度の使用し得る各安定剤とを含む溶液を無菌条件下に調製し、バイアル（公称容積１．０ｍｌ＞に入れ、凍結乾燥した。最終的な凍結乾燥製剤におけるタンパク質効力（ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｏｔｅｎｃｙ）に及ぼす保存の影響を、加速安定性試験（３５℃／４５℃）によって検査した。既にｂＦＧＦにおいて見られたように、Ｎａ−ＣＭＣはＣＭ−ＦＧＦの安定性を著しく向上する。

下記の材料、装置及び溶液を使用し、後述する条件下に試料のＨＰＬＣアッセイを実施した。

材料：ｂＦＧＦ凍結バルク溶液、作業用標準ＣＭ−ＦＧＦ凍結バルク溶液、作業用標準アセトニトリル、ＨＰＬＣ用水、ＨＰＬＣ用トリブトリフルオロ酢酸用１．４− ジチオトレイトール。

装置：・液体クロマトグラフィー装置：以下のものを備えたＭｉｌｔｏｎ　Ｒｏｙ　モデルＣＭ４０００または等価の装置ニー・Ｖｙｄａｃ　２１８ＴＰ５４　３００人を充填したクロマトグラフィーカラム（長さ２５０　ｍ　ｍ　、内径４゜６ｍｍ）または等価の装置・・注入バルブ：１００ｍｃｉ試料ループを取り付けたＲｈｅｏｄｙｎｅモデル７１２５または等価の装置・・検出器：Ｓｈｉｍａｄｚｕ　モデルＳＦＤ　６Ａまたは等価の装置・・積算レコーダー：ＳＰ　４２７０（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）または等価の装置・膜フィルター：０．２２μｍ多孔度、　Ｍｉ　Ｉ　ｌ　１ｐｏｒｅ　Ｄｕｒａｐｏｒｅ　ＧＶＷＰまたは等価の装置・精密実験用ガラス器具・プラスチックピペットチップ（Ｇｉｌｓｏｎ）・自動ピペット（Ｇｉｌｓｏｎ）・使い捨てプラスチックマイクロチューブ、容量２．５ｍ１（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）溶液：・移動相（Ａ）：上記膜フィルターを用いて一過し、脱気した、０．１％のトリフルオロ酢酸（ｗ　／　ｖ　）を含む水溶液・移動相（Ｂ）：上記膜フィルターを用いて一過し、脱気した、０．１％のトリフルオロ酢酸（ｗ／ｖ）を含む９５％アセトニトリル−５％水からなる溶液・１，４−ジチオトレイトール溶液ＨＰＬＣ用水中に約１ｍｇ／ｍｌを含むよう調製した溶液・標準溶液正確に計量した適量のｂＦＧＦまたはＣＭ−ＦＧＦ作業用標準バルク溶液を、使い捨てプラスチックマイクロチューブに移し、約５０　ｍ　ｃ　ｇ　／　ｍ　ｌのｂＦＧＦまたはＣＭ−ＦＧＦを含む最終溶液を得るために、適量の１．４−ジチオトレイトール溶液で希釈したもの、標準溶液は新しく調製し、作業日中に使用せねばならない。

・試料溶液少なくとも５つの凍結乾燥バイアルを使用して試料溶液を調製する。５０ｍｃｇのｂＦＧＦまたはＣＭ−ＦＧＦを含む各バイアルの内容物を１．０ｍｌのＨＰＬＣ用水中に溶解し、調製した全ての溶液を用いてプールを作製する。

クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）条件：下記の実験条件下で、液体クロマトグラフィーに標準溶液及び試料溶液のいずれかを交互に３回以上注入する二カラム温度　：室温（２２±２℃）移動相流速　：１ｍｌ／分分析波長　：２１０±ｌｎｍ検出器感度　：検出器“コンピューター”出力を最高感度で積算器に接続しておく。

注入量　：　１００ｍｃ　＋積算レコーダー減衰（ａｔｔｅｎｕａｔ　ｉ　ｏｎ）：　２５６罫紙速度　：０．５ｃｍ／分寒ｍａ）ナトリウムカルボキシメチルセルロースを用いて安定化したｂＦＧＦ組成物の調製ｌバイアル当たり車車車　２，０００バイアル当たり車掌本ＦＣＥ　２６１８４１　０．０８０４　ｍｇｌｇ　１２０．８　ｍｇ車ナナトリウムカルボキシ　１．０５００論ｇ　２．１　ｇメチルセルロース１．４−ジチオトレイトール　０．１０５０１１１１　２１０．０　ｍｇマンニトール　ｚｔ、ｏｏｏｏ曽ｇ　４２．０　ｇＯ，０１Ｎ　ＮａＯＨ又は０．ＯＩＮ　ＩｆＣＺ　ｐＨ＝６　ｐＨ＝６（指示値にする十分量）注入用水車車　１．０５　ｍｌ　２．１１（指示値にする十分量）本　製造中の損失を補償するために１５％の過剰量を含む。

本末　凍結乾燥の際、注入用水は取り除いた。

本本本５％過剰量のｂＦにＦナトリウムカルボキシメチルセルロース／ＤＴＴ／マンニトール溶液を含む。

ｂ）ポリソルベート８０及びシスティンを用いて安定化したｂＦＧＦ組成物の調製１バイアル当たり本末＊　２，０００バイアｌし当たり富庫本ＦＣＥ　２６１８４車　０．０６０４　ｍｌ車　１２０．８　ｍｇ車本スティン　０．０１０５論［１２１，０ｍｇ１．４−ジチオトレイトール　０．１０５０　ｍｇ　２１０．０　ｍｇマンニトール　２１．００００論ｇ　４２．０　ｇポリソルベート８０　０．０５２５論ｇ　１０５．０　ｍｇＯ，ＯＩＮ　ＮａＯＨ又は０．ＯＩＮ　ＨＣｆ　ｐＨ＝６　ｐＨ＝６（指示値にする十分量）注入用水木本　１．０５　ｄ　２．１１（指示値にする十分量）本　製造中の損失を補償するために１５％の過剰量を含む。

ｖｓ　凍結乾燥中の際、注入用水は取り除いた。

本京車５％過剰量のｂＦＧＦナトリウムカルボキシメチルセルロース／ＤＴＴ／マンニトール溶液を含む。

上記両調製物を凍結乾燥し、個々のバイアルを窒素下に密閉した６Ｃ）ナトリウムカルボキシメチルセルロールを用いて安定化したＣＭ−ＦＧＦ組成物の調製１バイアル当たり本末車　ｚ、ｏｏｏバイアＩし当たり京零車ＣＭ−Ｆｉｌ；Ｆ本　０，０５　輸ｇ本　１００　ｍｇナトリウムカルボキシ　１．００　ｍｌ２．０　ｇメチルセルロース１．４−ジチオトレイト−１し　０．１０　ｍｇ　２００．０　ｍｇマンニトール　２０．００　ｍｇ　４０．０　ｇＯ，ＯＩＮ　ＮａＯＨ又は０．ＯＩＮ　ＨＣｆｆｉ　ｐＨ＝６　ｐＨ＝６（指示値にする十分量）注入用水軍車　１．０５　ｄ　２．１１（指示値にする十分量）車　製造中の損失を補償するために１５％の過剰量を含む。

車掌　凍結乾燥の際、注入用水は取り除いた。

車車寧５％過剰量のｂＦＧＦナトリウムカルボキシメチルセルロース／ＤＴＴ／マンニトール溶液を含む。

ｄ）ポリソルベート８０及びシスティンを用いて安定化したＣＭ−ＦＧＦ組成物の調製ｌバイアル当たり車車車　２，０００バイアル当たり車車車ＣＭ−ＦＧＦ車　０．０５　ｍｇ車　１００．Ｏｓｇ本本スティン　ｏ、ｏｉ信ｇ　２０　ｍｇマンニトール　２０　ｍｇ　４０．０ｇポリソルベート８０　０．０５　ｍｇ　１００．０　ｙｍｇＯ，ＯＩＮ　ＮａＯＲ又は０．０１Ｎ　ＭＣＩ　ｐＨ＝６　、Ｈ＝６（指示値にする十分量）注入用水木本　１．０５　ｍｌ　２．１１（指示値にする十分量）車　製造中の損失を補償するために１５％の過剰量を含む６車車　凍結乾燥の際、注入用水は取り除いた。

車寧車５％過剰量のｂＦｌｌ；Ｆナトリウムカルボキシメチルセルロース／ＤＴＴ／マンニトール溶液を含む。

上記両調製物を凍結乾燥し、個々のバイアルを窒素下に密閉した。

ｅ）ポリソルベート８０及びシスティンを用いて安定化したＣＭ−ＦＧＦ組成物の調製１バイアル当たり京本車　２，０００バイアル当たり本車掌ＣＭ−ＦＧＦ　Ｏ，０５ｗ、ｇ車　１００．０　論ｇ富システィア　０．０１ｍｇ　２０　ｍｇｌ、４−ジチオトレイトール　０．１０　ｍｇ　２００　ｍｇマンニトール　２０　ｖｓｇ　４０．０ｇポリソルベー）８０　０．０５　ｗＩｇ　１００．０　＋ｓｇＯ，ＯＩＮ　ＮａＯＨ又は０．ＯＩＮ　ＨＣｆｆｉ　Ｅｌ［ｌ＝６　ｐＨ＝６（指示値にする十分量）注入用水零京　１．０５驕１　２．１１（指示値にする十分量）本　製造中の損失を補償するために１５％の過剰量を含む。

本章　凍結乾燥の際、注入用水は取り除いた。

本車車５％過剰量のｂＦｃＦＦｃジナトリウムカルボキシメチルセルロースＴＴ／マンニトール溶液を含む。

叉ｊｌｆｉ一旦の　の約５０μｇのｂＦＧＦを含む本発明の組成物が入った凍結乾燥バイアルを、種々の温度で種々の期間にわたって保存したときの長期安定性について調査した。結果は表３〜２２に示す、以下のパラメーターを調査した。容認可能な標準（値）も以下に示す。

外観：目視検査により評価、圧縮された白色の凍結乾燥ケーキまたは塊を含む無色のガラスバイアルであること。

識別：＊Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ　ｌｏｇｙ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎから入手可能なＰｈａｓｔ　Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）を使用した電気泳動（ＳＤＳ　ＰＡＧＥ）により評価、還元及び変性条件下に、ＦＣＥ２６１８４またはＣＭ−ＦＧＦの作業用標準溶液と同じ分子量バンドであること。

ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイ：標識量の９０〜１１０％であること。

バイオアッセイ（３Ｔ３細胞におけるＤＮＡ合成の刺激）：ＦＣＥ　２６１８４のＦＩＣＥ内部標準を使用し、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞中への３Ｈ−ＴｄＲ取込みについて測定する平行線アッセイ（ｐａｒａｌｌｅｌ　１ｉｎｅ　ａｓｓａｙ）によって計算される値、値を調製物の力価で表わすと、Ｒ＝１．０±０．３５であること。

無菌性：無菌水分：３％以下再構成（ｒｅｃｏｎｓｔ　ｉ　ｔｕｔ　ｉ　ｏｎ）後の外観＊：清浄な無色透明溶液であり、肉眼で見える異物粒子を含まな再構成後のｐＨ本：５．０〜７．０本バイアルを５ｍｌの所望の溶剤中に溶解した。

実施例２（ａ）の組成物一外観　標準に従う一−−−−−−−−−無変化−−−−一一一−−−−５ＤＳＰＡＧＥ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ −バイオアッセイ　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ。

−水分％　０．９　１．２　１．０　１．０−外観　標準に従う一−−−−−− −−−無変化一一一一一〜−−−一（再構成溶液） −ｐＨ６，０６，０８，１８，０（再構成溶液）Ａ＝正しい分子量位置に濃いバンドｎ、ｄ、＝未測定表４−ＦＣＥ　２６１８４凍結乾燥バイアルの加速安定性データーバッチＰ８１９９／１０／Ｃ，活性薬物バッチ番号０Ｐ４９実施例２（ａ）の組成物試験　初期　３５℃ 対照　１週間　２週間　４週間 −外観　標準に従う一一−−−−−−−−無変化−−−−−−−−一−−ＳＤＳＰＡＧＥ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ −ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイ・ＩＩｃｇ／バイアル　４９．８８　５０．８３　４６．８４　４８．７３・初期値に対する％１００．０　１０１．９　９３．９　９７．７−バイオアッセイ　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ。

−水分％　０．９　０．８　０．９　０．９−外観　標準に従う一一−−−−− −−−無変化−−−−−−−−一−（再構成溶液） −ｐＨ６，０５，９６，０８，０（再構成溶液）Ａ＝正しい分子量位置に濃いバンドｎ、ｄ、＝未測定実施例２（ａ）の組成物一外観　標準に従う一−−−−−−−＝−−−−−−無変化−−−−−−−−− −−〜−−−−−５ＤＳＰＡにＥ　Ａ　ｎ、ｄ、　Ａ　ｎ、ｄ、　Ａ　Ａ−ＲＰ −ＨＰＬＣアッセイ一バイオアッセイ　範囲内　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、範囲内　範囲内−水分％　１．５　１．８　１．５　１．９　１．７　ｎ、ｄ。

−外観　標準に従う一−−−−−−−−−−−−−−無変化−−−−−−−−− −一〜−−−−−（再構成溶液） −ｐＨｅ、ｏ　ｓ、ｏ　ｓ、ｏ　ｅ、ｏ　６．０　５．６（再構成溶液）Ａ＝正しい分子量位置に濃いバンドｎ、ｄ、＝未測定実施例２（ａ）の組成物一外観　標準に従う−−〜−−−−−−−−−−−−−−−無変無変化−一−− −−−−−−−−−−−−〜−−ＳＤＳＰＡＧＥ　Ａ　ｎ、ｄ、　Ａ　ｎ、ｄ、ｎ、ｄ、　Ａ　Ａ−バイオアッセイ　範囲内　範囲内　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ。

−水分％　１．５　１．０　１．２　１．４　１．６　１．８　ｎ、ｄ。

−外観　標準に従う一一−−−−−−−−−−−−〜−−−無変化−−〜−−− −−−−−−−−−−−−−−−（再構成溶液） −ｐＨ６，０６，０５，９ｎ、ｄ、　６．０　５．９　５．７（再構成溶液）一無菌性　無菌　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　無菌Ａ＝正しい分子量位置に濃いバンドｎ、ｄ、＝未測定実施例２（ａ）の組成物一外観　標準に従う一−−−−−−−−−−−−−−−−−一無変化一−−−〜 −−−−−−−−−−−−−−−−ＳＤＳＰＡＧＥ　Ａ　ｎ、ｄ、　Ａ　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　Ａ　Ａ−バイオアッセイ　範囲内　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、範囲内　ｎ、ｄ。

−水分％　１．５　２．０　１．５　１．４　１．７　１．８　ｎ、ｄ。

−外観　標準に従う一−−−−−−−−−−−−−−−−−無変化−−−−一一 −−−−−−−−−−−−−−−Ａ＝正しい分子量位置に濃いバンドｎ、ｄ、＝未測定実施例２（ａ）の組成物一外観　標準に従う　−一一一一一一一一一無変化一一一一一一一一一一−５ＤＳ　ＰＡＧＥ　Ａ　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　Ａ−バイオアッセイ　範囲内　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ。

−水分％　１．５　１．４　１．０　１．０−外観　標準に従う　−−−一−− −−−−無変化−−−−−−−−〜−（再構成溶液） −ｐＨ８，０８，０５，９５，９（再構成溶液）ＬＣＴ　＝ライトキャビネット温度（２８±２℃）Ｆ、Ｃ，＝フートキャンドルＡ＝正しい分子量位置に濃いバンド　−ｎ、ｄ、＝未測定実施例２（ａ）の組成物一外観　標準に従う一一−−−−−−−−無変化一−−−−−一−−−−ＳＤＳＰＡＧＥ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ −バイオアッセイ　範囲内　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　範囲内−水分％　１．０　１．２　１．４　１．５−外観　標準に従う−−−−−−−−−−無変化−〜−一一一一一一−（再構成溶液）Ａ＝正しい分子量位置に濃いバンドｎ、ｃ１．＝未測定表１２−ＦＣＥ　２６１８４凍結乾燥バイアルの長期安定性データーバッチＴＦ／２３６２５．活性薬物バッチ番号○Ｐ４８実施例２（ａ）の組成物一外観　標準に従う−−−−−−−−−−−−−−−無変化−−−−−−−一一 −−−−−−−ＳＤＳＰＡＧＥ　Ａ　Ａ　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　Ａ−ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイ・ｍｃｇ／バイアル　４９．４３　４８．３４　５２．１Ｏｎ、ｄ、　４５．４６・初期値に対する％１００．０　９７．８　１０５．４　ｎ、ｄ、　９２．０ −バイオアッセイ　範囲内　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ。

−水分％　１．０　１．２　１．１　１．３　１．１−外観　標準に従う一−− −−−−−−−−−−−−無変化−−−一−−−−−−−−−−−（再構成溶液） −ｐＨ５，４５，４５，４５，６５，５（再構成溶液）一無菌性　無菌　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ。

Ａ＝正しい分子量位置に濃いバンドｎ、ｄ、＝未測定表１３−ＦＣＥ　２６１８４凍結乾燥バイアルの長期安定性データーバッチＴＦ／２３６２５．活性薬物バッチ番号０Ｐ４８実施例２（ａ）の組成物一外観　標準に従う−−−−−−−−−−−−−−−無変化−−−一一一−−− −−−−−−−ＳＤＳＰＡＧＥ　Ａ　Ａ　Ａ　ｎ、ｄ、　Ａ−ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイ一バイオアッセイ　範囲内　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ。

−水分％　１．０　１．１　１．２　１．２　１．４−外観　標準に従う一−− −−−−−−−−−−−−無変化−−−−−−−−−一−−−−−−（再構成溶液） −ｐＨ５，４５，４５，４５，６５，４（再構成溶液）Ａ＝正しい分子量位置に濃いバンドｎ、ｄ、＝未測定表１４−ＦＣＥ　２６１８４凍結乾燥バイアルの長期安定性データーバッチＴＦ／２３６２５．活性薬物バッチ番号０Ｐ４８実施例２（ａ）の組成物一外観　標準に従う−−−−−−−−−−−−−−−−無変化−−−−一一一− −−−−−−−−−５ＤＳＰＡＧＥ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ　ｎ、ｄ、　Ｂ−ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイ・ＩＩｃｇ／バイアル　４９．４３　４６．６１　４７．０６　５１．２　４８．８２　４５．０１・初期値に対する％１００．０　９４．３　９５．２　１０３．６　９８．８　９１．１−バイオアッセイ　範囲内　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　範囲内−水分％　１．０　１．２　１．１　１．１　１．２　１．２−外観　標準に従う一−−−−−−−−−−−−−−無変化一−−− 一一−−−−−−−−−−−（再構成溶液） −ｐＨ５，４５，６５，４５，４５，７５，５（再構成溶液）Ａ＝正しい分子量位置に濃いバンドｎ、ｃｊ、＝未測定表１５−ＦＣＥ　２６１８４凍結乾燥バイアルの長期安定性データーバッチＴＦ／２３６２５．活性薬物バッチ番号０Ｐ４８実施例２（ａ）の組成物一外観　標準に従う−−−−−−−−−−−−−−−無変化−−−一−−−−− −−−−−−−５ＤＳＰＡＧＥ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ。

−ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイ・ｌｃｇ／バイアル　４９．４３　４５．８２　４９．１８　５１．５　４８．４８　ｎ、ｄ。

・初期値に対する％１００．０　９２．７　９９．５　１０４．２　９８．ｉ　ｎ、ｄ。

−バイオアッセイ　範囲内　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ。

−水分％　１．０　１．２　１．１　１．３　１．３　ｎ、ｄ。

−外観　標準に従う一−−−−−−−−−−−−−−無変化一−−−一−−−− −−−−−−−（再構成溶液） −ｐＨ５，４５，５５，５５，４５，７ｎ、ｄ。

（再構成溶液）Ａ＝正しい分子量位置に濃いバンドｎ、ｄ、＝未測定表１６−ＦＣＥ　２６１８４凍結乾燥バイアルの加速安定性データーバッチＴＦ／２３６２５．活性薬物バッチ番号０Ｐ４８実施例２（ａ）の組成物一外観　標準に従う　−−−一−−−−−−−無変化−−−−−−−−−一−− −５ＤＳ　ＰＡＧＥ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ −バイオアッセイ　範囲内　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ。

−水分％　１．０　１５　１．４　１．２−外観　標準に従う　−一一一−−− −−−−無変化−−−−−一−−−−−−（再構成溶液） −ｐＨ５，４５，５５，５５，５（再構成溶液）Ａ＝正しい分子量位置に濃いバンドｎ、ｄ、＝未測定実施例２（ｂ）の組成物一外観　標準に従う一一一−−−−−−−無変化−−−−一−−−−−−ＳＤＳＰＡＧＥ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ −バイオアッセイ　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ。

−水分％　０．８　０．９　０．９　１．０−外観　標準に従う一−−−−−− −〜−無変化−−−〜−−−−−−（再構成溶液） −ｐＨ６，０６，２６，１６，２（再構成溶液）Ａ＝正しい分子量位置に濃いバンドｎ、ｄ、＝未測定実施例２（ｂ）の組成物一外観　標準に従う一一−−−−−〜−−無変化−−−−−一−−−−−ＳＤＳＰＡＧＥ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ −バイオアッセイ　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ。

−水分％　０．８　０．８　０．８　０．９−外観　標準に従う−−−−−−− −−−無変化−一−−−ｍ−−−−（再構成溶液） −ｐＨ６，０６，３６，３６，３（再構成溶液）Ａ＝正しい分子量位置に濃いバンドｎ、ｄ、＝未測定実施例２（ｂ）の組成物一外観　標準に従う一一−−−−無変化−−−−−−−３ＤＳＰＡＧＥ　Ａ　Ａ　Ａ −ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイ一バイオアッセイ　範囲内　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ。

−水分％　０．８　１．０　１．２ −外観　標準に従う一一一一一一無変化−−−−−（再構成溶液） −ｐＨ６，１６，４６，３（再構成溶液）Ａ＝正しい分子量位置に濃いバンドｎ、ｄ、＝未測定実施例２（ｂ）の組成物一外観　標準に従う一〜−−−−−−−−−−−−−無変化−−−−−−−−一一−−−−−−５ＤＳＰＡＧＥ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ−パイオアッセイ　範囲内　ｎ、ｄ、　範囲内　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ。

−水分％　０．８　０．８　０．９　１．０　１．１−１５溶よ、標準４２従５ −−−−−−−−−−−−−−一無変化一一一−−−−−−−−−−−一−−ｐ）１　６．１　６．３　６．２　６．１　６．３（再構成溶液）Ａ；正しい分子量位置に濃いバンドｊｌ、ｄ、＝未測定実施例２（ｂ）の組成物一外観　標準に従う一−−−−−−−−−−−−〜−−無変化一−−−〜−−− −−−−−−−−−５ＤＳＰＡＧＥ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ−バイオアッセイ　範囲内　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、範囲内　ｎ、ｄ、、　ｎ、ｄ。

−水分％　０．８　１．０　１．０　０．９　１．２　１．５−外観　標準に従う一一−−−−−−−−−−−−−−無変化一−−−−−−−一一−−−−−− （再構成溶液） −ｐＨ６，１６，３６，３６，３６，３６，１（再構成溶液）Ａ＝正しい分子量位置に濃いバンドｎ、ｄ、士未測定実施例２（ｃ）の組成物同様の安定性が実施例２（ｄ）及び２（ｅ）の組成物においても認められた。

配列表（１）配列番号：１（１）配列の特徴（Ａ）長さ＝１５５アミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｃ）鎖の数ニー零値（Ｄ）トポロジー二直鎚状（ｉｉ）分子の種類：タンパク質（×ｉ）配列：配列番号＝１！若繊維芽細胞成長因子（Ｆ　Ｇ　Ｆ　）の安定な凍結乾燥製剤は、ＦＧＦと、医薬的に容認可能な増量剤と、（ａ）カルボキシアルキルセルロースのアルカリ金属塩、または（ｂ）ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及びシスティンのいずれかとを含む。

国際調査報告１ｍ−１−一１−Ａｗ＆ＩＮ＠１ｌＦＴ／Ｃロ０１７Ｉ’ｌｌｌ’ｌ１１国際調査報告ＳＡ　４９１５３

Claims

【特許請求の範囲】

１．線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と、医薬的に容認可能な増量剤と、（ａ）カルボキシアルキルセルロースのアルカリ金属塩、または（ｂ）ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及びシステインのいずれかとを含む凍結乾燥組成物。
２．更に、抗酸化剤を含む請求項１に記載の組成物。
３．前記抗酸化剤がジチオトレイトールである請求項２に記載の組成物。
４．前記増量剤が、マンニトール、ラクトース、ポリビニルビロリドン、ガラクチトールまたはトレハロースである請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
５．前記カルボキシアルキルセルロースのアルカリ金属塩が、ナトリウムカルボキシメチルセルロースである請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
６．前記ポリオキシエチレン脂肪酸エステルがポリソルベート８０である請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
７．無菌ガラスバイアル内に密封されている請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
８．前記線維芽細胞成長因子が塩基性ＦＧＦである請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
９．前記線維芽細胞成長因子が、配列番号１に示された位置１０から位置１５５のアミノ酸配列で、位置７８及び９６にあるＣｙｓ残基がカルボキシメチル化されている配列を有する塩基性ＦＧＦである請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
１０．（ａ）請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物、及び（ｂ）前記組成物を再構成するための無菌溶液を含むキット。
１１．線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と、医薬的に容認可能な増量剤と、（ａ）カルボキシアルキルセルロースのアルカリ金属塩、または（ｂ）ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及びシステインのいずれかとを水溶液中で混合し、前記水溶液を凍結乾燥することからなる、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）を含む凍結乾燥組成物を製造する方法。
１２．請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物を、無菌水性希釈剤を用いて再構成することからなる、ＦＧＦ水溶液を製造する方法。