JPH05509320A

JPH05509320A - 組織誘導型腫瘍成長抑制物質、その調製及び使用方法

Info

Publication number: JPH05509320A
Application number: JP3514242A
Authority: JP
Inventors: イワタ，ケネス，ケー．; ホールケス，ジェイ．ゴードン; テンディジュク，ピーター; ハリー，ジョン，ディー．
Original assignee: オーエスアイ　ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド
Priority date: 1990-06-25
Filing date: 1991-06-25
Publication date: 1993-12-22
Also published as: AU8395891A; AU659412B2; EP0538398A4; CA2084992A1; EP0538398A1; WO1992000318A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

岨ｍ誘導型腫蕩成長抑制物質、その調製及び使用方法本出願は、現在放棄されている１９８５年４月１９日提出の米国特許出願筒７２５．０００３号の一部継続出願であった現在放棄されている１９８６年４月７日提出の米国特許出願筒８４７．９３１号の一部継続出願であった現在放棄されている１９８６年１０月２０日提出の米国特許出願筒９２２．１２１号の一部継続出願である１９８７年１０月２０日提出の米国特許出願筒１１１．０２２号の一部継続出願である１９８８年４月２０日提出の米国特許出願筒１８３，２２４号の一部継続出願である１９８９年５月１７日提出の米国特許出願筒３５３，４１０号の一部継続出願であり、これらの出願各々の内容は、本出願に参考として内含される。発明の背景本出願全体を通して、さまざまな刊行物がカンコ内のアラビア数字で参照指示されている。これらの刊行物についての完全な引用は、請求の範囲の直前の明細書の終りに記されている。これらの刊行物の開示は、本書に記述され請求されている本発明の日付現在の当業者にとって既知の技術状況をより完全に記述するために、本出瀬中に参考として全面的に内含されている。トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）は、単独で又はその他の分子と組合わせた形で細胞の増殖及び分化を変調すると思われる多機能タンパク質の一族に属する。報告によると、成熟、プロ及び前駆体形態の両方を含むＴＧＦ−β は、異なる遺伝子によりコードされるいくつかのイソ型（すなわち、τＧＦ−β Ｉ、−β２．−β３゜−β４、及び−β５）を内含する。ＴＧＦ−β２及びＴＧＦ−β３　ｃＤＮＡはいくつかの哺乳類供給ｌ！Ｘ（１４）から発見されてきた（１４）。ＴＧＦ−β４　ｃＤＮＡは、ニワトリの細胞から分離されただけである（１７）。成熟ＴＧＦ−β１３−β２．−β３　ｃＤＮＡは約７５〜・８０％のアミノ酸配列の同一性を共有しているが、一方ＴＧＦ−β１．−β２．−β３前駆体はわずか２５〜３５％の同一性しか示さない、驚くべきことに、ＴＧＦ−βの間に高度の相同性が見られるにもかかわらず、これらのタンパク質は効力について全く異なっているお思われる（１４）。成ｐ　ＴＧＦ−βはさまざまな種から分離されてきた。マウス、ウシ１、ヒト及びブタのＴＧＦ−βが分離され、これらはアミノ酸」成についてきわめてわづ′ かな差を示し−こいる（５．　８．　ＩＬ　１４．２４）ゆ成ｐ　ＴＧＦ−βのｃＤ局配列、正常細胞及び形質転換された細胞の両、、＋７におけるその発現及び真核細胞内で生物活性ある成熟ＴＧＦ−βを生産するための方法が、記述されてきた（２．３７．　８．１１．３８）　。Ｒ，Ｄｅｒｙｎｃｋ他（３日）は、（ａ）ＴＧＦ−β３をコードする核酸を含むベクターを構築すること、（ｂ）ベクターを用いて異種宿主真核細胞を形質転換すること、（ｃ）形質転換された細胞を培養すること及び（ｄ）培地からＴＧＦ −β３を回収することを含む方法を記述した。発明の要約本発明ば、ＴＧＦ−β３前駆体、ＴＧＦ−８３前駆体のプコ顛域及び成熟ＴＧＦ −β３を含むタンパク質を生産し純化するための方法を提供する。さらに本発明は同様に、生産性の向上及び、突然変異、シグナルペプチド欠失及びプロテアーゼ分割部位置換を含む治療上の有益性の向上を伴う新規のホモ二量体タンパク質の生産・純化方法をも提供する。図面の簡単な説明図１は、ＴＧＦ−β３をコードするヌクレオチド配列及びその推定されたアミノ酸配列を示す。推定されたグリコジル化部位及びポリアデニル化シグナルには下線が引かれている。成Ｗ！ｒｃＦ−β３番よ、ヌクレオチド位置１１６３〜１１６５のアラニンにおいて星印でマークされている。図２は、ＰｖｕＨ・Ｐｖｕｌｌ　ＴＧＦ−β１　ｃＤＮＡプローブでハイプリノＦ形成されたヒトＩ！ｗ瘍ＤＮＡのサザンブロノト分析を示す。図３は、プローブとしてＴＧＦ−β３をコードする遺伝子のＥｃｏＲ１−Ｂｇｌ　ＩＩ　１．７ｋｂ　ｃＤＮＡ断片を用いた、Ａ６７３、Ａ３４９及びＡ４９８のノーザングロント分析を示す。図４は、ＴＧＦ−β、３のゲノム配列からのＰｖｕ　ＩＩ　−Ｔａｑ　ｌプローブを用いたＡ６７３．　Ａ３４９及びＡ４９８細胞系統のノーザンブロント分析を示す。図５は、Ｐｓｔ　１−　Ｂａｌ　Ｉ　ＴＧＦ−β１プローブを用いた、Ａ６７３゜Ａ３４９及びＡ４９８細胞系統のノーザンブロ、ト分析を示す。図６は、プローブとしてＴＧＦ−β１前駆体の完全なコード配列を含むＴＧＦ− β１　ｃＤＮＡを用いたＡ６７３．　Ａ３４９及びＡ４９８細胞系統のノーザンブロソト分析を示す。図７は、ＴＧＦ−８３をコードする遺伝子のＥｃｏＲＩ　Ｂｇｌ　ｎ　ｃＤＮＡを用いたＡ６７３細胞系統とさい帯（へその緒）からのｍＲＮＡのノーザンブロント分析である。図８は、ＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による３つの溶菌液（リゼイト）の」丘Ｅ　：　：　ＴＧＦ−β３融合タンパク質の生産を示す。（Ａ）はＴＧＦ−β３に対応する。図９は、ｔｒｐ　Ｅ　：　：　ＴＧＦ−β１融合タンパク質（レーン１及び４）、ｔｒｐＥ：：　（Ａ）融合タンパク質（レーン２及び５）及びＴＧＦ−β１タンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズから購入）を含む全細胞細菌溶菌液が１２．５％の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離されたことを示す、タンパク質を、ニトロセルロースフィルタ（孔径１　ａｍ＞に電気泳動で移送させ、３００倍のモル余剰分の抗原ペプチドが無い状態（レーン１，２及び３）又はある状態（レーン４，５、及び６）のいずれかでアフィニティ純化された抗ペプチド抗体１００ μｇと共に製置した。メーカーの指示に従い、ヤギの抗ウサギ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ）に接合されたアルカリ性ホスノアターゼを用いて、抗体を検出した。図１０は、コーディング配列を囲んだ状態でＴＧＦ−β３をコードするｍＲＮＡの概略図を示している、胎盤（１，７ｋｂ）　、さい帯（１，９ｋｂ）及びＡ６７３（１，７ｋｂ）　５イブラリから得たｃＤＮＡインサートの相対的拡張が示されている。囲みのダノシュイ」き部分は、ＴＧＦ−βに対する高い相同性を示１

【−末端領域を表わづ。胎盤ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの５　’　ＥｃｏＲＩ　−Ｂｇｉ　ｎ制限断片は１本の棒で示されている。図１１　Ａ　／’　＋３ば１、ＴＧＩ菖β：（を−７−ド！Ｉ−る遺伝子の予想アミノ酸配グリ及びスクレオｊ−ド配列をＴＧＦ−βｌ及びＴＧＦ−βと比較し７でボしでいる７同一・のン′ミノ゛酸は囲みがついている１、成熟ＴＧＦ−β ３Ｉミ７）酸配列は、位置３１５ご開始する。（Ａ）はＴＧＩ−−β３に対応ず石。凹１２は、ｐ　ＯＲＦ　Ｘ及びｐＢｌｕｅ−ＴＧＩ’−６３グラスミドからのｐｃｔ’ｌＶ　−ＴＧＦ−−β３発現プラスミドの構成の概略図である。図１３は、ＣＩ（０親細胞（レーンｌ）、ＴＧＦ−β３　ｃＤＮＡでトランスフェクション（形質移入）されたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ６，３５）　（レーン２）及び２０ｎＭ　ＭＴＸで増幅されたＣＨＯ６，３５（ＣＨＯ６，３５／２０ｎＭ）（レーン３）のＴＧＦ−β３特異プローブを用いたノーザンハイブリンド形成によって決定されたＴＧＦ−β３　ｔｍＲＮＡ発現のレヘルを示す。図１４（Ａ）は、純化ＴＧＦ−β１を用いたミンク細胞成長抑制の用量反応関係を示す。細胞成長はＭＴＴの代謝によって測定された。（３−〔４，５−ジメチルチアゾール−２−ｙｌ〕−２，５−ジフェニルテトラアゾリウム臭化物：チアゾールブルー）（１４８）。（Ｂ）は、酸活性化無血清上澄Ｃ）ｔｏ　６．３５／２０ｎＭ形質移入体及びＣ）１０６．３５形質移入体を用いたミンク成長抑制の用量反応関係を示す。細胞成長は、ＭＴＴの代謝によって測定された。図１５は、抗原として用いられるさまざまなＴＧＦ−β３ペプチドの相対的場所を示す。回１６は、β３ｖ抗体による天然組換え型ＴＧＦ−８３タンパク嘗の免疫沈降を示す。図１７（Ａ）は、還元条件十でのｚ、＝ルからの検出のためβ３　ＩＩＩ及びβ３ｖ抗体を用いた（、ＨＯ６，３，５／　２０ｎＭ形質移入体の馴化培地からのＴＧＦ −β３の免疫プロント法を示す。（１３）は、非還元条件１・−でのゲルからの検出のためのβ３　Ｔｌｌ及びβ ３ｖ抗ｌｉｔ用いたＣＨＯ６，，３５／′２０ｎＭ形質移入体の馴化培地からのＴＧＦ−β３の免疫プロット法を示す。図１８は、検出のれめβ３Ｖ抗体を用いたＣｌｌ０６．３５／２０ｎＭ形質移入体の馴化培地（１８Ｂ）及び細胞抽出物（１８Ａ）のウェスタンプロット法を示す。図１９Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄは、β３ｖ抗体及び対照抗体によるヒｌ〜のさい帯のパラフィン切片に対する染色を示す。Ａ及びＣは、それぞれβ３■抗体による線維芽細胞及び上皮細胞染色及び平滑筋繊維染色を示す。Ｂ及びＤは、対照のウサギの多クローン性抗体による非染色を示している。図２０は、純化ＴＧＦ−β３及びＴＧＦ−βｌの銀染色ゲルである。図２１Ａ、Ｂ、Ｃは、β３Ｖによるミンク細胞成長のＴＧＦ−β３抑制の特異的抗体中和を示す。図２２は、ＴＧＦ−β３前駆体内に遺伝子工学操作されたさまざまなプロテアーゼ部位の場所を示す。発明の詳細な説明本発明に従うと、成熟ＴＧＦ−β３は、各々基本的に１１２のアミノ酸から成りヌクレオチド１１６３−１１６５によってコードされたアラニンで始まりヌクレオチド１４９６−１４９８によってコードされたセリンで終る図１に示されたアミノ酸配列とほぼ同じ配列をもつ２つのポリペプチドを含む組換え型ホモニ量体タンパク質として定義づけられる。さらに、ここで使用されるＴＧＦ−β３前駆体というのは、ヌクレオチド２６３ −２６５によってコードされたメチオニンで始まり、ヌクレオチド１４９６−１４９８でコードされたセリンで終る図１に示されているアミノ酸配列とほぼ同じ配列によって各々コードされた２つのポリペプチドを含む組換え型ホモニ量体タンパク質である。さらに、ここで使用するＴＧＦ−β３前駆体でプロ領域というのは、成熟ＴＧＦ −β無しでＴＧＦ−β３前駆体を含む組換え型タンパク質のことである。特に、ＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域は、ヌクレオチド２６３−２６５によってコードされたメチオニンで始まりヌクレオチド１１６０−１１６２によってコードされたアルギニンで終わる図１に示されたアミノ酸配列とほぼ同し配列によってコードされたタンパク質である。同様にここで使用されているＴＧＦ−βという語は、成熟ＴＧＦ−β（例えばＴＧＦ−β１．−β２．−β３）、ＴＧＦ−β前駆体（例えば、ＴＧＦ−β１前駆体、ＴＧＦ−β２前駆体、ＴＧＦ−β３前駆体）又はＴＧＦ−β（例えばＴＧＦ −β１．−β２．−β３）前駆体のプロ領域のいずれかを意味する。駆体を生産するための方法をも提供する。この方法には：　（ａ）膜Ｐ場内Ｆ万ＩＩをｔｌつＴＧＦ　−Ｒ３前駈休をコードするＤＮＡを！■製すること：本発明は、哺乳類細胞誘導ポリペプチドの混合物から純化された非変性成熟ＴＧＦ− β３を回収する方法を提供する。この方法は、成ＰＴＧＦ−β３に特異的に結合するものの成熟ＴＧＦ−β１及び成熟ＴＧＦ−β２との交叉感受性をほぼ全く示さない抗体と混合物を接触させることを含む。１例においては、哺乳類細胞誘導ポリペプチドの混合物は、ＴＧＦ−β３が中で発現されているヒトのものではない細胞がらのヒト以外の哺乳類のポリペプチドの混合物である。さらに、本発明のもう１つの例においては、抗体をアミノ配列ＹＬＲ５ＡＤＴＴＨ５ＴＶＬＧＬＹＮＴＬＮＰＥＡＳＡＳＹ　ニよッテ規定されルエピトーブに向けることができる。−例を挙げると、前述の抗体を、ＴＧＦ−β３が分離され純化されるような条件下で固体支持体上に固定化させることも可能である。さらに、本発明は、足場膜配列を有するほど純化されたＴＧＦ　−β３前駆体を生産する方法において＝　（ａ）膜足場配列を有するＴＧＦ−β３前駆体をコードするＤＮＡを調製すること；　（ｂ）宿主細胞と相容性ある適切なプロモータに連鎖された発現ベクター内にＤＮＡを挿入すること；（ｃ）ＴＧＦ−β３前駆体が発現されるようにする段階（ｂ）のＤＮＡの発現ならびにそれに続く膜足場配列をもつ発現されたＴＧＦ−３３前駆体の転座を誘発するために、ベクターで宿主細胞を形質転換させること；　（ｄ）培地内で宿主細胞を培養すること：　（ｅ）培地から宿主細胞を分離すること；　（ｆ）膜足場配列を有するＴＧＦ− β３前駆体を含む溶菌液（リゼイト）が生産されるように細胞を分断させること；　（ｇ）はぼ純化されたＴＧＦ−β３前駆体が生産されるような条件下で溶菌液がら膜足場配列をもつＴＧＦ−β３前駆体を純化することを含む方法を提供する。本発明は同様に、足場膜配列をもつほぼ純化されたＴＧＦ−β３前同しアミノ酸配列をコードする、第２のＤＮＡ配列に連鎖された第３のＤＮＡ配列を含むＤＮＡを調製すること；　（ｂ）宿主細胞と相容性ある適切なプロモータに連鎖された発現ヘクター内に段階（ａ）のＤＮＡを挿入すること；　（Ｃ）突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体が発現されるように段階（ｂ）のＤＮＡの発現を誘発するべくベクターで宿主細胞を形質転換すること；　（ｄ）このように発現された突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体が培地内に分泌されるような条件下で培地内で宿主細胞を培養すること；　（ｅ）このように分泌された突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を含む培地から宿主細胞を分離すること；　（ｆ）はぼ純化された突然変異体ＴＧＦ−β３が生産されるように突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を純化することが含まれる。上述の方法はさらに：　（ａ）前駆体から成熟ＴＧＦ−β３を分離するよう、このように回収された純化突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を活性化剤で処理すること、及び（ｂ）段階（ａ）の分離された成！！８７ＧＦ−β３を回収することを含んでいる。さらに、本発明はほぼ純化された突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を生産する（もう１つの）方法も提供している。この方法には、（ａ）ヌクレオチド２６３−２６５によってコードされたメチオニンで始まりヌクレオチド１１４８−１１５０によりコードされたグルタミンで終結する図１に示されているアミノ酸配列とほぼ同しアミノ酸配列をコード化する第１のＤＮＡ配列、プロテアーゼ分割配列をコードし、ヌクレオチド１１５０に連鎖されている第２のＤＮＡ配列、及びヌクレオチド１１６３−１１６５によってコードされたアラニンで始まりヌクレオチド１４９６−１４９８によってコードされたセリンで終結する図１に示されたアミノ酸配列とほぼ同じアミノ酸配列をコードする、第２のＤＮＡ配列に連鎖された第３のＤＮＡ配列を含むＤＮＡを調製すること；　（ｂ）宿主細胞と相容性ある適切なプロモータに連鎖された発現ベクター内に段階（ａ）のＤＮＡを挿入すること；　（Ｃ）突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体が発現されるように段階（ｂ）のＤＮＡの発現を誘発するべくベクターで宿主細胞を形質転換すること；　（ｄ）培地から、発現された突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を含む宿主細胞を分離すること；　（ｅ）突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を含む溶菌液が生産されるよ・うに宿主細胞を分析すること及び；　（ｆ）はぼ純化された突然変異体ＴＧＦ− β３前駆体が生産されるように突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を純化することが含まれる。さらに前述の方法には、（ａ）このようにして回収された純化突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を、前駆体から成熟ＴＧＦ−β３を分離するように活性化剤で処理すること及び（ｂ）段階（ａ）の分離された成ｐ　ＴＧＦ−β３を回収することも含まれる。さらに本発明は、はぼ純化された突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を生産する方法において、（ａ）ヌクレオチド２６３−２６５によってコードされたメチオニンに始まりヌクレオチド１１４８−１１５０によってコードされたグルタミンで終結する図１に示されたアミノ酸配列とほぼ同しアミノ酸配列をコードする第１のＤＮＡ配列、ヌクレオチド１１５０に連鎖されたＡＴＧを含む第２のＤＮＡ配列、ヌクレオチド１１６３−１１６５によってコードされたアラニンで始まりヌクレオチド１４６９−１４７１でコードされたアスパラギンで終結する図１に示されたアミノ酸配列とほぼ同しアミノ酸配列をコードする、第２のＤＮＡ配列に連鎖された第３のＤＮＡ配列、Ｘを含み第３のＤＮＡ配列に連鎖された第４のＤＮＡ配列、及びヌクレオチド１４７５−１４７７によってコードされたバリンで始まりヌクレオチド１４９６−１４９８によってコードされたセリンで終結する図１に示されたアミノ酸配列とほぼ同じアミノ酸配列をコードする、第４のＤＮＡ配列に連鎖された第５のＤＮＡ配列を含むＤＮＡを調製すること、（ｂ）宿主細胞と相客性ある適切なプロモータに連鎖された発現ベクターの中に段階（ａ）のＤＮＡを挿入すること；　（Ｃ）突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体が発現されるように段階（ｂ）のＤＮＡの発現を誘発するべく−、フタ−で宿主細胞を形質転換すること；　（ｄ）発現された突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体が培地内に分泌されるような条件下で培地内で宿主細胞を培養すること：（ｅ）このように分泌された突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を含む培地から細胞を分離すること；及び（ｆ）はぼ純化された突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体が生産されるように、突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を純化すること、を含む方法を提供する。この方法にはさらに、（ａ）前駆体から成熟ＴＧＦ−β３を分離するため臭化シアンでこのように回収された純化突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を処理すること；及び（ｂ）段階（ａ）の分離されたＴＧＦ−β３を回収することが含まれる。さらに、本発明は、はぼ純化された突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を生産する方法において、（ａ）ヌクレオチド２６３−２６５によりコードされたメチオニンで始まりヌクレオチド１１４８−１１５０によってコードされたグルタミンで終結する図１に示されたアミノ酸配列とほぼ同じアミノ酸配列をコードする第１のＤＮＡ配列、ヌクレオチド１１５０に連鎖されているＡＴＧを含む第２のＤＮＡ配列、ヌクレオチド１１６３−１１６５によってコードされたアラニンで始まりヌクレオチド１４６９−１４７１によってコードされたアスパラギンで終結する図１に示されたアミノ酸配列とほぼ同しアミノ酸配列をコードする、第２のＤＮＡ配列に連鎖された第３のＤＮＡ配列、Ｘを含み第３のＤＮＡ配列に連鎖された第４のＤＮＡ配列及びヌクレオチド１４７５−１４７７によってコードされたバリンで始まりヌクレオチド１４９６−１４９８によってコードされたセリンで終結する図１に示されたアミノ酸配列とほぼ同しアミノ酸配列をコードし第４のＤ）ｉＡ配列に連鎖された第５のＤＮＡ配列を含むＤＮＡを調製すること；　（ｂ）宿主細胞と相容性ある適切なプロモータに連鎖された発現ベクター内に段階（ａ）のＤＮＡを挿入すること；　（Ｃ）突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体が発現されるように段階（ｂ）のＤＮＡの発現を誘発するためベクターで宿主細胞を形質転換すること；　（ｄ）培地から、発現された突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を含む宿主細胞を分離すること；　（ｅ）突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を含む溶菌液が生産されるように宿主細胞を分断すること、及び（ｆ）はぼ純化された突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体が生産されるように突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を純化すること、を含む方法も提供している。この方法にはさらに、（ａ）前駆体から成熟ＴＧＦ−β３を分離するため、このように回収された純化突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を臭化シアンで処理すること；及び（ｂ）段階（ａ）の分離された成熟ＴＧＦ−８３を回収することが含まれている。さらに、上述の方法の実施に従うと、段階（ａ）のＸは、ＴＴＴ。ＴＴＣ，ＴＴＡ、　ＴＴＧ、　ＴＣＴ、　ＴＣＣ，ＴＣＡ、　ＴＣＧ、　ＴＡＴ、　ＴＡＣ，ＴＧＴ、　ＴＧＣ，ＴＧＧ。ＣＴＴ、　ＣＴＣ，ＣＴＡ、　ＣＴＧ、　ＣＣＴ、　ＣＣＣ，ＣＣＡ、　ＣＣＧ、　ＣＡＴ、　ＣＡＣ，ＣＡＡ、　ＣＡＧ。ＣＧＴ、　ＣＧＣ，ＣＧＡ、　ＣＧＧ、　ＡＴＴ、　ＡＴＣ，ＡＴＡ、　ＡＣＴ、　ＡＣＣ，ＡＣＡ、　ＡＣＧ、　ＡＡＴ。ＡＡＣ，ＡＡＡ、ＡＡＧ、ＡＧＴ、八ＧＣ，ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＧＴＴ、ＧＴＣ，ＧＴＡ、ＧＴＧ、ＧＣＴ。ＧＣＣ，ＧＣＡ、　ＧＣＧ、　ＧＡＴ、　ＧＡＣ，ＧＡＡ、　ＧＡＧ、　ＧＧＴ、　ＧＧＣ，ＧＧＡ、及びＧＧＧから成るトリ・ヌクレオチドの一群の中から選択することができる。本発明の一実施態様においては、純化はアフイニテイクロマＩ−グラフィによって行なわれる。アフィニティクロマトグラフイの一例は、抗体カラムクロマトグラフィである。アフィニティクロマトグラフィのもう１つの例は、レクチンカラムクロマトグラフィである。レクチンカラムクロマトグラフィは、ＴＧＦ−β３のグリコジル化された前駆体の形態の分離を可能にする。同様に、本発明の一実施例においては、上述の方法の段階（ａ）において、プロテアーゼ分割配列はコラゲナーゼ認識配列であってよい。代替的には、プロテアーゼ分割配列は、因子Ｘａ認識配列であってよい。プロテアーゼ分割配列は、膜を足場としたＴＧＦ−β３前駆体の生産を可能にする。本発明は同様に、突然変異体ＴＧＦ−β３を生産する方法において、（ａ）ヌクレオチド３３２−３３４によってコードされたロイシンで始まりヌクレオチド１４９６−１４９８によってコードされたセリンで終結する図１に示されたアミノ酸配列とは回しアミノ酸配列をコードするＤＮＡを調製すること；　（ｂ）宿主細胞と相容性ある適切なプロモータに作動的に連鎖された発現ベクター内に段階（ａ）のＤＮＡを挿入すること；　（Ｃ）突然変異体ＴＧＦ−β３が発現されるように段階（ａ）のＤＮＡの発現を誘発するべくベクターで宿主細胞を形質転換すること；　（ｄ）培地内で宿主細胞を培養すること；　（ｅ）このように発現された突然変異体ＴＧＦ−β３を含む宿主細胞を培地から分離すること；　（ｆ）突然変異体ＴＧＦ−β３を含む溶菌液を生産するため細胞を分断すること；及び（ｇ）突然変異体ＴＧＦ−β３を純化する段階を含む方法も提供している。上述の方法はさらに、（ａ）突然変異体ＴＧＦ−β３から成熟ＴＧＦ−β３を分離するため、このように回収した純化突然変異体ＴＧＦ−β３を活性化剤で処理すること及び（ｂ）段階（ａ）の分離された成熟ＴＧＦ−β３を回収することを含んでいる。本発明はさらに、（ａ）沈殿剤とＴＧＦ−β３前駆体を接触させかくして沈殿内のＴＧＦ−β３前駆体を濃縮させること；　（ｂ）成軌ＴＧＦ−β３をベレットから分離させるような条件下で酸性化された有機溶液で段階（ａ）にペレットを抽出すること；及び（Ｃ）段階（ｂ）でこのように分離された成熟ＴＧＦ−β３を回収することを含むプロセスをも提供する。本発明に従うと、段階（ｂ）の酸性化された有機溶液は酸性化されたアセトニトリルであってよい。さらに、有機溶液は５０％のアセトニトリルと１．０Ｍの酢酸を含んでいてよい、同様に本発明に従うと、段階（ａ）の沈殿剤は硫酸アンモニウムでありでよい。本発明は同様に、血清結合タンパク質に対する減少した結合親和力を示す突然変異体、成熟ＴＧＦ−β３を生産し識別するための方法をも提供する。この方法には、（ａ）ＴＧＦ−β３をコードするＤＮＡを調製すること；　（ｂ）段階（ａ）のＤＮＡに対し突然変異誘発（例えばランダム突然変異誘発）を行ない、かくして突然変異体ＤＮＡを得ること；　（Ｃ）宿主細胞と相容性ある適切なプロモータに連鎖された発現ベクター内に突然変異体ＤＮＡを挿入すること；　（ｄ）突然変異体ＴＧＦ−β３が発現されるような条件の下で段階（ｃ）の突然変異体ＤＮＡの発現を誘発するため、ベクターで宿主細胞を形質転換すること；　（Ｃ）発現された突然変異体子ＧＦ−β３が培地内に分泌されるような条件下で培地内で宿主細胞を培養すること；　（ｆ）このように発現された突然変異体ＴＧＦ −β３を含む培地から宿主細胞を分離すること；　（ｇ）突然変異体ＴＧＦ−β ３を純化すること；（ｈ）突然変異体成熟ＴＧＦ−β３が突然変異体ＴＧＦ−β ３から分離されるような条件下で、このように発現された突然変異体ＴＧＦ　− β３を活性化すること；及び（ｉ）突然変異体、成ＦＴＧＦ−β３について培地を検定し、かくして血清結合タンパク質に対する減少した結合親和力を示す突然変異体、成熟ＴＧＦ−β３を識別すること、が含まれている。さらに本発明は、血清結合タンパク質に対する減少した結合親和力を示す突然変異体、成Ｆ！ＴＧＦ−β３を生産し識別するためのもう１つの方法を提供する。この方法には、（ａ）ＴＧＦ−β３をコードする［ｌＮＡを調製すること；　（ｂ）段階（ａ）のＤＮＡに対し突然変異誘発（例えばランダム突然変異誘発）を行ないかくして突然変異体ＤＮＡを得ること；　（Ｃ）宿主細胞と相客性ある適切なプロモータに連鎖された発現ベクター内に突然変異体ＤＮＡを挿入すること；　（ｄ）突然変異体ＴＧＦ−β３が発現されるような条件下で段階（ｃ）の突然変異体ＤＮＡの発現を誘発させるべくベクターで宿主細胞を形質転換すること；　（ｅ）発現された突然変異体ＴＧＦ−β３が宿主細胞内で生産されるような条件下で培地内で宿主細胞を培養すること；（ｆ）培地から、このように発現された突然変異体ＴＧＦ−β３を含む宿主細胞を分離すること：　（ｇ）突然変異体ＴＧＦ〜β３を含む溶菌液を生産するため細胞を分断すること；　（ｈ）突然変異体ＴＧＦ−β３を純化すること；　（ｊ）成熟ＴＧＦ−β３が突然変異体ＴＧＦ　−β３から分離されるような条件下で、このように発現された突然変異体ＴＧＦ−β３を活性化すること；及び（ｊ）血清結合タンパク質に対する減少した結合親和力を示す突然変異体、成Ｐ　ＴＧＦ−β３について培地を検定し、かくして血清結合タンパク質に対する減少した結合親和力を示す突然変異体、成熟ＴＧＦ−β３を識別すること、が含まれる。上述の方法の一実施例においては、血清結合タンパク質はα２−マクログロブリンである０代替的には、もう１つの実施例において、血清結合タンパク質はｍ型ＴＧＦ−βレセプタ例えばベータグリカンである。さらに代替的には、血清結合タンパク質は、ＴＧＦ−β前駆体のプロ領域であってよい。本発明はさらに、ＴＧＦ−β３前駆体のほぼ純化されたプロ領域を生産するための方法を提供する。この方法には、（ａ）ＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域をコードするＤＮＡを調製すること、（ｂ）宿主細胞と相容性ある適切なプロモータに連鎖された発現ベクター内にＤＮＡを挿入すること；（ｃ）ＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域が発現されるような条件下で段階（ｂ）のＤＮＡの発現を誘発するべくベクターで宿主細胞を形質転換すること；　（ｄ）培地内で宿主細胞を培養すること；　（ｅ）培地から宿主細胞を分離すること；　（ｆ）　ＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域を含む溶菌液を生産するため宿主細胞を分断すること；及び（ｇ）　Ｔｌｌ；Ｆ−β３前駆体のほぼ純化されたプロ領域が生成されるように溶菌液からＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域を純化すること、が含まれる。さらに、本発明は、ＴＧＦ−β３前駆体のほぼ純化されたプロ領域に生産する方法において、（ａ）ＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域をコード化するＤＮＡを調製すること；　（ｂ）宿主細胞と相客性ある適当なプロモータに連鎖された発現ベクター内にＤＮＡを挿入すること；（ｃ）ＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域が発現されるような条件下で段階（ｂ）のＤＮＡの発現を誘発するためベクターで宿主細胞を形質転換すること；　（ｄ）　ＴＧＦ−β３前駆体の発現されたプロ領域が培地内に分泌されるような条件下で培地内で宿主細胞を培養すること；（ｅ）このように分泌されたＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域を含む培地から宿主細胞を分離すること；及び（ｆ）ＴＧＦ−β３前駆体のほぼ純化されたプロ領域が生産されるようにＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域を純化すること、を含む方法をも提供する。さらに、上述の方法の各々において、宿主細胞は真核細胞か原核細胞のいずれかであってもよい。本発明は、以下の実験詳細説明の項で例示されている。この項は、本発明の理解を助けるべく記されているものであり、いかなる形であれ、以下のクレームに記す通りの本発明を制限することを意図されたものではなく又そのようにみなされるべきものではない。ス）ｊυ書已凋灰ＡＬ　（象、性白血病）ＡＮｒＬ　（成人非リンパ性白血病）ＡＰＲＴ　（アデノシルホスフォリボシル・トランスフェラーゼ）ＢＦｕ−Ｅ（バースト形成単位−赤血球）ＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン）ＣＬ　（慢性白血病）ＣＬＬ　（慢性リンパ性白血病）ＣＭＬ　（慢性骨髄性白血病）ＣＮＢｒ　（臭化シアン）ＣＦＵ　（コロニー形成単位）ＣＦＩＪ−Ｅ　（コロニー形成単位−赤血球）ＣＰＵ−ＧＥＭＭ　（コロニー形成単位−顆粒球、赤血球、マクロファージ、卓球）ＣＦＵ−ＧＭ　（コロニー形成単位−顆粒球／マクロファージ）ＣＦＵ　−ｍｅｇ　（コロニー形成単位−巨核球）ＣＨＯ（チャイニーズハムスタの卵巣）ＣＭＶ　（サイトメガロウィルス）Ｃ５Ｆ　（コロニー刺激因子）ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）ＤＭＥＭ　（ダルヘノコの変更イーグル培地）ＤＭＦ　（ジメチルホルムアミド）ＤＭＳＯ（ジメチルスルフオキシド）ＤＮＡ　（デオキシリボ核酸）ＥＰＯ（エリスロボエチン）Ｆｅ２　（ウシ胎児血清）Ｇ−Ｃ５Ｆ（！Ｉ！粒球−コロニー刺激因子）ＧＭ　−Ｃ５Ｆ　（顆粒球／マクロファージ−コロニー刺激因子）ｋｂ　（キロベースペア）ｋＤａ　（キロダルトン）ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィ）ＩＬ−３（インターロイキン−３）夏Ｌ−４（インターロイキン−４）ＭＥ門（変更イーグル培地）ｍＲＮＡ　（伝令リボ核酸）ＲＮＡ　（リポ核酸）ＴＧＦ−β　（形質転換成長因子−β）ＴＩＦ　（腫瘍抑制因子）ＷＢＣ（白血球） μｍ」−」−−１庁り二二β一旦一を二；−二ドする′　云　のクローニングＴＧＦ−β１に対する相同性をもつ配列を識別するため、はとんどの成熟型ＴＧＦ −β１のｃＤＮＡ配列を含むＰｖｕ　Ｉ［−Ｐｖｕ　ＩＩｎプローブｉｚｐ標識付けし、標準的な方法を用いてＥｃｏＲＩ　、　Ｈｉｎｄｌｌｌ又は５ｓｔｌで消化されたヒトＤＮＡ全てのサザンブロント（３４）をスクリーニングするために用いた。各消化物の中で、低緊縮性洗浄液（２，５ＸＳＳＣ。６５°Ｃ）で２本の帯が存在していた（図２）、洗浄液の緊縮性を増大させたところ（０，０ＩＸＳＳＣ，６５°Ｃ）　、各消化物内に１本のハイブリッド形成帯のみが残った（図２）。強力にハイブリッド形成する帯はＴＧＦ−β１であり、ハイブリッド形成性の弱い帯は、同様にＴＧＦβ３をコードする関連遺伝子である。ＴＧＦ−β３をコードするヌクレオチド配列及びそのアミノ酸配列は（図１）に示されている。ＴＧＦ−β１に対する相同性を有するＴＧＦ−β３をコードする遺伝子を分離するためには、慢性骨髄性白血病細胞系統（Ｋ５６２）のＤＮＡから構成されたヒトのファージライブラリをスクリーニングするべく　ＴＧＦ−β１クローンを用いた。　ＴＧＦ−βｌ及びＴＧＦ−β３をコードする関連遺伝子に対応する２つのゲノム遺伝子座（図１）をクローニングした。Ｋ５６２ライブラリの構成、組換え型クローンのスクリーニング及び分離は基本的にＧｒｏｓｖｅｌｄ他（１５）の手順に従って行なった。ＴＧＦ−β３をコードする配列を含むファージＤＮＡクローンは５ａｕ３Ａで切断し、制限断片はＡ１３にクローニングした。組換え型プラークをＴＧＦ−β１のＳｍａ　Ｉ　Ｐｖｕ　ｎプローブでスクリーニングした。Ｓａｎｇｅｒ他（３３）の方法により６つのハイブリッド形成ゲノミンククローンを配列決定し、約１３０ｂｐの領域でＴＧＦ−β１　ｃＤＮＡに対して相同であることがわかった。これらの実験でクローニングされたＴＧＦβ１及びＴＧＦ β３のアミノ酸配列を比較した場合、８２％相同であることがわかった。ＴＧＦ−β３の反復無しのプローブを得るためには、この遺伝子のＢａｍＨｌ− Ｂａ園）ＩＩサブクローンからのさまざまな制限断片をＴＧＦ−β１ｃＤＮＡならびに全ヒトＤＮＡに対しハイブリッド形成した。遺伝子すなわちＴＧＦ−β３のＢａｍＨＩ　−Ｔａｑ　Ｉ断片はＴＧＦ−β１　ｃＤＮＡとクロスハイブリッド形成することがわかったが、ヒトＤＮＡ内の反復配列要素に対してはハイブリッド形成しなかった。ラムダ−ｇ【１１ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリ（Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ）をスクリーニングするためにはＴＧＦ−β３をコードする配列のＢａｍＨＩ−Ｔａｑ　Ｉ独自のプローブを用いた。２つの強ハイブリッド形成りローンならびに４つの弱ハイブリッド形成りローンを分離した。　ＤＮＡ配列分析により、弱ハイブリッド形成りローンがＴＧＦ−β１に対応することが示された。１つの強ハイブリッド形成りローンを分離し、１．７ｋｂのＥｃｏＲＴインサートをｐＵｃ８にサブクローニングした。このクローンに対する制限断片をＡ１３にサブクローニングし５ａｎｇｅｒ他の方法で配列決定した。この遺伝子の演−されたアミノ酸配列は、ＴＧＦ−β１．ＴＧＦ−β２、グリア芽細胞腫Ｔ細胞すブレンサー因子（Ｇ−ＴｓＦ）、インヒビンーアクチビン、ミューラー抑制因子（Ｍｉｓ）及びショウジヨウバエのデカペンタプレシック転写物複合体を含む遺伝子グループ（２４）と広範な相同性を示し、６つのＣ末端システィン残基は全体を通して保持されている。遺伝子すなわちＴＧＦ−β３の配列を含む１７ｋｂのゲノミックＤＮＡ断片をクローニングした。ＴＧＦ−β３のゲノム遺伝子座でＴＧＦ−β３をコードする１、７　ｃＤＮＡクローンの５′及び３′の部分をハイブリッド形成すると、１．７ｋｂ　ｃＤＮＡ配列がゲノミッククローン内に完全に含まれていることがわかった。ＴＧＦ−β３の最大長メツセージが３．５ｋｂであることを考慮に入れると、完全な遺伝子を得るために付加的な５′及び３′のフランキング配列を分離する必要がある。このことは、ＴＧＦ−β３をコードする遺伝子に独自のプローブでゲノムプローブ及びコスミドライブラリをスクリーニングすることによって行なわれる。ＴＧＦ−β１の中では、配列Ｒ−Ｒは成熟タンパク質を生成するタンパク質分解分割部位を表わしている。　ＴＧＦ−β３内で、配列Ｒ−に−に−Ｒは対応する分割部位を表わしている。分割部位に至るＮ末端領域内では、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β３は３５％の相同性しか示さない。しかしながら、両方のタンパク質は共にフィブロネクチンレセプタによって認識されるＮ末端領域内の配列Ｒ−（、−Ｄを含む。どの細胞型がＴＧＦ−β３を発現するかを決定するためには、５′末４ＥｃｏＲＩ　−Ｂｇｌ　ＩＩｎプローブ用いてノーザンハイブリノド形成を行なった（図３）、ノーザンハイブリノド形成の結果、Ａ６７３　（横絞筋肉腫）　、Ａ４９８　（腎ガン）内の約３．５ｋｂのｍＲＮＡ及びＡ３４９　（肺腺ガン）の中の微弱ハイブリッド形成シグナルが判明した。次に同じノーザンプロットをスクリーニングするために、（タンパク質分解分割の推定部位の下流の配列に対応する）　ＴＧＦβ３の３′領域からのゲノムプローブを用いた。ＴＧＦ−β１　（２，５ｋｂ）、ＴＧＦ　−β３　（３，５ｋｂ）及びもう１つの関連遺伝子（４，２ｋｂ）に対応する３つの強いハイブリッド形成シグナルがＡ６７３及びＡ４９８の両方で観察された（図４）。これらの結果は、このプローブがＴＧＦ−β３に相同な配列と交叉反応するという考え方と一貫したものである。Ｐｓｔ　Ｉ　−Ｂａｌ　Ｉ　ＴＧＦ−β１プローブを用いたＡ６７３．　Ａ３４９及びＡ４９８細胞系統のノーザンブロノト分析を次に行なった。　Ｐｓｔ　ｌ −Ｂａ１　ＩＴＧＦ−β１プローブは、これらの細胞系統合ての中で２．５ｋｂのｍＲＮＡ帯に対して強くハイブリッド形成した。４．２ｋｂ及び３．５ｋｂでも複数の弱ハイブリッド形成帯が見られる（図５）、このプローブは、ＴＧＦ− βｌがこの遺伝子ファミリーのその他のメンバーに対する相同性をほとんど示さない領域である、タンパク質分割部位に至るＮ末端残基に対応する配列を含んでいるため、ＴＧＦ−β１に対しかなり特異的である。次に、ＴＧＦ−βｌ前駆体の完全なコーディング配列を含むＴＧＩ−β１　ｃＤＮＡを用いて、Ａ６７３．　Ａ３４９及びＡ４９８細胞系統のノーザンブロノトをスクリーニングした。このプローブは、ＴＧＦ−β】に相同な配列とクロスハイブリッド形成した。限定的に言うと、ＴＧＦ−β１に対応する２、５ｋｂのｍＲＮＡ帯に対する強いハイブリッド形成が存在した（図６）。ヒトのさい帯及びＡ６７３細胞系統からの■ＲＮＡのノーザンブロノト分析も、プローブとしてＴＧＦ−β３のＥｃｏＲＩ　−Ｂｇｌ　Ｉｆ　ｃＤＮＡ断片を用いてスクリーニングした（図７）。図７は同様に、各レーン内の■ｌ？ＮＡのレベルを標準化するための対照としてアクチンプローブを用いたノーザンプロットの結果も示している。アクチンｍＲＮＡレベルに標準化されたとき、さい帯はこれまで検討されてきたその他のｌｌＲＮＡ供給源に比べて最高レベルのＴＧＦ− β３をコードする遺伝子のｌｌｌＲＮＡを発現する。ＥｃｏＲ１で消化されＴＧＦ−β３のＳｍａ　Ｉ　−Ａｖａ　Ｉ　ｃＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリッド形成されたさまざまな異なる腫瘍のＤＮＡについて、サザンプロット分析を行なった。低（２，５ｘｓＳＣ，６５”ｃ）及び高（０，３ｘ　ｓＳＣ，６５°Ｃ）の両方の緊縮性の洗浄でハイブリッド形成を行なった。サザンブロノト分析は、ＴＧＦ−β３に関連するその他の遺伝子座の存在の可能性を示した。プローブは、低緊縮性で洗浄される場合にのみ観察された２つの帯（３ｋｂ及び１２ｋｂ）とハイブリッド形成した。」工り二Ｌｌ茎１づＥ　６ＵＪ４ＪＬ炙６ｆｌ潜」ど［意ｔｒｐ　Ｅ遺伝子の小さな領域に融合されたＴＧＦ−β３のＣ末端の１５０のアミノ酸を含むキメラ細菌性タンパク質すなわち融合タンパク質が構成されてきた。この融合タンパク質は、ＴＧＦ−β３の成熱型のアミノ酸番号９〜２８から誘導されたペプチドに対して生産された抗体によって認識された。この抗体は、ｔｒｐＥ：：　ＴＧＦ− β３融合タンパク譬を認識した。又このペプチドはこの抗体の結合のためＴＧＦ −３３と特異的に競合する。ＴＧＦ−β３に対しコードするＤＮＡ配列をｐＫＳベクター内にクローニングした。このベクターは、誘導」■プロモータ及び多重クローニング部位を含むｐＡＴＨＵ誘導体である。結果として得られた構成体は、ｔｒｐ　Ｅ遺伝子の最初の２２のアミノ酸、ＴＧＦ−β３のＣ末端の１５０のアミノ酸から成るキメラタンパク質を生産する。これらのクローンを含む形質転換体をまず制限エンドヌクレアーゼ分析でスクリーニングし、究極的にキメラタンパク質の生産のためＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によりスクリーニングした。３つのクローンすなわちｐＨ６、Ｐ１Ｓ４及びＰ２Ｓ５のタンパク質生成物は図８に示されている。これらの細胞を、早期対数期に達するまで規定培地内で成長させ、次にｔｒｐ　Ｅ誘導物質インドールアクリル酸（ＩＡＡ）が存在する中で又は存在しない状態で３時間塩！した０次に細胞を収集し、分解し、そのタンパク質を１２．５％のＳＯＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させた０図８は、クーマシーブルーで染色させたこのような１つのゲルの写真である。これを見ればわかるように、溶菌液ｐ１１６及びＰ１Ｓ５は、ＩＡＡが存在する中でその相対的存在量が増加する約１９０００ダルトン分子量のタンパク質を生産する。これとは対照的に、Ｐ１Ｓ４はこのタンパクｉｌｌを生産しない、　ｐＨ６及びＰ１Ｓ５は両方共、制限分析によって１９５００ダルトンの分子量の融合タンパク質を生産するべき配向でクローニングされたＴＧＦ−β３の配列を有するプラスミドを含んでいる。　Ｉ）１３４のプラスミドは、反対の配向でＴＧＦ−β３の配列を有することがわがった。ｔｒｐＥ：：　ＴＧＦ−β３融合タンパク質は、抗原としてＴＧＦ−β３の一部分に相同なペプチドを用いた抗体の特異性をテストするのに用いられた。配列内の残基９つまりアルギニンがセリンと置換されることを除いて、成熟ＴＧＦ−β ３の残基９〜２８に対応するポリペプチドを合成した。ペプチドは、逆相ＨＰ１．Ｃで純化し、ウサギにおける免疫原として使用するためキーホールリンベントヘモシアニンに結合させた。最初の注入（５００μｇ）から３３日後、−ウェルあたり１１００ｎのペプチドを用いて標準ＥＬＩＳＡにより抗血清をスクリーニングした。１匹のウサギは１：２５の抗血清希釈で１．００Ｄ　（光学密度）単位のシグナルを示した。このウサギを最初に出血させてがら１０日後に、２５０＋ｓｇの共役抗原のブースタを与えた。最初の出血から２０日後の次の出血は、ペプチド抗原に対する抗体応答の２０倍の増加を示した。最初の出血から４０日後（第３の出血）、抗体の１：８０００希釈で１．００Ｄ単位のシグナルが達成され、これは第２の出血に比べ１６倍の抗体力価の増大である。この抗体は、ＴＧＦ−β１配列から誘導された相同ペプチドとわずかな交差反応性しか示さなかった。ＴＧＦ−β１誘導ペプチドは、成ｐ　ＴＧＦ−β１タンパク質のアミノ酸番号４〜１９から成っていた。１１個の共通アミノ酸すなわち残基９〜１９のうち、７個がＴＧＦ−β３とＴＧＦ−βｌの間に保たれている。ペプチド認識抗体がＴＧＦ−β３を認識できるか否かを決定するために、この抗体をｔｒｐＥ：成熟ＴＧＦ−β３及びｔｒｐＥ：成熟ＴＧＦ　−β１融合タンパク質に対するウェスタンプロット分析で使用した。図９を見るとわかるように、抗ペプチド抗体はＴＧＦ−β３の融合タンパク質と強く反応したが一方ｔｒｐ　Ｅ　：　：　ＴＧＦ−β１融合タンパク質とは弱くしか反応しなかった。融合タンパク質は両方共、市販の抗−ＴＧＦ−β１抗体（Ｒａｎｄ　Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）によって認識された（図９）。図９を見るとわかるように、ＴＧＦ−β３を認識する抗ペプチド抗体は同様に、細菌タンパク質に対する高レベルの背景反応性も有している。この交差反応性を減少させるために、我々は、抗原として用いられたもとのペプチドを含むＣＮＢｒ−セファロースカラム上で抗体を純化させた。抗体は、ＴＧＦ−８３のペプチドに対するその高い力価及びＴＧＦ−β１から誘発された相同ペプチドに対する低い交差反応性を保持していた。純化された抗体はＴＧＦ−β３の融合タンパク質と非常に強く反応する。ＴＧＦ−３と　人された丁ＧＦ−１の　玄サルのＣＯ８細胞内でヒトの組換え型ＴＧＦ−β１を発現させた。ｐｓｖｔ真核発現ヘクター（Ｐｈａｒ麟ａｃｉａより得たもの）を用いてＳＶ４０プロモータから下流で、ＴＧＦ−β１　ｃＤＮＡの完全な前駆体をコードする配列をクローニングした。この構成体を、標準リン酸カルシウム沈殿法（１３）を用いてＣＯＳ細胞内に形質移入した。形質移入（トランスフェクション）の後、２日間無血清培地内で約４Ｘ１０’個の細胞を成長させた。馴化培地を次に収集し、酸性化し、生物学的活性についてテストした。ＴＧＦ〜β１形質移入細胞からの馴化培地は、ｐＳＶＬベクター単独で形質移入されたＣＯＳ細胞からの馴化培地がわずか３２％しかＣＣＬ６４細胞の成長を抑制しなかったのに比べて、この単層のミンクの肺の供試細胞系統（ＣＣＬ６４）の成長を５９％抑制することがわかった。ＴＧＦ−β１前駆体：：成熟ＴＧＦ−β３融合構成体のキメラプロ領域を、ＴＧＦ−β１前駆体の５′配列をＴＧＦ−β３をコードする配列で置換することによって作製した。２つのタンパク質が相同性を有しそのシスティン残基の位置が保持されていることがら、このような構成体がＣＯＳ細胞内に形質移入された時点で、新しい融合タンパク質は生物学的に活性な成熟ＴＧＦ−β３へと処理される。マウスの哺乳類ａｉｍウィルス（ＭＭＴＶ）の長末端反復のＳＶ４０プロモータのいずれかの調節配列の下でクローニングされたｔｒｐ　Ｅ　：　：　ＴＧＦ −β３融合から成る付加的な構成体を作製し、過渡的形質移入実験で生物学的活性についてテストした。、汐ｕ：ｆｆ　コード　る゛　云　の　゛なる配置゛ＴＧＦ−８３をコードする遺伝子の無反復プローブでラムダｇｔｌｌのヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリ（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈの１２　Ｘ　１０’個の独立したクローン）をスクリーニングした結果、１．７ｋｂのｃＤＮＡクローンが分離された。ノーザン分析で、ＴＧＦ− β３に対するｎＲＮＡは、約３．５ｋｂであることがわかった。このことは、全長のｃＤＮＡが得られながったことを示している。付加的な５′配列情報を得るためには、胎盤ｃＤＮＡクローンから誘導された５ ’　ＥｃｏＲＩ　−ＢｇｌＩ［制限断片で、ラムダｇｔｌｌヒトさい帯ｃＤＮＡライブラリ（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ、　１．５Ｘ１０’個の独立クローン）をスクリーニングした。この結果、１．９ｋｂのｃＤＮＡが分離された。配列分析から、このクローンが５′配列情報の付加的な１８０のヌクレオチドを含んでいることが判明した。さい帯ライブラリからのこのｃＤＮＡの分離は、この遺伝子がこの＆Ｉｌ織内で活発に転写されることを再度確認している。ＴＧＦ−−β３をコードする遺伝子についてのさらなるｃＤＮＡ配列情報を得るため、ｍＲＮＡをＡ６７３細胞から分離し、ｃＤＮＡライブラリを調製した。５ μｇのポリ（Ａ）　”　ｌ？ＮＡで始めて、Ａｍｅｒｓｈａｍ　ｃＤＮＡ合成システムを用いメーカーの千１＋［に従って、ラムダｇｔｌｏ内で約２Ｘ１０６個のクローンのランダムブライミングされたｃＤＮＡライブラリを構築した。１．９ｋｂ　ｃＤＮＡクローンの５′末端近くの配列に相応する２５−　ｍｅｒオリゴヌクレオチドブローフ゛（５’　ＡＴＡ丁ＡＧＣＧＣＴＧＴＴＴＧＧＣＡＡＴＧＴＧＣＴ３’　）で、約０．７　Ｘ　１０’の末端幅のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンをスクリーニングし、　１．７ｋｂのインサートを含む単一の正クローンを識別した。３つの重複するｃＤＮＡ　（図１０）の分析から、最大のオープンリーディングフレームが１２３６個の塩基である、２５２９個の塩基の配列が判明した。重複するｃＤＮＡの中では配列差は全く見られず、このことは、これらのｃＤＮＡが同し遺伝子の転写物から誘導されたものであることを示している０重複配列は、ポリ（Ａ）トラクトから２５ｂｐ上流に１つのポリアデニル化シグナルを伴って１０３１ｂｐの完全な３′未翻訳領域を含んでいる。５′未翻訳領域は、２６２ｂｐを含むが、ノーザン分析で見積られたｍＲＮＡ０サイズから判断されるように、約１ｋｂ欠如している。ＴＧＦ−β３をコードする遺伝子の予想アミノ酸配列は、ンバク質は全て、同様に、前分泌シグナルペプチド配列（３１１を表わしうる疎水性Ｎ末端をも有している。興味深いことに、ＴＧＦ−β１ＴＧＦ−β１及びβ２に対する広範な相同性を示す（図１１）（８，９，２２）ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２はそれぞれ３９０及び４１４個のアミノ酸残基の前駆体形態で生産される（８．９）。ＴＧＦ−β３をコードする遺伝子すなわちＴＧＦ−β３（図１）について得られたｃＤＮＡ配列は、１６２ヌクレオチドだけ上流で、第１のＡＴＧの前に１つの停止コドンが先行している状態で、４１２個のアミノ酸についてコードするオープンリーディングフレームを含んでいる。ＴＧＦ−β１　（１０）について見られるように、腫瘍抑制活性をもつタンパク質のための開始コドンは、Ｋｏｚａｋコンセンサスの一部を成していない（２０）。興味深いことに、６つのヌクレオチドだけ下流には、Ａが−３の位置にある状態で、ＴＧＦ−β２内の開始コドンと整列する第２のＡＴＧが存在する（９）。ＴＧＦ−β１とβ２のＣ末端の１１２の残基のホモニ量体は、これらのタンパク質の生物学的に活性な形態を表わす。その成熟形態への分割部位に先行して、ＴＧＦ−β１及び−β２はそれぞれ４及び５個の塩基性残基の伸張を有する。ＴＧＦ −β３内には、星印の付いた分割部位に先行して５つの塩基性残基が存在する。　ＴＧＦ−β１及び−β２の成熟形態は８０／１１２の同し残基を共有する。ＴＧＦ−β３内の対応する１１２のＣ末端アミノ酸は、それぞれＴＧＦ−β１及び −β２に比べて８６／１１２及び８９／１１２の同し残基を示す（図１１）。残る差異の多くが、保存的置換を表わす、３つのタンパク質は全てこの領域内のシスティン残基の厳密な保存を示している。　ＴＧＦ−β３前駆体のＮ末端領域は、ＴＧＦ−β１に対する約３５％の相同性及びＴＧＦ−β２に対する４５％の相同性を示している。比較すると、ＴＧＦ−β１及び−β２β２前駆対応する配列は３３％の配列相同性を有する（図１１）、（８，９）、ＴＧＦ−β３前駆体のＮ末端部分内には４つの潜在的グリコジル化部位が含まれており、そのうちの１つは３つのタンパク質金ての中に含まれている。３つのりＸｂａ　Ｉで切断した真核発現ベクターｐＯＲＦＥＸ（３）内にクローニングした。この構成体（ｐＣＭＶ：　ＴＧＦ−β３）において、ＴＧＦ−β３　ｃＤＮＡ及びＴＧＦ−β３は両方とも（ただしＴＧＦ−β２は除＜）、フィブロネクチン結合配列Ｒ−Ｇ−Ｄ（３２）を含んでいる。ＴＧＦ−β１及び−β２に対する類推によると、−β３は、成熟ポリペプチドを生産するためタンパク質分解分割を受けるＴＧＦ−β３前駆体の形で合成される。ＴＧＦ−β１及び−β２に対する機能的及び構造的相同性に基づくと、−β３は、ガン治療、創傷ゆ合及び免疫抑制において治療的活性をもつ可能性が高い。班主上」旺二り主Ω光嬰ＴＧＦ−３の　１盗完全なＴＧＦ−β３タンパク質をコードするＴＧＦ−βｃＤＮＡの１５００ｂｐのＡｌｕｌ−１１ｇａｌ制限断片を、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ。Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）内にクローニングし、プラスミドｐＢ１ｕｅ　ＴＧＦ　−β３を生成させた。このベクターのｆ１遺伝子間領域は、ｆ１ヘルツマーファージでのその宿主細胞の感染を介しての一本鎖ＤＮＡの生産を可能にしている。ＴＧＦ−βの開始コドンは、翻訳効率に影響を及ぼすことが示されたＫｏｚａｋコンセンサス配列（ＣＣＡＣＣ（ＡＴＧＩ　Ｇ）　（２０）の一部を成していない。組換え型ＴＧＦ−β３タンパク質の高い収量を促進するため、Ｎａｋａｍａｙｅ及びＥｃｋｓｔｅｉｎ　（２６）の方法を用いてＣＡＣＡ［ＡＴＧ）　ＡをＣＣＡＣＣ［ＡＴＧ）　Ａに変えることにより、さらに効率の良い翻訳配列へと開始コドンのフランキング配列を突然変異誘発した。突然変異誘発を配列分析により確認した。発現収量は、ＴＧＦ−８３の５′及び３′未翻訳〔非コーディング〕配列の消失によってさらに最適化される。それに続いて、突然変異誘発されたｐＢｌｕｅ　−ＴＧＦ−β３を、ｃＤＮ＾インサートに隣接する２つのポリリンカー制限部位であるＫｐｎ　Ｉ及びＳｐｅ　Ｉで切断した。この断片を、Ｋｐｎ　Ｉ及び配列は、サイトメガウィルスの即時型プロモータによって転写調節ビヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（独自のプロモータによって駆動されたハムスタのＤＨＦＲミニ遺伝子を含むｐＤｃｌ（ＩＰプラスミド）とｐＣＭＶ−ＴＧＦ−β３構成体（図１２）を、ＤＨＦＲ遺伝子（３５）が欠如したチャイニーズハムスタの卵巣（ＣＨＯ）細胞内に同時形質移入することによって、ＴＧＦ−β３を発現する安定した形質転換体を得た。ＤＮＡ形質移入には標準的なＣａＰＯ４ＤＮＡ沈殿法（１３）を用いた。それぞれ１０μｇ対５０ｕｇＯ比で、ｐＣＭＶ：　ＴＧＦ−β３　（５，７ｋｂ）及びｐＤＣＨＩＰ　（２，５ｋｂ）をＣａＰＯａと共同沈降させ、沈降物を０．５Ｘ１０６のＣＨＯ（ＤＨＦＲ−）細胞に付加した。ＤＨＦＩＩ＋表現型での形質転換体の選択を、１０％の透析されたウシ胎児血清で補足されたアルファＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）内で行なった。選択培地内で１０〜１４日間培養した後に現われたコロニーを、標準的な方法で分離し、拡張させた。遺伝子増幅のために、メトトレキセート　（ＭＴＸ；　Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ＋　ＭＯ）の濃度を増大させながら、−次形質移入体を段階的選択に付した。第１回目の選択は２０ｎＭのｌ’ｌＴＸで行なった。ＴＧＦ−β３のｍＲＮＡの発現をアクチンの発現に標準化するＲＮＡサイトドントハイブリッド形成によって、ＴＧＦ−β３の発現レヘルを測定した。初期の高い発現を伴う３つのクローンのうちの２つ（クローンＣＨＯ６，３５及びＣＨＯ９，１）は２０ｎＭのＭＴＸｆｉ度でＴＧＦ−β３　ｍＲＮＡ発現の増大を示した（図１３）。Ｃｌｌ０細胞（レーン１　）　、Ｃ）ｔｏ　６．３５　（レーン２）及びＣＨＯ６，３５（２０ｎＭ）（レーン３）からの合計ＲＮＡ　（７５ｕ　ｇ　）を１．２％のアガロース−ホルムアルデヒドゲル上で分画し、ニトロセルロース上にブロッティングし、ＴＧＦ−β３特異プローブ（さい帯から分離された部分的ＴＧＦ−β３　ｃＤＮＡクローンのＥｃｏＲＩ　−Ｓｅａ　Ｉ　ｃＤＮＡＤＮＡ制限断片二番１０参照べた。馴化培地からの初期タンパク質純化及びさらなる遺伝子増幅のため、最高の発現レベルを有するＣＩ（０６，３５／２０ｎＭ　（２０ｎＭのＭＴＸでの一次形質移入体ＣＩＯクローン６．３５）を選択した。さらなるＭＴＸ選択（１０ＨＭのＭＴＸ）からの最高のクローンを拡張させ、凍結原料のバンクを打ち立てた。このクローン６．３６Ｈを、ＴＧＦ−β３のその後の生産全てにおいて使用し、１０％の透析された胎仔ウシ血清で補足されたアルファＭＥＭ内でＴ２２５のフラスコ　（２２５ｃｍ”）の中に維持した。ＴＧＦ−β３の生産には、１０％の透析されたＦＢＳで補足されたアルファＭＥＭ内の６．３５Ｈの３つの集密フラスコからの細胞をＮｕｎｃ細胞生産工場（１つの生産工場につき６０００ｃｍ”の表面積）に接種することが関与していた。細胞は、細胞生産工場内で８０％の集密性まで成長させた。次に、培地をＭＢＣ）１０つまりＨＡＮＡ　（Ｈａｎａ　Ｂｉｏ−１ｏｇｉｃｓ）からの無血清培地で置換した。７２時間後、合計５個の馴化ＨＢＣＨＯ培地の収集のため、培地を除去し新鮮なＨＢＣＩ（Ｏと交換した。１（ＢＣＨＯ馴化培地の第１の収集は、低いレベルのＴＧＦ−β３を含んでおり、最大量は、４回目〜６回目の収集において生産された。Ｎｕｎｃ細胞生産工場は、Ｃ）１０などの単層細胞系統の大規模成長に充分な表面積を提供し、無菌環境内での許容可能な程度の使い易さで、一つの生産工場あたり合計７．５リツトルの馴化培地を生み出す（収集−回あたり２．５リツトルで、３回の収集）。より進んだ発現ヘクター系を用いると、当業者なら生産収量を著しく増大することができるはずである。代替的には、細胞系統を懸濁成長に適合させ、撹拌されたタンク発酵システム内又はエアリフト型発酵槽の中で生産させることができる。単層細胞（すなわちＣＨＯ細胞）を撹拌式又はエアライフ懸濁培養に適合させる手段として多孔性ガラスシリンダサポートを使用することも同様に評価され、許容可能なＴＧＦ−β３収量を与えることが示された。六然；ｔｃｐ−３＋の突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体は、標準的な部位誘導突然変異誘発手順を用いて、ＴＧＦ−β３プロ頭域を成熟ＴＧＦ−β３の間のＲ−に−に−Ｒ分割部位を例えば因子Ｘａ分割配列（Ｉ　Ｉｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）又はコラゲナーゼ分割配列（Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）　（図２２）などのプロテアーゼ分割部位へと突然変異させ、その後、発現ベクター内に突然変異体ＴＧＦ−β３核酸を挿入し突然変異体ＴＧＦ−β３／ベクターＤＮＡを選択可能なマーカー（例えばｎｅｏ、　ｄｈｆｒ）をコードするＤＮＡと共に宿主細胞（例えば大ｌｌ１ｍ、あらゆる哺乳類細胞、例えばＣＨＯ又はＨｅＬａ細胞、哺乳類以外のを椎動物の細胞、′例えばひなの細胞及び無を椎動物の細胞例えば昆虫の細胞）内に形質移入することによって、宿主細胞内で単一のホモ二量体ポリペプチドとして発現される。さらに、突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体は、ヌクレオチド２６３−２６５でコードされるメチオニンで始まりヌクレオチド１１４８−１１５０でコードされるグルタミンで終わる図１に示されたアミノ酸配列とほぼ同しアミノ酸配列をコードする第１のＤＮＡ配列、ヌクレオチド１１５０に連鎖されたＡＴＧを含む第２のＤＮＡ配列、ヌクレオチド１１６３−１．１６５によりコードされるアラニンで始まりヌクレオチド１４６９−１４７１でコードされたアスパラギンで終わる図１に示されたアミノ酸配列とほぼ同しアミノ酸配列をコードし第２のＤＮＡ配列に連鎖された第３のＤＮＡ配列、ＴＴＴ、　ＴＴＣ，ＴＴＡ、　ＴＴＧ、　ＴＣＴ、　ＴＣＣ，ＴＣＡ、　ＴＣＧ、　ＴＡＴ、　ＴＡＣ。ＴＧＴ、ＴＧＣ，ＴＧＧ、　ＣＴＴ、　ＣＴＣ，ＣＴＡ、　ＣＴＧ、　ＣＣＴ、　ＣＣＣ，ＣＣＡ、　ＣＣＧ、　ＣＡＴ。ＣＡＣ，ＣＡＡ、ＣＡＧ、ＣＧＴ、ＣＧＣ，ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＴＴ、ＡＴＣ，ＡＴＡ、ＡＣＴ、ＡＣＣ。ＡＣＡ、ＡＣＧ、ＡＡＴ、ＡＡＣ，ＡＡＡ、ＡＡＧ、ＡＧＴ、ＡＧＣ，ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＧＴＴ、ＧＴＣ。ＧＴＡ、ＧＴＧ、ＧＣＴ、ＧＣＣ，ＧＣＡ、ＧＣＧ、ＧＡＴ、ＧＡＣ，ＧＡＡ、ＧＡＧ、ＧＧＴ、ＧＧＣ。ＧＧＡ及びＧＧＧから成るリストからのいずれかのトリヌクレオチド配列を含み第３のＤＮＡ配列に連鎖された第４のＤＮＡ配列を含むＤＮＡを調製することによって、生産されうる。このＤＮＡは同様に、ヌクレオチド１４７５−１４７７によってコードされるバリンで始まりヌクレオチド］、４９６−１４９８によってコードされるセリンで終わる図１に示されたアミノ酸配列とほぼ同しアミノ酸配列をコードし、第４のＤＮＡ配列に連鎖された第５のＤＮＡ配列をも含んでいる。当業者であれば、このようなりＮＡを適切な発現ベクター内に挿入し、選択可能なマーカー（発現プラスミドに連鎖されているか又はされていない）と共に宿主細胞内に形質移入させることが可能である。形質移入された細胞は、選択可能なマーカーを発現する細胞を選択する適当な培地内で培養でき、このような細胞は突然変異ＴＧＦ　−β３の発現についてさらに特徴づけられる。このように誘導された細胞は、その後の純化のために突然変異体ＴＧＦ−β３を生産するのに使用可能である。プロテアーゼ分割部位がＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域と成熟領域を分離している場合、タンパク質分解分割によって前駆体から成Ｆ！ＴＧＦ−β３を放出させることができる。同様に、ヌクレオチド１４７２−１４７４でメチオニンが欠如している突然変異体成ｐ　ＴＧＦ−β３とＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域をメチオニンが分離している場合、突然変異体、成ｐ　ＴＧＦ−β３を放出するのに臭化シアン処理を用いることができる。、立上のための０．１Ｍの最終４度まで馴化培地を酢酸で処理し、生物学的活性について連続希釈をテストした。ミンクの肺（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ）から誘導された細胞系統であるＣＣＬ６４は、さい帯から分離された自然に発生するＴＧＦ−β３に対しきわめて感応性が高いことがわかった。従って、Ｉ　ｗａ　Ｌａ他（１９）の方法に従って組換え型ＴＧＦ−β３タンパク質の生物学的活性について馴化培地をテストするために、当初この細胞系統が選択された。ＴＧＦ　−β１（純化されたもの）又はＴＧＦ−β３（馴化培地からのもの）によって生産されたＣＣＬ６４　ミンク肺細胞の成長抑制が、図１４Ａ／Ｂに示されている。図１４Ａは、純化ＴＧＦ／βｌ　（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いた成長抑制の用量応答を示す。Ｏ，］、ｎｇのＴＧＦ−β１で５０％の抑制が得られた。２０ｎＭのＭＴＸでの選択された形質移入体からの馴化培地と親形質移入体からの培地を比較すると、ミンク細胞成長抑制活性の増大が見られた。図１４Ｂは、ＣＨＯ６，３５／２０ｎＭの形質移入体（閉じた円）及びＣＩＯ６，３５形質移入体（開いた円）の酸活性化された無血清上澄みの生物学的活性を示している；それぞれ３０ｎｇ／−１及び５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１活性と等価の５０％の抑制が得られた。親Ｃ）１０　（ＤＨＦ！＋　−）からの馴化培地は、いずれの形質移入体よりもはるかに低い成長抑制を有していた。これらの結果は、明らかに、ＴＧＦ−β３　ｃＤＮＡが転写されていること、そしてＴＧＦ−β３　ｍＲＮＡが翻訳され生物学的活性をもつタンパク質を生産していることを示している。ＥＧＦが存在する場合、ＴＧＦ−β３を含むＣ）１０６．３５からの酸性化された馴化培地は、ＮＲＫ細胞の軟質寒天成長を促進することができた。軟質寒天内のＮｉ１Ｋ細胞の成長は、創傷のゆ合における重要なパラメータである細胞外基質タンパク質の生産を刺激することによって誘発可能であることが立証された。免炎検上ＴＧＦ−β３タンパク質のさまざまな部分的アミノ酸配列に相応するペプチドを、ｔ、Ｂ　ｏ　ｃ化学（図１５）を用いたＡｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓｔｅＩｌ＋ｓのベグチド合成器（４３ＯＡ型）で合成した。ペプチドをグルタルアルデヒドテキーホールリンペットヘモシアニンに結合させ、ウツキの免疫化のために用いた。抗体力価を特徴づけするため最初酵素結合免疫吸着検定を用いた（表１）、このため及び以下の免疫学的実験のためには、標準的な技術を用いた（１７）。β３Ｖ又はβ３■ペプチドを注射した免疫化されたウサギからの高力価の抗体を、Ａｆｆｉ−ｐｒｅｐｌ。（ＢｉｏＲａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）に接合されたそれぞれのペプチドβ３抗原から成るアフィニティ基質を用いて純化した。表　１ペプチド　配　列　エリザ力価Ｉ　ＥＥ門ＨＧＥＲＥＥＧＣＴ［１ＥＮＴＥＳＥＹ　１　：　６．０００ｎＬ　ＧＤＩＬＥＮＩ）ＩＥＶＭＥＴＫＲＫＧＶＤＮＥＤＤ　１　：　１０，０００Ｕｓ　ＧＤＩＬＥＮＴＩ（ＥＶＭＥＩＫ　１　：　１９，０００ＩＴ［ＤＴＮＹＣＦＲＮＬＥＥＮＣ１：２６，０００ＴＶ　ＣＶＲＰＬＹＩＤＦＲＱＤＬＧＷＫＷＶＨＥＰＫＧＹＹＡＮＦＣ１：　１９，０００Ｖ　ＹＬＲ５ＡＤＴＴＦＩＳＴＶＬＧＬＹＮＴＬＮＰＥＡＳＡＳＹ　１　：　２６，０００ＶＩ　ＣＶＰＱＤＬＥＰＬＴＩＬＹＹＶＧＲＴＰＫＶＥＱＬＳＩＩＭＶＶＫＳＣ１：　４，０００アフイニテイ純化されたβ３■抗体は、ＴＧＦ−β１又は−β２のいずれかからの同族体ペプチド配列に比べて３００倍以上のβ３■ペプチドに対する特異性を示す。さらに、ＴＧＦ−βｌ又は−β２のいずれのタンパク質に対しても、この抗体の著しい交差反応性は全（観察されなかった。しかしながら、この抗体の馴化培地からの天然の組換え型ＴＧＦ−β３タンパク質を免疫沈降させる能力は、きわめて制限されたものにすぎない。アフィニティ純化されたβ３ｖ抗体は、ＴＧＦ −β１からの対応するペプチド配列に比べ少なくとも４倍のβ３■ペプチドに対する選択性を示す。この抗体は同様に、天然のＴＧＦ−β３タンパク質を効率良く免疫沈降させることもできる（図１６）　、。図１７Ａ／Ｂは、検出のためβ３ｍ及びβ３■の抗体を用いてＣＩ（０６，３５／２Ｏｒ＋Ｐ形質移入体により生産された馴化培地内のＴＧＦ−β３の免疫プロットを示す、ペプチド遮断実験のためには、プロットを伴う装置に先立って８０倍のモル余剰分のペプチドと共に抗体を予備点Ｉした。検出のためには、ヤギ抗ウサギＩｇＧに対し接合されたアルカリ性ホスファターゼ（Ｚｙｍｅｄ、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　ＣＡ）を第２の抗体として用いた。図１７Ａは電気泳動に先立って試料を還元に付したゲルのウェスタンブロンドを示し、一方図１７Ｂは非還元性条件下での試料のウェスタンブロンドを示す。各図において、レーン１〜３及び４〜６はそれぞれβ３ｖ及びβ３■抗体で免疫プロットされた馴化培地に相応し、レーン２及び５は、余剰同族体ペプチドの存在する中で行なわれた免疫プロットに相応する。アフィニティ純化されたβ３■及びβ３Ｖ抗体を用いた還元性条件下のＣＨＯ６，３５／２０ｎＭ細胞からの馴化培地のウェスタンブロッティングは、５０ｋＤａ及び１２ｋＤａの帯を検出した。これらの帯は、Ｇｅｎ　ｔｒｙ他（１１）及びＭａｄｉｓｅｎ他（２２）　（図１７Ａ／Ｂ）によって記されたＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２の処理に対する類推により、ＴＧＦ−β３前駆体及び成ｐ　ＴＧＦ−β３に相応する。非還元条件下で、１００ｋＤａ及び２４ｋＤａの帯を観察した。これらは、ＴＧＦ−β３前駆体及び成熟ＴＧＦ−β３のホモニ量体形態に相応すると考えられる。見かけの前駆体は、いくつかのグリコジル化されたタンパク質の特徴である広い帯として現われる。ＴＧＦ−β３の前駆体形態のシグナルペプチド配列の分割に続いて、４３ｋＤａの問（分子ｉりをもつタンパク質が期待される（還元条件下で）。ＴＧＦ−β３の一次配列に基づき、４つのＮ連鎖グリコジル化部位が存在し、このことはさらに、検出された前駆体タンパク質がグリコジル化されていることを表わしている。１Ｊ１８Ａ、／Ｂは、検出のためβ３■抗体を用いた、ＣＨＯ６，３５／２０ｎＭ形質移入体の馴化培地（図１８Ｂ）と細胞抽出物（図１８Ａ）のウェスタンプロットを示す。細胞抽出物の調製のためには、細胞をまず食塩前リン酸緩衝液で洗浄し、次に、ゲル電気泳動に先立ちＳＯＳ／β−メルカプ］・エタノールで直接溶解した。ペプチド遮断のためには（レーン２及び４）、プロットを伴う温室に先立ち１００倍のモル余剰分の特異的ペプチドと共に、抗体を温室した（検出のためには１２５１タンパク質Ａを用いた）。還元条件下でのＣＨＯ６，３５／２０ｎＭの細胞抽出物内で、潜在的前駆体形態に相応する５０ｋＤａの帯のみが検出されている（図１８Ａ／Ｂ）。ウェスタ〉 ′ブロッティングに先立ってペプチド免疫原で抗体を予備吸収することによって、抗体の特異性を実証した（図１７Ａ／Ｂ及び１８Ａ／Ｂ）。予想どおり、ｍＲＮＡ及び生物学的活性のデータに基づくと、抗体は、親ＣＨＯ（ＤＨＦＲ−）細胞の馴化培地内でいかなるＴＧＦ−β３タンパク質も検出しなかった。天然組換え型ＴＧＦ−β３タンパク質の免疫沈降についても両方の抗体をテストした（Ｅ１６）。ＣＩ（０６゜３５／２０ｎＭを、集密性を有するまで成長させ、５％の透析されたウシ胎児拘清及び５％の透析されていないウシ胎盤血清の存在する中でメチオニン無しのＤｈＥＭ内で２４時間（ｚｓＳ］メチオニンで標識づけした。培地を収集し、４°Ｃで２時間、１０μｇ／ｌｓＩのアフィニティ純化抗体と２０μｇ／ｍｌ　（１：　２（７）ｌｉ釈）のタンパク譬Ａアガロースで免疫沈降させた。１２，５％のＳＯＳポリアクリルアミドゲル上での免疫沈降されたタンパク質の分離は、成ｐ　ＴＧＦ−β３　（１２ｋＤａ）及び前駆体ＴＧＦ−β３　（５０ｋＤａ＞に対し２つのタンパク質が同様に泳動することを明らかにした（図１６）。しかしながら、４３ｋＤａでは１・つの余分な免疫沈降タンパク質が発見された。４３ｋＤａのタンパク質は、非グリコジル化前駆体又はタンパク質分解生成物のいずれかに相応する。β３■抗体と比較してβ３ｖ抗体は、ＴＧＦ−β３タンパク質を免疫沈降する上ではるかに効率が良いことがわかった。免疫沈降の特異性は、同族体ペプチド又は無関係のペプチドの配列のいずれかの８０倍の余剰分で抗体を予備’ＩＡ置することによって決定された。特異的ペプチドは、３つの帯金ての完全な競合を示したのに対し、無関係のペプチドはこれを示さなかった。予想通り、ＴＧＦ−β３タンパク質内のメチオニンの分布及びアミノ酸組成に基づき、５０ｋＤａは著しく多くの３ｓ３標識を含んでいる。 β３Ｖアフイニテイ純化抗体は又、ヒトのさい帯のパラフィン切片においても用いられた（図１９Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）、結合組織も細胞外基質もこの抗体で染色しなかったのに対し、線維芽細胞及び上皮細胞は、さい帯の脈管系の平滑筋繊維と同様に（図１００）染色した（図１９Ａ）、対照のウサギ多クローン性抗体（Ｐ２１０ＰｉＬ／煎Ｖ＝Ｏ３１カタログＮｏ、　ＰＣＯ２に対するＩｇ）は、全く染色を示さなかった（図１９Ｂ及びＤ）。さい帯組織内の強い染色は、さい帯からの抽出物が高レベルのｗＲＮＡを有していたことを示す早期のデータと合致する。ｊ且駈コ［１単り」ジー乙１坑−生Ω書製以下の特徴を有するＴｒｐＥ　−ＴＧＦ−β３融合が大腸菌（ｌｉ、ｃｏｌｉ）内で生産された。すなわちアミノ酸１〜１９はＴｒｐ　Ｅ及びポリリンカー分節によりコードされ、アミノ酸２０〜１７０は（完全成Ｐ　ＴＧＦ−β３配列を含む）ＴＧＦ−β３前駆体のアミノ酸２７３〜４１２に対応する。この融合タンパク質は、ＰＢＳ内の音波処理の後不可溶性の分画内にとどまった。その後、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルとの分離によりタンパク質を純化し、電気溶出により単離させた。この材料ば、以下のプロトコルによりマウスの免疫化のために利用した：ａ、０日目、目目間及び１４日目にＲＩＢＩアジュバント中１００μｇのＴｒｐＥ　−ＴＧＦ−β３で、Ｂａ１ｂ／ｃの雌のマウスを腹腔内で免疫化させた。ｂ、２４日目に、試験的出血は、ＴｒｐＥ　−ＴＧＦ−β３及び純化されたＴＧＦ−β３タンパク質に対する高い力価を示していた。Ｃ３次にマウスに、同し抗原１００μｇで２８日目、２９日目及び３０日目にブースタ注入した。ｄ、翌日、ひ臓融合を行なった。ｅ、標準的な手順（Ｉ７）に従って、その後に続くハイブリドーマ選択、培養及びサブクローニング方法を行゛なった。安定した５つのハイプリドーマが生産され、その特徴は表２に示されている。クローンは全て、ＩｇＧｋクラスの抗体を生産した。単クローン性抗体は、純化されたＴＧＦ−β３で免疫プロットした。５つの単クローン性抗体は全て、ＥＬＩＳＡにょるＴＧＦ−β１との反応性を全く示さなかったが、ＴＧＦ−β２と交差反応した。丁ＧＦ−β３合成ペプチドを用いた単クローン性抗体によって認識されたエピトープの分析は、全ての抗体がアミノ酸残基３８０〜４１２と反応することを示した。４：、１ヒ土立ｔか”のＴＧＦ−３の′　−”法２０Ｍのメトトレキセートが存在する中で集密性に至るまで成長させられたＣＨＯ６，３５／２０ｎＭの細胞から馴化培地を調製した。食塩加リン酸緩衝液で細胞を洗浄し、血清タンパク質の繰残分を除去するための２時間無血清培地で温！した。４８時間新鮮な無血清培地で温置された細胞から馴化培地を誘導した。以下のプロトコルを用いて馴化培地からＴＧＦ−β３を純化した。ｉ、１μｍのガラス繊維フィルタ（？ｌ１ｃｒｏｎ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　ＮＣＣＧ　２００００−ＡＯＩ）を通して馴化培地をろ過し、０．１ｍＭ＋７）ＰＭＳＦ、４ｍＭ（７）ＥＤＴＡ。１ｍＭのＥＧＴＡ、　０．０２％の窒化ナトリウム及び１０ｗＭ　Ｔｒｉｓ　ＦＩＣＩ　ｐ［１７，５の付加の後４°Ｃでプラスチック容器内に保存した。ｉｉ、高容量の低タンパク質結合Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　’Ｐｅ１ｌｉｃｏｎ」膜力−トリ７シ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　ＰＬＧＣ再生セルｏ　−ス、分子量遮断１００００）を用いて、約１００倍に培地を濃縮する。山、タンパク質濃度をＩＯＬ１ｇ／ｍｌに調製し、硫酸アンモニウム（９０％。ｐＨ７＞を４５％になるまで付加し、ｐＨを７．６に調整し、材料を０℃で４時間（又は−晩）温置した。沈降物を遠心分離（３０分間１００００　Ｘ　ｇ　）によりベレット化し、ベレットを１０分閏ドレンさせた。ｉｖ、ｏｏＣで、アセトニトリル、５０％（体積比）／酢酸（ＩＭ）でベレットを抽出した。前記（ｉｊ）内の出発タンパクｗ１グラムあたり２５ｍ１の抽出緩衝液を用いた。３０分間１００００Ｘ　ｇで遠心分離に至るまで懸濁液を処理した。ｖ、（ｉｉ）に記されているような同じ膜を用いてＭｉｎｉｔａｎ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて抽出上澄みをさらに濃縮した。タンパク質の沈降を防ぎ緩衝液をＩＭの酢酸へと変えるため濃縮中、ＩＭの酢酸を加えた。ｖｉ、ＩＭの酢酸の移動相を用いてＰ−６０ゲルろ過により濃縮された材料をクロマトグラフィに付し、ピーク分画をＭｉｎｉｔａｎ濃縮器を用いて濃縮させる。ｉ、濃縮物をＴｒｉｔｏｎ　Ｘ　１００内で１％にし、ｐＨを、固体Ｔｒｉｓ　Ｂａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）　テア、５ニ調整し、３０分間１０，０ＯＯｘ　ｇ　Ｔ！遠心分離によって清澄させた。次に、β３ｖ抗ペプチド抗体アフィニティヵラム（１２，５ｃｍＸ０．８ｃｍ）上でクロマトグラフィ（４℃で）に付し、溶出液中にいかなるタンパク質も検出できなくなるまでカラムを０．１ＭＴｒｉｓ　ＨＣＩ　ｐＨ７，５，１０ｍＭのＥＧＴＡ、１　ｆｆ１ＭのＰＭＳＦ、１％のＴｒｉ　ｔｏｎχ−１００゜ＩＭのＮａＣ１で大量に洗浄した。次に、ｐＨ２の５０ｍＭグリシン内でシリコン化プラスチックバイアルの中へＴＧＦ−β３を溶出させた。この材料をプールしておき、最終濃度２５％に至るまでアセトニトリルを付加し、−２０°Ｃに凍結状態で保存した。報、生体内試験に先立ちこの段階でＣ１８逆相を実施した。抗体アフィニティカラムから溶出されたＴＧＦ−β３をＷａｔｅｒｓ　Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラムに通用し、０〜６０％アセトニトリル０．１％ＴＦＡの勾配、流速０．５ｍｌ／分で展開させ、２１０ｎｍの流動検出器を用いて監視した。材料を等分（アリコートに）し、−２０°Ｃで溶出溶剤中で保存した。クロマトグラフィ収量の測定は、β３■抗ペプチド抗体を用いたウェスタンプロット又は抗原補捉検定によって達成した。馴化培地及び純化されたクロマトグラフィ分画を組換え型ＴＧＦ−β３タンパク質の生物学的活性についてテストするため、ＣＣＬ　−６４細胞生物検定を利用した。成長抑制検定は、成長抑制の尺度として未処理の細胞に比較した処理済みの細胞の５’（ＩＺＳＩ〕−ヨード− ２′−デオキシウリジンの取込みの減少を用いたＤＮＡ合成（１８）の測定に基づくものである。馴化培地を酸活性化し、数回の希釈でテストした。分画を銀染色及びウェスタンプロットで分析し、ピーク分画をプールした。銀染色されたゲルは、それぞれ還元条件又は非還元条件下で１２ｋＤａ及び２４ｋＤａの単−帯を識別した（図２０）。単−銀染色帯は、調製物が９５％以上相同であることを示している。さらに、レクチンアフィニティ力ラムを用いてＴＧＦ−β３のグリコジル化形態又はＴＧＦ−β３のプロ領域の分離を可能にする新しい純化プロコトコルについて記述する。その−例は、アガロースに結合されたコムギ胚芽凝集系などの市販の固定化レクチン（例えばＳｉｇＩＩＩａ）を用いることである。レクチンカラムを洗浄し、結合緩衝液（０，１５Ｍの１ｉａｃ１．５０ｍＭのＨｅｐｅｓ　ｐ）！７．６．０．１％のＴｒｉｔｏｎχ−１００）　５力ラム体積で平衡化する。グリコジル化された前駆体の形態のＴＧＦ　−β３を含む細胞溶菌液又は細胞馴化培地を、結合緩衝液の中で懸濁させ、ゆっくりとレクチンアフィニティ力うム上に装荷する。カラムに対するタンパク質の結合を最大限にするため、ＴＧＦ −β３を含む緩衝液を最高３回通過させることが必要となる可能性がある。未結合の材料を除去するため、５力ラム体積の結合緩衝液でカラムを洗浄する。カラムから結合したグリコジル化ＴＧＦ−β３前駆体タンパク質を溶出するため、０．３ＭのＮ−アセチルグルコースアミンを含む結合緩衝液でカラムを溶出する。さらに、前駆体複合体がら生物学的に活性のホモ二量体を放出するべく　ＴＧＦ −β３をその他の糖タンパク質から分離させ処理する。使用可能なその他のレクチンの例としては、リジン、アブリン及びＣｏｎ　Ａがあるが、これらに制限されるわけではない。前駆体形態のＴＧＦ−β３又はＴＧＦ−β３前駆体のプロｊＩ域は、当業者にとっては周知のクロマトグラフィ段階を用いてさらに純化することができる。例えば、逐次ゲルろ過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、抗体カラムクロマトグラフィ及び高圧液体クロマトグラフィ又はこれらの組合せを用いることができる。ＴＧＦ−β３前駆体の突然変異体又は成熟ＴＧＦ−β３の突然変異体を、本書に記されているようにＴＧＦ−β３前駆体及び成ｌ！Ｆ！ＴＧＦ−β３について記した方法を用いて純化することが可能である。５：ＴＧＦ−１を　する３、１２５〜０．０４９　ｎｇ／ｍｌの濃度でのヒトの血小板ＴＧＦ−β１　（Ｃｏｌｌａ−ｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　ＭＡ）、ブタのＴＧＦ− β２　（Ｒ＆　Ｄ、　Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）又は純化組換え型ヒｌ−ＴＧＦ−β ３を、３７°Ｃで３時間５μｇ／ｍｌのアフィニティ純化された多クローン性ウサギ抗体（β３Ｖ抗体及び抗−ＴＧＦ−β（Ｒ＆　Ｄ、　Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ））と共に温置した。抗体無しで対照のＴＧＦ−β３．　ＴＧＦ−β２又はＴＧＦ −β１を温置した。抗体で処理されたＴＧＦ−β３．　ＴＧＦ−β２又はＴＧＦ −β１及び対照の未処理のＴＧＦ−β３．　ＴＧＦ−β２又はＴＧＦ−β１によるミンク細胞の成長抑制を上述のように測定した０図２１Ａ、２１Ｂ及び２１Ｃは、β３Ｖ抗体（閉じた四角）が、抗体が無い状！！（開放円）における同し濃度のＴＧＦ−β′の成長抑制活性との関係において、ミンクの細胞上でＴＧＦ− β３の成長抑制活性を中和するもののＴＧＦ−β２又はＴＧＦ　−β１の成長抑制活性を中和しないということを示している。抗−ＴＧＦ−β（Ｒ＆　Ｄ、　Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）は、ＴＧＦ−β３．　ＴＧＦ−β２及びＴＧＦ−β１（図２１Ａ、２１Ｂ及び２ＩＣ）（閉鎖円）を中和する。いずれの抗体も、ＴＧＦ−β ３が無い状態でＣＣＬ　−６４細胞の成長にいかなる著しい効果も及ぼさなかった。ＴＧＦ−β３ペプチドβ３ｖに対する抗体は、明らかにＴＧＦ−β３の成長抑制活性を特異的に中和する。拠旦：　でのＴＧＦ−３の　、Ｉｗａｔａ　Ｋ、に他（１９）により記述されたＴＧＦ−β３の単層検定の変更を用いて成長を測定した。１ウエルあたり２Ｘ１０’細胞の接種密度で９６−ウェル組織培養プレート上で１００μｍの培地内で白血病ではない細胞を継代培養した。１０％の胎仔ウシと２％のし一グルタミンを含むダルヘノコの変更イーグル培地の中で細胞を維持し検定した。これらの細胞を２５ｎｇ／ａｌｌ　（−１ｎＭ）のＴＧＦ−β３で処理し、未処理の対照ウェル内の細胞が９０％集密になった時点で１μＣｉ　／　ｍ　１の５−Ｃｌ２Ｊ）−ヨード２′デオキシウリジンで２４時間圧出し、収穫した。５０μｍの培地内で白血病細胞（Ｋ５６２．　ＫＧ　−１、ＫＧ−１ａ、　ＨｕＴ７８及び１１９３７）を接種した。、に５６２を、１０％の胎仔ウシ血清で補足したＲＰＭＩ内でウェルあたりｌＸｌ０”細胞の密度で接種した。ＫＧ−１及びにＧ−１ａは、１０％の胎仔ウシ血清で補足したｌ５ｃｏｖｅ培地内でウェルあたり３．５Ｘ１０”細胞の密度で接種した。　Ｈｕｔ７８及びＵ９３７は、１０％の胎仔血清で補足されたＲＰＭＩ内で１ウエルあたり３．５Ｘ１０’　！胞の密度で接種した。細胞成長を顕微鏡検査で決定した０例は表２に示されており、この表はＴＧＦ−β３によるいくつかのヒトの腫瘍系統の抑制ＴＧＦ−β３ペプチドβ３Ｖに対して作られたアフィニティ純化を受けたウサギ多クローン性抗体（０，１ＭのＮａＨＣＯｓ内で５　ｕ　ｇ／ａｔ、　１）β９．１）５０μＩでプレートをコーティングする。プレートを４°Ｃで一晩装置した。吸引によって未結合の抗体をとり除く、プレートを室温で１時間１％のＢＳＡ　（ＰＢＳ−ＢＳＡ）を含むｉｏ。 μｌのＰＢＳで遮断する。次にプレートを、０．０５％のＴｗｅｓｎ　２０（ＰＢＳＴ）を含む食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２度洗浄する。適切なウェルに対し５０１！ｌの最終体積のＰＢＳ　−ＢＳＡの試料を付加し、室温で一時間装置する。未結合のタンパク質を除去し、ＰＢＳＴで４度プレートを洗浄する。全てのウェルに、５０μｌの対ＴＧＦ−β３マウス単クローン性り体（ＰＢＳ中５μｇ／■１）を入れる。室温で１時間温置した後、未結合の抗体を除去しプレートを４度ＰＢＳＴで洗浄する。全てのウェルは、ヤギ抗マウス抗体に接合されたアルカリ性ホスファターゼの適切な希釈５０μｌを受け入れる。室温°で１時間温置した後、ＰＢＳＴで４時間プレートを洗浄した。１００μｌでアルカリ性ホスファターゼ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸）に対する基質を全てのウェルに加え室温で１５分間温１する。４９０ｎｍで各ウェル内の吸光度を測定した。この検定を用いて、我々は３〜５ｎｇ／ｍｌの岨換え型ＴＧＦ−β３を検出した。８：　の　び　”としたＴＧＦ−３の生物学的活性を有するＴＧＦ−β３及び有さないＴＧＦ−β３の発現は、最終タンパク質生成物が細胞により保持され細胞培地内に放出されないように真核細胞内で達成することができる。これは、回収中の細胞膜に対しＴＧＦ−β３を濃縮する上で培地内にＴＧＦ−β３を放出することに比べ有利である。小胞体（ＥＲ）　、原形質膜又は細胞外基質に対する１つの細胞内のＴＧＦ−β３のタンパク質選別は、標的シグナル配列を回収及び純化中に除去できるように、ＴＧＦ−β ３前駆体又は成ｐ　ＴＧＦ−β３内に特異的標的シグナルを取り込むことによって達成される。表２立　のヒト　、　の　に・するＴＧＦ　−３（１ｎＭ）の六昶−胞−系一扱　遇Ｉ引にヒト腫瘍細胞Ａ３４９　（肺腺ガン）４６Ａ３７５　（黒色腫）４７Ａ２０５８　（黒色腫）８日匈ｉＤＲ（結腸腺ガン）２４ＭＣＦ７　（乳ガン）５７ヒト白血病細胞に５６２　（ＣＭＬ）　５５ＫＧ−１（ＡＭＬ）　５０ＫＧ−１ａ（ＡＭＬ）　５０ＨｕＴ７８（Ｔ細胞リンパ腫）５０Ｕ９３７　（細網肉腫）５０健常なヒトＨｕｆ（包皮線維芽細胞）　６例えば、ＴＧＦ−β３　ｃＤＮＡは、疎水性膜内外配列を介して膜を足場とするＴＧＦ−β３前駆体タンパク質を生産するよう変更可能である。簡単に言うと、このようなＴＧＦ−β３タンパク質は以下のように発現される。分子生物学技術は、標準的な方法を使用する（２３）。以下の特性をもつＴＧＦ −β３生産用の高レベルの発現ベクターが構築される。ＴＧＦ−β３の転写は、転写をさらに高め構成体の短期分析のためＣＯＳ細胞又はポリオーマ形質転換細胞系統内での複製を可能にするべく　、ＳＶ４０ウィルス及びポリオーマウィルスのためのエンハンサ−／複製起点と結合された強いプロモータから誘導される。発現ベクターはさらに、ＲＮＡを安定化しその半減期を増大させる配列（例えば、ウサギのβ−グロビン５′及びウシ成長ホルモン３ ′領域からの未翻訳配列）を含み、さらにＩＩＮＡ転写物を安定化させるためのスプライシングシグナル（免疫グロブリンイントロン配列又はＳＶ４０小型ｔイントロン配列）を含む。ベクターは、ｍＲＮＡの効率の良い翻訳を促進するため開始メチオニンをとり囲むＫｏｚａｋサンセンサス配列を含む。ＴＧＦ−β２及びＴＧＦ−β３には、Ｂｌｏｂｅｌにより規定されているようなコンセンサスシグナルペプチド分割配列（塩基性アミノ酸好ましくはＬｙｓ又はＡｒｇとそれに続く小さい側鎖を伴うアミノ酸一般的にはＧｌｙ又はＡｌａ）が欠如している。ＴＧＦ−β３プレモ体は、推定上クリプテイック分割部位における小胞体を横切った転座に付される２２−２４アミノ酸疎水性シグナルペプチドの分割により前駆体形態にまで処理される。この部位は、最適な分泌／転座を促進するべく標準的な部位特異突然変異誘発技術を用いてコンセンサスＡｒｇ−Ａｌａ分割配列に突然変異させることもできるし、或いは又細胞質局在化を促進するべく欠失させてもよい。前駆体タンパク質のカルボキシル末端では、こうして変更された丁ＧＦ−β３前駆体タンパク質が原形質膜に結合するように、疎水性膜内外アミノ酸配列（例えば、表皮成長因子レセプタｅＤＮＡ又はｃ−ｅｒｂＢ２　ｃＤＮＡによりコート ′されたアミノ酸配列）をコードするＤＮＡとそれに続く高い負荷の「ストップトランスファ」アミノ酸配列が挿入される。特定のプロテアーゼ（例えば因子Ｘ又はコラゲナーゼ）のためのアミノ酸認識部位が、特定のプロテアーゼ（例えば因子Ｘａ又はコラゲナーゼ）による膜からのＴＧＦ−β３の効率のよい分割を可能にするべく、Ｃ末端膜内外配列とＮ末端ＴＧＦ−β３前駆体の間に含まれている（図２２）。この手順の一例は、以下のとおりである：１、ＴＧＦ−β３終止コドンのＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ公開部位３′を工学操作するのに、突然変異オリゴヌクレオチド（５’　ＣＴＣＴＧＴＣＧＣＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＣＴＡ３’　）を用いる。２、ＴＧＦ−β３終止コドンを除去するべく当業者は、第２の突然変異オリゴヌクレオチドを用いる。３、配列がＴＧＦ−β３前駆体と同じ翻訳されたリーディングフレーム内に挿入されるように、プロテアーゼ分割部位（例えば因子Ｘａ：１１ｅ　（ｉｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ又はコラゲナーゼ：　Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）とその後に続＜　ｃ−ｅｒｂＢ２膜内外配列及びストップトランスファ配列をコードする配列（Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｉｌａ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａ−１ａｖａｌ　Ｖａ±１ユ乃」二重Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｖａ　Ｌｅｕ　ＧＩ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　ＧＪＬ土順」徂土ユｌｅ　ＬｙｓＡｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｉｌａ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ）を導入するべく、合成オリゴヌクレアーゼを構成する。生成された核酸分子を発現ヘクター内に挿入し、宿主細胞系統（例えばＣＨＯ及びＨｅＬａ細胞）内に導入される。代替的には、介入するプロテアーゼ分割配列（例えば因子Ｘａ又はコラゲナーゼ）を伴うＴＧＦ−β３前駆体のＣ末端に対して、水庖性口内炎ウィルスの膜内外及び細胞質ドメインを連鎖することによって、ラット成長ホルモンについて記述されているように（１６）　、、膜を足場としたＴＧＦ−β３前駆体の生産が可能となる。共有ホスファチジルイノシトール連鎖を介して数多くのタンパク質が細胞膜を足場とする（例えばＱａ−２、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、Ｔｈｙ−１）（２］）　、膜を足場とするＴＧＦ−β３の発現は同様にホスファチシルイノシトール連鎖配列の内含によっても達成できる。ホスファチジルイノシトール連鎖のＴＧＦ− β３前駆体タンパク譬をボスフォリバーゼＣでの処理によって膜から遊離させることができるというのが好ましいが、必須条件ではない。例えば、因子Ｘａプロテアーゼ分割配列（１−Ｄ−（、−Ｒ）又はコラゲナーゼ分割配列（Ｐ−Ｘ−Ｇ−Ｐ）によりＴＧＦ−β３前駆体配列に連鎖されたＤＡＦ（７）　Ｃ末端３７７　ミ／酸（ＰＩＩＩＫＧＳＧＴＴＳＧＴＴＲＬＬＳＧＩ（ＴＣＦＴＬＴＧＬＬＧＴＬνＴＭにＬＬＴ）　（４）の内含は、ＴＧＦ−β３を、ＤＡＦ配列に付着されたグリコリン脂質膜足場によってＴＧＦ−β３が生産された細胞へと連鎖させることになる。トリハノソーム・ブルセイの変異型表面糖タンパク質（ＶＳＧ）のＣ末端配列は、ホスフォリパーゼＣ足場により原形質膜に連鎖されることが立証されている（２１）　、前述のようなプロテアーゼ分割配列を介してのＴＧＦ−β３前駆体のＣ末端に対するこの配列の連鎖は、膜結合されたＴＧＦ−β３前駆体タンパク質の合成を可能にする。代替的には、結果として得られるタンパク質がヌクレオチド位置３３２−３３４のロイシンで始まるようにするＴＧＦ−β３シグナルペプチド配列の欠失によって、及びＴＧＦ−β３前駆体配列内へのロタウィルスＳＡ　ｎ　塘タンパク質シＰ７シグナル配列（３６）といった小胞体標的配列の内含によって、小胞体にＴＧＦ−β３前駆体タンパク質をターゲツティングすることもできる。代替的には、プロテアーゼ分割配列（例えば因子Ｘａ又はコラゲナーゼ）がＶＰ７シグナル配列がら成熟ＴＧＦ−β３を分離するよう、成熟ＴＧＦ−β３のＣ末端にＶＰ７シグナル配列を連鎖させることもできる。９　：　びｔ　′４　・　の　゛　：　告　４ｙｕ丘ＴＧＦ−βはレセプタ結合を通してその生物学的効果を発揮する。化学的架橋により３つの推定上のレセプタが識別され、それぞれ分子Ｗ６５ｋＤ、　８５ｋＤ及び２８０ｋ［ｌをもつ■型、■型及び■型レセプタと呼称されている（５．６）。ＴＧＦ−β１．−２及び−３の生物学的効果は、Ｉ型及び／又は■型レセプタにより媒介されていると思われる。■型レセプタが欠如している細胞はなおもＴＧＦ−βに対する応答性をもつ；従って、■型レセプタ結合は、少なくともＴＧＦ−βの生物学的活性の多くにとって必須でないと思われる。 ■型レセプタは、Ｉ型及び■型のレセプタに比べて高い濃度で体内に存在し２ている。■型レセプタは、Ｎ−グリコジル化コアタンパク質を介してＴＧＦ−βを結合する膜プロテオグリカン及び細胞外基質と結びつけられた分泌された可溶形態であるベータグリカンという２つの形態で存在する（１）、従って、■型レセプタに特異的に結合するのを防くようＴＧＦ−β３を突然変異させ、かくして保持された活性の工俺古半減期を増大させることが可能であるかもしれない。ＴＧＦ−βは同様にα２マクログロブリンといった血清タンパク質を結合するものとして知られている（２９．１８）。従ってα２マクログロブリン又はその他の血清タンパク質へのＴＧＦ−β３の結合は同様に、キレート形成したり、不活性化したり又はＴＧＦ〜β３のクリアランス（清澄化）を促進する可能性もある。丁ＧＦ−βは同様に、ＴＧＦ−−βプロ領域を結合するものとしても知られており、この複合体内で不活性化される。　ＴＧＦ−βは±ｌｌａで短かい半減期を有する（２．２分と見積られている）（７）。Ｕリゴヌクレオチド株″′炊−悸クリアランス又は不活性化に関与するタンパク質に対するＴＧＦ　−β３の結合を調査するために、これらのタンパク質と相互作用するＴＧＦ−β３の領域（例えばα２マクログロブリン及びＴＧＦ−βのベータグリカンレセプタの分泌された形Ｂ）が、縮重オリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発に付され（５，２５）　、その後このようなタンパク質に対するそのアフィニティについて組換え型突然変異体ＴＧＦ−β３がテストされる。結合又はクリアランスタンパク質と関与する領域にまたがる縮重オリゴヌクレオチドは、制限エンドヌクレアーゼ分割部位を包含する８ヌクレオチドパリンドロ一ム配列を３′末端が含むような形で設計されている。好ましくは、オリゴヌクレオチドの５′末端は、もう１つの制限エンドヌクレアーゼ部位を包含する配列から成る。中央顛域（２０〜１００ｂｐ）は、ＴＧＦ−β３相互作用部位の突然変異誘発された配列を含んでいる。望ましい領域内に点突然変異を導入するために、オリゴヌクレオチド合成は、突然変異が望まれない位置（例えばＩＩＪ限部位）が個々のホスホルアミダイトの溶液を用いて合成され、一方突然変異が望まれる位置がホスホルアミダイトの規定混合物を用いて合成されるようにプログラミングされている。この手順を用いて、３つの「不適正な」ヌクレオチドの各々３．３％と野生型ヌクレオチド９０％の混合物によって１０％の突然変異率を達成することができる０合成の後、オリゴヌクレオチドは、短かいオリゴヌクレオチド（＜　５０ｎ　ｔ）については５ｅｐＰａｋＣ１Ｂカートリッジを用いて、又比較的長いオリゴヌクレオチドについては準備的ポリアクリルアミド電気泳動を変性することによって、純化される。２本鎖ＤＮＡに対する変換は、３′　（及び５′）端パリンドローム配列を用いたオリゴヌクレオチドの自己アニーリング及び、４つのｄＮＴＰが存在する中でのＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏ−断片での処理によって達成される。５′及び３′の外部部位を認識する制限酵素での消化の後、非変性ポリアクリルアミドゲルによって２末鎖オリゴヌクレオチド混合物を純化する０次にこのオリゴヌクレオチド混合物を用いて、ＴＧＦ−β３発現プラスミド内の相応する断片を置換する。突然変異体の遺伝子型を直接決定するため、２本鎖配列決定方法が用いられる。突然変異の頻度が低すぎる場合には、プローブとしてキナーゼ付加され、５′３ ”Ｐｔｍ！識付けされたオリゴヌクレオチドを用いた葺成コロニーフィルタハイブリッド形成によって突然変異体クローンを識別する。　ＴＧＦ−β３突然変異体発現構成体は、ＣＯＳ細胞内に形質移入される。これに続いて、ＴＧＦ−β３タンパク質は、丁ＧＦ−β３免疫アフィニテイ力ラムを用いて部分的に純化され、ＴＧＦ−β３結合／不活性化タンパク質と相互作用する能力についてテストされる。菫胆又然変異透発完全な成ｐ　ＴＧＦ−β３をコードするｃＤＮＡ断片内の多数の任意に分布したヌクレオチド１換を生み出すためには、飽和突然変異誘発法が利用される。結果として得られたＴＧＦ−β３突然変異体は、生物学的活性、レセプタ結合能力及びＴＧＦ−β結合タンパク質に対するアフィニティについてテストされる。最終的に、選択された一群の突然変異体の↓生前半減期がテストされる。まず第一に、ＴＧＦ−β３　ｃＤＮＡを含むＢｌｕｅ−ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）プラスミドは、（成熟タンパク質に先行する）ＴＧＦ−β３のＲ −に−に−Ｒ処理部位のＦｓｐ　Ｉ部位及びＴＧＦ−β３停止コドンのＢａｍＨ１部位３′を生成するため、部位誘導突然変異誘発を受ける。次の突然変異オリゴヌクレオチドが使用されることになる：これらの部位は、ＴＧＦ−β３　ｃＤＮＡプラスミドからの突然変異断片の除去及びこのプラスミド内へのこの断片の再挿入を容易にする。Ｆｓｐ　Ｉ　−ＢａｍＨｒ　ＴＧＦ−β３　ｃＤＮＡ標的断片は、Ｍ１３内で、Ｍ１３複製起点との関係において両方の方向にサブクローニングされる。突然変異誘発を受けた標的配列の各々の鎖に対して３つの異なる反応が行なわれる（管１本につき１ｍｇ／ｍｌの１本１ｉＤＮＡ　４０Ｍｇ）。１、１０μｌの酢酸ナトリウム、ｐＨ４，３と、５０μｌの２Ｍの亜硝酸ナトリウムを付加し、室温で６０分間温１する。２　、６０ｕ　１　（Ｄｉｌ＠＊　（１８Ｍ）　ｆｉ！！［−加工、室温テ１０分間温室スル。３．６０μｍの濃縮（１２Ｍ）　ヒドラジンを加え、室温で１０分間温１する。温室の後、ＤＮＡをエタノール沈降させ、７０％のエタノールで洗浄し、ＴＥＥＭ衝液内で再度懸濁させた。第２の鎖は、ＡＭＶ逆転写酵素を用いたプライマ拡張により調製される（脱プリンは、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡｐｏｌｌによるＤＮＡ合成を抑制するが、逆転写酵素によるＤＮＡ合成は抑制しない、突然変異体は、ランダムクローンのＤＮＡ配列決定より直接識別されうる。主しヱノ１！四１゛リンに・　るＴＧＦ−３）　ムＴＧＦ−β３、変更ＴＧＦ− β３又は抗ＴＧＦ−β３抗体に結合されたＴＧＦ−β３に対するα！−マクログロブリンの結合は、０’　Ｃｏｎｎｅｒ−ＭｃＣｏｕｒｔ他（２９）によって記述されている方法を修正したものを用いて測定される。Ｎ単に言うと、”’Ｉ　ＴＧＦ−β３は、標識づけされていないＴＧＦ−β３、変更ＴＧＦ−β３又は抗ＴＧＦ−β３抗体に結合されたＴＧＦ−β３のいずれかを含むＰＢＳ内でβ２− マクログロブリンと共に温室される。非特異的結合は、標識づけされていない成長因子の４００倍のモル余剰分を用いて測定される。　”５１　ＴＧＩ−β３に対するβ２−マクログロブリンの架橋は、ＰＢＳ内の１ｚ４体積（７）　５　ｍＭ　ヒス（スルフォスクシニミジル）スペリン酸塩（ＢＳ３；Ｐｉｅｒｃｅ）の付加によって達成され、反応は２．５Ｍグリシン１／２０体積の付加により４° Ｃで２分後に停止される。等量のＳＤＳ　−ＰＡＧＥ試料緩衝液（２×）が試料に付加され、３分間沸とうした水浴中で加熱される。試料について電気泳動が行なわれ、脱染されたゲルは乾燥され、強調スクリーンを用いて一７０’ＣでＸ線フィルムに露出される。代替的には、架橋を伴って又は伴わずにβ２−マクログロブリン１２５１７ＧＦ−β３複合体を免疫沈降させるため、市販の抗α２マクログロブリン（Ｓｉｇｍａ）が用いられ、ガンマカウンタによって直接測定される。 ■刑しセプタに・　るＴＧＦ−３の　入■型レセプタは、膜結合（プロテオグリカン）及び可溶性（ベータグリカン）の両方の形態で存在する。ＴＧＦ−β、変更ＴＧＦ−β又は抗ＴＧＦ−β抗体に結合された変更ＴＧＦ−β又はＴＧＦ−β に対するベータグリカンの結合は、Ａｎｄｒｅｓ他（１）が記述した方法を用いて測定される。非特異型結合は、標識づけされていない成長因子の４００倍モル余剰分を用いて決定される。簡単に言うと、可溶性ベータグリカンは、無血清の馴化培地型３Ｔ３−　ＬＬ脂肪細胞から作られる。マウス３Ｔ３−　Ｌｌ脂肪細胞を、集茫性又は近集密性になるまで成長させる。細胞単層を２回洗浄し３日間無血清の−ａｙｍｏｕｔｈ培地内で温室する。収集直後に０．２１Ｍの最終濃度になるまで、新鮮なＰＭＳＦの濃縮材料を付加する。収集した馴化培地を４°Ｃで１５分間２０００Ｘｇで遠心分離し、その後４℃ で４０分間２０００，０ＯＯＸ　ｇで超遠心分離した。　０．２５ｍＮａＣ１という最終濃度に至るまで馴化培地にＮａＣｌを付加し、ＩＭでｐ！（６，０のＢＩＳ−Ｔｒｉｓの付加によりｐＦ１６．０までもっていき、結合緩衝液（ＩＩＷｇ／ｍｌのＢＳＡを含むｐＨ７，５の５０ｍＭのＮａＣ１，１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、５ｍＭのＫＣＩ、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ）でプレ均衡化した。　”’Ｉ　ＴＧＦ−βを、結合緩衝液の中で、標識付けされたＴＧＦ−β、変更ＴＧＦ−β又は抗−ＴＧＦ−β抗体に結合されたＴＧＦ−β及び可溶性ベータグリカン（適切に希釈されたもの）と混合させ、温室する。この混合物をプレ均衡化されたＤＥＡＥ−セファロースＦａｓｔ　Ｆｌｏ−に加え、連続的に混合しなから４°Ｃで３．５時間温置する０次に低温結合緩衝液（アルブミン無し）で５回ビーズを洗浄する。ビーズ上に残る放射能量が測定されることになる。■型プロテオグリカンレセプタに対する特異的結合の分析のためには、”５Ｉ　ＴＧＦ−βを無傷の細胞に架橋（６）させ、レセプタを標準ＳＤＳ　−ＰＡＧＥで分離し、”５Ｉ　 −ｂｉｎｄｉｎｇを濃度計で測内部標識付けされたＴＧＦ−β３　（”Ｓシスティンで代謝的に標識付けされたもの）又は”’Ｉ　ＴＧＦ−β３を用いた脈管内、腹腔内及び皮下経路を介しての巨丸剤注入（マウス−匹あたり０．１〜１０μ ｇ）に続いて、マウスの血清内でＴＧＦ−β３の化学的半減期を測定する。標識付けされた材料の組織分布は、肝臓、肺臓及び骨髄の部位を特に強調してさまざまな器官内で測定される。マ婆古のＴＧＦ−β３の生物学的半減期が受諾できないほど短かいことがわかった場合、直接的膵臓内注入（体壁を通して）による局所投与が用いられるか、或いは又大腿動脈への注入が関与するＧｏｅｙ他（１２）が報告した外科的技術が用いられる。この後者のアプローチは、ＴＧＦ− β１を骨髄に局所化させるのに有効であり結果として早期幹細胞及び始原細胞の増殖は抑制されることが報告されている。ｆｌｕ−μ■二１３１］Ｌ生ｐプロ鮪Ｊ！（’！Ｊｌ曳ＴＧＦ−β３プロ領域タンパク質は、成熟ＴＧＦ−β３と結び′つき、成熟ＴＧＦ−β３の半減期及び生物学的活性を変更する０位置］、１６３−１１６５で翻訳終止コドン（ＴＧＡ、　ＴＡＧ、　ＴＡＡ）を導入するため図１内の核酸の突然変異誘発により、ヌクレオチド位置２６３−２６５でメチオニンで始まり位置１１６０−１１６２でアラギニンで終わるＴＧＦ−β３前駆体をコードする核酸を工学操作する。結果として得られた核酸を発現ベクター内に挿入し、前述のとおり付加的な選択可能なマーカと共に適切な宿主細胞内に形質移入する。培地からＴＧＦ−β３プロ頭域タンパク質を回収する。このタンパク質は、安定した形で成Ｐ　ＴＧＦ−β３を結合しかくしてキレート形成し、成熟ＴＧＦ−β３の半減期及び生物学的活性を変更する。ＴＧＦ−３プロ貧　ンバク　に・　る丁ＧＦ−３の　人ＴＧＦ−β３又は突然変異体ＴＧＦ−β３に対するＴＧＦ−β３プロ領域の結合は、以下のように測定される。氷上で５時間、ｉｍ付けされたＴＧＦ−β３又は突然変異体ＴＧＦ−β３のいずれかを含むＰＢＳ内で純化ＴＧＦ−β３プロ領域と共に”’Ｉ　ＴＧＦ− β３を温室する。標識付けされていない成長因子の４００倍のモル余剰分を用いて非特異的結合を測定することになる。　１２５１　ＴＧＦ−β３に対するＴＧＦ　−β３プロ領域の架橋は、ＰＢＳ内で１／４体積の５１のビス（スルフォスクシニミジル）スペリン酸塩（ＢＳ３；　Ｐｉｅｒｃｅ）の付加によって達成され、２．５Ｍのグリシン１／２０体積を付加することによって４°Ｃで２分後に反応を停止させる。試料に等量の５０５−　ＰＡＧＥ試料緩衝液（２×）が付加され、３分間沸とうする水浴内で加熱される。試料に対し電気泳動を行ない、脱染されたゲルを乾燥させ、強調スクリーンを用いてＸ線フィルムに対し一７０゛Ｃで露出させる。代替参考文献的には、架橋を伴って又は伴わずに”Ｊ　ＴＧＦ−β複合体で複合体化されたＴＧＦ−β３プロ頭域を免疫沈降させるのにａｎｔｉ　Ｉ−ＴＧＦ　−β３が用いられ、ガンマカウンタによって直接測定される。Ｍａｎｕａｌ＋　２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ。２４、門ａｓｓａｑｕｅ、Ｊ、（１９８７）　Ｃｅ１ｌ、　４９＋　４３７−４３８゜１、Ａｎｄｒｅｓ、Ｊ、Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、（１９８９）　Ｊ、Ｃｅ１１８ｉｏ１．１０９：３１３７−３１４５゜２、Ａｓ５ｏｉａｎ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋＊、　フ江ニア１５５゜３、Ｂａｒｋｅｒ、Ｃ，Ｒ，、ｌｌｏｒｍａｎ、Ｃ，Ｐ、、　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ、Ｊ、Ｌ　（１９７５）　ハリｍｌ工２５、　Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、Ｍ、Ｄ、　ａｎｄ　Ｈｅｙｎｅｋｅｒ、Ｈ，Ｌ、（１９８３）　Ｎｕｃｌ、Ａｃｔｄｓ　Ｒｅｓ。１１：３１１３−３１２１゜２６、　Ｎａｋａｍａｙｅ＋に、　ａｎｄ　Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｆ、（１９８６）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４：９６７９−９６９８゜Ｆ工ＧｏｌｆΣ１日ＧＵＲε１日ＧＬＩＲε２２．５Ｘ　ＳＳＣ，６５°Ｃ日ＧＵＲε３日ＧＬＪＲε４ −　・　−−２，１０−アクチン口ＧＵＲＥ５日ＧＬＪＲε６日ＧｕＲε７口ＧＵＲεＢ（Ａ）＝腫瘍増殖阻害活性を有するタンノくり質口ＧＵＲε９ＦＩＧＵＲε１゜ＦＩＧＵＲＥｌｌ９０　１＠＋ＩＯ！３０　Ｍ　３５０ＦＩＧＵＲＥｌｌ＆０５０　６０　７０　８０ＦＩＧＬＩＲε１２日ＧＬＩＲＥ１３０　、ロロ０１　．００１　．０１　．１　１　Ｔ。ＴＧＨ−βｌ対照の量（ｎ９）、０１　１　１　ｔｏ　ＴＯＯならし培地の量し１）日ＧＵＲε１５ＦＩＧＵＲε１６ｄｅａｌＲ＠１＠　−神−− 未関係ペプチド　“ ＦＩＧＵＲＥｉ９ＡＦＩＧＵＲＥ　１９Ｂ口ＧＵＦＩＥ　２Ｏ −ＤＴＴ　＋ＤＴＴＦＩＧＵＲε２１Ａウサギポリクローナル抗−β３Ｖ及び抗−ＴＧＦ−β５ｒｓｕｓＴＧＦイＩＴＧＦ−８１（ｎ６７ｍ１）ＦＩＧＵＲＥ２１Ｂウサギポリクローナル抗−β３Ｖ及び抗−ＴＧＦ−βＶ・ｒｓｕｓＴＧＦ−聞ＴＧＦ−ａ３　（ｎ６７ｍ１）ＦＩＧＵＲＥ　２１Ｃウサギポリクローナル抗−β３Ｖ及び抗−ＴＧＦ−βＶ・ｒｓｕｓ丁ＧＦ−８２丁ＯＦ−６２（ｎｇ／ｍＱ１’！ＧＯＲＥ　２２要約書本発明は、ＴＧＦ−β３前駆体、そのＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域及び成ｐ　丁ＧＦ−β３を含んで成るタンパク質を生成し、そして精製するための方法を提供する。さらに、本発明はまた、変異、単一ペプチドの欠失及びプロテアーゼ切断部位置換を含んで成る、増強された生成及び高められた治療的利用性を伴って、新規ホモニ璽体タンパク質を生成し、そして精製するための方法も提供する。国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．成熟ＴＧＦ−β３に特異的に結合するものの成熟−β１及び成熟ＴＧＦ−β ２との交叉感受性をほぼ全く示さない抗体と混合物とを接触させることを含む、哺乳類細胞誘導ペプチドの混合物から純化された未変性成熟ＴＧＦ−β３を回収する方法。
２．哺乳類細胞誘導ポリペプチドの混合物が、ＴＧＦ−β３が中で発現されているヒトのものでない細胞からのヒト以外の哺乳類のポリペプチドの混合物を含む、請求の範囲第１項に記載の方法。
３．抗体が、アミノ酸配列【配列があります】により測定されるエピトープに向けられる、請求の範囲第１項に記載の方法。
４．抗体が固体支持体上に固定化されている、請求の範囲第３項に記載の方法。
５．足場膜配列を有するほぼ純化されたＴＧＦβ３前駆体を生産する方法において；（ａ）膜足場配列を有するＴＧＦ−β３前駆体をコードするＤＮＡを調製すること、（ｂ）宿主細胞と相容性ある適切なプロモータに連鎖された発現ベクター内にＤＮＡを挿入すること、（ｃ）ＴＧＦ−β３前駆体が発現されるようにする段階（ｂ）のＤＮＡの発現ならびにそれに焼く膜足場配列をもつ発現されたＴＧＦ−β３前駆体の転座を誘発するために、ベクターで宿主細胞を形質転換させること；（ｄ）培地内で宿主細胞を培養すること；（ｅ）培地から宿主細胞を分離すること；（ｆ）膜足場配列を有するＴＧＦ−β３前駆体を含む溶菌液（リゼイト）が生産されるように宿主細胞を分断させること；（ｇ）ほぼ純化されたＴＧＦ−β ３前駆体が生産されるような条件下で溶菌液から膜足場配列をもつＴＧＦ−β３前駆体を純化すること、を含む方法。
６．足場膜配列をもつほぼ純化されたＴＧＦ−β３前駆体を生産するための方法において、（ａ）膜足場配列をもつＴＧＦ−β３前駆体をコードするＤＮＡを調製すること、（ｂ）宿主細胞と相容性ある適切なプロモータに連鎖された発現ベクター内にＤＮＡを挿入すること；（ｃ）ＴＧＦ−β３前駆体が発現されるようにする段階（ｂ）のＤＮＡの発現及びそれに続く吸蔵体内での膜足場配列をもつ発現されたＴＧＦ−β３の吸蔵を誘発するべくベクターで宿主細胞を形質転換すること、（ｄ）培地内で宿主細胞を培養すること；（ｅ）宿主細胞及び培地から吸蔵体を分離すること；（ｆ）膜足場配列をもつＴＧＦ−β３前駆体を含む溶液を生産するよう吸蔵体を分断すること；及び（ｇ）ほぼ純化されたＴＧＦ−β３前駆体が生産されるように溶菌液から膜足場配列をもつＴＧＦ−β３前駆体を純化すること、を含む方法。
７．足場連鎖配列にはホスファチジルイノシトール連鎖が含まれている、請求の範囲第５項又は第６項のいずれか１項に記載の方法。
８．足場連鎖配列には、疎水性膜内外ペプチド配列が含まれている、請求の範囲第５項又は第６項のいずれか１項に記載の方法。
９．ほぼ純化された突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を生産する方法において、（ａ）ヌクレオチド２６３−２６５によってコードされたメチオニンで始まりヌクレオチド１１４８−１１５０によってコードされたグルタミンで終結する図１に示されているアミノ酸配列とほぼ同じアミノ酸配列をコードする第１のＤＮＡ配列、プロテアーゼ分割配列をコードするヌクレオチド１１５０に連鎖される第２のＤＮＡ配列、及びヌクレオチド１１６３−１１６５によってコードされたアラニンで始まりヌクレオチド１４９６−１４９８によってコードされたセリンで終わる図１に示されたアミノ酸配列とほぼ同じアミノ酸配列をコードする、第２のＤＮＡ配列に連鎖された第３のＤＮＡ配列、を含むＤＮＡを調製すること；（ｂ）宿主細胞と相容性ある適切なプロモータに連鎖された発現べクター内に段階（ａ）のＤＮＡを挿入すること；（ｃ）突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体が発現されるように段階（ｂ）のＤＮＡの発現を誘発するべくベクターで宿主細胞を形質転換すること；（ｄ）発現された突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体が培地内に分泌されるような条件下で培地内で宿主細胞を培養すること；（ｅ）このように分泌された突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を含む培地から細胞を分離すること；（ｆ）突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を純化しかくしてほぼ純化された突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を生産すること；を含む方法。
１０．実質的に純化された突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を生産する方法において、（ａ）ヌクレオチド２６３−２６５でコードされたメチオニンで始まりヌクレオチド１１４８−１１５０によりコードされたグルタミンで終結する図１に示されているアミノ酸配列とほぼ同じアミノ酸配列をコードする第１のＤＮＡ配列、プロテアーゼ分割配列をコードする、ヌクレオチド１１５０に連鎖されている第２のＤＮＡ配列、及びヌクレオチド１１６３−１１６５によってコードされたアラニンで始まりヌクレオチド１４９６−１４９８によってコードされたセリンで終結する図１に示されたアミノ酸配列とほぼ同じアミノ酸配列をコードする、第２のＤＮＡ配列に連鎖された第３のＤＮＡ配列を含むＤＮＡを調製すること、（ｂ）宿主細胞と相容性ある適切なプロモータに連鎖された発現ベクター内に段階（ａ）のＤＮＡを挿入すること；（ｃ）突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体が発現されるように段階（ｂ）のＤＮＡの発現を誘発するべくベクターで宿主細胞を形質転換すること；（ｄ）培地から、発現された突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を含む宿主細胞を分離すること；（ｅ）突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を含む溶菌液が生産されるように宿主細胞を分断すること、及び（ｆ）突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体と純化しかくしてほぼ純化された突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を生産すること、を含む方法。
１１．ほぼ純化された突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を生産する方法において、（ａ）ヌクレオチド２６３−２６５によってコードされたメチオニンで始まりヌクレオチド１１４８−１１５０によってコードされたグルタミンで終結する図１に示されたアミノ酸配列とほぼ同じアミノ酸配列をコードする第１のＤＮＡ配列、ヌクレオチド１１５０に連鎖されたＡＴＧを含む第２のＤＮＡ配列、ヌクレオチド１１６３−１１６５によってコードされたアラニンで始まりヌクレオチド１４６９−１４７１でコードされたアスパラギンで終結する図１に示されたアミノ酸配列とほぼ同じアミノ酸配列をコードする、第２のＤＮＡ配列に連鎖された第３のＤＮＡ配列、Ｘを含み第３のＤＮＡ配列に連鎖された第４のＤＮＡ配列、及びヌクレオチド１４７５−１４７７によってコードされたバリンで始まりヌクレオチド１４９６−１４９８によってコードされたセリンで終結する図１に示されたアミノ酸配列とほぼ同じアミノ酸配列をコードする、第４のＤＮＡ配列に連鎖された第５のＤＮＡ配列を含むＤＮＡを調製すること、（ｂ）宿主細胞と相容性ある適切なプロモータに連鎖された発現ベクターの中に段階（ａ）のＤＮＡを挿入すること；（ｃ）突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体が発現されるような条件下で段階（ｂ）のＤＮＡの発現を誘発するべくベクターで宿主細胞を形質転換すること；（ｄ）発現された突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体が培地内に分泌されるような条件下で培地内で宿主細胞を培養すること；（ｅ）このように分泌された突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を含む培地から細胞を分離すること；及び（ｆ）ほぼ純化された突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体が生産されるように、突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を純化することを含む方法。
１２．ほぼ純化された突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を生産する方法において、（ａ）ヌクレオチド２６３−２６５でコードされたメチオニンで始まりヌクレオチド１１４８−１１５０によってコードされたグルタミンで終結する図１に示されたアミノ酸配列とほぼ同じアミノ酸配列をコードする第１のＤＮＡ配列、ヌクレオチド１１５０に連鎖されているＡＴＧを含む第２のＤＮＡ配列、ヌクレオチド１１６３−１１６５によってコードされたアラニンで始まり、ヌクレオチド１４６９−１４７１によってコードされたアスパラギンで終結する図１に示されたアミノ酸配列とほぼ同じアミノ酸配列をコードする、第２のＤＮＡ配列に連鎖された第３のＤＮＡ配列、Ｘを含み第３のＤＮＡ配列に連鎖された第４のＤＮＡ配列及びヌクレオチド１４７５−１４７７によってコードされたバリンで始まりヌクレオチド１４９６−１４９８によってコードされたセリンで終結する図１に示されたアミノ酸配列とほぼ同じアミノ酸配列をコードし、第４のＤＮＡ配列に連鎖された第５のＤＮＡ配列を含むＤＮＡを調製すること；（ｂ）宿主細胞と相容性ある適切なプロモータに連鎖された発現ベクター内に段階（ａ）のＤＮＡを挿入すること；（ｃ）突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体が発現されるような条件下で段階（ｂ）の発現を誘発するべくベクターで宿主細胞を形質転換すること；（ｄ）培地から、発現された突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を含む宿主細胞を分離すること、（ｅ）突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を含む溶菌液が生産されるように宿主細胞を分断すること、及び（ｆ）ほぼ純化された突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体が生産されるように突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を純化すること、を含む方法。
１３．段階（ａ）において、ＸはＴＴＴ，ＴＴＣ，ＴＴＡ，ＴＴＧ，ＴＣＴ，ＴＣＣ，ＴＣＡ，ＴＣＧ，ＴＡＴ，ＴＡＣ，ＴＧＴ，ＴＧＣ，ＴＧＧ，ＣＴＴ，ＣＴＣ，ＣＴＡ，ＣＴＧ，ＣＣＴ，ＣＣＣ，ＣＣＡ，ＣＣＧ，ＣＡＴ，ＣＡＣ，ＣＡＡ，ＣＡＧ，ＣＧＴ，ＣＧＣ，ＣＧＡ，ＣＧＧ，ＡＴＴ，ＡＴＣ，ＡＴＡ，ＡＣＴ，ＡＣＣ，ＡＣＡ，ＡＣＧ，ＡＡＴ，ＡＡＣ，ＡＡＡ，ＡＡＧ，ＡＧＴ，ＡＧＣ，ＡＧＡ，ＡＧＧ，ＧＴＴ，ＧＴＣ．ＧＴＡ，ＧＴＧ，ＧＣＴ，ＧＣＣ，ＧＣＡ，ＧＣＧ，ＧＡＴ，ＧＡＣ，ＧＡＡ，ＧＡＧ，ＧＧＴ，ＧＧＣ，ＧＧＡ及びＧＧＧから成るトリ−ヌクレオチドの一群の中から選択されている、請求の範囲第１１項又は第１２項のいずれか１項に記載の方法。
１４．純化がアフィニティクロマトグラフィを含む、請求の範囲第５項、６項、９項、１０項、１１項又は１２項のいずれか１項に記載の方法。
１５．アフィニティクロマトグラフィがレクチンカラムクロマトグラフィを含む、請求の範囲第５項、６項、９項、１０項、１１項又は１２項のいずれか１項に記載の方法。
１６．アフィニティクロマトグラフィが抗体カラムクロマトグラフィを含む、請求の範囲第１４項に記載の方法。
１７．段階（ａ）において、プロテアーゼ分割配列にはコラゲナーゼ認識配列が含まれている、請求の範囲第９項又は第１０項のいずれかに記載の方法。
１８．段階（ａ）においてプロテアーゼ分割配列には因子Ｘａ認識配列が含まれる、請求の範囲第９項又は第１０項のいずれかに記載の方法。
１９．（ａ）前駆体から成熟ＴＧＦβ３を分離するため活性化剤を用いてこのように回収された純化ＴＧＦ−β３前駆体を処理すること；及び（ｂ）段階（ａ）の分離された成熟ＴＧＦ−β３を回収することをさらに含む、請求の範囲第５項又は第６項のいずれかに記載の方法。
２０．（ａ）前駆体から成熟ＴＧＦ−β３を分離するため活性化剤を用いて、こうして回収された純化突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を処理すること、及び（ｂ）段階（ａ）の分離された成熟ＴＧＦ−β３を回収することをさらに含む、請求の範囲第９項又は第１０項のいずれかに記載の方法。
２１．（ａ）前駆体から成熟ＴＧＦ−β３を分離させるため臭化シアンを用いて、このように回収した純化突然変異体ＴＧＦ−β３前駆体を処理すること、及び（ｂ）段階（ａ）の分離された成熟ＴＧＦ−β３を回収すること、をさらに含む、請求の範囲第１１項又は第１２項のいずれかに記載の方法。
２２．突然変異体ＴＧＦ−β３を生産するための方法において、（ａ）ヌクレオチド３３２−３３４によりコードされたロイシンで始まりヌクレオチド１４９６ −１４９８によってコードされたセリンで終結する図１に示されたアミノ酸配列とほぼ同じアミノ酸配列をコードするＤＮＡを調製すること；（ｂ）宿主細胞と相容性ある適切なプロモータに作動的に連鎖された発現ベクター内に段階（ａ）のＤＮＡを挿入すること；（ｃ）突然変異体ＴＧＦ−β３が発現されるような条件下で段階（ｂ）のＤＮＡの発現を誘発するべくベクターで宿主細胞を形質転換すること；（ｄ）培地内で宿主細胞を培養すること；（ｅ）このように発現された突然変異体ＴＧＦ−β３を含む宿主細胞を培地から分離すること；（ｆ）突然変異体ＴＧＦ−β３を含む溶菌液を生産するため細胞を分断すること；及び（ｇ）突然変異体ＴＧＦ−β３を糖化する段階を含む方法。
２３．（ａ）突然変異体ＴＧＦ−β３から成熟ＴＧＦ−β３を分離するため活性化剤を用いて、このように回収された純化突然変異体ＴＧＦ−β３を処理すること；及び（ｂ）段階（ａ）の分離された成熟ＴＧＦ−β３を回収すること、をさらに含む、請求の範囲第２２項に記載の方法。
２４．（ａ）沈殿剤とＴＧＦ−β３前駆体を接触させかくして沈殿内のＴＧＦ− β３前駆体を濃縮させること、（ｂ）ペレットから成熟ＴＧＦ−β３を分離させるような条件下で酸性化された有機溶液で段階（ａ）のペレットを抽出すること、及び（ｃ）段階（ｂ）でこのように分離された成熟ＴＧＦ−β３を回収すること、を含むプロセス。
２５．段階（ｂ）内の酸性化された有機溶液が酸性化されたアセトニトリルを含む、請求の範囲第２４項に記載のプロセス。
２６．酸性化されたアセトニトリルには５０％のアセトニトリルと１．０Ｍの酢酸が含まれている、請求の範囲第２５項に記載のプロセス。
２７．段階（ａ）の沈殿剤が硫酸アンモニウムを含む、請求の範囲第２４項に記載のプロセス。
２８．血清結合タンパク質に対する減少した結合親和力を示す突然変異体、成熟ＴＧＦ−β３を生産し識別するための方法において（ａ）ＴＧＦ−β３をコードするＤＮＡを調製すること；（ｂ）段階（ａ）のＤＮＡに対し突然変異誘発を行ない、かくして突然変異体ＤＮＡを得ること；（ｃ）宿主細胞と相容性ある適切なプロモータに連鎖された発現ベクター内に突然変異体ＤＮＡを挿入すること；（ｄ）突然変異体ＴＧＦ−β３が発現されるような条件の下で段階（ｃ）の突然変異体ＤＮＡの発現を誘発するため、ベクターで宿主細胞を形質転換すること；（ｅ）発現された突然変異体ＴＧＦ−β３が培地内に分泌されるような条件下で培地内で宿主細胞を培養すること；（ｆ）このように発現された突然変異体ＴＧＦ−β３を含む培地から宿主細胞を分離すること；（ｇ）突然変異体ＴＧＦ−β３を純化すること；（ｈ）突然変異体成熟ＴＧＦ− β３が突然変異体ＴＧＦ−β３から分離されるような条件下で、このように発現された突然変異体ＴＧＦ−β３を活性化すること；及び（ｉ）突然変異体、成熟ＴＧＦ−β３について培地を検定し、かくして血清結合タンパク質に対する減少した結合親和力を示す突然変異体、成熟ＴＧＦ−β３を識別すること、を含む方法。
２９．血清結合タンパク質に対する減少た結合親和力を示す突然変異体、成熟ＴＧＦ−β３を生産し識別するための方法において、（ａ）ＴＧＦ−β３をコードするＤＮＡを調製すること；（ｂ）段階（ａ）のＤＮＡに対し突然変異誘発を行ないかくして突然変異体ＤＮａを得ること、（ｃ）宿主細胞と相容性ある適切なプロモータに連鎖された発現ベクター内に突然変異体ＤＭＡを挿入すること；（ｄ）突然変異体ＴＧＦ−β３が発現されるような条件下で段階（ｃ）の突然変異体ＤＮＡの発現を誘発させるべく、ベクターて宿主細胞を形質転換すること；（ｅ）発現された突然変異体ＴＧＦ−β３が宿主細胞内で生産されるような条件下で培地内で宿主細胞を培養すること；（ｆ）培地から、このように発現された突然変異体ＴＧＦ−β３を含む宿主細胞を分離すること；（ｇ）突然変異体ＴＧＦ−β３を含む溶菌液を生産するため細胞を分断ずること；（ｈ）突然変異体ＴＧＦ−β３を純化すること；（ｉ）成熟ＴＧＦ−β３が突然変異体ＴＧＦ−β３から分離されるような条件下で、このように発現された突然変異体ＴＧＦ−β３を活性化すること；及び（ｊ）血清結合タンパク質に対する減少した結合親和力を示す突然変異体、成熟ＴＧＦ−β３について培地を検定し、かくして血清結合タンパク質に対する減少した結合親和力を示す突然変異体、成熟ＴＧＦ−β３を識別すること、を含む方法。
３０．血清結合タンパク質がαｚ−マクログロブリンである、請求の範囲第２８項及び第２９項のいずれかに記載の方法。
３１．血清結合タンパク質がＩＩＩ型ＴＧＦ−βレセプタである、請求の範囲第２８項又は第２９項のいずれかに記載の方法。
３２．ＩＩＩ型ＴＧＦ−βレセプタがベータグリカンである、請求の範囲第３１項に記載の方法。
３３．血清結合タンパク質がＴＧＦ−β前駆体のプロ領域である、請求の範囲第２８項又は２９項のいずれかに記載の方法。
３４．ＴＧＦ−β３前駆体のほぼ純化されたプロ領域を生成する方法において、（ａ）ＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域をコードするＤＮＡを調製すること、（ｂ）宿主細胞と相容性ある適切なプロモータに連鎖された発現ベクター内にＤＮＡを挿入すること、（ｃ）ＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域が発現されるような条件下で段階（ｂ）のＤＮＡの発現を誘発するべくベクターで宿主細胞を形質転換すること；（ｄ）培地内で宿主細胞を培養すること；（ｅ）培地から宿主細胞を分離すること；（ｆ）このように発現されたＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域を含む溶菌液を生産するべく宿主細胞を分断すること；及び（ｇ）ＴＧＦ−β３前駆体のほぼ糖化されたプロ領域が生成されるように溶菌液からＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域を純化すること、を含む方法。
３５．ＴＧＦ−β３前駆体のほぼ純化されたプロ領域を生産する方法において、（ａ）ＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域をコード化するＤＮＡを調製すること、（ｂ）宿主細胞と相容性ある適切なプロモータに連続された発現ベクター内にＤＮＡを挿入すること、（ｃ）ＴＧＦ−β３前駆体のプロ領域が発現されるような条件下で段階（ｂ）のＤＮＡの発現を誘発するためベクターで宿主細胞を形質転換すること、（ｄ）ＴＧＦ−β３前駆体の発現されたプロ領域が培地内に分泌されるような条件下で培地内で宿主細胞を培養すること、（ｅ）このように分泌されたＴＧＦ− β３前駆体のプロ領域を含む培地から宿主細胞を分離すること；及び（ｆ）ＴＧＦ−β３前駆体のほぼ純化されたプロ領域が生産されるようにＴＧＦ −β３前駆体のプロ領域を純化すること、を含む方法。
３６．宿主細胞が真核細胞てある、請求の範囲第５項、６項、９項、１０項、１１項、１２項、２２項、２８項、２９項、３４項又は３５項のいずれかに記載の方法。
３７．宿主細胞が原核細胞である、請求の範囲第５項、６項、９項、１０項、１１項、１２項、２２項、２８項、２９項、３４項、又は３５項のいずれかに記載の方法。