JPH05509257A - バイオポリマー合成のための方法と装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 バイオポリマー合成のための方法と装置本出願は１９９０年５月１５日に出願さ れた米国特許出願第５２３，７９１号の“混合樹脂を用いるペプチド混合物の制 御合成“に対する継続比ｉ１”ｒある；この出願をここに参考として編入する。

１、主班■肢止公立 本発明はバイオポリマー、例えばポリペプチドおよびポリヌクレオチドの合成の ための方法と装置に関するものである。

２．１考文献 ビドリングマイヤー・ビイ・エイら、イン・リビエル・ジェイら（著）ペプチド 二ケミストリイ、ストラフチャー・アンド・バイオロジイ　（第１１回アメリカ ン・ペプチド・シンポジウムの会報）　、ＥＳＣＯＭ、ライデン、１９９０．１ ００３頁。

ツイルラ・ニス・イーら、プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデ ミイ・オプ・サイエンシーズＵＳＡ、　８７　：　６３７８（１９９０）。

ゲイセン・エイチ・エムら、プロシーディンゲス・オブ・ザ・ホウテン・アール ・エイ、プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイ エンシーズＵＳＡ、　８２　：　５１３５（１９８５）。

カイザー・イーら、アナリティカル・バイオケミストリイ、３４　：　５９５（ １９７０）　。

パームリイ・ニス・エフら、ジーン、７３　：　３０５（１９８８）。

ンヨルンヘルグ・ジーら、テトラヘドロン、４５　：　７７５９（１９８９）。

スコツト・ジェイ・ケイら、サイエンス、２４９　：　３８６（１９９０）。

チョエング・エフ・ニスら、Ｉｎｔ　Ｊ　Ｐｅｐｔ　Ｐｒｏｔ　Ｒｅｓ、　３５ 　：　１４１（１９９０）。チョエング・エフ・ニス著。

３・光里皇宵１ 限定されたシーケンスのバイオポリマー、例えばポリペプチドおよびポリヌクレ オチドは固相方法によって決まりきった手順で合成され、ポリマーサブユニット は固体支持体に固定化された成長するポリマー鎖に段階的に付加される。一般的 な合成法は自動化または半自動化した仕方で限定されたシーケンスのバイオポリ マーを構築することができる市販品として入手できる合成装置を用いて行うこと ができる。しかしながら、これまでは市販品として入手できる合成装置は単一操 作で合成することができるポリマーの全量によって制限されていた。

次第に、異なるシーケンスのバイオポリマーを含有するバイオポリマー混合物を 合成することに関心が寄せられてきている。例えば、ペプチドにおける構造・機 能の関係を試験する際に、−ケ所またはそれ以上のポリペプチド残基の位置で、 異なるアミノ酸置換基を有するペプチドの混合物を生成することは、多くの場合 興味あることである。別の例として、所望の活性、例えば所定の受容体または抗 体に対する高い結合親和力を有するポリペプチドは、（ａ）多数のランダムシー ケンスのペプチドを生成し、（ｂ）　これらのペプチドをスクリーニングして所 望の結合親和力を有する１個またはそれ以上のペプチドを同定することによって 、同定することができる。好ましくは、混合物中のポリペプチドは、多数のシー ケンスからいずれか１つのシーケンスを検出する可能性を最大にするように実質 的に等モルで存在し、そのモル量では華−のシーケンスの検出が可能である。

異なるシーケンスのペプチドの混合物を合成するための方法が提案されているが （例えば、ホウトン、ゲイセン）、このような方法は、単一の操作で合成できる 異なるシーケンスのポリペプチドの数と量の両方で制限され、また実施するには 比較的費用がかかる。これらの制限は、構造・機能の研究のため、またはポリペ プチド選択方法のために、異なるシーケンスのペプチドを入手する可能性を制限 してきた。

４、発明の概要 本発明のひとつの一般的な目的は、固相粒子に固定化された末端サブユニットに サブユニットを付加して生成されるポリペプチドおよびポリヌクレオチドのよう なバイオポリマーの有効な合成のための方法および装置を提供することである。

本発明の他の目的は、異なるシーケンスのバイオポリマーの混合物を合成する際 に使用するための方法および装置を提供することである。

ひとつの局面において、本発明の装置は面相粒子に固定化されたポリマーサブユ ニットに対してサブユニットを付加する反応を行う複数の反応容器を含む。この 容器は、操作できるバルブ構造によって真空および圧縮気体の供給源に連結され ている底部粒子フィルターを有し、閉鎖状態では、容器を供給源から孤立させ、 開放状態では、粒子と懸濁液を混合するため容器に気体をバブリングするため、 気体供給源と容器を連結し、または！ｌ！ｉｆ５液を容器から除去するため、真 空源と容器を連結する。装置中のコントロールユニットは、容器に連続して添加 される一連のサブユニット付力旧容器を混合し除去するため選択された状態でバ ルブ構造物を配置するように操作する。

反応容器は好ましくは複数のセントの容器に配列され、これらのセットは任意の 選択された数の反応容器についてバルブ制御を可能にする配置でバルブ調節され る。

装置はさらにサブユニットの付加に使用される溶液試薬を保持するための試薬容 器、および試薬容器から各移送容器に溶液を移送するために操作できる移送デバ イスを含むことができる。この装置中の制御ユニットは、反応容器中の固相粒子 の懸濁液を用いて操作でき： （ｉ）　反応容器と真空供給源を連結し、固相粒子を懸濁する液体を除去するよ うにバルブ構造物を作動し、（ｉｉ）　選択された試薬容器から各反応容器に溶 液試薬を移送するように移送デバイスを作動し、 （ｉｉｉ）各反応容器と圧縮気体供給源を連結し、各容器に添加された反応溶液 と固相粒子を混合するための各容器中にバブリングするようにバルブ構造物を作 動し、そして（ｉｖ）　粒子上に固定化されるサブユニットに対してサブユニッ トを付加するために必要な各試薬溶液が容器に添加されるまで、（ｉ）〜（ｉｉ ｉ）の工程を繰り返す。

さらに装置は１個またはそれ以上の混合容器を含むことができ、この容器に移送 デバイスによって、混合粒子懸濁液を生成するため、反応容器からの粒子懸濁液 を移送することができる。混合後、懸濁液を、移送デバイスによって、選択され た反応容器に分配することができる。

別の局面において、本発明はバイオポリマー合成のための自動化した混合粒子方 法に使用するための装置を含む。この装置は、好ましくは上記のように構成され た複数の反応容器、試薬容器、混合容器、および各反応容器に混合容器中の選択 された容量の粒子懸濁液を分配するため、各反応容器から混合容器に粒子懸濁液 を移送するため、および試薬容器から反応容器に選択された試薬溶液を移送する ための移送デバイスを含む。移送デバイスは、連続した混合粒子サブユニットの カップリング反応を行うため、そして粒子懸濁液を混合し再分配するため、制御 ユニットによって操作される。

装置は異なるシーケンスのバイオポリマーの混合物の自動化合成方法のために設 計される。この方法を行う際に、装置は複数の各反応容器に対して、粒子を結合 したバイオポリマー末端サブユニ、トを用いて誘導された固相粒子の懸濁液から 成る粒子懸濁液を分配するように操作する。次に選択されたサブユニットを、上 記のようにカップリング試薬溶液にａＬ続添加し、反応させ、この溶液を除去す ることによって、各反応容器中の粒子結合末端サブユニットに結合させる。各反 応容器中の粒子の懸濁液は反応容器から引き出し、混合容器に移送し、混合粒子 懸濁液を形成するように混合し、再分配して反応容器を分離する。所望の長さの 異なるシーケンスのバイオポリマーが合成されるまで、このサイクルは繰り返さ れる。

好適例では、粒子はポリスチレン粒子であり、懸濁溶液は実質的に等容量でＤＭ Ｆ／塩化メチレンを含む。

さらに一般的に、本発明は選択されたサブユニット位置にて異なる選択されたサ ブユニットを存するバイオポリマーの混合物を合成する方法を提供する。この方 法を実施する際に、異なる末端粒子結合ハイオポリマーサブユニットを用いて誘 導された固相粒子の混合物から成る粒子懸濁液が生成される。この懸濁液は複数 の別々の反応容器に分配され、異なる選択されたサブユニットは各容器中の粒子 結合末端サブユニットに結合される。サブユニ。

トを付加した後、各容器からの粒子の懸濁液を混合し、再分配して反応容器を分 離する。このサイクルは、所望の長さの異なるシーケンスのバイオポリマーが生 成されるまで繰り返される。

この方法は、ポリペプチド合成に応用するとき、既知のソーケンスのポリペプチ ドの所定の活性の選択された残基の位置でアミノ酸置換の効果を決定するため、 そして受容体に対して選択された結合活性を有するポリペプチドを生成するため にを用である。

この方法は、ポリヌクレオチド合成に応用するとき、ランダムコーディングシー ケンスを用いてポリヌクレオチドを合成するために有用である。ランダムシーケ ンスは受容体等に対して選択された結合活性を有するポリペプチドの発現のため に、または新規のペプチド治療および診断薬の製造のために選択することができ る。

本発明のこれら、および他の目的および特徴は、次の本発明の詳細な説明を図面 と共に読むときに一層明らかになるだろう。

区血二旦連左裁泗− 図１は本発明の１実施例に従って構成された複数容器のバイオポリマー合成装置 の線図であり； 図２はソレノイドバルブと２個の反応容器との間のバルブとチューブ連結を示す 図１の装置の断片部分の断面図であり；図３八と３Ｂは混合工程（３Ａ）および 液体除去工程（３Ｂ）の間の図１の装置の反応容器を示す図であり；図４は本発 明の他の実施例に従って構成された複数容器のバイオポリマー合成の平面線図で あり； 図５は図４に示される装置において、アミノ酸すブユニット付加のため、プログ ラムされた操作で制御ユニットによって実施される工程の流れ図であり； 図６は本発明の装置の他の実施例に従って構成された複数容器のバイオポリマー 合成装置の線図であり；図７は本発明の装置において、ＭＷまでの異なるソーケ ンスを有するポリペプチド′の合成に対してプログラムされた操作でのコントロ ールユニットによって実施される工程の流れ図であり；図８Ａ〜８Ｇは本発明の ひとつの局面に従って形成された単一シーケンスのポリペプチドのＨＰＬＣクロ マトグラフであり；図９は、本発明の方法に従って、異なるシーケンスのバイオ ポリマーの合成のための本発明方法を示し；図１０は、本発明の方法に従って調 製されたペプチド混合物のアミノｆ！Ｉ組成物を示すグラフであり；図１１Ａお よびＪＩＢはプール中の一定のアミノ酸のパーセント量を示すグラフであり；そ して 図１２は選択された結合活性をもつポリペプチドを符号化するポリヌクレオチド の合成と選択の工程を示す図である。

主所皇詳亙屋脱凱 ■、　ヒバイオボリマ−Ａ　−１ 図１は本発明の１実施例に従って構成されたバイオポリマー合成装置１０の概略 図である。装置は、容器１２ａ−１２ｆのような複数の反応容器を含み、それぞ れはバルブ１８ａ〜１８ｄのようなバルブを介して、真空マニホルド１４および 圧縮気体マニホルド１６に連結されている。装置は、それぞれ図に示されるよう に、真空および気体供給源と真空および気体マニホルドの連結によって、圧縮気 体、好ましくはアルゴンのような不活性気体の供給ｆｉ２２と真空供給源２０を 用いて設計される。各バルブは、バルブに連結された容器を真空および気体の供 給源から孤立させる閉鎖位置、および容器をひとつの開放位置で真空マニホルド と、他の開放位置で気体マニホルドと連絡させる開放位置との間に操作できる。

図に示した配置では、容器はセット２４．２６．２８のような５セツトの容器に 分けられる。これらのセットのうち４つは、５個の容器の各々をチューブ３０． ３２のようなチューブによってマニホルド３４のようなバルブマニホルドに連結 し、次にマニホルドはバルブ１８ａのようなバルブに連結される。このようにし て、セント中の各容器は単一のバルブによって真空および気体マニホルドと統合 して連結される。５番目のセントでは、４個の容器はチューブ３６のようなチュ ーブによって、容器１２ｄに連結されたバルブ１８ｄのような各バルブに連結さ れる。これらの各バルブおよびこのセントの５番目の容器は、バルブ１８ｃに連 結されたバルブマニホルド３８に連結され、このバルブは従ってこのセットの容 器に対してマスターバルブとして働く。

前記のバルブの配置は、比較的少数のバルブによって、装置中の任意の選択され た数の容器に関してバルブコントロールを生しさせることは高く評価されるだろ う。従って、例えば、閉鎖位置に配置される他のバルブのすべてと共に、単一の 容器１２ｆをバルブ１８Ｃの各コントロール下に置くことができる。同様に、５ 個までの任意の数の容器をバルブ１８ｃ、およびバルブ１２ｅのような各コント ロールバルブの１個のコントロール下に置くことができる。

（５個の容器は他の容器セントの１組で単一のバルブによってコントロールする ことができるので、このように個々にコントロールされた容器を４個だけ必要と する。さらに、これら４個のうち２個は単一のバルブのコントロール下に置くこ とができ、やはり１〜４個の容器をコントロールすることができる）。５個また はそれ以上の容器に対して、１組またはそれ以上の５個の容器のセントを用い、 任意の各容器は５番目のセットに用いる。

図２は、反応容器１２ａおよび１２ｂ、およびそれらのバルブ１８ａへの連結を 示す装！の断面図である。装置中のバルブおよび容器は、バルブおよび容器の取 付けのため、開口部４２ａ、４２ｂ、４２Ｃのようなねし込み開口部の配列をも つ台４０に置かれる。代表として容器１２ａは開口部４２ａの上側にねじ込みで 収容されるＬｕｅｒ−Ｌｏｋ（登録商標）タイプの隔壁取付部品４４に取外しで きるように設けられる。チューブ取付部品４６ば図に示すように開口部の下側に 収容される。容器１２ａをバルブ１８ａに連結するチューブ３０は、２個の取付 部品を介して収容され緊密にそこに保持される０例示的なテフロンＬｕｅｒ−Ｌ ｏｋ　（登録商標）取付部品、および１７１６インチテフロン（登録商標）連結 チューブを使用するための例示的なテフロンチューブ取付部品がコール−パーマ −（シカゴ、ＩＬ）から入手できる。

代表として連結チューブ３０は、装置を操作している間に容器１２ａに添加され る液体の高さを越えて伸びている上部ループ部４８をもつ。この高さは容器１２ ａのマーク５０によって示される。チューブ上部は、バルブが容器を真空マニホ ルドに連結する場合を除いて、容器中の液体がバルブに排出しないようにトラ、 プとして作用する。またトラップは反応容器間の交差汚染を妨げる。

代表として容器１２ａは、従来通り、取付部品４４に取外しできるように密閉し て取り付けるように設計されたベース５２を存する。

容器の底部に位置するフィルター５４は下記のバイオポリマー合成反応に使用さ れる固相粒子を濾過するために有効である。代表的には、約３０〜１５０　ミク ロンの直径をもつ樹脂またはガラスピーズである。容器の容量は所望の反応容量 に従って選択することができ、例えば１０〜５０ｍ　ｌである。容器の】例とし て、コンテス（バインランド、ＮＪ）から市販品として入手できる２０ミクロン の孔径のポリエチレンフィルターをもつ１８ｍ１のガラスチューブがある。反応 チューブは泡を生成しないで乱流混合するために側壁湾曲部Ｃ図には示していな い）で形成することができる。

バルブ１８ａは、図に示したように、バルブ内にねじ込み開口部５８を掛合する アダプタ５６によって台４０に取付け、それ自身はマニホルド３４（［ｆｆ１ｌ ）を収容するねじ込みソケット６０を与える。マニホルドは、チャンネル５９の ような５個のチューブチャンネルを与える５〜１個のコネクタであり、チューブ ３０のような連結チューブの端部を、マニホルドをアダプタに固定される際に、 うまく収容させる。チューブチャンネルは好ましくは互いにマニホルドの中心か ら等距離で配列される。例示的なアダプタはコール−パーマ−から入手できる１ ／４インチＮＰＴ雌バイブアダプタである。

マニホルドの下端はチューブ６２によってバルブの内側に連結される。

代表としてバルブ１８ａは、上記のように閉鎖および開放の位！または条件の間 にデジタル入力信号によってコントロールできるソレノイドバルブである。閉鎖 位置でのバルブは気体および真空マニホルドからバルブマニホルドを孤立させ、 一方および他方の開口位置において、バルブマニホルドを真空マニホルドまたは 気体マニホルドと連絡する。バルブは、図に示したように、それぞれ真空マニホ ルドと気体マニホルドにチューブを連結するための取付部品６４．６６を収容す る。バルブ１８ａのようなバルブ、マニホルド３４のようなバルブマニホルド、 およびバルブマニホルドを容器に連結するチューブ３０のようなチューブもまた 、真空および気体マニホルドと容器を選択的に連結するためのバルブ手段と呼ば れる。

装置の操作は図３Ａおよび３Ｂに示される。まず、装置内のコントロールユニッ トをセントして、選択された数の反応サイクルの間に、各サイクルにおいて特定 の反応時間で選択された数の反応容器を作動させる。これらの設定は連続反応混 合および液体の除去、バルブ作動のシーケンス、および連続バルブ作動間の時間 に対し、どの容器を活動状態に配置するかを決定する。代表的なバイオポリマー の合成操作において、末端保護サブユニットを用いて誘導される固相粒子を反応 容器の選択されたグループに添加する。この合成操作において、下記の一連の異 なる試薬溶液を各選択された容器に連続して添加すると共に、各溶液は容器中で 選択された反応時間で、固相反応粒子と混合し、次に、次の溶液を添加する前に 、濾過によって容器から除去される。

代表として反応容器７０について図３に示された混合工程において、上記のよう に、選択された容器を気体供給源と連結する。容器フィルターを通過する気体流 入は、図に示したように、試薬溶液７４中に撹拌懸濁された状態で、７２で示し たように、固相粒子を保持する制御されたバブリング作用を生しる。予しめ設定 した混合時間ののち、容器と真空供給源を連結する位置までコントロールバルブ のスイッチを切り換えて、図３Ｂに示したように、懸濁液を容器から濾過させる 。濾過後、新しい試薬溶液を選択された容器に添加し、混合および液体除去の工 程を繰り返す。

ここで、コントロールバルブが閉鎖位置にある場合、容器中の液体について、容 器をバルブに連結するチューブの上部トラップ部は液体がバルブに排出すること を防げることは注目される。また、コントロールユニットが操作中に粒子含有容 器と気体および真空マニホルドとだけを連結するように操作することは注目され る。

図４は前記のものに似た装置７６の平面図であるが、バイオポリマー合成反応中 に選択された反応容器に連続して試薬溶液を添加するための自動化した移送装置 を設ける。この装置は容器７日のような反応容器を含み、セット８０のような５ 個の容器セットに形成され、上述のように、バルブ８２のようなバルブによって 制御され、それぞれ気体および真空のマニホルドを介して、それぞれ真空および 気体の供給源８４．８６と連結される。バルブは上記のように、マイクロプロセ ッサコントロールユニット８８によって制御される。

追加として装置は、バイオポリマー合成に使用される試薬溶液を保持するため容 器９０．９２．９４、および９６のような複数の試薬容器を含む。試薬容器は２ 種類あり、第１のタイプは、容器９０．９２によって示され、容器９１と連結し たバルブ９５のようなソレノイドバルブによって、加圧下に液体を分配するため に設計される。容器は、図に示したように、圧縮ライン９１を介して、供給ｆ１ ８６からの圧縮気体によって加圧される。代表としてバルブ９５は容器９１から 以下に記述される供給ユニット１１０まで延在するディスペンサーチューブ９６ に直列に連結される。またチューブはチューブを介して液体流速を制御するため の直列ニードルバルブ（図には示していない）を含むことができる。分配操作に おいて、容器からディスペンサーチューブを介して所定容量の試薬溶液を分配す るため、バルブは一定の間隔で開放される。前記試薬容器は、以下に記述される 装置の操作において、種々の試薬溶液を反応容器に分配する際に使用される。

試薬容器の第２のタイプは、容器９４．９６によって示され、バイオポリマー合 成に使用される選択されたサブユニットの溶液を含む。例えば、装置をポリペプ チド合成のために使用する場合、これらの反応容器を使用して、合成に使用され る各アミノ酸を保持する。サブユニット？８液試薬容器を固定した位置で装置の 台に取付ける。装置をポリヌクレオチド合成のために使用する場合、反応容器を 使用して、ホスホルアミド化ヌクレオチドのような各活性化されたヌクレオチド モノマーを保持する。

またユニット８８のコントロール下に操作できるロボットデバイス１００を装置 に含ませて、溶液容器から選択されたグループの反応容器まで予じめ選択された 容量の溶液を移送する。このデバイスは、台の」二にステーション１０日のよう なピンクアップステーションでたくわえられるユニット１０４．１０６のような 多数の選択された送出ユニットのひとつを運ぶことができる伸縮アーム１０２を 有する。図４のアーム１０２に結合したユニット１１０は、上述の反応溶液容器 から、チューブ９８のようなチューブの末端を運ぶ差込部ユニットである。移送 デバイス中の他のユニットのひとつは自動化操作のために設計され、（ａ）取外 しできるピペットチップをピックアップして、（ｂ）１個の容器から選択された 容量の液体を引き出し、（ｃ）引き出した液体を他の容器に分配し、そして（ｄ ）ピペットチップを押出す。

ロボットアームを、軸１１１の周りを回転でき、アームを上下するためにこの軸 に沿って垂直方向に移動できるヘッド１０９に取付ける。アームの末端はステー ション１０８から選択された送出ユニットをピックアップして開放するために設 計されている。

ロボットデバイスの好適なタイプはジマーク・コーホ（ホブキントン、ＭＡ）か ら市販されているジマート■プラスロボ、トである。この装置に使用される供給 ユニットは、適当な差込アセンブリをつかみ、チューブ９８のような反応容器チ ューブにこれを運ぶことができる２本のフィンガーを有するジマーク１一般目的 １のハンドである。装置に用いられる他のユニットはジマーク１〜４ｍ！ヒペノ トハンドおよびジマーク０．２〜１ｍｌビペ・ントハント′である。ロボットア ームと連結送出ユニットもまた、ここでは移送デバイス、または移送装置と呼ば れる。

装置中のコントロールユニットは、コントロールバルブを作動し、ユーザーが特 定化する設定に従ってロボットアームの操作を管理するようにプログラムされて いるマイクロプロセッサである。

マイクロプロセッサプログラムの設計、およびユーザーインターフェースの必要 性は、以下のように、バイオポリマー合成における装置の操作から明らかだろう 。

装置の操作は、サブユニット付加サイクルを共に構成する溶液サイクルの予じめ 定められたシーケンス、およびこの種のサブユニット付加サイクルの予じめ定め られた数を含み、各々は反応容器中の成長する粒子結合バイオポリマーに新しい サブユニット４付加する。まず、ユーザーはコントロールユニットを次のサブユ ニットサイクルのパラメーターを特定化するようにセットする＝（ａ）操作中に 使用される選択された反応容器、（ｂ）溶液サイクルのシーケンス（溶液容器の 位置の用語において特定化）　、（ｃ）サブユニ７）付加において反応容器に添 加される試薬溶液の容量、および（ｄ）各サイクルでの混合時間。各溶液サイク ルで使用されることになっている送出サブユニットは選択された溶液容器によっ て指図される。例えば図６に関連して記述した実施例での差込ユニットは、サブ ユニットおよびピペットユニットによって添加される活性化試薬溶液を除いて、 全部の溶液添加のために用いられる。また各反応容器のためのサブユニットシー ケンスも特定化される。

図５はポリペプチド合成においてアミノ酸サブユニット付加に使用するための完 全なサブユニット付加サイクルの工程の流れ図である。第１の溶液サイクル（Ｃ ｙ＝１）において、コントロールユニットは、連続するバルブ開放と閉鎖によっ て、指示された容器に懸／ＩＡ流体を排出するためバルブを作動するように、ま ず操作される。ロボットアームは、各指示された反応容器に対して引続きアーム を動かして、脱保護溶液を移送するように作動し、？８液送出のため分配を作動 する。待機位置までアームを戻した後、コントロールユニットは上記のように粒 子懸濁液を混合するため、反応容器と気体供給源を連結するように操作する。溶 液サイクルはバルブの閉鎖によって終わらせる。操作は各連続する試薬溶液サイ クルによって循環し、図に示したように、指示された反応容器中の粒子を洗浄溶 液（サイクル２）、選択されたアミノ酸の溶液プラス力、プリング試薬溶液（サ イクル３）、すすぎ溶液（サイクル４）、および粒子結合サブユニットの未反応 の脱保護サブユニットをキャソフ゛するためのキャッピング？容器（サイクル５ ）に浸漬する。

完全なひとつのサブユニット付加サイクルを完了した後、次のサブユニットを粒 子結合バイオポリマーに付加するため、装置は上記工程を繰り返す。所定の反応 容器中の各ポリマーに選択されたサブユニットを付加するこれらのサブユニット サイクルを、各容器中のバイオポリマー合成が完了するまで繰り返す。

図６は、以下のセクション■で述べるように、混合したシーケンスを有するバイ オポリマーの合成に使用するため、本発明の他の実施例に従って構成された装置 １１２の概略図である。この装置は、台１１８の固定した位置に取付けられ、バ ルブ１２２のようなバルブを介して、それぞれ気体および真空マニホルド１１７ ．１１９に連結された容器１１４．１１６のような複数の反応容器を含む。装置 は供給源をマニホルド１１７．１１９にそれぞれ連結して、気体および真空供給 ａｖ：１．１２３と共に使用するために設計される。バルブ付容器の構成の設計 と操作は上記の装置１０に関連して記載されたものと類似している。

サブユニット付加合成に必要な異なる試薬を保持するため、容器１２６．１２８ のような複数の試薬容器も装置に含まれる。選択された試薬容器は、図４を参照 して記載したように、反応容器に測定された液体分量を分配するため、ソレノイ ド駆動ディスペンサー（図には示していない）に連結される。さらに装置は、台 １１８の固定位置に取付けられる容器１３０のような１個またはそれ以上の混合 容器を含む。好ましくは各容器は全反応容器の一緒にした懸濁内容物を保持する ために十分な収容力の容量を有する。

代表として容器１３０は、底部フリットまたはフィルター１３２を有し、ここを 通って圧縮気体は容器中の粒子懸濁液を混合するため容器中に泡立って流入し、 容器を真空にすると容器から液体が除去される。このために、図に示したように 、容器を気体および真空マニホルド１１７．１１９にソレノイドバルブ１３３を 介して連結する。

また、ロボット移送デバイス１３４、または上述のように揺動可能な垂直に位置 できるベース上に取付けた伸長できるアーム１３６を有する手段を装置内に含ま せる。移送デバイスの末端は、アームに取付けた図に示されるユニット１４０お よび台上に備えられるユニット１４２のような種々の送出ユニットのひとつを用 いて操作するように設計される。この移送デバイスは、液体を溶液容器から指示 された反応容器まで移送するために使用される送出ユニ。

トを含み、上記のデバイス１００と似ている。

装置中のバルブおよびロボットデバイスはマイクロプロセッサ−コントロールユ ニット１４４の制御下にある。ユニットに使用されるソフトウェアの指令、およ びユーザーインターフェイスの要求は、図７の流れ図を参照して記載されるだろ う追加の操作と共に、装置１００に関連して記載されたものと似ている。

図７の操作はＲ個の残基の各々にＭ個までの異なるアミノ酸を有するポリペプチ ドの自動化合成のための装置の工程を示す。すなわち、最終のポリペプチド混合 物はＭ１１個までの異なるシーケンスのポリペプチドを含むことができる。始め に、Ｎ−保護アミノ酸を結合した粒子をＭ個の反応容器に添加する。好ましくは 各反応容器に添加された粒子はＭ個の異なるＮ−保護アミノ酸の等モル混合物を 含む、コントロールユニットは上記のように初期値にセットされ、追加として以 下のように所望の粒子混合サイクルをセットする。

１にセントしたサブユニット付加サイクルについて、コントロールユニットは、 図５に関連して上述したように、サブユニット付加サイクルにおいてバルブ、デ ィスペンサー、および移送デバイスの操作のシーケンス、すなわち溶液サイクル のシーケンスを指図する。各サブユニット付加サイクルについて、追加のサブユ ニットは末端粒子結合サブユニット、代表的には各反応容器のＭ個の異なるアミ ノ酸の１つに付加される。

第１のサブユニットの追加サイクルの終りで、コントロールユニットは、混合容 器に各反応容器中の粒子懸濁液を移送することになる一連の操作においてロボッ トデバイスに指図する。これらの操作はロボットデバイスに指図して、（ａ）　 ピペットユニットをロボットアームに取付け；（ｂ）新しいピペットチップをピ ックアップし、（ｃ）選択された反応容器に移動し、（ｄ）粒子懸濁液を前記反 応容器から引き出し、（ｅ）混合容器に移動し、（ｆ）引き出した懸濁液を混合 容器に分配し、そして（ｇ）粒子懸濁液の全部が引き出されるまで（ｃ）〜（ｆ ）の工程を繰り返す。これは次に、容器中に残りの粒子が懸濁するように混合し ながら、所定量の新しい懸、ａ液を各反応容器に添加し、続いて、全部の樹脂粒 子が反応容器から移送されるまで、反応容器から混合容器に１種またはそれ以上 の追加の懸濁液を移送することによって行われる。

コントロールユニットは懸濁液を除去するように混合容器バルブを作動し、ロボ ７）アームに新しい懸濁溶液を混合容器に添加するように指図し、新しく添加し た溶液中に粒子を混合するように混合バルブを作動する。混合容器中の液体のレ ベルは容器に取り付けた液体レベルセンサー（図には示していない）のコントロ ール下に正確な必要容量にする。

この混合工程の終りに、ロボットデバイスは一連の操作に向けられ、混合容器の 内容物を各反応容器に戻して分配することになる。ここでコントロールユニット はロボットデバイスに指図して、（ａ）　ピペットユニットをロボットアームに 取付け；（ｂ）新しいピペットチップをピックアップし、（ｃ）混合容器に移動 し、（ｄ）混合容器から粒子懸濁液の部分を引出し、（ｅ）選択された反応容器 に移動し、（ｆ）引出した懸濁液を反応容器に分配し、そして（ｇ）混合容器中 の粒子懸濁液が選択された反応容器の各々に分配されるまで（ｃ）〜（ｆ）の工 程を繰り返す。

装置はその元の状態まで戻り、各反応容器はＮ−保護粒子結合サブユニットの混 合物を含んでいる。全体のサイクルはＲ個の残基金部が付加されるまでＲ−１回 繰り返される。

装置に形成される異なるシーケンスのペプチドの最大数は、混合および反応の容 器において装置が収容できる樹脂粒子の数によって制限されるだろう。ポリペプ チド合成のために有用な代表的なポリスチレン樹脂は、粒径が約４０ミクロンで あり、１ｍｌの懸濁液はせいぜい約１０７個の粒子を収容できる。５０ｍ　ｌの 粒子懸濁液を用いると、約９００ｍｇのポリペプチドを合成することができる。

前記のことから、いかに本発明の装置が種々の目的および特徴に合致しているか が高く評価されるだろう。図１に関連して記述した複数の容器装置は２０種まで またはそれ以上の異なるバイオポリマーの大規模な同時合成、および各溶媒を添 加後の自動的に時間を合わせた混合および溶液の除去を可能にする。例えば、１ ８ｍ１の反応容器を用いると、装置中の容器１個につき約３００ｍｇまでのポリ ペプチドを合成することができる。

図４に関連して記載された装置は同じ利点があり、さらにバイオポリマー合成の ために完全に自動化された操作を与える。この装置のひとつの利点によれば、複 数の反応容器においてサブユニット力ノブリング工程中の粒子の混合は、全部の 容器において実質的に完全なサブユニットの付加を確保するように時間を合わせ ることができる。さらに、各ベアのアミノ酸に対して既知のカップリング率を基 礎に、コントロールユニットは各反応容器において完全なサブユニットの付加を 確保するために各反応工程に必要な最少のカップリング時間を与えるように操作 することができる。

図８Ａ〜８Ｇは図４に記載した装置によって生成した７個のグラミシジンＳペプ チド類似体のＨＰＬＣクロマトグラムである。

簡単に述べると、アルギニンを用いて誘導された樹脂（Ｒ−Ｍｔｓ）を７個の各 反応容器に添加し、連続するサブユニット付加を用いて；バリンを第１サイクル で；プロリンを第２サイクルで；ｄ−フェニルアラニンまたはｄ−アラニンを第 ３サイクルで；ロイシンまたはｄ−アラニンを第４サイクルで；ロイシンまたは フェニルアラニンを第５サイクルで；バリンを第６サイクルで；プロリンを第７ サイクルで、ｄ−フェニルアラニン、ｄ−アラニン、またはセリンを第８サイク ルで；そしてロイシンまたはアラニンを第９サイクルで、図に示したように付加 した。図から見られるように、実質的に純粋なポリペプチドが各容器に生成した 。７個のペプチドのアミノ酸分析はアミノ酸組成を確認した。

図６に関連して記載した装置は、上記の特徴のほかに、以下のセクションＨにお いて開示されるバイオポリマー合成方法に従って、異なるシーケンスを有する等 モル量の混合したシーケンスバイオポリマーの自動化合成のための操作を与える 。セクション■から認められるように、装置の操作は、Ｍ８個までの異なるシー ケンスを有する任意の組合せのシーケンスの合成のために、予じめ選択されたモ ル比において前もってセットすることができる。

本装置の操作はポリペプチド合成に関して示してきたが、固相粒子上に保持され る末端保護サブユニットにサブユニットを付加して構築されるポリヌクレオチド のような他のバイオポリマーの自動化合成のためにも用いられることは認められ るだろう。自動化した混合シーケンスポリヌクレオチドのための本装置の使用は 以下のセクションＨに記載されるだろう。

Ｈ６ヒｒＡＪ　バイオポリマー人　法 本発明の装置は、本発明の他の特徴に従って、異なるシーケンスのバイオポリマ ーを合成するために使用することができる。混合樹脂合成方法は、図６に示した 装置１１２を特に参照して記載され、本方法に必要な特徴は次の通りである：（ ａ）容器１３２のような混合容器、 （ｂ）容器１１６のような複数の反応容器、（ｃ）容器１２６．１２８のような 試薬容器、（ｄ）混合容器中の選択された容量の粒子懸濁液を各反応容器に分配 するため、各反応容器から混合容器まで粒子懸濁液を移送するため、および試薬 容器から反応容器まで選択された試薬溶液を移送するための移送装置、 （ｅ）　選択された遊離のザブユニットを末端の粒子結合サブユニットに各反応 容器中でカンブリングするための装置、そし、て（ｆ）移送装置とカップリング 装置の操作をコントロールするためのコントロール装置。

本方法は、固相バイオポリマー合成に適しているポリスチレン球体のような固相 粒子を用いる。代表的な方法では、粒子のバッチは、従来の誘導方法に従って、 選択された末端保護バイオポリマーザブユニ、ト、例えばＮ−保護アミノ酸、ま たは５′−ＯＨ保護ヌクレオチドを用いて誘導される。図９に示した方法では、 固体球で示された樹脂粒子の５種のパノヂが、５種のＮ−保護アミノ酸ニゲリシ ン（Ｇ）、リジン（Ｋ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、およ びセリン（Ｓ）を用いて誘導される。粒子に誘導されるＮ−保護アミノ酸はまた 、ここでは末端Ｎ−保護サブユニットと呼ばれる。

バ・７チは等モル部分で、すなわち、粒子上に誘導された末端サブユニットの等 モル量を含む部分で一緒にされる。図９の例では、これは等モル量の結合したＧ 、に、Ｅ、Ｆ、およびＳのＮ−保護サブユニットを存する粒子の混合物を生成す る。混合粒子は適当な１！！濁液に懸濁され、図９において四角形に結合した“ Ｍ“によって示される粒子−懸濁液混合物を生成する。好ましくは、上記のよう に、容器の底から不活性気体を導入して、粒子を懸濁させる。

上記のように、ポリペプチド合成ポリスチレン粒子のために好ましい懸濁液はＤ ＭＦと塩化メチレンの１：１の混合物である。

この液は、ポリスチレン球と実質的に等密度であり、粒子の沈澱に対して安定な 粒子懸濁液を形成する、すなわち、懸濁液は安定な実質的に均一な粒子密度を有 する。

粒子−懸ｆｉ／＆混合物は好ましくは等容量で、装置中の選択された数の反応容 器の各々に分配される。懸濁液の均一な粒子密度のため、これは実質的に等モル 量で粒子結合末端サブユニットを各容器に添加することになる。

代表的には、ネックスト・イン・シーケンス残基位置に付加されることになって いる各々の異なるサブユニットに対して、粒子混合物は分離した反応容器に分配 された。図９の例では、５種の選択されたアミノ酸を混合粒子の末端サブユニッ トに結合することが望まれる；従って混合物は５種の反応容器に等しく分配され る０粒子懸濁液の最初の分配は、セクションＩで述べたように、混合容器から手 動または自動化移送することができる。

本方法の次の工程では、装置を操作して、選択された各反応容器中の混合粒子上 の末端サブユニットに選択されたサブユニットを結合する。アミノ酸のカップリ ングでは、装置は上記のように操作して、連結して粒子を（ａ）脱保護溶液、（ ｂ）洗浄溶液、（ｃ）選択されたアミノ酸プラスカップリング剤、および（ｄ） キャッピング試薬と反応させる。

これらの試薬は連続して移送手段によって各反応容器に送られ、続けてバルブ作 動によって、上述のように、バブリングおよび液体除去のために反応容器に送ら れる。ポリヌクレオチド力、プリングに適している試薬はセクション■に与えら れる。

図９の例では、混合粒子は同じ５種のアミノ酸（、に、Ｅ＝　Ｆ、およびＳの１ 種と反応する。各アミノ酸は５種の各末端粒子結合サブユニットにカップリング するので、各反応容器は５種のジペプチドを含む。

上記のように、サブユニットカップリング反応は好ましくは完了するまでサブユ ニットの付加反応を最も遅くするために十分な時間で行われる。これにより、反 応によって生成したダイマーは粒子上に実質的に等モル量で表すことができる。

第１のサブユニット付加サイクルの完了に続いて、各反応容器中の粒子は適当な 懸濁液媒体に再懸濁し、移送手段によって共通の混合容器に粒子を混合するため に移送される。図９の例において生成した混合物は四角形に結合した“ＭＭ”で 示され、５２個のジペプチドの１個を用いて誘導された粒子を含む。混合物は移 送手段によって選択された数の反応容器に再分配され、次に新しく選択されたサ ブユニ、トを、上記のように、末端粒子結合サブユニットにカップリングする。

図９の例において、同じ５個のアミノ酸は粒子結合ジペプチドに結合され、２５ 種の異なるシーケンスのトリペプチドを各反応容器に生成する。各反応容器中の 粒子は再び、懸濁し、共通の混合容器に移送され、混合され、好ましくは実質的 に等モル量で、５３種の異なるトリペプチドを用いて誘導された粒子混合物を生 成する。

分配、カンプリング、および混合の工程は、サブユニットの所望の数のバイオポ リマーを粒子上に形成するまで繰り返される。

その後に、粒子結合サブユニットは脱保護されるか他の処理を行い、従来の方法 に従って粒子から脱離することができる。

前記の図９に関連した方法は、Ｍ６種までの異なるシーケンスの自動化合成の方 法を示しており、Ｍ個までの異なる残基は各カップリングサイクルで混合樹脂に 結合し、このカップリングサイクルはＲ−１回繰り返される。自動化方法は、適 当なコントロールユニットの指令によって、手順を変えて合成を行うように変化 させることができる。例えば、若干のカップリングサイクルでは、同しアミノ酸 を全部の反応容器に添加して、変化しない残基部位を生成することができる。さ らに、各残基部位にて変化の可能性−〇 の度合を違うようにしたい場合には、使用される反応容器の数をサイクルからサ イクルまで変えることができる。例えば、１サイクルで、５種だけのアミノ酸の 変化を所望し、他のサイクルでは２０全部の変化を所望することができる。

ｍ−／ｇ人鳥　バイオポリマー人　法 このセクションでは、混合粒子バイオポリマー合成方法のさらに一般的な特徴、 およびポリペプチドおよびポリヌクレオチド生合成への本方法の応用を述べる。

本方法は基本的な工程：異なる末端粒子結合パイオポリマーサブユニットを用い て誘導された固相粒子の懸濁液から成る粒子−懸濁液混合物を生成し；混合物を 複数の分離した反応容器に分配し；異なる選択されたサブユニットを各反応容器 中の粒子結合末端サブユニットにカップリングし；そして複数の反応容器からの 懸濁液を混合して新しい粒子懸濁液混合物を形成する工程から成る。分配、カッ プリング、および混合の工程は、サブユニットの変化が望まれる各バイオポリマ ー残基部位で繰り返される。

好適例において、はぼ等モル量の異なるシーケンスのバイオポリマーが、各サブ ユニット付加工程で生成する。これは、（ａ）はぼ等モル量の粒子結合バイオポ リマー鎖を各反応器に添加し、そして（ｂ）サブユニット付加反応が実質的に各 反応容器中で完了するまで行うことによって達成される。上記のように、これら の条件の第１は、実質的に等しい容量の均一な粒子密度の懸濁液を各反応容器に 添加させることによって満たすことができる。

第２の条件は、遊離のサブユニットを過剰に添加して、最も遅いサブユニフｌ− の添加反応でサブユニットの添加を完了させる反応時間（および温度）を用いて 満たすことができる。従って、例えば、ポリペプチドを合成する際に、異なるア ミノ酸サブユニソ１−を異なる各反応容器に添加する場合、および４００の可能 なアミノ酸対アミノ酸の各カップリングがそれ自身の特徴的なカップリング率を もつことが期待される場合、各容器は完了するまでに反応容器中に最も遅いサブ ユニット対サブユニットの組み合わせを可能にするに十分な時間反応させる。

また好適例において、合成される異なるシーケンスのバイオポリマーの各々の分 量は、異なるシーケンスのバイオポリマーの各々を選択された性質について分析 することを可能にするに十分な量である。ポリペプチドの場合には、この活性は 一般には選択された受容体の分子または抗体に関して測定された結合親和性であ る。選択できる他の活性は酵素阻害、酵素または補因子の活性、膜結合またはト ランスロケーション、核酸結合等を含む。ポリペプチド分析が溶液相バイオポリ マーに行われる場合、固相粒子から脱離後、さらに非粒子形態で分析および検索 するために十分な分量でなければならない。代表的には、下記のように、本方法 はそれぞれ異なるシーケンスのポリペプチドを少なくとも約１００　ピコモル生 成する条件下に行われる。

ポリヌクレオチドの場合、関係する活性は、ハイブリッド形成のため、プライマ ーとして、あるいは下記のような適当な発現系におけるコーディングシーケンス として、異なるシーケンスのポリヌクレオチドの使用を含む。後者の応用では、 それぞれ異なるシーケンスのポリヌクレオチドのモル量は、例えばピコモルの範 囲で極めて小さくすることができる。他の活性は、例えば、リボザイムおよびリ ポザイム様活性、プロティン結合活性等を含む。

Ｉ［ＩＡ、水ユ王ブ土上玉裁五迭 一般的応用のひとつには、既知のアミノ酸シーケンスをもつポリペプチド（また はプロティン）の構造−機能分析のために使用できる異なるシーケンスのポリペ プチドを生成するために本方法を用いる。関係するペプチドは抗原ペプチド、ブ ブチドホルモン、または抗生物質ペプチド、例えばグラミシジンまたはパリノマ イシンであってよい。代表的には、構造−機能研究において、１またはそれ以上 の選択された残基部位にて種々のアミノ酸置換基の１個の活性の効果を決定する ことが望ましい。通常、関係する残基の部位はアナログペプチドの族において半 分保護されているが保護されていないものである。

例えば、グラミシジンＳは一次構造をもつ開放鎖ペプチドである： １−　Ｖａ　ｌ　（ＮＨＣＨＯ）　−ｄ−Ｇ　Ｉｙ−１−Ａ　１ａ−ｄ−Ｌｅｕ −１−Ａｌａ−ｄ−Ｖａｌ　−１−Ｖａ　１−ｄ−Ｖａ　ｌ|１− Ｔｒｐ−ｄ−Ｌｅｕ−１−Ｔｒｐ−ｄ−Ｌｅｕ−１−Ｔｒｐ　（ＣＯＮＨ（ＣＨ ｚ）　ｚｏｏ）　。

構造−機能の研究では、２つのｄ−Ｖａ１部位にて全部の可能なアミン＃置換基 の効果を決定することは興味あることかも知れない。

所望のペプチドアナログを生成するため、従来法によって、粒子はＮ−末端ペン タペプチド１−Ｖａｌ−ｄ−Ｇｌｙ−１−Ｌｅｕ−ｄ−Ｖａｌｉ−Ａｌａを用い て誘導される。次に粒子は２０個の反応容器のそれぞれに等モルの分量で分配さ れ、別々に２０個のｄ−アミノ酸に結合する。結合した後、粒子の懸濁液をプー ルして、次に別々の反応容器または単一の容器の中で、１−Ｖａｌサブユニット を用いて反応させ、６−残基部位で２０の異なるアミノ酸の組合せをもつヘプタ ペプチド、および７一部位残基でＶａｌを生成する。

上述からの粒子を混合し２０個の異なる反応容器のそれぞれに再分配し、２０の 異なるｄ−アミノ酸を粒子上の末端サブユニットに結合させる。得られたオクタ ペプチドは６−残基部位で２０の異なるアミノ酸の組合せ、７一部位残基で単一 のｖａｌ、および８一部位（Ｎ末端）残基で２０の異なるアミノ酸の組合せを有 し、従って、全部で４００種のシーケンスペプチドを構成する。ペプチドは最後 の７個の残基をペプチドにバッチ方式で結合する従来の合成方法によって仕上げ ることができる。

ペプチドを脱離し、および適当なＮ−またはＣ−末端を改変した後に、２０個の 各反応容器中のペプチドを、標準のアッセイを用いて、抗生物質および／または イオン輸送活性のために試験する。

試験した各ペプチドは共通の８一部位のｃｌ−Ｖａｔ置換基および、全部で２０ の６一部位のｄ−Ｖａｌ置換基をもつ。２０グループの活性を規則正しく並べた 後、６一部位でのみ異なり、選択された８一部位の１換基を有する新しいグルー プのペプチドを、上記のように、さらに構造−機能を研究するため、合成するこ とができる。

本方法は選択された残基部位で所望の置換基を含む多数のペプチドアナログを生 成するための迅速で規則正しい方法を提供することは高く評価されるだろう。

他の一般的な応用では、本合成方法を用いて、抗体のような既知の受容体に対し て所望の活性、代表的には結合活性をもつペプチドを選択するため：ランダム− シーケンスポリペプチドを生成する。この方法を用いて、各Ｒの残基部位にて２ ０の異なる酸（Ｌ−アミノ酸、Ｄ〜ルアミノまたはＤ−またはＬ−アミノ酸アナ ログが挙げられる）のそれぞれ可能な組合せを生成することができる。この方法 での固相粒子は好ましくは粒子の混合物から形成され、各々は２０の可能なし一 アミノ酸のひとつを等モル量で含む。

この混合物は、各粒子混合物に対して２０個のし一アミノ酸サブユニットのひと つを付加するため、２０個の各反応容器に分配される。

サブユニットを付加した後、第３のアミノ酸を付加するため、２０個の反応容器 に粒子を入れて再分配する。この方法は所望のＲ−残基ポリペプチドの合成のた めにＲ−１回繰り返される。

ペプチドは、このペプチドがジペプチドである場合は４００の員数を含み；テト ラペプチドである場合は８，０００の員数、トリペプチドの場合は１６０．００ ０の員数というように含む。選択および分析のための方法に委ねるために、混合 物は選択および分析のための要求を満たすように各々充分な員数を与えなければ ならない。代表的には、約１００ピコモルのペプチドがペプチドを選択し、その 一時構造を分析するために必要である。１００ピコモルの各ペプチドを生成する ために必要なプロティン混合物の全量は容易に計算でき、４００の二量体につい て２．２μｇ　、８，０００の三量体について０．４４ｍｇ、　１６０　Ｋの四 量体について８．８ｍｇ　、　３２０万の三量体について１７６ｍｇ　、および ６４００万の六量体について３．５ｇに、はぼ相当する。

従って、６個のアミノ酸のペプチドに対しても、約３．５ｇのみの全混合物を必 要とする。多くの免疫反応性ペプチド種は長さが５〜６個のアミノ酸であるから 、抗体のような選択された受容体と免疫反応する“ミメトープ゛を生成するため に本方法は適している。

この方法は、保護領域、すなわち固定アミノ酸をもつ部位が存在するとき、一層 大きいペプチドについても可能である。

例として、次のペプチド混合物の合成を記載する：各５０ナノモルの５個のアミ ノ酸樹脂、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｇｉｎ、Ｐｈｅ、およびＬｅｕを置換基に基づいて 秤量し、ＤＭＦ中の希薄スラリー（約１　ｇ　／４０ｍ１）　として混合し、１ 時間渦巻攪拌し、次に塩化メチレン（約１００ｍ１）で洗浄し、真空下に乾燥し た。次いで樹脂ミックスを５個の反応容器に等分に分配した。

粒子に結合したＦｍｏｃ−Ｎ＝保護アミノ酸をＤＭＦ中２０％のピペリジン（２ Ｘ３ｍｌ、それぞれ１０分間）を用いてインキュベーションによって脱保護し、 次に大量に洗浄した（３Ｘ３ｍｌのＤＭＦ、続いて３Ｘ３ｍｌのメタノール、お よび３Ｘ３ｍｌのＤＭＦ）。各反応容器に０．２５ミリモルの活性化アミノ酸を 添加した０合成を容易にするため、予備形成した３−ヒドロキシ−４−オキソ− ３“。

４−ジヒドロベンゾトリアジンエステル（ＯＤＨＢｔエステル）として添加した セゾンおよびスレオニンを除いては、予備形成したペンタフルオロフェニルエス テル（ＯＰｆｐエステル）として活性化アミノ酸を添加した。Ｏ，ｈｌのＤＭＦ 中に０．５　ＭのＨＯＢｔを各カップリング反応に添加した。反応は２時間行っ た。過剰のアミノ酸を吸引除去し、樹脂をＤＭＦ　（３Ｘ３ｍｌ）で洗浄し、続 いてメタノール（３Ｘ　３ｍ１）で洗浄した。各カンプリング反応の終了は定性 ニンヒドリン（トリケトヒドリン永和物）によって証明され、陰性の場合は９９ ％以上のカップリングを示す（カイセル）。

次に粒子を再び一緒にして、ＤＭＦで膨潤し、上記のように混合した。混合物を 必要とするサイクル２とサイクル４において、樹脂を再び分けて上記のように結 合した適当なアミノ酸を用いて処理した。部位３では、単一のアミノ酸のグリシ ンが必要であった。粒子を合わせてグリシンの単一反応で全粒子混合物に結合さ せた。最終のペプチド生成物または上述のペプチド混合物のアミノ酸分析の特性 化（ビルドリングマイヤー）はペプチドが図１０に示したアミノ酸組成を有する ことを示している。この図から、グリシンを除いたアミノ酸すべてが実質的に等 モルに存在し、実質的に等モルの混合物のポリペプチドの合成を示していること が認められる。予言ささたように、グリシンは他のアミノ酸よりも５倍多い分量 で存在する。チロシンは若干少ないが、加水分解の間にチロシンが酸化されたた めであるらしい。

第２セツトのペプチド混合物を同様に合成した。この場合に、ｃｒｙ、Ｌｙｓ、 Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、および３ｅｒのアミノ酸主成分を用いる豆量体のすべての可能 な組み合わせを合成した。これらは、各々が１２５個の異なるペプチドを含む２ ５のプールで合成した０合成は各プールが同しアミノ末端のアミノ酸と、他の３ 残基ですべての５アミノ酸の等モルの混合物（例えば、ＧＧ−ｓｉｘ−ｍｉｘ− ＋＊ｉｘ　、、ＧＫ−ｍｉｘ−ＩＩｌｉｘ−ｓｉｘ、　ＳＦ−ｍｉｘ−ｍｉｘ− ｎ＋ｉｘ’　等）を含むように設計した。上記の方法体系を用いて合成を行った 。図１１ＡとＩＩＢは２５個のプールの２個に対してアミノ酸分析を行った結果 を示している。プールの期待される組成に基づく各アミノ酸に対する理論値は得 られた値の隣に示しである。プールの実際のアミノ酸組成は理論値に近いことが 認られ、さらに等モルのポリペプチド混合物の合成のために、この方法が有用で あることを示している。

また本方法は他のアミノ酸残基に応用することが可能であり、あるいは適当なサ ブユニット、例えばヒドロキシプロリン、ｎ−アミノイソ酪酸、サルコシン、シ トルリン、システィン酸、１−ブチルグＪＪシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニ ルグリシン、シクロヘキシルアラニン、８−アラニン、４−アミノ酪酸等、なら びにアミノ酸のＤ型に適していることは高く評価されるだろう。さらにサブユニ ット付加サイクルで生じたプールの数を変えることができる。従って、２０個の プールを第１の工程の反応に対して生成するが、粒子混合物を第２のサブユニッ ト付加に対して５フラクシヨンだけに分けて、部位２で２０種のアミノ酸変化お よび部位３で５種のアミノ酸変化を与えることができる。２０以上の異なる単量 体、例えばＬ−およびＤ−アミノ酸を収容する必要がある場合、装置は２０個以 上の反応容器を与えることができることが理解されるだろう。

さらに、全長のペプチドの単離は、ｔＢｏｃ−ビオチンのような選択されたグル ープを用いてブロックされる最終のアミノアシル残基を用いることによって促進 され、アビジンまたはストレプトアビジン固体支持体上のアフィニティクロマト グラフィーによってポリペプチドを単離することができる。最終部位におけるこ の種の親和性グループの使用は完全なシーケンスペプチドの単離を保証する。

本発明の方法は異なるシーケンスペプチドの複合混合物に帰する。この混合物か ら、所望の活性を有する１種またはそれ以上のペプチドが選択される。代表的に は、所望の活性は受容体、例えば免疫グロブリン、グリコリピド、受容体プロテ ィン、または酵素に対する所定の結合親和性である。ペプチドは受容体を固定支 持体に結合するアフィニティクロマトグラフィーによって、従来通りに所望の結 合活性に対して遮蔽することができる。ここで、ペプチド混合物はアフィニティ 支持体と接触させ、結合していないペプチドは洗浄によって除去される。結合し たペプチドは、次にペプチド−受容体の結合を切断するために有効な高い塩また は他の変質剤を用いて洗浄して、支持体から脱離される。

あるいは、プロテアーゼのような酵素のための基質であるペプチドを、開裂生成 物の大きさ、またはペプチドからのアフィニティラヘルの脱離等に基づいて混合 物中の非基質ペプチドから分離することができる。

所望の結合活性を用いてペプチドを、ｉ４ｉ離した後、さらに選択されたペプチ ドを、例えばＨＰＬＣによって精製することができる。

スクリーニングによって大きい副次集団が得られる場合、さらに一層厳格なスク リーニングが有用である。従って、例えば、所定の抗体または受容体に結合する ペプチドの混合物が５０位の員数を含むならば、塩濃度またはｐＨを調整し、全 部でしかも最も緊密に結合した員数を解離し、あるいは天然基質を使用して競合 結合させることができる。

分析の標準法を使用して、分子量、アミノ酸組成、およびアミノ酸シーケンスを 含む回収された特定の単数または複数のペプチドを同定するために情報を得るこ とができる。

本方法は診断試薬またはワクチンとして有用な抗原ポリペプチドの合成と選択の ために用いることができる。さらにペプチドは、選択された受容体に結合する能 力、またはスクリーニング方法において観察できる他の選択できる生理学的効果 を生成する能力に従って、ペプチドホルモン、ペプチド抗生物質またはペプチド と他の治療上の指度として、これらの活性に基づいて選択すること本発明の方法 はまた、異なるシーケンスのポリヌクレオチド、代表的には一本鎖ＤＮＡを合成 するために有用である。一般的な固相試薬、保護および脱保護戦法、およびカン プリング反応試薬は従来通りでよい。代表的には、例えば、制御された有孔ガラ ス粒子を単一の５′−〇Ｈ保護単一ポリヌクレオチドまたはトリヌクレオチドを 用いて誘導するだろう。各サブユニット付加サイクルにて、粒子は先ずジクロロ 酢酸と反応させて末端ヌクレオチドサブユニットを脱保護し、次いで洗浄して脱 保護試薬を除去し、粒子結合脱保護末端サブユニットの各サブユニットを実質的 に完全にカンプリングするのに有利である条件下に、遊離のホスホルアミダイｌ −活性５′−○Ｈ保護ヌクレオチドサブユニットと反応させる。

各カップリングにおいて用いられるサブユニットは、単一ヌクレオチド、または ２個またはそれ以上の限定されたシーケンスのオリゴヌクレオチドから形成され たサブユニットでよい。下記の好適例のひとつでは、サブユニットは、選択され たコドン、例えば２０個の天然し一アミノ酸のそれぞれに対するコドンに対応す るトリヌクレオチドである。この例では、各サブユニット付加サイクルはポリマ ーに３個のヌクレオチドのコドンを付加するために有効である。従って、例えば 、Ｒ−残基ペプチドのランダムソーケ、ンスに対してコードするポリヌクレオチ ドの混合物を調製するため、この合成方法はＲ−１回のサブユニット付加を必要 とし、２ＯＮのトリヌクレオチドコドンサブユニットのそれぞれは各サイクルで 粒子混合物に付加される。

一般的な応用のひとつでは、異なるシーケンスのオリゴヌクレオチドはＤＮＡの ボリメ゛ラーゼ鎖反応（ＰＣＢ＞増幅のための変性プライマーとして使用するた めに調製される。代表的な応用では、既知のアミノ酸シーケンスの領域をもつプ ロティンを入手することができ、このプロティンに対応する（符号化する）ゲノ ムまたはｃＤＮＡフラグメントを単離してクローンすることが望ましい。

ＰＣＲ方法は空間のある既知のシーケンスのプロティンＧＩ　域に対応する変性 プライマーが２七ノド必要である。各セットは本発明に従って、選択された既知 のシーケンス領域におけるＮ−末端アミノ酸に対して１〜６個の各コドンを用い て誘導された樹脂粒子を調製することによって、生成される。粒子を混合し、次 にネックスト−インアミノ酸の変性コドンの数によって、１〜６個の別々の反応 容器に分配し、次に各混合物を、各コドンのサブユニット付加が実質的に終了す る条件下に、この矛ツクストーインコドンの１〜６個のコドンと反応させる。こ れらの容器からの粒子は、−緒にすると、プロティンの選択された既知のシーケ ンス領域において最初の２個のＮ−末端アミノ酸に対して１〜１６の可能なコド ンシーケンスのすべてを含む。

この方法を繰り返して、所望の長さのプライマーセットが生成されるまで混合し て、各サブユニット（コドン）付加サイクルを用いて１〜６個の反応容器に粒子 混合物を再分配する。代表的には、有効なＰＣＲプライマーセットに対して少な くとも約１２〜２１個のヌクレオチド（３〜６サイクル）を必要とする。

異なるシーケンスのポリヌクレオチドを合成するための方法の第２の一般的な応 用を図１２に示す。この方法の目的は、選択された結合活性のような所望の活性 をもつペプチドを符号化するポリヌクレオチドシーケンスを生成し、単離し、ク ローンするためである。第１の工程として、本発明の方法は、所定の大きさ、例 えば５〜１０個のアミノ酸を有ずろペプチドのすべての（または少なくとも大多 数の）可能なコーディングシーケンスを符号化するポリヌクレオチドの混合物を 生成するために使用される。ポリヌクレオチド合成は図１２の上部に概略した一 般的なアプローチに続く。四角形で示された樹脂粒子は５′−シーケンスＣＴＣ Ｔ　ＣＡＣＴＣＣ（Ｓｓ・）を用いて従来通りに調製される。樹脂は２０個の各 反応容器に分配され、ここで２０個の可能なＬ−アミノ酸コドン、例えばアラニ ンに対するＧＣＡコドン、アルギニンに対するＡＧＡ　）リヌクレオチドコドン 等にクローニングが行われる。２０個の容器からの粒子を混合して２０個の容器 に再分配し、コドンの付加反応を繰り返す。混合と再分配のサイクルは全部でＮ 回繰り返され、上記のように、全体で２ＯＮの異なるシーケンスを生成する。

Ｎ回目の混合コドンサイクルの後に、樹脂は一緒にして、さらに異なるシーケン スポリマーの各々にシーケンスＧＧＣＧＧＣＡＣＴ。

ＧＴＴ、　ＧＡＡ、　ＡＧＴ、　ＴＧＴ−３’　（５°°で示した）を置くよう に処理する。

ポリマーは粒子から脱離し、適当な３′〜末端および５′−末端オリゴヌクレオ チドを用いてアニールし、既に述べたように（ツイルラ）ベクターｆｔ１ｓＥｓ ｉ製型フアージの５ｔｉ１部位に導入する。この構成はランダムシーケンスポリ ヌクレオチドをｆｄファージのｐＩＩＩ吸着プロティンのＮ末端に対してコーデ ィングする領域に置く。ファージは細菌性ホスト中で成長し、単離され、次いで パンニングとして知られているアフィニティ技法によって選択された受容体に活 性物を結合するためスクリーニングする（パームリイ・スコツト）。このように して、この方法で選択されたファージはスクリーニング受容体に対して結合親和 性をもつペプチドを符号化するコーディングシーケンスを有する。これらのファ ージは、さらに再スクリーニングして精製され、所望のコーディングシーケンス （図１２ではｘｘｘｘｘで示した）を得ることができる。このコーディングシー ケンスは所望のコーディングシーケンスを決定するために配列することができる 。

一旦コーディングシーケンスが判ると、相当するシーケンスのポリペプチドを従 来の固相方法によって生成することができ、あるいは、このシーケンスをプロテ ィンの組換え製造のための従来の発現系において用いることができる。

上記のことから、本発明の目的および特徴がどのように満たされるかが正しく認 識されるだろう。バイオポリマーのための混合粒子方法は、比較的少ないサブユ ニット付加工程を用いて、実質的に等モルの分量で、非常に多数のバイオポリマ ーの合成を可能にする。さらに、単一のサブユニットを含む若干の部位、および ２〜２０またはそれ以上の異なるサブユニットを含む他の部位と共に、異なるポ リマー部位にて選択的にサブユニットを変化させるれる。特に、一旦ハイオポリ マーシーケンスの変化をコントロールユニットに対して初めに特定化すると、こ の装置は所望のバイオポリマー混合物を生成するように完全に自動化された様式 で機能することができる。

本発明を特定のポリペプチドおよびポリヌクレオチド方法および装置に関連して 述べてきたが、これらの方法の種々の変更および追加の応用が本発明から離れる ことなく可能であることは認識されるだろう。

Ｆｉｇ、２ Ｆｉｇ、３Ａ　Ｆｉｇ、３Ｂ Ｒ（Ｍｔｓ）−Ｖ−Ｐ−ｏＦ−Ｌ−Ｌ−Ｖ−Ｐ−ｏＦ−Ｌ　Ｒ（Ｍｔｓ）−Ｖ− Ｐ−ｏＡ−Ｌ−Ｌ−Ｖ−Ｐ−ＯＦ−ＬＲ（Ｍ　ｔｓ）−Ｖ−Ｐ−ＣＦ−Ｌ−Ｌ− Ｖ−ｐ−ｏＡ−Ｌ　Ｒ（Ｍ　ｔｓ）−Ｖ−Ｐ−ＤＡ−Ｌ−Ｌ−Ｖ−Ｐ−ＤＡ−Ｌ ｎモルアミノ酸／ｍｇ樹脂 Ｆｉｇ、１１Ａ Ｆｉｇ、ＩＩＢ ）Ｓ＝Ｍ １１−ｓ′Ｍａｃａ　１１−ｓ“ＭＡＧＡ−−−）−ｓ°Ｍａｕｕ１シＭ　Ｎ− ’ＧＣＡＳ”　＠−８’Ｍ　Ｎ−’ＡＧＡＳ”　−−−＠ｌ−５ｗＭＮ−’ＧＵ ＵＳ嘗Ｆｉｇ、１２ 要　約　書 ポリペプチドおよびポリヌクレオチドのような、バイオポリマーを合成するため の方法および装置０本装置は粒子懸濁液中でバイオポリマーにサブユニットカッ プリングを行う複数の反応容器を含む、容器は懸濁物を混合し懸濁液を除去する 際に使用するための共通のバルブ調節構造物に連結される。１実施例では、装置 中のロボットアームを操作して反応溶液を反応容器に移送し、粒子懸濁液を反応 容器から混合容器に移送し、反応容器に戻すことができる０本方法は好ましくは 等モル量の異なるシーケンスのバイオポリマー、例えばポリペプチドおよびポリ ヌクレオチドを生成するために使用することができる。

補正書の翻訳文の提出書く特許法第１８４条の８）平成４年１１月１６日

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. １．固相粒子に固定化された末端保護サブユニットにバイオポリマーサブユニッ トを逐次付加してバイオポリマーを合成するため、真空供給源および圧縮気体供 給源を組み合わせて使用するための装置において、操作状態で、 各々が粒子の懸濁液を保持するために適合しており、各々が底部の粒子フィルタ ーを真空にするとき粒子懸濁液中の粒子を保持するように適合させた該フィルタ ーを有する、複数の反応容器、各容器内の該フィルターを真空および気体供給源 に連結し、該容器がこれらの供給源から孤立する閉鎖位置、および１の開放位置 において真空供給源と、他の開放位置において気体供給源と、該反応容器とを連 結する複数の開放位置に配置できるバルブ装置、及び 前記バルブを閉鎖位置と開放位置に選択的に置くように操作する前記バルブ装置 に連結されたコントロール装置、から成る装置。
2. ２．前記反応容器が複数セットの容器を含み、そして前記バルブ装置が、各セッ トに対して、該セット中の容器を前記真空供給源および圧縮気体供給源に連結す る単一のソレノイドバルブを含む請求項１記載の装置。
3. ３．さらに、バルブの閉鎖位置において独占的に操作されるように装置中の容器 を任意の選択された数にする配置において、個々のソレノイドバルブによって各 々該真空および気体供給源に連結されている１セットの容器を含む請求項２記載 の装置。
4. ４．該バルブ装置が、各セットの容器に対して、前記バルブに連結されるマニホ ルドおよび該マニホルドを該セット中の各容器に連結する複数のチューブを追加 的に含み、該チューブは、ポリマー調製において該装置の操作の間に液体が該容 器に添加される時に到達する該容器の最大レベルを越えて延在する請求項２記載 の装置。
5. ５．さらに、固相支持体上に固定化された該サブユニットにサブユニットを付加 するために使用される試薬溶液を保持するための試薬容器を含み、 選択された容量の溶液を、前記試薬容器の選択された１個から前記反応容器の各 々に移送するために操作できる移送装置、および 前記移送装置とバルブ装置に操作的に連結され、反応容器中の固相粒子の懸濁液 を用いて操作でき： （ｉ）各容器と該真空供給源を連結し、固相粒子を懸濁する液体を各容器から除 去するようにバルブ装置を作動し、（ｉｉ）選択された試薬容器から該反応容器 の各々に反応溶液を移送するように前記移送装置を作動し、（ｉｉｉ）各容器と 該圧縮気体供給源を連結し、各容器に添加された該反応溶液と該固相粒子を混合 するための各容器中にバブリングするようにバルブ装置を作動し、そして（ｉｖ ）支持体上に固定化された該サブユニットに対してサブユニットを付加するため に必要な各反応溶液が容器に添加されるまで、（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を繰り 返し、そして（ｖ）該バイオポリマーを生成する際に使用される各サブユニット が支持体上に固定化された該サブユニットに付加されるまで工程（ｉｖ）を繰り 返す コントロール装置を含む請求項１記載の装置。
6. ６．前記移送装置が、装置中の前記容器の位置に対応する予め選択された位置間 に液体を移送するように操作できるロボットアームを含む請求項５記載の装置。
7. ７．前記コントロール装置が、バイオポリマーを生成する際に使用される各サブ ユニットが支持体上に固定化されたサブユニットに付加されるまで（ｉ）〜（ｉ ｖ）の工程を繰り返すように操作できる請求項５記載の装置。
8. ８．ペプチド合成に使用するため、該固定化サブユニットがＮ−保護アミノ酸で あり、該反応溶液が脱保護溶液、洗浄溶液、選択されたアミノ酸サブユニットの 溶液、カップリング試薬溶液、およびキャッピング試薬溶液を含み、そして、コ ントロール装置が（ａ）該脱保護溶液、（ｂ）該洗浄溶液、（ｃ）選択されたア ミノ酸サブユニットの溶液および該カップリング試薬溶液、および（ｄ）該キャ ッピング溶液に対して（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を行うように操作できる請求項 ７記載の装置。
9. ９．異なる選択されたシーケンスを用いてペプチドを合成する際に使用するため 、工程（ｉｉ）において異なる容器に異なる選択されたアミノ酸サブユニット溶 液を移送するために前記移送装置を作動させるように、コントロール装置が操作 できる請求項８記載の装置。
10. １０．該バイオポリマーの混合物を合成する際に使用するため、さらに混合容器 を含み、前記コントロール装置が工程（ｉｖ）に続いて、 （ｖ）選択された容量の固相粒子の懸濁液を、各反応容器から前記混合容器まで 移送するように、該移送装置を作動し、（ｖｉ）該反応容器の各々に該混合容器 内の選択された容量の懸濁液の該混合物を分配するため、該移送装置を作動する ように、操作できる請求項９記載の装置。
11. １１．実質的に等モル量の異なるシーケンスのポリペプチドを含むペプチドの混 合物を合成するため、前記コントロール装置が、工程（ｖｉ）において、実質的 に等モル量で、２０個までの異なる容器の各々に選択された容量で該混合容器中 の該懸濁液混合物を分配するため該移送手段を作動するように操作でき、そして 、各反応容器に異なるアミノ酸を添加するため、該反応容器にアミノ酸溶液を添 加するための工程（ｉｉ）を操作できる請求項１０記載の装置。
12. １２．ポリヌクレオチドを合成する際に使用するため、該固定化サブユニットが ５′−ＯＨ保護ヌクレオチドであり、該反応溶液が脱保護溶液、洗浄溶液、選択 された活性化されたヌクレオチドサブユニットの溶液、およびキャッピング試薬 溶液を含み、そして、コントロール装置が（ａ）咳脱保護溶液、（ｂ）該洗浄溶 液、（Ｃ）選択された活性化されたヌクレオチドサブユニットの溶液、および（ ｄ）該キャッピング溶液に対して（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を行うように操作で きる請求項７記載の装置。
13. １３．粒子懸濁液中の固相粒子上に運ばれた固定化サブユニットにバイオポリマ ーサブユニットを逐次付加することによって異なるシーケンスのバイオポリマー を合成する際に使用するための装置において、操作状態で、 （ａ）混合容器、 （ｂ）複数の反応容器、 （ｃ）試薬容器、 （ｄ）各反応容器から該混合容器まで粒子懸濁液を移送するため、そして該試薬 容器から該反応容器まで選択された試薬を移送するため、該混合容器中の選択さ れた容量の粒子懸濁液を該反応容器の各々に分配するための移送装置、 （ｅ）選択された遊離サブユニットを、該各反応容器中の末端の粒子結合サブユ ニットにカップリングするための装置、そして、（ｆ）（１）該混合容器中の混 合粒子懸濁液を選択された反応容器に分配し、（２）選択されたサブユニットを 各反応容器中の末端粒子結合サブユニットにカップリングし、そして（３）該反 応容器中の該粒子懸濁液を該混合容器に移送するため、該移送装置およびカップ リング装置をコントロールするためのコントロール装置からなる装置。
14. １４．真空供給源と組み合わせて使用するため、前記反応容器の各々がフィルタ ーを有し、該フィルターは該フィルターを真空にするときに該粒子懸濁液の該固 相を保持するために適合する下部容器表面を画定し、そして前記カップリング装 置は、該容器が該真空供給源から隔離される閉鎖位置と、バルブ装置が該セット 中の該容器を該真空供給源と連絡する開放位置との間に配置できる、前記各容器 中の該フィルターを該真空供給源と連結するバルブ装置を含み、そして前記コン トロール装置は該バルブ装置をその閉鎖位置からその開放位置まで作動するよう に操作できる、請求項１３記載の装置。
15. １５．圧縮気体供給源と組み合わせて使用するため、前記バルブ装置はまた各反 応容器フィルターを該圧縮気体供給源と連結し、そして該バルブ装置が各反応容 器を圧縮気体源と連結する第二の開放位置に配置でき、該容器内でバブリングに よって混合し、そして前記コントロール装置が該バルブ装置をその第二の開放位 置に作動するように操作できる、請求項１４記載の装置。
16. １６．前記反応容器が複数セットの容器を含み、そして前記バルブ装置が、各前 記セットに対して、各セット中の該容器を該真空および圧縮気体の供給源に連結 するソレノイドバルブを含む請求項１５記載の装置。
17. １７．さらに、該装置中の容器の任意の選択された数の容器は、前記開放位置に おいて操作できるバルブに連結されている方式で操作でき、そして該装置中の残 りの容器は、閉鎖位置において独占的に操作できるバルブに連結されているよう に、各ソレノイドバルブによって該真空および圧縮気体の供給源に各々連結され ている容器の１セットを含む、請求項１６記載の装置。
18. １８．該バルブ装置が、各セットの容器に対して、前記バルブに連結されるマニ ホルドおよび該マニホルドを該セット中の各容器に連結する複数のチューブを追 加的に含み、該チューブは、ポリマー調製において該装置の操作の間に液体が該 容器に添加される時に到達する該容器の最大レベルを越えて延在する請求項１６ 記載の装置。
19. １９．ペプチド合成に使用するため、該固定化サブユニットがＮ−保護アミノ酸 であり、該反応溶液が脱保護溶液、洗浄溶液、選択されたアミノ酸サブユニット の溶液、カップリング試薬溶液、およびキャッピング試薬溶液を含み、そして、 コントロール装置が、工程（ｉｉ）を行う際に、（ａ）該脱保護溶液、（ｂ）該 洗浄溶液、（ｃ）選択されたアミノ酸サブユニットの溶液および該カップリング 試薬溶液、および（ｄ）該キャッピング溶液を、該反応容器に逐次的に添加し除 去するように操作できる請求項１３記載の装置。
20. ２０．異なるシーケンスのポリペプチドの混合物を合成するため、前記コントロ ール装置が、工程（ｖｉ）において、実質的に等モル量で、選択された容量で混 合容器中の懸濁液混合物をＮ個までの異なる容器の各々に分配するための移送装 置を作動するように操作でき、そして異なるアミノ酸を各反応容器に添加するよ うに、該反応容器にアミノ酸溶液を添加するための工程（ｉｉ）を操作できる請 求項１３記載の装置。
21. ２１．複数の反応容器の各々に、粒子結合バイオポリマー末端サブユニットを用 いて誘導された固相粒子の懸濁液から成る粒子懸濁液を分配し、 （ａ）脱保護基にサブユニットを結合するために有効な形態で選択されたサブユ ニットを含む反応溶液、および（ｂ）粒子が懸濁されている懸濁溶液を、 逐次各容器中で粒子に添加しそして粒子から除去することによって、選択された サブユニットを各反応容器中の該粒子結合末端サブユニットにカップリングし、 各容器から該粒子の懸濁液を引き出し、引き出した懸濁液を、新しい粒子懸濁液 混合物を生成するように混合し、そして 前記分配、カップリング、引き出し、および混合の工程を繰り返す、 各工程から成る、異なるシーケンスバイオポリマーの混合物の合成方法。
22. ２２．該容器から引き出された粒子懸濁液が実質的に均一な粒子密度を有し、前 記引き出しが各容器から選択された容量の該懸濁液を引き出すことを含む、請求 項２１記載の方法。
23. ２３．該粒子がポリスチレン粒子であり、そして該懸濁液溶液がＤＭＦ／塩化メ チレンを実質的に等モル量で含む請求項２２記載の方法。
24. ２４．実質的に等モル量の異なるシーケンスの該バイオポリマーを調製する際に 使用するため、該容器から引き出される粒子懸濁液が実質的に等モル量のバイオ ポリマーを粒子上に含む、請求項２２記載の方法。
25. ２５．前記カップリング、引き出し、および混合の工程が、所望の数のサブユニ ットのバイオポリマーが該粒子上に形成されるまで操り返される請求項２１記載 の装置。
26. ２６．実質的に等モル量のポリヌクレオチドを生成するため、該粒子に結合した 前記末端サブユニットがＮ−保護Ｎ−末端アミノ酸残基であり、各反応容器に添 加された前記選択されたサブユニットがＮ−保護アミノ酸である請求項２１記載 の装置。
27. ２７．実質的に等モル量のポリヌクレオチドを生成するため、該粒子に結合した 前記末端サブユニットが５′−ＯＨ保護５′−末端ヌクレオチドであり、各反応 容器に添加された前記選択されたサブユニットがその５′−ＯＨ基にて保護され たホスホルアミダイトー活性化ヌクレオチドである請求項２１記載の装置。
28. ２８．異なる末端粒子結合バイオポリマーサブユニットを用いて誘導された固相 粒子の懸濁液から成る粒子−懸濁液混合物を生成し、 該混合物を複数の別々の反応容器に分配し、異なる選択されたサブユニットを各 反応容器中の該粒子結合末端サブユニットにカップリングし、 異なる末端粒子結合バイオポリマーサブユニットを用いて誘導された固相粒子の 懸濁液から成る新しい粒子懸濁液混合物を形成するように、複数の反応容器中に 懸濁液を混合し、異なる選択されたサブユニットが望まれる各サブユニット位置 に対して前記分配、カップリング、および混合の工程を繰り返す、各工程から成 る、選択されたサブユニット位置にて、異なる選択されたサブユニットを有する バイオポリマー混合物を合成する方法。
29. ２９．１またはそれ以上の選択されたアミノ酸位置にて異なる選択されたアミノ 酸を有する実質的に等モル量のポリペプチドを合成する際に使用するため、複数 の反応溶液に分配される前記粒子懸濁液混合物が、粒子上に実質的に等モル量の 誘導された該バイオポリマーを含み、前記カップリングが、該末端サブユニット ヘの該カップリングが実質的に完了する条件下に行われる請求項２８記載の方法 。
30. ３０．既知シーケンスのポリペプチドの所定の活性で選択された残基部位にて、 アミノ酸置換体の効果を決定する際に使用するため、ポリペプチドが、選択され た残基部位にて選択されたアミノ酸置換体を有する該既知シーケンスのポリペプ チドおよびそのアナログを含むように合成され、そしてさらに、所定の活性に対 して合成されたポリペプチドをアッセイする工程を含む請求項２９記載の方法。
31. ３１．受容体に対して選択された結合活性を有するポリペプチドを生成するため 、（ａ）各カップリング工程で、少なくとも１０個の異なるアミノ酸が、該誘導 された末端アミノ酸に結合し、そして（ｂ）前記繰り返す工程が少なくとも５回 行われる請求項２９記載の方法。
32. ３２．１またはそれ以上の選択されたコドン位置にて、異なるコドンを有する実 質的に等モル量のオリゴヌクレオチドを合成する際に使用するため、該複数の反 応容器に分配される前記粒子懸濁液混合物が、実質的に等モル量の誘導されたヌ クレオチドサブユニットを含む請求項２８記載の方法。
33. ３３．ランダムコーディングシーケンスを用いてポリヌクレオチドを合成する際 に使用するため、各サブユニットがヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドであ り、前記繰り返しが少なくとも約６個のコドンを含有するポリヌクレオチドを生 成するために有効である請求項２８記載の方法。
34. ３４．受容体に対して選択された結合活性を有するポリペプチドを符号化するコ ーディングシーケンスを生成する際に使用するため、さらに、（ａ）発現ベクタ ーに該合成されたポリペプチドを挿入し、（ｂ）適当する発現系において該ポリ ヌクレオチドシーケンスを発現し、（ｃ）選択さた結合活性のため該ベクターの 発現生成物に対してスクリーニングし、そして（ｄ）発現生成物が所望の結合活 性を有するベクターを単離する工程を含む請求項３１記載の方法。
35. ３５．該ベクターがファージラムダベクターであり、該ポリヌクレオチドがファ ージ構造−プロテイン遺伝子のコーディングシーケンスに挿入され、そして前記 スクリーニングが該受容体に結合するためファージをスクリーニングすることを 含む請求項３４記載の方法。