PL169616B1 - Sposób ustalania sekwencji ligandu biooligomerowego dla czasteczki akceptorowej PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób ustalania sekwencji ligandu biooligomerowego dla czasteczki akceptorowej, w którym biblioteke róznych ligandów biooligomerów eksponuje sie na dzialanie akceptora, wyod- rebnia sie z biblioteki biooligomery wiazace akceptor i ustala sie sekwencje wyodrebnionych biooligomerów, znamienny tym, ze do biblioteki, obejmujacej wiele rodzajów biologicznie aktywnych biooligomerów pozbawionych grup ochronnych, które sa peptydami lub oligonukleo- tydami, wiele dokladnie wymieszanych stalofazowych nosników, i w której kazdy pojedynczy rodzaj biooligomeru jest polaczony z kazdym stalofazowym nosnikiem tworzac kombinacje stalofazowy nosnik/biooligomer, i w której dla kazdego rodzaju biblioteki tozsamosc meru biooligomeru obecnego w dowolnej danej niejednorodnej pozycji rodzajów biooligomeru jest statystycznie niezalezna od tozsamosci merów w innych pozycjach biooligomerów wprowadza sie czasteczke akceptorowa bedaca przedmiotem zainteresowania tak, ze wprowadzona czasteczka akceptorowa rozpoznaje i wiaze sie z jednym lub wiecej rodzajami kombinacji stalofazowy nosmk/biooligomer z biblioteki, i wydziela sie kombinacje stalofazowy nosnik/biooligomer, wykazujaca wiazanie z czasteczka akceptorowa. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób ustalania sekwencji ligandu biooligomerowego dla cząsteczki akceptorowej.

Biooligomerem w rozumieniu sposobu według wynalazku może być peptyd, oligonukleotyd lub chimeryczny konstrukt peptydowo-oligonukleotydowy.

Rozpoznawanie i wiązanie ligandów reguluje prawie wszystkie procesy biologiczne takie jak rozpoznawanie odporności, sygnalizowanie i komunikacja w komórkach, transkrypcja i translacja, sygnalizowanie wewnątrzkomórkowe oraz katalizę, np. reakcje enzymatyczne. Od dawna istnieje zainteresowanie identyfikacją cząsteczki, które działają jako agonisty lub które mogąagonizować lub antagonizować aktywność ligandów takich jak hormony, czynniki wzrostu i neurotransmitery; które indukują odporność komórki B (z pośredniczeniem przeciwciała) lub komórki T (z pośredniczeniem komórki); które mogą katalizować reakcje chemiczne;lub które mogą regulować ekspresję genu na poziomie transkrypcji lub translacji.

Szczególnie interesujące są ligandy proteinowe lub peptydowe. Należy do nich większość hormonów, czynników wzrostu, cząsteczek neuroaktywnych oraz epitopów odporności. Ponadto, jak to przedstawiono poniżej, najwięcej prób w tworzeniu antagonistów lub agonistów biologicznej aktywności z udziałem receptorów, a także epitopów antyciał lub komórek T, zogniskowano na peptydach. Jednakże rozwój środków farmaceutycznych dostosowanych do centrów wiązania receptorów jest znacznie zahamowany z uwagi na trudności w ustaleniu sekwencji ligandów peptydowych. Olbrzymia liczba i znaczna różnorodność takich sekwencji peptydowych spowodowała, że jest to cel niemożliwy do osiągnięcia żadnymi środkami z wyjątkiem żmudnego wydzielania określonego kompleksu, identyfikacji położenia epitopu oraz sekwencjonowania tego epitopu. Problem jest dodatkowo skomplikowany w związku z tym, że

169 616 często epitop zawiera reszty aminokwasów, które me sąsiadują w sekwencji pierwotnej Usiłowano obejść ten czasochłonny proces ustalając sekwencję aminokwasów w białku na podstawie sekwencji nukleotydów w jego komplemencie Białka są wielkimi peptydami złożonymi z aminokwasów; każdy aminokwas jest kodowany przez jeden lub więcej kodonów złożonych z trzech reszt kwasów nukleinowych. Tak np. peptyd A zawierający aminokwas glutaminę powinien być kodowany przez kodon z trzech reszt kwasów nukleinowych: cytozyny, adeniny i guamny. Komplementem do tego kodonu powinna być guanina (która wiąże się z cytozyną), tymina (która wiąze się z adeniną) oraz cytozyną, przy czym będzie on kodował aminokwas w peptydzie B. Zgodnie z teorią komplementarności peptyd B powinien wiązać się z peptydem A W szczególności Bost i Blalock (1989, Methods in Enzymology 168' 16-28) zasugerowali, ze dowolny dany peptyd będzie wiązać się z innym peptydem kodowanym przez komplementarną sekwencję reszt kwasów nukleinowych oraz, napodstawie tej informacji, przewidzieli sekwencję aminokwasów w peptydzie komplementarnym. Użyli om sekwencję do zsyntetyzowama peptydu i zbadania jego zdolności do wiązania.

Jednakże podejście to me zapewniło rozwiązania problemu gdyż powinowactwo wiązania między komplementarnymi peptydami było zasadniczo bardzo małe i wymagało stosowania komplementarnych peptydów zawierających ponad 15 reszt Ponadto podejście takie wymagało znajomości sekwencji aminokwasów lub sekwencji kwasów nukleinowych w wiązącym partnerze białka będącego przedmiotem zainteresowania. Podejście takie nie daje również rezultatów w przypadku epitopów zawierające reszty aminokwasów nie sąsiadujące w sekwencji podstawowej.

Ostatnio pojawiło się szereg doniesień dotyczących wytwarzania bibliotek peptydów i ich zastosowania w identyfikacji ligandów peptydowych, które mogą wiązać się z akceptorami Jeden z wariantów dotyczy stosowania zrekombinowanego bakteriofaga do wytwarzania wielkich bibliotek Wykorzystując metodę fagową (Scott i Smith, 1990, Science 249: 386-390; Swirla i mm, 1990, Proc, Natl. Acad. Sci., 87 6378-6382, Devlin i inni, 1990, Science, 249: 404-406 (konstruować można bardzo duże biblioteki (I0⁶ - 10⁸ indywiduów chemicznych), z tym ze kod genetyczny i układ biologiczny narzuca surowe wewnętrzne ograniczenia na uniwersalność i różnorodność układu. W drugim wariancie wykorzystuje się podstawowe metody chemiczne, których przykład stanowi metoda Geysena (Geysen i inni, 1986, Molecular Immunology 23 709-715; Geysen i inni, 1987, J. Immunologie Method 102:259-274) oraz nowa metodaFodora i innych (1991, Science 251,767-773). Metodologia Geysonai innych umożliwia syntetyzowanie ograniczonej ilości peptydów (10³ - 10⁴) na szpilkach polietylenowych w ciągu kilku dni. Metoda Fodora i innych wykorzystuje technikę sterowanej światłem, przestrzennie kierowanej równoległej syntezy chemicznej. Technika ta wykazuje ograniczenie spowodowane względnym brakiem rozwoju fotochemicznych metod syntezy peptydów.

Opracowano również techniki równoległe zgodnej syntezy peptydów w dużej skali. Houhton doniósł o równoczesnej syntezie setek analogicznych peptydów w pakietach z siatki polipropylenowej (metoda torebek herbaty) (Houghton, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci USA 82: 5131 - 5135).

Metodę torebek herbaty opisano szerzej w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4 631 211. Polega ona na umieszczeniu stałofazowych nośników w porowatych oznaczonych pojemnikach tak, ze w tym samym naczyniu można prowadzić procesy chemiczne wspólne dla kulku różnych syntez. Po zakończeniu wspólnych procedur indywidualnie oznakowane pojemniki można rozdzielić i poddawać dalszej obróbce indywidualnie aby zakończyć syntezę i usunąć peptyd z nośnika. Ujawnienie to dotyczy jednak syntezy zestawu peptydów, a nie mieszanin peptydów.

Przykładowe ujawnienie w tym opisie dotyczy konstruowania zestawu peptydów, opartego na wcześniej założonej sekwencji (sekwencja probanta). Każdy człon zestawu różni się od tej wcześniej założonej sekwencji w jednej i tylko jednej pozycji (pozycja wariantowa) Tak więc, dla każdego rodzaju peptydu w zestawie identyfikacja pozycji wariantowej natychmiast określa tożsamość reszty peptydu we wszystkich innych pozycjach, a tym samym sekwencję probanta Ponadto każdy rodzaj peptydu w zestawie otrzymanym jak opisano we wspomnianym opisie patentowym różni się od każdego innego rodzaju w jednej lub dwóch pozycjach sekwencji

169 616 probanta, składającej się z 13 pozycji. Tak więc w opisie tym nie ujawniono sposobu wytwarzania biblioteki przypadkowych peptydów, jak to ma miejsce w sposobie według wynalazku.

(Berg i inni (1989, J Am. Chem Soc. 111.8024-8026) donieśli o nowej polietylenowej folii szczepionej polistyrenem, jako nośniku nadającym się do syntezy peptydów techniką równoległą. W obydwu metodach wykorzystuje się standardową żywicę Boc-aminokwasową i standardową procedurę odblokowywania, zobojętniania, sprzęgania i przemywania podaną w oryginalnej metodzie syntezy w fazie stałej Merrifielda (1963, J Am Chem. Sci. 85: 2149-2154).

Furka i inni (1988, 14th International Congress of Biochemistry, Vol. 5, Abstract FR. 013) opisali sposób wytwarzania mieszaniny peptydów oddzielnego sprzęgania każdego z trzech różnych aminokwasów, a następnie wymieszania wszystkich żywic.

Furka i inni stwierdzają, że korzystnie, stosując ten sposób, można wytworzyć wielką ilość peptydów, oszczędzając wiele czasu i pracy. Sugeruje się w tej publikacji, że mieszaninę peptydów można poddać frakcjonowaniu w poszukiwaniu peptydów czynnych biologicznie, stwierdzajednak, że dotychczas nie przeprowadzono żadnych testów biologicznych na mieszaninie peptydów.

W celu zilustrowania opisanego w tej publikacji sposobu, przedstawiono następujący przykład syntezy mieszaniny 9 tetrapeptydów. Mieszaninę 9 tetrapeptydów wytworzono, wychodząc z 3 równych próbek Ala(A)-zywica, które acylowano, odpowiednio, pochodnymi Glu(E), Phe(F) i Lys(K) z odpowiednio zabezpieczonymi grupami Boc łańcuchami bocznymi. Otrzymane pochodne trzech żywic mieszano, następnie dzielono ponownie na 3 równe części, które ponownie sprzęgano, odpowiednio, z Glu, Phe lub Lys, i następnie mieszano. Następnie mieszaninę sprzęgano z Glu. Syntetyzowano dziewięć rodzajów żywicy, z których każdy zawierał peptyd o postaci E(E/F/K) (E/F/K)A, gdzie (E/F/K) oznacza Glu, Phe lub Lys.

Następnie z peptydów jednocześnie usuwano grupy zabezpieczające i odszczepiano peptydy od żywic.

Procedura opisana przez Furkę i innych nie zapewnia jednak zadawalającej metody wydzielania peptydu będącego przedmiotem zainteresowania spośród szeregu wytworzonych peptydów.

Jakkolwiek użyteczne z praktycznego punktu widzenia, chemiczne metody Geysena, Fodora, Houghtona, Berga oraz Furki i współpracowników umożliwiają jednorazowo syntezę i zbadanie jedynie od setek do kilku tysięcy peptydów. Techniki te są zdecydowanie ograniczone w świetle milionów możliwych sekwencji peptydowych, z których jedna lub dwie mogą odpowiadać centrom wiązania między indywiduami będącymi przedmiotem zainteresowania. W przypadku 20 znanych aminokwasów dla sekwencji 5 aminokwasów istnieje 20⁵ czyli około 3,2 x 10⁶ możliwych kombinacji aminokwasów. Żadna z tych procedur nie umożliwia równoczesnej syntezy tak wielu peptydów, Dalsze zwielokrotnienie wystąpi przy zmienianiu długości łańcucha peptydu. Również konwencjonalne syntezy peptydów, takie jak opisane przez Stewarda i Younga (1984, Solid Phase Synthesis, Second Edition, Pierce Chemical Co., Rockford, IL) nie dostarczają sposobu równoczesnej syntezy tysięcy do milionów peptydów.

Na dodatek żadna z innych konwencjonalnych metod syntezy peptydów nie umożliwia syntezy rzeczywiście statystycznej biblioteki peptydów związanych ze stałofazowym nośnikiem. Rzeczywistą statystyczną bibliotekę peptydów stanowi taka biblioteka, w której występuje dobry statystyczny rozkład wszystkich składników cząsteczkowych, tak że w bibliotece występują w przybliżeniu równomolowe stosunki wszystkich indywidualnych rodzajów peptydów.

Syntezy rzeczywiście statystycznego peptydu zazwyczaj nie można przeprowadzić dodając równocześnie różne aminokwasy do jednego reaktora, gdyż szybkości sprzęgania różnych aminokwasów w syntezie peptydów w fazie stałej (SPPS) różnią się znacznie (Ragnarsson i inni, 1971, Acta Chem., Scand. 25: 1487 -1489; Ragnarsson i inni, 1974, J. Org. Chem. 39:3837 - 3842). Tak np. szybkość sprzęgania Fmocglicyny z rosnącym peptydem jest o wiele większa niż szybkość Fmoc-waliny, prawdopodobnie na skutek zawady przestrzennej, którą stanowi duży boczny łańcuch waliny Gdyby wymieszało się wszystkie 20 aktywowanych eukariotycznych L-aminokwasów z żywicą w każdym cyklu sprzęgania, najszybciej reagujące aminokwasy byłyby wybiórczo wprowadzane do peptydu i nie usyskanoby równomolowych stosunków dla

169 616 wszystkich rodzajów peptydów. Ponadto każdy z możliwych nukleofili będące wykazywać różne reaktywności

Na dodatek żadna ze znanych metod syntezy nie umożliwia wytwarzania biblioteki ponad 10⁵ peptydów, w której każdy rodzaj peptydu przyłączony jest do jednego stałofazowego nośnika. Występowanie jednego tylko rodzaju peptydu na nośniku znacznie usprawniłoby obecne techniki wydzielania peptydów.

W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na bibliotekę rzeczywiście statystycznych sekwencji peptydów oraz sekwencji oligonukleotydów, to znaczy sekwencji biooligomerów, w której pojedynczy rodzaj biooligomeru można będzie łatwo i szybko oddzielić od reszty biblioteki. Istnieje również zapotrzebowanie na sposób szybkiego i niezbyt drogiego syntetyzowania tysięcy lub milionów takich rzeczywiście statystycznych sekwencji biooligomerów.

Sposób ustalania sekwencji ligandu biooligomerowego cząsteczki akceptorowej, w którym bibliotekę różnych ligandów biooligomerów eksponuje się na działanie akceptora, wyodrębnia się z biblioteki biooligomery wiążące akceptor i ustala się sekwencję wyodrębnionych biooligomerów według wynalazku charakteryzuje się tym, że do biblioteki, obejmującej wiele rodzajów biologicznie aktywnych biooligomerów pozbawionych grup ochronnych, które są peptydami lub oligonukleotydami, wiele dokładnie wymieszanych stałofazowych nośników, i w której każdy pojedynczy rodzaj biooligomeru jest połączony z każdym stałofazowym nośnikiem tworząc kombinację stałofazowy nośnik/biooligomer, i w której dla każdego rodzaju biblioteki tożsamość meru biooligomeru obecnego w dowolnej danej niejednorodnej pozycji rodzajów biooligomeru jest statystycznie niezależna od tożsamości merów w innych pozycjach biooligomerów wprowadza się cząsteczkę akceptorową będącą przedmiotem zainteresowania tak, ze wprowadzona cząsteczka akceptorowa rozpoznaje i wiąże się z jednym lub więcej rodzajami kombinacji stałofazowy nośnik/biooligomer z biblioteki, i wydziela się kombinację stałofazowy nośnik/biooligomer, wykazującą wiązanie z cząsteczką akceptorową

Tak więc w sposobie według wynalazku ustalania sekwencji ligandu biooligomeru dla cząsteczki akceptorowej, stosuje się statystyczną bibliotekę biooligomerów przyłączonych do stałofazowych nośników, przy czym każdy stałofazowy nośnik jest połączony z pojedynczym rodzajem biooligomeru, a wszystkie możliwe kombinacje merów, z których złożone są biooligomery, występują w kolekcji, wprowadzenia do statystycznej biblioteki cząteczki akceptorowej lub cząsteczki substratu, będącej przedmiotem zainteresowania, tak ze wymieniona cząsteczka akceptorowa będzie rozpoznawać i wiązać jeden lub więcej rodzajów kombinacji stałofazowy nośmk/biooligomer w bibliotece, albo tez wymieniona cząsteczka - substrat będzie ulegać reakcji chemicznej katalizowanej przez jeden lub więcej rodzajów kombinacji stałofazowy nośnik/biooligomer w bibliotece; wydzielenie kombinacji stałofazowy nośnik/biooligomer wykazującej pożądane właściwości; oraz sekwencjonowania biooligomeru w wydzielonej kombinacji stałofazowy nośnik/biooligomer. W innym wariancie część biooligomeru uwalnia się in situ z kombinacji stałofazowy nośnik/biooligomer i aktywność biologiczną składnika będącego przedmiotem zainteresowania wykrywa się in situ. W jednym wykonaniu biooligomer stanowi peptyd W innym wykonaniu biooligomer stanowi oligonukleotyd, a zwłaszcza DNA lub rNa W jeszcze innym wykonaniu biooligomer stanowi chimeryczny peptyd/oligonukleotyd.

Wynalazek objaśniają rysunki.

Figura 1 przedstawia schemat syntezy statystycznego peptydu z wykorzystaniem metody syntezy z odszczepianiem dla statystycznego trójpeptydu z dodanym na końcu tryptofanem: X-X-X-W (gdzie X = S, A lub V, istnieje 3³ czyli 27 możliwości).

Figura 2 schematycznie przedstawia cykliczne peptydy, n = 0, 1, 2, 3, ...., a m = 12, 3, ... ; n oraz m mogą, lecz nie muszą być takie same. Linie stałe oznaczają wiązania liniowego peptydu, linie przerywane oznaczają usieciowania Pary specyficznie sąsiadujących merów oznaczano jako A i B. A sieciuje tylko z A, a B sieciuje tylko z B (a) Motyw koszykowy, (b) motyw drabinkowy (c) motyw lassowy.

Figura 3 przedstawia chromatogramy (CiHPLC wysokosprawna chromatografia cieczowa z odwróceniem faz, Vydac) statystycznych tetrapeptydów (X-X-X-W, gdzie X = S, A lub V) zsyntetyzowanych (A) nowym sposobem (patrz tekst) oraz (B) w wyniku standardowej syntezy peptydów w fazie stałej Chromatogram uzyskano eluując kolumnę acetonitrylem z liniowym

169 616 gradientem. Rozpuszczalnik A 0,1 % kwasu trifluorooctowego i 5% acetonitrylu rozpuszczalnik B: 0,1% kwasu trifluorooctowego i 10% acetonitrylu

Figura 4 przedstawia fotografię peptydu długi v-mos/ziarna, znaczonego przeciwciałem przeciw-v-mos i przeciwciałem drugorzędowym.

Figura 5 przedstawia fotografię mieszaniny ziaren długi v-mos i ziaren krótki v-mos, znaczonych przeciwciałem przeciw-v-mos i przeciwciałem drugorzędowym.

Figura 6 przedstawia fotografię mieszaniny ziaren długi v-mos i ziaren krótki v-mos, znaczonych przeciwciałem przeciw-v-mos i przeciwciałem drugorzędowym.

Figura 7 przedstawia mikrofotografię screeningu typowej biblioteki ligandu peptydowego, na której dodatnie (ciemno błękitne) ziarno można łatwo zidentyfikować w tle wielu tysięcy nagatywnych (bezbarwnych) ziaren.

Figura 8 przedstawia mikrofotografię przedstawiającą uzależnione od stężenia inhibitujące działanie biotyny na barwienie ziaren mimotopu LHPQF-żywica przez streptawidynę-fosfatazę alkaliczną. A: 100 nM, 10 nM, C. 1 nM; D. 0,1 nM biotyny. Ziarna stanowiące ślepą próbę (β-Ala-kwas minokapronowy-żywica) wymieszano w stosunku 1:1 z LHPQF-żywicą przed inkubowaniem streptawidyną-fosfatazą alkaliczną, tak aby służyły jako negatywny wzorzec wewnętrzny

W użytym znaczeniu określenie biblioteka dotyczy kolekcji zasadniczo statystycznych biooligomerów. W użytym znaczeniu określenie biooligomer dotyczy polimeru z mniej niz około 100 merów. Biooligomer może stanowić peptyd, zawierający mery aminokwasów, oligonukleotyd zawierający mery nukleotydów lub chimera peptydowo-oligonukleotydowa.

Sposoby generowania biblioteki statystycznych biooligomerów

Stosowaną w sposobie według wynalazku bibliotekę biooligomerów generuje się na drodze syntezy biooligomerów o statystycznych sekwencjach merów. W użytym znaczeniu określenie statystyczne sekwencje merów dotyczy sekwencji,w których dowolny mer może występować przed lub za innym merem.

W jednym wykonaniu mer może stanowić aminokwas, analog aminokwasu lub peptydomimetyk. W użytym znaczeniu peptydomimetyk oznacza cząsteczkę, która strukturalnie i chemicznie przypomina peptyd dwóch lub więcej aminokwasów, W innym wykonaniu mer może stanowić nukleotyd; nukleozyd może stanowić kwas rybonukleinowy, albo też może to być kwas dezoksyrybonukleinowy. W jeszcze innym wykonaniu mery mogą stanowić aminokwasy i nukleozydy. Biooligomer może stanowić peptyd (zawierający aminokwasy), oligonukleotyd RNA (zawierający rybonukleozydy), oligonukleotyd DNA (zawierający dezoksyrybonukleozydy), chimeryczny oligonukleotyd DNA-RNA lub chimera peptyd-oligonukleotyd. Bibliotekę zawierającą peptydy,oligonukleotydy lub chimery peptyd-oligonukleotyd generować można sposobem obejmującym powtarzanie następujących etapów (i) dostarczanie co najmniej dwóch próbek stałofazowego nośnika dla statystycznych sekwencji merów;

(ii) oddzielne wprowadzenie zestawu merów do próbek stałofazowego nośnika;

(iii) kompletne sprzęganie merów z zasadniczo wszystkimi centrami stałofazowego nośnika z wytworzeniem kombinacji stałofazowy nośnik/nowy mer;

(iv) stwierdzenie komp letności sorzęgania graz,w raz ie potrzepo, wymuszeniakomp letności reakcji;

(v) dokładne wymieszanie próbek kombinacji stałofaaowe nornie/nowy mer; oraz po powtórzeniu powyższych etapów (i) - (v) wymaganą ilość razy, ostateczny etap (vi) usunięcia grup blokujących Lik ze biooligomer pozostaje przyłączony do statofazowego nośnika. W kolejnym wykonaniu wytworzyć można tak bibliotekę statystycznych biooligomerów, ze co najmniej w jednym etapie ten sam mer sprzęga się w przypadku wszystkich stołofazowech nośników, oraz w co najmniej jednym innym etapie co najmniej dwa mery sprzęga się ze stałofazowym nośnikiem Bibliotekę statystycznych biooligomerów generować można powtarzając raz powyższe etapy (i) - (v); w innym wykonaniu bibliotekę statystycznych biooligomerów generować można wykonując więcej niż jedną powtórkę powyższych etapów (i) - (v). Zastosować można stałofazowy nośnik, z którym sprzęgnięto już jeden lub więcej merów.

169 616

Biblioteka biooligomerów może być złozona z ustalonej, ograniczonej liczby merów W innym wykonaniu biblioteka statystycznych biooligomerów może zawierać wszystkie dostępne mery.

W kolejnym wykonaniu biooligomer będący przedmiotem zainteresowania zidentyfikować można w sekwencyjnym procesie wytwarzając najpierw bibliotekę, a następnie identyfikując sekwencję biooligomeru wykazującą interesujące właściwości. Wytwarza się w ten sposób stałofazowy nośnik zawierający zidentyfikowaną sekwencję biooligomeru Do uprzednio zidentyfikowanej sekwencji dodaje się nowy segment sekwencji merów i identyfikuje się tą nową sekwencję zawierającą znaną sekwencję oraz statystyczną sekwencję, która wykazuje interesujące właściwości.Taka sekwencyjna strategia optymalizacji - randomizacji umożliwia szybką identyfikację biooligomeru będącego przedmiotem zainteresowania .

Biooligomery z biblioteki stosowanej w sposobie według wynalazku mogą, lecz nie muszą występować w bibliotece w zasadniczo równomolowych ilościach. Jak to jest zrozumiałe dla specjalisty, jednostka molowa oznacza takie stężenie, gdy jedną jednostkę ciężaru cząsteczkowego wyrażonego w gramach (1 ml) substancji rozpuszcza się w takiej ilości rozpuszczalnika, aby uzyskać 1 litr roztworu. W użytym znaczeniu zasadniczo równomolowe ilości biooligomerów dotyczą rodzajów merów, których stężenia są w przybliżeniu takie same. Oznacza to, ze jeśli w zbiorze 150 000 biooligomerów stężenie biooligomeru A wynosi 200 pmoli/litr, to stężenie każdego z pozostałych 150 000 rodzajów biooligomerów będzie wynosić również około 200 pmoli/litr. Jednakże w użytym znaczeniu uważa się, ze zasadniczo równomolowa ilość uwzględnia heterogeniczność wielkości stałofazowego nośnika. Na skutek heterogeniczności stałofazowego nośnika występują wahania w ilości biooligomeru, który może być przyłączony do danego nośnika

Stosuje się co najmniej dwie próbki stałofazowego nośnika, przy czym liczba stałofazowych nośników w próbkach korzystnie odpowiada co najmniej liczbie biooligomerów, które mają być zsyntetyzowane Umożliwia to utworzenie biblioteki, w której każdy stałofazowy nośnik zawiera pojedynczy rodzaj biooligomeru, czyli jedno ziarno na jeden biooligomer. W użytym znaczeniu, próbka dotyczy części, która stanowi określony ułamek całej ilości stałofazowych nośników.

Biblioteki statystycznych peptydów

W szczególnym wariancie biblioteka statystycznych biooligomerów może zawierać peptydy. Określenie peptyd używane jest w najszerszym znaczeniu i dotyczy związku dwóch lub więcej merów aminokwasów, analogów aminokwasów lub peptydomimetyków. Mery mogą być połączone wiązaniami peptydowymi. W innym wariancie mery mogą być połączony innymi wiązaniami, np estrowymi, eterowymi, itp. W użytym znaczeniu określenie aminokwas dotyczy naturalnych i/lub nienaturalnych albo syntetycznych aminokwasów, w tym glicyny oraz izomerów optycznych D lub L, a także analogów aminokwasów oraz peptydomimetyków. Peptyd z trzech lub więcej aminokwasów jest powszechnie określany jako oligopeptyd, jeśli łańcuch peptydu jest krótki. Jeśli łańcuch peptydu jest długi, peptydjest powszechnie określany jako polipeptyd lub białko

Wynalazek niniejszy oparty jest na chemii syntetycznych peptydów i nie dotyczy zastosowania jakiegokolwiek układu żyjącego do amplifikacji lub selekcjonowania. Biblioteki peptydów mogą zawierać nienaturalne aminokwasy I tak peptydy stosowane w sposobie według wynalazku mogą zawierać D-aminokwasy, kombinacje D-i L-aminokwasów, oraz różne zaprojektowane aminokwasy (np β-metylo-aminokwasy, C-a-metylo-aminokwasy, N-a-metyloaminokwasy itp.) w celu nadania specjalnych właściwości peptydom w bibliotece. Ponadto stosując określone aminokwasy w określonych etapach sprzęgania generować można biblioteki peptydów z α-heliksami, β-skrętami, β-paskami (β-sheets), γ-skrętami oraz peptydy cykliczne.

Biblioteka peptydów stosowana w sposobie według wynalazku zawiera wszystkie możliwe kombinacje aminokwasów, z których składają się peptydy. Używając jako przykładu dipeptydu wytworzonego z dwóch aminokwasów, glicyny i proliny, istnieją cztery możliwe kombinacje glicyna-glicyna, glicyna-prolina, prolina-glicyna i prolina-prolina, a statystyczna biblioteka będzie zawierać wszystkie cztery kombinacje

169 616

Zestaw pierwszych aminokwasów oddzielnie wprowadza się do każdej z próbek. Zasadniczo aminokwasami stosowanymi w syntezie peptydów są wrażliwe na zasady N“-amino blokowane 9-fluorenylometoksykarbonylem (Fmoc) aminokwasy opisane po raz pierwszy przez Caprino i Hana (1972, J. Org. Chemi. 37’ 3403 - 3409). Zgodnie ze sposobem według wynalazku stosować można również Boc-aminokwasy (N^a-amino blokowane N“-tertbutoksykarbonylem). Zarówno Fmoc jak i Boc N“-amino-blokowane aminokwasy otrzymać można z Fluka, Bachem, Advanced Chemtech, Sigma, Cambridge Research Biochemical, Bachem z Peninsula Labs, albo od innych producentów chemicznych, znanych specjalistom. Dodatkowo zgodnie ze sposobem według wynalazku stosować można inne grupy N“ blokujące, znane specjalistom.

Kontynuując przykład dipeptydu opisany powyżej pierwszy zestaw wprowadzonych aminokwasów powinien obejmować glicynę i prolinę; do każdej próbki dodaje się N^a-Fmocglicynę lub N^a-Fmoc-prolinę.

Po dodaniu zestaw pierwszych aminokwasów kompletnie sprzęga się z zasadniczo wszystkimi centrami stałofazowych nośników W użytym znaczeniu kompletne sprzęganie oznacza, ze reakcję sprzęgania doprowadza się do końca bez względu na różnice w szybkościach sprzęgania poszczególnych aminokwasów. Na dodatek aminokwasy sprzęga się z zasadniczo wszystkimi dostępnymi centrami sprzęgania na stałofazowym nośniku, tak że stałofazowy nośnik będzie zawierać zasadniczo tylko jeden rodzaj peptydu. W wyniku kompletnego sprzęgania uzyskuje się kombinacje stałofazowy nośnik/pierwszy aminokwas. Używając jako przykładu opisanego powyżej dipeptydu, w wyniku kompletnego sprzęgania uzyska się kompozycję ziarno-glicyna i kombinację ziarno-prolina.

Sprzęganie aminokwasów przeprowadzić można technikami znanymi specjalistom, opisanymi np. w pracy Stewarda i Younga, 1984, Solid Phase Synthesis, Second Edition, Pierce Chemical Co., Rockford, IL. Jak to jest wiadome specjalistom, sposób syntezy peptydów obejmuje konstruowanie peptydu od końca karboksylowego lub C, zgodnie z którym C-końcowy aminokwas z zablokowaną grupą α-aminową przyłącza się do stałego polimeru. Grupę blokującą odszczepia się następnie i następny aminokwas, również zablokowany, sprzęga się poprzez wiązanie peptydowe z grupą α-aminową aminokwasu przyłączonego do stałofazowego nośnika. Cykl odblokowania poprzedniego aminokwasu i sprzęgania dodatkowego aminokwasu powtarza się aż do zakończenia peptydu. Jakiekolwiek reaktywne boczne łańcuchy w aminokwasach blokuje się grupami chemicznymi, które wytrzymują procedurę sprzęgania i N“-odblokowania, ale mogą być usunięte pod koniec syntezy

W celu sprzęgania aminokwasu z rosnącym syntetycznym łańcuchem grupa karboksylowa zablokowanego aminokwasu musi być uaktywniona. Można stosować wiele sposobów aktywacji obejmujących np. wstępne wytwarzanie symetrycznych bezwodników (PSA), wstępne wytwarzanie mieszanych bezwodników (PMA), chlorki kwasowe, aktywne estry, a także aktywowanie kwasu karboksylowego in situ, jak to opisali Fields i Noble, 1990, Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids, Int. J. Pept. Protein Res. 35: 161 -214.

Zastosowanie Fmoc aminokwasów stanowi podstawową strategię w syntezie peptydów. Strategię z Boc (tert-butoksykarbonylo-zablokowaną grupą aminową) można również wykorzystać do wytwarzania biblioteki peptydów związanych ze stałofazowym nośnikiem (np. Geysen i inni, 1987, J. Immunol. Methods 102: 259 - 274).

Należy ocenić kompletność sprzęgania. Specjaliści powinni znać powszechnie wykorzystywane ilościowe wizualne próby takie jak próba ninhydrynowa (próba cesarska), próba z kwasem pikrynowym, kwasem 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowym (TNBS), fluoreskaminą i chloranilem, oparte na reakcji reagentu z wolnymi grupami aminowymi z wytworzeniem związku chromoforowego. Przy stosowaniu iminokwasów (np. Pro lub Hyp), korzystną metodę stanowi monitorowanie izartynowe, patrz Fields i Noble, powyżej. Kompletność reakcji można śledzić ilościowo w czasie przebiegu reakcji, jak to np. opisał Salisbury i inni (Międzynarodowa publikacja patentowa nr WO91/03484).

W przypadku syntezy Fmoc korzystnie stosuje się próbę cesarską. W próbie cesarskiej próbkę z każdej probówki można badać za pomocą odczynnika ninhydrynowego dostępnego z

169 616

Pierce Chemical, sposobem opisanym przez Sanna i innych (1981, Anal. Biochem. 117: 147-157)

Jeśli reakcja sprzęganiajest niekompletna, naco wskazuje test, kompletność reakcji można wymusić różnymi sposobami znanymi specjalistom, obejmującymi (a) drugie sprzęganie z wykorzystaniem 1-5-k.rotnego nadmiaru zablokowanego aminokwasu, (b) dodatkowe sprzęganie z wykorzystaniem różnych lub dodatkowych rozpuszczalników (np trifluoroetanu) lub (c) dodatek soli chaotropowych, np NaCJO3 lub LiBr (Klis i Steward, 1990, Peptides Chemistry, Structure and Biology, River and Marshall, Eds , ESCOM Publ., str. 904-906).

Po doprowadzeniu do końca reakcji sprzęgania próbki kombinacji stałofazowy nośnik/pierwszy aminokwas dokładne miesza się. Dokładne wymieszanie uzyskuje się, gdy powstanie jednorodna mieszanina próbek, korzystnie w wyniku wymieszania próbek w jednym reaktorze. Jakkolwiek dowolny sposób dokładnego mieszania objęty jest zakresem niniejszego wynalazku, a specjalistom znane są różne sposoby, to korzystny sposób obejmuje np. miksowanie lub wytrząsanie w dowolnym dostępnym w handlu mechanicznym urządzeniu do wytrząsania, albo tez barbotowanie gazu obojętnego, np. azotu lub argonu.

Uzyskaną mieszaninę dzieli się na co najmniej dwie części, próbki Objętość tych próbek jest taka sama, a jeśli mieszanie zostało przeprowadzone wystarczająco dokładnie, to próbki powinny zawierać zasadniczo takie same ilości kombinacji stałofazowy nośnik/pierwszy aminokwas. Używając dipeptydu jako przykładu, każda z próbek będzie zawierać zasadniczo takie same ilości kombinacji ziarno-glicyna i kombinacji ziarno-prolina

Do każdej próbki wprowadza się oddzielnie drugi zestaw aminokwasów. Ten drugi zestaw może zawierać (a) te same aminokwasy, które dodano w pierwszym zestawie, np glicynę lub prolinę, (b) inny zestaw aminokwasów, np. tryptofan lub leucynę, (c) tylko jeden rodzaj aminokwasu, np. izoleucynę.

Podobnie jak w przypadku pierwszego zestawu aminokwasów, drugi zestaw aminokwasów indywidualnie sprzęga się kompletnie z kombinacją stałofazowy nośnik/pierwszy aminokwas w każdej próbce, uzyskując peptydy zawierające pierwszy aminokwas i drugi aminokwas. Podobnie jak przy pierwszym sprzęganiu, sprzęganie przeprowadzić można dowolną techniką wykorzystywaną w takich reakcjach. Używając przykładowego dipeptydu opisanego powyżej (a) przy dodawaniu takiego samego zestawu aminokwasów uzyskany peptyd stanowi glicynaglicyna, glicyna-prolina, prolina-glicyna lub prolina-prolina; (b) w przypadku innego zestawu aminokwasów uzyskany peptyd stanowi Gly-Trp, Gly-Leu, Pro-Trp lub Pro-Leu, (c) w przypadku jednego rodzaju aminokwasu uzyskany peptyd stanowi Gly-Ile lub Pro-Ile.

Sposób ten powtarzać można tyle razy, ile jest aminokwasów do dodania. Jeśli interesującym peptydem jest tetrapeptyd X-X-X-Trp, gdzie X oznacza np. walinę, serynę lub alaninę, sposób można powtórzyć 3 razy w celu uzyskania tetrapeptydu X-X-X-Trp. W pierwszym, drugim i trzecim wbudowywaniu aminokwasów dodaje się próbek stałofazowego nośnika N“-Fmoc-walmę, N^a-Fmoc-serynę(O-Bu') lub N^a-Fmoc-alaninę, uzyskując 27 różnych peptydów w zasadniczo równomolowych ilościach (fig. 1) Jeśli pożądany heksapeptyd ma zawierać 5 różnych aminokwasów, zgodnie ze sposobem powinno się użyć 5 próbek, z których każda zawiera inny aminokwas, w każdym etapie sprzęgania. Jeśli natomiast heksapeptyd ma zawierać dowolnie z podstawowego zestawu 20 aminokwasów, sposób powinien obejmować stosowanie 20 próbek w każdym etapie.

Do syntezy peptydów wykorzystać można stałofazowe nośniki, do których aminokwas jest, lub jeszcze nie został przyłączony Dodatkowo wykorzystać można łącznik, który już został przyłączony do stałofazowego nośnika. Jednym z powszechnie stosowanych nośników zawierających już związany aminokwas jest żywica β-alanino-PAM (dostępna z Bachem Biochemical) Żywice takie są dostępne z wielu źródeł lub mogą być wytworzone w laboratorium przez specjalistów w dziedzinie syntezy peptydów

Jeśli jako wyjściowy reagent stosuje się kombinację stałofazowy nośnik/aminokwas lub łącznik stała faza/nośnik, dzieli się go na co najmniej dwie próbki, do każdej z których dodaje się aminokwas z pierwszego zestawu aminokwasów. Jak to opisano powyżej, pierwszy zestaw aminokwasów całkowicie sprzęga się z zasadniczo wszystkimi centrami wiązania na kombinacji stałofazowy nośnik/aminokwas lub na łączniku stała faza/nośnik, po czym próbki zawierające

169 616 te nowo dodane aminokwasy dokładnie miesza się ze sobą. Jak to opisano powyżej, mieszaninę dzieli się na co najmniej dwie próbki, po czym do każdej z próbek dodaje się aminokwas z drugiego zestawu aminokwasów i reakcję sprzęgania powtarza się z wytworzeniem rosnącego peptydu. Jak to opisano powyżej, proces ten można powtarzać tyle razy, ile potrzeba do wytworzenia peptydu będącego przedmiotem zainteresowań

Metodę tą można wykorzystać do syntezy peptydów statystycznych a także do syntezy biblioteki peptydów zawierającej wstępnie ustalone sekwencje, Synteza ustalonych sekwencji obejmuje stosowanie określonych N“-Boc-, N“-Fmoc lub w inny sposób odpowiednio zablokowanych aminokwasów w konkretnych etapach sprzęgania. Tak np. można tak dobrać aminokwasy w konkretnych etapach sprzęgania, aby uzyskane peptydy wykazywały prawdopodobieństwo lub preferencję konkretnej struktury drugorzędowej, np. β-paska, α-heliksu, β-skręt itp I tak α-heliks będzie preferowana jeśli jako korzystne aminokwasy zastosuje się Glu, Ala, Leu, His i Trp; z drugiej strony β-paski będą preferowane jeśli zastosuje się Val, Ile, Tyr i Met. Alternatywnie, jeśli zastosuje się Gly, Asn, Pro i Asp, preferowana będzie struktura β-skrętu. Rozważyć można inne ewentualności, takie jak kwaśne aminokwasy w sąsiedztwie końca N i zasadowe aminokwasy w sąsiedztwie końca C, które stabilizują α-spiralę. D-aminokwasy mogą stabilizować pewne skręty, a ponadto wprowadzać można różne inne strukturalne motywy (patrz sekcje 5.2.1. i 5.2.2 poniżej). Można wytwarzać nawet biblioteki peptydów cyklicznych z disiarczkowymi, laktamowymi, laktonowymi lub innymi grupami zamykającymi pierścień (patrz sekcja 5 2.1 poniżej).

Należy podkreślić, ze opisany sposób umożliwia syntezę peptydów tak, że stałofazowy nośnik taki jak ziarno żywicy będzie zawierać jedynie jeden rodzaj peptydu. Sposób zapewnia, ze każde ziarno żywicy kontaktuje się jedynie z jednym aminokwasem podczas każdego cyklu sprzęgania, oraz ze sprzęganie doprowadza się do końca. Synteza typu jedno ziarno - jeden peptyd zapewnia zwiększoną selektywność i wydajność wydzielania peptydu specyficznego dla indywiduum, z których wiąże się.

Opisany sposób można łatwo zaadoptować tak. aby umożliwić syntezę statystycznego zbioru peptydów zawierającego 10⁵-10⁷ różnych rodzajów peptydów.

W jednym z wariantów peptydy z biblioteki mogą zawierać specjalny aminokwas na końcu C, zawierający boczny łańcuch CO2H lub CONH2, co imituje grupę glicynową lub glicyno-amidową. Inny wariant takiego specjalnego podstawnika może stanowić analog D- lub L-aminokwasu z bocznym łańcuchem zawierającym łącznik lub wiązanie z ziarnem. W jednym z wariantów pseudoswobodny C-końcowy podstawnik może wykazywać konfigurację optyczną D lub L; w innym wariancie stosować można racemiczną mieszaninę izomerów D i L.

W dodatkowym wariancie piroglutaminian można zastosować jako N-końcową resztę peptydów z biblioteki. Jakkolwiek piroglutaminian nie jest podatny na sekwencjonowanie na drodze degradacji Edmana, to ograniczając podstawienie N-końcowym piroglutamimanem jedynie do 50% peptydów na danym ziarnie pozostanie do sekwencjonowania wystarczająca ilość peptydu nie-piroglutaminianowego. Specjalista będzie mógł łatwo stwierdzić, ze technika taka może być stosowana do sekwencjonowania dowolnego peptydu, który zawiera podstawnik odporny na degradację Edmana na końcu N Inne sposoby charakteryzowania poszczególnych peptydów wykazujących pożądaną aktywność są opisane poniżej. Aktywność właściwą peptydu zawierającego zablokowaną grupę N-końcową, np. piroglutaminian, gdy konkretna grupa N-końcowa występuje w 50% peptydów, można łatwo zademonstrować porównując aktywności całkowicie (w 100%) blokowanego peptydu i nieblokowanego (w 0%) peptydu

W kolejnym wariancie wybiera się mery peptydów nadające użyteczne właściwości chemiczne i strukturalne. Tak np. peptydy zawierające D-aminokwasy będą odporne naproteazy specyficzne dla L-aminokwasów in vivo. Dodatkowo wynalazek niniejszy obejmuje wytwarzanie bibliotek peptydów o lepiej zdefiniowanych właściwościach strukturalnych, oraz zastosowanie peptydomimetyków i wiązań peptydomimetycznych takich jak wiązania estrowe, do wytwarzania bibliotek o nowych właściwościach. W innym wariancie generować można biblioteki peptydów, które zawierają zredukowane wiązania peptydowe, to znaczy R1-CH2-NH-R2, gdzie R fi R2 oznaczają reszty lub sekwencje aminokwasów. Zredukowane wiązanie peptydowe można wprowadzić jako mer dipeptydowy. Taka cząsteczka byłaby odporna na hydrolizę

191 919 wiązania peptydowego, np przez aktywną proteazę Takie biblioteki zapewniałyby ligandy o unikatowym działaniu i aktywności, np. wydłużony okres półtrwania in vivo z powodu odporności na rozkład metaboliczny lub działanie proteazy Wiadomo również, że w pewnych układach peptydy o nieswobodnej konformacji wykazują zwiększoną aktywność funkcyjną (Hruby, 1982, Life Sciences 31: 189-199; Hruby i inni, 1990, Biochem. J 268 249 - 262); wynalazek mniejszy dostarcza sposobu wytwarzania peptydów o nieswobodnej konformacji, zawierających statystyczne sekwencje we wszystkich innych pozycjach

Peptydy o nieswobodnej konformacji i peptydy cykliczne

Peptyd o nieswobodnej konformacji, cykliczny lub usztywniony peptyd wytworzyć można sposobem opisanym powyżej, pod warunkiem, ze co najmniej w dwóch pozycjach w sekwencjach wszystkich peptydów z biblioteki wstawi się aminokwas lub analog aminokwasu zawierający grupę funkcyjną zdolną do sieciowania, tak aby spowodować nieswobodną konformację, cyklizację lub usztywnienie peptydu po obróbce w celu wytworzenia usieciowania Cyklizacja będzie przeważała, gdy wprowadzi się aminokwas indukujący skręt. Do przykładowych aminokwasów zdolnych do sieciowania peptydu należy cysteina tworząca disiarczki, kwas asparaginowy tworzący lakton lub laktam oraz chelator taki jak kwas γ-karboksyglutaminowy (Gla) (Bachem) chelatujący metale przejściowe z wytworzeniem usieciowania. Zablokowany kwas γ-karboksyglutaminowy wytworzyć można modyfikując syntezę opisaną przez Zee-Chenga i Olsona(1980,Biophys Biochem. Res. Commun. 94: 1128-1132) Biblioteka peptydów, w której sekwencje peptydowe zawierają co najmniej dwa aminokwasy zdolne do sieciowania, poddać można obróbce, np poprzez utlenianie reszt cysteiny z wytworzeniem disiarczku lub dodania jonu metalu w celu wytworzenia chelatu, tak aby usieciować peptyd i wytworzyć peptyd o nieswobodnej konformacji, cykliczny lub usztywniony.

Opisany sposób dostarcza zestawu ogólnych sztywnych motywów do stosowania przy wytwarzaniu bibliotek stosowanych w sposobie według wynalazku W jednym wariancie przedstawionym na fig 2a, wprowadza się dwie pary reszt sieciujących w celu wytworzenia koszyka Taki motyw koszykowy może znaleźć konkretne zastosowanie jako kieszeń katalityczna, oprócz nowych właściwości wiążących wynikających z jego nieswobodnej konformacji W innym wariancie przy dwóch parach reszt sieciujących zaprojektować można motyw drabinkowy, przedstawiony na fig 2b. Stosując na przemian D- i L-aminokwasy w motywie drabinkowym wytworzyć można peptyd, w którym wszystkie łańcuchy boczne będą zorientowane najednej powierzchni, analogicznie do struktury β-baryłki występującej w gramicydynie. Taka powierzchnia może potencjalnie stanowić unikatowe centrum katalityczne W jeszcze innym wariancie wytworzyć można prosty motyw lassa, zgodnie z którym dwie reszty tworzą usieciowanie,jak to przedstawiono na fig. 2c. Oprócz tworzenia pętli peptydowej krótszy motyw lassa będzie powodować powstanie konformacyjna nieswobodność liniowego peptydu, co stabilizuje strukturę drugorzędową, np. α-heliks

Oczywiste jest również, że tworzyć można usieciowania międzypeptydowe, uzyskując w ten sposób sztywną matrycę peptydową.

Opisany sposób dostarcza strategu systematycznego wytwarzania usieciowań. Tak np. jeśli 4 reszty cysteiny wprowadza się do sekwencji peptydu, zastosować można różne grupy blokujące (Hiskey, 1981, w The Peptides. Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 3, Gross i Meienhofer, Eds., Academic Press: New Yozk, str. 137-167; Ponsanti i inni, 1990, Tetrahedron 46: 8255-8266). Pierwszą parę cystern można odblokować i utlenić, po czym drugą parę cystein można odblokować i utlenić. W ten sposób uzyskać można określony zestaw usieciowań disiarczkowych. Alternatywnie wbudować można parę cystein i parę chelatujących analogów aminokwasów, tak że uzyska się usieciowania o różnej naturze chemicznej.

Nieklasyczne aminokwasy indukujące nieswobodną konformację

Do biblioteki statystycznych peptydów można wbudować następujące nieklasyczne aminokwasy w celu zaindukowama określonych motywów konformacyjnych 1,2,3,4-tetrahydroizochinolino-3-karboksylan (Kazmierski i inni, 1991, J Am. Chem. Soc. 113: 2275-2283), (2S,3S)-metylofenyloalanina, (2S,3R)-metylofenyloalanma, (2R,3S)-metylofenyloalamna oraz (2R,3R)-metylofenyloalamna (Kazmierski i Hruby, 1991, Tetrahedron Lett.), kwas 2-aminotetrahydronaftaleno-2-karboksylowy (Landis, 1989, Ph.D. Thesis, University of Arizona); hydro12

169 616 ksy-1,2,3,4-tatrahydroizochinolino-3-karboksylan (Miyake i inni, 1989, J. Takeda Res Labs 43' 53-76), β-karbolina (D i L) (Kazmierski, 1988, Ph D. Thesis, University of Arizona), HIC (kwas histydyno-izochinolinokarboksylowy) (Zechel i inni, 1991, Int. J. Pep Protein Res 43), oraz HIC (histydynomocznik cykliczny) (Dharanipragada).

Do wybranej biblioteki można wprowadzić następujące analogi aminokwasów oraz peptydomimetyki w celu zaindukowama lub faworyzowania określonych struktur drugorzędowych, LL-Acp (kwas LL-3-amino-2-propenidono-6-karboksylowy), analog dipeptydu indukujący βskręt (Kemp 10 inni, 1985, J Org. Chem. 50' 5834-5838) analogi indukujące (-pasek (Kemp i inni, 1988, Tetrahedron Lett. 29 5081-5082), analogi indukujące β-skręt (Kemp i inni, 1988, Tetrahedron Lett. 29' 5057-5060); analogi indukujące α-hehsk (Kemp i inn, 1988' Tetrahedron Lett. 29: 4935-4938); analogi indukujące skręty(Kemp i inni, 1989, J. Org. Chem. 54' 109-115)' oraz analogi opisane w następujących pozycjach literaturowych: Nagi i Sato, 1985, Tetrahedron Lett. 26. 647-650; DiMaio i inni, 1989, J. Chem, Soc Perkin Trans, str 1687; a także analogi skrętu Gly-Ala (Kahn i inni, 1989, Tetrahedron Lett. 30. 2317); izoster wiązania amidowego (Jones i inni, 1988, Tetrahedron Lett. 29: 3853-3856); tetrazol (Zabrocki i inni, 1988, J. Am. Chem. Soc 110' 5875^5^00'); DTC (Samanen i inni, 1990, Int J Protein Pep' Res. 35' 501-509)' oraz analogi podane przez Olsena i innych, 1990, J. Am. Chem. Soc. 112: 323-333 i Gervey’a i innych, 1990, J. Org Chem 56. 436.

Jakkolwiek powyższe nieklasyczne peptydy i peptydomimetyki nie poddają się analizie sekwencyjnej metodą klasycznej degradacji Edmana, kombinację wyjściowej degradacji Edmana, a następnie analizy aminokwasów w pozostałym łańcuchu wykorzystać można do określenia struktury peptydu o pożądanej aktywności Alternatywnie wykorzystać można spektralną analizę masową.

Derywatyzacja i modyfikowanie peptydów w bibliotece

Peptydy w bibliotece można również modyfikować lub derywatyzować. Modyfikacje są dobrze znane specjalistom i obejmują fosforylowanie, karboksymetylowanie oraz acylowame Modyfikacje przeprowadzić można metodami chemicznymi lub anzymatycznymi

W kolejnym wariancie wytwarzać można glikozylowane lub tłuszczowo-acylowane pochodne peptydów. Wytwarzanie glikozylowanych lub tłuszczowo-acylowanych peptydów jest dobrze znane, czego przykład stanowią następujące pozycje literaturowe·

1. Berg i Jeanloz, 1985, w Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry,

Vol. 43, Academic Press.

2. Kunz, 1987, w Ang. Chem, Int, Ed English 26:294-308.

3. Horvat i inni, 1988, Int. J Pept. Protein res 31:499-507.

4. Bardaji i inni, 1990, Ang. Chem. Int. Ed. English 23. 231

5. Toth i inni, 1990, w Peptides: Chemistry, Structure and Biology, Rivier i Marshall, Eds., ESCOM Publ., Leiden, str 1078-1079.

6. Torres i inni, 1989, Experientia 45: 574-576.

7. Torres i inni, 1989, EMBO J. 8: 2925-2932.

8. Hordever i Musiol, 1990, w Peptides: Chemistry, Structure and Biology, loc cit., str. 811-812.

9. Zee-Cheng i Olson, 1989, Biochem. Biphys. Res. Commun. 94: 1128-1132.

10. Marki i inni, 1977, Helv. Chim. Acta., 60:807.

11. Fuju i inni, 1987, J. Chem. Soc. Chem. Commun., str. 163-164.

Ponsati i inni, 1990, Peptides 1990, Giralt i Andreau, Eds., ESCOM Publ., str. 238-240

13. Fuji i inni, 1987, 1988, Peptides: Chemistry, Structure and Biology, Rivier i Marshall, Eds., ESCOm Publ., Leiden, str. 217-219.

Znane są dwie podstawowe klasy wiązań peptydowo-węglowodanowych. Pierwsze wiązanie, eterowe łączy grupę hydroksylową seryny lub treoniny z grupą hydroksylową cukru. Drugie wiązanie, amidowe łączy karboksylanowe grupy glutaminianu lub asparaginianu z grupą aminową cukru. W szczególności pozycje 1 i 2 powyżej przedstawiają sposoby wytwarzania peptydo-węglowodanowych eterów i amidów. Węglowodan z peptydem mogą również łączyć wiązania acetalowe ketalowe.

169 616

Wytwarzać można także tłuszczowo-acylowe pochodne peptydów Przykładowo, ale nie na zasadzie ograniczeń wolną grupę aminową (N-końcową lub lizylową) można acylować, np mirystyloilować. W innym wariancie do peptydów w bibliotece wprowadzać można aminokwas zawierający boczny łańcuch alifatyczny o wzorze (CH2ICH3. Takie i inne konjugaty peptydów z kwasami tłuszczowymi nadające się do wykorzystania w sposobie wytwarzania biblioteki stosowanej w sposobie według wynalazku ujawniono w brytyjskim opisie patentowym GB 8809162.4, międzynarodowym zgłoszeniu patentowym PCT/AU89/00166, oraz w podanej wyżej pozycji literaturowej 5.

Biblioteki statystycznych oligonukleotydów

Jako sposób syntezy wybranej biblioteki złożonej z kwasów nukleinowych zaadaptować można syntezę DNA w fazie stałej metodą fosforamidanową zaproponowaną po raz pierwszy przez Caruthersa (1985, Science 230 281; Caruthers i inni, 1987, Methods of Enzymology 154 287-313).

Zarówno oparty na krzemionce nieprzepuszczalny nośnik polimeryczny jak i zablokowane dezoksynukleozydy są dostępne w handlu (np Peninsula Laboratories, Inc. California, Applied Biosystems, Inc ) Do przykładowych zablokowanych dezoksynukleozydów należy 5'-Odimetoksytnetylodezoksy-tymidyna 5'-O-dimetoksytrietylo-N-benzoiiodezoksycytozyna oraz 5^/-O-dimetoksytrietylo-N-izobutylodezoksyguanozyna. Inne specyficzne grupy blokujące wykorzystywać można w zależności od zastosowania Odpowiednie 3'-fosforoamidany dezoksynukleozydów syntetyzować można, a następnie sprzęgać ze stałofazowym nośnikiem metodą Cruthersa i innych, patrz wyżej). Pierwszy dezoksynukleozyd powinien być związany np. jako dezoksyadenozyna Po odtritylowaniu i przemyciu dichlorometanem, a następnie acetonitrylem stałofazowy nośnik dzieli się na 4 takie same próbki i przenosi do czterech różnych reaktorów. Do czterech oddzielnych reaktorów dodaje się następnie po jednym z czterech 3'-fosforoamidanów dezoksynukleozydów Po zakończeniu sprzęgania stałofazowe nośniki z czterech reaktorów dokładnie miesza się ze sobą, dokładnie przemywa się i poddaje utlenianiu mieszaniną J^/HoO/lutydyna/THF. Po utlenianiu stałofazowy nośnik dokładnie przemywa się acetonitrylem i powyższy cykl powtarza się. Po zakończeniu syntezy statystycznych łańcuchów polidezoksynukleotydowych (np po 11 etapach sprzęgania) grupy estrów metylowych rozszczepia się tiofenem, a grupy DMT rozszczepia się kwasem trichlorooctowym Odblokowane łańcuchy polinukleotydowe zachować można w postaci kowalencyjnie połączonej ze stałofazowym nośnikiem (przy doborze odpowiednich łączników), gotowe do wykorzystania w wybranej metodologu selekcjonowania, jak to przedstawiono poniżej

Można stosować oligonukleotydy z wiązaniami innymi niż fosforodiestrowe. Tak np. oligonukleotyd może zawierać połączenie fosforotionianowe Znane są inne modyfikowane wiązania fosfodiestrowe lub analogi wiązań Wiadomo, że takie modyfikowane wiązania są odporne na działanie egzonukleaz i endonukleaz.

W związku z tym, ze w każdym etapie sprzęgania stosuje się jedynie cztery nukleozydy DNA lub RNA, w bibliotece z 12 zasad nukleozydowych będzie 4¹ możliwych sekwencji polinukleotydów czyli łącznie 1,68 x 10⁷ możliwości. Oligonukleotyd można-również syntetyzować stosując zarówno nukleozydy DNAjak i RNA. Specjaliści /ro/umleją również, ze oprócz podstawowych nukleozydów można także stosować nukleozydy niezwyczajne i modyfikowane Do niezwyczajnych i modyfikowanych nukleozydów należy inozyna, metylowane nukleozydy purynowe, pochodne urydyny oraz 2'-0-metyloryboza, która może występować w dowolnym rybonukleozydzie.

Stałofazowe nośniki i łączniki do stosowania w bibliotece statystycznych biooligomerów, stosowane w sposobie według wynalazku

Stałofazowe nośniki stosowane do generowania biblioteki stosowanej w sposobie według wynalazku powinny być obojętne w warunkach reakcji przy syntezie biooligomerów, to znaczy przy syntezie peptydów i/lub syntezie oligonukleotydów, Stałofazowy nośnik musi zawierać grupy reaktywne umożliwiające przyłączenie meru, albo przyłączenie łącznika lub umocowania, które może służyć jako wyjściowy punkt wiązania meru. W jednym wariancie stałofazowy nośnik może nadawać się do stosowania in vivo, to znaczy służyć jako nośnik lub podłoże przy bezpośrednich zastosowaniach biblioteki biooligomerów (np Tentagel, Rapp Polymera, Tubin14

169 616 gen, Niemcy; patrz sekcja 5 8, poniżej). W konkretnym wariancie stałofazowy nośnik może być przyjemny w smaku i nadawać się do spożycia. W innym wariancie stałofazowy nośnik może stanowić użyteczny nośnik chromatograficzny.

W użytym znaczeniu określenie stałofazowy nośnik nie ogranicza się do określonego typu nośników Dostępna jest raczej i znana specjalistom duża liczba nośników. Do stałofazowych nośników należą żele krzemionkowe, żywice, folie z tworzyw sztucznych z grupami funkcyjnymi, ziarna szklane, bawełna, ziarna z tworzyw sztucznych, żele tlenku glinu. Odpowiedni stałofazowy nośnik może być wybrany w oparciu o pożądane ostateczne zastosowanie i przydatność w różnych procesach syntezy. Tak np w przypadku syntezy peptydów stałofazowy nośnik może stanowić żywica taka jak polistyren (np, żywica PAM dostępna z Bachem Inc., Peninsula Laboratories itp.), żywica POLYHIPE® (dostępna z Aminotech, Kanada), żywica poliamidowa (dostępna z Peninsula Laboratories), żywica polistyrenowa szczepiona glikolem polietylenowym (TentaGel® , Rapp Polymere, Tubingen, Niemcy) lub żywica polidimetyloakrylamidowa (dostępna z Milligen/Bioserch, Kalifornia). W korzystnym wariancie dotyczącym syntezy peptydu stałofazowy nośnik stanowi żywica polidimetyloakryloamidowa. Stałofazowe nośniki mogą również zawierać łącznik. W użytym znaczeniu łącznik oznacza dowolną cząsteczkę, która stanowi odstęp między nośnikiem i syntetyzowanym peptydem. Łączniki mogą być kowalencyjnie przyłączone do stałofazowego nośnika przed sprzęganiem z N“-Boc- lub N^aFmoc lub w inny odpowiedni sposób blokowanymi aminokwasami. Różne łączniki zastosować można w celu przyłączenia oligomeru do stałofazowego nośnika. Do przykładowych łączników należy kwas aminomasłowy, kwas aminokapronowy, kwas 7-aminoheptanowy oraz kwas 8-aminokaprylowy. .Kwas Fmoc-aminokapronowy jes t dostępny w handlu z Bachem Blochem i stanowi korzystny wariant. W innym wykonaniu łączniki mogą zawierać dodatkowo jedną lub więcej β-alanin jako przekładki. Na dodatek stały nośnik może być modyfikowany tak, aby spełnić określone wymagania w konkretnym celu przy biooznaczeniach lub detekcji, Modyfikację statofazowego nośnika wykonać można wprowadzając odpowiedni wrażliwy na kwas, wrażliwy na zasadę, nukleofilowo-wrażliwy, elektrofilowo-wrażliwy, fotoczuły, wrażliwy na utlenianie lub wrażliwy na redukcję.

Oprócz łączników opisanych powyżej stosować można selektywnie rozszczepiane łączniki Zastosowanie łącznika wrażliwego na promieniowanie nadfioletowe, ONb, przedstawione jest poniżej (patrz Barany i Albericio, 1985, J. Am. Chem. Soc. 107: 4936-4942). Inne rozszczepialne łączniki wymagają hydrogenohozy lub fotoliozy. Przykłady fotoczułych (fotorozszczepia^ych) łączników podaje Wang (1976, J. Org. Chem. 41 · 32-58), Hammer i inni (1990, Int. J. Pept. Protein Res. 36:31045) oraz Kreib-Cordonier i inni (1990, w Peptides-Chemistry, Structure and Biology, Rivier i Marshall, Eds., str 895-897). Landen (1977. Methods Enzym. 47: 145-1490) zostosował uwodniony kwas mrówkowy do rozszczepienia wiązań Asp-Pro; takie rozwiązanie zastosowano do charakteryzowania determinant komórek T, w połączeniu z metodą syntezy szpilkowej Geysena(Van derZee i inni, 1989, Eur. J. Immunol, 119. 43-47). Do innych potencjalnych grup łączących rozszczepialnych w warunkach zasadowych należą łączniki oparte na kwasie p-(hydrokaymetylo)benzoeaowym (Atherton i inni, J. Chem. Soc. Perkin 1:538-546) oraz kwasie hydroksyoctowym (Baleaux i inni, 1986, Int. J. Pept. Protein Res. 28: 22-28) Geysen i inni (1990, J. Immunol. Methods 134: 23-33) donosi o rozszczepianiu peptydu według mechanizmu diketopiperazynowego. Enzym może specyficznie rozszczepić łącznik, zawierający sekwencję, która jest wrażliwa lub stanowi substrat dla enzymu, dotyczy to proteazowego rozszczepiania peptydu lub endonukleazowego rozszczepiania oligonukloetydu. W pewnych przypadkach można derywatyzować 10-50% żywicy, stosując podstawienie rozszczepialnym łącznikiem, a pozostałe 50-90% podstawić nierozszczepialnym łącznikiem, tak aby po przeprowadzeniu rozszczepienia łącznika zapewnić pozostanie odpowiedniej ilości peptydu w celu dokonania sekwencjonowania. Zastosować można również kombinacje łączników tak, aby umożliwić kolejne rozszczepianie od jednego ziarna.

Stałofazowy nośnik stosowany do generowania biblioteki może zawierać ponadto biooligomer, stanowiący przedmiot zainteresowania, do którego dodać można statystyczną sekwencję merów Wstępnie przyłączony biooligomer wyselekcjonować można opisanymi metodami.

169 616 albo też może on zawierać sekwencję, odnośnie której wiadomo, ze wykazuje pożądane właściwości

W syntezie oligonuklρotedów korzystnie można zastosować dtałofazowe nośnik oparty na krzemionce Jak to podano powyżej, stałofazowρ nośniki oparte na krzemionce są dostępne w handlu (np z Peniasula Laboratories, Inc ; oraz z Applied Biosystems, Inc.).

Metody detekcji i identyfikacji biooligomerów będących przedmiotem zainteresowania

Selekcjonowanie biblioteki biooligomerów pozwala na zidentyfikowanie tych biooligomerów z biblioteki, które wykazują aktywność biologiczną będącą przedmiotem zainteresowania, taką jak wiązanie, stymulowanie, lnhibltowoale, toksyczność, smak itp Sposobami opisanymi poniżej można również poddawać selekcjonowamu inne biblioteki biooligomerów pod względem aktywności enzymatycznej, aktywności w iahibitowaaiu enzymów oraz właściwości chemicznych i fizycznych będących przedmiotem zαiateresowαaia.

Biooligomery będące przedmiotem zainteresowania, wykryte we wstępnym selekcjonowaniu nie muszą być ostatecznie Ugandami. W rzeczywistości korzystne jest zdentptyaowanip drugiej biblioteki opartej na wspólnych sekwencjach ligandów wybranych podczas pierwszego selekcjonowania W ten sposób będzie można zidentyfikować Ugandy o nawet jeszcze wyższej aktywności, pod warunkiem ze drugie selekcjonowanie wykonuje się w o wiele ostrzejszych warunkach

Próby wiązania

Sposób według wynalazku umożliwia identyfikację ligandów biooligomerów wiążących cząsteczki akceptorowe W użytym znaczeniu określenie, cząsteczka akceptorowa dotyczy dowolnej substancji, która wiąże się z ligandem biooligomerycznym, Jako cząsteczki akceptorowe stosuje się korzystnie przeciwciała, receptory, bakterie lub wirusy Cząsteczkami akceptorowymi mogą być korzystnie związki chemiczne takie jak białka, węglowodany, kwasy nukleinowe, lipidy, leki, ortometale.

Biblioteka biooligomerów stosowana w sposobie według wynalazku może potencjalnie oddziaływać z wieloma różnymi cząsteczkami akceptorowymi Identyfikując konkretne rodzaje biooligomeru, z którymi wiąże się określona cząsteczka akceptorowa, można na drodze fizycznej wydzielić rodzaje biooligomeru będące przedmiotem aaiateresowamα.

W związku z tym, ze niewielka ilość ziaren będzie usuwana w czasie każdego etapu selekcji/detekcji/wydaielaaia, większość ziaren pozostanie w zbiorze. Dlatego tez bibliotekę statystycznych biooligomerów można ponownie wykorzystać szereg razy. Jeśli różne zabarwienie lub schematy identyfikacji wykorzystuje się w przypadku różnych cząsteczek akceptorowych (np. akceptorów znaczonych związkami powodującymi fluorescpncję), takimi jak fluorescma (zielona barwa), czerwień teksaska (czerwona) lub DAPI (błękitna), oraz zastosuje się odpowiednie filtry wzbudzające w mikroskopie fluorescencyjnym lub w detektorze fluorescpncji, do biblioteki peptydów można będzie dodać różne akceptory (receptory) i dokonywać oceny równocześnie, co ułatwia szybkie selekcjonowanie w odniesieniu do konkretnego ligandu. Takie strategie nie tylko zmniejszają koszty, ale również zwiększają liczbę cząsteczek akceptorowych, które można wyselekcjonować.

Zgodnie ze sposobem według wynalazku cząsteczkę akceptorową będącą przedmiotem zainteresowania wprowadza się do biblioteki biooligomprów, gdzie rozpoznaje ona i wiążpjpden lub więcej rodzajów biooligomeru Każdy rodzaj biooligomeru, z którym wiąże się cząsteczka akceptorowa, można będzie znalezć na pojedynczym stałofazowym nośniku, tak ze nośnik ten, a więc i biooligomer, można będzie łatwo zidentyfikować i wydzielić.

Biooligomer wydzielić można dowolnymi sposobami znanymi specjalistom, przy czym wynalazek nie jest ograniczony sposobem wydzielania. Tak np., ale nie wyłącznie, można wydzielić na drodze fizycznej taką kombinację stαłofozowy aośaik/biooligomer, która wykazuje aajsilniejsae oddziaływanie fizykochemiczne z cząsteczką akceptorową. W jednym wariancie, opartym na oddziaływaniu fizykochemicznym, roztwór określonych cząsteczek akceptorowych dodaje się do biblioteki statystycznych peptydów, zawierającej około 10⁵ - 10⁷ stałofazowech nośników. Cząsteczkę akceptorową inkubie się z żywicą przez okres czasu niezbędny do zajścia sprzęgania między peptydem i przeciwciałem, np przez 1 godzinę w 22°C Następnie wydziela się kombinację bioollgomer/stałofazowe nośnik pokrytą cząsteczką akceptorową Dokładniejsze

169 616 warianty przedstawione są poniżej w metodach, które opisują zastosowanie monoklonalnego przeciwciałajako rozpuszczalnej cząsteczki akceptorowej. Oczywiste stanie się, że metody takie można łatwo zaadaptować do wykrywania wiązania dowolnej cząsteczki akceptorowej Ponadto, jakkolwiek poniższy opis dotyczy bibliotek peptydów, zrozumiałe jest, ze oceniać można także biblioteki oligonukleotydów lub chimer peptyd-oligonukleotyd.

(i) Monoklonalne przeciwciało znaczy się najpierw grupą fluorescencyjną lub fluorosceinuje się technikami dobrze znanymi specjalistom. Przeciwciało o stężeniu 1 gg/ml wprowadza się następnie do biblioteki peptydów i po łagodnym wymieszaniu w 22°C przez 1 godzinę, stałofazowe nośniki przemywa się i kombinacje fluorescencyjnego przeciwciała ze stałofazowym nośnikiem/peptydem identyfikuje się i oddziela w sortowniku komórek aktywowanym fluorescencyjnie. Alternatywnie kombinacje fluorescencyjnego przeciwciała ze stałofazowym nośnikiem/peptydem identyfikuje się i selekcjonuje się na drodze fizycznej pod mikroskopem operacyjnym z przystawką fluorescencyjną, za pomocą mikromanipulatora Względna intensywność fluorescencji jest zazwyczaj proporcjonalna do powinowactwa peptydu-ligandu do odnośnych monoklonalnych przeciwciał.

(ii) Monoklonalne przeciwciała najpierw koniuguje się ziarnach ferromagnetycznych, powszechnie stosowanych. Skoniugowane przeciwciała o stężeniu 1 gg/ml inkubuje się następnie z biblioteką przez 1 godzinę w 22°C. Magnetyczne ziarna tworzą rozetę wokół stałofazowego nośnika/peptydu będącego przedmiotem zainteresowania, którą można następnie oddzielić na drodze fizycznej za pomocą silnego magnesu.

(iii) Monoklonalne przeciwciała najpierw koniuguje się z enzymem takim jak fosfataza alkaliczna, znanymi sposobami. Taki koniugat przeciwciało/enzym inkubuje się następnie w bibliotece statystycznych peptydów przez 30 minut - 1 godzinę w 22°C Po przemyciu całość biblioteki wylewa się na szalki Petriego zawierającego substrat dla fosfatazy alkalicznej, np. 5-bromo-4-chloro-3-indoilofosforan (BCIP) oraz nitrobłękitne tetrazoleum (NBT). Po inkubowaniu przez kilka minut kombinacja stałofazowy nośnik/peptyd zmienia barwę (staje się błękitna) ze względu na wytrącanie się przekształconego substratu na stałofazowym nośniku, tak ze można ją łatwo zidentyfikować i oddzielić na drodze fizycznej pod mikroskopem operacyjnym za pomocą mikromanipulatora. Względna intensywność reakcji barwnej jest zazwyczaj proporcjonalna do powinowactwa peptydu-ligandu do odnośnych monoklonalnych przeciwciał (iv) Monoklonalne przeciwciała koniuguje się najpierw z enzymem takim jak peroksydaza chrzanowa znanymi sposobami Taki koniugat przeciwciało/enzym inkubuje się następnie w bibliotece statystycznych peptydów przez 30 minut - 1 godzinę w 22°C Po przemyciu całość biblioteki wylewa się na szalki Petriego zawierające substrat dla peroksydazy, np. 3,3', 4, 4'-diaminobenzydynę (DAB); 3,3', 5,5'-tetrametylobenzydynę (TMB); lub 4-chloro-1 -naftol (4CN) PO inkubowaniu przez kilka minut kombinacja stałofazowy nośnik/peptyd zmienia barwę, tak że można ją łatwo zidentyfikować i oddzielić na drodze fizycznej pod mikroskopem operacyjnym za pomocą mikromanipulatora. Względna intensywność reakcji barwnej jest zazwyczaj proporcjonalna do powinowactwa peptydu-ligandu do odnośnych monoklonalnych przeciwciał.

(v) Monoklonalne przeciwciała znaczy się najpierw biotyną czyli biotynyluje się znanymi sposobami, po czym inkubuje się w bibliotece statystycznych peptydów przez 30 minut - 1 godzinę w 22°C Po przemyciu dodaje się kompleks streptowidyny z peroksydazą chrzanową i całość inkubuje się przez 30 minut. Nośnik przemywa się następnie, po czym zabarwienie wywołuje się metodą enzymatyczną, jak to opisano powyżej w metodzie (iii). Kombinację peptyd/stałofazowy nośnik będącą przedmiotem zainteresowania oddziela się na drodze fizycznej, jak to opisano powyżej.

Oprócz stosowania rozpuszczalnych cząsteczek akceptorowych, w innym wariancie wykrywać można biooligomery wiążące się z powierzchniowymi receptorami komórek z wykorzystaniem komórek dziewiczych Zastosowanie komórek dziewiczych jest korzystne w przypadku receptorów, które są wielomerowe, nietrwałe, albo w przypadku receptorów, które wymagają funkcjonowania domeny lipidowej w błonie komórkowej W technice tej można stosować komórki żywe lub unieruchomione Komórki inkubuje się z biblioteką statystycznych peptydów,

169 616 tak że wiążą one pewne peptydyz biblioteki tworząc rozetę między komórkami docelowymi i odnośnym stałofazowym nośnikiem/peptydem Rozetę można następnie oddzielić na drodze różnicowego wirowania lub wydzielić na drodze fizycznej pod mikroskopem operacyjnym

Alternatywnie dokonać można selekcji biblioteki z wykorzystaniem techniki panwiowej stosując linie komórek takie jak (i) rodzicielska linia komórek, w których na powierzchni komórek nie występują receptory będące przedmiotem zainteresowania, oraz (11) receptoro-dodatnią linię komórek, to znaczy linię komórek uzyskaną w wyniku transfekcji linii rodzicielskiej genem kodującym receptor będący przedmiotem zainteresowania. Można następnie przeprowadzić selekcję biblioteki z wykorzystaniem następującej strategu: (i) najpierw usuwa się z biblioteki niespecyficzne ziarna, które będą wiązać się z komórkami nie zawierającymi receptora, w wyniku wprowadzenia monowarstwy rodzicielskiej linii komórek z wykorzystaniem standardowej techniki panwiowej, pozostawiając specyficzne względem receptoranie wiążące ziarna, czyli ziarna niezwiązane, (11) usuwa się ziarna nie wiążące, do których należą zarówno ziarna specyficzne względem receptora jak i ziarna nie związane i wprowadza się je na monowarstwę receptorowo-dodatniej linii komórek, w wyniku czego ziarna specyficzne względem receptora będą wiązać się z receptoro-dodatnią linią komórkową, (iii) usuwa się pozostałe nie związane i niewiążące ziarna na drodze łagodnego przemywania i dekantacji oraz (iv) usuwa się ziarno (perełkę) specyficzne względem receptora, za pomocą mikromanipulatora

Jako alternatywę w stosunku do prób z całymi komórkami w odniesieniu do receptorów związanych w błonie lub receptorów wymagających funkcjonowania domeny lipidowej w błonie komórkowej, odtworzyć można cząsteczki receptorowe w lipozomach, do których przyłączyć można grupę raportową lub enzym

Jakkolwiek powyższe przykłady odnoszą się do ligandów peptydowych, do realizacji sposobu według wynalazku można wykorzystać dowolny z biooligomerów opisanych powyżej I tak cząsteczki akceptorowe można wiązać z peptydami nieklasycznymi, ukołowionymi, zmodyfikowanymi lub o nieswobodnej konformacji, z oligonukleotydami lub z chimerami peptydoligonukleotyd

W jednym wykonaniu cząsteczka akceptorowa może być bezpośrednio znaczona. W innym wariancie zastosować można znaczony drugorzędowy reagent do wykrywania wiązania cząsteczki akceptorowej ze stałofazowym nośnikiem zawierającym biooligomer będący przedmiotem zainteresowania Wiązanie można wykryć poprzez wytwarzanie chromoforu in situ przez znacznik enzymatyczny Do odpowiednich enzymów należy, ale nie wyłącznie, alkaliczna fosfataza i peroksydaza chrzanowa W innym wariancie przeprowdzić można próbę dwubarwną z wykorzystaniem dwóch chromogenicznych substratów z dwoma znacznikami enzymatycznymi na różnych cząsteczkach akceptorowych będących przedmiotem zainteresowania. Za pomocą próby dwubarwnej zidentyfikować można ligandy reagujące krzyżowo i reagujące prosto.

Do innych znaczników stosowanych zgodnie z wynalazkiem należą barwione ziarna lateksowe, ziarna magnetyczne, znaczniki fluorescencyjne (np izotiocyjanian fluorescenu (FITC), fikaerytryna (PE), czerwień teksaska (TR), rodamina, swobodne lub chelatowane sole z serii lantanowców, cząsteczki chemiluminescencyjne, radioizotopy lub znaczniki tworzące obraz w rezonansie magnetycznym. Próby dwubarwne przeprowadzić można stosując dwa lub więcej rodzajów barwionych ziaren lateksu lub fluorofory emitujące przy różnych długościach fali Znaczone ziarna można wydzielać ręcznie lub mechanicznie. Do sposobów mechanicznych należy sortowanie aktywowane fluorescencją, np analogiczne do FSCS, oraz usuwanie za pomocą mikromanipulatorów.

W konkretnych przykładach zamieszczonych poniżej zastosowano znaczniki enzym-chromogram oraz znaczniki fluorescencyjne (FITC).

Reaktywne ziarna można wydzielać, wymieniając kilka kryteriów, na podstawie intensywności znacznika, np intensywności barwy, intensywności fluorescencji, mocy magnetycznej. Najintensywniej znaczone ziarna można wybrać i poddać sekwencjonowaniu lub charakteryzować w inny sposób, np metodą spektralnej analizy masowej. W innym wariancie wybrać można i poddać sekwencjonowaniu statystyczny zbiór ziaren o intensywności znacznika powyżej arbitralnie ustalonej granicy Ewentualnie można wykorzystać nowoczesną mikroskopię z analizowaniem obrazu do ilościowego ustalania intensywności barwy i na tej podstawie dokład18

191 919 nie ustalić względne powinowactwo ligandu w stosunku do cząsteczki akceptorowej przed dokonaniem analizy sekwencyjnej ziarna. Można także wykorzystać ilościową mikroskopię immunofluorescencyjną, jeśli akceptor znaczony jest znacznikiem fluorescencyjnym. Wjeszcze innym wariancie ziarna wykazujące pewną intensywność znacznika wybiera się w celu wykonania analizy składu, to znaczy ustalenia składu aminokwasów. Na podstawie analizy składu wytworzyć można i wyselekcjonować wybraną bibliotekę zawierającą ograniczony zestaw merów zidentyfikowanych jako istotne.

Zgodnie z innym wariantem biooligomer(y) o największym powinowactwie wiązania, to znaczy o stałej wiązania, identyfikować można stopniowo rozcieńczając cząsteczki akceptorowe będące przedmiotem zainteresowania, aż wykryje się wiązanie jedynie kilku stałofazowych nośników z biblioteki. Alternatywnie zwiększyć można moc roztworu wiążącego lub, w przypadku kwasów nukleinowych, hybrydyzację docelowym kwasem nukleinowym czyli cząsteczką akceptorową. Dla specjalistów zrozumiałe jest, że moc wiązania lub hybrydyzację można zwiększyć (i) zwiększając siłę jonową roztworu; (ii) zwiększając stężenie związków denaturujących takich jak mocznik, (iii) podwyższając lub obniżając pH w stosunku do obojętnego (pH 7); lub(iv) w przypadku kwasów nukeinowych, dochodząc do T_m (temperatury topnienia). Inne sposoby zmieniania warunków w roztworze w celu ograniczenia wiązania do oddziaływań o wysokim powinowactwie są powszechnie znane Duże rozcieńczenie lub wysoką silę wiązania cząsteczki akceptorowej ze stałofazowym nośnikiem/biooligomerem wykorzystać można do wykrywania ligandu będącego przedmiotem zainteresowania w statystycznej bibliotece obejmującej wszystkie lub prawie wszystkie możliwe mery, albo w ograniczonej, rafinowanej bibliotece.

Zgodnie z jeszcze innym wariantem przedmiotem zainteresowania mogą być biooligomery wykazujące małe powinowactwo wiązania Można je wyselekcjonować usuwając najpierw wszystkie biooligomery o wysokim powinowactwie wiązania, a następnie wykrywać wiązania w warunkach mniej drastycznych lub przy mniejszym rozcieńczeniu.

W korzystnym wariancie przeprowadzić można próbę podwójnego znaczenia Pierwszy znacznik zastosować można w celu wykrycia niespecyficznego wiązania cząsteczki akceptorowej będącej przedmiotem zainteresowania z ziarnami w obecności rozpuszczalnego ligandu. Znaczone ziarna usuwa się następnie z biblioteki, po czym usuwa się rozpuszczalny ligand Z kolei wykrywa się specyficzną cząsteczkę akceptorową dla pozostałych ziaren. Należy oczekiwać, ze biooligomery na takich ziarnach będą wiązać cząsteczkę akceptorową w tym samym miejscu co ligand będący przedmiotem zainteresowania i w związku z tym będą imitować ligand będący przedmiotem zainteresowania. Próba podwójnego znaczenia ma tę zaletę, ze cząsteczka akceptorowa będąca przedmiotem zainteresowania nie musi być oczyszczana, gdyż pierwszy etap próby umożliwia usunięcie niespecyficznie dodatnio reagujących ziaren.

Imitacje enzymów/inhibitory enzymów

Wynalazek niniejszy dotyczy także biooligomerów, które katalizują reakcje, to znaczy bibliotek enzymów, które służą jako koenzymy lub które inhibitują reakcje enzymatyczne. W związku z tym wynalazek dostarcza metod oceny aktywności enzymatycznej lub ko-enzymatycznej, albo inhibitowania aktywności enzymatycznej.

Aktywność enzymatyczną zaobserwować można w wyniku powstawania wykrywalnego produktu reakcji. W konkretnym wariancie biooligomer z biblioteki katalizuje reakcję enzymatyczną substratu fosfatazy alkalicznej, fosforanu 5-bromo-4-chloro-3-indoilu (BCIP), w której powstaje błękitny, nierozpuszczalny produkt reakcji na stałofazowym nośniku (patrz przykład VI poniżej)

W innym wariancie w półstałej matrycy może tworzyć się strefa dającego się zaobserwować produktu, np. zabarwienie lub fluorescencja. Warstwę biblioteki nanosi się półstałą matrycę, np, na żel agarozowy, po czym dodaje się chromogeniczny lub innego typu indykatorowy substrat. Gdy biooligomer/stałofazowy nośnik wykazuje pożądaną aktywność enzymatyczną, powstanie strefa produktu. Tak np., ale nie wyłącznie, biooligomeryczny analog peroksydazy chrzanowej można zidentyfikować dodając roztwór aminoantypirenu (0,25 mg/ml; Kodak), fenol (8 mg/ml) i H2O2 (0,005%) w 0,1M buforze fosforanowym, pH 7,0. Ziarna wykazujące aktywność enzymatyczną będą tworzyć strefę o zabarwieniu purpurowym. W innym wariancie

169 616 biooligomery/ziarna wykazujące aktywność proteazową można zidentyfikować dodając dobrze znane kolorymetryczne substraty proteazy

Aktywność koenzymatyczną zaobserwować można oceniając aktywność enzymu z pośredniczeniem koenzymu, gdy naturalny lub zwykły koenzym nie jest obecny.

Aktywność inhibitowania enzymu można wykryć częściowo uwolnionym biooligomerem. Uwalnianie biooligomerów przedstawiono powyżej Przykładowo, ale nie wyłącznie, bibliotekę biooligomerów nanieść można w formie warstwy na półstałą matrycę zawierającą enzym. Bibliotekę poddaje się obróbce częściowo uwolnionym biooligomerem. Gdy biooligomer inhibituje aktywność enzymu, zidentyfikować można strefę, w której nie ma produktu W jednym wariancie substrat enzymu jest chromogeniczny i powstaje barwny produkt. W związku z tym obecność enzymu spowoduje powstanie strefy bez zabarwienia, W innym wariancie inhibitowanie proteolizy hemoglobiny lub indykatorowy enzym taki jak fosfatazę alkaliczną wykryć można na podstawie nieprzezroczystej strefy w półstałej matrycy Jest to spowodowane tym, że inhibitor proteolizy będzie zapobiegać degradacji hemoglobiny lub enzymu indykatorowego

Specjaliści dobrze wiedzą, ze biooligomer, który wykazuje aktywność enzymatyczną, aktywność koenzymu lub inhibituje aktywność enzymatyczną, może stanowić peptyd, oligonukleotyd lub chimera pepty-oligonukleotyd. Szczególnie interesujące są peptydy o nieswobodnej konfiguracji lub cykliczne, które mogą tworzyć unikatową katalitycznie wiążącą kieszeń lub powierzchnię, jak opisano wyżej Można również oczekiwać, ze chimera peptyd-oligonukleotyd będzie wykazywać unikatowe właściwości chemiczne, takie jak aktywność enzymatyczna lub ko-enzymatyczna, z uwagi na wyjątkowe zestawienie odpowiednich grup funkcyjnych Ponadto przewiduje się, że biooligomer/stałofazowy nośnik może wykazywać aktywność enzymatyczną lub ko-enzymatyczną, gdy wolny biooligomer nie będzie wykazywać aktywności Jest to spowodowane tym, ze nagromadzenie dużej gęstości biooligomeru może nadać unikatowe właściwości chemiczne kombinacji biooligomer/stałofazowy nośnik Przewiduje się także, że biooligomer może wykazywać aktywność enzymatyczną lub ko-enzymatyczną po uwolnieniu z ziarna. Przewiduje się, że znane koenzymy (koczynniki) można wbudowywać chemicznie do biooligomeru o nieswobodnej konformacji w celu stymulowania prostego lub złożonego enzymu obejmującego np łańcuch przenoszący elektrony.

Metody charakteryzacji biooligomeru

Poza wybraniem ziarna zawierającego biooligomer będący przedmiotem zainteresowania dowolnym ze sposobów przedstawionych powyżej wynalazek niniejszy dostarcza sposobu ustalania budowy i sekwencji biooligomeru

Gdy biooligomer stanowi peptyd, korzystny sposób sekwencjonowania stanowi degradacja Edmana Szczególnie korzystną metodę wykorzystuje sekwenator Applied Biosystems 477A Protem Sequencer. Sekwencję aminokwasów w peptydach można również wyznaczyć metodą spektroskopu masowej z bombardowaniem szybkimi atomami (FAB-MS) lub innymi metodami analitycznymi.

Peptydy można sekwencjonować zarówno wtedy, gdy są połączone ze stałym nośnikiem jak i po odszczepieniu W celu odszczepienia peptydu wydzielone ziarna z peptydami poddaje się obróbce środkami rozszczepiającymi znanymi specjalistom z tego, ze oddzielają polimer od stałofazowych nośników. Rodzaj wybranego środka rozszczepiającego zależy od rodzaju stosowanego nośnika stałofazowego. Tak np. w celu odszczepienia peptydu od żywicy Wang korzystnie stosuje 50% kwas trifluorooctowy (TFA) w dichlorometanie.

Alternatywnie, można oddzielić pojedynczy stałofazowy nośnik taki jak ziarno, z przyłączonymi do niego biooligomerami i wprowadzić ziarno do sekwenatora bez uprzedniego odszczepienia biooligomerów od ziaren. Tak np jeśli biooligomer stanowi peptyd, ocenia się, że pojedyncze ziarno żywicy o średnicy 100 Lim z podstawieniem 0,5 milirównoważnika (mEq)g żywicy, zawiera około 200 pmoli peptydu Pojedyncze ziarno żywicy PAM o średnicy 250 mm przy podstawieniu 0,5 mEq/g żywicy zawiera około 3125 pmoli peptydu W przypadku nowoczesnych sekwenatorów peptydów w celu wykonania prawidłowego sekwencjonowania potrzeba jedynie 5-10 pmoli Z tego względu jeden standardowy nośnik żywicy PAM o średnicy 1θ0 Lim zawiera peptyd w ilości większej od wymaganej do sekwencjonowania

169 616

W przypadku gdy peptydy zawierają aminokwasy lub peptydomimetyki, które nie poddają się analizie Edmana, uzyskać można takie ziarno, na którym 10-50% peptydów nie zawiera reszt nie dających się sekwencjonować. Ustalić można resztę sekwencji i na tej podstawie dokonać można ekstrapolacji sekwencji zawierającej resztę nie dającą się sekwencjonować.

Inne podejście w przypadku reszt nie dających się sekwencjonować polega na przejściowym zakończeniu części peptydu przed wprowadzeniem nie ulegającej sekwencjonowaniu reszty w czasie syntezy biblioteki Podczas prowadzonej potem identyfikacji strukturalnej zastosować można degradację Edmana aż do reszty nie ulegającej sekwencjonowaniu, po czym odblokowuje się tymczasowe zakończenie i odtwarza resztę sekwencji, od końca C do reszty nie ulegającej sekwencjonowamu.W przypadku oligonukleotydów sekwencjonowame przeprowadzić można za pomocą zautomatyzowanego sekwenatora oligonukleotydów (np. Applied Biosystems). Korzystną alternatywę stanowi technika Maxama i Gilberta (1977, Proc. Natl. Acad Sci. USA 74: 560-564) Zastosować można również inne znane metody sekwencjonowama oligonukleotydów

Spektroskopia z bombardowaniem szybkimi atomami stanowi chyba najskuteczniejszą metodę analizy strukturalnej. Dzięki wykrywaniu fragmentów, a także rodzajów biooligomerów zrekonstruować można sekwencję. Dane odnośnie struktury i sekwencji dostarcza również wysokosprawna spektroskopia masowa wysokiej typu electrospray (Finnigan MAT).

Po ustaleniu sekwencji wybranego biooligomeru znacznąjego ilość można zsyntetyzować na drodze chemicznej z wykorzystaniem zautomatyzowanego syntezatora peptydów lub innymi sposobami syntezy biologicznej lub chemicznej, Na dodatek po zidentyfikowaniu sekwencji biooligomeru stosować można podstawienie analogami merów w celu wzmocnienia aktywności konkretnego biooligomeru.

Przykład I Synteza biblioteki tetrapeptydów.

Sposób według wynalazku wykorzystano do syntezy rodziny tetrapeptydów o wzorze X-X-X-Trp, w którym X oznacza wahnę, serynę lub alaninę, a pierwszy aminokwas stanowi zawsze tryptofan,. Tryptofan wprowadzano na końcu karboksylowym w celu ułatwienia monitorowania spektrofotometrycznego przy OD280.

Żywicę Ne-Fmoc-tryptofano-alkoksymetylo-polistyrenową opisaną przez Wanga (1973, J Am. Chem. 95 1328-1333) otrzymano z Bachem Inc , Torrence, Ca. i umieszczono w standardowym naczyniu do syntezy peptydów w fazie stałej. Dodawanymi aminokwasami były również Fmoc-modyfikowane aminokwasy otrzymane w Bachem Inc. Innymi reagentami były zasadniczo takie same reagenty, które wykorzystuje się rutynowo w syntezie w fazie stałej, opisanej przez Austena (1988, Peptide Synthesis Methods in Molecular Biology, vol. 3, str 311-331).

Do przeprowadzenia reakcji sprzęgania zastosowano naczynie reakcyjne z korkami z wykładziną z Teflonu™; standardowe naczynie reakcyjne do syntezy białek w fazie stałej wykorzystano jako komorę mieszania, w której mieszano próbki po reakcji sprzęgania.

Około 0,5 g żywicy Fmoc-Trp-alkoksymetylowej spęczniano w 20 ml dichlorometanu (DMC). Żywicę przemyto następnie dwukrotnie DCM, raz mieszaniną 1: 1 DCM i dimetyloformamidu (DMF) oraz 3 razy DMF. Z kolei żywicę odblokowano 20% (v/v) piperydyną w DMF. Po dokładnym przemyciu odblokowanej żywicy DMF (3 razy) DCM (3 razy) i mieszaniną (1:1) DCM i DMF (2 razy) żywicę ponownie zawieszono w około 7,5 ml DMF, podzielono na 3 odrębne próbki po około 2,5 ml i wprowadzono do 3 ponumerowanych probówek do sprzęgania.

Dodawaną ilość zablokowanego aminokwasu wyliczono na podstawie ilości moli tryptofanu już przyłączonego do żywicy W przypadku każdego dodawanego aminokwasu 5-molowy nadmiar aminokwasu dodawano do każdego naczynia reakcyjnego, do którego juz dodano próbkę przemytej żywicy. Do każdego naczynia reakcyjnego wprowadzano pięciokrotny nadmiar innego aminokwasu. Każde z naczyń wytrząsano przez 2 minuty i dodawano 5-krotny molowy nadmiar diizopropylokarbodiimidu (DIC) w 3 ml DMF, po czym wytrząsanie kontynuowano przez 1 godzinę.

W celu sprawdzenia kompletności sprzęgania próbkę z każdej probówki zbadano odczynnikiem ninhydrynowym otrzymanym z Pierce Chemical, metodą podaną przez Sarina i innych (1981, Anal. Biochem 1 17: 147-157), przytaczaną tu jako źródło literaturowe. Jeśli test ten

169 616 wykaże, że reakcja sprzęgania jest niekompletna, kompletność reakcji wymuszano kilkoma sposobami, znanymi specjalistom, obejmującymi, (a) drugie sprzęganie z zastosowaniem 1-5krotnego nadmiaru zablokowanego aminokwasu, (b) dodatkowe sprzęganie z zastosowaniem różnych lub dodatkowych rozpuszczalników (np. trifluoroetanolu) lub (c) dodatek chaotropowych soli, np. NaCIO4 lub LiBr (Klis i Steward, 1990, Peptides· Chemistry. Stiuicture and Biology’ Rivier and Marshall, Eds , ESCOM Publ., str. 904-906)

Po sprzęganiu żywicę z trzech probówek do sprzęgania ostrożnie przenoszono i połączono w jednej komorze mieszania. Żywicę przemyto 2 razy DCM/DMF (1:1), 3 razy DCM i 3 razy DMF, po czym odblokowano 20% (v/v) piperydyną w DMF. Po dokładnym przemyciu DCM i DMF w sposób opisany powyżej mieszaninę podzielono na 3 próbki i rozdzielono do trzech odrębnych naczyń reakcyjnych Dodano drugi zestaw aminokwasów Po kompletnym sprzęganiu żywicę najpierw odblokowano 20% piperydyną, a następnie dokładnie przemyto DCM i DMF, w sposób opisany powyżej. Trzeci zestaw aminokwasów dodano w taki sam sposób.

W celu odszczepienia peptydów od stałofazowych nośników 30 ml 50% (v/v) kwasu trifluorooctowego (TFA) z dodatkiem 5% (v/v) anizolu i 0,9% (v/v) etanoditiolu, w DCM, dodano do żywicy. Mieszaninę wytrząsano przez 4 godziny, po czym zebrano ciecz znad osadu z peptydami. Ciecz znad osadu z peptydami zatężono w wyparce rotacyjnej i peptydy wytrącono eterem. Po dokładnym przemyciu wytrącone peptydy wysuszono i przygotowano do dalszej analizy. Liofilizowany peptyd (w postaci proszku) przechowywano w stanie zamrożonym. Ala-Trp i Val-Ser-Ser-Trp

Wniosek

Wyniki te wykazują, ze sposób syntezy statystycznych peptydów umożliwia syntezę biblioteki statystycznych peptydów w zasadniczo równomolowych ilościach, w przeciwieństwie do standardowej techniki SPPS, w której dominuje zestaw peptydów zawierających aminokwasy o większej szybkości sprzęgania.

Przykład II. Wydzielanie ligandu peptydowego wiążącego cząsteczkę receptorową.

W celu wykazania przydatności metody według wynalazku do wydzielania określonego peptydu, zsyntetyzowano peptyd z 12 aminokwasów o wstępnie ustalonej sekwencji z produktu genu V-mos. V-mos jest onkogenem wydzielonym z mięsaka myszy i jest związany z wirusem mięsaka mysiego Moloney’a. Wiadomo, ze produkt genu v-mos wykazuje aktywność kinazy serynowo/treoninowej.

Materiały i metody

Sekwencję Leu-Gly-Ser-Gly-Gly-Phe-Ser-Val-Tyr-Lys-Ala zsyntetyzowano na ziarnach poliakryloamidowych (o średnicy -300 μm) z wykorzystaniem chemii N“-Fmoc oraz standardowych reagentów i technik syntezy peptydów w fazie stałej. Grupy chroniące łańcuchy boczne usunięto 50% TFA, a peptyd pozostał kowalencyjnie związany z żywicą poliakrylamidową poprzez łącznik, kwas aminokapronowy-etylenodiaminę, tak że ostatecznie uzyskano strukturę Leu-Gly-Ser-Gly-Gly-Phe-Ser-Val-Tyr-Lys-Ala-kwas aminokapronowy-etylenodiamina-zywica (poniżej określany jako ziarno długi v-mos). Taka sekwencja peptydowa odpowiada resztom 100-111 produktu genu v-mos.

W taki sam sposób zsyntetyzowano krótszy peptyd z reszt 106-111 produktu genu v-mos (Gly-Ser-Val-Tyr-Lys-Ala) na ziarnach poliakryloamidowym z wykorzystaniem tego samego łącznika (poniżej określany jako ziarno krótki v-mos) Peptyd ten służył jako negatywny peptyd kontrolny.

Linię komórek hybrydomy wytwarzającą monoklonalne przeciwciało mysie specyficzne względem długiego peptydu v-mos znane jako anty-v-mos (Hybridoma No. 165-28E7, SCRF354, Lot No. 165-119) uzyskano jako produkt handlowy z Microbiological Associates Inc., Maryland. W teście ELISA przeciwciało to wykrywa homologiczną sekwencję v-mos, produkty genowe MOS, neu/HER-1, HER-2. Wiadomo, ze przeciwciało to wykazuje minimalne powinowactwo do krótkiego peptydu v-mos. Drugorzędowe kozie przeciwmysie IgG (specyficzne względem ciężkiego i lekkiego łańcucha), znaczone fosfatazą alkaliczną, otrzymano z Sigma

Wykorzystując konwencjonalne techniki wytwarzania monoklonalnego przeciwciała podane w Methods in Enzymology, Vol 121 (1986), wytworzono monoklonalne przeciwciało w postaci ascytów, a następnie oczyszczano w kolumnie 6 z białkiem, otrzymanym z Pharmacia.

191 919

Wyniki

Ziarna długie v-mos wymieszano z 1000-krotnym nadmiarem ziaren krótki v-mos. 2 ml oczyszczonych monoklonalnych przeciwciał anty-v-mos (1 gg/ml) w PBS z 0,1% Tween 20 dodano do mieszaniny ziaren długiego i krótkiego v-mos i prowadzono inkubację w temperaturze pokojowej przez godzinę z łagodnym mieszaniem. Następnie ziarna myto przez godzinę z łagodnym mieszaniem Z kolei ziarna przemyto w małej kolumnie polipropylenowej jednorazowego użytku (uzyskanej z Isolab), w której ziarno zatrzymuje się na spieku. Ziarna wymieszano następnie z 2 ml drugorzędowego przeciwciała w rozcieńczeniu 1 2000, przez jedną godzinę Po przemyciu ziarna wylano na polistyrenową szalkę Petnego i pozostawiono do opadnięcia Ciecz znad osadu usunięto i jako substrat dodano ostrożnie roztwór fosforanu 5-bromo-4-chloro-3-indoilu i nitrobłękit tetrazolilowy.

Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 15 minut ziarna długi v-mos zmieniły zabarwienie na purpurowe, podczas gdy ziarna krótki v-mos pozostały bezbarwne. Umożliwia to natychmiastowe wykrycie pojedynczych ciemnych ziaren w masie tysięcy ziaren bezbarwnych. Rozróżnienie między ziarnami przedstawiono na fig 4-6, na których pokazano fotografie ziaren rozprowadzonych na szalkach Petnego, powiększonych 40 razy Na fig. 4 przedstawiono tło ziaren długi v-mos znaczonych monoklonalnym przeciwciałem, na fig 5 mieszaninę ziaren długi v-mos i krótki v-mos, znaczonych monoklonalnym przeciwciałem anty-v-mos, a na fig. 6 przedstawiono gotowe wykrywanie pojedynczego niebieskiego ziarna na tle bezbarwnych ziaren Wynika stąd, ze ziarna zawierające sekwencję peptydową będącą przedmiotem zainteresowania można łatwo odróżnić od innych ziaren z biblioteki

Po oddzieleniu zastosowano sekwenator Applied Biosystems 477A Protein Squencer w celu ustalenia sekwencji N-końcowych aminokwasów w pojedynczym ziarnie długi v-mos-żywica.

Wniosek

Przykład ten wykazuje wykorzystanie sposobu według wynalazku do sekwencjonowania ziaren zawierających ligand biooligomerowy, w danym przypadku peptyd, będący przedmiotem zainteresowania, spośród tysiąckrotnego nadmiaru nie wiążących, niereaktywnych ziaren. Przykład ten wykazuje ponadto, ze reaktywne ziarno można wydzielić, a sekwencję peptydu można ustalić.

Przykład III. Wydzielanie krótszego ligandu peptydowego, który wiąże cząsteczkę receptorową.

W celu bliższego wykazania przydatności sposobu według wynalazku do wydzielania konkretnego peptydu, zsyntetyzowano heksapeptyd o ustalonej sekwencji Gly-Phe-Gly-SerVal-Tyr na standardowej żywicy PAM o ziarnach 100 gm, wykorzystując chemizm N“-Fmoc oraz inne reagenty stosowane w standardowej syntezie peptydów w fazie stałej.

Materiały i metody

Reakcje sprzęgania przeprowadzono w sposób opisany powyżej. Blokujące grupy α-aminowe usunięto 20% piperydyną, grupy chroniące boczne łańcuchy usunięto 50% TFA, a peptyd pozostawiono w postaci kowalencyjnie związanej z żywicą polistyrenową poprzez łącznik kwas aminokapronowy-e-alanina, tak że ostatecznie uzyskano strukturę Gly-Phe-Gly-Ser-Val-Tyrkwas aminokapronowy-e-Ala-żywica. Taka sekwencja peptydową odpowiada resztom 104-109 produktu genu v-mos, opisanego powyżej w przykładzie II

Podobnie jak w przykładzie II, przeciwciała anty-v-mos pobrano z linii komórek hybrydomy wytwarzającej monoklonalne przeciwciało mysie specyficzne względem tego peptydu v-mos. Znaczone fosfatazą alkaliczną, drugorzędowe kozie-przeciwmysie IgG otrzymano z Sigma.

Wyniki

Około 1,5 mg żywicy PAM/peptydu v-mos, opisanego powyżej, wymieszano ze 100-krotnym nadmiarem ziarna N-Fmoc-alamna-żywica PAM, otrzymanego z Bachem, Inc. Do mieszaniny peptyd-nośnik dodano 2 ml oczyszczonych monoklonalnych przeciwciał (1 gg/ml) w PBS z dodatkiem 0,1 % Tween 201 całość inkubowano w temperaturze pokojowej przez 45 minut z łagodnym mieszaniem.

Ziarna przemyto w małej kolumnie polipropylenowej jednorazowego użytku (uzyskanej z Isolab), której ziarno zatrzymuje się na spieku Ziarna mieszano następnie z 2 ml drugorzędowych przeciwciał znaczonych fosfatazą alkaliczną (rozcieńczenie 1:1 θ00) przez 1 godzinę Po

169 616 przemyciu ziarna rozprowadzono na kawałku filtru szklanego i namoczono w substracie, kwasie 2,2'-aaynobis(3-etylobenzotlazollnosulfoaowym) (ABTS) z dodatkiem H2O2Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 15 minut zabarwienie ziaren żywica PAM/peptyd v-mos zmieniło się na ciemno zielone Na filtrze szklanym powstało aipwiplkie otaczające jaśniejsze zielone halo. Większość statofazowych nośników nie zawierających peptydu v-mpos nie oddziaływa z moaokloaαlnym przeciwciałem i z tego względu nie wykazała żadnej zmiany barwy. Ziarna v-mos można było łatwo odróżnić

Wniosek

Przykład ten wykazuje, ze cząsteczka akceptorowa będąca przedmiotem zainteresowania nie reaguje niespecyficznie ze stałofazowym nośnikiem, ale raczej jest specyficzna względem kombinacji stałofazowy nośnik/pρptyd. Jak w przykładzie II powyżej, dodatnio reagujące ziarna można oddzielić, a przyłączony do nich peptyd poddać sekwencjonowamu

Przykład IV. Ustalanie ligandów dla streptawidyny i anty-e-endorfiny MAB.

Przykład ten dokładniej ilustruje bardzo różniące się podejście do identyfikacji ligandu peptydowego sposobem według wynalazku. Zamiast opierać się na układzie biologicznym (np. przeprowadzając fuzję włóknistego faga) w celu generowania statystycznej biblioteki, sposoby według wynalazku skutecznie wykorzystują chemiczną syntezę olbrzymiej biblioteki peptydów, w której każdy peptyd znajduje się na odrębnym ziarnie. Poszczególne ziarna zawierające specyficznie wiążące peptydy oddziela się następnie na drodze fizycznej i ustala się sekwencję peptydu

Podejście takie uzależnione jest od zdolności chemicznego zsyntetyaowania olbrzymiej statystycznej biblioteki peptydów oraz od sprzęgania ich do odpowiedniego układu umożliwiającego wykrywanie, wydzielanie i ustalanie struktury

Dostarczony przez mniejszy wynalazek sposób rozwiązania tego problemu polega na podzieleniu ziaren żywicy na serie odrębnych równych próbek w każdym cyklu sprzęgania i przeprowadzeniu do końca reakcji każdej próbki żywicy z odrębnym aktywowanym aminokwasem, Po kompletnym sprzęganiu różne próbki żywicy dokładnie miesza się ze sobą, przemywa, odblokowuje, przemywa i ponownie rozdziela na próbki w celu przeprowadzenia nowego cyklu sprzęgania. W związku z tym żadne ziarno żywicy nie styka się w dowolnym cyklu sprzęgania z więcej niż jednym aminokwasem i po zakończeniu szeregu takich etapów każde ziarno będzie zawierać jedną unikatową sekwencję peptydową. Teoretycznie biblioteka peptydów wytworzona takim sposobem powinna być rzeczywiście statystyczna. Na dodatek uzyskuje się równomolowe ilości każdego rodzaju peptydu. Całkowita liczba permutacji, a więc liczba peptydów będzie aolpzna odliczby próbek i aminokwasow wybranych w każdym etapie sprzęgania, a także od całkowitej ilości etapów sprzęgania w syntezie (długości peptydu).

Nowy sposób równoczesnej syntezy wielkiej liczby peptydów nie tylko zapewnia rzeczywiście rondomizowaaą i równomolową bibliotekę, ale co jeszcze wazniejsze, zapewnia uzyskanie biblioteki ziaren stαłofαzowpj żywicy z peptydami, w której każde ziarno zawiera tylko jedną unikatową sekwencję peptydową. Ta ostatnia właściwość jest pewna, gdyż w czasie każdego cyklu syntezy peptydów każde ziarno kontaktuje się z jednym tylko odrębnym aminikwasem w tym samym czasie, a każdą reakcję sprzęgania doprowadza się do końca. W rzeczywistości koncepcja jedno ziαrao-jpden peptyd mo decydujące ^ομονο w powodzeniu ujawnionej metody.

Znojąc toki sposób syntezy zdentptezować możno praktycznie dowolną bibliotekę pzptydów o dokładnie ustalonym składzie. Tak np. w każdym etapie sprzęgania stosować można do 20 naturalnych L-aminokwasow w poszczególnych próbkach, albo też jzdzn lub kilka ominokwasow zastosować można w pewnych etapach sprzęgania

Materiały i metody

Synteza biblioteki peptydów

Zdyatptyaowαao wielką bibliotekę o strukturze Χ-Χ-Χ-Χ-β-Alal -kwas ammokapronowyetylenodiamina-żywica (X = 19 spośród 20 powszechnych aminokwasów z wyjątkiem cysteiny w każdym cyklu sprzęgania). Jako wybrane w syntezie stałofazowe ziarna żywicy wybrano polidimetyloakrylamid (PDA) (MUngon, Inc. USA).

Chemizm i metoda syntezy peptydów z zastosowaniem takiej żywicy oparta była na procy Athertono i Sheppardo (1988, Solid Phase Peptide Syn^es^, A Practical Approoch, IRL Press).

169 616 g żywicy (około 2 miliony ziaren) łagodnie mieszano z etylenodiaminą przez noc. Po dokładnym przemyciu z żywicą sprzęgnięto kwas aminokapronowy, a następnie β-alaninę, z blokowaniem Fmoc, ale bez rozszczepialnego łącznika. W następnych 5 etapach przeprowadzano randomizację, przy czym w każdym w etapów sprzęgania stosowano pojedynczo wszystkie 19 Fmoc-aminokwasów-OPfg, z wyjątkiem cysteiny. Po zakończeniu 5 etapów sprzęgania grupy moc usunięto w 20% piperydynie (v/v) w DMF Grupy chroniące łańcuccy boczne usunięto w mieszaninie 90% (v/v) TFA, 1% (v/v) anizolu i 0,9% (v/v) etanoditiolu. Żywicę zobojętniono 10% diizopropyloaminą (w DMF) i przechowywano w DMF w 4°C.

Łącznik β-alamna-kwaa aminokapronowy-etylenodiamina zawiera łącznie 11 atomów C i 4 atomy N, przy maksymalnej długości ramienia 17,6 A. W związku z tym, ze w każdym z 5 statystycznych etapów sprzęgania zastosowano 19 różnych aminokwasów, teoretyczna liczba peptydów wynosi 19t, czyli 2 476 099 odrębnych pentapeptydów w aminokwasie

Jak to zaznaczono wcześniej, ogólny schemat postępowania obejmuje syntezę wielkiej biblioteki statystycznych peptydów na pojedynczych ziarnach stałofazowej żywicy, tak że każde ziarno żywicy zawiera jeden rodzaj peptydu Pojedyncze ziarno żywicy, które oddziaływuje z cząsteczką akceptorową,można następnie zidentyfikować i oddzielić na drodze fizycznej, po czym wyznaczyć można sekwencję aminokwasów w ligandzie peptydowym przeprowadzając degradację Edmana Powodzenie takiego sposobu postępowania wymaga w związku z tym dokładnej identyfikacji sekwencji peptydowej na pojedynczym ziarnie. Wykorzystując zautomatyzowany sekwenator białek (Model 477A-01 Pulsed Liquid Automazis Protein/Peptide Sequncer, Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia) z każdego ziarna odzyskiwano rutynowo 50-500 pmoli peptydów Ponadto wcześniejsza analiza (DiMarch i inni, 1990, Peptides: Chemistry, Structure and Biology, Proceedings of the Eleventh American Peptide Symposium, 9-14 lipca 1988, La Jolla, Ca., eScOM, Leiden, str 229-230) wyników sekwencji wykazała, ze wydajność sprzęgania w syntezie peptydów w fazie stałej przekracza 98%

Specyficzna identyfikacja i selekcja ligandów peptydowych z biblioteki

Identyfikacji i selekcji konkretnych ligandów peptydowych ze statystycznej biblioteki można łatwo dokonać technikami immunologicznymi, takimi jak Enzyme Linked Immunoabsorbant Assay (ELISA), immunofluorescencja lub z wykorzystaniem ziaren immunomagnetycznych W opisanych eksperymentach w układzie detekcji zastosowano techniki immunohistochemiczne. Jako specyficznie wiążące cząsteczki akceptorowe zastosowano w badaniach (i) atreptawidynę, białko wiążące biotynę oraz (ii) anty-β-endorfmowe monoklonalne przeciwciało (MAb), wykorzystując układ biblioteki epitopów fuzyjnego faga włóknistego (Cwirla i inni, Devlin i inni, Sekcja 2 powyżej), ligandy peptydowe z powodzeniem zidentyfikowano z udziałem obydwu wymienionych cząsteczek akceptorowych.

Techniki immunohistochemiczne wykorzystano do wykrywania ziaren wiążących streptawidynę. Statystyczną bibliotekę ziaren z peptydami łagodnie wymieszano w kolejno dwukrotnie zwiększonymi ilościami wody destylowanej w celu rozcieńczenia DMF. Następnie ziarna dokładnie przemyto PBS i dodano żelatynę (0,1% v/v) w celu zablokowania ewentualnego niespecyficznego wiązania Z kolei do ziaren dodano aterptowldynę-fosfatazę alkaliczną (Pierce, Rockford, Illinois) w rozcieńczeniu 1:200 000 i całość mieszano łagodnie przez jedną godzinę. Następnie ziarna dokładnie przemyto i dodano standardowy aubatrat fosforan 5-bromo-4-chloro-3-indolilu/nitrobłękit tetrazolilowy, (BCIP-NBT). Ziarna wraz z roztworem substratu przeniesiono na 15 polistyrenowych szalek Petriego (100 x 20 mm) i reakcję prowadzono przez okres czasu do 2 godzin Ziarna ze związaną streptawldyną-foafatazą alkaliczną zmieniały zabarwienie na ciemno błękitne, podczas gdy większość ziaren w bibliotece pozostała bezbarwna.

Oznaczanie powinowactwa ligandów peptydowych

Powinowactwo ligandu peptydowego w wiązaniu z monoklonalnym przeciwciałem antyβ-endorfiny określano w fazie roztworu W próbie wiązania anty-β-endorflny oznaczano inhibitowanie przez ligand peptydowy wiązania 5,0 nM [ H]-[Leu]enkefaliny (aktywność właściwa = 39,0 Ci/mmol. New England Nuclear, Boston MA) z 125-200 ng/ml anty-β-endorfmy MAb w buforze 1,0 ml 40 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4; zawierającym 1,0 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, 0,1% (v/v) Tween 20 i 0,05% (x/v) azydku sodowego. Wiązanie właściwe określano jako różnicę między wiązaniem zmierzonym w obecności i bez udziału 1,0 μM

169 616 nieznaczonej [Leu]enkefaliny Związany radioligand wytrącono dodając 1O-krotny nadpomiar Protein-6 Sepharose (Pharmacia), a następnie prowadząc inkubację przez noc (23-24°C) Protein-6 Sepharose oddzielono przez odwirowanie (13 000 x g przez 5 minut), po czym pastylki zdyspergowano w 250 μΐ 5% (v/v) kwasu octowego przed przeniesieniem do fiolek do pomiaru scyntylacji cieczy. Wielkości Kd (n = 3) ustalano na podstawie analizy nasycenia przy 5 stężeniach radioligandu (1,87 - 30 nM) dla [^JH][Leu]enkefaliny, w każdym przypadku stosując po dwie próbki całkowicie i niespecyficznie wiążące Zmierzona średnia wielkość Kd wynosiła 9,79 ±4,63 mM. Wykreślono krzywe inhibitowania ligandu peptydowego dla 8 stężeń peptydu w zakresie 400-krotnym. Wyniki wiązania w badaniach nasycenia i inhibitowania analizowano metodami wazonej-nieliniowej regresji z wykorzystaniem odpowiednich jednocentrowych modeli podanych przez Knappa i innych (1990, J Pharmacol Exp Ther. 255 1278-1282). Wielkości K, dla stałych inhibitowania wiązania wyliczano metodą podaną przez Chenga i Prusoffa (1973, Biochem. Pharmacol 22: 3099-3102) Każdą wielkość K wyliczono z 3-4 niezależnych oznaczeń.

Wyniki

Dokonano selekcji wielkiej biblioteki syntetycznych statystycznych peptydów (X-X-X-X-żywica, gdzie X oznacza 19 typowych aminokwasów (nie stosowano cysteiny), co odpowiada łącznie 19⁵ - 2 476 099 permutacji) Porcja selekcjonowanej biblioteki zawierała około 2 miliony ziaren. W pierwszym stadium selekcjonowania, z samą streptawidyną-fosfatazą alkaliczną (patrz powyżej) około 75 ziaren zabarwiło się na różne odcienie; ziarna te oddzielono pod mikroskopem operacyjnym za pomocą mikromanipulatora. Każde ziarno przemyto następnie 8M chlorowodorkiem guanidyny w celu usunięcia związanego koniugatu enzymu streptawidyny Z kolei każde ziarno osobno umieszczono na szklanym filtrze w pojemniku sekwenatora Applied Biosystem Protein Squencer (ABI) Sekwencje 28 spośród 75 ziaren podano w tabeli 1. Wszystkie te ziarna wykazują sekwencję konsensusu HPQ lub HPM. Mikrofotografia na fig. 7 ilustruje jak dodatnie (ciemno błękitne) ziarno można łatwo zidentyfikować w tle wielu tysięcy ujemnych (bezbarwnych) ziaren podczas selekcjonowania biblioteki ligandów peptydowych.

Tabela 1

Sekwencje peptydowe poszczególnych ziaren oddziaływujące ze streptawidyną ^a

HPQFV (b0,8,c1120)	GHPQG (0,44, 250)	PLHPQ (2,5, 48)
HPQGP (0,35, 60)	MYHPQ	AIHPQ
HPQAG (1,5, 53)	REHPQ (0,56, 112)	AAHPQ (0,9, 476)
LHPQF (0,47, 286)	IQHPQ (1,8, 192)	dTPHPQ (0, 158)
FHPQG (0,23, 72)	GNHPQ (0, 222)	WNHPM (2,5, 59)
GHPQN (0,4, 44)	TVHPQ (0, 96)	WTHPM (1,4, 202)
THPQN (0,5, 44)	IGHPQ	WHPMA (0,6, 21)
QHPQG (2,3, 60)	WMHPQ (, 7, 257)	dMNPMA (0,31, 140)
IHPQG (2,1,57)	GAHPQ

a - Ligandy te zidentyfikowano selekcjonując bibliotekę 2 467 099 (19 ) peptydów b - Pierwsza liczba w nawiasach oznacza procent przekładania dla cyklu 5 degradacji Edmana (to znaczy ilość reszt 5 w cyklu 4/ilość reszt 5 w cyklu 5) c - Druga liczba w nawiasach wskazuje ilość peptydu (w pmolach) odzyskanego podczas sekwencjonowania d - Zidentyfikowano dwie sekwencje TPHPQ i dwie MHPMA, nie stwierdzono innych powtórek

W celu potwierdzenia, ze sekwencje konsensusu HPQ rzeczywiście wiążą się z centrum wiązania biotyny w cząsteczce sterptawidyny,zsyntetyzowano LHPQF-e-Ala-kwas aminokapronowy-etylenodiamina-zywica (LHPQF-zywica). LHPQF-żywicę wymieszano następnie ze streptawidyną-fosfatazą alkaliczną w obecności biotyny o różnych stężeniach. Wyniki przedstawiono na fig. 8 Biotyna przy stężeniu 100 nM całkowicie zablokowała barwienie LHPQF-żywicy. Przy stężeniu 10 i 1,0 nM biotyna częściowo inhibituje barwienie, a przy stężeniu 0,1 nM nie wywiera wpływu na barwienie LHPQF-żywicy przez streptawidyną-fosfatazą alkaliczną. Badania inhibitowania potwierdziły, ze sekwencja konsensusu HPQ wiąże się z centrum wiążącym biotynę a streptawidynie.

191 919

Przed wykorzystaniem tej samej biblioteki statystycznych peptydów do selekcjonowania z anty-e-endorfiną MAb usunięto wszystkie błękitne ziarna, które zostały zabarwione samą streptawidyną-fosfatazą alkaliczną. Pozostałe ziarna zadano 8M chlorowodorkiem guanidyny w celu usunięcia jakiegokolwiek związanego białka. Taką przebadaną bibliotekę mieszano następnie z biotynylowaną anty^-endorfiną MAb (anty^-endorfinę, klon 3-E7, otrzymano jako produkt handlowy z Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) przez 16 godzin Po dokładnym przemyciu przeprowadzono drugi etap ze streptawidyną-fosfatazą alkaliczną w celu wyzwolenia reakcji barwienia w ELISA. Przy takim selekcjonowaniu zidentyfikowano 6 peptydów z sekwencją konsensusu bardzo zbliżoną do ligandu rodzimego, Leu-enkafalina (YGGFL), a mianowicie YGGMV, YGALQ, YGGLS, YGGFA i YGGFQ. Zsyntetyzowano peptydowe analogi tego ligandu o różnych końcach karbonylowych, po czym ustalono ich powinowactwo (K1 z wykorzystaniem [³H]Leu-enkafaliny New England Nuclear, Boston, Massachusetts) jako znaczonego ligandu, oraz nieznaczonych peptydów jako ligandu konkurującego (próbka anty-β-endorfinowa, patrz wyżej). Wyniki tych badań zestawiono w tabeli 2.

Tabela 2

Powinowactwo ligandów peptydowych w stosunku do monoklonalnego przeciwciała anty^-endorfiny K, nM

Koniec karboksylowy

Peptyd	-OH -NH2	-PA-OH	eA-NH 2
aYGGFL	17,5 ±3,2	27,9 ±2,3	17,1 ± 1,8	13,7 ± 1,7
YGGFA	32,9 ±2,0	72,0 ± 16,4	82,3 ± 8,8	93,6 ±34,7
YGGFT	36,9 ±7,7	65,2 ± 16,8	50,6 ±89	43,3 ±2,3
YGGFQ	15,0 ± 1,7	40,1 ±6,0	39,4 ± 2,3	45,4 ± 11,6
YGGLS	726 ± 134	991 ±52	916± 182	1150 ±247
YGGLQ	1980± 303	2910 ±695	1470± 120	1910±504
YGGMV	8780± 1500	14000± 11 10	5140 ±885	7169 ± 1010

a - YGGL oznacza [Leu^S]enkafalinę, rodzimy ligand dla anty^-endorfiny MAb

Dyskusja

Możliwość syntezowania pojedynczych peptydów na każdym ziarnie w połączeniu z układem czułej i specyficznej detekcji i selekcji ma decydujące znaczenie w powodzeniu metodologii według wynalazku. Taką nową metodologię określa się jako selektywny proces Pojedyncze ziarno wyselekcjonowane z biblioteki i poddane obróbce 8M chlorowodorkiem guanidyny (w celu usunięcia związanego białka) zostało skutecznie oczyszczone przy pozostawieniu peptydu kowalencyjnie związanego z żywicą i nadającego się do sekwencjonowania. Nowoczesne zautomatyzowane sekwenatory peptydów umożliwiają sekwencjonowanie peptydów przy stężeniach zaledwie 5-10 pmol. Ponadto błękitny barwnik, który nieodwracalnie wiąże się z ziarnem, nie wpływa na sekwencjonowanie. W czasie każdego cyklu sprzęgania z randomizacją usiłowano wszelkimi sposobami zoptymalizować metodologię syntezy, w tym stosując duży nadmiar N“-Fmoc-aminokwasów Analiza przekłamań wstępnych danych sekwencjonowania wyraźnie wykazała, ze wydajność sprzęgania w reakcjach syntezy chemicznej przekracza 98%

W związku z tym, ze zabarwione ziarna wyróżniają się w tle ziaren bezbarwnych (patrz fig 7), praktycznie bez problemu można przeprowadzić selekcję 2 milionów ziaren pod mikroskopem operacyjnym na serii 10-15 szalek Petriego i na również względne powinowactwo różnych ligandów oceniając względną intensywność zabarwienia każdego dodatniego ziarna Taka właściwość umożliwia wybrać ziarna o określonej intensywności zabarwienia do sekwencjonowania

Devlin i inni (1990, Science 259 404-406, sekcja 2, powyżej), donieśli o istotności sekwencji HPQ, HPM i HPN w 20 ligandach wiążących streptawidynę, wydzielonych techniką fuzyjnego włóknistego faga. Wśród tych 20 izolatów 15 zawierało sekwencje konsensusu HPQ, 4 - sekwencję HPM , a jeden sekwencję HPN. Jest interesujące, ze z biblioteki peptydów wydzielono 28 różnych peptydów, z których 23 zawierało sekwencję konsensusu HPQ, a 5

169 616 zawierało sekwencję konsensusu HPM (tabela 1) Okazało się, ze położenie sekwencji HPQ/HPM w pentapeptydzie nie ma znaczenia w wiązaniu streptawidyny. Spośród wszystkich zidentyfikowanych pentapeptydów z sekwencjami HPQ lub HPM tylko dwie były powtórzone (TPHPQ i MHPMA). Stanowi to wyraźny kontrast w porównaniu z wynikami podanymi przez Devlina i innych, patrz wyżej, w przypadku których w 20 izolatach stwierdzono liczne powtórki, co sugeruje iż w takiej metodzie biosyntezy następuje zakłócenie selekcji.

W składzie anty-β-endorfiny zidentyfikowano 6 peptydów z sekwencjami bardzo zbliżonymi do wykazywanej przez rodzimy ligand YGGFL (tabela 2). Są to wyniki zbliżone do uzyskanych techniką fuzyjnego włóknistego faga, w której wykorzystano to samo monoklonalne przeciwciało (klon 3-E7) (Cwirla i inni, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-6382, patrz wyżej) Jakkolwiek biblioteka peptydów zawierała mniej sekwencji ligandów niż uzyskali ich Cwirla i inni, 50% uzyskanych ligandów wykazywało o wiele większe powinowactwo do przeciwciała niż jakikolwiek ligand wyselekcjonowany techniką fagową.

Przykład V. Ograniczona biblioteka peptydów

W innej serii doświadczeń wynalazek niniejszy sprawdzono z innym układem przeciwciał, w którym epitop zlokalizowany został raczej w środku łańcucha peptydowego niż na końcu N (jak w przypadku β-endorfiny). Zastosowanym przeciwciałem było monoklonalne przeciwciało peptydowe anty-v-mos (anty-v-mos MAb) (patrz powyżej). Przeciwciało to uzyskano uodparniając myszy peptydem 12 aminokwasów (LGSGGFGSVYKA) odpowiadającym resztom 100-111 produktu onkogenu v-mos Peptyd skomugowano z białkiem stanowiącym nośnik przed uodpornianiem. W teście ELISA taki anty-v-mos MAb wykrywa homologiczną sekwencję produktów genów v-mos, MOS, neu/HER-1 i HER-2.

Materiały i metody

Wykorzystując dostępny w handlu układ wieloszpilkowy (Geysen i inni, 1986, Mol. Immunol. 23: 709-715) zestawu do mapowania epitopu (Cambridge Research Biochemical, Boston) w celu syntetyzowania nakładających się peptydów (zestawów tetrapeptydów, pentapeptydów i heksapeptydów), epitop peptydu v-mos o 12 aminokwasach, rozpoznawany przez anty-v-mos MAb, zmapowano z sekwencją pentapeptydową (FGSVY) (to znaczy resztami 6-10 dodekapeptydu v-mos).

W eksperymencie wykorzystano ograniczoną statystyczną bibliotekę, w której celowo pominięto aminokwasy, wahnę i serynę, występujące w epitopie v-mos. Kompozycja tej ograniczonej statystycznej biblioteki była następująca: G-K-K-K-K-K^-Ala-kwas aminokapronowy-etylenodiamina-żywica, gdzie K = Glu, Pro, Asn, Phe, His, Thr, Lys, Leu, Gly, Tyr, Ala, Met, Arg, Trp. Wybrano tych 14 aminokwasów, z pominięciem waliny i seryny, przy czym w tym celu, aby obecne były wszystkie boczne grupy funkcyjne, (i) wybrano Asn, a nie Gin, (ii) wybrano Glu a me Asp, (m) wybrano Thr a nie Ser; (iv) wybrano Leu a nie Iei lub Val; oraz (v) wybrano Met a nie Cys. W związku z tym, ze w każdym z 5 etapów statystycznego sprzęgania wybrano 14 aminokwasów, teoretyczna ilość peptydów wynosiła 14⁵, co odpowiadało 537 824 indywidualnym peptydom.

Linię komórek hybrydomy wytwarzającą monoklonalne przeciwciała anty-v-mos otrzymano z Microbiological Associates Inc., Maryland (Hybridoma No 165-28E7, SCRF, 354, partia nr 165-119).

Powinowactwo ligandu peptydowego względem anty-v-mos mAb wyznaczano w próbie wiązania w fazie roztworu z wykorzystaniem peptydu [³H]acetylo-v-mos ([³H]Ac-v-mos) jako radioligandu. Radioligand otrzymano w wyniku N-końcowego acetylowania peptydu v-mos przed odblokowaniem łańcuchów bocznych równomolową ilością [³H]octanu sodowego (aktywność właściwa = 2,52 Ci/mol, New England Nuclear, Boston, MA). Produkt [³H]Ac-vmos, który oddzielono od nieprzereagowanego peptyd v-mos na drodze HPLC z odwróceniem faz, wykazywał aktywność właściwą 2,50 Ci/mol. Powinowactwo wiązania [³H]Ac-v-mos względem anty-v-mos MAb (=10 μg/ml) wyznaczano w 1,0 ml buforu PBS-żelatyna (0,05% żelatyny w PBS) z 23-24°C po inkubacji przez 3 godziny. Wiązanie właściwe zdefiniowanojako różnicę między wiązaniem [³H]Acv-v-mos w obecności (niespecyficzne) lub przy braku (pełne) 100 μM nieznaczonego peptydu v-mos dla każdego stężenia [³H]Ac-v-mos. Związany radioligand oddzielano na drodze wirowania stosując 10-krotny nadmiar (zdolność wiązania względem

169 616 stosowanej immunoglobuliny) Protein-6 Sepharose (Pharmacia) w celu wytrącenia przeciwciała. Analiza wiązania nasycenia dla 5 oznaczeń w zakresie stężeń 125-5000 nM wykazała, że [³H]Ac-v-mos związał się z anty-v-mos mAb, przy czym stała Kd wynosi 850-±160 nM. Powinowactwo wiązania ligandów peptydowych wyznaczano w badaniach inhibitowania wiązania przy siedmiu stężeniach ligandu peptydowego konkurującego z 10 gg/ml anty-v-mos MAb z 20 nM [³H]Ac-v-mos, w warunkach opisanych powyżej. Ponad 50% całkowitego wiązania było specyficzne w badaniach inhibitowania Stałe nasycenia i inhibitowania wiązania wyznaczano dla jednocentrowego wiązania metodą regresji nieliniowej, jak to opisano uprzednio (Knapp i Yamamura, 1990, Life Sci. 46: 1457-1463)

Wyniki

Około 230 000 ziaren poddano selekcji za pomocą koniugatu anty-v-mos-fosfataza alkaliczna. W związku z tym zbadano mniej niż 43% permutacji. Po inkubacji z substratem około 50 ziaren zabarwiło się na intensywnie niebieski kolor. 24 spośród tych ziaren oddzielono na drodze fizycznej, po czym w 11 z nich ustalono sekwencje aminokwasów. Dodatkowo do sekwencjonowania wybrano przypadkowo 17 bezbarwnych ziaren.

Wyniki sekwencjonowania ligandu anty-v-mos zamieszczono w tabeli 3. W związku z tym, ze ta biblioteka peptydów celowo nie zawierała waliny i seryny, nie stanowi zaskoczenia iż żadna z 11 sekwencji ligandów peptydowych nie przypomina rodzimego epitopu (FGSVY). Jakkolwiek w 11 ligandach peptydowych nie występowały powtórki, ich sekwencje nie były przypadkowe. W sekwencjach tych często występuje arginina i tyrozyna. Ponadto co najmniej jedna, a czasami dwie argimny występują w pozycji drugiej/trzeciej każdego z ligandów peptydowych Z drugiej strony ujemne ziarna wybrane przypadkowo nie wykazują żadnego wspólnego^wzoru sekwencji aminokwasów Jakkolwiek wielkość próbki jest ograniczona( zgodność z~ dopasowywania statystycznego sekwencji z ujemnych ziaren nie była znacząca (z2 = 18,27, df = 13, P = 0,15), co wskazuje na brak ewidentnego nierównomiernego rozkładu aminokwasów dla nie zabarwionych ziaren statystycznych peptydów.

Tabela 3

Sekwencje peptydów z poszczególnych ziaren oddziaływujące z monoklonalnym przeciwciałem anty-v-mos

A Ziarna interaktywne
GRRGME	GRYMPK
GRRPYG	GFRHMA
GRRAYE	GFRYHN
GRREGP	GHRYFH
GRYAKH GRKTYY	GWREKE
B Ziarna nie-interaktywne
GKELAG	GFEKHP
GPYLMW	GWGAYP
GTKMNF	GAARPP
GEKMEF	GLGGME
GYEEPK	GRLNTL
GKKPNP	GMTHAY
GEYAPP	GPYGMA
GGFMEF GPKFMA	GHYNNL

Pewne z dodatnich ligandów zsyntetyzowano i ich powinowactwo względem anty-v-moswyznaczono w próbach wiązania w fazie roztworu Wyniki badań zestawiono w tabeli 4

W tabeli 4 zestawiono powinowactwa wiązania epitopu v-mos (ustalone na podstawie mapowania epitopu) względem monoklonalnego przeciwciała anty-v-mos. Przedstawiono również wpływ zmiany końca karboksylowego W tabeli 4B zestawiono powinowactwa wiązania

169 616 mimotopów zidentyfikowanych z biblioteki peptydów nie zawierających szeregu aminokwasów występujących w epitopie v-mos. Pewne badane ligandy zawierały β-alaninoamid, w celu symulowania struktury zidentyfikowanego ligandu, z którym na ziarnie łączy się przeciwciało.

Tabela 4

Powinowactwo wiązania ligandu peptydowego z anty-v-mos MAb

Peptyd	K1, pM
A. LGSGGFGSVYKA (peptyd v-mos)	3,2 ±0,4
GFGSVY-NH2 (epitop v-mos)	246-337
GFGSVy-OH	> 1000
GFGSVY -βΑ-NH 2	409-442
GFGSVY-eA-OH	529-770
B GRRAYE-OH	6,79 ±2,31
GRRAYE-NH 2	24,70 ±7.00
GRRAYE-eA-OH	15,10 ± 0,50
GRRAYE-eA-NH 2	9,02 - 20,40
GRRGME-OH	> 100
GRRGME-eA-NH 2	24,00 ±8,40
GRREGP-eA-NH2	26,90 ±6,20
GRRPYG-OH	> 1000
GRRPYG-eA-NH2	20,50 ±4 50

Powinowactwo najlepszego mimotopu anty-v-mos z tabeli 4 jest około 2,5 razy mniejsze niż powinowactwo peptydu rodzimego. Jakkolwiek żaden z ligandów peptydowych nie wykazywał tak niskiej wielkości K, jak rodzimy ligand v-mos, wyniki wyraźnie wskazują, że stosując statystyczną bibliotekę nie zawierającą pewnych aminokwasów występujących w rodzimym epitopie zidentyfikować można szereg strukturalnie różnych mimotopów wykazujących powinowactwo względem cząsteczki akceptorowej, to znaczy anty-v-mos.

Dyskusja

Anty-v-mos stosowany w tych badaniach wykazywał stosunkowo niskie powinowactwo względem peptydu v-mos (immunogenu). Seryna i walina były obecne w liniowym epitopie v-mos (FGSVY), ale zostały celowo pominięte w stosowanej sekwencjonowanej biblotece, pomimo to sposób umożliwił określenie liniowego mimotopu o całkowicie odmiennej sekwencji i składzie aminokwasowym, ale o porównywalnym powinowactwie względem przeciwciała, Ilustruje to wyraźnie złożoność, ale również i uniwersalność oddziaływań makrocząsteczkowopeptydowych.

Wyniki

Analiza HPLC wyraźnie wykazała, że żadne tripeptyd nie uwalnia się przy naświetlaniu VIS w wodzie, oraz prawie całkowite uwalnianie tripeptydu przy naświetlaniu UV przez 1 godzinę.

W szczególności peptyd (i) w wodzie ulegał ro/szczepieniu do pojedynczego produktu. W pewnych przypadkach zaobserwowano eluowanie dwóch produktów z HPLC. Przy dłuższych czasach napromieniowania (UV) co najmniej w kilku przypadkach zaobserwowano wzajemną konwersję dwóch produktów.

Dyskusja

Łącznik wrażliwy na UV wyraźnie działa uwalniając peptyd w roztworze wodnym. Czas ekspozycji 1 godzina wystarcza do uzyskania niekompletnego uwolnienia peptydu. Wyniki wskazują ponadto, ze żywica poliamidowa jest stabilna i kompatybilna z układami wodnymi

Przykład VI. Identyfikacja imitacji enzymu

Materiały i metody

Wytworzono statystyczną bibliotekę pentapeptydów zawierającą 19 spośród 20 naturalnych aminokwasów (z wyłączeniem cysteiny) (patrz powyżej).

191 919

Bibliotekę peptydów wystawiono na działanie substratu chromogenicznego, nitrobłękitu, chlorku tetrazoilowego (NBT) w nieobecności egzogenicznego enzymu w warunkach sprzyjających powstaniu produktu i zidentyfikowano ziarna reagujące pozytywnie. Ziarna te wybrano i poddano sekwencjonowaniu

Wyniki

Sekwencje 5 ziaren, które katalizują redukcję NTB do odpowiedniego ciemno błękitnego produktu, diformazanu, podano w tabeli 5.

Tabela 5

Sekwencje ziaren z peptydami działających jako enzymy

PNNNH

WNNNM

PNNNG

MNNNR

QNNNR

Dyskusja

Powyższe wyniki sugerują, ze ziarna z peptydem PNNNH jest zdolne do redukowania NTB ciemno błękitnego pigmentu diformazanowego, chemicznie lub enzymatycznie. Jako taki peptyd lub układ peptyd-ziarno wykazuje aktywność sztucznego enzymu lub imitacji enzymu

169 616

,(x)„-	Α-	-(X)
A(X)m-	Α
Μ-Β^Ιχ)/
	Ą-	(X)
(X)„ |
\b-(X)„-	A-	(X)

Π

Fig. 2

A—(X)„

191 919

Intensywność względna (OD215

Fig. 3

169 616

Fig. 4

191 919

CL

Fig. 5

169 616

Fig. 6

191 919

Fig. 7

191 919

Fig. 8

169 616 w -O i

a| A W “0	s | sw-0	v| vw-0
(mieszanie,	przemywacie,	odblokowanie, przemywanie)
A	sl	vj
4	4
AAW~0	SAW-0	VAW -0
ASW-0	ssw-0	VSW-0
AVW “0	svw-0	vvw-0
(mieszanie,	przemywanie,	odblokowanie, przemywanie)
Ai	si	V
AAAW-0	SAAW-4	VAA W-0
AASW-0	S ASW-0	VASW-0
AAVW~0	SAVW~0	VAVW“0
AS AW-0	SSA W-0	V S A W-0
AS SW“0	s ssw-0	7 3 SW-0
AS VW“0	S S VW-0	$ v w -0
AVAW-0	S VAW-0	WAW-0
AVSW~0	s vs w-0	V V S W -0
AWW“0	S vvw-0	V V VW-0

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz Cena 6,00 zł

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób ustalania sekwencji ligandu biooligomerowego dla cząsteczki akceptorowej, w którym bibliotekę różnych ligandów biooligomerów eksponuje się na działanie akceptora, wyodrębnia się z biblioteki biooligomery wiążące akceptor i ustala się sekwencję wyodrębnionych biooligomerów, znamienny tym, ze do biblioteki, obejmującej wiele rodzajów biologicznie aktywnych biooligomerów pozbawionych grup ochronnych, które są peptydami lub oligonukleotydami, wiele dokładnie wymieszanych stałofazowych nośników, i w której każdy pojedynczy rodzaj biooligomeru jest połączony z każdym stałofazowym nośnikiem tworząc kombinację stałofazowy nośnik/biooligomer, i w której dla każdego rodzaju biblioteki tożsamość meru biooligomeru obecnego w dowolnej danej niejednorodnej pozycji rodzajów biooligomeru jest statystycznie niezależna od tożsamości merów w innych pozycjach biooligomerów wprowadza się cząsteczkę akceptorową będącą przedmiotem zainteresowania tak, ze wprowadzona cząsteczka akceptorowa rozpoznaje i wiąże się z jednym lub więcej rodzajami kombinacji stałofazowy nośnik/biooligomer z biblioteki, i wydziela się kombinację stałofazowy nośnik/biooligomer, wykazującą wiązanie z cząsteczką akceptorową.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje się cząsteczkę akceptorową wybraną z grupy obejmującej wirusy, bakterie, białka, węglowodany, kwasy nukleinowe, lipidy, leki i ortometale
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze jako cząsteczkę akceptorową stosuje się przeciwciało.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ż e jako cząsteczkę akceptorową stosuje się receptor.